WO2013069504A1 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム Download PDF

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山口光城
田邊哲也
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Definitions

  • the present invention uses an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, and uses atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in a solution ( These are hereinafter referred to as “particles”), for example, biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate objects such as viruses and cells, or non- It relates to optical analysis technology that can detect light from biological particles and obtain useful information in the analysis or analysis of those states (interaction, binding / dissociation state, etc.).
  • the present invention relates to an optical analysis device, an optical analysis method, and an optical analysis computer program that enable various optical analyzes by individually detecting light from a single light emitting particle using the optical system as described above.
  • a particle that emits light (hereinafter referred to as “luminescent particle”) is either a particle that emits light itself, or a particle to which an arbitrary luminescent label or luminescent probe is added.
  • the light emitted from the luminescent particles may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or the like.
  • Such optical analysis techniques include, for example, fluorescence correlation spectroscopy (FCS; see, for example, Patent Literature 1-3 and Non-Patent Literature 1-3), and fluorescence intensity distribution analysis (Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA, for example, Patent Document 4, Non-Patent Document 4) and Photon Counting Histogram (PCH, for example, Patent Document 5) are known.
  • Patent Documents 6 to 8 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • the applicant of the present application described in Patent Documents 9 to 11 is an optical analysis technique using an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a new optical analysis technique based on a principle different from optical analysis techniques such as FCS and FIDA has been proposed.
  • optical analysis techniques such as FCS and FIDA
  • fluorescent molecules floating in a minute region hereinafter referred to as “light detection region” that is a light detection region in a sample solution.
  • Statistical calculation processing is executed on the light intensity data obtained by continuously measuring the light, and the concentration and / or other characteristics of the fluorescent molecules are detected.
  • the position of the light detection region is moved in the sample solution, that is, the sample solution is scanned by the light detection region.
  • the light detection region includes light emitting particles that are dispersed in the sample solution and move randomly, the light emitted from the light emitting particles is individually detected, so that one light emitting particle in the sample solution is detected. By detecting each of them, it is possible to obtain information on the counting of the luminescent particles and the concentration or number density of the luminescent particles in the sample solution.
  • the sample required for the measurement is a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L) as in the optical analysis techniques such as FCS and FIDA.
  • the measurement time is short (measurement of time in the order of seconds is repeated several times in one measurement), and the concentration of particles to be observed is the same as that of optical analysis technology such as FCS and FIDA. It is possible to detect the presence of luminescent particles in a sample solution lower than a well measurable level (about 1 nM) and quantitatively detect its concentration, number density or other characteristics.
  • the “scanning molecule counting method” is used for analysis of rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, clinical diagnosis of diseases, screening of bioactive substances, etc.
  • the number of specimens is large, it is possible to perform experiments or tests at a lower cost or more quickly than conventional biochemical methods, and at a lower concentration so that FCS, FIDA, etc. cannot be performed well. It is expected to be a powerful tool capable of detecting the concentration and / or properties of
  • each pulse appears as a pulse signal, it is assumed that one pulse signal corresponds to one luminescent particle.
  • the presence of is detected individually.
  • the intensity of the detection light emitted from the light detection region of the optical system of the confocal microscope or the multiphoton microscope (the intensity of the light emitted from a single luminescent particle and reaching the photodetector) is typically
  • due to the spatial distribution of excitation light and / or the characteristics of the optical system it has a bell-shaped distribution with the approximate center of the light detection region as the apex.
  • the measured emission intensity varies depending on the position in the detection region.
  • the low-luminance particle passed through the site where the excitation light intensity was strong It cannot be distinguished from the case where a particle with strong brightness passes through a portion where the excitation light intensity is weak by the magnitude of the emission intensity of the pulse signal. That is, the absolute value of the luminescence intensity measured in the scanning molecule counting method is not an intrinsic value of the luminescent particles, and a common luminescence wavelength is determined by using the difference in luminescence intensity of a single luminescent particle. The luminescent particles that have different brightness but cannot be distinguished from each other.
  • the luminescent particles are classified for each type. It cannot be detected while identifying.
  • the main object of the present invention is to provide a novel technique that enables identification or identification of the type of luminescent particles corresponding to each pulse signal in the above-described scanning molecule counting method.
  • the inventors of the present invention when the same luminescent particles are detected multiple times in the scanning molecule counting method, the light intensity of the signal changes, and the change in the light intensity is emitted. It was found that it was caused by the movement of particles due to diffusion. That is, since the light intensity change of the signal over a plurality of times reflects the diffusion characteristics of the light emitting particles, the light emitting particles can be identified by the diffusion characteristics based on the light intensity changes of the signal over a plurality of times. Such knowledge is advantageously used in the present invention.
  • the above problem is an optical analyzer that detects light from luminescent particles that are dispersed in a sample solution and randomly move using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a light detection region moving unit that periodically moves the position of the light detection region of the optical system of the microscope in the sample solution along a predetermined path, and a light detection unit that detects light from the light detection region, The time-series light intensity data from the light detection area detected by the light detection unit is generated while moving the position of the light detection area in the sample solution.
  • a signal processing unit that individually detects a signal representing light from a single luminescent particle, and the signal processing unit detects the intensity value of the signal representing the light of one detected luminescent particle and time-series light intensity data At the time of the generation of a signal representing the light of the one luminous particle.
  • the luminous particles dispersed in the sample solution and moving randomly means particles emitting light such as atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution.
  • any particle may be used as long as it is not fixed to the substrate or the like and freely moves in the solution in Brownian motion.
  • the luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes.
  • the illumination light is Corresponds to the focused region (in the confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the luminescent particles emit light without illumination light, for example, chemiluminescence or biological In the case of particles that emit light by light emission, illumination light is not required in the microscope.
  • the light detection unit detects light from the light detection region by photon counting that counts the number of photons that arrive every predetermined measurement unit time (bin time), and in this case, the light intensity in time series The data becomes time-series photon count data.
  • a time region separated by a time corresponding to an integral multiple of the movement period of the position of the light detection region as measured from the generation time of a signal representing the light of one light emitting particle refers to the light of a certain light emitting particle. Is a time region obtained by adding or subtracting only the time corresponding to an integral multiple of the movement period of the position of the light detection region to the generation time of the signal representing That is, such a time region is a time region (data corresponding to the same space) in which a light detection value appears when a light detection region that circulates repeatedly passes through a space where a certain luminescent particle exists. is there.
  • the term “light emitting particle signal” refers to a signal representing light from the light emitting particles unless otherwise specified.
  • the scanning molecule counting method which is the basic configuration of the present invention, first, the position of the light detection region is moved in the sample solution, that is, the sample solution is scanned by the light detection region. However, the detection of light is performed sequentially. Then, when the light detection region that moves in the sample solution includes light emitting particles that are moving randomly, the light from the light emitting particles is detected, thereby detecting the presence of one light emitting particle. There is expected. Therefore, the light signals from the luminescent particles are detected individually in the time-series data (time-series light intensity data) of the light detected sequentially, thereby detecting the presence of each particle individually. As a result, various information regarding the state of the particles in the solution is acquired.
  • the intensity of light emitted from a single light emitting particle in the optical analyzer and reaching the light detector varies depending on the position of the light emitting particle in the light detection region.
  • the absolute value of the signal light intensity cannot be directly used to identify or identify the types of luminescent particles having a common emission wavelength but different brightness.
  • the change in the light intensity of the same luminescent particles detected when the position of the light detection region circulates along a predetermined path is changed in the movement direction of the light detection region during the rotation of the position of the light detection region.
  • the position of the light detection region is set along a predetermined path so that the same luminescent particle is detected a plurality of times. Optical measurements are performed with periodic movement.
  • the period of movement of the position of the light detection region is calculated from the intensity value of the signal representing the light of one detected light emitting particle and the time of generation of the signal representing the light of one light emitting particle in the time-series light intensity data.
  • Intensity values in a time domain separated by a time corresponding to an integer multiple of the intensity of the light detection region, that is, the intensity of a series of light from the space in which one luminescent particle exists during the circular movement of the light detection region Refer to the value or the intensity value of a series of signals of the same luminescent particles during the circular movement of the light detection region, and represent the translational diffusion characteristics of the luminescent particles based on the plurality of light intensity values. An index value is determined, thereby attempting to identify or identify the type of such individual luminescent particles. Specifically, the type of the luminescent particles may be determined based on the index value indicating the translational diffusion characteristics of the luminescent particles determined as described above.
  • the index value indicating the translational diffusion characteristic of the luminescent particles is, for example, the intensity value of the signal of one luminescent particle and the light detection before and after the signal of the one luminescent particle. It may be a ratio to the sum of intensity values in a time region separated by a time corresponding to the movement period of the region position.
  • the space in which a luminescent particle corresponding to one signal exists corresponds to the movement cycle of the position of the light detection region before and after the signal of the one luminescent particle. It is included in the light detection region in a time region separated by time.
  • the change in the light intensity emitted from the space represents the magnitude of the movement of the luminescent particles due to the Brownian motion while the light detection region circulates. That is, the slower the movement of the luminescent particles, the stronger the intensity in the time region that is separated by the time corresponding to the movement value of the signal intensity value of one luminescent particle and the position of the light detection region before and after the signal of that luminescent particle.
  • the ratio the ratio with the sum of intensity values in the time domain varies with the ease of translational diffusion of the luminescent particles.
  • the ratio of such intensity values may be employed as an index value for identifying or identifying the type of luminescent particles.
  • the index value representing the translational diffusion characteristics of the luminescent particles may be a diffusion coefficient of the luminescent particles or a function value thereof.
  • the change in the light intensity of the signal of the same luminescent particle detected every rotation of the light detection region corresponds to the change in the position of the luminescent particle during the rotation of the light detection region.
  • the autocorrelation function value with respect to time calculated from the signal intensity value of the same luminescent particle for each round of the light detection region is a given diffusion coefficient in a plane perpendicular to the moving direction of the light detection region.
  • the theoretical equation obtained from such a translational diffusion model is fitted to the autocorrelation function value of the signal intensity value with respect to time. It is possible to calculate the diffusion coefficient. Therefore, in the present invention, it is separated by a time corresponding to an integral multiple of the moving period of the position of the light detection region, as measured from the generation time of the signal representing the light of one luminescent particle in the time-series light intensity data.
  • the intensity value in the time domain the intensity value of the signal representing the light of the same luminescent particle as that one luminescent particle (generated in the time domain) is used, and the signal representing the light of the single luminescent particle In a plane perpendicular to the moving direction of the light detection region with respect to the autocorrelation function value with respect to the time calculated from the intensity value of the light and the intensity value of the signal representing the light of the same light emitting particle as the one light emitting particle
  • a diffusion coefficient calculated by fitting a theoretical formula derived from a translational diffusion model of a luminescent particle or a function value thereof may be adopted as an index value representing a translational diffusion characteristic of the luminescent particle for identification of the luminescent particle.
  • the diffusion coefficient of the luminescent particles or a function value thereof is determined, and the diffusion coefficient or the function value thereof may be adopted as an index value for identifying the luminescent particles.
  • the signal processing unit of the apparatus of the present invention determines whether or not one luminescent particle has entered the light detection region from the detection value signal from the sequential light detection unit. This may be done on the basis of a signal profile representing the time-series light detected in this way.
  • a signal profile representing the time-series light detected typically, when a signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, it is detected that one luminescent particle has entered the light detection region. It's okay.
  • the signal profile representing the light from the luminescent particles is usually the time-series detection value of the light detection unit, that is, the light intensity data.
  • the signal processing unit of the apparatus of the present invention is configured to detect a pulse signal having an intensity exceeding a predetermined threshold as a signal representing light from a single luminescent particle on the time-series light intensity data. It may be.
  • the “predetermined threshold value” can be set to an appropriate value experimentally.
  • the detection target of the apparatus of the present invention is light from a single luminescent particle, the light intensity is very weak, and when one luminescent particle is a single fluorescent molecule or several molecules, The light emitted from the luminescent particles is probabilistically emitted, and there is a possibility that a signal value may be lost in a very short time. When such a lack occurs, it becomes difficult to specify a signal corresponding to the presence of one luminescent particle. Therefore, the signal processing unit smoothes the time-series light intensity data, processes the data so that the missing signal value at a minute time can be ignored, and then uses the smoothed time-series light intensity data.
  • a bell-shaped pulsed signal having an intensity exceeding a predetermined threshold value may be detected as a signal representing light from a single luminescent particle.
  • the signal processing unit determines the existence area of the bell-shaped pulse signal in the time differential value of the smoothed time-series light intensity data, and the existence area of the pulse signal.
  • a pulse-like signal whose intensity value obtained by fitting a bell-shaped function equation to the smoothed time-series light intensity data in the sample exceeds a predetermined threshold is determined as a signal representing light from a single luminescent particle. It may be configured to avoid the trouble of manually detecting the region where the pulse-like signal exists visually.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution in the above-described apparatus of the present invention may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the moving speed of the light detection region increases, the amount of light obtained from one light emitting particle decreases, so that the light from one light emitting particle can be measured with high accuracy or sensitivity. It is preferable that the moving speed can be appropriately changed.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected (the average moving speed of the particles due to Brownian motion).
  • the apparatus of the present invention detects the light emitted from the light emitting particles when the light detection region passes the position where the light emitting particles exist, and individually detects the light emitting particles.
  • a signal (representing the presence of the luminescent particles) is emitted multiple times from one luminescent particle.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles, so that one luminescent particle can correspond to one signal (indicating the presence of the luminescent particle). It becomes. Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent particles, as described above, according to the characteristics (particularly, the diffusion coefficient) of the luminescent particles, the apparatus of the present invention can appropriately change the movement speed of the light detection region. It is preferable to be configured.
  • the movement period of the light detection region is preferably set to be shorter than the time required for the luminescent particles once detected to move a distance corresponding to the size of the light detection region by Brownian motion.
  • the moving period of the light detection region can be set by appropriately adjusting the moving speed and the length of the predetermined path.
  • the movement of the position of the light detection region in the sample solution may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path of the optical system of the microscope by using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope, or
  • the position of the sample solution may be moved (for example, by moving a microscope stage) to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope, the movement of the light detection region is quick, and mechanical vibrations and hydrodynamic actions are applied to the sample solution. Therefore, it is advantageous in that light can be measured in a stable state without the influence of the mechanical action of the luminescent particles to be detected.
  • the number of light-emitting particles included in the light detection region may be counted by counting the number of signals (particle counting).
  • information on the number density or concentration of the identified luminescent particles in the sample solution can be obtained by combining the number of detected luminescent particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the number density or concentration ratio of a plurality of sample solutions, or the relative number density or concentration ratio with respect to the standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated, or An absolute number density value or concentration value may be determined using a relative number density or concentration ratio relative to a standard sample solution that is a reference for concentration or number density.
  • the total volume of the movement locus of the light detection region position is specified by any method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of the luminescent particles can be reduced. It can be calculated specifically.
  • photodetection is performed by detecting the light while moving the position of the photodetection region in the sample solution, and individually detecting a signal from a single luminescent particle.
  • the processing of optical analysis technology that detects the light of the luminescent particles multiple times and determines the index value representing the translational diffusion characteristics of the luminescent particles based on the change in the light intensity can also be realized by a general-purpose computer. is there.
  • a computer program that periodically moves the position of the light detection region of the microscope optical system along a predetermined path in the sample solution, and moves the position of the light detection region in the sample solution.
  • the movement period of the position of the light detection region is measured from the generation time of the signal representing the light of the one light emitting particle.
  • the computer implements the above-described procedure by reading a program stored in a storage medium and executing information processing / arithmetic processing.
  • the computer-readable recording medium may be a magnetic disk, a magneto-optical disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a semiconductor memory, or the like.
  • the above-described program may be distributed to a computer via a communication line, and the computer that has received this distribution may execute the program.
  • the procedure of detecting light from the light detection region and generating time-series light intensity data the number of photons that arrive at every measurement unit time (bin time) is calculated. Light from the light detection area is detected by counting photon counting.
  • time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • the index value representing the translational diffusion characteristics of the luminescent particles includes the intensity value of the signal of one luminescent particle and the movement period of the position of the light detection region before and after the signal of the one luminescent particle.
  • a ratio with the sum of intensity values in a time domain separated by a time corresponding to may be employed.
  • the individual detection of the signal representing the light from each of the luminescent particles may be performed based on a time-series signal profile.
  • a signal having an intensity greater than a predetermined threshold it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region.
  • a bell-shaped pulse-like signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle, and preferably, time-series light
  • the intensity data is smoothed, and a bell-shaped pulse signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the smoothed time-series light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle.
  • the presence region of the bell-shaped pulse signal is determined in the time differential value of the smoothed time-series light intensity data, and smoothed in the existence region of the pulse signal.
  • a pulse-like signal whose intensity value obtained by fitting a bell-shaped function equation to time-series light intensity data exceeds a predetermined threshold value may be determined as a signal representing light from a single luminescent particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles, the number density or concentration in the sample solution, and preferably in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected.
  • the movement cycle of the position of the light detection region is preferably set to be shorter than the time required for the luminescent particles once detected to move a distance corresponding to the size of the light detection region by Brownian motion.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. May be changed.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • a procedure for counting the number of light-emitting particles detected during movement of the position of the light detection region by counting the number of signals from the individually detected light-emitting particles and / or A procedure for determining the number density or concentration of luminescent particles in the sample solution based on the number of detected luminescent particles may be included.
  • an optical analysis method for detecting light of individual luminescent particles while moving the position of the photodetection region in the sample solution.
  • a method for measuring the diffusion characteristic value of luminescent particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope The process of periodically moving the position of the light detection region of the optical system of the microscope along a predetermined path, and the light from the light detection region while moving the position of the light detection region in the sample solution.
  • the process of generating light intensity data by measuring the intensity of light the process of individually detecting a signal representing light from a single light emitting particle on the light intensity data, and the light of one detected light emitting particle
  • the distance from the generation time of the signal representing the light of the one light emitting particle is separated by a time corresponding to an integral multiple of the moving period of the position of the light detection region Based on intensity values in the time domain
  • Method characterized by including the step of determining an index value representing the translational diffusion characteristics of in the light emit
  • time-series light intensity data is time-series photon count data. Also in this case, there may be provided a process of determining the type of the luminescent particles based on the index value representing the translational diffusion characteristics of the luminescent particles.
  • the index value representing the translational diffusion characteristics of the luminescent particles includes the intensity value of the signal of one luminescent particle and the position of the light detection region before and after the signal of the one luminescent particle.
  • a ratio with the sum of intensity values in a time region separated by a time corresponding to the movement period may be employed.
  • the individual detection of the signal representing the light from each of the luminescent particles may be performed based on the time-series signal profile.
  • a signal having an intensity greater than a predetermined threshold it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region.
  • a bell-shaped pulse-like signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle, and preferably, time-series light
  • the intensity data is smoothed, and a bell-shaped pulse signal having an intensity exceeding a predetermined threshold in the smoothed time-series light intensity data may be detected as a signal representing light from a single light emitting particle.
  • the presence region of the bell-shaped pulse signal is determined in the time differential value of the smoothed time-series light intensity data, and smoothed in the existence region of the pulse signal.
  • a pulse-like signal whose intensity value obtained by fitting a bell-shaped function equation to time-series light intensity data exceeds a predetermined threshold value may be determined as a signal representing light from a single luminescent particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles, the number density or concentration in the sample solution, and preferably in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. May be changed.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • a step of determining the number density or concentration of the luminescent particles in the sample solution based on the number of luminescent particles formed may be included.
  • the optical analysis technique of the present invention described above is typically a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell. It is used for analysis or analysis of the state of matter in solution, but it may also be used for analysis or analysis of the state of non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.) in solution. It should be understood that such cases are also within the scope of the present invention.
  • a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell. It is used for analysis or analysis of the state of matter in solution, but it may also be used for analysis or analysis of the state of non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.) in solution. It should be understood that such cases are also within the scope of
  • the type of luminescent particles can be identified or identified by the translational diffusion characteristics of the luminescent particles in the scanning molecule counting method.
  • the sample solution includes a plurality of types of luminescent particles
  • different types of luminescent particles having a common emission wavelength can be identified by conventional FCS and FIDA.
  • FCS the translational diffusion time is calculated.
  • the translational diffusion time represents the diffusion characteristics of the particles, and the translational diffusion time is referred to even in a sample solution in which a plurality of types of luminescent particles having different diffusion characteristics are mixed.
  • the average luminescence intensity per single luminescent particle is calculated, and even in a sample solution in which a plurality of types of luminescent particles having different brightness are mixed, the ratio and concentration of the luminescent particles are determined for each type. Can be estimated.
  • This advantage is similar to the present invention, but it should be understood that in the case of the present invention, the diffusion characteristic is grasped for each single luminescent particle, and thus the identification is performed for each luminescent particle. Is possible.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that performs the scanning molecule counting method according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIG. 1D is a schematic diagram of a mechanism for moving the position of the photodetection region in the sample solution by moving the horizontal position of the microplate.
  • FIGS. 2A and 2B are a schematic diagram for explaining the principle of light detection in the scanning molecule counting method to which the present invention is applied, and a schematic diagram of time variation of the measured light intensity, respectively.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that performs the scanning molecule counting method according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region
  • FIG. 2C is a schematic diagram of a cross section of the light detection region viewed from the light traveling direction of the microscope, and schematically shows the luminescent particles passing through the light detection region CV.
  • FIG. 2D is a schematic diagram of an example of time-series light intensity data measured in the case of (C).
  • FIG. 2E shows a spatial distribution of the intensity of light emitted and detected from the luminescent particles in the light detection region.
  • FIG. 3A is a schematic perspective view of a spatial region included by movement along a predetermined path in the sample solution of the light detection region CV of the microscope.
  • FIG. 3B is a diagram schematically illustrating an example of the movement of the luminescent particles in a plane perpendicular to the moving direction of the light detection region during the rotation of the light detection region.
  • FIG. 3C is a graph schematically showing the intensity of light from the luminescent particles detected with respect to time when the luminescent particles hardly move while the light detection region circulates a predetermined path. is there.
  • FIG. 3D is a schematic diagram of the light detection region for explaining the relationship between the size of the light detection region and the displacement (per one period of the light detection region) due to the Brownian motion of the luminescent particles.
  • FIG. 4 is a flowchart showing the processing procedure of the scanning molecule counting method executed in accordance with the present invention in the form of a flowchart.
  • FIG. 5A and 5B show the case where the luminescent particles traverse the light detection region while performing Brownian motion, and the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles. It is a model figure showing the mode of movement of particles when luminous particles cross a photodetection region by moving.
  • FIG. 5C shows a detection signal in a processing procedure for detecting a signal corresponding to a single luminescent particle from measured time-series light intensity data (time change of photon count) according to the scanning molecule counting method. It is a figure explaining the example of this signal processing process.
  • FIG. 5C shows a detection signal in a processing procedure for detecting a signal corresponding to a single luminescent particle from measured time-series light intensity data (time change of photon count) according to the scanning molecule counting method. It is a figure explaining the example of this signal processing process.
  • FIG. 6 shows an actual measurement example (bar graph) of measured photon count data, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the pulse existence region.
  • a signal labeled “noise” is ignored as it is a signal due to noise or foreign matter.
  • FIG. 7A illustrates the process of determining the translational diffusion feature amount (ratio of the signal intensity of one luminescent particle and the sum of the light intensity values of the time before and after one period of the light detection region) according to the present invention. It is a figure to do.
  • FIG. 7B shows a formula, a plot, and a fitting curve of the autocorrelation function of the light intensity calculated for calculating the diffusion coefficient of the issued particles according to the present invention.
  • FIG. 8A is a graph showing the average value of the translational diffusion feature amount of the plasmid and the fluorescent dye (TAMRA) measured according to the scanning molecule counting method (Example 1) improved according to the present invention.
  • FIG. 8B is a graph showing the histogram (frequency) of the translation diffusion feature amount of (A) in the form of a graph.
  • FIG. 9 shows examples of signal intensity (A), autocorrelation function value, and fitting curve (B) of the same luminescent particles measured according to the scanning molecule counting method (Example 2) improved according to the present invention. ing.
  • optical analysis apparatus 1 that realizes the optical analysis technique according to the present invention is capable of executing FCS, FIDA, and the like as schematically illustrated in FIG.
  • the apparatus may be a combination of an optical system of a confocal microscope and a photodetector.
  • optical analysis apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA at the outgoing end of the light, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, the reflection mirrors 6, 7, and the objective lens 8. Is incident on.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • luminescent particles that are the object of observation typically particles to which luminescent labels such as fluorescent particles or fluorescent dyes have been added are dispersed or dissolved, and these luminescent particles enter the excitation region.
  • the luminescent particles are excited and light is emitted.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14. (Here, only the light component of a specific wavelength band is selected.), Introduced into the multimode fiber 15, reaches the photodetector 16, is converted into a time-series electrical signal, and then to the computer 18.
  • Input and processing for optical analysis is performed in a manner described later.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and as a result, as shown in FIG. Only the light emitted from the focal region of the laser beam, that is, the excitation region as schematically shown, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • the focal region of the laser beam illustrated in FIG. 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is in the region).
  • the photodetector 16 is preferably an ultra-high light that can be used for photon counting.
  • a sensitive photodetector is used.
  • the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • a mechanism for scanning the sample solution with the light detection region that is, for moving the position of the focal region, that is, the light detection region in the sample solution.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region for example, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. A method of moving the absolute position of the light detection area).
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • FIG. 1D the horizontal position of the container 10 (microplate 9) into which the sample solution is injected is moved to detect light in the sample solution.
  • the stage position changing device 17a may be operated to move the relative position of the region (a method of moving the absolute position of the sample solution).
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a cooperates with the light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18 in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected by the program in the computer 18). It may be.)
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 or the stage up and down.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed. Further, when the luminescent particles to be observed emit light regardless of excitation light due to chemiluminescence or bioluminescence phenomenon, the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted. When the luminescent particles emit light by phosphorescence or scattering, the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of the excitation light may be appropriately selected according to the excitation wavelength of the luminescent particles.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a plurality of types of luminescent particles having different wavelengths are included in the sample, light from them can be detected separately according to the wavelength. It may be.
  • light detection light polarized in a predetermined direction may be used as excitation light, and a component in a direction perpendicular to the polarization direction of excitation light may be selected as detection light.
  • a polarizer (not shown) is inserted in the excitation light optical path, and the polarization beam splitter 14a is inserted in the detection light optical path. According to this configuration, it is possible to significantly reduce the background light in the detection light.
  • the computer 18 includes a CPU and a memory, and the CPU executes various arithmetic processes to execute the procedure of the present invention. Each procedure may be configured by hardware. All or a part of the processing described in the present embodiment may be executed by the computer 18 using a computer-readable storage medium storing a program for realizing the processing. That is, the computer 18 may realize the processing procedure of the present invention by reading a program stored in a storage medium and executing information processing / calculation processing.
  • the computer-readable recording medium may be a magnetic disk, a magneto-optical disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a semiconductor memory, or the like.
  • the above-mentioned program is distributed to a computer via a communication line. The computer that has received the distribution may execute the program.
  • the optical analysis technique of the present invention in short, in the scanning molecule counting method, The position is periodically moved along a predetermined path, the light of the same luminescent particle is detected multiple times, and an index value representing the translational diffusion characteristic of the luminescent particle is determined based on the change of the light intensity. In this way, the type of each luminescent particle can be identified or identified by the index value representing such translational diffusion characteristics.
  • the principle of calculation of the index value representing the translational diffusion characteristic of the scanning molecule counting method of the present invention will be described.
  • the light detection region CV moves (time to to t2 in the figure) and passes through the region where one light emitting particle exists (t1), light is emitted from the light emitting particle, A pulse-like signal having a significant light intensity (Em) appears on the time-series light intensity data as depicted in FIG.
  • Em significant light intensity
  • the movement of the position of the light detection region CV and the light detection are executed, and pulse-like signals (significant light intensity) appearing in the meantime illustrated in FIG. 2B are detected one by one.
  • the luminescent particles are individually detected, and the number of the luminescent particles is counted to obtain information on the number, concentration, or number density of the luminescent particles present in the measured region.
  • the intensity distribution of the excitation light in the light detection region and / or the objective lens passes through the pinhole and reaches the light detector. Due to the characteristics of the optical system described above, the intensity of the light emitted from the luminescent particles passing through the light detection region and reaching the photodetector varies depending on the position of the luminescent particles in the light detection region CV. Typically, the intensity distribution of light emitted from the light detection region and reaching the light detector is approximately at the center of the light detection region (condensing region) as illustrated in FIG.
  • maximum intensity point It becomes maximum (hereinafter, the point of maximum intensity is referred to as “maximum intensity point”), and has a bell-shaped distribution with respect to the radial distance (radius r) from the maximum intensity point. That is, even if the light-emitting particles have the same brightness (light-emitting particles having substantially the same light emission intensity when observed under the same conditions), the detected light intensity differs depending on the position through which the light-emitting particles pass. For example, as shown in FIG. 2C, when the light emitting particles ⁇ , ⁇ , and ⁇ having the same brightness cross the light detection region CV at the illustrated position, the light intensity of the light emitting particle ⁇ passing through the approximate center of the light detection region.
  • the absolute intensity value of the signal of the luminescent particles is not a unique value of the luminescent particles, and the difference in the intensity values cannot be directly used for identifying or identifying the type of the luminescent particles.
  • the absolute intensity value of the signal of the luminescent particles cannot be used as it is for identifying or identifying the type of the luminescent particles, but is mentioned in the “Summary of Invention” section.
  • the change in the intensity value of the signal of the same luminescent particle reflects the change in the position of the luminescent particle. The change in the position of the luminescent particle depends on the Brownian motion of the luminescent particle, and the speed of the change in the position depends on the translational diffusion characteristic of the luminescent particle.
  • the change in the signal intensity of the same luminescent particles is detected while the position of the light detection region is revolving, and the translation of the luminescent particles is detected from the change in the signal of the same luminescent particles.
  • An attempt is made to calculate an index value representing diffusion characteristics and use it for identification or identification of the type of luminescent particles.
  • the light detection region (CV) passes through a predetermined path (for example, a ring with a radius R) in the sample solution. It is circulated. At that time, the light detection region is detected until the light detection particle is detected before the light emission particle once detected (the light emission particle included in the light detection region) deviates from the space region through which the light detection region passes. The movement period (tcycle) of the light detection region is adjusted so as to arrive. Then, as long as the same luminescent particles exist in the spatial region through which the photodetection region passes while the photodetection region goes around the predetermined path, the signal is transmitted as shown in FIG.
  • a predetermined path for example, a ring with a radius R
  • the detection region is periodically detected corresponding to the movement cycle tcycle of the detection region, and the signal intensity thereof varies depending on the position of the luminescent particle corresponding to the movement of the position of the luminescent particle due to Brownian motion (see FIG. 3B). Then, the change in the position of the luminescent particles, that is, the faster the movement, the greater the change in the signal intensity. Therefore, the translational diffusion characteristics of the luminescent particles are determined from the change in the signal intensity. Specific processing for calculating the index value representing the translational diffusion characteristics of the luminescent particles will be described later.
  • the signal of the same luminescent particles is It becomes difficult to capture every rotation of the light detection region. This is because, if the moving direction of the luminescent particles once included in the light detection region coincides with the passage region (predetermined path) of the light detection region, it is included again in the light detection region after the circulation of the light detection region.
  • the luminescent particles move in a random direction, when the (average) displacement of the luminescent particles in one period of the photodetection region is large enough to exceed the size of the photodetection region, the luminescent particles are This is because, after being included by the light detection region, it is highly likely that the light detection region deviates from the passage region of the light detection region and is not included again by the light detection region after the light detection region circulates. Therefore, in order to capture a periodic signal in order to reliably achieve the above calculation of the diffusion coefficient D, as illustrated in FIG. 3D, the luminescent particles in the light detection region moving period tcycle are illustrated.
  • the movement period tcycle of the light detection region may be adjusted so that the condition of the above formula (1) is satisfied in the expected diffusion coefficient of the luminescent particles to be inspected. .
  • FIG. 4 shows processing in the present embodiment expressed in the form of a flowchart.
  • the particles to be observed in the optical analysis technique of the present invention are arbitrary as long as they are dispersed particles in the sample solution and move randomly in the solution, such as dissolved molecules.
  • biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells, metal colloids, other non-biological molecules, etc. It's okay.
  • a luminescent label fluorescent molecule, phosphorescent molecule, chemical / bioluminescent molecule
  • the sample solution is typically an aqueous solution, but is not limited thereto, and may be an organic solvent or any other liquid.
  • the light intensity in the optical analysis by the scanning molecule counting method of the present embodiment is measured by driving the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • it may be executed in the same manner as the light intensity measurement process in FCS or FIDA.
  • the operation process typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18.
  • the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution are started.
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a drives the mirror 7 (galvanomirror) or the microplate 9 on the stage of the microscope, and the wells.
  • the position of the light detection region is moved, and at the same time, the light detector 16 sequentially converts the detected light into an electric signal and transmits it to the computer 18.
  • time-series light intensity data is generated from the transmitted signal and stored.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, and therefore when the light detection is based on photon counting, the time-series light intensity data is a time-series data. It may be photon count data. The bin time in photon counting is set appropriately so that the bell-shaped features of the signal profile are not lost.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the scanning molecule counting method, in general, in order to carry out individual detection of luminescent particles from measured time-series light intensity data quantitatively and accurately.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity is set to a value faster than the random movement of the luminescent particles, that is, the moving speed due to the Brownian movement.
  • the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement of the particle due to Brownian motion, the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the light intensity changes randomly, and it becomes difficult to specify a significant light intensity change (a signal representing light from the light emitting particles) corresponding to each light emitting particle.
  • the particles cross the light detection region in a substantially straight line, so that the light intensity corresponding to each particle in the time-series light intensity data.
  • the profile of the light intensity change is substantially the same as the excitation light intensity distribution. See the upper part of FIG. 6A.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set faster than the average moving speed (diffuse moving speed) due to the Brownian motion of the particles.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s, which is 10 times or more.
  • various movement speeds of the position of the light detection region are set, and the profile of the change in light intensity is expected to be expected (typically, the excitation light intensity distribution and Preliminary experiments for finding conditions that are substantially the same) may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the signal it has corresponds to the passage of one particle through the light detection region and one luminescent particle may be detected.
  • a signal whose light intensity does not exceed the threshold value Ith or whose time width ⁇ is not within a predetermined range is determined as a noise or foreign matter signal.
  • the light intensity profile corresponds to the passage of one particle through the light detection region, and one luminescent particle may be detected.
  • a signal whose intensity A and width a are outside the predetermined range is determined as a noise or foreign object signal and may be ignored in the subsequent analysis or the like.
  • smoothing is performed on the light intensity data (FIG. 5C, “detection result (unprocessed)” at the uppermost stage).
  • Is performed (step 110 in FIG. 4 and “smoothing” in the upper part of FIG. 5C).
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example.
  • the parameters for executing the smoothing process are the moving speed (scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data Speed) and BIN TIME may be set as appropriate.
  • a primary differential value with respect to time of the light intensity data is calculated (step 120).
  • the time differential value of the light intensity data as illustrated in the lower “time differential” in FIG. 5C, the change in the value at the time of change of the signal value becomes large, so the time differential value is referred to.
  • the significant signal start and end points can be advantageously determined.
  • step 130 significant pulse signals are sequentially detected on the light intensity data. Specifically, first, the start and end points of one pulse signal are searched and determined sequentially on the time differential value data of the light intensity data to identify the pulse existence region. (Step 130). When one pulse existence area is specified, a bell-shaped function fitting is performed on the smoothed light intensity data in the pulse existence area (FIG. 5 (C) lower stage “bell-shaped function fitting”). Parameters such as the intensity Ipeak of the peak (maximum value) of the pulse of the bell-shaped function, the pulse width (full width at half maximum) Wpeak, and the correlation coefficient (of the least square method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function. Whether or not the calculated bell-shaped function parameter is within a range assumed for the bell-shaped profile parameter drawn by the pulse signal detected when one luminescent particle passes through the light detection region, That is, whether the pulse peak intensity, pulse width, and correlation coefficient are each within a predetermined range, for example, the following conditions: 20 ⁇ sec ⁇ pulse width ⁇ 400 ⁇ sec peak intensity> 1.0 [pc / 10 ⁇ s] (A) Correlation coefficient> 0.95 Whether or not the condition is satisfied is determined (step 150). Thus, as shown in the left of FIG.
  • the signal determined that the calculated bell-shaped function parameter is within the range assumed in the signal corresponding to one luminescent particle is one luminescent particle.
  • one luminescent particle is detected.
  • a pulse signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise. Note that the counting of the number of signals, that is, the counting of the luminescent particles may be performed simultaneously with the detection of the signal of the luminescent particles.
  • the search and determination of the pulse signal in the processing of the above steps 130 to 150 may be repeatedly executed over the entire area of the light intensity data (step 160).
  • the process which detects the signal of a luminescent particle separately from light intensity data is not restricted to said procedure, You may perform by arbitrary methods.
  • index value indicating translational diffusion characteristics of luminescent particles (step 170) As described above, when individual detection of the signal of the luminescent particles is performed, an index indicating the translational diffusion characteristics of each luminescent particle using the change in light intensity from each luminescent particle during the circular movement of the light detection region. The value is calculated.
  • the index value includes (i) the intensity value of the signal of one luminescent particle and the intensity value in a time domain separated by a time corresponding to the movement period of the position of the photodetection area before and after the signal of the one luminescent particle. (Ii) the diffusion coefficient of the luminescent particles may be employed. Hereinafter, the calculation process of each index value will be described.
  • the light detection region is periodically circulated through a predetermined path.
  • the light intensity value from the same spatial region is measured for each movement period of the light detection region. Accordingly, a time region that is a time before the time corresponding to the movement period of the light detection region and a time corresponding to the movement period of the light detection region, calculated from the generation time of each signal of the luminescent particles detected up to step 160.
  • the light intensity values in the later time domain reflect the state before and after one cycle of the space where the luminescent particles corresponding to each signal existed, and the position of the luminescent particles in the space. Determined by.
  • the light intensity value of the signal of the luminescent particles, and the light intensity values in the previous time region and the subsequent time region by the time corresponding to the moving period of the light detection region, as calculated from the generation time of the signal By comparing the above, it is possible to estimate the ease of changing the position of the luminescent particles in the movement period of the light detection region, that is, the ease of translational diffusion of the luminescent particles.
  • the signal intensity values of the signals detected up to step 160 and the signal values before and after each signal.
  • the translational diffusion feature amount is the number of photons pc in the pulse existence region of the signal of one luminescent particle, and the time region ⁇ Tf that is the previous time by the time corresponding to the moving period of the position of the light detection region.
  • (Translational diffusion feature amount) (p ⁇ 1 + p +1 ) / pc (6) May be defined by Note that the widths of the time regions ⁇ Tf and ⁇ Tr may be arbitrarily set experimentally or theoretically, and are typically required for the light detection region to pass a distance corresponding to the maximum diameter of the light detection region. It may be time. According to this translational diffusion feature amount, as shown schematically in FIG. 7A, in the case of relatively large particles (left figure), the moving speed due to Brownian motion is slow and stays in the same space region.
  • the translational diffusion feature amount represents the translational diffusion characteristic of the luminescent particles and is a value unique to the luminescent particles, and thus can be used for identifying or identifying the type of the luminescent particles.
  • such a change in light intensity reflects a change in position in the radial direction from the maximum intensity point of the light detection area of the luminescent particles, and since the light detection area has moved in one direction, It can be considered that the change in the peak intensity of the signal is due to the translational diffusion movement of the luminescent particles in the plane perpendicular to the moving direction of the light detection region as illustrated in FIG.
  • a set of signals appearing at each movement period of the light detection region is extracted from the signal of the luminescent particles detected up to step 160.
  • a signal of one luminescent particle is selected, and the time corresponding to an integral multiple of the movement period of the position of the light detection region is calculated from the generation time of the signal.
  • a signal of luminescent particles existing in a time region separated by a distance may be selected as a signal of the same luminescent particle, and may be a set of signals of one luminescent particle. Further, such an operation is performed over the entire time-series light intensity data.
  • a plurality of signal sets of a single luminescent particle may be extracted from one time-series light intensity data.
  • the autocorrelation function value of the light intensity of each set is calculated by the equation (9).
  • the theoretical formula (dotted line in the figure) derived from the described translational diffusion model is fitted to the autocorrelation function value (plot point in the figure), and the diffusion coefficient D is calculated.
  • the autocorrelation function value may be calculated (therefore, the number of numerator terms in equation (9) decreases with the magnitude of ⁇ ).
  • the number of light intensity values for calculating the autocorrelation function value and the number of calculated autocorrelation function values are relatively small, and the expression (7) , (8) is difficult to fit well.
  • the second term that is a term characterizing the change in the theoretical formula (8) may be fitted to the autocorrelation function value. That is, an equation obtained by modifying equation (8) as follows may be used as the fitting equation.
  • K is a constant and is determined by fitting.
  • a function value obtained by multiplying the diffusion coefficient by a constant may be calculated, and it should be understood that such a case also belongs to the scope of the present invention. It is.
  • the above (i) translational diffusion feature amount or (ii) diffusion coefficient (or a function value thereof) is determined for each luminescent particle.
  • these values can be specific values of the luminescent particles, and therefore these types can identify or identify the type of each luminescent particle.
  • the computer 18 performs various analyzes such as the calculation of the concentration of the luminescent particles by the processing according to the program stored in the storage device. May be executed.
  • the total volume of the region through which the photodetection region passes can be calculated by any method.
  • the number density or concentration of the luminescent particles in the sample solution is determined from the volume value and the number of the luminescent particles.
  • the total volume of the region through which the light detection region passes may be theoretically calculated based on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system.
  • a solution having a known particle concentration (control solution) was detected by measuring the light intensity, detecting the luminescent particles, and counting as described above under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined.
  • It may be determined from the number of luminescent particles and the concentration of luminescent particles in the control solution. Specifically, for example, for a control solution having a concentration C of luminescent particles, if the number of detected luminescent particles in the control solution is N, the total volume Vt of the region through which the photodetection region has passed is Vt N / C (11) Given by.
  • a control solution a plurality of solutions having different concentrations of luminescent particles are prepared, measurement is performed for each, and the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be like this.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • the relationship between the concentration C of various standard luminescent particles and the number N of luminescent particles (formula (12)) regarding the assumed movement pattern of the light detection region. ) May be stored in advance in the storage device of the computer 18 so that the user can use the information stored as appropriate when the user of the device performs optical analysis.
  • the type or identification of a single luminescent particle can be made by identifying or identifying the type of luminescent particles by means of the translational diffusion feature quantity or diffusion coefficient. It can be determined every time.
  • the translational diffusion feature amount defined by the equation (6) was calculated for each signal of the luminescent particles detected on the time-series light intensity data.
  • a solution containing phosphorescent buffer TAMRA (MW 430.45, Sigma-Aldrich Cat. No. C2734) as a luminescent particle at 100 fM in a phosphate buffer (containing 0.05% Tween 20), phosphorus A solution containing SYTOX Orange (pbr322 2.9MDa Takara Bio Inc. Cat. No. 3035) and 10 nM DNA intercalator fluorescent dye SYTOX Orange (Invitrogen Cat. No. S-11368) in acid buffer It binds to a single plasmid to form a single luminescent particle).
  • TAMRA MW 430.45, Sigma-Aldrich Cat. No. C2734
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device, and the above-mentioned “(2) Sample solution
  • time-series light intensity data photon count data
  • laser light of 543 nm was used as excitation light
  • light in a wavelength band of 560 to 620 nm was measured using a bandpass filter to generate time-series photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution was 6000 rpm (15 mm / second), BIN TIME was 10 ⁇ sec, and measurement was performed for 2 seconds.
  • the time region ⁇ Tf that is the time corresponding to the movement period of the position of the light detection region is a section 10.05 to 9.95 milliseconds before the peak of the signal, and is the time corresponding to the movement period of the position of the light detection region.
  • the time region ⁇ Tr just after is defined as a section 9.95 to 10.05 ms after the peak of the signal.
  • FIG. 8 (A) shows the average value (bar graph) and standard deviation (error bar) of the translational diffusion features of the fluorescent dye molecule TAMRA and the plasmid stained with SYTOX Orange
  • FIG. 8 (B) shows the translation.
  • the frequency of occurrence of the diffusion feature amount (histogram) is shown.
  • the average (0.87) translational diffusion feature amount of the large and slow-moving plasmid is the translational diffusion feature amount of the small and fast-moving fluorescent dye molecule TAMRA. The value was much larger than the average value (0.18).
  • the overlapping portion of the histogram between the translational diffusion feature amount of the plasmid and the translational diffusion feature amount of the fluorescent dye molecule TAMRA was small.
  • the fluorescent dye molecule TAMRA out of the signals below the reference value (the signal determined as the fluorescent dye molecule TAMRA signal).
  • the plasmid signal was 89%. This result shows that the type of two luminescent particles can be substantially distinguished by the translational diffusion feature amount.
  • each luminescent particle signal detected on the time-series light intensity data is diffused for each luminescent particle by the process described in “(ii) Calculation of diffusion coefficient of luminescent particle”. The coefficient was calculated.
  • phosphate buffer containing 0.05% Tween20
  • phosphate buffer with 1 pM plasmid pbr322 2.9MDa Takara Bio Inc. Cat. No. 3035
  • 10 nM DNA intercalator fluorescent dye SYTOX A solution containing Orange (Invitrogen Cat. No. S-11368) was prepared.
  • the light measurement and the individual detection of the luminescent particle signal were performed in the same manner as in Example 1. However, 633 nm laser light was used as excitation light.
  • a set of signals of the same luminescent particles is extracted, and the autocorrelation function value of Expression (9) is calculated for each set, and the calculated autocorrelation function value is calculated.
  • the equation (10) was fitted to calculate the diffusion coefficient D and the minor axis diameter Wo of the light detection region.
  • AR in Formula (10) was set to 3.5.
  • FIG. 9A shows an example of the peak intensity of each signal in the signal set identified as the signal of the same luminescent particle among the luminescent particle signals detected in the time-series light intensity data.
  • FIG. 9B shows the autocorrelation function value (plot point) and fitting curve (dotted line) of the peak intensity of the corresponding signal set, respectively.
  • Equation (10) was well fitted to the autocorrelation function value.
  • the calculated diffusion coefficient D and the minor axis diameter Wo of the light detection region were as follows.
  • the plasmid used for the measurement is considered to have a molecular shape in an aqueous solution between a spherical shape and a rod shape, and its diffusion coefficient is theoretically estimated to be 4.2 to 22 ⁇ 10 ⁇ 12 m 2 / s. Therefore, the above results agreed with the theoretical estimate.
  • the radius (Wo) of the light detection region (confocal volume) is about 0.4 ⁇ m by design, the above result almost coincided with the design value. From these results, in the scanning molecule counting method, it is possible to detect the signal of the same luminescent particle multiple times and to calculate the diffusion coefficient of the luminescent particle. It was shown that it was possible to identify light-emitting particles by obtaining information on various characteristics, that is, size (molecular weight, morphology).
  • an index representing the translational diffusion characteristics of luminescent particles in a plane perpendicular to the direction of movement of the light detection region in the scanning molecule counting method It has been shown that values can be determined individually for each luminescent particle and that such index values can be used in identifying or identifying the type of luminescent particle.

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Abstract

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、各パルス状信号に対応する発光粒子の種類の識別又は同定を可能にする手法が提供される。本発明による試料溶液中の発光粒子の光を検出する光分析技術では、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動し、光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成し、光強度データ上にて発光粒子の光の信号を個別に検出する。そして、一つの発光粒子の光の信号の強度値と時系列の光強度データにて前記の一つの発光粒子の光の信号の発生時間から計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値とに基づいて、光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける発光粒子の並進拡散特性を表す指標値が決定され、該指標値によって、発光粒子の同定が可能となる。

Description

単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
　本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１－３、非特許文献１－３参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）などが知られている。また、特許文献６～８には、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。
　更に、本願出願人は、特許文献９～１１に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合、端的に述べれば、試料溶液内に於ける光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）に浮遊する蛍光分子からの光を連続的に計測することにより得られた光強度データに対して統計的な演算処理が実行されて、蛍光分子の濃度及び／又はその他の特性が検出される。これに対し、特許文献９～１１に於いて提案された新規な光分析技術では、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。この光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）、更に、観測対象となる粒子の濃度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の良好に測定可能なレベル（１ｎＭ程度）よりも低い試料溶液に於いて、発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。かくして、「走査分子計数法」は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行でき、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等を良好に実行できない程度のより低い濃度の粒子の濃度及び／又は特性の検出が可能な強力なツールとして期待される。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特開２００９－２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報 国際公開第２０１１／１０８３６９ 国際公開第２０１１／１０８３７０ 国際公開第２０１１／１０８３７１
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要　１９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.　Kask,　K.　Palo,　D.　Ullmann,　K.　Gall　PNAS　96,　13756-13761　(1999)） アール・リグラー他３名、ヨーロピアン・バイオフィジカル・ジャーナル　１９９３年、２２巻、１６９－１７５頁（R.　Rigler,　U.　Mets,　J.　Widengren　and　P.　Kask，European　Biophysics　Journal,　1993,Volume22,Number3,Pages169-175） マーチャン他１名、インターナショナル・ジャーナル・オブ・モレキュラー・サイエンス、２０１０年、１１巻、４２７－４５７頁（R.Machan　and　M.Hof　Int.J.Mol.Sci.　2010,11,427-457）
　ところで、上記の走査分子計数法に於いては、共通の発光波長を有する互いに異なる種類の発光粒子について、それらの種類を、例えば、発光粒子の明るさ（同一の条件下での観測に於いて発光強度）によって互いに区別すること、或いは、「発光粒子の同定」（発光粒子の種類の特定若しくは識別或いは検出された発光粒子が如何なる発光粒子であるか若しくは何れの発光粒子であるかの確認若しくは決定）を行うことは困難である。走査分子計数法の場合、特許文献９～１１にも記載されているように、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときにその発光粒子の発した光が時系列の光強度データ上に於いてパルス状の信号として現れるので、一つのパルス状信号が一つの発光粒子に対応するとの仮定の下、時系列光強度データ上に於いてパルス状信号を個別に検出して、各発光粒子の存在が個別に検出される。かかる構成に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域から放出される検出光の強度（単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度）は、典型的には、励起光の空間的な分布及び／又は光学系の特性に起因して、光検出領域の略中心を頂点とした釣鐘型の分布を有するので、同一の発光粒子であっても光検出領域内に於ける位置によって、測定される発光強度が異なることとなる。そして、単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度が光検出領域に於ける発光粒子の位置によって異なることから、明るさの弱い粒子が励起光強度の強い部位を通過した場合と明るさの強い粒子が励起光強度の弱い部位を通過した場合とを、パルス状信号の発光強度の大きさによって区別することができない。即ち、走査分子計数法に於いて測定された発光強度の絶対的な値は、発光粒子の固有の値にはならず、単一の発光粒子の発光強度の違いを用いて共通の発光波長を有するが明るさが互いに異なる発光粒子を互いに識別できないこととなる。従って、複数の種類の発光粒子が混在する試料溶液の場合に、たとえ各発光粒子の明るさが互いに異なっていても、それらの発光粒子が共通の発光波長を有するときには、発光粒子を種類毎に識別しながら検出することができないこととなる。
　かくして、本発明の主な課題は、上記の走査分子計数法に於いて、各パルス状信号に対応する発光粒子の種類の識別又は同定を可能にする新規な手法を提供することである。
　上記の課題に関して、本発明の発明者等は、走査分子計数法に於いて、同一の発光粒子を複数回に亘って検出した場合、その信号の光強度が変化し、その光強度変化が発光粒子の拡散による移動に起因することを見出した。即ち、複数回に亘る信号の光強度変化は、発光粒子の拡散特性を反映しているので、複数回に亘る信号の光強度変化に基づいて、拡散特性による発光粒子の同定が可能となる。かかる知見は、本発明に於いて有利に利用される。
　かくして、本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて単一の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部が、検出された一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と時系列の光強度データに於いて前記の一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値とに基づいて、光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定することを特徴とする装置によって達成される。
　上記本発明の構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。また、典型的には、光検出部は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。更に、「一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域」とは、或る一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間に対して光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ加算又は減算した時間領域である。即ち、かかる時間領域は、繰り返し周回する光検出領域が、或る一つの発光粒子の存在した空間を通過した際の光の検出値が出現する時間領域（互いに同一の空間に対応するデータ）である。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
　上記の本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光の時系列データ（時系列光強度データ）に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在が一つずつ個別に検出され、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。
　かかる構成に於いて、既に述べた如く、光分析装置に於ける単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度は、光検出領域に於ける発光粒子の位置によって異なるため、信号の光強度の絶対的な値は、共通の発光波長を有するが明るさが互いに異なる発光粒子の種類の識別又は同定に直接的に利用できない。一方、光検出領域の位置を所定の経路に沿って周回した際に検出される同一の発光粒子の光強度の変化は、光検出領域の位置の周回の間に、光検出領域の移動方向に垂直な面内に於けるその発光粒子のブラウン運動による位置の変化（並進拡散移動）を反映し、後に詳細に述べる如く、光検出領域の周回移動に亘る発光粒子の光強度の変化からその発光粒子の並進拡散特性に関する情報を取得することが可能となる。そして、発光粒子の並進拡散特性は、その発光粒子の種類の識別又は同定に利用可能である。そこで、本発明に於いては、個々の発光粒子の並進拡散特性を検出するべく、同一の発光粒子が複数回に亘って検出されるように、光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動して光測定が実行される。そして、検出された一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と時系列の光強度データに於いて一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値とを参照して、即ち、光検出領域の周回移動の間に於ける一つの発光粒子が存在する空間からの一連の光の強度値、或いは、光検出領域の周回移動の間に於ける同一の発光粒子の一連の信号の強度値を参照して、それらの複数の光強度値に基づいて、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定し、これにより、かかる個々の発光粒子の種類の識別又は同定が試みられる。具体的には、上記の如く決定された発光粒子の並進拡散特性を表す指標値によって、発光粒子の種類が決定されるようになっていてよい。
　上記の本発明の構成の一つの態様に於いて、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値は、例えば、一つの発光粒子の信号の強度値とその一つの発光粒子の信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値の和との比であってよい。後の詳細な説明の欄にも示されている如く、一つの信号に対応する発光粒子の存在する空間は、その一つの発光粒子の信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域に於いて光検出領域に包含されることとなる。そして、一つの発光粒子の信号の強度値とその一つの発光粒子の信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値との関係、即ち、同一の空間から放出される光強度の変化は、光検出領域が周回する間の発光粒子のブラウン運動による移動の大きさの程度を表すこととなる。即ち、発光粒子の運動が遅いほど、一つの発光粒子の信号の強度値とその一つの発光粒子の信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値との間の変化、即ち、光検出領域が周回する間の同一の空間から放出される光強度の変化が小さくなる。従って、上記の如く、一つの発光粒子の信号の強度値とその一つの発光粒子の信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値の和との比を参照することによって、発光粒子の並進拡散特性が把握されることとなる。実際、後述の実施例に於いて示されている如く、一つの発光粒子の信号の強度値とその一つの発光粒子の信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値の和との比は、発光粒子の並進拡散のし易さによって変化することが見出された。かくして、かかる強度値の比が発光粒子の種類の識別又は同定のための指標値として採用されてよい。
　また、本発明の構成の別の態様に於いて、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値は、発光粒子の拡散係数又はその関数値であってよい。上記の説明から理解される如く、光検出領域の周回毎に検出される同一の発光粒子の信号の光強度の変化は、光検出領域の周回の間に於ける発光粒子の位置の変化に対応する。そして、光検出領域の周回毎の同一の発光粒子の信号の強度値から算定される時間に対する自己相関関数値は、光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける所与の拡散係数を有する単一発光粒子の並進拡散モデルから理論的に導出されるので、かかる並進拡散モデルから得られる理論式を信号の強度値の時間に対する自己相関関数値にフィッティングすることにより、単一発光粒子の拡散係数を算定することが可能である。そこで、本発明に於いては、時系列の光強度データに於いて一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値として、（かかる時間領域内にて発生した）その一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値を用い、かかる一つの発光粒子の光を表す信号の強度値とその一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値とから算定される時間に対する自己相関関数値に対して光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける発光粒子の並進拡散モデルから導出される理論式をフィッティングすることにより算定された拡散係数又はその関数値が、発光粒子の同定のための発光粒子の並進拡散特性を表す指標値として採用されてよい。即ち、光検出領域の移動周期毎に発生した発光粒子の信号は同一の発光粒子の信号であるので、それらの強度値の自己相関関数値に対して並進拡散モデルから導出される理論式をフィッティングして、発光粒子の拡散係数又はその関数値が決定され、かかる拡散係数又はその関数値が、発光粒子の同定のための指標値として採用されてよい。
　上記の本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの検出値の信号から１つの発光粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、光検出部にて検出された時系列の光を表す信号のプロファイルに基づいて為されてよい。この点に関し、実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。より具体的には、後の実施形態の欄にて説明される如く、通常、発光粒子からの光を表す信号のプロファイルは、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データに於いて、或る程度以上の強度を有する釣鐘型のパルス状となり、ノイズのプロファイルは、釣鐘型のパルス状ではないか、その強度が小さくなる。そこで、本発明の装置の信号処理部は、時系列光強度データ上に於いて、所定閾値を超える強度を有するパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。
　更に、本発明の装置の検出対象は、単一の発光粒子からの光であるため、光強度は、非常に微弱であり、一つの発光粒子が、蛍光一分子又は数分子などである場合、発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いて信号の値の欠落が生じる可能性がある。そして、そのような欠落が生ずると、一つの発光粒子の存在に対応する信号の特定が困難となる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、微小な時間に於ける信号値の欠落を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。なお、時系列光強度データに於いて、パルス状信号の存在する領域を目視等で人的に検出することは、非常に煩わしい操作となる。そこで、実施の形態に於いては、信号処理部が、平滑化された時系列光強度データの時間微分値に於いて釣鐘型のパルス状信号の存在領域を決定し、パルス状信号の存在領域に於ける平滑化された時系列光強度データに対して釣鐘型関数式をフィッティングして得られた強度値が所定閾値を超えるパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として判定するよう構成され、パルス状信号の存在する領域を目視等で人的に検出する手間が回避できるようになっていてよい。
　上記の本発明の装置に於ける試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散係数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
　更に、本発明の場合、複数回に亘って光検出領域が周回する間に同一の発光粒子を光検出領域内に周期的に包含できるようにする必要がある。そこで、光検出領域の移動周期は、一度検出された発光粒子がブラウン運動によって光検出領域の大きさに相当する距離を移動するのに要する時間よりも短くなるよう設定されることが好ましい。光検出領域の移動周期は、上記の移動速度と所定の経路の長さとを適宜調節することにより設定することが可能である。
　試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。特に、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更される場合、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点で有利である。
　上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。
　上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、単一発光粒子からの信号を個別に検出する光分析技術であって、同一の発光粒子の光を複数回に亘って検出し、その光強度の変化に基づいてその発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定する光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。
　従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する手順と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する手順と、光強度データ上に於いて単一の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する手順と、検出された一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と時系列の光強度データに於いて前記の一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値とに基づいて、光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける前記の発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。なお、コンピュータプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に記憶されて提供される。コンピュータは、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、上記の手順を実現する。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよい。更に、上述のプログラムは、通信回線によってコンピュータへ配信され、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。また上記の構成に於いて、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光が検出され、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである。また、この場合に於いても、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値によって発光粒子の種類を決定する手順が設けられていてよい。
　上記の構成に於いても、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値としては、一つの発光粒子の信号の強度値と前記の一つの発光粒子の信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値の和との比が採用されてよい。或いは、時系列の光強度データに於いて一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値として、かかる時間領域内に発生した一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値を用い、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値として、前記の一つの発光粒子の光を表す信号の強度値とその一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値とから算定される時間に対する自己相関関数値に対して光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける発光粒子の並進拡散モデルから導出される理論式をフィッティングすることにより算定された拡散係数又はその関数値が採用されてよい。
　また、上記のコンピュータプログラムに於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号のプロファイルに基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。具体的には、光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよく、好適には、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。そして、より詳細には、平滑化された時系列光強度データの時間微分値に於いて釣鐘型のパルス状信号の存在領域が決定され、かかるパルス状信号の存在領域に於ける平滑化された時系列光強度データに対して釣鐘型関数式をフィッティングして得られた強度値が所定閾値を超えるパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として判定されてよい。
　更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。また、光検出領域の位置の移動周期は、好適には、一度検出された発光粒子がブラウン運動によって光検出領域の大きさに相当する距離を移動するのに要する時間よりも短くなるよう設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。
　上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、個々の発光粒子の光の検出を行う光分析方法であって、同一の発光粒子の光を複数回に亘って検出し、その光強度の変化に基づいてその発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定する新規な方法が実現される。
　かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子の拡散特性値を測定する方法であって、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、光強度データ上に於いて単一の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程と、検出された一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と時系列の光強度データに於いて前記の一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値とに基づいて、光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける前記の発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定する過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。かかる方法に於いても、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光が検出され、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである。また、この場合に於いても、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値によって発光粒子の種類を決定する過程が設けられていてよい。
　そして、上記の構成に於いても、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値としては、一つの発光粒子の信号の強度値と前記の一つの発光粒子の信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値の和との比が採用されてよい。或いは、時系列の光強度データに於いて一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値として、かかる時間領域内に発生した一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値を用い、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値として、前記の一つの発光粒子の光を表す信号の強度値とその一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値とから算定される時間に対する自己相関関数値に対して光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける発光粒子の並進拡散モデルから導出される理論式をフィッティングすることにより算定された拡散係数又はその関数値が採用されてよい。
　更に、上記の方法に於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号のプロファイルに基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。具体的には、光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよく、好適には、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。そして、より詳細には、平滑化された時系列光強度データの時間微分値に於いて釣鐘型のパルス状信号の存在領域が決定され、かかるパルス状信号の存在領域に於ける平滑化された時系列光強度データに対して釣鐘型関数式をフィッティングして得られた強度値が所定閾値を超えるパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として判定されてよい。
　また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記の方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。
　上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　総じて、本発明によれば、走査分子計数法に於いて、発光粒子の並進拡散特性によって発光粒子の種類の識別又は同定が可能となる。本発明の手法は、例えば、粒子の種類毎に異なる発光波長を有するように発光粒子の調製を行うといった処理は必要なく、複数の種類の発光粒子を含む試料溶液の存在の検出、濃度の決定等に於いて有利である。
　ところで、試料溶液が複数の種類の発光粒子を含む場合、従前のＦＣＳやＦＩＤＡによっても、共通の発光波長を有する互いに異なる種類の発光粒子の識別は可能である。ＦＣＳの場合には、並進拡散時間が算出され、並進拡散時間は、粒子の拡散特性を表し、拡散特性の異なる複数種の発光粒子が混在する試料溶液に於いても、並進拡散時間を参照することで、複数種の発光粒子の割合や濃度を見積もることが可能である。また、ＦＩＤＡの場合には、単一発光粒子当たりの平均の発光強度が算定され、明るさの異なる複数種の発光粒子が混在する試料溶液に於いても、発光粒子の割合や濃度を種類毎に見積もることが可能である。この利点については、本発明も同様であるが、理解されるべきことは、本発明の場合は、単一の発光粒子毎に、その拡散特性が把握され、これにより、発光粒子毎にその同定が可能である。また、本発明では、ＦＣＳやＦＩＤＡの場合よりも大幅に濃度の低い発光粒子の同定が可能となるということである。かかる利点によれば、試料溶液中に於いて、複数種類の、存在数が少ない発光粒子が含まれる場合についても、各発光粒子の存在又は濃度を検出することができることとなる。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、顕微鏡の光の進行方向から見た光検出領域の断面の模式図であり、光検出領域ＣＶ内を通過する発光粒子を模式的に表している。図２(Ｄ）は、（Ｃ）の場合に計測される時系列の光強度データの例の模式図である。図２（Ｅ）は、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の空間分布を示している。 図３（Ａ）は、顕微鏡の光検出領域ＣＶの試料溶液内に於ける所定の経路に沿った移動により包含される空間領域の模式的な斜視図である。図３（Ｂ）は、光検出領域の周回の間の、光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける発光粒子の運動の例を模式的に表した図である。図３（Ｃ）は、光検出領域が所定の経路を循環する間に発光粒子が殆ど移動しない場合に検出される発光粒子からの光の強度を時間に対して模式的に表したグラフ図である。図３（Ｄ）は、光検出領域の寸法と発光粒子のブラウン運動による（光検出領域の一周期当たりの）変位との関係を説明する光検出領域の模式図である。 図４は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図５（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から単一の発光粒子に対応する信号を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図６は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図７（Ａ）は、本発明による並進拡散特長量（一つの発光粒子の信号強度と光検出領域の一周期前及び後の時間の光強度値の和との比）を決定する処理を説明する図である。図７（Ｂ）は、本発明による発行粒子の拡散係数の算定のために算出される光強度の自己相関関数の表式とプロット及びフィッティング曲線を示している。 図８（Ａ）は、本発明により改良された走査分子計数法（実施例１）に従って測定されたプラスミドと蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）の並進拡散特長量の平均値をグラフの形式にて示した図であり、図８（Ｂ）は、（Ａ）の並進拡散特長量のヒストグラム（頻度）をグラフの形式にて示した図である。 図９は、本発明により改良された走査分子計数法（実施例２）に従って計測された同一の発光粒子の信号強度（Ａ）とその自己相関関数値及びフィッティング曲線（Ｂ）の例をそれぞれ示している。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー等
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
光分析装置の構成
　本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
　観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらからの光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。更にまた、光の検出に関して、励起光として所定の方向に偏光した光が用いられ、検出光として励起光の偏光方向と垂直な方向の成分が選択されてよい。その場合、励起光光路には、ポーラライザ（図示せず）が挿入され、検出光光路に偏光ビームスプリッタ１４ａが挿入される。かかる構成によれば、検出光に於ける背景光を大幅に低減することが可能となる。
　コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
本発明の光分析技術の原理
　「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動し、同一の発光粒子の光を複数回に亘って検出し、その光強度の変化に基づいてその発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定し、これにより、かかる並進拡散特性を表す指標値によって、各発光粒子の種類の識別又は同定を可能にする。以下、本発明の走査分子計数法及びの並進拡散特性を表す指標値の算定の原理について説明する。
１.走査分子計数法の原理
　走査分子計数法に於いて実行される基本的な処理に於いては、特許文献９～１１に記載されている如く、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ～ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、従前のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
　ところで、上記の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域に於いては、光検出領域内の励起光の強度分布及び／又は対物レンズからピンホールを通過して光検出器に至るまでの光学系の特性に起因して、光検出領域を通過する発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度は、光検出領域ＣＶ内での発光粒子の位置によって異なっている。典型的には、光検出領域から放出され光検出器まで到達する光の強度の分布は、図２（Ｅ）にて例示されている如く、光検出領域（集光領域）の略中心にて最大となり（以下、最大強度の点を「最大強度点」と称する。）、最大強度点からの放射方向距離（半径ｒ）に対して釣鐘状の分布となる。即ち、明るさの同じ発光粒子（同一の条件下での観測に於いて発光強度が実質的に等しい発光粒子）であっても、その通過する位置によって、検出される光強度は異なる。例えば、図２（Ｃ）の如く、同じ明るさの発光粒子α、β、γが図示の位置にて光検出領域ＣＶを横切る場合、光検出領域の略中心を通過する発光粒子βの光強度は、発光粒子α、γの光強度よりも高くなる（図２（Ｄ）参照）。従って、発光粒子の信号の絶対的な強度値は、発光粒子の固有の値とならず、強度値の違いをそのまま発光粒子の種類の識別又は同定に利用することはできない。
２．発光粒子の並進拡散特性の検出
　上記の如く、発光粒子の信号の絶対的な強度値は、そのまま、発光粒子の種類の識別又は同定に利用できないが、「発明の概要」の欄に於いて触れた如く、同一の発光粒子の信号の強度値の変化は、発光粒子の位置の変化を反映したものとなっている。発光粒子の位置の変化は、発光粒子のブラウン運動に依るものであり、その位置の変化の速さは、その発光粒子の並進拡散特性に依存する。そこで、本発明に於いては、光検出領域の位置が周回移動する間に於ける同一の発光粒子の信号の強度の変化を検出し、かかる同一の発光粒子の信号の変化から発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を算定し、発光粒子の種類の識別又は同定に利用することが試みられる。
　具体的には、まず、図３（Ａ）に模式的に描かれている如く、光検出領域（ＣＶ）は、試料溶液中で、所定の経路（例えば、半径Ｒの円環）を通過するよう循環される。その際、一度検出された発光粒子（一度光検出領域に包含された発光粒子）が光検出領域の通過する空間領域から逸脱するよりも前に、光検出領域が発光粒子の検出された空間まで到達するように、光検出領域の移動周期（ｔcycle）が調整される。そうすると、光検出領域が所定の経路を周回する間に於いて、同一の発光粒子が光検出領域の通過する空間領域に存在している限り、その信号が、図３（Ｃ）の如く、光検出領域の移動周期ｔcycleに対応して周期的に検出され、その信号強度は、発光粒子の位置のブラウン運動による移動（図３（Ｂ）参照）に対応して発光粒子の位置によって変化する。そして、発光粒子の位置の変化、即ち、運動が速いほど、その信号強度の変化も大きくなるので、信号強度の変化から発光粒子の並進拡散特性が決定されることとなる。具体的な発光粒子の並進拡散特性を表す指標値の算定処理は、後述される。
　ところで、発光粒子の拡散係数が、光検出領域の移動周期ｔcycleに於ける発光粒子の（平均的な）変位が光検出領域の大きさを超えるほど大きい場合には、同一の発光粒子の信号を光検出領域の周回毎に捉えることが困難となる。なぜなら、光検出領域により一度包含された発光粒子は、その移動方向が、偶然、光検出領域の通過領域（所定の経路）に沿っていれば、光検出領域の周回後に再度光検出領域により包含されるが、発光粒子はランダムな方向に運動するので、光検出領域の一周期に於ける発光粒子の（平均的な）変位が光検出領域の大きさを超えるほど大きいときには、発光粒子は、光検出領域により一度包含された後、光検出領域の通過領域から逸脱し、光検出領域の周回後に再度光検出領域により包含されなくなる可能性が高いためである。従って、上記の拡散係数Ｄの算定を確実に達成するべく周期的な信号を捉えるためには、図３（Ｄ）に例示されている如く、光検出領域の移動周期ｔcycleに於ける発光粒子の（３次元の）変位ｌが光検出領域の直径２ｒを超えないように、光検出領域の移動周期ｔcycleが調整されることが好ましい。即ち、本発明の方法により拡散係数の測定をする場合には、好適には、光検出領域の移動周期ｔcycleは、
　　（２ｒ）２＞２δ・Ｄ・ｔcycle　　　…（１）
（ここで、δは、次元であり、ここでは、δ＝３である。）
を満たすよう調整される。なお、実際の測定に於いては、検査されるべき発光粒子の予想される拡散係数に於いて、上記の式（１）の条件が成立するよう光検出領域の移動周期ｔcycleが調整されてよい。
走査分子計数法の処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、（３）発光粒子信号の検出処理及び（４）発光粒子の並進拡散特性を表す指標値の算定処理が実行される。図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
（１）試料溶液の調製
　本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
（２）試料溶液の光強度の測定（図４－ステップ１００）
　本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。フォトンカウンティングに於けるビンタイムは、信号のプロファイルの釣鐘状の特徴が失われないように適宜設定される。
　光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、一般的には、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略同様となり（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。図６（Ａ）上段参照。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径ｒの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
　　（２ｒ）２＝６Ｄ・Δτ　　　…（２）
から、
　　Δτ＝（２ｒ）２／６Ｄ　　　…（３）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２ｒ／Δτ＝３Ｄ／ｒ　　　…（４）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、ｒが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（３）発光粒子の信号の個別検出（ステップ１１０～１６０）
　時系列光強度データが生成されると、まず、光強度データ上にて、発光粒子の信号を個別に検出する処理が実行される。既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
　　Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（５）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（５）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
　光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、光強度データ（図５（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４－ステップ１１０、図５（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。光強度データの時間微分値は、図５（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０～１６０）。具体的には、まず、光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図５（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か、例えば、下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞１．０［ｐｃ／１０μｓ］　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。
　上記のステップ１３０～１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
（４）発光粒子の並進拡散特性を表す指標値の算定処理（ステップ１７０）
　上記の如く、発光粒子の信号の個別検出が為されると、光検出領域の周回移動の間の各発光粒子からの光強度の変化を利用して、各発光粒子の並進拡散特性を表す指標値が算定される。かかる指標値としては、（ｉ）一つの発光粒子の信号の強度値とその一つの発光粒子の信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値の和との比（以下、「並進拡散特長量」と称する。）、或いは、（ii）発光粒子の拡散係数のいずれかが採用されてよい。以下、それぞれの指標値の算定処理について説明する。
（ｉ）「並進拡散特長量」の算定処理
　図３に関連して説明されている如く、光検出領域は、所定の経路を周期的に循環させられるので、時系列光強度データに於いて、光検出領域の移動周期毎に、同一の空間領域からの光強度値が計測されている。従って、ステップ１６０までに於いて検出された発光粒子の信号の各々の発生時間から計って光検出領域の移動周期に相当する時間だけ前の時間領域と、光検出領域の移動周期に相当する時間だけ後の時間領域とに於ける光強度値は、それぞれ、各信号に対応する発光粒子の存在した空間の一周期前及び後の状態を反映しており、空間内に於ける発光粒子の位置によって決定される。そして、発光粒子の信号の光強度値と、その信号の発生時間から計って光検出領域の移動周期に相当する時間だけ前の時間領域及び後の時間領域とに於けるそれぞれの光強度値とを比較することにより、光検出領域の移動周期に於ける発光粒子の位置の変化のし易さ、即ち、発光粒子の並進拡散のし易さが見積もられることとなる。
　そこで、本実施形態に於いては、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値として、ステップ１６０までに於いて検出された発光粒子の信号の各々について、信号の光強度値と、各信号の前後の光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の光強度値の和との比（並進拡散特長量）が採用される。並進拡散特長量は、具体的には、一つの発光粒子の信号のパルス存在領域に於ける光子数ｐｃと、光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ前の時間領域ΔＴｆに於ける光子数ｐ－１と、光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ後の時間領域ΔＴｒに於ける光子数ｐ＋１とから、
　　（並進拡散特長量）＝（ｐ－１＋ｐ＋１）／ｐｃ　　　…（６）
によって定義されてよい。なお、時間領域ΔＴｆ、ΔＴｒの幅は、実験的に又は理論的に任意に設定されてよく、典型的には、光検出領域の最大径に相当する距離を光検出領域が通過するのに要する時間であってよい。この並進拡散特長量によれば、図７（Ａ）に模式的に描かれている如く、比較的大きい粒子の場合（左図）、ブラウン運動による移動速度は遅く、同一の空間領域内に滞留する時間が長いので、信号に於ける光強度（光子数ｐｃ）とその信号の発生時間よりも光検出領域の位置の移動周期ｔcycleだけ前及び後の時間領域内の光強度（光子数ｐ－１、ｐ＋１）との差は比較的小さく、従って、式（６）で定義される並進拡散特長量は、大きくなる。一方、比較的小さい粒子の場合（右図）、ブラウン運動による移動速度は速く、同一の空間領域内に滞留する時間が短いので、信号に於ける光強度（光子数ｐｃ）とその信号の発生時間よりも光検出領域の位置の移動周期ｔcycleだけ前及び後の時間領域内の光強度（光子数ｐ－１、ｐ＋１）との差は比較的大きくなり、或いは、発光粒子が同一空間内に存在しない場合もあるので、従って、式（６）で定義される並進拡散特長量は小さくなる。かくして、並進拡散特長量は、発光粒子の並進拡散特性を表しており、発光粒子に固有の値となるので、発光粒子の種類の識別又は同定に利用できることとなる。
（ii）発光粒子の拡散係数の算定処理
　図３（Ａ）～（Ｃ）を再度参照して、図３（Ａ）の如く、光検出領域を循環させる間、発光粒子が、或る位置に光検出領域ＣＶが存在するときに包含される空間内にて滞留しているとき、発光粒子の信号（パルス状の信号）は、図３（Ｃ）に例示されている如く、概ね光検出領域の移動周期ｔcycle毎に出現する。その間、既に述べた如く、発光粒子の位置はブラウン運動により変化するので、一連の信号の光強度は変化することとなる。この点に関し、かかる光強度の変化は、発光粒子の光検出領域の最大強度点から放射方向の位置の変化を反映したものであるところ、光検出領域が一方向に移動しているので、各信号のピーク強度の変化は、図３（Ｂ）に例示されている如き光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける発光粒子の並進拡散運動によるものであるとみなすことができる。
　光検出領域の移動方向に垂直な面内於いて、発光粒子の並進拡散運動が、二次元のブラウン運動による並進拡散モデルに従うとすると、拡散係数Ｄの発光粒子の光強度の時間に対する自己相関関数は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 により与えられる（非特許文献５、６）。ここで、Ｎは、光検出領域内の平均粒子数であり、τは、遅延時間であり、Ｗｏは、光検出領域の短軸径であり、Ｗｚは、光検出領域の長軸径である（図１（Ｂ）参照）。本発明の場合、Ｎ＝１であり、また、ＡＲ＝Ｗｚ／Ｗｏとすると、式（７）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 となる。一方、発光粒子の信号の光強度から算出される時間に対する自己相関関数は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 により計算される。
　かくして、本実施形態に於いては、まず、ステップ１６０までに於いて検出された発光粒子の信号に於いて、光検出領域の移動周期毎に出現する信号の組を抽出する。かかる抽出に於いては、時系列光強度データに於いて、一つの発光粒子の信号を選択し、その信号の発生時間からから計って光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内に存在する発光粒子の信号を同一の発光粒子の信号と見做して選択し、一つの発光粒子の信号の組としてよい。また、かかる操作は、時系列光強度データ全域に亘って実行され、従って、一つの時系列光強度データに於いて、単一の発光粒子の信号の組が複数組抽出されてよい。かくして、発光粒子の信号の組が抽出されると、図７（Ｂ）に示されている如く、各組の光強度の自己相関関数値が式（９）により算出され、しかる後に、上記に説明された並進拡散モデルから導出された理論式（図中、点線）が自己相関関数値（図中、プロット点）に対してフィッティングされ、拡散係数Ｄが算定される。かかる一連の処理に於いて、光強度の自己相関関数値の算出では、Δｔ＝ｔcycleとして、図７（Ｂ）中に示されている如く、発光粒子の信号の組に於いて、発生時間が１周期離れた信号の組（τ＝Δｔ）、２周期離れた信号の組（τ＝２Δｔ）、３周期離れた信号の組（τ＝３Δｔ）、…のそれぞれについて、式（９）に対応して自己相関関数値が算出されてよい（従って、τの大きさと共に式（９）の分子の項数は低減する。）。また、並進拡散モデルから導出された理論式について、本実施形態の場合、自己相関関数値を算出する光強度値の点数と算出される自己相関関数値の点数が比較的少なく、式（７）、（８）を良好にフィッティングすることが困難である。そこで、本実施形態に於いて、好適には、理論式（８）に於ける変化を特徴付ける項である第２項のみが自己相関関数値へフィッティングさせられてよい。即ち、フィッティング式として、式（８）を下記の如く修正した式が用いられてよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 ここで、Ｋは、定数であり、フィッティングにより決定される。なお、フィッティングに於いて、拡散係数Ｄではなく、例えば、拡散係数に定数が乗算された関数値等が算定されてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　かくして、上記の（ｉ）並進拡散特長量又は（ii）拡散係数（又はその関数値）が、発光粒子毎に決定される。既に述べた如く、これらの値は、発光粒子に固有の値とすることができるので、これらの値により、発光粒子毎にその種類の識別又は同定が可能となる。
（５）その他の分析
　上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、更に、発光粒子濃度算出等の各種分析が実行されてよい。
　例えば、検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される。光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
　　　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　…（１１）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
　　　ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　…（１２）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（１２））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。理解されるべきことは、本発明によれば、並進拡散特長量又は拡散係数により、単一発光粒子毎に種類の識別又は同定が可能なので、濃度についても、発光粒子の（識別可能な）種類毎に決定できるという点である。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
　走査分子計数法に於いて、時系列光強度データ上で検出された発光粒子の信号の各々について、式（６）にて定義される並進拡散特長量を算定した。
　試料溶液として、リン酸緩衝液（０．０５％　Tween20を含む）に発光粒子として蛍光色素TAMRA(Ｍ．Ｗ．４３０．４５　Sigma-Aldrich　Cat.No.C2734)を１００ｆＭにて含む溶液と、リン酸緩衝液に１ｐＭのプラスミド（pbr322　２．９ＭＤａ　タカラバイオ株式会社　Cat.No.3035）と１０ｎＭのＤＮＡインターカレータ蛍光色素SYTOX　Orange（インビトロジェン社　Cat.No.S-11368）を含む溶液（SYTOX　Orangeが単一のプラスミドに結合して単一の発光粒子となる。）を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の二つの試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、５４３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、５６０－６２０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列フォトンカウントデータを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、６０００ｒｐｍ（１５ｍｍ／秒）とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、２秒間の測定を行った。
　光計測後のデータ処理に於いては、まず、取得された時系列フォトンカウントデータに於いて、「（３）発光粒子の信号の個別検出」及び図４のステップ１１０～１６０に記載された要領に従って、時系列フォトンカウントデータにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞１［ｐｃ／１０μｓ］　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子の信号として抽出した。次いで、各発光粒子信号について、式（６）の並進拡散特長量を算出した。光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ前の時間領域ΔＴｆは、信号のピーク時の１０．０５～９．９５ｍ秒前の区間とし、光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ後の時間領域ΔＴｒは、信号のピーク時の９．９５～１０．０５ｍ秒後の区間とした。
　図８（Ａ）は、蛍光色素分子TAMRAと、SYTOX　Orangeにて染色されたプラスミドの並進拡散特長量の平均値（棒グラフ）と標準偏差（エラーバー）を示し、図８（Ｂ）は、並進拡散特長量の発生頻度（ヒストグラム）を示している。同図を参照して、並進拡散特長量については、大きくて動きの遅いプラスミドの並進拡散特長量の平均値（０．８７）は、小さくて動きの速い蛍光色素分子TAMRAの並進拡散特長量の平均値（０．１８）よりも大幅に大きな値となった。また、ヒストグラムを参照して明らかな如く、プラスミドの並進拡散特長量と蛍光色素分子TAMRAの並進拡散特長量とのヒストグラムの重複部分は少なかった。実際、プラスミドの並進拡散特長量の平均値から１ＳＤを減算した０．６を基準値にすると、基準値以下の信号（蛍光色素分子TAMRAの信号として判定される信号）のうち、蛍光色素分子TAMRAの信号は８５％であり、基準値以上の信号（プラスミドの信号として判定される信号）のうち、プラスミドの信号は、８９％となった。この結果は、並進拡散特長量によって二つの発光粒子の種類の識別が実質的に可能であることを示している。
　走査分子計数法に於いて、時系列光強度データ上で検出された発光粒子の信号の各々について、「（ii）発光粒子の拡散係数の算定処理」に記載した処理により、発光粒子毎に拡散係数を算定した。
　試料溶液として、リン酸緩衝液（０．０５％　Tween20を含む）にリン酸緩衝液に１ｐＭのプラスミド（pbr322　２．９ＭＤａ　タカラバイオ株式会社　Cat.No.3035）と１０ｎＭのＤＮＡインターカレータ蛍光色素SYTOX　Orange（インビトロジェン社　Cat.No.S-11368）を含む溶液を調製した。光の測定及び発光粒子信号の個別検出は、実施例１と同様に行った。ただし、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用いた。しかる後、検出された発光粒子信号のうち、同一の発光粒子の信号の組を抽出し、それぞれの組毎に、式（９）の自己相関関数値を算出し、算出された自己相関関数値に対して、式（１０）をフィッティングし、拡散係数Ｄと光検出領域の短軸径Ｗｏを算定した。なお、式（１０）中のＡＲは、３．５とした。
　図９（Ａ）は、それぞれ、時系列光強度データに於いて検出された発光粒子信号のうち、同一の発光粒子の信号であると特定された信号組に於ける各信号のピーク強度の例を示しており、図９（Ｂ）は、それぞれ、対応する信号組のピーク強度の自己相関関数値（プロット点）とフィッティング曲線（点線）を示している。同図を参照して、式（１０）は、自己相関関数値に対して良好にフィッティングされた。そして、図示の例に於いて、算定された拡散係数Ｄと光検出領域の短軸径Ｗｏは、以下の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　計測に用いたプラスミドは、水溶液中における分子の形体が球状と棒状の間にあると考えられ、その拡散係数は、理論的には、４．２～２２×１０－１２ｍ２／sと見積もられるので、上記の結果は、理論的な見積りに一致した。また、光検出領域（コンフォーカル・ボリューム）の半径（Ｗｏ）は、設計上、約０．４μｍであるので、上記の結果は、設計値に略一致した。これらの結果から、走査分子計数法において、同一の発光粒子の信号を複数回に亘って検出し、発光粒子の拡散係数を算定することが可能であり、これにより、粒子の水溶液中における動的な特性、つまり大きさ（分子量、形態）に関する情報が得られ、発光粒子の同定が可能となることが示された。
　かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、走査分子計数法に於いて光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を各発光粒子について個別に決定することが可能であり、かかる指標値は、発光粒子の種類の識別又は同定で利用できることが視示された。

Claims (12)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する光検出領域移動部と、
    　前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて単一の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
    　前記信号処理部が、前記検出された一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と前記時系列の光強度データに於いて前記一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って前記光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値とに基づいて、前記光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定することを特徴とする装置。
  2. 　請求項１の装置であって、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値によって前記発光粒子の種類を決定することを特徴とする装置。
  3. 　請求項１の装置であって、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値が一つの発光粒子の信号の強度値と前記一つの発光粒子の信号の前後の前記光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値の和との比であることを特徴とする装置。
  4. 　請求項１の装置であって、前記時系列の光強度データに於いて前記一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って前記光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値が、前記時間領域内に発生した前記一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値であり、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値が、前記一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と前記一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値とから算定される時間に対する自己相関関数値に対して前記光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける前記発光粒子の並進拡散モデルから導出される理論式をフィッティングすることにより算定された拡散係数又はその関数値であることを特徴とする装置。
  5. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子の拡散特性値を測定する方法であって、
    　前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、
    　前記光強度データ上に於いて単一の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程と、
    　前記検出された一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と前記時系列の光強度データに於いて前記一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って前記光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値とに基づいて、前記光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定する過程と
    を含むことを特徴とする方法。
  6. 　請求項５の方法であって、更に、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値によって前記発光粒子の種類を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
  7. 　請求項５の方法であって、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値が一つの発光粒子の信号の強度値と前記一つの発光粒子の信号の前後の前記光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値の和との比であることを特徴とする方法。
  8. 　請求項５の方法であって、前記時系列の光強度データに於いて前記一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って前記光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値が、前記時間領域内に発生した前記一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値であり、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値が、前記一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と前記一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値とから算定される時間に対する自己相関関数値に対して前記光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける前記発光粒子の並進拡散モデルから導出される理論式をフィッティングすることにより算定された拡散係数又はその関数値であることを特徴とする方法。
  9. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
    　前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する手順と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する手順と、
    　前記光強度データ上に於いて単一の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する手順と、
    　前記検出された一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と前記時系列の光強度データに於いて前記一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って前記光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値とに基づいて、前記光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値を決定する手順と
    をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  10. 　請求項９のコンピュータプログラムであって、更に、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値によって前記発光粒子の種類を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  11. 　請求項９のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値が一つの発光粒子の信号の強度値と前記一つの発光粒子の信号の前後の前記光検出領域の位置の移動周期に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値の和との比であることを特徴とするコンピュータプログラム。
  12. 　請求項９のコンピュータプログラムであって、前記時系列の光強度データに於いて前記一つの発光粒子の光を表す信号の発生時間から計って前記光検出領域の位置の移動周期の整数倍に相当する時間だけ離れた時間領域内の強度値が、前記時間領域内に発生した前記一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値であり、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値が、前記一つの発光粒子の光を表す信号の強度値と前記一つの発光粒子と同一の発光粒子の光を表す信号の強度値とから算定される時間に対する自己相関関数値に対して前記光検出領域の移動方向に垂直な面内に於ける前記発光粒子の並進拡散モデルから導出される理論式をフィッティングすることにより算定された拡散係数又はその関数値であることを特徴とするコンピュータプログラム。
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