JP6010033B2 - 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム - Google Patents
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Description
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
14a…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
本発明による単一粒子検出技術を実現する単一粒子検出装置は、基本的な構成に於いて、図1(A)に模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、単一粒子検出装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。単一粒子検出装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光(Ex)が、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。なお、試料溶液中には、典型的には、観測対象物である単一粒子と、背景光を生ずる任意の発光物質が分散又は溶解されており、単一粒子が励起領域に進入していないときには、発光物質が励起されて実質的に一定の光が放出されて、背景光となり、単一粒子が励起領域に進入すると、背景光が低減することとなる。
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の単一粒子検出技術に於いては、端的に述べれば、単一粒子の影を検出する形式の走査分子計数法(以下、「反転型走査分子計数法」と称する。)にて、即ち、背景光の存在下で、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動し、単一粒子が光検出領域に包含された際の背景光の低下を単一粒子の信号として検出する態様にて、単一粒子の存在が個別に検出され、その計数、或いは、試料溶液中の濃度に関する情報が取得される。以下、本発明による反転型走査分子計数法の原理について説明する。
FCS、FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度(フォトンカウント)が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、発光粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号(フォトンカウント)が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
α=4π∫r2f(r)dr [積分区間は、0〜a] …(1)
にて与えられる。一方、光検出領域内に、半径bの単一粒子が進入し、図2(C)の下段の如く光検出領域の中心に位置するとき、その領域の発光物質が排除されることとなるので、図2(C)の上段の斜線領域に相当する光量が低減することとなる。その排除される発光物質に相当する光量、つまり低下量βは、
β=4π∫r2f(r)dr [積分区間は、0〜b] …(2)
にて与えられる。かくして、光強度の低下の割合は、β/αにより概算することが可能となる。
f(r)=0.684exp(−2r2) …(3)
となる。図2(D)は、式(3)を用いて、半径比b/aに対する光強度の低下の割合β/αをプロットした図である。同図を参照して、典型的には、背景光の変動率が1%程度であり、単一粒子による光強度の低下の割合が1%以下であると、信号の検出が不可能となるので、光検出領域の半径に対する単一粒子半径の比b/aは、0.15以上とすべきである。また、単一粒子による光強度の低下の割合を10%以上とする場合には、光検出領域の半径に対する検出可能な単一粒子半径の比b/aは、0.35となる。
図1(A)に例示の単一粒子検出装置1を用いた本発明に従った反転型走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、(1)単一粒子と背景光を生成する発光物質とを含む試料溶液の調製、(2)試料溶液の光強度の測定処理、及び(3)測定された光強度の分析処理が実行される。図3は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
本発明の単一粒子検出技術の観測対象物となる粒子は、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であって、粒径が光検出領域の径の好適には15%以上、より好適には、35%以上であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物、非生物学的な粒子(例えば、原子、分子、ミセル、リポソーム、金属コロイド、ビーズ(磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等)、消光剤(アゾベンゼン類(dabcyl,BHQなど)、金属粒子など)などであってよい。この点に関し、「発明の概要」の欄に於いて既に述べた如く、本発明では、単一粒子が光検出領域内に存在することによる光検出領域からの光量の有意な低下を検出するので、単一粒子は、検出光波長帯域に於いて背景光よりも発光強度が低い粒子であってもよい。また、背景光を与える発光物質としては、任意の発光分子、例えば、蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子であってよく、発光物質は、光検出領域内に常に数分子以上存在する濃度にて試料溶液中に溶解又は分散される。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってもよい。
本実施形態の反転型走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器17又はステージ位置変更装置17aを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行う他は、FCS又はFIDAに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器17又はステージ位置変更装置17aは、ミラー7(ガルバノミラー)又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート9を駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器16は、一光子の到来の有無を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2Wo)2=6D・Δt …(4)
から、
Δt=(2Wo)2/6D …(5)
となるので、粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo …(6)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の信号の検出、単一粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
時系列の光強度データに於いて、一つの粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図4(B)に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、(光学系により決定される)光検出領域内の光強度分布を反映した下に凸の略釣鐘状のプロファイルを有する(図4(C)最上段参照)。従って、走査分子計数法では、基本的には、背景光から計った適宜設定される閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度の低下のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、背景光Ibgから下に凸のガウス分布:
I=Ibg−A・exp(−2t2/a2) …(7)
であると仮定できるときには、有意な光強度の低下のプロファイル(背景光のゆらぎではないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(7)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。)
下記の条件:
20μ秒<パルス幅<400μ秒
ピーク強度>4.0[pc/10μs] …(A)
相関係数>0.95
を満たすか否か等が判定される(ステップ150)。かくして、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの粒子に対応する信号であると判定される。一方、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
更に、検出された単一粒子の信号の数を計数して、粒子の数の決定が為されてもよい(粒子のカウンティング)。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と粒子の数とから試料溶液中の粒子の数密度又は濃度が決定される(ステップ170)。
Vt=N/C …(8)
により与えられる。また、対照溶液として、単一粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、単一粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の粒子濃度cは、
c=n/Vt …(9)
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Cと粒子の数Nとの関係(式(6))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が単一粒子検出を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
上記の単一粒子検出処理に於いては、或る設定した時間に亘って光測定を実行した後、得られた光強度データ上にて単一粒子の信号が検出される。その場合、試料溶液中の粒子濃度が未知であるとき、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定を行う場合には、粒子の濃度が低い場合に備えて、測定時間は、十分に長く設定されることとなる。一方、試料溶液中の粒子の濃度が高い場合には、濃度等の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するのに必要な時間以上に光強度の測定が継続されることとなる。また、試料溶液中の粒子濃度が実験者の想定した濃度よりも低く、設定された測定時間が足りない場合には、結果の誤差が大きくなってしまう。そこで、単一粒子検出処理の別の態様として、光検出領域を移動しながらの光強度の測定と単一粒子の信号の検出とを信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間が計測され、かかる単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、粒子濃度が決定されてよい。かかる構成によれば、試料溶液中の粒子濃度が高い場合には、光強度の測定に要する時間は短縮され、試料溶液中の粒子濃度が低い場合には、結果(即ち、粒子濃度)に要求される精度を達成する粒子数が得られるまで光強度の測定を継続させることが可能となる。そして、単一粒子の信号の数が達するべき予め定められた数を結果に要求される精度を達成する粒子数に設定しておくことにより、単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間には、結果に要求される精度を達成する粒子数が反映されることとなるので、その時間に基づいて決定される粒子の濃度値は、許容可能な又は満足する精度を有していることが期待される。
粒子の濃度値と、信号数が予め定められた数に達するのに要した時間とは、以下の如く、関係づけられる。即ち、或る粒子濃度Cの試料溶液中に於いて、時間τに亘って、光検出領域を走査速度uにて移動させた場合、光検出領域の断面積をSとすると、検出される粒子信号の数Xは、
X=CSuτNA …(10)
となる。ここで、NAは、アボガドロ数である。従って、信号数が予め定められた数XEに達するのに時間Tを要したとすると、粒子濃度Cは、
C=XE/(STuNA) …(11)
により、時間Tの関数として与えられる。なお、式(11)に於いて、単位時間当たりの粒子の検出速度Vは、信号数が予め定められた数XEに達するのに要した時間Tと粒子検出数XEとに基づいて
V=XE/T …(12)
により与えられるので、粒子濃度Cは、
C=V/(SuNA)…(13)
と表される。この式(13)に於いては、粒子濃度Cが、検出速度Vに一次に比例し、粒子濃度Cと検出速度Vとの対応関係がわかり易いので、実際の実験に於いては、粒子濃度Cは、検出速度Vを用いて決定されてもよい。
一定の信号数を検出する単一粒子検出処理は、例えば、図5のフローチャートに示した処理手順により実行されてよい。同図の例に於いては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、単一粒子の信号の検出及び検出された粒子信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔t(所定の時間間隔)毎に、検出された粒子数Xが終了粒子数XE(単一粒子数が到達すべき予め定められた数)に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ18の処理作動により実現されることは理解されるべきである。
図5を参照して、操作処理に於いて、具体的には、まず、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、初期設定として、終了粒子数XEの設定(ステップ10)及び解析時間間隔tの設定(ステップ20)を行う。終了粒子数XEと解析時間間隔tとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数XEは、粒子濃度の結果値に要求される精度を達成できるように粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である。解析時間間隔tとしては、処理の開始後から粒子数(X)が終了粒子数(XE)に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置1に於ける処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数XEと解析時間間隔tとは、それぞれ、粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置1に於いて記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。
上記の如く終了粒子数XEと解析時間間隔tの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔t毎に、解析時間間隔tに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの粒子信号の検出並びに粒子数xの検出(ステップ30)と、ステップ30にて検出された粒子数xを累積して粒子の総数X(tn)を算定する処理(ステップ40)とが粒子の総数X(tn)が終了粒子数XEに到達するまで(ステップ50)、反復して実行される。なお、ステップ30〜50の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Tsが記憶されてよい(ステップ25)。
X(tn)=X(tn−1)+x …(14)
により算出される(図5−ステップ40)。なお、X(tn−1)は、前回の解析時間間隔tまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は0である。そして、ステップ30〜40は、単一粒子の検出総数X(tn)が終了粒子数XEに到達するまで、即ち、
X(tn)≧XE …(15)
が成立するまで(ステップ50)、解析時間間隔t毎に繰り返される。そして、ステップ30〜50を反復しているうちに、式(15)が成立すると、試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップ30〜50の反復処理が終了すると、終了時間TEが記憶されてよい(ステップ60)。
ところで、解析時間間隔t毎にステップ30〜50の反復実行期間に於いて(式(15)が成立するまで)、コンピュータ18のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数X(tn)及び/又は測定終了時間TE若しくは測定残り時間Trが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。
v=X(tn)/(Tp−Ts) …(16)
により与えられてよい。ここで、Tpは、現在の時刻である。かくして、粒子の検出速度vを用いて、測定残り時間Tr(ステップ30〜50の処理終了までの時間)が、
Tr=(XE−X(tn))/v …(17)
により推定され、また、測定終了時間TE(ステップ30〜50の処理が終了する時間)が、
TE=Tp+Tr …(18)
により推定される(ステップ56)。そして、推定された測定終了時間TE若しくは測定残り時間Trが表示器上に表示される(ステップ58)。なお、既にステップ30〜50の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、X(tn)=0のときは、式(17)又は(18)は、演算されずに、Tr及びTEは、不明であると表示されてよい。
かくして、粒子数が終了粒子数に到達すると、粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間T(=TE−Ts)或いは検出された粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい(ステップ70)。粒子濃度は、既に述べた如く、式(12)を用いて、終了粒子数に到達するまでの時間Tと終了粒子数XEとから、粒子の検出速度Vを算出し、粒子の検出速度Vから、式(13)の関係を用いて決定される。
S=N/(C・NA・uo・τo) …(19)
により与えられる。また、対照溶液として、粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたSの平均値が光検出領域の断面積Sとして採用されるようになっていてよい。
上記の試料溶液の光強度の測定と単一粒子の検出・計数の処理に於いて、別の態様として、解析時間間隔tは、固定値ではなく、単一粒子の検出状況に応じて修正されるようになっていてもよい。図6(A)は、解析時間間隔tを粒子の検出状況に応じて修正する処理(ステップ20’)を含むよう構成された試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理をフローチャートの形式で表したものであり、図6(B)は、ステップ20’に於ける解析時間間隔tの演算処理をフローチャートの形式で表したものである。なお、図6(A)に於いて、図5と同一の処理には、同一のステップ番号が付されている。
t=Tr/(N−k) …(20)
により算定される(ステップ240)。なお、算定される解析時間間隔tには、下限が設定されていてよく、解析時間間隔tが下限値tminを下回るときには、解析時間間隔tは、下限値tminに設定されてよい(ステップ250、260)。上記の如く、解析時間間隔tが修正される態様によれば、測定残り時間Trには、観測対象となっている試料溶液中の粒子の検出状況が反映されているので、解析時間間隔tがかかる粒子の検出状況に応じて最適化されることとなる。
20μ秒<パルス幅<400μ秒
ピーク強度>4[pc/10μs] …(A)
相関係数>0.95
を満たすパルス信号のみを単一粒子の信号として抽出し、その信号数を計数した。
Claims (36)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出装置であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、これにより、前記単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に前記光検出部にて検出される光強度の低下が生じ、
前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於いて、前記光検出領域内を一つの単一粒子が相対的に移動する間に想定されるプロファイルを有する前記光強度の低下を一つの単一粒子の信号として個別に検出することを特徴とする装置。 - 請求項1の装置であって、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光又は照明光であることを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、前記単一粒子の検出光波長帯域に於ける発光強度が背景光より低いことを特徴とする装置。
- 請求項1乃至3のいずれかの装置であって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の15%以上であることを特徴とする装置。
- 請求項4の装置であって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の35%以上であることを特徴とする装置。
- 請求項1乃至5のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至6のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至7のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに1つの単一粒子が前記光検出領域に入ったと判定することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至8のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記時系列光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記単一粒子の存在を表す信号として検出することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至9のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至10のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された単一粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至10のいずれかの装置であって、前記信号処理部が検出した前記単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域移動部による前記光学系の光検出領域の位置の移動と、前記光検出部による前記光検出領域からの光の検出と、前記信号処理部による前記単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、前記単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記単一粒子の濃度を決定することを特徴とする装置。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出方法であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域からの光にして、実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に光強度の低下が生ずる光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列光強度データに於いて前記光検出領域内を一つの単一粒子が相対的に移動する間に想定されるプロファイルを有する前記光強度の低下を一つの単一粒子の存在を表す信号として個別に検出する過程と
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項13の方法であって、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光又は照明光であることを特徴とする方法。
- 請求項13の方法であって、前記単一粒子の検出光波長帯域に於ける発光強度が背景光より低いことを特徴とする方法。
- 請求項13乃至15のいずれかの方法であって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の15%以上であることを特徴とする方法。
- 請求項16の方法であって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の35%以上であることを特徴とする方法。
- 請求項13乃至17のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
- 請求項13乃至18のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする方法。
- 請求項13乃至19のいずれかの方法であって、前記単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに1つの単一粒子が前記光検出領域に入ったと判定することを特徴とする方法。
- 請求項13乃至20のいずれかの方法であって、前記単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記単一粒子の存在を表す信号として検出することを特徴とする方法。
- 請求項13乃至21のいずれかの方法であって、更に、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項13乃至22のいずれかの方法であって、更に、前記検出された単一粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項13乃至22のいずれかの方法であって、前記単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域の位置の移動と、前記光検出領域からの光の検出と、前記単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、前記単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記単一粒子の濃度を決定することを特徴とする方法。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出用コンピュータプログラムであって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域からの光にして、実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に光強度の低下が生ずる光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
前記時系列光強度データに於いて前記光検出領域内を一つの単一粒子が相対的に移動する間に想定されるプロファイルを有する前記光強度の低下を一つの単一粒子の存在を表す信号として個別に検出する手順と、
をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。 - 請求項25のコンピュータプログラムであって、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光又は照明光であることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項26のコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の検出光波長帯域に於ける発光強度が背景光より低いことを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項25乃至27のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の15%以上であることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項28のコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の35%以上であることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項25乃至29のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項25乃至30のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動することを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項25乃至31のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに1つの単一粒子が前記光検出領域に入ったと判定することを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項25乃至32のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記単一粒子の存在を表す信号として検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項25乃至33のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項25乃至34のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された単一粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項25乃至34のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域の位置の移動と、前記光検出領域からの光の検出と、前記単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、前記単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記単一粒子の濃度を決定することを特徴とするコンピュータプログラム。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP2778658A4 (en) | 2011-11-10 | 2015-12-02 | Olympus Corp | SPECTROSCOPY DEVICE, SPECTROSCOPY PROCESS AND SPECTROSCOPY COMPUTER PROGRAM DETECTING SINGLE LIGHT-EMITTING PARTICLES |
US9291562B2 (en) * | 2011-11-15 | 2016-03-22 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. | Method and apparatus for tracking a particle, particularly a single molecule, in a sample |
JP2015083922A (ja) * | 2012-02-07 | 2015-04-30 | オリンパス株式会社 | 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム |
EP2816344A4 (en) | 2012-02-17 | 2015-09-23 | Olympus Corp | OPTICAL ANALYSIS DEVICE USING SINGLE PARTICLE DETECTION TECHNIQUE, OPTICAL ANALYSIS METHOD, AND COMPUTER PROGRAM FOR OPTICAL ANALYSIS |
JP5940651B2 (ja) | 2012-04-18 | 2016-06-29 | オリンパス株式会社 | 標的粒子の検出方法 |
JP6010114B2 (ja) * | 2012-04-18 | 2016-10-19 | オリンパス株式会社 | 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム |
CN104736999B (zh) * | 2012-10-25 | 2017-04-12 | 奥林巴斯株式会社 | 目标粒子的检测方法 |
US10352844B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-07-16 | Particles Plus, Inc. | Multiple particle sensors in a particle counter |
US9677990B2 (en) | 2014-04-30 | 2017-06-13 | Particles Plus, Inc. | Particle counter with advanced features |
US11579072B2 (en) | 2013-03-15 | 2023-02-14 | Particles Plus, Inc. | Personal air quality monitoring system |
US10983040B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-04-20 | Particles Plus, Inc. | Particle counter with integrated bootloader |
JP6313776B2 (ja) * | 2013-10-07 | 2018-04-18 | オリンパス株式会社 | 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム |
WO2015108023A1 (ja) * | 2014-01-17 | 2015-07-23 | 株式会社ニコン | 微粒子分析装置、観察装置、微粒子分析プログラムおよび微粒子分析方法 |
JP6228858B2 (ja) * | 2014-02-06 | 2017-11-08 | 日本電子株式会社 | 粒子解析装置、およびプログラム |
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EP3472591B1 (en) * | 2016-06-20 | 2023-08-30 | Plair SA | Device and method for detecting and/or characterizing fluid-borne particles |
JP6742435B2 (ja) * | 2016-12-08 | 2020-08-19 | 東京エレクトロン株式会社 | 信号処理方法及びプログラム |
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CN113340894B (zh) * | 2021-05-28 | 2023-04-07 | 上海睿钰生物科技有限公司 | 一种非透明微粒的检测方法 |
CN115046926A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-09-13 | 湖南超亟检测技术有限责任公司 | 一种基于编组直排光栅的扫描识别方法及扫描识别系统 |
Family Cites Families (67)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4251733A (en) | 1978-06-29 | 1981-02-17 | Hirleman Jr Edwin D | Technique for simultaneous particle size and velocity measurement |
US4284355A (en) * | 1979-10-29 | 1981-08-18 | Ortho Diagnostics, Inc. | Automated method for cell volume determination |
CA2035703A1 (en) * | 1991-01-22 | 1992-07-23 | Pedro Lilienfeld | System and method for determining and printing airborne particle concentration |
JPH04337446A (ja) | 1991-05-15 | 1992-11-25 | Hitachi Ltd | 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置 |
US5866336A (en) | 1996-07-16 | 1999-02-02 | Oncor, Inc. | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
EP0836090A1 (en) | 1996-10-12 | 1998-04-15 | Evotec BioSystems GmbH | Method of analysis of samples by determination of the distribution of specific brightnesses of particles |
US6235471B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-05-22 | Caliper Technologies Corp. | Closed-loop biochemical analyzers |
US6710871B1 (en) | 1997-06-09 | 2004-03-23 | Guava Technologies, Inc. | Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples |
GB2326229A (en) | 1997-06-13 | 1998-12-16 | Robert Jeffrey Geddes Carr | Detecting and analysing submicron particles |
SE9800360D0 (sv) | 1998-02-06 | 1998-02-06 | Goeteborg University Science I | Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules |
JP4812937B2 (ja) | 1998-03-16 | 2011-11-09 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション | 共焦点顕微鏡イメージングシステム |
US6388788B1 (en) | 1998-03-16 | 2002-05-14 | Praelux, Inc. | Method and apparatus for screening chemical compounds |
US20030036855A1 (en) | 1998-03-16 | 2003-02-20 | Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey | Method and apparatus for screening chemical compounds |
WO2000066985A1 (en) | 1999-04-29 | 2000-11-09 | Evotec Biosystems Ag | A method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions |
US6376843B1 (en) | 1999-06-23 | 2002-04-23 | Evotec Oai Ag | Method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions |
WO2000071991A1 (en) * | 1999-05-25 | 2000-11-30 | Biometric Imaging, Inc. | Apparatus and method for optical detection in a limited depth of field |
US8264680B2 (en) | 1999-05-28 | 2012-09-11 | Yokogawa Electric Corporation | Biochip reader and electrophoresis system |
US6965113B2 (en) | 2000-02-10 | 2005-11-15 | Evotec Ag | Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness |
US20010035954A1 (en) | 2000-03-10 | 2001-11-01 | Rahn John Richard | Method and apparatus for measuring particle size distributions using light scattering |
DE10035190C5 (de) | 2000-07-20 | 2009-07-16 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung |
DE10038528A1 (de) | 2000-08-08 | 2002-02-21 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Erhöhung der spektralen und räumlichen Detektorauflösung |
US6947133B2 (en) | 2000-08-08 | 2005-09-20 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors |
HU226937B1 (en) | 2000-11-17 | 2010-03-29 | Mta Szegedi Biolog Koezpont | Method and apparatus for determining polarization amount of material by a laser scanning microscope |
WO2002048693A1 (fr) * | 2000-12-14 | 2002-06-20 | Olympus Optical Co., Ltd. | Analyseur fluorometrique et analyse fluorometrique |
US6633368B2 (en) | 2001-01-02 | 2003-10-14 | Becton, Dickinson And Company | Method for determining the volume of single red blood cells |
US6782297B2 (en) | 2001-05-24 | 2004-08-24 | Eric Paul Tabor | Methods and apparatus for data smoothing |
US6750963B2 (en) | 2002-05-21 | 2004-06-15 | Agilent Technologies, Inc. | Imaging systems for signals on a surface |
US20040090613A1 (en) * | 2002-07-17 | 2004-05-13 | Goix Philippe J. | Method for measuring the volume of cells or particles |
ES2306900T3 (es) | 2002-11-07 | 2008-11-16 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Sondas fret y metodos para detectar moleculas de interaccion. |
US6929945B2 (en) * | 2002-12-09 | 2005-08-16 | Advanced Fluidix Laboratories Llc | Male fertility assay method and device |
US7038848B2 (en) | 2002-12-27 | 2006-05-02 | Olympus Corporation | Confocal microscope |
JP4315794B2 (ja) | 2002-12-27 | 2009-08-19 | オリンパス株式会社 | 共焦点顕微鏡 |
JP2005098876A (ja) | 2003-09-25 | 2005-04-14 | Institute Of Physical & Chemical Research | 2成分相互作用分析方法 |
AU2005290314A1 (en) | 2004-09-28 | 2006-04-06 | Singulex, Inc. | System and method for spectroscopic analysis of single particles |
GB0427050D0 (en) * | 2004-12-10 | 2005-01-12 | Amersham Biosciences Uk Ltd | Method of,and apparatus and computer software for,imaging biological objects |
AU2006210424A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods and devices for characterizing particles in clear and turbid media |
JP4757103B2 (ja) | 2005-06-13 | 2011-08-24 | 学校法人関西文理総合学園 | 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム |
JPWO2007010803A1 (ja) | 2005-07-15 | 2009-01-29 | オリンパス株式会社 | 光測定装置 |
WO2007118209A2 (en) | 2006-04-07 | 2007-10-18 | Kim Laboratories | Apparatus and method for rapid detection of analytes |
US8445655B2 (en) | 2006-06-16 | 2013-05-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Functional nucleic acid ligands to fluorescent proteins |
WO2008007580A1 (fr) | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Olympus Corporation | Procédé d'analyse de particules fines |
US20080052009A1 (en) | 2006-08-23 | 2008-02-28 | Washington, University Of | Method for deconvolving single-molecule intensity distributions for quantitative biological measurements |
GB0618057D0 (en) | 2006-09-14 | 2006-10-25 | Perkinelmer Ltd | Improvements in and relating to scanning confocal microscopy |
US7413666B2 (en) * | 2006-09-18 | 2008-08-19 | Bryant Robert L | Method for selectively sampling particulates in boiler/steam cycle corrosion transport |
JP5473202B2 (ja) | 2006-10-13 | 2014-04-16 | 滋賀県 | 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム |
WO2008080417A1 (en) | 2006-12-28 | 2008-07-10 | Flult Biosystems Gmbh | A method of determining characteristic properties of a sample containing particles |
US7804594B2 (en) * | 2006-12-29 | 2010-09-28 | Abbott Laboratories, Inc. | Method and apparatus for rapidly counting and identifying biological particles in a flow stream |
EP2124085A4 (en) | 2007-02-14 | 2010-04-28 | Nikon Corp | CONFOCAL SLOTTED SCANNING MICROSCOPE |
JP2008292371A (ja) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Institute Of Physical & Chemical Research | 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法 |
JP2009145242A (ja) | 2007-12-14 | 2009-07-02 | Olympus Corp | 光測定装置 |
CN101946180B (zh) | 2007-12-19 | 2013-11-13 | 神谷来克斯公司 | 单分子检测用扫描分析器和使用方法 |
DE102008013715B4 (de) | 2008-02-29 | 2011-12-08 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Verfahren zur DNA-Analyse |
JP5139885B2 (ja) | 2008-05-21 | 2013-02-06 | 浜松ホトニクス株式会社 | 蛍光解析装置及び解析方法 |
JP2009288161A (ja) | 2008-05-30 | 2009-12-10 | Olympus Corp | 光測定装置及び光測定方法 |
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JP5265408B2 (ja) * | 2009-02-18 | 2013-08-14 | オリンパス株式会社 | 相関分光分析方法及び相関分光分析装置 |
WO2010119098A1 (en) * | 2009-04-15 | 2010-10-21 | Stefan Wennmalm | Inverse-fluorescence correlation spectroscopy |
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