JP4757103B2 - 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム - Google Patents
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Description
1. 蛍光標識されたあるいは蛍光性を持つウイルス結合性物質と試料を混合して試料溶液を調製する工程、共焦点光学系を用いて該試料溶液の蛍光信号の時間経過を計測する工程を含む試料中のウイルスまたは/およびウイルス感染細胞由来ウイルス関連物質を検出する方法。
2. 前記ウイルス結合性物質が、糖、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、低分子化学物質からなる群から選ばれる項1に記載の方法。
3. ウイルスが粒子状態であり、ウイルス表層にて蛍光標識物質と結合することを特徴とする、項1記載の方法。
4. あらかじめウイルス粒子の一部または全部を物理的または化学的に破砕することを特徴とする、項1記載の方法。
5. 試料中のウイルスの抽出および精製のための前処理工程をさらに含むことを特徴とする、項1〜4のいずれかに記載の方法。
6. ウイルスの平均粒子直径が短径1〜1000nm、長径5〜10000nmであることを特徴とする、項1〜5のいずれかに記載の方法。
7. ウイルスがインフルエンザウイルスであることを特徴とする、項1〜6のいずれかに記載の方法。
8. 蛍光標識されたあるいは蛍光性を持つウイルス結合性物質と共焦点光学系を含むウイルスまたは/およびウイルス感染細胞由来ウイルス関連物質の検出システム。
9. 前記ウイルス結合性物質が、糖、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、低分子化学物質からなる群から選ばれる項8に記載のシステム。
10. 蛍光標識されたあるいは蛍光性を持つウイルス結合性物質の蛍光波長が350〜800nm、分子量が120以上、共焦点光学系の共焦点領域が10−16〜10−10リットルであることを特徴とする、項8または9に記載のシステム。
11. ウイルスの平均粒子直径が短径1〜1000nm、長径5〜10000nmであることを特徴とする、項8〜10のいずれかに記載のシステム。
12. 測定対象のウイルスがインフルエンザウイルスであることを特徴とする、項8〜11のいずれかに記載のシステム。
ウイルス結合性物質は、ウイルスに特異的に結合するものであれば特に限定されず、糖、抗体、タンパク質(糖蛋白を含む)、ペプチド、核酸、脂質(糖脂質を含む)、低分子化学物質などが広く例示される。例えば、インフルエンザウイルスの検出には、ウイルス結合性物質としてフェチュインが好ましく使用できる。好ましいウイルス結合性物質は、ウイルスに特異的な抗体、或いはフェチュインなどのタンパク質、ガングリオシドLysoGM3などの糖脂質が挙げられる。
もっとも好ましいウイルス結合性物質は、各ウイルスの特異抗体および各ウイルスのレセプター様物質である。レセプターが以下に示すような蛋白質の場合、ウイルスとの結合部位を含む完全長の蛋白質、部分長蛋白質あるいはペプチドでも構わない。ポリオウイルスに対するCD155、麻疹ウイルスに対するCD46およびCD150、牛疫ウイルスおよびイヌジステンパーウイルスに対するCD155、シンドビスウイルスに対するラミニンレセプター、ラッサ熱ウイルスおよびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに対するa-ジストログリカン、コクサッキーウイルスに対するCAR、CD55およびavb3インテグリン、エコーウイルスに対するCD55およびa2 b1インテグリン、ヒトコロナウイルスに対するアミノペプチダーゼN、マウス肝炎ウイルスに対するBgp1、HIVおよびSIVに対するCD4、ケモカインレセプター(CXCR4およびCCR3など)およびガラクトシルセラミド、トリ白血病ウイルスに対するTVAおよびTVB、マウス白血病ウイルスに対するMCAT-1およびPiT-2、ネコ白血病ウイルスおよびサル肉腫ウイルスに対するPiT-1、単純ヘルペスウイルスに対するHveA、HveB、HveC、Prr1およびPrr2、ヒトヘルペスウイルス6型に対するCD46、ヒトヘルペスウイルス7型に対するCD4、EBウイルスに対するCR2、ライノウイルスに対するICAM-1およびLDLR、アデノウイルスに対するCAR、avb3インテグリンおよびavb5インテグリンなどが挙げられる。また、糖鎖をレセプターとするウイルスでは、該当の糖鎖を含有する糖蛋白質、糖脂質あるいは遊離の糖鎖自身がウイルスに結合する。例えば、インフルエンザウイルスAおよびB型、パラインフルエンザウイルス、レオウイルス3型、マウスポリオーマウイルス、イヌパルボウイルスおよびアデノウイルスではシアル酸が、インフルエンザウイルスC型では9-O-アセチルシアル酸が、ヒトおよびウシコロナウイルスでは、N-アセチル-9-O-アセチルシアル酸が、HIVではガラクトシルセラミドが、単純ヘルペスウイルスおよびヒトサイトメガロウイルスでは硫酸ヘパリンがレセプターとして機能する。
共焦点光学系として、共焦点(レーザ)顕微鏡が使用できるが、レーザをスキャンする機能は必ずしも必要なく、溶液中の1点(例えばサブフェムトリットル領域)の蛍光強度を相関法により計測できればよい。
(i)試料中のウイルス結合性物質を予め蛍光標識する、ただしウイルス結合性物質が蛍光性を有する場合はこの操作を省くことも出来る。
(ii)レーザ光を対物レンズでフェムトリットル以下の領域まで焦点を絞る。
(iii)分子がレーザの焦点領域を通過するミリ秒以下の時間内に、数百〜数千個のフォトンが発生する。
(iv)溶液中の蛍光標識されたウイルス結合性物質がウイルスと結合することにより分子サイズが大きくなるために、溶液中の移動速度が遅くなる。
(v)移動速度の変化と蛍光強度を自己相関法で解析し、分子間相互作用を観測する。
ウイルスまたはその破砕物の平均粒子直径は、短径1〜1000nm、長径5〜10000nm程度、好ましくは短径10〜200nm、長径10〜1000nm程度である。ウイルスまたはその破砕物の平均粒子直径が小さすぎると検出感度が低下し、大きすぎると検出が困難になる。
<ウイルス液の調製法>
A/New Caledonia/20/99 (H1N1)およびA/Hyogo/73/2002 (H1N1)株について、組織培養細胞を用いてウイルス液を調製した。MDCK(Madin-Darby canine kidney)細胞の単層培養にウイルスをMultiplicity of Infection (M.O.I.)が0.01(計算上0.1%の細胞が感染する)になるよう接種し、5μg/mlトリプシン(Sigma製)添加、血清非添加Minimum Essential Medium(MEM、Sigma製)で34℃、3〜5日間培養した。培養上清を2,500gで10分間遠心し、上清をウイルス液として-80℃で保存した。
A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)について、発育鶏卵を用いてウイルス液を調製した。種ウイルスを1x103〜104倍希釈して(感染価にして1x103〜104CIU/ml)発育鶏卵10日卵の漿尿膜腔へ200μl接種し、34℃で転卵しながら2〜3日培養した。採取した漿尿液を2,500gで10分間遠心し、上清をウイルス液として-80℃で保存した。
<感染力価の測定法>
MDCK細胞に4倍段階希釈したウイルス液を接種、34℃で14時間培養し、エタノールで感染細胞を固定した。一次抗体として抗インフルエンザウイルスウサギポリクローナル抗体(大阪府立公衆衛生研究所、奥野良信博士より分与)、続いて二次抗体としてFITC結合抗ウサギIgGヤギ血清(医学生物学研究所製)を用いた間接蛍光抗体法で感染細胞を標識した後、蛍光顕微鏡(Zeiss製)で観察し、画像解析により計数して感染力価を算出した。
結果:
A/New Caledonia/20/99 (H1N1):3.9x106 CIU/ml
A/Hyogo/73/2002 (H1N1):5.6x107CIU/ml
A/Puerto Rico/8/34 (H1N1):1.1x108 CIU/ml
<ウイルスの部分精製法>
A/New Caledonia/20/99 (H1N1)について、部分精製ウイルスを作製した。上記方法にて調製したウイルス液を、60%グリセロールphosphate buffered saline(PBS)に20%グリセロールPBSを積み重ねた上に重層し、113,000g、4℃で1時間遠心(日立製超遠心機使用)した。60%グリセロールPBSと20%グリセロールPBSの間のウイルス層を採取し、100%グリセロールクッションの上に重層、113,000g、4℃で1時間遠心(日立製超遠心機使用)して濃縮し、部分精製ウイルスとした。この操作により、ウイルス液を約100倍の濃度に精製濃縮した。
<ウイルス粒子の破砕法>
A/New Caledonia/20/99 (H1N1)のウイルス液を超音波(日本精機製作所)で5秒間処理、あるいは、等量の1% polyoxyethylene(10) octylphenol ether(Triton X-100、和光純薬)と混合し(最終濃度0.5%)、ウイルス粒子を破砕した。
[実施例1]蛍光標識糖タンパク質プローブによるインフルエンザウイルスの検出
糖タンパク質の一種であるフェチュインは、インフルエンザウイルスが結合しうる糖鎖構造を表面に複数持つことが一般的に知られている。インフルエンザウイルス(ニューカレドニア株)とフェチュインを混合し、遠心操作でインフルエンザウイルス粒子を沈殿させると、ウイルス粒子に結合したフェチュインが共沈することから、溶液中でウイルス粒子とフェチュインが複合体を形成することからもこれは明らかである(図1)。
(実施例2)蛍光標識糖鎖を利用したインフルエンザウイルスの検出
ヒト型あるいはトリ型かを区別するためには、2-6結合型シアル酸および2-3結合型シアル酸を有する蛍光標識糖鎖をプローブとして用いることができる。2-3結合型シアル酸を有する蛍光標識糖鎖の作製のために、糖脂質であるガングリオシドLysoGM3にローダミンを導入した(図4)。
1. 試料
使用したインフルエンザウイルス
・ A/New Caledpnia/20/99(H1N1)
2. 試験方法
評価対象
・ エスプラインインフルエンザA,B-N(富士レビオ製)
・ キャピリアFluA,B(タウンズ製)
各インフルエンザウイルス迅速診断キットの操作方法(製造者のプロトコール)に従って行った。
3. 試験結果
キャピリアFluA,B、エスプラインインフルエンザA,B-Nの検出感度は、どちらも1.0×106 pfu/mlと1.0×107 pfu/mlの間であった。
検出感度、シグナル強度をさらに向上させるために、文献(Y. Makimuraら, Chemoenzymatic synthesis and application of a sialoglycopolymer with a chitosan backbone as a potent inhibitor of human influenza virus hemagglutination., Carbohydrate Research, 2006年, May 20)にしたがい、ウイルスに結合するシアル酸を末端に持つ糖鎖をタンデムに親水性ポリマーに多数固定した物質に蛍光官能基を導入し、ウイルス検出用プローブとした。該蛍光プローブを用いることにより、複数の隣接する糖鎖構造にウイルス粒子表面を構成する複数のタンパク質が結合し、高い親和性をもたらすものと期待された。該蛍光プローブの構造を、図6に示す。親水性ポリマーとしては、キトサンを使用した。
Claims (7)
- 蛍光標識されたあるいは蛍光性を持つウイルス結合性物質と試料を混合して試料溶液を調製する工程、
共焦点光学系を用いて該試料溶液の蛍光信号の時間経過を計測し、自己相関解析をすることなく蛍光強度変動パターンを観測する工程を含む、
試料中のウイルスまたは/およびウイルス感染細胞由来ウイルス関連物質を検出する方法。 - 前記ウイルス結合性物質が、糖、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、低分子化学物質からなる群から選ばれる請求項1に記載の方法。
- ウイルスが粒子状態であり、ウイルス表層にて蛍光物質と結合することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- あらかじめウイルス粒子の一部または全部を物理的または化学的に破砕することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 試料中のウイルスの抽出および精製のための前処理工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- ウイルスの平均粒子直径が、短径1〜1000nm、長径5〜10000nmであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- ウイルスがインフルエンザウイルスであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
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