WO2013118519A1 - 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム - Google Patents

光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム Download PDF

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拓哉 葉梨
田邊哲也
山口光城
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Definitions

  • the present invention uses an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, and uses atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in a solution ( These are hereinafter referred to as “particles”), for example, biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate objects such as viruses and cells, or non- More about single particle detection technology that can detect biological particles and obtain useful information in analysis or analysis of their state (interaction, binding / dissociation state, etc.)
  • a single particle detection device a single particle which enables various analyzes by detecting a single particle by measuring a change in light intensity due to the presence of a single particle using the optical system as described above. Detection method and single particle detection computer According to another program.
  • Such optical analysis techniques include, for example, fluorescence correlation spectroscopy (FCS; see, for example, Patent Literature 1-3 and Non-Patent Literature 1-3), and fluorescence intensity distribution analysis (Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA, for example, Patent Document 4, Non-Patent Document 4) and Photon Counting Histogram (PCH, for example, Patent Document 5) are known.
  • Patent Documents 6 to 8 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • the applicant of the present application described in Patent Documents 9 to 11 is an optical analysis technique using an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a new optical analysis technique based on a principle different from optical analysis techniques such as FCS and FIDA has been proposed.
  • optical analysis techniques such as FCS and FIDA
  • fluorescent molecules floating in a minute region hereinafter referred to as “light detection region” that is a light detection region in a sample solution.
  • Statistical calculation processing is executed on the light intensity data obtained by continuously measuring the light, and the concentration and / or other characteristics of the fluorescent molecules are detected.
  • the position of the light detection region is moved in the sample solution, that is, the sample solution is scanned by the light detection region.
  • the light detection region includes particles (light-emitting particles) that emit light that randomly moves by being dispersed in the sample solution, the light emitted from the light-emitting particles is individually detected, thereby It is possible to detect each of the luminescent particles one by one and to obtain information on the counting of the luminescent particles and the concentration or number density of the luminescent particles in the sample solution.
  • the sample required for the measurement is a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L) as in the optical analysis techniques such as FCS and FIDA.
  • the measurement time is short (measurement of time in the order of seconds is repeated several times in one measurement), and the concentration of particles to be observed is the same as that of optical analysis technology such as FCS and FIDA. It is possible to detect the presence of luminescent particles in a sample solution lower than a well measurable level (about 1 nM) and quantitatively detect its concentration, number density or other characteristics.
  • the “scanning molecule counting method” is used for analysis of rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, clinical diagnosis of diseases, screening of bioactive substances, etc.
  • the number of specimens is large, it is possible to perform experiments or tests at a lower cost or more quickly than conventional biochemical methods, and at a lower concentration so that FCS, FIDA, etc. cannot be performed well. It is expected to be a powerful tool capable of detecting the concentration and / or properties of
  • the scanning molecule counting method that individually detects the light of single particles that emit light as described above, the light from the single particles is weak, and is easily affected by stray light or Raman scattering of water. That is, in the case of an analysis method for identifying an increase in light intensity value representing light emitted from a luminescent particle as a signal of the luminescent particle, light due to stray light or water Raman scattering may be erroneously identified as a signal of the luminescent particle. is there. In the case of a scanning molecule counting method that detects light of a single particle, particles to be observed (observed particles) are limited to luminescent particles.
  • luminescent labels fluorescent labels, phosphorescent labels, etc.
  • the observation target particle may be denatured by applying a luminescent label.
  • the detection of light is performed in the same manner as the ⁇ molecular counting method '', and the presence of a single particle is detected by detecting the shadow of the single particle when a single particle that does not emit light is included in the light detection region.
  • An “inverted scanning molecule counting method” was proposed. According to the “inverted scanning molecule counting method”, stray light or Raman scattered light is not erroneously detected as a signal of an observation target particle, and a single particle that does not emit light at a low concentration can be detected.
  • the particles to be observed of the present invention have a light emission wavelength characteristic that emits light in a specific wavelength band but hardly emits light in another wavelength band. Therefore, when multiple types of particles coexist in the same sample solution, if the wavelength bands that do not emit light of these particles are different, light detection is performed in the “inverted scanning molecule counting method”.
  • the detection wavelength of the light in the region to each of the wavelength bands where there is no light emission of the plurality of types of particles
  • the specific wavelength of the plurality of types of particles mixed in the sample solution corresponding to the detection wavelength It becomes possible to detect the types of particles separately, and the particles can be detected while identifying the types.
  • the main problem of the present invention is that when a plurality of types of particles are mixed in the same sample solution, the principle of the inverted scanning molecule counting method is used to select a specific type of the plurality of types. It is to provide a single particle detection technique based on a novel principle that makes it possible to detect single particles while detecting particles or identifying types.
  • the above-described problem is solved by using a confocal microscope or an optical system of a multiphoton microscope to detect a single particle that is dispersed in a sample solution and randomly moves.
  • a light detection region moving unit that moves the position of the light detection region of the optical system of the microscope in the sample solution, a light detection unit that detects light from the light detection region, and the sample solution Generate time-series light intensity data of light from the light detection area detected by the light detection unit while moving the position of the light detection area, and each single particle in the time-series light intensity data
  • a signal processing unit that individually detects a signal that represents a first particle in which a single particle does not emit light in the first wavelength band but emits light in a second wavelength band different from the first wavelength band.
  • the signal representing the presence of each of the single particles, including the background light is a decrease in the light intensity detected by the light detection unit that occurs when the first single particle enters the light detection region,
  • the wavelength band of the light detected by the light detection unit is the second wavelength band
  • the light from the light detection region includes a substantially constant background light in the second wavelength band
  • each of the single particles The signal representing the presence is achieved by an apparatus characterized by a decrease in light intensity detected by the light detection unit that occurs when the second single particle enters the light detection region.
  • “single particles that are dispersed in the sample solution and randomly move” are atoms, molecules, or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution and fixed to the substrate or the like. Any particle may be used as long as it is a particle that freely performs Brownian motion in the solution.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes. When illumination light is given from an objective lens, the illumination light is Corresponds to the focused region (in a confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole).
  • the light from the light detection region includes substantially constant background light in the first (second) wavelength band,” and “the wavelength band of the detection light is set to the first (second) wavelength band”
  • the intensity value of the detection light that is, background light
  • the background light is adjusted such that the fluctuation is sufficiently smaller than the decrease in the intensity of the detection light that occurs when a single particle enters the light detection region.
  • a single particle that does not “emit substantially in the first (second) wavelength band” means a single particle whose emission intensity in the corresponding wavelength band is sufficiently smaller than the background light. means.
  • the emission intensity of such single particles is preferably almost zero, but may be acceptable even at a level significantly lower than the intensity of background light.
  • the term “single particle signal” refers to a signal indicating the presence of a single particle unless otherwise specified.
  • the position of the light detection region is moved in the sample solution, that is, the sample.
  • the light is sequentially detected while scanning the inside of the solution with the light detection region.
  • the light from the light detection region includes background light having a significant intensity in the wavelength band of the detection light
  • single particles that do not emit light in the wavelength band of the detection light are light.
  • the light from the light detection region due to the presence of a single particle when entering the detection region or when the light detection region moving within the sample solution includes single particles that do not emit light in the wavelength band of the detection light.
  • the light intensity or light quantity of the background light that reaches the detection unit will decrease.
  • a single particle that emits light in the wavelength band of the detection light is present in the light detection region, it is mixed with the background light and almost no decrease in light intensity or light amount is detected.
  • a single particle does not emit light in the first wavelength band but emits light in the second wavelength band, and light emission in the first wavelength band.
  • the wavelength band of the detection light is changed to the first wavelength band.
  • the wavelength band is set, and the decrease in the light intensity or light quantity of the background light is individually detected as a single particle signal, whereby the presence of the particles is detected individually and sequentially one by one.
  • the wavelength band of the detection light is set to the second wavelength band, and the decrease in light intensity or light quantity of the background light is individually detected as a single particle signal.
  • the presence of particles is detected individually and sequentially.
  • different particles in the sample solution that is, the first and second particles are detected separately, that is, for each type, and for each type, various information regarding the state of the particles in the solution is obtained. Will be acquired.
  • the device of the present invention detects, for each specific wavelength band, the shadow of a single particle that does not emit light in that specific wavelength band in a region where a certain background light exists. By this, single particles are detected individually.
  • the background light to be included in the light from the light detection region is fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, or scattered light caused by a substance dispersed in the sample solution. It may be.
  • the substance that emits or scatters light when the substance that emits or scatters light is not dispersed in the solution used as the sample solution, the substance that actively emits or scatters light may be dissolved or dispersed in the solution.
  • the solution used as the sample solution emits autofluorescence
  • the autofluorescence may be used as the background light.
  • the microscope apparatus is equipped with a light source and an optical system for illumination light.
  • the background light may be illumination light by transmitted illumination or the like if it is reduced when a single particle is present in the light detection region.
  • the degree of background light reduction is determined by the size of the single particle and the size of the light detection region. Depends on the relationship.
  • the outer diameter of the single particle to be observed is preferably 15% or more of the diameter of the light detection region, and more preferably, the outer diameter of the single particle. Has been found to be 35% or more of the diameter of the light detection region.
  • single particles that emit light in the wavelength band of the detection light that is not the object of observation have an intensity substantially equal to the intensity of the background light. It is preferable to have. This is because if the difference between the light intensity of a single particle that is not the object of observation and the intensity of the background light is large, it affects the detection of the signal of the single particle that is the object of observation in the light intensity data. (If the brightness of a single particle that emits light in the wavelength band of detection light is excessive, the background light value will be excessively calculated, and the brightness of the single particle that emits light in the wavelength band of detection light.
  • the intensity of the background light and the light from the second single particle are substantially equal.
  • the intensity of the background light is adjusted so that Such background light adjustment may be achieved, for example, by dispersing a luminescent material in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution in the apparatus of the present invention may be appropriately changed based on the characteristics of single particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the moving speed of the light detection region is increased, the degree of decrease in light intensity or light amount due to the presence of a single particle is reduced. Therefore, the decrease in light intensity or light amount due to a single particle is accurate or sensitive. It is preferable that the moving speed of the light detection region can be changed as appropriate so that measurement can be performed.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set higher than the diffusion moving speed of the single particles to be detected (average moving speed of particles due to Brownian motion).
  • the device of the present invention detects the reduction of background light due to the presence of a single particle when the light detection region passes through the position where the single particle exists, and individually separates the single particle. To detect.
  • a single particle moves randomly in the solution due to Brownian motion and enters and exits the photodetection region multiple times, the presence of the signal is detected multiple times from one single particle. Therefore, it becomes difficult to make the detected signal correspond to the presence of one single particle.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the single particle, thereby making one single particle correspond to one signal (representing the presence of a single particle). It becomes possible. Since the diffusion movement speed varies depending on the characteristics of the single particle, as described above, the apparatus of the present invention appropriately changes the movement speed of the light detection region according to the characteristics of the single particle (particularly, the diffusion constant). It is preferable that it is configured to be possible.
  • the movement of the position of the light detection region in the sample solution may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path of the optical system of the microscope by using a galvanometer mirror adopted in a laser scanning optical microscope, or
  • the position of the sample solution may be moved (for example, by moving a microscope stage) to move the relative position of the light detection region in the sample solution.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the signal processing unit of the apparatus of the present invention determines whether or not one particle has entered the light detection region from the detection value signal from the sequential light detection unit. May be based on the shape of the signal representing the time-series light detected at. In an embodiment, it is typically determined that a single particle has entered the light detection region when a signal having a light intensity lower than a predetermined threshold, as measured from the intensity of the background light, is detected. Good. More specifically, as will be described later in the section of the embodiment, the signal indicating the presence of a single particle is usually a time-series detection value of the light detection unit, that is, light intensity data.
  • the signal processing unit of the apparatus of the present invention generates a bell-shaped pulse-shaped signal that is lower than a predetermined threshold value measured from the intensity of background light on the time-series light intensity data, and the presence of a single particle. It may be configured to detect as a signal representing.
  • the “predetermined threshold value” can be set to an appropriate value experimentally.
  • the signal processing unit smoothes the time-series light intensity data, processes the data so that the fine increase / decrease in the light intensity can be ignored, and then determines the background light intensity in the smoothed time-series light intensity data. It may be configured to detect a downwardly convex bell-shaped pulse signal having an intensity below a predetermined threshold, as a signal representing the presence of a single particle.
  • the number of single particles included in the light detection region may be counted by counting the number of signals (particle counting).
  • information on the number density or concentration of the identified single particles in the sample solution can be obtained by combining the number of detected single particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the number density or concentration ratio of a plurality of sample solutions, or the relative number density or concentration ratio with respect to the standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated, or An absolute number density value or concentration value may be determined using a relative number density or concentration ratio relative to a standard sample solution that is a reference for concentration or number density.
  • the total volume of the movement locus of the position of the light detection region is specified by any method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of single particles Can be calculated specifically.
  • the concentration of single particles having different wavelength bands that do not emit light and are mixed in the same sample solution it is possible to separately count and / or calculate the concentration of single particles having different wavelength bands that do not emit light and are mixed in the same sample solution.
  • the number of single particle signals obtained during an arbitrarily set measurement time is counted.
  • the number of single particle signals detected varies depending on the length of the set measurement time.
  • the single particle value calculated from the number of detection signals is low.
  • the variation of the density value becomes large and the accuracy can be lowered. Therefore, in the above-described apparatus of the present invention, as another aspect of particle counting, measurement is performed until the number of signals of a single particle reaches an arbitrarily set number.
  • One particle concentration value may be calculated.
  • the above-described apparatus allows the position of the light detection region of the optical system by the light detection region moving unit until the number of signals indicating the presence of single particles detected by the signal processing unit reaches a predetermined number.
  • the number representing the presence of a single particle signal is determined in advance by repeating the movement of the light, the detection of light from the light detection region by the light detection unit, and the detection of the signal indicating the presence of a single particle by the signal processing unit. May be configured to determine the concentration of a single particle in the sample solution based on the time taken to reach the number. In this case, shortening of the measurement time for a single particle high-concentration sample solution is expected, and the measurement for a single particle low-concentration sample solution is performed with sufficient time.
  • measurement time is optimized according to the density
  • a predetermined number is set to a number that achieves the accuracy required for the result, the time required to detect the predetermined number of single particles or any result derived therefrom can be obtained. Variations in this are suppressed to a small level, and the accuracy of the result can be satisfied.
  • the position of the light detection region is moved in the sample solution in which single particles having different wavelength bands that do not emit light are mixed.
  • Light detection is performed in the presence of background light, and a decrease in light intensity or light quantity of background light is individually detected as a single particle signal, so that it is single for each type (for each wavelength band that does not emit light).
  • the processing of the single particle detection technique for sequentially detecting the presence of particles one by one can be realized by a general-purpose computer. Therefore, according to another aspect of the present invention, a single particle detection computer program for detecting single particles that are dispersed in a sample solution and randomly move using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the procedure for moving the position of the light detection area of the microscope optical system in the sample solution and the light from the light detection area are detected while moving the position of the light detection area in the sample solution.
  • the computer executes a procedure for generating time-series light intensity data and a procedure for individually detecting signals representing the presence of each single particle in the time-series light intensity data.
  • the light from the light detection region includes a substantially constant background light in the second wavelength band, and a signal representative of the presence of each single particle is
  • a computer program characterized by a decrease in light intensity in light intensity data generated when entering a light detection area.
  • the computer program is stored in a computer-readable storage medium and provided.
  • the computer implements the above-described procedure by reading a program stored in a storage medium and executing information processing / arithmetic processing.
  • the computer-readable recording medium may be a magnetic disk, a magneto-optical disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a semiconductor memory, or the like.
  • the above-described program may be distributed to a computer via a communication line, and the computer that has received this distribution may execute the program.
  • the background light may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or illumination light by a substance dispersed in the sample solution.
  • the intensity of such background light is preferably such that when the wavelength band of the detected light is the first wavelength band, the intensity of the background light and the light intensity from the second single particle are substantially equal,
  • the wavelength band of the detected light is the second wavelength band, for example, luminescent particles are placed in the sample solution so that the intensity of the background light is substantially equal to the light intensity from the first single particle.
  • the intensity of the background light is adjusted by dispersing the light.
  • the outer diameter of the single particle is preferably 15% or more of the diameter of the photodetection region, and more preferably 35% or more of the diameter of the photodetection region.
  • the individual detection of the signal representing the presence of each single particle may be performed based on the shape of the time-series signal.
  • a signal having a light intensity lower than a predetermined threshold measured from the background light intensity is detected. It may be determined that one single particle has entered the light detection region.
  • a downwardly convex bell having an intensity below a predetermined threshold measured from the intensity of background light in time-series light intensity data is detected.
  • a pulse signal of the type may be detected as a signal representing the presence of a single particle, in which case the time-series light intensity data is smoothed and the downwardly convex bell in the smoothed time-series light intensity data.
  • a type of pulsed signal may be detected as a signal representing the presence of a single particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the single particle, the number density or concentration in the sample solution, and preferably in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the light detection region at is set higher than the diffusion moving speed of the single particle to be detected.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. May be changed.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • particle counting the number of single particle signals obtained during an arbitrarily set measurement time is typically counted. The measurement may be performed until the number of signals of one particle reaches an arbitrarily set number, and the single particle concentration value may be calculated based on the measurement time.
  • the above computer program also moves the position of the light detection region, detects light from the light detection region, and detects single particles until the number of signals indicating the presence of single particles reaches a predetermined number. Detection of a signal representing the presence of a single particle, and determining the concentration of a single particle in the sample solution based on the time taken for the number representing the presence of a single particle signal to reach a predetermined number.
  • a procedure may be configured.
  • the first or second wavelength band is moved while moving the position of the light detection region in the sample solution in which single particles having different wavelength bands that do not emit light are mixed.
  • the light intensity or light intensity of the background light is individually detected as a single particle signal.
  • a single particle detection method for detecting single particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, The process of moving the position of the light detection area of the optical system of the microscope in the solution and the time series light by detecting the light from the light detection area while moving the position of the light detection area in the sample solution Including the step of generating intensity data and the step of detecting individually as signals representing the presence of each single particle in the time-series light intensity data, wherein the single particle is substantially in the first wavelength band.
  • a second single particle that does not emit light, and the wavelength band of the detected light When in the first wavelength band, the light from the photodetection region includes a substantially constant background light in the first wavelength band, and a signal representative of the presence of each single particle is the first single particle Is a decrease in the light intensity in the time-series light intensity data that occurs when the light enters the light detection region.
  • the wavelength band of the detected light is the second wavelength band
  • the light from the light detection region Time-series light intensity data generated when the second single particle enters the light detection region, including a substantially constant background light in the second wavelength band, and a signal representing the presence of each single particle.
  • a method is provided which is characterized by a decrease in light intensity at.
  • the background light may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or illumination light by a substance dispersed in the sample solution.
  • the intensity of such background light is preferably such that when the wavelength band of the detected light is the first wavelength band, the intensity of the background light and the light intensity from the second single particle are substantially equal,
  • the wavelength band of the detected light is the second wavelength band, for example, luminescent particles are placed in the sample solution so that the intensity of the background light is substantially equal to the light intensity from the first single particle.
  • the intensity of the background light is adjusted by dispersing the light.
  • the outer diameter of the single particle is preferably 15% or more of the diameter of the photodetection region, and more preferably 35% or more of the diameter of the photodetection region.
  • the individual detection of the signal indicating the presence of each single particle may be performed based on the shape of the time-series signal.
  • a signal having a light intensity lower than a predetermined threshold is detected from the background light intensity. It may be determined that one single particle has entered the light detection region.
  • a downwardly convex bell having an intensity below a predetermined threshold measured from the intensity of background light in time-series light intensity data.
  • a pulse signal of the type may be detected as a signal representing the presence of a single particle, in which case the time-series light intensity data is smoothed and the downwardly convex bell in the smoothed time-series light intensity data.
  • a type of pulsed signal may be detected as a signal representing the presence of a single particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the single particle, the number density or concentration in the sample solution, and preferably in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the light detection region at is set higher than the diffusion moving speed of the single particle to be detected.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. May be changed.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the process of counting the number of individually detected single particle signals to count the number of single particles detected during the movement of the position of the light detection region and / or A step of determining the number density or concentration of single particles in the sample solution based on the number of single particles detected may be included.
  • particle counting the number of single particle signals obtained during an arbitrarily set measurement time is typically counted. Measurement may be performed until the number of particle signals reaches an arbitrarily set number, and a single particle concentration value may be calculated based on the measurement time.
  • the above method also moves the position of the light detection region, detects light from the light detection region, and detects the single particle until the number of signals indicating the presence of a single particle reaches a predetermined number.
  • the above-described single particle detection technique of the present invention typically involves particulate biological materials such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells and the like.
  • particulate biological materials such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells and the like.
  • non-biological particles eg, atoms, molecules, micelles, liposomes, metal colloids, beads (magnetic beads, polystyrene beads, latex beads, etc. ), Quenchers (azobenzenes (dabcyl, BHQ, etc.), metal particles, etc.
  • non-biological particles eg, atoms, molecules, micelles, liposomes, metal colloids, beads (magnetic beads, polystyrene beads, latex beads, etc. ), Quenchers (azobenzenes (dabcyl, BHQ, etc.),
  • the single particle detection technique of the present invention is a reversible scanning molecular counting method that detects single particles that do not emit light dispersed in a solution. Makes it possible to detect.
  • the configuration of the present invention similar to the scanning molecule counting method, the number density or concentration of a single particle to be observed is significantly lower than the level necessary for optical analysis techniques such as FCS, FIDA, PCH, etc. It has the advantage that it can be applied to a solution, and the advantage that false detection of stray light and Raman scattered light of the inverted scanning molecule counting method as a signal of the observation target particle is eliminated, and a plurality of types in one solution. Even in the presence of single particles, it is advantageous in that they can be detected separately if the wavelength bands in which the plurality of types of single particles do not emit light are different. The selection of the wavelength band may be made with reference to the result of a preliminary experiment or the like.
  • FIG. 1 (A) is a schematic diagram of the internal structure of a single particle detection apparatus that executes the inverted scanning molecule counting method according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (light detection region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIG. 1D is a schematic diagram of a mechanism for moving the position of the photodetection region in the sample solution by moving the horizontal position of the microplate.
  • FIGS. 1A and 2B are a schematic diagram and a measurement for explaining the principle of detecting the presence of a single particle that does not emit light in the detection light wavelength band in the inverted scanning molecule counting method in the present invention, respectively. It is a schematic diagram of the time change of the light intensity performed.
  • 2 (C) to 2 (E) are diagrams for explaining how particles appear when a background light of a detection light wavelength band is given in a solution in which two types of particles having different wavelength bands that do not emit light are mixed. is there.
  • FIG. 3 is a diagram showing, in the form of a flowchart, one embodiment of the processing procedure of the inverted scanning molecule counting method executed in accordance with the present invention.
  • FIG. 4A and 4B show the case where the single particle crosses the light detection region while performing Brownian motion, and the position of the light detection region in the sample solution is faster than the diffusion movement speed of the single particle. It is a model diagram showing the mode of movement of particles when particles cross the photodetection region by moving at.
  • FIG. 4C shows a signal of a detection signal in a processing procedure for detecting the presence of a single particle from measured time-series light intensity data (time change of photon count) according to the inverted scanning molecule counting method. It is a figure explaining the example of a process.
  • FIG. 5 is a flowchart showing another aspect of the processing procedure of the inverted scanning molecule counting method executed according to the present invention.
  • FIG. 6 is a flowchart showing still another aspect of the processing procedure of the inverted scanning molecule counting method executed according to the present invention.
  • FIG. 7 is a fluorescent image of fluorescent beads.
  • (A) is a case where the wavelength band where the beads emit light is set as the detection light wavelength band
  • (B) is a case where the wavelength band where the beads do not emit light is set as the detection light wavelength band.
  • FIG. 8 shows detection of a solution containing no beads (no beads), a solution 1 containing non-fluorescent beads (non-fluorescent beads), and a solution 2 containing fluorescent beads (fluorescent beads) according to the inverted scanning molecular counting method according to the present invention. The average value (bar graph) and standard deviation (error bar) of the number of pulses obtained are shown.
  • a single particle detection device that realizes the single particle detection technology according to the present invention has an FCS, as schematically illustrated in FIG. It may be an apparatus formed by combining an optical system of a confocal microscope capable of executing FIDA and the like and a photodetector.
  • single particle detection apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the single particle detection apparatus 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is transmitted.
  • the light diverges at an angle determined by the specific NA at the emission end of the fiber and is radiated, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, and the reflection mirrors 6 and 7, and is objective.
  • the light enters the lens 8.
  • the wavelength of the excitation light for generating the background light can be selected.
  • a plurality of light emitting sources (lasers) may be provided.
  • excitation light having different wavelengths may be simultaneously emitted from a plurality of light emission sources and introduced into the objective lens 8.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • the sample solution typically, particles that do not emit light in the detection wavelength band, which is an observation object, and any light-emitting substance that generates background light are dispersed or dissolved, and light is emitted in the detection wavelength band.
  • the luminescent material is excited to emit substantially constant light to become background light, and when particles that do not emit light in the detection wavelength band enter the excitation region, the background light Will be reduced.
  • the light (Em) emitted from the excitation region passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter.
  • 14 (here, only a light component in a specific wavelength band is selected), introduced into the multimode fiber 15, reaches the photodetector 16, and is converted into a time-series electrical signal. Thereafter, it is input to the computer 18 and processing for single particle detection is performed in a manner described later.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and as a result, as shown in FIG.
  • the focal region of the laser beam illustrated in FIG. 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is in the region). It has a Gaussian distribution with the center at the apex.
  • the effective volume is the volume of a substantially elliptical sphere bounded by the plane where the light intensity is 1 / e 2 )), and is called confocal volume.
  • the light that has passed through the pinhole 13 is divided by the wavelength band in such a manner that light in a part of the wavelength band is reflected by the dichroic mirror 14a and light in the remaining wavelength band is transmitted.
  • Each component passes through the corresponding barrier filter 14 (here, only the light component in a specific wavelength band is selected), and is introduced into the multimode fiber 15 to the corresponding photodetector 16. After reaching and being converted into a time-series electrical signal, it is input to the computer 18 and processing for optical analysis is performed in a manner described later.
  • the photo detector 16 is preferably a photon.
  • An ultra-sensitive photodetector that can be used for counting is used.
  • the light detection is based on photon counting
  • the light intensity is measured sequentially over a predetermined period of time by measuring the number of photons arriving at the photodetector at a predetermined unit time (BIN TIME).
  • the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • the sample solution is scanned by the light detection region, that is, the focal region, that is, the position of the light detection region is moved in the sample solution.
  • the mechanism is provided.
  • a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. A method of moving the absolute position of the light detection area).
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • FIG. 1D the horizontal position of the container 10 (microplate 9) into which the sample solution is injected is moved to detect light in the sample solution.
  • the stage position changing device 17a may be operated to move the relative position of the region (a method of moving the absolute position of the sample solution).
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a cooperates with the light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18 in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected by the program in the computer 18).
  • the absolute position of the light detection region can be moved while moving the position of the sample solution. May be executed. In this case, it is avoided that the same single particle is repeatedly detected when the light detection region in the short time passes through the same region. Or, by moving the absolute position of the light detection region, the same region is intentionally repeatedly passed through the light detection region, the same single particle is periodically detected multiple times, and the signal An improvement in accuracy may be achieved. In this case, after the absolute position of the light detection region is moved for a predetermined time, the position of the sample solution moves intermittently, and the same single particle is moved to another place in the sample solution.
  • the position of the light detection region is moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 or the stage up and down, and the locus of the position of the light detection region is three-dimensionally within the sample solution. It may be designed to be deployed.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed. In addition, when the luminescent material that generates background light emits light regardless of excitation light due to chemiluminescence or bioluminescence, the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted. When the luminescent material that generates background light emits light by phosphorescence or scattering, the optical system of the confocal microscope is used as it is. Furthermore, the background light may be provided by illumination light. In that case, the sample solution is illuminated from above the objective lens by transmitted illumination (may be Koehler illumination).
  • the computer 18 includes a CPU and a memory, and the CPU executes various arithmetic processes to execute the procedure of the present invention. Each procedure may be configured by hardware. All or a part of the processing described in the present embodiment may be executed by the computer 18 using a computer-readable storage medium storing a program for realizing the processing. That is, the computer 18 may realize the processing procedure of the present invention by reading a program stored in a storage medium and executing information processing / calculation processing.
  • the computer-readable recording medium may be a magnetic disk, a magneto-optical disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a semiconductor memory, or the like.
  • the above-mentioned program is distributed to a computer via a communication line. The computer that has received the distribution may execute the program.
  • the single particle detection technology of the present invention is simply described as a single particle in a specific wavelength band.
  • a scanning molecule counting method (hereinafter referred to as “inverted scanning molecule counting method”) that detects the shadow of a single particle, that is, in the presence of background light in a specific wavelength band.
  • inverted scanning molecule counting method In a mode in which the position of the light detection region is moved at and a decrease in background light when a single particle that does not emit light in that specific wavelength band is included in the light detection region is detected as a single particle signal, The presence of a single particle is detected individually.
  • the presence of a plurality of types of single particles is detected for each type, and information regarding the count of those particles or the concentration in the sample solution is provided. To be acquired.
  • the principle of the inverted scanning molecule counting method according to the present invention will be described.
  • the particles to be observed are luminescent particles, and particles that do not emit light cannot be detected in the wavelength band of the detection light. Therefore, when particles that do not emit light are to be observed, it is necessary to attach a light-emitting label such as a fluorescent label to the particles. However, depending on the particle, it may be difficult to apply the luminescent label, or the particle may be modified due to the application of the luminescent label.
  • the “inverted scanning molecule counting method” of the present invention allows the background light to be emitted from the light detection region (or the light detection region is illuminated with illumination light) in the optical measurement by the scanning molecule counting method described above.
  • a particle to be observed enters the light detection region, a single particle is detected by detecting that the detected background light decreases.
  • the optical path is changed by driving a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the light detection region, or a sample solution is injected.
  • the horizontal position of the container 10 (microplate 9) is moved to move the position of the light detection region CV in the sample solution as schematically illustrated in FIG.
  • light detection is performed while scanning the sample solution by the light detection region CV.
  • the luminescent material is dispersed in the sample solution, and a large number of luminescent materials are present in the light detection region CV.
  • t2 Basically, light from these luminescent materials is detected substantially uniformly.
  • the light detection region CV moves through the region where one non-light emitting particle exists (t1), the volume of the region where the light emitting material exists is reduced, so that the light emitted from the light emitting material is reduced.
  • a significant light intensity (Em) in the form of a bell-shaped pulse appears on the time-series light intensity data.
  • a single particle is detected individually by detecting the signal representing the presence one by one, and by counting the number, the number of single particles present in the measured area, or the concentration or number density The information regarding can be acquired.
  • the degree of decrease in the light intensity can be estimated from the relationship between the diameter of a single particle that does not emit light and the diameter of the light detection region.
  • the light intensity distribution in the light detection region has a bell-shaped profile f (r) having a maximum intensity Imax at the center and decreasing toward the radius r.
  • a single particle that does not emit light having a radius b enters the photodetection region and is positioned at the center of the photodetection region, the luminescent material in that region is excluded. The corresponding amount of light will be reduced.
  • the rate of decrease in light intensity can be estimated by ⁇ / ⁇ .
  • the fluctuation rate of the background light is about 1% and the rate of decrease in light intensity due to a single particle is 1% or less, signal detection becomes impossible.
  • the ratio b / a of the single particle radius to the radius of the photodetection region should be 0.15 or more.
  • the ratio b / a of the detectable single particle radius to the radius of the photodetection region is 0.35. If the single particle to be observed is a quencher or a fluorescence energy transfer acceptor, the single particle absorbs ambient light (for example, 10 nm). It can be reduced from the illustrated radius.
  • the particles to be observed in the present invention usually have a wavelength band that emits light (emission wavelength). Band) and a wavelength band that substantially does not emit light (non-emission wavelength band).
  • the emission wavelength band and the non-emission wavelength band are different from each other depending on the type of particles, and It is possible to prepare.
  • the wavelength band of the detection light that is, the wavelength band of the background light is set within the non-emission wavelength band of the particle, the shadow of the particle is formed, and the particle The presence of can be detected.
  • a single particle having a non-emission wavelength band in the detected wavelength band by detecting light in a plurality of wavelength bands and detecting a decrease in background light for each wavelength band. Is detected.
  • the non-emission wavelength band varies depending on the type of particles. Therefore, when a plurality of types of particles are mixed in the same sample solution, the non-emission wavelength band is different if the non-emission wavelength band is different. It is possible to detect a single particle while discriminating.
  • FIG. 3 shows processing in this embodiment expressed in the form of a flowchart.
  • the particles to be observed in the single particle detection technique of the present invention are particles that are dispersed in the sample solution and move randomly in the solution, and the particle size is the light detection region.
  • the diameter may be 15% or more, more preferably 35% or more, such as protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid, or an aggregate thereof.
  • Particulate biological objects such as biomolecules, viruses, cells, non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, liposomes, metal colloids, beads (magnetic beads, polystyrene beads, latex beads, etc.
  • the luminescent substance that gives the background light can be any luminescent molecule, such as a fluorescent molecule, phosphorescent molecule, chemical, etc. It may be a bioluminescent molecule, and the luminescent substance is dissolved or dispersed in the sample solution at a concentration that is always present in the light detection region at a few or more molecules, which is typically an aqueous solution.
  • the organic solvent and other arbitrary liquids may be used.
  • sample preparation is performed.
  • a light emitting material that provides background light in the first wavelength band and a background in the second wavelength band if the second single particle that emits light and does not emit light in the second wavelength band is included.
  • a luminescent material that provides light may be dispersed.
  • the emission luminance in the particles is uniform, Ideally, there should be no uneven brightness between the particles, but it is not always necessary to adjust the brightness of the particles and the background light, and there is a slight difference in brightness and a decrease in background light. However, it is sufficient if it can be identified in the analysis.
  • grains with which the fluorescent substance was covered by the non-fluorescent shell, etc. may be sufficient, for example.
  • the brightness difference between the background light and the particles is ideally a brightness difference equal to or less than the CV value of the background light. Since the CV value of typical background light is 10%, it is desirable that the luminance difference between the light emitting particles and the background light is 10% or less, and preferably, the sample solution achieves such a state. It is prepared as follows.
  • the background light may be fluorescence, autofluorescence, scattering (Raman scattering (solvent (water) carbon disulfide, isoprene, transition metal complex)), light from a luminescent material, or illumination light from a uniform light source. .
  • the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution are started.
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a drives the mirror 7 (galvanomirror) or the microplate 9 on the stage of the microscope, and the wells.
  • the position of the light detection region is moved, and at the same time, the light detector 16 sequentially converts the detected light into an electric signal and transmits it to the computer 18. In this manner, time-series light intensity data is generated from the transmitted signal and stored.
  • each of the plurality of photodetectors 16 detects light in different wavelength bands, and time-series light intensity data is generated for each detected different wavelength band. Measurement of light in different wavelength bands may or may not be performed simultaneously.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the presence or absence of the arrival of one photon. Therefore, when the light is detected by photon counting, the time-series light intensity data is It may be a series of photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the size or volume of the region through which the light detection region has passed is required, so that the moving distance is grasped.
  • the movement of the position of the light detection region is executed in the manner.
  • the movement speed is basically a constant speed.
  • the present invention is not limited to this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to carry out quantitatively accurate detection of single particles or counting of the number of single particles from the measured time-series light intensity data. For this reason, it is preferable that the moving speed is set to a value faster than the moving speed by the random movement of the single particle, that is, the Brownian movement. Since the observation target particles of the single particle detection technique of the present invention are particles that are dispersed or dissolved in a solution and move freely and randomly, the position moves with time by Brownian motion. Accordingly, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement of the particle due to Brownian motion, the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the light intensity changes randomly (as already mentioned, the excitation light intensity in the light detection region decreases outward with the center of the region as the apex), corresponding to each single particle. It becomes difficult to identify a significant change in light intensity. Therefore, preferably, as shown in FIG. 4B, the particle crosses the light detection region in a substantially straight line, so that in the time-series light intensity data, the uppermost stage of FIG.
  • the light intensity change profile corresponding to each single particle becomes substantially uniform (if the single particle passes through the light detection region substantially linearly, the light intensity change profile is This is almost the same as the profile obtained by inverting the excitation light intensity distribution.)
  • the moving speed of the position of the light detection region is the average of the Brownian motion of the particles so that the correspondence between the individual particles and the light intensity can be easily identified. Is set to be faster than the moving speed (diffusion moving speed).
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s or more, which is 10 times or more.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 detects a single particle signal by processing according to a program stored in a storage device, Various analyzes such as particle counting and concentration calculation are performed.
  • a signal in which the time width in which the decrease in light intensity below the threshold continues is not within the predetermined range is determined as a noise or foreign matter signal.
  • the intensity A and the width a calculated by fitting the equation (7) to a significant light intensity decrease profile (a profile that can be clearly determined not to be fluctuation of background light) are predetermined.
  • the light intensity profile corresponds to the passage of one particle through the light detection region, and one particle may be detected.
  • a signal whose intensity A and width a are outside the predetermined range is determined as a noise or foreign object signal and may be ignored in the subsequent analysis or the like.
  • time-series light intensity data (FIG. 4C, uppermost “detection result (unprocessed)” ) Is performed (step 110 in FIG. 3, step “smoothing” in FIG. 4C).
  • the light emitted by the luminescent material is probabilistically emitted, and the light intensity is relatively weak. Therefore, the fine increase / decrease occurs.
  • the detection accuracy of a signal indicating the presence of the signal is deteriorated.
  • the smoothing process makes it possible to ignore the fine increase and decrease on the data.
  • the smoothing process may be performed, for example, by a moving average method (for example, an adjacent average method, an algorithm of Savinsky-golay method), a percentile filter method, or an FFT filter method.
  • a moving average method for example, an adjacent average method, an algorithm of Savinsky-golay method
  • a percentile filter method for example, a percentile filter method
  • FFT filter method for example, a percentile filter method
  • Parameters for performing the smoothing process such as the number of data points averaged at a time in the moving average method and the number of moving averages, are the moving speed (scanning speed) of the position of the light detection region when acquiring light intensity data.
  • BIN TIME may be set as appropriate.
  • the moving average method may be used.
  • a smoothing process is performed in order to detect a time region (pulse existing region) where a significant pulse-like signal (hereinafter referred to as “pulse signal”) exists.
  • a first derivative value with respect to time of the subsequent time-series light intensity data is calculated (step 120).
  • the time differential value of the time-series light intensity data has a large change in value at the time of change of the signal value, as illustrated in the lower “time differential” in FIG. By reference, significant signal start and end points can be advantageously determined.
  • a significant pulse signal is sequentially detected on the time-series light intensity data, and it is determined whether or not the detected signal is a signal corresponding to a single particle. Specifically, first, on the time-series time differential value data of the time-series light intensity data, with reference to the time differential value sequentially, the start point and the end point of one pulse signal are searched and determined, A pulse presence region is identified (step 130). When one pulse existence area is specified, a downward convex bell-shaped function fitting is performed on the smoothed time-series light intensity data in the pulse existence area (see FIG.
  • Bell-shaped function fitting ”), peak-shaped intensity of peak of bell-shaped function (maximum decrease from background light) Ipeak, pulse width (full width at half maximum) Wpeak, correlation coefficient (of least squares method) in fitting, etc.
  • a parameter is calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function. Whether or not the calculated bell-shaped function parameter is within a range assumed for the bell-shaped profile parameter drawn by the pulse signal detected when one single particle passes through the light detection region.
  • the peak intensity of the pulse (A in Equation (7), maximum value of decrease in background light), pulse width, and correlation coefficient are within predetermined ranges, for example, The following conditions: 20 ⁇ s ⁇ pulse width ⁇ 400 ⁇ s peak intensity> 4.0 [pc / 10 ⁇ s] (A) Correlation coefficient> 0.95 Whether or not the condition is satisfied is determined (step 150).
  • the signal determined that the calculated bell-shaped function parameter is within the assumed range in the signal corresponding to one particle is determined to be the signal corresponding to one particle.
  • a pulse signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise.
  • the search and determination of the pulse signal in the processing of the above steps 130 to 150 may be repeatedly executed over the entire area of the time series light intensity data (step 160).
  • the above steps 110 to 170 are executed for each of the time-series light intensity data in different wavelength bands, and the number of pulse signals corresponding to particles in each wavelength band is counted. May be.
  • the process which detects the signal of a single particle individually from time series light intensity data is not restricted to said procedure, You may perform by arbitrary methods.
  • the number of particles detected may be counted to determine the number of particles (particle counting). If the total volume of the region through which the light detection region has passed is calculated by an arbitrary method, the number density or concentration of particles in the sample solution is determined from the volume value and the number of particles (step 170). ).
  • the total volume of the region through which the light detection region has passed may be theoretically calculated based on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system.
  • control solution a solution having a known concentration
  • control solution a plurality of solutions having different concentrations of single particles are prepared, and measurement is performed on each of them.
  • the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region passes. You may be supposed to.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • information on the relationship between the concentration C and the number N of various standard particles is assumed for the assumed movement pattern of the light detection region.
  • Information stored in advance in the storage device of the computer 18 may be used so that the user of the device can appropriately use the stored information when performing single particle detection.
  • the counting and concentration of particles in the sample solution can be determined by the above processing procedure. It becomes.
  • particle counting is performed for each detection wavelength band, and a single particle concentration is determined, thereby making it possible to determine the concentration for each type of particle.
  • the single particle detection process measurement of light intensity while moving in the light detection region and detection of single particle signals are repeated until the number of signals reaches a predetermined number, The time required for the number of particles to reach a predetermined number is measured, and based on the time required for the number of such single particle signals to reach a predetermined number, the particle concentration is determined. Good. According to this configuration, when the particle concentration in the sample solution is high, the time required for measuring the light intensity is shortened, and when the particle concentration in the sample solution is low, the result (ie, particle concentration) is required. The light intensity measurement can be continued until the number of particles that achieve the desired accuracy is obtained.
  • the number of single particle signals is a predetermined number.
  • the time taken to reach the value reflects the number of particles that achieve the required accuracy in the results, so the particle concentration value determined based on that time is acceptable or satisfactory. It is expected to have accuracy. Even in such a configuration, in the case of the present invention, from the optical measurement to the calculation of the particle concentration is executed for each of a plurality of detection wavelengths.
  • the concentration value of particles and the time required for the number of signals to reach a predetermined number are related as follows. That is, in a sample solution having a certain particle concentration C, when the photodetection region is moved at the scanning speed u over time ⁇ , the detected particle is represented by S as the cross-sectional area of the photodetection region.
  • the particle concentration C is linearly proportional to the detection speed V, and the correspondence between the particle concentration C and the detection speed V is easy to understand. Therefore, in an actual experiment, the particle concentration C May be determined using the detection speed V.
  • the single particle detection processing for detecting a certain number of signals may be executed, for example, by the processing procedure shown in the flowchart of FIG.
  • a series of processes of moving the position of the light detection region, detecting light from the light detection region, detecting a single particle signal and counting the detected particle signal are repeatedly executed at every analysis time interval t (predetermined time interval) until the detected particle number X reaches the end particle number XE (a predetermined number that a single particle number should reach).
  • t predetermined time interval
  • (A) Initial setting Referring to FIG. 5, in the operation process, specifically, first, the sample solution is injected into the well 10 of the microplate 9 and placed on the microscope stage, and then the user.
  • the computer 18 inputs an instruction to start light intensity measurement and particle detection / counting processing to the computer 18, the computer 18 sets the end particle number XE (step 10) and the analysis time interval t as initial settings. Is set (step 20).
  • the number of end particles XE and the analysis time interval t may be arbitrarily set by the user.
  • the number XE of end particles can be appropriately determined with reference to the result of a preliminary experiment using a solution having a known particle concentration so that the accuracy required for the result value of the particle concentration can be achieved.
  • the analysis time interval t is an arbitrary time interval that is sufficiently shorter than the time from the start of processing until the number of particles (X) reaches the number of end particles (XE). It may be set as appropriate in consideration.
  • the end particle number XE and the analysis time interval t values preliminarily determined with reference to the result of a preliminary experiment using a solution having a known particle concentration are stored in the apparatus 1, and such storage is performed. The set value may be used automatically or by user selection.
  • Step 40 is repeatedly executed until the total number of particles X (tn) reaches the final particle number XE (step 50).
  • the start time Ts of a series of processes may be stored (step 25).
  • the light detection / particle number detection process in step 30 may be the same as the process shown in FIG.
  • the light intensity is measured over the analysis time interval t while moving the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution), and then the obtained analysis is performed.
  • the computer 18 performs processing according to a program stored in the storage device to detect a signal indicating the presence of a single particle and count the detected number. Executed.
  • Step 40 in FIG. 5 X (t n ) is the total number of particles detected up to the previous analysis time interval t, and its initial value is zero. Steps 30 to 40 are performed until the total number X (tn) of single particles reaches the end particle number XE, that is, X (t n ) ⁇ XE (15) Is repeated at each analysis time interval t until the above is established (step 50). If the equation (15) is satisfied while the steps 30 to 50 are repeated, the processing of measuring the light intensity of the sample solution and detecting / counting the particles is completed. When the iterative process of steps 30 to 50 ends, the end time TE may be stored (step 60).
  • each process indicated by a dotted line in the drawing is executed. Specifically, first, the latest total number of detected particles X (tn) calculated in step 40 is displayed on the display (step 52). If the repeated execution of steps 30 to 50 has already been performed, the value of the total number of detected particles X (tn) so far is updated. Next, in order to calculate the measurement end time TE or the measurement remaining time Tr, the particle detection speed v after the start of the processing of Steps 30 to 50 is calculated (Step 54).
  • Tp is the current time.
  • Tr the remaining measurement time Tr (time until the end of the processing in steps 30 to 50)
  • Tr (XE ⁇ X (t n )) / v (17)
  • the measurement end time TE (the time at which the processing of steps 30 to 50 is completed)
  • TE Tp + Tr (18) (Step 56).
  • the measurement of the light intensity in step 100 of FIG. 3 may be continuously performed during the execution of the signal processing steps other than step 100 from the start to the end of the measurement. That is, in the light detection / particle number detection process, when the measurement of the light intensity over the analysis time interval t of one cycle is completed, the measurement of the light intensity over the analysis time interval t of the next cycle is performed.
  • the computer 18 executes processing for detecting and counting the particle signal from the light intensity data acquired over the analysis time interval t of the completed cycle. Become. Thereby, detection / counting of particles is achieved in real time.
  • the particle concentration is calculated from the time T until reaching the end particle number and the end particle number XE using the equation (12), and the particle detection speed V is calculated. , Determined using the relationship of equation (13).
  • cross-sectional area S of the passage region of the light detection region in the equations (10) to (13) is theoretically calculated based on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system.
  • control solution for a solution having a known particle concentration (control solution), measurement of light intensity and particle detection described above under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined. It may be determined from the number of particles detected by performing the counting and the concentration of a single particle in the control solution.
  • the number of detected particles in the measurement of light intensity performed for a certain time ⁇ o at a moving speed uo for a control solution having a particle concentration C is N
  • a plurality of solutions having different concentrations of particles are prepared as a control solution, and measurement is performed on each of them.
  • the calculated average value of S is adopted as the cross-sectional area S of the light detection region. Good.
  • FIG. 6A is a flowchart of the measurement of the light intensity of the sample solution and the particle detection / counting process configured to include a process (step 20 ′) for correcting the analysis time interval t according to the particle detection state.
  • FIG. 6B shows the calculation processing of the analysis time interval t in step 20 ′ in the form of a flowchart.
  • the same step number is assigned to the same process as in FIG.
  • the analysis time interval t is corrected (step 20 ′).
  • the process of the example shown in the drawing is referred to as a predetermined number N (hereinafter referred to as “scheduled number of updates”) in one measurement from the start until the number of particles reaches the end particle number XE. ) Only the light intensity measurement and particle detection / counting processing cycles are executed. Specifically, as an initial setting, first, after setting the number XE of end particles (step 10) and storing the start time Ts (step 25), first the light intensity measurement and particle detection / counting processing are executed.
  • Step 50 the total number of detected particles X (t n ) and / or the measurement end time TE or the remaining measurement time Tr are displayed on a display such as the monitor of the computer 18. (Steps 52 and 58). If the number of particles has reached the end particle number XE in the first processing cycle, the light intensity measurement and particle detection / counting processes are terminated (step 50).
  • step 20 ′ for correcting the analysis time interval t it is first determined whether or not the number of particles X (tn) detected so far is 0 (step 220). .
  • the analysis time interval t in the immediately preceding cycle may be multiplied by m (m is a positive number of 1 or more).
  • the analysis time interval t is determined by using the remaining measurement time Tr, the scheduled update count N, and the execution count k of the processing cycle.
  • the measurement remaining time Tr reflects the detection state of particles in the sample solution to be observed. It will be optimized according to the detection status of such particles.
  • a 20% polyethylene glycol solution containing 200 ⁇ M fluorescent dye ATTO488, 50 ⁇ M fluorescent dye ATTO633 and 10 fM fluorescent beads (FP-4052-2: spherotec (D: 4000 nm)) was prepared.
  • the sample solution was observed using a confocal laser scanning microscope FV10i (Olympus) to obtain a confocal fluorescence microscope image.
  • the measurement was performed using excitation light 473 nm (120 ⁇ W) and excitation light 635 nm (47 ⁇ W).
  • the fluorescent beads used are particles that emit light when illuminated with excitation light at 473 nm, and hardly emit light when illuminated with excitation light at 635 nm.
  • ATTO 488 and ATTO 633 are luminescent materials for emitting background light when fluorescence is observed with excitation light 473 nm and excitation light 635 nm, respectively.
  • FIG. 7 shows confocal fluorescence microscopic images observed at (A) excitation light 473 nm and (B) excitation light 635 nm, respectively.
  • (A) in the case of excitation light 473 nm the shadow of the beads was hardly detected
  • (B) excitation light 635 nm the shadow of each bead was observed.
  • the presence of particles that emit light in a specific wavelength band and hardly emit light in another wavelength band can be detected in the presence of background light in the non-emission wavelength band of the particle, This indicates that the light is not detected in the presence of background light in the emission wavelength band.
  • the beads were counted in the sample solution containing the beads.
  • fluorescent solution is used in solution 1 and 10 fM in which non-fluorescent beads (CP-40-10: spherotec (D: 4000 nm)) are dispersed at 10 fM in a 20% polyethylene glycol solution containing 0.5 ⁇ M fluorescent dye ATTO488.
  • Solution 2 in which beads (FP-4052-2: spherotec (D: 4000 nm)) were dispersed was prepared.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device, and the above-mentioned “(2) Sample solution
  • time-series light intensity data photon count data
  • 50 ⁇ W of 488 nm laser light was used as the excitation light
  • light in the wavelength band of 650-690 nm was measured by an optical filter (615LP and 670BP) to generate time-series photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution was 9000 rpm (67.5 mm / second), the BIN TIME was 50 ⁇ sec, and the measurement for 100 seconds was performed three times for each solution. Note that, under the above conditions, the beads in the solution 2 fluoresce, so that the light intensity is hardly lowered.
  • FIG. 8 shows the number of pulses detected in the time-series photon count data for the solution containing no beads, the solution 1 containing non-fluorescent beads, and the solution 2 containing fluorescent beads in the above procedure. .
  • about 2700 pulses were detected in solution 1 containing non-fluorescent beads, whereas the number of pulses was greatly reduced in solution 2 containing fluorescent beads. .
  • This result indicates that it is possible to detect a specific type of particles in the sample solution depending on whether or not light similar to background light is emitted.
  • the reason why the number of pulses was detected is considered to be due to variations in the emission luminance of the fluorescent beads. That is, in the beads used as fluorescent beads, This is because some of them have low emission brightness.
  • the inverted scanning molecule counting method in multiple wavelength bands in accordance with the teachings of the present invention allows for emission wavelength bands and non-emissions dispersed in the sample solution. Detection of single particles having different wavelength bands and acquisition of information on their concentrations are possible for each type of particle.
  • the present invention individually detects single particle signals, particles can be detected even if the particle concentration in the sample solution is lower than the concentration range required by optical analysis techniques such as FCS. Yes, such a feature may be advantageous when performing analysis on rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development.

Abstract

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いて単一粒子を個別に検出する走査分子計数法による単一粒子検出技術であって、複数種類の特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が混在する試料溶液中にて単一粒子を種類毎に検出可能とする技術が提供される。本発明による試料溶液中の単一粒子を検出する技術は、互いに異なる波長帯域で発光しない複数種類の単一粒子を含む試料溶液内に於ける顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの特定の波長帯域の光を検出して時系列の光強度データを生成し、時系列光強度データに於いて特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下をその単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する。

Description

光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
　本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な単一粒子検出技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の粒子の存在に依る光強度の変化を計測して単一粒子を検出し、種々の分析を可能にする単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラムに係る。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１－３、非特許文献１－３参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）などが知られている。また、特許文献６～８には、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。
　更に、本願出願人は、特許文献９～１１に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合、端的に述べれば、試料溶液内に於ける光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）に浮遊する蛍光分子からの光を連続的に計測することにより得られた光強度データに対して統計的な演算処理が実行されて、蛍光分子の濃度及び／又はその他の特性が検出される。これに対し、特許文献９～１１に於いて提案された新規な光分析技術では、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（発光粒子）を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。この光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）、更に、観測対象となる粒子の濃度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の良好に測定可能なレベル（１ｎＭ程度）よりも低い試料溶液に於いて、発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。かくして、「走査分子計数法」は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行でき、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等を良好に実行できない程度のより低い濃度の粒子の濃度及び／又は特性の検出が可能な強力なツールとして期待される。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特開２００９－２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報 国際公開第２０１１／１０８３６９ 国際公開第２０１１／１０８３７０ 国際公開第２０１１／１０８３７１ 国際公開２０１０－１１９０９８
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要　１９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.　Kask,　K.　Palo,　D.　Ullmann,　K.　Gall　PNAS　96,　13756-13761　(1999)）
　上記の如き発光する単一粒子の光を個別に検出する走査分子計数法に於いては、単一粒子からの光は、微弱であるので、迷光や水のラマン散乱による影響を受けやすい。即ち、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大を発光粒子の信号として識別する分析手法の場合、迷光や水のラマン散乱による光を誤って発光粒子の信号として識別してしまうことがある。また、単一粒子の光を検出する走査分子計数法の場合には、観測対象となる粒子（観測対象粒子）は、発光粒子に限られる。従って、発光しない粒子を観測したい場合には、観測対象となる粒子に発光標識（蛍光標識、りん光標識など）を付与する必要があるところ、観測対象粒子に常に適当な発光標識が付与可能であるとは限らない（発光標識の付与により、観測対象粒子が変性することもあり得る。）。
　この点に関し、一般に、顕微鏡の光学系により光計測を行う場合、背景光が高いときには、迷光や水のラマン散乱による影響を受けにくい。また、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の場合、通常の光学顕微鏡よりも光軸方向の分解能が高いので、発光しない単一粒子がコンフォーカル・ボリュームの内部を通過すると、コンフォーカル・ボリュームからの光強度の低下が観測される（特許文献１２）。そこで、本願出願人は、特願２０１１－１８４６３５に於いて、観測対象粒子を発光しない単一粒子として用い、実質的に一定の背景光を放出する試料溶液内を光検出領域により走査する「走査分子計数法」と同様の要領にて光の検出を行い、発光しない単一粒子が光検出領域内へ包含された際の単一粒子の影を検出して、単一粒子の存在を検出する「反転型走査分子計数法」を提案した。かかる「反転型走査分子計数法」によれば、迷光やラマン散乱光を観測対象粒子の信号として誤検出することはなく、また、低濃度の発光しない単一粒子の検出が可能となる。
　ところで、一般に、本発明の観測対象となる粒子は、特定の波長帯域に於いて光を放出するが、別の波長帯域に於いては殆ど光を放出しないという発光波長特性を有している。従って、同一の試料溶液内に於いて複数種類の粒子が混在する場合に、それらの粒子の光を放出しない波長帯域が異なっていれば、「反転型走査分子計数法」に於いて、光検出領域の光の検出波長を、複数の種類の粒子の光の放出のない波長帯域のそれぞれに設定することによって、検出波長に対応して試料溶液内に混在する複数種類の粒子のうちの特定の種類の粒子を別々に検出することが可能となり、種類の識別をしながら、粒子の検出を行えることとなる。
　かくして、本発明の主な課題は、同一の試料溶液内に於いて複数種類の粒子が混在する場合に、反転型走査分子計数法の原理を利用して、複数種類のうちの特定の種類の粒子を検出し、或いは、種類の識別をしながら、単一粒子を検出することを可能にする新規な原理による単一粒子検出技術を提供することである。
　本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、単一粒子が第一の波長帯域に於いて発光せず第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて発光しない第二の単一粒子とを含み、光検出部により検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第一の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光検出部にて検出される光強度の低下であり、光検出部により検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第二の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光検出部にて検出される光強度の低下であることを特徴とする装置によって達成される。
　かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などにして、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。）。「光検出領域からの光が前記第一（第二）の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、」とは、検出光の波長帯域が第一（第二）の波長帯域に設定されている場合に、観測対象となる単一粒子が光検出領域内に存在していないときの検出光（即ち、背景光）の強度値が許容誤差の範囲内に収まることを意味している。換言すれば、背景光は、その変動が単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる検出光の強度の低下幅よりも十分に小さくなるよう調節される。一方、「第一（第二）の波長帯域に於いて実質的に発光」しない単一粒子とは、対応する波長帯域に於ける発光強度が背景光に比して十分に小さい単一粒子を意味する。即ち、かかる単一粒子の発光強度は、殆ど０であることが好ましいが、背景光の強度よりも有意に低いレベルであっても許容されてよい。なお、本明細書に於いて、「単一粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、単一粒子の存在を表す信号を指すものとする。
　上記から理解される如く、本発明の装置に於いては、基本的には、「走査分子計数法」と同様に、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。かかる構成に於いて、光検出領域からの光に、検出光の波長帯域の有意な強度の背景光が含まれている場合には、検出光の波長帯域に於いて発光しない単一粒子が光検出領域に進入したときに或いは試料溶液内にて移動する光検出領域が検出光の波長帯域に於いて発光しない単一粒子を包含したときに、単一粒子の存在によって光検出領域からの光検出部まで到達する背景光の光強度又は光量が低下することとなる。一方、検出光の波長帯域に於いて発光する単一粒子は、光検出領域内に存在しても、背景光に紛れて、光強度又は光量の低下が殆ど検出されないこととなる。かくして、本発明の装置では、単一粒子が第一の波長帯域に於いて発光せず第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて発光しない第二の単一粒子とを含む場合に、第一の波長帯域に於いて有意な背景光が放出されるときには、検出光の波長帯域を第一の波長帯域に設定し、かかる背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、第二の波長帯域に於いて有意な背景光が放出されるときには、検出光の波長帯域を第二の波長帯域に設定し、かかる背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出する。そして、これにより、試料溶液中の互いに異なる粒子、即ち、第一及び第二の粒子がそれぞれ別々に、即ち、種類毎に検出され、種類毎に粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。換言すれば、本発明の装置に於いては、特定の波長帯域毎に、一定の背景光が存在する領域に於けるその特定の波長帯域に於いて発光しない単一粒子の影を検出することにより、単一粒子が個別に検出される。
　上記の本発明の装置に於いて、光検出領域からの光に含まれているべき背景光としては、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であってよい。この場合、試料溶液として使用する溶液中に光を放出又は散乱する物質が分散していない場合には、かかる溶液中に積極的に光を放出又は散乱する物質が溶解又は分散されてよい。また、試料溶液として使用する溶液が自家蛍光を発する場合には、その自家蛍光が上記の背景光として利用されてよい。特に、背景光を生ずる物質が励起光又は照明光を必要とする場合には、顕微鏡装置に於いて照明光用の光源及び光学系が装備される。一方、背景光を生ずる物質が励起光又は照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する物質の場合には、顕微鏡装置に於いて照明光は要しない。更に、背景光は、光検出領域内に単一粒子が存在する場合に低減するのであれば、透過照明等による照明光であってもよいことは理解されるべきである。なお、上記の本発明の構成に於いては、単一粒子の存在による背景光の低減を検出するところ、その背景光の低減の度合は、単一粒子の寸法と光検出領域の寸法との関係に依存する。この点に関し、後に詳細に述べる見積によれば、好ましくは、観測対象となる単一粒子の外径は、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好ましくは、単一粒子の外径が光検出領域の直径の３５％以上であることが見出されている。（特願２０１１－１８４６３５参照）
　更に、上記の本発明の構成に於いて、或る特定の波長帯域の光の検出に際して、観測対象とならない検出光の波長帯域にて発光する単一粒子は、背景光の強度と略等しい強度を有していることが好ましい。これは、もし観測対象とならない単一粒子の光強度と背景光の強度との差が大きい場合には、光強度データに於いて、観測対象となる単一粒子の信号の検出に影響するためである（検出光の波長帯域にて発光する単一粒子の輝度が過大であると、背景光の値が過大に算定されることとなり、検出光の波長帯域にて発光する単一粒子の輝度が過小であると、観測対象の単一粒子に対応する光強度の低下と区別がしにくくなる）。そこで、上記の本発明に於いては、好適には、光検出部により検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、背景光の強度と第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、光検出部により検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、背景光の強度と第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう背景光の強度が調節される。かかる背景光の調節は、例えば、試料溶液中に発光物質を分散することによって為されてよい。
　上記の本発明の装置に於ける試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、単一粒子の存在による光強度又は光量の低下の度合が低減することとなるので、単一粒子による光強度又は光量の低下が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。
　また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が単一粒子の存在位置を通過したときにその単一粒子の存在による背景光の低減を検出して単一粒子を個別に検出する。しかしながら、単一粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの単一粒子から複数回、その存在を信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの単一粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの単一粒子を一つの（単一粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、単一粒子の特性によって変わるので、上記の如く、単一粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
　試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける相対的な位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。特に、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更される場合、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる単一粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点で有利である。
　また、上記の本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの検出値の信号から１つの粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、光検出部にて検出された時系列の光を表す信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定されてよい。より具体的には、後の実施形態の欄にて説明される如く、通常、単一粒子の存在を表す信号は、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データに於いて、或る程度の強度を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号として現れ、ノイズは、釣鐘型のパルス状ではないか、強度の高い信号として現れる。そこで、本発明の装置の信号処理部は、時系列光強度データ上に於いて、背景光の強度から計って所定閾値を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。
　更に、本発明の装置により得られる光強度は、比較的微弱であり、細かい増減が生じ、かかる光強度の細かい増減は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、光強度の細かい増減を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。
　上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された単一粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された単一粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された単一粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、単一粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。特に本発明の場合には、同一の試料溶液中に混在する発光しない波長帯域が互いに異なる単一粒子について、それぞれ、別々にカウンティング及び／又は濃度の算定が可能となる。
　ところで、粒子のカウンティングの典型的な態様に於いては、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数される。しかしながら、その場合、設定された測定時間の長さによって、検出される単一粒子の信号数の変動することとなり、特に、単一粒子濃度が低いときには、検出信号数から算定される単一粒子濃度値のばらつきが大きくなって精度が低下し得る。そこで、上記の本発明の装置に於いては、粒子のカウンティングの別の態様として、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。即ち、上記の本発明の装置は、信号処理部が検出した単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域移動部による光学系の光検出領域の位置の移動と、光検出部による光検出領域からの光の検出と、信号処理部による単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう構成されていてよい。この場合、単一粒子の高濃度の試料溶液についての測定時間の短縮が期待され、単一粒子の低濃度の試料溶液についての測定は、十分な時間を費やして実行されることとなる。即ち、上記の構成によれば、単一粒子の濃度に応じて測定時間が最適化される。また、予め定められた数を結果に要求される精度を達成する数に設定しておけば、その予め定められた数の単一粒子の検出に要した時間又はそれから導出される任意の結果に於けるばらつきは、小さく抑制され、結果の精度を満足するものとすることが可能となる。
　上記の本発明の装置に於いて、発光しない波長帯域が互いに異なる単一粒子が混在する試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、第一又は第二の波長帯域に於ける光検出を背景光の存在下にて行い、背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、種類毎に（発光しない波長帯域毎に）単一粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出する単一粒子検出技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列光強度データに於いて単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する手順とをコンピュータに実行させ、単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第一の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度データに於ける光強度の低下であり、検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第二の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度データに於ける光強度の低下であることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。なお、コンピュータプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に記憶されて提供される。コンピュータは、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、上記の手順を実現する。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよい。更に、上述のプログラムは、通信回線によってコンピュータへ配信され、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
　かかる構成に於いても、背景光は、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であるか、照明光であってよい。かかる背景光の強度は、好適には、検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、背景光の強度と第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、背景光の強度と第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう、例えば、試料溶液中に発光粒子を分散することなどによって、背景光の強度が調節される。また、単一粒子の外径は、好適には、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好適には、光検出領域の直径の３５％以上となる。
　また、上記のコンピュータプログラムに於いても、単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定するようになっていてよい。具体的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよく、その際、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよい。
　更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された単一粒子の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された単一粒子の数を計数する手順及び／又は検出された単一粒子の数に基づいて、試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。なお、上記のコンピュータプログラムの場合にも、粒子のカウンティングに於いては、典型的には、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数されるが、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。従って、上記のコンピュータプログラムも、単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の位置の移動と、光検出領域からの光の検出と、単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう手順が構成されていてよい。
　上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、発光しない波長帯域が互いに異なる単一粒子が混在する試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、第一又は第二の波長帯域に於ける光検出を背景光の存在下にて行い、背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、種類毎に（発光しない波長帯域毎に）単一粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出する新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出方法であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列光強度データに於いて単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する過程とを含み、単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第一の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる時系列光強度データに於ける光強度の低下であり、検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第二の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる時系列光強度データに於ける光強度の低下であることを特徴とする方法が提供される。
　かかる構成に於いても、背景光は、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であるか、照明光であってよい。かかる背景光の強度は、好適には、検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、背景光の強度と第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、背景光の強度と第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう、例えば、試料溶液中に発光粒子を分散することなどによって、背景光の強度が調節される。また、単一粒子の外径は、好適には、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好適には、光検出領域の直径の３５％以上となる。
　また、上記の方法に於いても、単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定するようになっていてよい。具体的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよく、その際、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよい。
　更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記の方法に於いても、個別に検出された単一粒子の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された単一粒子の数を計数する過程及び／又は検出された単一粒子の数に基づいて、試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。なお、上記の方法の場合にも、粒子のカウンティングに於いては、典型的には、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数されるが、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。従って、上記の方法も、単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の位置の移動と、光検出領域からの光の検出と、単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう構成されていてよい。
　上記の本発明の単一粒子検出技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、リポソーム、金属コロイド、ビーズ（磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等）、消光剤（アゾベンゼン類（dabcyl,BHQなど）、金属粒子など）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　端的に述べれば、本発明の単一粒子検出技術は、溶液中に分散した発光しない単一粒子の検出を行う反転型走査分子計数法に於いて、単一粒子をその種類を識別しながら個別に検出することを可能にする。本発明の構成によれば、走査分子計数法と同様に、観測対象の単一粒子の数密度又は濃度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能であるという利点と、反転型走査分子計数法の迷光やラマン散乱光を観測対象粒子の信号として誤検出することが無くなるという利点とを有するとともに、一つの溶液中に複数の種類の単一粒子が存在する場合でも、それらの複数の種類の単一粒子の発光しない波長帯域が異なっていれば、別々に検出可能となる点で有利である。波長帯域の選択は、予備実験等の結果を参考になされてよい。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明による反転型走査分子計数法を実行する単一粒子検出装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の光検出領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明に於ける反転型走査分子計数法に於ける検出光波長帯域で発光しない単一粒子の存在を検出する原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）～（Ｅ）は、発光しない波長帯域の異なる２種類の粒子が混在する溶液に於いて、検出光波長帯域の背景光を与えた場合の粒子の見え方を説明する図である。 図３は、本発明に従って実行される反転型走査分子計数法の処理手順の一つの態様をフローチャートの形式で表した図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、単一粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、反転型走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から単一粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図５は、本発明に従って実行される反転型走査分子計数法の処理手順の別の態様をフローチャートの形式で表した図である。 図６は、本発明に従って実行される反転型走査分子計数法の処理手順の更に別の態様をフローチャートの形式で表した図である。 図７は、蛍光ビーズの蛍光画像である。（Ａ）は、ビーズが発光する波長帯域を検出光波長帯域に設定した場合であり、（Ｂ）は、ビーズが発光しない波長帯域を検出光波長帯域に設定した場合である。 図８は、ビーズを含まない溶液（ビーズなし）、無蛍光ビーズを含む溶液１（無蛍光ビーズ）、蛍光ビーズを含む溶液２（蛍光ビーズ）について、本発明による反転型走査分子計数法に従って検出されたパルス数の平均値（棒グラフ）と標準偏差（エラーバー）とを示している。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
単一粒子検出装置の構成
　本発明による単一粒子検出技術を実現する単一粒子検出装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、単一粒子検出装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。単一粒子検出装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。なお、本発明の装置に於いては、複数の波長帯域の背景光の検出が行われるところ、背景光を発生させるための励起光の波長が選択できるように、図示の如く、光源２に於いて複数の発光源（レーザー）が設けられていてよい。測定の態様によって、波長が異なる励起光が同時に複数の発光源から出射され、対物レンズ８へ導入されるようになっていてもよい。
　対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。なお、試料溶液中には、典型的には、観測対象物である検出波長帯域にて発光しない粒子と、背景光を生ずる任意の発光物質が分散又は溶解されており、検出波長帯域にて発光しない粒子が励起領域に進入していないときには、発光物質が励起されて実質的に一定の光が放出されて、背景光となり、検出波長帯域にて発光しない粒子が励起領域に進入すると、背景光が低減することとなる。
　かくして、励起領域から放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて単一粒子検出のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。
　ピンホール１３を通過した光は、ダイクロイックミラー１４ａに於いて、一部の波長帯域の光が反射し、残りの波長帯域の光が透過する態様にて波長帯域により分割され、分割された光の各成分は、それぞれ、対応するバリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、対応する光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。また、本発明では、数分子程度の蛍光色素分子からの微弱光からなる背景光に於ける単一粒子の存在による光量の低下を検出するので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の単一粒子検出装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。また、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式と試料溶液の絶対的な位置を移動する方式とを組み合わせて、試料溶液の位置を動かしつつ、光検出領域の絶対的な位置の移動が実行されてよい。この場合、短時間のうちの光検出領域が同一の領域を通過することにより同一の単一粒子を繰り返し検出することが回避される。或いは、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式により、意図的に光検出領域に同一の領域を繰り返し通過させ、同一の単一粒子を複数回に亘って周期的に検出し、信号の精度の向上が図られてもよい。この場合、光検出領域の絶対的な位置の移動を所定時間に亘って実行した後に、試料溶液の位置が間歇的に移動して、試料溶液内の別の場所にて、同一の単一粒子の繰り返し検出を実行し、検出される単一粒子の数の増大が図られてよい。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されて、光検出領域の位置の軌跡が、試料溶液内にて三次元的に展開されるようになっていてもよい。
　背景光を生成する発光物質が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、背景光を生成する発光物質が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。背景光を生成する発光物質がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、背景光は、照明光により与えられてもよい。その場合、対物レンズの上方から透過照明（ケーラー照明であってよい。）により試料溶液が照明される。
　コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
本発明の単一粒子検出技術の原理
　「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の単一粒子検出技術に於いては、端的に述べれば、特定の波長帯域に於ける単一粒子の影を検出する形式の走査分子計数法（以下、「反転型走査分子計数法」と称する。）にて、即ち、特定の波長帯域に於ける背景光の存在下で、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動し、その特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が光検出領域に包含された際の背景光の低下を単一粒子の信号として検出する態様にて、単一粒子の存在が個別に検出される。そして、複数の互いに異なる波長帯域に於ける光の検出を行うことにより、複数種類の単一粒子の存在を種類毎に検出し、それらの粒子の計数、或いは、試料溶液中の濃度に関する情報が取得される。以下、本発明による反転型走査分子計数法の原理について説明する。
１.反転型走査分子計数法の原理
　特許文献９～１１に記載されている「走査分子計数法」では、端的に述べれば、上記の如き単一粒子検出装置に於いて、発光粒子が分散された試料溶液内にて光検出領域の位置をしながら、光強度の測定が実行される。そして、光検出領域が発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が光検出部に到達することにより、光強度の測定値の増大が生ずるので、かかる光強度値の増大を検出して、一つの発光粒子の存在が個別に検出されることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、従前のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
　上記の通常の「走査分子計数法」の場合には、観測対象となる粒子は、発光粒子であり、検出光の波長帯域に於いて発光しない粒子を検出することができない。従って、発光しない粒子を観測対象とする場合には、かかる粒子に蛍光標識等の発光標識を付与する必要がある。しかしながら、粒子によっては、発光標識の付与が困難であったり、発光標識の付与に起因して粒子の変性が起き得る。また、粒子の放出する光をその粒子の存在を表す信号として識別する形式の場合、迷光や散乱光或いは光検出器の電気的ノイズにより、光強度データ上の値の増大が生じたときに、その値の増大を誤って発光粒子の信号として識別してしまう場合が在り得る。
　そこで、本発明の「反転型走査分子計数法」は、上記の走査分子計数法による光計測に於いて、光検出領域から背景光を放出させ（或いは、光検出領域を照明光にて照明し）、観測対象となる粒子が光検出領域に進入した際に、検出される背景光が低下することを捉えて、単一粒子の検出が為される。具体的には、通常の走査分子計数法と同様に、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。既に触れたように、試料溶液中には発光物質が分散され、光検出領域ＣＶ内には、多数の発光物質が存在しているので、光検出領域ＣＶの移動中（図中、時間ｔｏ～ｔ２）、基本的には、それらの発光物質からの光が略一様に検出される。しかしながら、光検出領域ＣＶが移動する間に於いて１つの発光しない粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光物質の存在領域の体積が低減するので、発光物質の放出する光の総量が低減し、図２（Ｂ）に描かれている如く、時系列の光強度データ上に、釣鐘型のパルス状の有意な光強度（Ｅｍ）の低下が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の有意な光強度の低下、即ち、単一粒子の存在を表す信号を一つずつ検出することによって、単一粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する単一粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。
　上記の光強度の低下の度合は、発光しない単一粒子の径と光検出領域の径との関係から概算することが可能である。典型的には、光検出領域内の光強度分布は、中心にて最大強度Ｉｍａｘを有し、半径ｒ方向に向かって低減する釣鐘型のプロファイルｆ（ｒ）を有している。従って、ｆ（ｒ）が略０になる光検出領域の半径ａを用いて、光検出領域内に発光しない粒子が存在していないときの光検出領域内から放出される光の総量αは、
　　α＝４π∫ｒ２ｆ（ｒ）ｄｒ　［積分区間は、０～ａ］　　　…（１）
にて与えられる。一方、光検出領域内に、半径ｂの発光しない単一粒子が進入し、光検出領域の中心に位置するとき、その領域の発光物質が排除されることとなるので、排除された発光物質に相当する光量が低減することとなる。その排除された発光物質に相当する光量、つまり低下量βは、
　　β＝４π∫ｒ２ｆ（ｒ）ｄｒ　［積分区間は、０～ｂ］　　　…（２）
にて与えられる。かくして、光強度の低下の割合は、β／αにより概算することが可能となる。ここで、ｆ（ｒ）がガウス関数であり、α＝１、ａ＝１となるとき、
　　ｆ（ｒ）＝０．６８４ｅｘｐ（－２ｒ２）　　　…（３）
となる。典型的には、背景光の変動率が１％程度であり、単一粒子による光強度の低下の割合が１％以下であると、信号の検出が不可能となるので、上記の式にて演算すると、光検出領域の半径に対する単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．１５以上とすべきである。また、単一粒子による光強度の低下の割合を１０％以上とする場合には、光検出領域の半径に対する検出可能な単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．３５となる。なお、観測されるべき単一粒子が消光剤や蛍光エネルギー移動のアクセプタである場合、単一粒子が周囲（例えば、１０ｎｍ）の光を吸収するので、検出可能な単一粒子半径は、上記に例示の半径よりも低減し得る。
２．複数波長帯域での光測定を行う反転型走査分子計数法
　「発明の概要」の欄に於いて触れた如く、本発明で観測対象となる粒子は、通常、光を放出する波長帯域（発光波長帯域）と実質的に光を放出しない波長帯域（非発光波長帯域）とを有しており、発光波長帯域と非発光波長帯域とは、粒子の種類によって互いに異なり、また、そのように粒子を調製することが可能である。そして、上記の如き反転型走査分子計数法に於いて、検出光の波長帯域、即ち、背景光の波長帯域を粒子の非発光波長帯域内に設定すれば、その粒子の影が形成され、粒子の存在が検出可能となる。一方、検出光の波長帯域に発光波長帯域を有する粒子の放出する光は、背景光と区別がつかず、かかる粒子は検出されない。即ち、図２（Ｃ）の如く、第一の波長帯域にて発光する粒子ａと第二の波長帯域にて発光する粒子ｂが存在している場合、図２（Ｄ）の如く、第一の波長帯域の背景光が検出される状態下では、粒子ａが発光するので、背景光の低下は生ぜず、粒子ａは検出されないが、粒子ｂは発光しないので、背景光の低下が生じ、これにより、その存在が検出されることとなる。一方、図２（Ｅ）の如く、第二の波長帯域の背景光が検出される状態下では、粒子ｂが発光するので、背景光の低下は生ぜず、粒子ｂは検出されないが、粒子ａは発光しないので、背景光の低下が生じ、これにより、その存在が検出されることとなる。
　かくして、本発明に於いては、複数の波長帯域にて光検出を行い、波長帯域毎に背景光の低下を検出することによって、検出される波長帯域にて非発光波長帯域を有する単一粒子が検出される。既に述べた如く、非発光波長帯域は、粒子の種類によって異なるので、これにより、同一の試料溶液内に複数種類の粒子が混在する場合に、それらの非発光波長帯域が異なっていれば、種類を識別しながら、単一粒子の検出が可能となる。
反転型走査分子計数法の処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の単一粒子検出装置１を用いた本発明に従った反転型走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）単一粒子と背景光を生成する発光物質とを含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図３は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
（１）試料溶液の調製
　本発明の単一粒子検出技術の観測対象物となる粒子は、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であって、粒径が光検出領域の径の好適には１５％以上、より好適には、３５％以上であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、リポソーム、金属コロイド、ビーズ（磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等）、消光剤（アゾベンゼン類（dabcyl,BHQなど）、金属粒子など）などであってよい。また、背景光を与える発光物質としては、任意の発光分子、例えば、蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子であってよく、発光物質は、光検出領域内に常に数分子以上存在する濃度にて試料溶液中に溶解又は分散される。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってもよい。
　また、特に、本発明の単一粒子検出技術に於いては、既に触れた如く、観測対象となる単一粒子の非発光波長帯域と特定の発光波長帯域とに於いて背景光が与えられるように試料の調製が行われる。例えば、試料溶液中に、第一の波長帯域に於いて発光せず第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて発光しない第二の単一粒子とが含まれる場合、第一の波長帯域に於いて背景光を与える発光物質と第二の波長帯域に於いて背景光を与える発光物質とが分散されてよい。この点に関し、粒子の発光波長帯域に於いて光の検出を行う場合、背景光の輝度と粒子の発光輝度とが完全に一致すること、粒子内の発光輝度が一様であり、また、複数の粒子間で輝度ムラがないことが理想であるが、必ずしもそのように粒子の輝度と背景光輝度とを調整する必要はなく、多少の輝度ムラや背景光の低下の度合のずれがあっても、解析上識別できれば十分である。例えば、例えば、無蛍光のコアに蛍光を示す外殻を持つような粒子、蛍光性物質が無蛍光の殻に覆われた粒子などであってもよい。背景光と粒子の輝度差については、背景光のＣＶ値以下の輝度差であることが理想である。典型的な背景光のＣＶ値は１０％であるため、発光する粒子と背景光の輝度差が１０％以下となっていることが望ましく、好適には、試料溶液は、かかる状態が達成されるよう調製される。背景光は、蛍光、自家蛍光、散乱（ラマン散乱（溶媒（水）二硫化炭素、イソプレン、遷移金属錯体）、発光物質による光であってよく、或いは、均一光源による照明光であってもよい。
（２）試料溶液の光強度の測定（図３－ステップ１００）
　本実施形態の反転型走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、本実施形態に於いては、複数の光検出器１６の各々が、互いに異なる波長帯域の光を検出し、検出された互いに異なる波長帯域毎に時系列光強度データが生成される。互いに異なる波長帯域の光の測定は、同時に行われてもよいし、同時に行われなくてもよい。また、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来の有無を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された単一粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの単一粒子の個別の検出、或いは、単一粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、単一粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の単一粒子検出技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の単一粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の単一粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（単一粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布を反転したプロファイルと略同様となる。）、個々の粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
　　（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　　…（４）
から、
　　Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ　　　…（５）
となるので、粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（６）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（３）光強度の分析
　上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の信号の検出、単一粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
（ｉ）単一粒子信号の個別検出
　時系列の光強度データに於いて、一つの粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した下に凸の略釣鐘状のプロファイルを有する（図４（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、背景光から計った適宜設定される閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度の低下のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、背景光Ｉｂｇから下に凸のガウス分布：
　　Ｉ＝Ｉｂｇ－Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（７）
であると仮定できるときには、有意な光強度の低下のプロファイル（背景光のゆらぎではないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（７）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
　時系列光強度データからの単一粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３－ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光物質の発する光は確率的に放出されるものであり、また、その光強度は、比較的微弱であるので、細かい増減が生じるところ、かかる光強度の細かい増減（ゆらぎ）は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。スムージング処理は、かかるデータ上の細かい増減を無視できるようにすることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法（例えば、隣接平均法、サビンスキー-ゴレイ(Savinsky-golay)法のアルゴリズム）、パーセンタイルフィルタ法、ＦＦＴフィルタ法により為されてよい。スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。例えば、移動平均法等により為されてよい。
　次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が単一粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、下に凸の釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピークの強度（背景光からの最大低下量）Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの単一粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度（式（７）のＡ、背景光の低下分の最大値）、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か、例えば、
下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞４．０［ｐｃ／１０μｓ］　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの粒子に対応する信号であると判定される。一方、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
　上記のステップ１３０～１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。特に、本実施形態に於いては、互いに異なる波長帯域の時系列光強度データの各々について、上記のステップ１１０～１７０が実行され、それぞれの波長帯域についての粒子に対応するパルス信号の数が計数されてよい。なお、時系列光強度データから単一粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
（ii）粒子濃度の決定
　更に、検出された単一粒子の信号の数を計数して、粒子の数の決定が為されてもよい（粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と粒子の数とから試料溶液中の粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。
　光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の単一粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
　　　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　…（８）
により与えられる。また、対照溶液として、単一粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、単一粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子濃度ｃは、
　　　ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　…（９）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（８））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が単一粒子検出を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
　かくして、光検出領域により試料溶液中にて走査して粒子を個別に検出する反転型走査分子計数法に於いて、上記の処理手順により、試料溶液中の粒子のカウンティング、濃度の決定等が可能となる。特に、本発明の場合に於いては、検出波長帯域毎に、粒子のカウンティングが為され、単一粒子濃度が決定され、これにより、粒子の種類毎の濃度の決定が可能となる。
（４）一定の信号数を検出する単一粒子検出処理
　上記の単一粒子検出処理に於いては、或る設定した時間に亘って光測定を実行した後、得られた光強度データ上にて単一粒子の信号が検出される。その場合、試料溶液中の粒子濃度が未知であるとき、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定を行う場合には、粒子の濃度が低い場合に備えて、測定時間は、十分に長く設定されることとなる。一方、試料溶液中の粒子の濃度が高い場合には、濃度等の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するのに必要な時間以上に光強度の測定が継続されることとなる。また、試料溶液中の粒子濃度が実験者の想定した濃度よりも低く、設定された測定時間が足りない場合には、結果の誤差が大きくなってしまう。そこで、単一粒子検出処理の別の態様として、光検出領域を移動しながらの光強度の測定と単一粒子の信号の検出とを信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間が計測され、かかる単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、粒子濃度が決定されてよい。かかる構成によれば、試料溶液中の粒子濃度が高い場合には、光強度の測定に要する時間は短縮され、試料溶液中の粒子濃度が低い場合には、結果（即ち、粒子濃度）に要求される精度を達成する粒子数が得られるまで光強度の測定を継続させることが可能となる。そして、単一粒子の信号の数が達するべき予め定められた数を結果に要求される精度を達成する粒子数に設定しておくことにより、単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間には、結果に要求される精度を達成する粒子数が反映されることとなるので、その時間に基づいて決定される粒子の濃度値は、許容可能な又は満足する精度を有していることが期待される。なお、かかる構成に於いても、本発明の場合には、光計測から粒子濃度の算定までが、複数の検出波長毎に実行される。
（ｉ）基本原理
　粒子の濃度値と、信号数が予め定められた数に達するのに要した時間とは、以下の如く、関係づけられる。即ち、或る粒子濃度Ｃの試料溶液中に於いて、時間τに亘って、光検出領域を走査速度ｕにて移動させた場合、光検出領域の断面積をＳとすると、検出される粒子信号の数Ｘは、
　　Ｘ＝ＣＳｕτＮＡ　　　…（１０）
となる。ここで、ＮＡは、アボガドロ数である。従って、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに時間Ｔを要したとすると、粒子濃度Ｃは、
　　Ｃ＝ＸＥ／（ＳＴｕＮＡ）　　　…（１１）
により、時間Ｔの関数として与えられる。なお、式（１１）に於いて、単位時間当たりの粒子の検出速度Ｖは、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに要した時間Ｔと粒子検出数ＸＥとに基づいて
　　Ｖ＝ＸＥ／Ｔ　　　…（１２）
により与えられるので、粒子濃度Ｃは、
　　Ｃ＝Ｖ／（ＳｕＮＡ）…（１３）
と表される。この式（１３）に於いては、粒子濃度Ｃが、検出速度Ｖに一次に比例し、粒子濃度Ｃと検出速度Ｖとの対応関係がわかり易いので、実際の実験に於いては、粒子濃度Ｃは、検出速度Ｖを用いて決定されてもよい。
（ii）処理操作手順
　一定の信号数を検出する単一粒子検出処理は、例えば、図５のフローチャートに示した処理手順により実行されてよい。同図の例に於いては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、単一粒子の信号の検出及び検出された粒子信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔ｔ（所定の時間間隔）毎に、検出された粒子数Ｘが終了粒子数ＸＥ（単一粒子数が到達すべき予め定められた数）に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ１８の処理作動により実現されることは理解されるべきである。
（ａ）初期設定
　図５を参照して、操作処理に於いて、具体的には、まず、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び解析時間間隔ｔの設定（ステップ２０）を行う。終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数ＸＥは、粒子濃度の結果値に要求される精度を達成できるように粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である。解析時間間隔ｔとしては、処理の開始後から粒子数（Ｘ）が終了粒子数（ＸＥ）に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置１に於ける処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、それぞれ、粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置１に於いて記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。
（ｂ）粒子数の検出
　上記の如く終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔ｔ毎に、解析時間間隔ｔに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの粒子信号の検出並びに粒子数ｘの検出（ステップ３０）と、ステップ３０にて検出された粒子数ｘを累積して粒子の総数Ｘ（ｔｎ）を算定する処理（ステップ４０）とが粒子の総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで（ステップ５０）、反復して実行される。なお、ステップ３０～５０の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Ｔｓが記憶されてよい（ステップ２５）。
　ステップ３０に於ける光検出・粒子数検出の処理は、図３に示した処理と同様であってよい。端的に述べれば、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔ｔに亘って為され、しかる後、得られた解析時間間隔ｔに於ける時系列光強度データに於いて、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の存在を表す信号の検出及び検出数のカウンティングが実行される。
　かくして、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データに於ける粒子数ｘが検出されると、単一粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が
　　Ｘ（ｔｎ）＝Ｘ（ｔｎ－１）＋ｘ　　　…（１４）
により算出される（図５－ステップ４０）。なお、Ｘ（ｔｎ－１）は、前回の解析時間間隔ｔまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は０である。そして、ステップ３０～４０は、単一粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで、即ち、
　　Ｘ（ｔｎ）≧ＸＥ　　　…（１５）
が成立するまで（ステップ５０）、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。そして、ステップ３０～５０を反復しているうちに、式（１５）が成立すると、試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップ３０～５０の反復処理が終了すると、終了時間ＴＥが記憶されてよい（ステップ６０）。
（ｃ）粒子数と測定終了時間の表示
　ところで、解析時間間隔ｔ毎にステップ３０～５０の反復実行期間に於いて（式（１５）が成立するまで）、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。
　上記の如き表示を実行する場合には、図５のステップ５０の判定に於いて、式（１５）が成立しなかった場合に、図中、点線にて示された各処理が実行される。具体的には、まず、ステップ４０に於いて算定された最新の粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が表示器上に表示される（ステップ５２）。なお、既にステップ３０～５０の反復実行が為されている場合には、それまでの粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）の値が更新される。次いで、測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒを算出するために、ステップ３０～５０の処理の開始後からの粒子の検出速度ｖが算出される（ステップ５４）。現在までの粒子の検出速度ｖは、
　　ｖ＝Ｘ（ｔｎ）／（Ｔｐ－Ｔｓ）　　　…（１６）
により与えられてよい。ここで、Ｔｐは、現在の時刻である。かくして、粒子の検出速度ｖを用いて、測定残り時間Ｔｒ（ステップ３０～５０の処理終了までの時間）が、
　　Ｔｒ＝（ＸＥ－Ｘ（ｔｎ））／ｖ　　　…（１７）
により推定され、また、測定終了時間ＴＥ（ステップ３０～５０の処理が終了する時間）が、
　　ＴＥ＝Ｔｐ＋Ｔｒ　　　…（１８）
により推定される（ステップ５６）。そして、推定された測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示器上に表示される（ステップ５８）。なお、既にステップ３０～５０の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、Ｘ（ｔｎ）＝０のときは、式（１７）又は（１８）は、演算されずに、Ｔｒ及びＴＥは、不明であると表示されてよい。
　上記の図５のステップ３０～５０の処理は、既に述べた如く、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。この点に関し、図３のステップ１００の光強度の測定は、測定の開始から終了まで、ステップ１００以外の信号処理ステップの実行中も連続的に実行されてよい。即ち、光検出・粒子数検出の処理に於いては、一つのサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了されると、次のサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定がそのまま連続して実行されると同時に、コンピュータ１８に於いて、完了したサイクルの解析時間間隔ｔに亘って取得された光強度データからの粒子の信号の検出・計数の処理が実行されることとなる。これにより、リアルタイムに粒子の検出・計数が達成されることとなる。
（ｄ）濃度算出等の分析
　かくして、粒子数が終了粒子数に到達すると、粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間Ｔ（＝ＴＥ－Ｔｓ）或いは検出された粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい（ステップ７０）。粒子濃度は、既に述べた如く、式（１２）を用いて、終了粒子数に到達するまでの時間Ｔと終了粒子数ＸＥとから、粒子の検出速度Ｖを算出し、粒子の検出速度Ｖから、式（１３）の関係を用いて決定される。
　なお、式（１０）～（１３）中の光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出・計数を行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の単一粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの対照溶液について、移動速度ｕｏにて或る時間τｏに亘って実行された光強度の測定に於ける粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、
　　　Ｓ＝Ｎ／（Ｃ・ＮＡ・ｕｏ・τｏ）　　　…（１９）
により与えられる。また、対照溶液として、粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＳの平均値が光検出領域の断面積Ｓとして採用されるようになっていてよい。
（ｅ）試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の修正例
　上記の試料溶液の光強度の測定と単一粒子の検出・計数の処理に於いて、別の態様として、解析時間間隔ｔは、固定値ではなく、単一粒子の検出状況に応じて修正されるようになっていてもよい。図６（Ａ）は、解析時間間隔ｔを粒子の検出状況に応じて修正する処理（ステップ２０’）を含むよう構成された試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理をフローチャートの形式で表したものであり、図６（Ｂ）は、ステップ２０’に於ける解析時間間隔ｔの演算処理をフローチャートの形式で表したものである。なお、図６（Ａ）に於いて、図５と同一の処理には、同一のステップ番号が付されている。
　同図を参照して、図６の処理では、解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了する毎に解析時間間隔ｔが修正される（ステップ２０’）。また、図示の例の処理は、特に、開始から粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまでの一回の測定に於いて、予め定められた回数Ｎ（以下、「更新予定回数」と称する。）だけ、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクルが実行されるよう構成される。具体的には、まず、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び開始時間Ｔｓの記憶（ステップ２５）の後、最初に光強度の測定と粒子の検出・計数の処理を実行する際、即ち、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクルの実行回数ｋが０のとき、解析時間間隔ｔに、任意に設定されてよい初期値ｔｏが与えられる（図６（Ｂ）ステップ２００、２１０参照）。そして、処理サイクルの実行回数ｋが１増大され（ステップ２７０）、図５に記載の処理と同様に解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定及び粒子の検出・計数の処理が実行される（ステップ３０～５０）。かくして、最初のサイクルの粒子数ｘ（＝Ｘ（ｔ１））が得られると、粒子検出速度ｖ（ステップ５４）、測定残り時間Ｔｒ（ステップ５６）が順に算定される。なお、図５の場合と同様に、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい（ステップ５２、５８）。また、最初の処理サイクルで粒子数が終了粒子数ＸＥに到達していたときには、そのまま、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理が終了する（ステップ５０）。
　最初の処理サイクルの後、解析時間間隔ｔの修正と、図５の場合と同様の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクル（ステップ２０’、３０～５８）が、粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまで反復される。その際、解析時間間隔ｔの修正を行うステップ２０’に於いては、まず、そのときまでに検出されている粒子数Ｘ（ｔｎ）が０であるか否かが判定される（ステップ２２０）。Ｘ（ｔｎ）＝０のときは、直前のサイクルに於ける解析時間間隔ｔがｍ倍されてよい（ｍは、１以上の正数）。Ｘ（ｔｎ）＞０であるときには、測定残り時間Ｔｒと更新予定回数Ｎと処理サイクルの実行回数ｋとを用いて、解析時間間隔ｔが、
　　ｔ＝Ｔｒ／（Ｎ－ｋ）　　　…（２０）
により算定される（ステップ２４０）。なお、算定される解析時間間隔ｔには、下限が設定されていてよく、解析時間間隔ｔが下限値ｔｍｉｎを下回るときには、解析時間間隔ｔは、下限値ｔｍｉｎに設定されてよい（ステップ２５０、２６０）。上記の如く、解析時間間隔ｔが修正される態様によれば、測定残り時間Ｔｒには、観測対象となっている試料溶液中の粒子の検出状況が反映されているので、解析時間間隔ｔがかかる粒子の検出状況に応じて最適化されることとなる。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
　反転型走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データに於いて、発光しない単一粒子の存在を表す信号が検出可能であることを共焦点蛍光顕微鏡像により検証した。
　試料溶液として、２００μＭの蛍光色素ＡＴＴＯ４８８と５０μＭの蛍光色素ＡＴＴＯ６３３と１０ｆＭの蛍光ビーズ（FP-4052-2:spherotec(Ｄ:4000nm)）とを含む２０％ポリエチレングリコール溶液を調製した。かかる試料溶液を共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス社）を用いて観察し、共焦点蛍光顕微鏡像を得た。測定は、励起光４７３ｎｍ（１２０μＷ）と励起光６３５ｎｍ（４７μＷ）を用いて行った。用いられた蛍光ビーズは、励起光４７３ｎｍにて照明すると発光し、励起光６３５ｎｍにて照明したときには、殆ど発光しない粒子である。ＡＴＴＯ４８８とＡＴＴＯ６３３とは、それぞれ、励起光４７３ｎｍと励起光６３５ｎｍとにて蛍光観察する際の背景光を放出するための発光物質である。
　図７は、（Ａ）励起光４７３ｎｍにて、及び、（Ｂ）励起光６３５ｎｍにて、それぞれ観察された共焦点蛍光顕微鏡像を示している。図から理解される如く、（Ａ）励起光４７３ｎｍの場合には、ビーズの影は殆ど検出されなかったのに対し、（Ｂ）励起光６３５ｎｍの場合には、各ビーズの影が観察された。このことは、本発明の如く、特定の波長帯域で発光し別の波長帯域で殆ど発光しない粒子の存在がその粒子の非発光波長帯域の背景光の存在下に於いては検出可能であり、発光波長帯域の背景光の存在下に於いて検出されないことを示している。
　反転型走査分子計数法に従って、ビーズを含む試料溶液中に於いて、ビーズの計数を行った。試料溶液として、０．５μＭの蛍光色素ＡＴＴＯ４８８を含む２０％ポリエチレングリコール溶液に１０ｆＭにて非蛍光ビーズ（CP-40-10: spherotec(Ｄ:4000nm)）を分散させた溶液１及び１０ｆＭにて蛍光ビーズ（FP-4052-2:spherotec(Ｄ:4000nm)）を分散させた溶液２とを調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の二つの試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、５０μＷの４８８ｎｍのレーザー光を用い、光学フィルター（６１５ＬＰと６７０ＢＰ）により、６５０－６９０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列フォトンカウントデータを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、９０００ｒｐｍ（６７．５ｍｍ／秒）とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを５０μ秒とし、１００秒間の測定を各溶液について３回ずつ行った。なお、上記の条件に於いては、溶液２中のビーズは蛍光を発するので、光強度の低下が生じ難い状態である。
　光計測後のデータ処理に於いては、まず、取得された時系列フォトンカウントデータに於いて、「（ｉ）単一粒子の信号の個別検出」及び図３のステップ１１０～１６０に記載された要領に従って、時系列フォトンカウントデータにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度（背景光からの低下量の最大値）、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度≧背景光の平均値の２０％　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを単一粒子の信号として抽出した。
　図８は、ビーズを含まない溶液、無蛍光ビーズを含む溶液１、蛍光ビーズを含む溶液２について、上記の手順にて、時系列フォトンカウントデータに於いて検出されたパルスの数を示している。同図を参照して、無蛍光ビーズを含む溶液１に於いては、パルス数が２７００個程度検出されたのに対し、蛍光ビーズを含む溶液２に於いては、パルス数が大幅に減少した。これは、蛍光ビーズの発する光によって、背景光からの光強度の低下が生じ難くなったためであることを示唆している。かかる結果は、背景光と同様の光を発するか否かで、試料溶液中の特定の種類の粒子の検出が可能であることを示している。（蛍光ビーズを含む溶液２に於いて、パルス数が検出された理由は、蛍光ビーズの発光輝度にばらつきが存在するためであると考えられる。即ち、蛍光ビーズとされるビーズ中に於いて、発光輝度の弱いものが含まれていたためである。）
　かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従った複数波長帯域に於ける反転型走査分子計数法によれば、試料溶液中に分散された発光波長帯域と非発光波長帯域とが互いに異なる単一粒子の検出及びその濃度に関する情報の取得が粒子の種類毎に可能となる。特に、本発明は、単一粒子の信号を個別に検出するので、試料溶液中の粒子濃度が、ＦＣＳ等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、粒子の検出が可能であり、かかる特徴は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。

Claims (12)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出装置であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
    　前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
    　前記単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず前記第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、前記第一の波長帯域に於いて発光し前記第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、前記光検出部により検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第一の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光検出部にて検出される光強度の低下であり、前記光検出部により検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第二の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光検出部にて検出される光強度の低下であることを特徴とする装置。
  2. 　請求項１の装置であって、前記光検出部により検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、前記光検出部により検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう前記背景光の強度が調節されていることを特徴とする装置。
  3. 　請求項２の装置であって、前記背景光の強度が前記試料溶液中に発光粒子を分散することによって調節されていることを特徴とする装置。
  4. 　請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数することを特徴とする装置。
  5. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出方法であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
    　前記時系列光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する過程と
    を含み、
    　前記単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず前記第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、前記第一の波長帯域に於いて発光し前記第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、前記検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第一の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記時系列光強度データに於ける光強度の低下であり、前記検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第二の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記時系列光強度データに於ける光強度の低下であることを特徴とする方法。
  6. 　請求項５の方法であって、前記検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、前記検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう前記背景光の強度が調節されていることを特徴とする方法。
  7. 　請求項６の方法であって、前記背景光の強度が前記試料溶液中に発光粒子を分散することによって調節されていることを特徴とする方法。
  8. 　請求項５乃至７のいずれかの方法であって、更に、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
  9. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出用コンピュータプログラムであって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
    　前記時系列光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する手順と
    をコンピュータに実行させ、
    　前記単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず前記第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、前記第一の波長帯域に於いて発光し前記第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、前記検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第一の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光強度データに於ける光強度の低下であり、前記検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第二の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光強度データに於ける光強度の低下であることを特徴とするコンピュータプログラム。
  10. 　請求項９のコンピュータプログラムであって、前記検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、前記検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう前記背景光の強度が調節されていることを特徴とするコンピュータプログラム。
  11. 　請求項１０のコンピュータプログラムであって、前記背景光の強度が前記試料溶液中に発光粒子を分散することによって調節されていることを特徴とするコンピュータプログラム。
  12. 　請求項９乃至１１のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
     
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