CN111381026A - 多重检测免疫试剂及其制备方法、试剂盒、系统及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多重检测免疫试剂及其制备方法、试剂盒、系统及应用，免疫试剂包括多种第一免疫组合物，每种第一免疫组合物包括：固相载体；第一免疫结合物，用于进行特异性免疫反应；第一荧光标记物，连接在第一免疫结合物上；其中，每种第一免疫组合物具有不同的荧光强度。通过上述方式，本发明能够降低多重检测过程对磁珠种类和性能的依赖，并降低生产成本。

Description

多重检测免疫试剂及其制备方法、试剂盒、系统及应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种多重检测免疫试剂及其制备方法、试剂盒、系统及应用。
背景技术
随着免疫检测技术的不断发展，多重免疫检测技术因能够有效提高检测效率成为人们研究的热点。所谓多重检测技术即为向检测装置中加入一次样本即可同时得 到多个待测物的检测结果。
目前，对于多重免疫检测技术，通常将检测不同待测物的免疫结合物偶联到具 有不同荧光种类或荧光强度的编码微球上，通过编码微球上的荧光种类或强度进行 分类，可以确定不同的待测物的检测结果。但这种编码微球的价格昂贵，极大的限 制了多重免疫检测的应用。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种多重检测免疫试剂及其制备方法、试剂盒、系统及应用，能够实现多重检测的分类需求，降低检测过程对编码微球的依赖， 并降低检测成本。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种用于多重检测 的免疫试剂。
其中，免疫试剂包括:多种第一免疫组合物，每种所述第一免疫组合物包括：
固相载体；
第一免疫结合物，用于进行特异性免疫反应；
第一荧光标记物，连接在所述第一免疫结合物上；
其中，每种所述第一免疫组合物具有不同的荧光强度。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种用于多通道 检测的试剂盒。
其中，试剂盒包括：
试剂盒本体；
第一试剂容纳位，设置在试剂盒本体上，用于容纳上述免疫试剂。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种用于多通道 检测的免疫试剂的制备方法。
其中，制备方法包括：
提供预设种类的第一免疫结合物，预设种类的第一免疫结合物分别用于检测不同的待测物；
向每种第一免疫结合物中分别加入第一荧光标记物，使得第一荧光标记物分别标记每种第一免疫结合物；
向连接了荧光标记物的每种第一免疫结合物中加入固相载体，使得每种第一免疫结合物与固相载体连接，得到相应的第一免疫组合物；
将预设种类的第一免疫组合物混合，并将固相载体加入到第一免疫组合物的混合物中，反应一段时间后得到用于多重检测的免疫试剂；
其中，标记每种所述第一免疫结合物的第一荧光标记物的荧光强度不同；或者，多种所述第一免疫组合物的多种所述固相载体的粒径不同，且每种所述第一荧光标 记物相同。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种多重检测免 疫分析系统。
其中，系统包括：
上述试剂盒；样本分析仪，样本分析仪通过使用试剂盒中的免疫试剂进行不同 待测物的检测，并输出检测结果。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种上述免疫试 剂在免疫荧光分析中的应用。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明通过在固相载体上连接 用于检测不同待测物的第一免疫组合物，且不同的第一免疫组合物具有不同的荧光 强度的方式，实现多重检测。采用上述方式，多重检测过程不依赖于磁珠的种类和 性能，有利于降低检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 这些附图获得其他的附图。其中：
图1是本发明一种用于多重检测的免疫试剂第一实施方式的结构示意图；
图2是本发明一种用于多重检测的免疫试剂第二实施方式的结构示意图；
图3是本发明一种用于多重检测的试剂盒第一实施方式的结构示意图；
图4是本发明一种用于多重检测的试剂盒第二实施方式的结构示意图；
图5是本发明一种用于多重检测的免疫试剂的制备方法一实施方式的流程示 意图；
图6是本发明一种多重检测免疫分析系统一实施方式的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下 所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参阅图1，图1是本发明一种用于多重检测的免疫试剂第一实施方式的结构示 意图，该免疫试剂100包括：多种第一免疫组合物(110、120、130)，每种所述第 一免疫组合物包括：固相载体(121、122、123)、第一免疫结合物(111、112、113) 和第一荧光标记物(101、102、103)；第一免疫结合物(111、112、113)，用于进 行特异性免疫反应；第一荧光标记物(101、102、103)连接在所述第一免疫结合物 (111、112、113)上；其中，每种所述第一免疫组合物(110、120、130)具有不 同的荧光强度。
本实施方式通过在固相载体(121、122、123)上连接用于检测不同待测物的第 一免疫组合物，且不同的第一免疫组合物(110、120、130)具有不同的荧光强度的 方式，实现多重检测。采用上述方式，多重检测过程不依赖于磁珠的种类和性能， 有利于降低检测成本。
在本实施方式中，荧光免疫检测过程中，第一免疫结合物(111、112、113)包 括抗原和/或抗体。进一步的，抗体包括与不同抗原决定簇结合的检测抗体和/或捕获 抗体，抗原包括蛋白质、多肽、激素、糖类、酶、药物或核酸中的至少一种；抗原 包括蛋白质、多肽、激素、糖类、酶、药物或核酸中的至少一种。更进一步的，第 一免疫结合物(111、112、113)与第一荧光标记物(101、102、103)通过直接或 间接方式结合。在一个实施方式中，使用夹心法进行免疫检测的过程中，第一免疫 结合物(111、112、113)包括捕获抗体，捕获抗体连接藻红蛋白(PE)，检测抗体 连接藻蓝蛋白(APC)，藻红蛋白的激发波长为488nm，发射波长为575nm，藻蓝蛋 白的激发波长为633nm，发射波长为660nm，通过与激发波长对应的光进行照射， 并接收相应发射波长的光信号，通过光信号的有无，及光信号的强弱，实现对不同 待测物进行定性分析。此外，连接在每个固相载体(121、122、123)的第一免疫结 合物(111、112、113)的种类相同，但连接数量可根据实际需要进行设置。夹心法 包括但不限于双抗体夹心法和双抗原夹心法。
可选的，为使每种第一免疫组合物(110、120、130)具有不同的荧光强度，可 以使每种第一免疫组合物(110、120、130)中的第一荧光标记物(101、102、103) 的种类不同，也即利用不同种类的第一荧光标记物(101、102、103)发出不同强度 的荧光，使得第一免疫组合物(110、120、130)具有不同的荧光强度。或者采用同 种第一荧光标记物(101、102、103)，使不同的第一免疫结合物(111、112、113) 连接不同荧光强度的第一荧光标记物(101、102、103)，也可以获得具有不同的荧 光强度的第一免疫组合物(110、120、130)。又或者采用多种固相载体(121、122、 123)的粒径不同且每种第一荧光标记物(101、102、103)相同，同样可以获得具 有不同的荧光强度的第一免疫组合物(110、120、130)。总之，只要能使用于检测 不同待测物的第一免疫组合物(110、120、130)具有不同的荧光强度，就能对不同 种类的待测抗原或抗体进行分类检测。而保持单一变量，使其他保持不变，例如， 第三种方案，采用磁球粒径不同但每种第一荧光标记物(101、102、103)相同的方 式，又可以节省检测通道的数量，从而简化仪器、降低成本，且降低信号干扰。而 使不同第一免疫组合物(110、120、130)获得不同荧光强度的具体方法可以根据实 际情况进行选择，此处不做具体限定。
进一步的，第一荧光标记物(101、102、103)标记后的第一免疫结合物(111、 112、113)能够用于检测不同待测物的原理在于，第一免疫结合物(111、112、113) 中游离的氨基与第一荧光标记物(101、102、103)(例如，荧光染料)结合后，在 特定波长的光源的激发下，发出不同的荧光信号，进而通过荧光信号的波长范围， 获得不同检测指标对应的发光信号。具体的，第一荧光标记物(101、102、103)包 括自荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，花菁类荧光染料，香豆素类荧光染料， 氟硼类荧光染料，酞菁类荧光染料中的一种或以上的组合。荧光染料的具体种类可 根据待标记的第一免疫结合物(111、112、113)的种类，检测条件等指标具体确定， 此处不再限定。
在一个实施方式中，为获得较好的标记效果，第一荧光标记物(101、102、103) 包括异硫氰酸荧光素，其最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～ 530nm；异硫氰酸荧光素中的硫碳胺键能与第一免疫结合物(111、112、113)中游 离的氨基结合，在紫外线或蓝紫光照射下发出黄绿色荧光，便于免疫分析仪通过不 同的荧光强度对不同待测物进行定性或定量的检测。
可选的，固相载体(121、122、123)包括微孔板、玻璃片、微流控芯片、磁珠 中的至少一种。在本实施方式中，固相载体为磁珠，磁珠与第一免疫结合物连接， 第一荧光标记物质(101、102、103)与第一免疫结合物(111、112、113)连接。 由于对应不同检测指标的抗原能够与具有不同荧光强度的第一免疫结合物(111、112、 113)结合，检测不同待测物的第一免疫结合物(111、112、113)连接的磁珠可以 为普通磁珠，发光强度相同或不具有发光强度。具体的，磁珠是将纳米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸 附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后 剩磁为零的属性。在本实施方式中，所使用的磁珠应能满足直径为0.1-5μm，磁珠 还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2， 并通过活性功能基团与第一免疫结合物进行化学偶联。
可选的，请参考图2，图2是本发明一种用于多重检测的免疫试剂第二实施方 式的结构示意图，其中，免疫试剂200中的第一免疫组合物210还包括检测结合体 220，检测结合体220通过化学偶联或物理吸附的方式与第一免疫结合物211连接， 且201为第一荧光标记物。其中，高分子结合体220有利于提高第一免疫组合物210 的发光强度。具体的，检测结合体220的粒径为1-10微米，如，1微米、5微米或 10微米等。
进一步的，检测同一待测物的多个第一免疫结合物210与同一检测结合体220 连接。也即，每个检测结合体220上结合多个第一免疫结合物210，且多个第一免 疫结合物210用于检测同一待测物。这样，多个带有第一荧光标记物201的第一免 疫结合物211聚集到一个检测结合体220上，形成一个复合体，使得第一荧光标记 物201更加集中，目标尺寸更大，相比于不使用检测结合体220的情况，本实施方 式中的复合体的荧光强度更高，便于荧光信号的获取。
具体的，检测结合体220包括自身具有偶联基团的检测结合体和/或修饰有偶联基团的检测结合体，且偶联基团包括羧基、羟基、氨基、甲苯磺酰基、氯甲基、巯 基、醛基、酰肼、硅羟基、琥珀酰亚胺酯或环氧基中的至少一种。值得注意的是， 第一荧光标记物201和检测结合体220都通过偶联的方式连接到第一免疫结合物上 时，第一荧光标记物201和检测结合体220分别偶联到第一免疫结合物的不同基团 上。如，第一荧光标记物201与第一免疫结合物211的羧基偶联，则检测结合体220 不能通过第一免疫结合物211的羧基与第一免疫结合物211偶联，可以连接第一免 疫结合物211上除氨基以外的其他基团，如，羟基、羧基、巯基、醛基等。
更进一步的，检测结合体220包括有机高分子结合体、无机物结合体或有机高分子- 无机物杂化结合体；有机高分子结合体的材质包括聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基 丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺或乳胶中的一种或以上；无机物结合体的 材质包括二氧化硅。在一个实施方式中，为降低生产成本并获得较好的使用效果， 检测结合体220为乳胶检测结合体。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种用于多重检 测的试剂盒。
请参考图3，图3是本发明一种用于多重检测的试剂盒第一实施方式的结构示 意图，其中，试剂盒300包括：试剂盒本体310；第一试剂容纳位320，设置在试剂 盒本体310上，用于容纳的免疫试剂。
在本实施方式中，免疫试剂包括多种第一免疫组合物，每种第一免疫组合物包括：固相载体；第一免疫结合物，用于进行特异性免疫反应；第一荧光标记物，连 接在第一免疫结合物上；其中，每种第一免疫组合物具有不同的荧光强度。本实施 方式通过在固相载体上连接用于检测不同待测物的第一免疫组合物，且不同的第一 免疫组合物具有不同的荧光强度的方式，实现多重检测。采用上述方式，多重检测 过程不依赖于磁珠的种类和性能，有利于降低检测成本。
可选的，请参考图4，图4是本发明一种用于多重检测的试剂盒第二实施方式 的结构示意图，其中，试剂盒300还包括：第二试剂容纳位330，设置在试剂盒本 体310上，第二试剂容纳位330用于容第二免疫组合物，所述第二免疫组合物包括 第二免疫结合物和标记在所述第二免疫结合物上的第二荧光标记物，所述第二免疫 试剂与所述第一免疫试剂配合以进行不同待测物的检测。
在一个实施方式中，为获得更加牢固的结合效果，第二免疫组合物包括生物素 标记的第二免疫结合物，第二荧光标记物包括亲和素标记的荧光标记物；也即第二 免疫结合物和第二荧光标记物通过生物素-亲和素的方式进行结合。而在免疫荧光检 测过程中，不同第一免疫组合物具有不同的荧光强度，可对不同待测物进行定性分 析，而与不同第一免疫组合物对应的不同第二免疫组合物上的第二荧光标记物的荧 光强度也不同，通过第二荧光标记物不同的荧光强度可以对不同的待测物进行定量 分析，而免疫试剂中第一荧光标记物不同的荧光强度用于对不同的待测物进行定性 分析。相应的，多重检测的试剂盒能够实现多种待测物的联检，有利于提高检测效 率。
在一个实施方式中，第一免疫组合物、待测物及第二免疫组合物形成免疫捕获 组合物，免疫捕获组合物可以用于化学发光免疫分析法、电化学发光免疫分析法、 酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)、酶促免疫分析法、 生物素－亲和素系统测定法、放射免疫测定法、免疫荧光分析法中的至少一种方法。 其中，ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。可以理解的， 第一免疫组合物和第二免疫组合物的组成包括但不限于多种抗体和/或抗原，根据检 测方法学的不同，其组成有差异。例如，采用双抗体夹心法时，第一免疫结合物和 第二免疫组合物均为单一抗体或多个单一抗体；采用竞争法检测时，第一免疫结合 物为单一抗体或多个单一抗体，第二免疫结合物为单一抗原或多个单一抗原；采用 双抗原夹心法时，第一免疫结合物和第二免疫组合物均为单一抗体/多个单一抗体或 单一抗原/多个单一抗原。当然，第一免疫组合物及第二免疫组合物的具体组成应包 括但不限于上述方式，其应包括本领域的所有检测方法学，例如间接法等。
可选的，试剂盒还包括稀释液，稀释液包括牛血清白蛋白、新生牛血清、羊血 清、马血清、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、水合2-吗啉乙磺酸(如一水合2-吗 啉乙磺酸)、乙二醇、丙三醇、吐温-80、酪蛋白和乙二胺四乙酸二钠；稀释液的溶 剂优选于水。且稀释液各组分的浓度如下：1～10g/L的BSA、1～50体积％的新生 牛血清、0.1～10体积％的羊血清、0.1～10体积％的马血清、1～100mmol/L的二硫 苏糖醇、1～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、1～100mmol/L的水合2-吗啉乙磺酸、 0.1～10体积％的乙二醇、0.1～10体积％的丙三醇、0.01～2体积％的吐温-80、0.1～ 10g/L的酪蛋白和0.1～10g/L的乙二胺四乙酸二钠。该稀释液还优选地进一步包含 0.01～1g/L的防腐剂。
在检测过程中添加稀释液能够消除类风湿因子(RF)、人抗鼠抗体(HAMA)、嗜异 性抗体、抗核抗体(ANA)等多种干扰免疫反应因子，从而提供一个更利于抗体和抗 原反应的条件。因此，加入稀释剂能够显著地降低样本检测的非特异性结合，从而 进一步提高反应灵敏度和检测准确度。
可选的，稀释液还包括防腐剂，防腐剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚 硝酸钠、Proclin 300(免疫诊断常用防腐剂之一，主要活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉 -3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)和抗生素中的任一种或两种以上混合物。添加 防腐剂能够避免免疫试剂中的组分发生变质，有利于提高试剂盒的检测的质量，进 而提高检测结果的可靠性。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种用于多重检 测的免疫试剂的制备方法。
请参考图5，图5是本发明一种用于多重检测的免疫试剂的制备方法一实施方 式的流程示意图，其中，方法包括步骤：
S510、提供预设种类的第一免疫结合物，预设种类的第一免疫结合物分别用于 检测不同的待测物。
在步骤S510中，第一免疫结合物的种类与检测指标的种类对应，也即与需要联 检的项目数量对应。其中，预设种类的第一免疫结合物分别能够与相应的抗原进行 结合，已检测相应的指标。
S520、向每种第一免疫结合物中分别加入第一荧光标记物，使得第一荧光标记 物分别标记每种第一免疫结合物。
在步骤S520中，为了使不同种类的第一免疫结合物具有不同的荧光强度，对每 一种第一免疫结合物进行单独标记，也即分别向相应的第一免疫结合物中加入第一 荧光标记物，对第一免疫结合物进行荧光标记。通过使用不同荧光强度的第一荧光 标记物可以对不同待测物的第一免疫结合物进行定性分析。
S530、向连接了荧光标记物的每种第一免疫结合物中加入固相载体，使得每种 第一免疫结合物与固相载体连接，得到相应的第一免疫组合物。除了上述通过使用 不同荧光强度的第一荧光标记物可以对不同待测物的第一免疫结合物进行定性分析 的方案外，还可以通过使用不同粒径的多种所述固相载体，可以对不同待测物的第 一免疫结合物进行分类检测。
在步骤S530中，荧光标记物的每种第一免疫结合物分别与固相载体连接，为降 低成本及简化制备工艺，固相载体为磁珠，且连接在不同的第一免疫结合物上的磁 珠的种类相同或不同。
S540、将预设种类的第一免疫组合物混合，并将固相载体加入到第一免疫组合 物的混合物中，反应一段时间后得到用于多重检测的免疫试剂。
在步骤S540中，预设种类的第一免疫组合物的数量根据待测物的种类进行设置。而预设种类的第一免疫组合物的混合方式根据检测方式和检测项目的要求进行设置， 在一个实施方式中，将浓度相同的预设种类的第一免疫组合物按等体积的方式进行 混合，得到的免疫试剂可用于多重免疫检测。
在本实施方式中，由于免疫试剂包括多种第一免疫组合物，每种第一免疫组合 物包括：固相载体；第一免疫结合物，用于进行特异性免疫反应；第一荧光标记物， 连接在第一免疫结合物上；其中，每种第一免疫组合物具有不同的荧光强度。则通 过在固相载体上连接用于检测不同待测物的第一免疫组合物，且不同的第一免疫组 合物具有不同的荧光强度的方式，实现多重检测。采用上述方式，多重检测过程不 依赖于磁珠的种类和性能，有利于降低检测成本。
进一步的，向每种第一免疫结合物中分别加入第一荧光标记物之前，方法还包括：向至少一种第一免疫结合物中加入封闭剂，并反应一段时间，其中，封闭剂包 括多羟基糖类化合物、蛋白质类化合物或含有伯氨基(-NH2)的小分子化合物中的至 少一种。加入封闭剂后，第一免疫结合物上不需要荧光标记物结合物的点位被占据， 使得荧光标记物结合在检测抗体的特定点位上，获得较好的荧光标记效果。具体的， 多羟基糖类化合物为葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、葡聚糖、甘露醇或聚蔗糖中的 至少一种；蛋白质类化合物为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白、明胶、酪蛋 白水解物、免疫球蛋白、奶粉、人或动物血清中的至少一种；小分子化合物为三羟 甲基氨基甲烷、乙醇胺、羟胺、己胺或甘氨酸中的至少一种。在一个实施方式中， 封闭剂的包括至少两种不同种类的封闭剂，加入至少两种封闭剂能够提高封闭效果， 有利于减小背景信号，进一步提高检测灵敏度。
当然，在固相载体加入到第一免疫组合物的混合物中之前，也可以对固相载体 进行封闭处理，使得第一免疫组合物更好的与固相载体结合。
可选的，方法还包括：向至少一份第一免疫组合物中加入检测结合体，以使第 一免疫组合物中的第一免疫结合物与检测结合体连接。在本实施方式中，在第一免 疫结合物进行荧光标记之前，还可以对第一免疫结合物进行预处理。即在至少一种 第一免疫结合物中添加高分子检测结合体，每个高分子检测结合体上可以连接多个 第一免疫结合物，连接检测结合体后的第一免疫结合物再进行荧光标记、荧光检测， 更多的荧光标记后的第一免疫结合物聚集在检测结合体表面，有利于进一步提高荧 光强度。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种多重检测免 疫分析系统。
请参考图6，图6是本发明一种多重检测免疫分析系统一实施方式的结构示意 图，其中，多重检测免疫分析系统包括：试剂盒610；样本分析620仪，样本分析 仪620通过使用试剂盒中的免疫试剂进行不同待测物的检测，并输出检测结果。
本实施方式中，试剂盒610至少包括免疫试剂，免疫试剂包括多种第一免疫组 合物，每种第一免疫组合物包括：固相载体；第一免疫结合物，用于进行特异性免 疫反应；第一荧光标记物，连接在第一免疫结合物上；其中，每种第一免疫组合物 具有不同的荧光强度。则通过在固相载体上连接用于检测不同待测物的第一免疫组 合物，且不同的第一免疫组合物具有不同的荧光强度的方式，实现多重检测。采用 上述方式，多重检测过程不依赖于磁珠的种类和性能，有利于降低检测成本。
而免疫荧光分析仪620包括流式细胞分析仪、酶标仪、化学发光测定仪、或荧 光显微镜等通过荧光信号进行定性和定量检测的仪器。而试剂盒610的具体技术好 处和技术细节已经在前文进行了详细阐释，故此处不再赘述。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种上述免疫试 剂在免疫荧光分析中的应用。
具体的，免疫试剂用于任何可通过荧光分析的免疫检测过程，尤其是对甲状腺 功能相关蛋白、心血管功能相关蛋白、心肌肌钙蛋白、肝纤维化相关蛋白、肿瘤相 关蛋白、性腺功能相关蛋白、肾功能相关蛋白、骨代谢功能相关蛋白、糖代谢功能 相关蛋白、传染病相关蛋白、自身免疫功能相关蛋白、产前筛查项目相关蛋白、药 物检测相关蛋白、4型人类疱疹病毒相关蛋白、炎症相关蛋白中的至少一种进行检 测。
在本实施方式中，免疫试剂包括多种第一免疫组合物，每种第一免疫组合物包括：固相载体；第一免疫结合物，用于进行特异性免疫反应；第一荧光标记物，连 接在第一免疫结合物上；其中，每种第一免疫组合物具有不同的荧光强度。则通过 在固相载体上连接用于检测不同待测物的第一免疫组合物，且不同的第一免疫组合 物具有不同的荧光强度的方式，实现多重检测。采用上述方式，多重检测过程不依 赖于磁珠的种类和性能，有利于降低检测成本。而免疫试剂在应用过程中的具体技 术好处和技术细节已经在前文进行了详细阐释，故此处不再赘述。
下面通过具体实施例对本发明的方案进行详细阐释
以下所有性能参数的测试方案参照国家食品药品监督管理总局颁布的《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》执行。
实施例1
1、一种对cTnI、CK-MB、Myo进行联检的试剂盒
(1)第一免疫试剂中包括连接在磁球上的cTnI抗体、CK-MB抗体及Myo抗 体，且连接在cTnI抗体、CK-MB抗体及Myo抗体上的FITC荧光素的荧光强度MF1 分别为25622，48955，89542。
(2)第二免疫试剂中包括第一试剂和第二试剂。第一试剂包括生物素标记的 cTnI抗体、生物素标记的CK-MB抗体及物素标记的Myo抗体，第一试剂的浓度为 1ug/ml；第二试剂包括链霉亲合素标记的藻红蛋白，第二试剂的浓度为5ug/ml。
2、第一免疫试剂和第二免疫试剂的制备方法
(1)第一免疫试剂的制备
荧光素标记抗体：
1)用pH为7的MES缓冲液分别稀释cTnI抗体溶液1、CK-MB抗体溶液1、 Myo抗体溶液1，使得cTnI抗体溶液1、CK-MB抗体溶液1、Myo抗体溶液1中各 抗体的浓度分别为2mg/ml。
2)用无水DMSO溶解FITC，配置浓度为1mg/ml的FITC荧光素溶液。
3)取cTnI抗体溶液1、CK-MB抗体溶液1、Myo抗体溶液1各1mg，将20ul FITC 荧光素溶液加入到cTnI抗体溶液1中得到混合液1、将40ul FITC荧光素溶液加入 到CK-MB抗体溶液1中得到混合液2、将80ul FITC荧光素溶液加入到Myo抗体溶 液1中得到混合液3，并在4℃条件下避光反应2h。
4)向混合液1、混合液2及混合液3中分别加入1mol/L的氯化铵至氯化铵的 浓度为50mmol/L，并在室温下反应2h。
5)反应结束后用PBS缓冲液进行透析，得到荧光素标记的抗体。
6)对结束透析的荧光素标记的抗体的荧光强度进行测量，当cTnI抗体、CK-MB 抗体及Myo抗体标记的荧光素强度基本为成倍增加后，进行下一步操作。
磁珠与荧光素标记的抗体偶联：
1)取带氨基的磁珠3mg，并用pH为5，浓度为0.05mol/L的MES缓冲液清洗 两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
2)加入5mg的EDC及5mg的HS，并补加MES缓冲液到100ul，活化30min。
3)磁分离后，用MES缓冲液清洗磁珠两次，并在每次清洗之后进行磁分离操 作。
4)向磁分离后的磁珠中加入100ul的BS缓冲液，荧光标记后的抗体200ug， 并偶联4h。
5)磁分离后，用MES缓冲液清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
6)加入浓度为1％(1％为100ml溶液中含有1gBSA)且包含质量份数为0.05％的 吐温20的BSA封闭剂进行封闭2h。
7)磁分离后，用浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA保存液 清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作，得到第一免疫组合物。
8)重复上述步骤，获得检测不同待测物的第一免疫组合物，并将多种第一免疫 组合物等量混合，得到第一免疫试剂。
(2)第二免疫试剂的制备
第一试剂的制备：
1)分别取cTnI抗体、CK-MB抗体及Myo抗体各100ug，分别加入等体积的碳 酸氢钠，且碳酸氢钠的浓度为0.1mol/L，得到cTnI抗体溶液2、CK-MB抗体溶液2 及Myo抗体溶液2。
2)用无水二甲基亚砜溶解BNHS，使得BNHS的浓度为10mmol/L，取BNHS溶 液，分别中各加入2ul的BNHS溶液，并在37℃反应30min。
3)反应结束后将三种抗体混合，并用脱盐柱除去未与抗体结合的BNHS，得到 第一试剂。
第二试剂的制备：
链霉亲和素标记的藻红蛋白稀释至5ug/ml，得到第二试剂。
3、cTnI、CK-MB、Myo的检测步骤
取浓度为5ug/ml的第一免疫试剂50ul，并向其中加入标准样本50ul，37℃下 孵育5min，之后进行清洗和磁分离操作，得到第一磁珠复合物；
向第一磁珠复合物中加入1ug/ml的第一试剂100ul，37℃下孵育3min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到第二磁珠复合物；
向第二磁珠复合物中加入5ug/ml的第二试剂100ul，37℃下孵育2min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到待测样本。
2)待测样本的检测
以FITC荧光素的强度对三种抗体进行分类，再以PE信号进行检测。
3、灵敏度检测和线性范围检测
1)线性范围的确定
分别使用不同浓度的cTnI标准品、不同浓度的CK-MB标准品和不同浓度的 Myo标准品进行检测，得到标准品浓度(单位：ng/ml)与检测信号(单位：MFI) 之间的关系如下表1所示。并以浓度为横坐标，信号强度为纵坐标，绘制曲线，并 通过拟合获得表1中的线性范围。
表1 三种检测项目的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000111
Figure BDA0001931377930000121
用浓度接近线性区间下限的低值样本，将浓度接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为8个浓度点(计算方法如下表2)，进一步确定线性范围如下表3所 示，其中，cTnI的高值浓度和低值浓度分别为105ng/ml和0.05ng/ml；CK-MB的高 值浓度和低值浓度分别为305ng/ml和0.5ng/ml；Myo的高值浓度和低值浓度分别为 1050ng/ml和2ng/ml。
表2 选取的浓度点计算式汇总表
浓度点 理论浓度
1(高浓度) 100％(高浓度)+0％(低浓度)
2 50％(高浓度)+50％(低浓度)
3 25％(高浓度)+75％(低浓度)
4 12.5％(高浓度)+87.5％(低浓度)
5 6.25％(高浓度)+93.75％(低浓度)
6 3.13％(高浓度)+96.87％(低浓度)
7 1.56％(高浓度)+98.44％(低浓度)
8(低浓度) 0％(高浓度)+100％(低浓度)
以线性范围为横坐标(单位：ng/ml)，回归浓度为纵坐标(单位：ng/ml)，获 得表3中的回归方程，且获得表3中的回归常数。
表3 三种检测项目的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000122
Figure BDA0001931377930000131
根据上表3可知，cTnI标准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.954x +0.452，且回归常数R2＝0.999，则线性范围0.015-100ng/ml较为可靠；CK-MB标准 品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.974x+0.237，且回归常数R2＝0.999， 则线性范围0.3-300ng/ml较为可靠；Myo标准品的数据确定在线性范围内，根据表 6中的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.997x-1.059，且回归常数R2＝0.999， 则线性范围1-1000ng/ml较为可靠。
2)灵敏度的确定
用试剂测试空白样本(5％BSA)，重复测试20次，计算20次测试结果的平均值 X和标准差SD，X+2SD应不大于空白限值。
cTnI、CK-MB、Myo的灵敏度检测表如下表4。
表4、cTnI/CK-MB/Myo灵敏度检测表
Figure BDA0001931377930000132
Figure BDA0001931377930000141
从表4中可知，cTnI的灵敏度为0.015，CK-MB的灵敏度为0.031，Myo的灵 敏度为1.03.
实施例2
1、一种对cTnI、CK-MB、Myo进行联检的试剂盒
(1)第一免疫试剂中包括连接在磁球上的cTnI抗体、CK-MB抗体及Myo抗 体，cTnI抗体表面、CK-MB抗体表面及Myo抗体表面分别连接表面氨基修饰且粒 径为80nm的二氧化硅微球，且连接在cTnI抗体、CK-MB抗体及Myo抗体上的 CY5-NHS EASTER荧光素的荧光强度MF1分别为25622，48955，89542。
(2)第二免疫试剂中包括第一试剂和第二试剂。第一试剂包括生物素标记的 cTnI抗体、物素标记的CK-MB抗体及物素标记的Myo抗体，第一试剂的浓度为 1ug/ml；第二试剂包括链霉亲合素标记的藻红蛋白，第二试剂的浓度为5ug/ml。
2、第一免疫试剂和第二免疫试剂的制备方法
(1)第一免疫试剂的制备
抗体与二氧化硅微球结合：
1)取三份表面氨基修饰且粒径为80nm的二氧化硅微球取高分子物质微球，每 份微球的质量均为1mg，得到微球溶液1、微球溶液2和微球溶液3，向微球溶液1 中加入cTnI抗体50ug，向微球溶液2中加入CK-MB抗体50ug，向微球溶液3中 加入Myo抗体50ug，并向每个微球溶液中加入活化剂EDC和NHS各50ug，室温 反应3h。
2)加入浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA封闭剂封闭3h。
3)高速冷冻离心机离心，沉淀用pH为7的MES缓冲液溶解后再次离心，最 后用保存液保存，得到二氧化硅微球标记的cTnI抗体、二氧化硅微球标记的CK-MB 抗体及二氧化硅微球标记的Myo抗体。
荧光素标记抗体：
1)分别取二氧化硅微球标记的cTnI抗体、二氧化硅微球标记的CK-MB抗体 及二氧化硅微球标记的Myo抗体各50ug，并向每种抗体中分别加入5ul用DMSO 溶解的浓度为1mg/ml的荧光素CY5-NHS EASTER，之后在4℃下避光反应2h。
2)加入1mol/L氯化铵稀释至氯化铵的浓度为50mmol/L，室温反应2h。
3)反应结束后用磷酸缓冲盐溶液进行透析，除去多余的荧光素CY5-NHS EASTER。
4)对结束透析的荧光素标记的抗体的荧光强度进行测量，当cTnI抗体、CK-MB 抗体及Myo抗体标记的荧光素浓度基本成倍增加时，进行下一步操作。
磁珠与荧光素标记的抗体偶联：
1)取带氨基的磁珠3mg，并用pH为5，浓度为0.05mol/L的MES缓冲液清洗 两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
2)加入5mg的EDC及5mg的HS，并补加MES缓冲液到100ul，活化30min。
3)磁分离后，用MES缓冲液清洗磁珠两次，并在每次清洗之后进行磁分离操 作。
4)向磁分离后的磁珠中加入100ul的BS缓冲液，荧光标记后的抗体200ug， 偶联4h。
5)磁分离后，用MES缓冲液清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
6)加入浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA封闭剂进行封闭 2h。
7)磁分离后，用浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA保存液 清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作，得到第一免疫组合物。
8)重复上述步骤，获得检测不同待测物的第一免疫组合物，并将多种第一免疫 组合物等量混合，得到第一免疫试剂。
(2)第二免疫试剂的制备
第一试剂的制备：
1)分别取cTnI抗体、CK-MB抗体及Myo抗体各100ug，分别加入等体积的碳 酸氢钠，且碳酸氢钠的浓度为0.1mol/L，得到cTnI抗体溶液2、CK-MB抗体溶液2 及Myo抗体溶液2。
2)用无水二甲基亚砜溶解BNHS，使得BNHS的浓度为10mmol/L，取BNHS溶 液，分别中各加入2ul的BNHS溶液，并在37℃反应30min。
3)反应结束后用脱盐除去未与抗体结合的BNHS，得到第二试剂。
第二试剂的制备：
链霉亲和素标记的藻红蛋白稀释至5ug/ml。
3、cTnI、CK-MB、Myo的检测步骤
1)制备待测样本：
取浓度为5ug/ml的第一免疫试剂50ul，并向其中加入标准样本50ul，37℃下 孵育5min，之后进行清洗和磁分离操作，得到第一磁珠复合物；
向第一磁珠复合物中加入1ug/ml的第一试剂100ul，37℃下孵育3min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到第二磁珠复合物；
向第二磁珠复合物中加入5ug/ml的第二试剂100ul，37℃下孵育2min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到待测样本。
2)待测样本的检测
以CY5-NHS EASTER荧光素的强度对三种抗体进行分类，再以PE信号进行检 测
3、灵敏度检测和线性范围检测
1)线性范围的确定
分别使用不同浓度的cTnI标准品、不同浓度的CK-MB标准品和不同浓度的 Myo标准品进行检测，得到标准品浓度(单位：ng/ml)与检测信号(单位：MFI) 之间的关系如下表5所示，并以浓度为横坐标，信号强度为纵坐标，绘制曲线，获 得表5中的线性范围。
表5 三种标准品的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000161
用浓度接近线性区间下限的低值样本，将浓度接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为8个浓度点(计算方法如下表2)，进一步确定线性范围如下表6所 示，其中，cTnI的高值浓度和低值浓度分别为105ng/ml和0.02ng/ml；CK-MB的高 值浓度和低值浓度分别为405ng/ml和0.5ng/ml；Myo的高值浓度和低值浓度分别为 2050ng/ml和5ng/ml。
以线性范围为横坐标(单位：ng/ml)，回归浓度为纵坐标(单位：ng/ml)，获 得表6中的回归方程，且获得表6中的回归常数。
表6 三种检测项目的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000162
Figure BDA0001931377930000171
根据上表6可知，cTnI标准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.944x +0.166，且回归常数R2＝0.999，则线性范围0.008-100ng/ml较为可靠；CK-MB标 准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.986x+0.140，且回归常数R2＝1， 则线性范围0.3-400ng/ml较为可靠；Myo标准品的数据确定在线性范围内，根据表 6中的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.962x+6.900，且回归常数R2＝0.999， 则线性范围1-4000ng/ml较为可靠。
2)灵敏度的确定
用试剂测试空白样本(5％BSA)，重复测试20次，计算20次测试结果的平均值 X和标准差SD，X+2SD应不大于空白限值。
cTnI、CK-MB、Myo的灵敏度检测表如表7。
表7 cTnI/CK-MB/Myo灵敏度检测表
Figure BDA0001931377930000172
Figure BDA0001931377930000181
从表8中可知，cTnI的灵敏度为0.008ng/ml，CK-MB的灵敏度为0.3ng/ml， Myo的灵敏度为1ng/ml。
由实施例1和实施例2的结果比较见下表8，从表8中可知，偶联二氧化硅微 球后，有利于提高检测灵敏度及拓宽线性范围。
表8 实施例1和实施例2的结果比较表
Figure BDA0001931377930000182
实施例3
1、一种对cTnI、CK-MB、Myo进行联检的试剂盒
(1)第一免疫试剂中包括连接在磁球上的cTnI抗体、CK-MB抗体及Myo抗 体，cTnI抗体表面、CK-MB抗体表面及Myo抗体表面分别连接表面氨基修饰且粒 径为80nm的聚乙烯微球，且连接cTnI抗体连接FITC荧光素，CK-MB抗体连接 CY5-NHS EASTER荧光素，Myo抗体连接CPC荧光素，每种荧光素的荧光强度分 别为65841，85412及105236。
(2)第二免疫试剂中包括第一试剂和第二试剂。第一试剂包括生物素标记的 cTnI抗体、物素标记的CK-MB抗体及物素标记的Myo抗体，第一试剂的浓度为 1ug/ml；第二试剂包括链霉亲合素标记的藻红蛋白，第二试剂的浓度为5ug/ml。
2、第一免疫试剂和第二免疫试剂的制备方法
(1)第一免疫试剂的制备
抗体与聚乙烯微球结合：
1)取三份表面氨基修饰且粒径为80nm的聚乙烯微球取高分子物质微球，每份 微球的质量均为1mg，得到微球溶液1、微球溶液2和微球溶液3，向微球溶液1 中加入cTnI抗体50ug，向微球溶液2中加入CK-MB抗体50ug，向微球溶液3中 加入Myo抗体50ug，并向每个微球溶液中加入活化剂EDC和NHS各50ug，室温 反应3h。
2)加入浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA封闭剂封闭3h。
3)高速冷冻离心机离心，沉淀用pH为7的MES缓冲液溶解后再次离心，最 后用保存液保存，得到聚乙烯微球标记的cTnI抗体、聚乙烯微球标记的CK-MB抗 体及聚乙烯微球标记的Myo抗体。
荧光素标记抗体：
1)分别取聚乙烯微球标记的cTnI抗体、聚乙烯微球标记的CK-MB抗体及聚 乙烯微球标记的Myo抗体各50ug，并向每种抗体中分别加入5ul用DMSO溶解的 浓度为1mg/ml的荧光素CY5-NHS EASTER，之后在4℃下避光反应2h。
2)加入1mol/L氯化铵稀释至氯化铵的浓度为50mmol/L，室温反应2h。
3)反应结束后用磷酸缓冲盐溶液进行透析，除去多余的荧光素。
4)对结束透析的荧光素标记的抗体的荧光强度进行测量，当cTnI抗体、CK-MB 抗体及Myo抗体标记的荧光素的荧光强度各自不同时，进行下一步操作。
磁珠与荧光素标记的抗体偶联：
1)取带氨基的磁珠3mg，并用pH为5，浓度为0.05mol/L的MES缓冲液清洗 两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
2)加入5mg的EDC及5mg的HS，并补加MES缓冲液到100ul，活化30min。
3)磁分离后，用MES缓冲液清洗磁珠两次，并在每次清洗之后进行磁分离操 作。
4)向磁分离后的磁珠中加入100ul的BS缓冲液，荧光标记后的抗体200ug， 偶联4h。
5)磁分离后，用MES缓冲液清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
6)加入浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA封闭剂进行封闭 2h。
7)磁分离后，用浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA保存液 清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作，得到第一免疫组合物。
8)重复上述步骤，获得检测不同待测物的第一免疫组合物，并将多种第一免疫 组合物等量混合，得到第一免疫试剂。
(2)第二免疫试剂的制备
第一试剂的制备：
1)分别取cTnI抗体、CK-MB抗体及Myo抗体各100ug，分别加入等体积的碳 酸氢钠，且碳酸氢钠的浓度为0.1mol/L，得到cTnI抗体溶液2、CK-MB抗体溶液2 及Myo抗体溶液2。
2)用无水二甲基亚砜溶解BNHS，使得BNHS的浓度为10mmol/L，取BNHS溶 液，分别中各加入2ul的BNHS溶液，并在37℃反应30min。
3)反应结束后用脱盐柱除去未与抗体结合的BNHS，得到第二试剂。
第二试剂的制备：
链霉亲和素标记的藻红蛋白稀释至5ug/ml，得到第二试剂。
3、cTnI、CK-MB、Myo的检测步骤
1)制备待测样本：
取浓度为5ug/ml的第一免疫试剂50ul，并向其中加入标准样本50ul，37℃下 孵育5min，之后进行清洗和磁分离操作，得到第一磁珠复合物；
向第一磁珠复合物中加入1ug/ml的第一试剂100ul，37℃下孵育3min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到第二磁珠复合物；
向第二磁珠复合物中加入5ug/ml的第二试剂100ul，37℃下孵育2min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到待测样本。
3、灵敏度检测和线性范围检测
1)线性范围的确定
分别使用不同浓度的cTnI标准品、不同浓度的CK-MB标准品和不同浓度的 Myo标准品进行检测，得到标准品浓度(单位：ng/ml)与检测信号(单位：MFI) 之间的关系如下表9所示，并以浓度为横坐标，信号强度为纵坐标，绘制曲线，获 得表9中的线性范围。
表9 三种标准品的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000201
用浓度接近线性区间下限的低值样本，将浓度接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为8个浓度点(计算方法如下表2)，进一步确定线性范围如下表10 所示，其中，cTnI的高值浓度和低值浓度分别为105ng/ml和0.02ng/ml；CK-MB的 高值浓度和低值浓度分别为405ng/ml和0.5ng/ml；Myo的高值浓度和低值浓度分别 为2050ng/ml和5ng/ml。
以线性范围为横坐标(单位：ng/ml)，回归浓度为纵坐标(单位：ng/ml)，获 得表6中的回归方程，且获得表10中的回归常数。
表10 三种检测项目的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000211
根据上表10可知，cTnI标准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.916x +0.8262，且回归常数R2＝0.994，则线性范围0.08-100ng/ml较为可靠；CK-MB标 准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.987x+0.365，且回归常数R2＝1， 则线性范围0.3-400ng/ml较为可靠；Myo标准品的数据确定在线性范围内，根据表 10中的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.978x+4.891，且回归常数R2＝0.999， 则线性范围1-2000ng/ml较为可靠。
2)灵敏度的确定
用试剂测试空白样本(5％BSA)，重复测试20次，计算20次测试结果的平均值 X和标准差SD，X+2SD应不大于空白限值。
cTnI、CK-MB、Myo的灵敏度检测表如表11。
表11 cTnI/CK-MB/Myo灵敏度检测表
Figure BDA0001931377930000212
Figure BDA0001931377930000221
从表11中可知，cTnI的灵敏度为0.008ng/ml，CK-MB的灵敏度为0.3ng/ml， Myo的灵敏度为1ng/ml。
实施例1、实施例2和实施例3的结果比较见下表12，从表中可知，与实施例 1相比，偶联聚乙烯微球后，有利于提高检测灵敏度及拓宽线性范围。
表12 实施例1、实施例2和实施例3的结果比较表
Figure BDA0001931377930000222
实施例4
1、一种对cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer进行联检的试剂盒
(1)第一免疫试剂中包括连接在磁球上的cTnI抗体、NT-PROBNP抗体及D-Dimer 抗体，且连接在cTnI抗体、NT-PROBNP抗体及D-Dimer抗体上的FITC荧光素的 荧光强度分别为25856、69852及153698。
(2)第二免疫试剂中包括第一试剂和第二试剂。第一试剂包括生物素标记的 cTnI抗体、生物素标记的NT-PROBNP抗体及生物素标记的D-Dimer抗体，第一试 剂的浓度为1ug/ml；第二试剂包括链霉亲合素标记的藻红蛋白，第二试剂的浓度为 5ug/ml。
2、第一免疫试剂和第二免疫试剂的制备方法
(1)第一免疫试剂的制备
荧光素标记抗体：
1)用pH为7的MES缓冲液分别稀释cTnI抗体溶液1、NT-PROBNP抗体溶 液1、D-Dimer抗体溶液1，使得cTnI抗体溶液1、NT-PROBNP抗体溶液1、D-Dimer 抗体溶液1中各抗体的浓度分别为2mg/ml。
2)用无水DMSO溶解FITC，配置浓度为1mg/ml的FITC荧光素溶液。
3)取cTnI抗体溶液1、NT-PROBNP抗体溶液1、D-Dimer抗体溶液1各1mg， 将20ulFITC荧光素溶液加入到cTnI抗体溶液1中得到混合液1、将40ul FITC荧光 素溶液加入到NT-PROBNP抗体溶液1中得到混合液2、将80ul FITC荧光素溶液加 入到D-Dimer抗体溶液1中得到混合液3，并在4℃条件下避光反应2h。
4)向混合液1、混合液2及混合液3中分别加入1mol/L的氯化铵至氯化铵的 浓度为50mmol/L并在室温下反应2h。
5)反应结束后用PBS缓冲液进行透析，得到荧光素标记的抗体。
6)对结束透析的荧光素标记的抗体的荧光强度进行测量，当cTnI抗体、 NT-PROBNP抗体及D-Dimer抗体标记的荧光素浓度基本为成倍增加后，进行下一 步操作。
磁珠与荧光素标记的抗体偶联：
1)取带氨基的磁珠3mg，并用pH为5，浓度为0.05mol/L的MES缓冲液清洗 两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
2)加入5mg的EDC及5mg的HS，并补加MES缓冲液到100ul，活化30min。
3)磁分离后，用MES缓冲液清洗磁珠两次，并在每次清洗之后进行磁分离操 作。
4)向磁分离后的磁珠中加入100ul的BS缓冲液，荧光标记后的抗体200ug， 偶联4h。
5)磁分离后，用MES缓冲液清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
6)加入浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA封闭剂进行封闭 2h。
7)磁分离后，用浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA保存液 清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作，得到第一免疫组合物。
8)重复上述步骤，获得检测不同待测物的第一免疫组合物，并将多种第一免疫 组合物等量混合，得到第一免疫试剂。
(2)第二免疫试剂的制备
第一试剂的制备：
1)分别取cTnI抗体、NT-PROBNP抗体及D-Dimer抗体各100ug，分别加入等 体积的碳酸氢钠，且碳酸氢钠的浓度为0.1mol/L，得到cTnI抗体溶液2、NT-PROBNP 抗体溶液2及D-Dimer抗体溶液2。
2)用无水二甲基亚砜溶解BNHS，使得BNHS的浓度为10mmol/L，取BNHS溶 液，分别中各加入2ul的BNHS溶液，并在37℃反应30min。
3)反应结束后用脱盐柱除去未与抗体结合的BNHS，得到第二试剂。
第二试剂的制备：
链霉亲和素标记的藻红蛋白稀释至5ug/ml，得到第二试剂。
3、cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer的检测步骤
1)制备待测样本：
取浓度为5ug/ml的第一免疫试剂50ul，并向其中加入标准样本50ul，37℃下 孵育5min，之后进行清洗和磁分离操作，得到第一磁珠复合物；
向第一磁珠复合物中加入1ug/ml的第一试剂100ul，37℃下孵育3min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到第二磁珠复合物；
向第二磁珠复合物中加入5ug/ml的第二试剂100ul，37℃下孵育2min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到待测样本。
2)待测样本的检测
以FITC荧光素的强度对三种抗体进行分类，再以PE信号进行检测。
3、灵敏度检测和线性范围检测
1)线性范围的确定
分别使用不同浓度的cTnI标准品、不同浓度的NT-PROBNP标准品和不同浓度 的D-Dimer标准品进行检测，得到标准品浓度与检测信号之间的关系如下表13，并 以浓度为横坐标，信号强度为纵坐标，绘制曲线，获得表13中的线性范围。
表13 三种标准品的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000241
Figure BDA0001931377930000251
用浓度接近线性区间下限的低值样本，将浓度接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为8个浓度点(计算方法如表2)，进一步确定线性范围如下表14所 示，其中，cTnI的高值浓度和低值浓度分别为105ng/ml和0.02ng/ml；CK-MB的高 值浓度和低值浓度分别为35200pg/ml和50pg/ml；Myo的高值浓度和低值浓度分别 为55mg/ml和0.05mg/ml。
以线性范围为横坐标(单位分别为ng/ml、pg/ml和mg/ml)，回归浓度为纵坐标 (单位分别为ng/ml、pg/ml和mg/ml，获得表14中的回归方程，且获得表14中的 回归常数。
表14 三种检测项目的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000252
根据上表14可知，cTnI标准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.911x +0.639，且回归常数R2＝0.997，则线性范围0.015-100ng/ml较为可靠；CK-MB标准 品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.983x+24.01，且回归常数R2＝0.999， 则线性范围20-35000pg/ml较为可靠；Myo标准品的数据确定在线性范围内，根据 表6中的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.901x+0.431，且回归常数 R2＝0.996，则线性范围0.02-50mg/ml较为可靠。
2)灵敏度的确定
用试剂测试空白样本(5％BSA)，重复测试20次，计算20次测试结果的平均值 X和标准差SD，X+2SD应不大于空白限值。
cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer的灵敏度检测表如表15。
表15 cTnI/NT-PROBNP/D-Dimer灵敏度检测表
Figure BDA0001931377930000261
从表15中可知，cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer的灵敏度分别为0.015ng/ml、 20pg/ml及0.02mg/ml。
实施例5
1、一种对cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer进行联检的试剂盒
(1)第一免疫试剂中包括连接在磁球上的cTnI抗体、NT-PROBNP抗体及 D-Dimer抗体，cTnI抗体表面、NT-PROBNP抗体表面及D-Dimer抗体表面分别连 接表面氨基修饰且粒径为80nm的二氧化硅微球，且连接在cTnI抗体、NT-PROBNP 抗体及D-Dimer抗体上的CY5-NHSEASTER荧光素的荧光强度分别为35985,89564， 254125。
(2)第二免疫试剂中包括第一试剂和第二试剂。第一试剂包括生物素标记的 cTnI抗体、物素标记的NT-PROBNP抗体及物素标记的D-Dimer抗体，第一试剂的 浓度为1ug/ml；第二试剂包括链霉亲合素标记的藻红蛋白，第二试剂的浓度为5ug/ml。
2、第一免疫试剂和第二免疫试剂的制备方法
(1)第一免疫试剂的制备
抗体与二氧化硅微球结合：
1)取三份表面氨基修饰且粒径为80nm的二氧化硅微球取高分子物质微球，每 份微球的质量均为1mg，得到微球溶液1、微球溶液2和微球溶液3，向微球溶液1 中加入cTnI抗体50ug，向微球溶液2中加入NT-PROBNP抗体50ug，向微球溶液3 中加入D-Dimer抗体50ug，并向每个微球溶液中加入活化剂EDC和NHS各50ug， 室温反应3h。
2)加入浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA封闭剂封闭3h。
3)高速冷冻离心机离心，沉淀用pH为7的MES缓冲液溶解后再次离心，最 后用保存液保存，得到二氧化硅微球标记的cTnI抗体、二氧化硅微球标记的 NT-PROBNP抗体及二氧化硅微球标记的D-Dimer抗体。
荧光素标记抗体：
1)分别取二氧化硅微球标记的cTnI抗体、二氧化硅微球标记的NT-PROBNP 抗体及二氧化硅微球标记的D-Dimer抗体各50ug，并向每种抗体中分别加入5ul用 DMSO溶解的浓度为1mg/ml的荧光素CY5-NHS EASTER，之后在4℃下避光反应 2h。
2)加入1mol/L氯化铵稀释至氯化铵的浓度为50mmol/L，室温反应2h。
3)反应结束后用磷酸缓冲盐溶液进行透析，除去多余的荧光素CY5-NHS EASTER。
4)为确保cTnI抗体、NT-PROBNP抗体及D-Dimer抗体上标记了不同浓度的 荧光素，对结束透析的荧光素标记的抗体的荧光强度进行测量，当cTnI抗体、 NT-PROBNP抗体及D-Dimer抗体标记的荧光素浓度基本为成倍增加后，进行下一 步操作。
磁珠与荧光素标记的抗体偶联：
1)取带氨基的磁珠3mg，并用pH为5，浓度为0.05mol/L的MES缓冲液清洗 两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
2)加入5mg的EDC及5mg的HS，并补加MES缓冲液到100ul，活化30min。
3)磁分离后，用MES缓冲液清洗磁珠两次，并在每次清洗之后进行磁分离操 作。
4)向磁分离后的磁珠中加入100ul的BS缓冲液，荧光标记后的抗体200ug， 偶联4h。
5)磁分离后，用MES缓冲液清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
6)加入浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA封闭剂进行封闭 2h。
7)磁分离后，用浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA保存液 清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作，得到第一免疫组合物。
8)重复上述步骤，获得检测不同待测物的第一免疫组合物，并将多种第一免疫 组合物等量混合，得到第一免疫试剂。
(2)第二免疫试剂的制备
第一试剂的制备：
1)分别取cTnI抗体、NT-PROBNP抗体及D-Dimer抗体各100ug，分别加入等 体积的碳酸氢钠，且碳酸氢钠的浓度为0.1mol/L，得到cTnI抗体溶液2、NT-PROBNP 抗体溶液2及D-Dimer抗体溶液2。
2)用无水二甲基亚砜溶解BNHS，使得BNHS的浓度为10mmol/L，取BNHS溶 液，分别中各加入2ul的BNHS溶液，并在37℃反应30min。
3)反应结束后用脱盐柱除去未与抗体结合的BNHS，得到第二试剂。
第二试剂的制备：
链霉亲和素标记的藻红蛋白稀释至5ug/ml，得到第二试剂。
3、cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer的检测步骤
1)制备待测样本：
取浓度为5ug/ml的第一免疫试剂50ul，并向其中加入标准样本50ul，37℃下 孵育5min，之后进行清洗和磁分离操作，得到第一磁珠复合物；
向第一磁珠复合物中加入1ug/ml的第一试剂100ul，37℃下孵育3min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到第二磁珠复合物；
向第二磁珠复合物中加入5ug/ml的第二试剂100ul，37℃下孵育2min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到待测样本。
2)待测样本的检测
以CY5-NHS EASTER荧光素的强度对三种抗体进行分类，再以PE信号进行检 测。
3、灵敏度检测和线性范围检测
1)线性范围的确定
分别使用不同浓度的cTnI标准品、不同浓度的NT-PROBNP标准品和不同浓度 的D-Dimer标准品进行检测，得到标准品浓度与检测信号之间的关系如下表16，并 以浓度为横坐标，信号强度为纵坐标，绘制曲线，获得表16中的线性范围。
表16 三种标准品的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000291
用浓度接近线性区间下限的低值样本，将浓度接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为8个浓度点(计算方法如表2)，进一步确定线性范围如下表17所 示，其中，cTnI的高值浓度和低值浓度分别为105ng/ml和0.02ng/ml；CK-MB的高 值浓度和低值浓度分别为35200pg/ml和50pg/ml；Myo的高值浓度和低值浓度分别 为85mg/ml和0.05mg/ml。
以线性范围为横坐标(单位分别为ng/ml、pg/ml和mg/ml)，回归浓度为纵坐标 (单位分别为ng/ml、pg/ml和mg/ml，获得表14中的回归方程，且获得表14中的 回归常数。
表17 三种检测项目的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000292
Figure BDA0001931377930000301
根据上表17可知，cTnI标准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.957x +0.777，且回归常数R2＝0.992，则线性范围0.008-100ng/ml较为可靠；NT-PROBNP 标准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.992x+21.29，且回归常数 R2＝0.999，则线性范围10-35000pg/ml较为可靠；D-Dimer标准品的数据确定在线 性范围内，根据表17中的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.94x+0.309， 且回归常数R2＝0.999，则线性范围0.02-80mg/ml较为可靠。
2)灵敏度的确定
用试剂测试空白样本(5％BSA)，重复测试20次，计算20次测试结果的平均值 X和标准差SD，X+2SD应不大于空白限值。
cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer的灵敏度检测表如表18。
表18 cTnI/NT-PROBNP/D-Dimer灵敏度检测表
Figure BDA0001931377930000302
从表18中可知，cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer的灵敏度分别为0.008ng/ml、 10pg/ml及0.02mg/ml。
实施例4和实施例5的结果比较见下表19，从表中可知，偶联二氧化硅微球后， 有利于提高检测灵敏度及拓宽线性范围。
表19 实施例4和实施例5的结果比较表
Figure BDA0001931377930000311
实施例6
1、一种对cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer进行联检的试剂盒
(1)第一免疫试剂中包括连接在磁球上的cTnI抗体、NT-PROBNP抗体及 D-Dimer抗体，cTnI抗体表面、NT-PROBNP抗体表面及D-Dimer抗体表面分别连 接表面氨基修饰且粒径为80nm的聚乙烯微球，且连接cTnI抗体连接FITC荧光素， NT-PROBNP抗体连接CY5-NHSEASTER荧光素，D-Dimer抗体连接CPC荧光素， 每种荧光素的荧光强度分别为65841，85412及105236。
(2)第二免疫试剂中包括第一试剂和第二试剂。第一试剂包括生物素标记的 cTnI抗体、生物素标记的NT-PROBNP抗体及生物素标记的D-Dimer抗体第一试剂 的浓度为1ug/ml；第二试剂包括链霉亲合素标记的藻红蛋白，第二试剂的浓度为 5ug/ml。
2、第一免疫试剂和第二免疫试剂的制备方法
(1)第一免疫试剂的制备
抗体与聚乙烯微球结合：
1)取三份表面氨基修饰且粒径为80nm的聚乙烯微球取高分子物质微球，每份 微球的质量均为1mg，得到微球溶液1、微球溶液2和微球溶液3，向微球溶液1 中加入cTnI抗体50ug，向微球溶液2中加入NT-PROBNP抗体50ug，向微球溶液3 中加入D-Dimer抗体50ug，并向每个微球溶液中加入活化剂EDC和NHS各50ug， 室温反应3h。
2)加入浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA封闭剂封闭3h。
3)高速冷冻离心机离心，沉淀用pH为7的MES缓冲液溶解后再次离心，最 后用保存液保存，得到聚乙烯微球标记的cTnI抗体、聚乙烯微球标记的NT-PROBNP 抗体及聚乙烯微球标记的D-Dimer抗体。
荧光素标记抗体：
1)分别取聚乙烯微球标记的cTnI抗体、聚乙烯微球标记的NT-PROBNP抗体 及聚乙烯微球标记的D-Dimer抗体各50ug，并向每种抗体中分别加入5ul用DMSO 溶解的浓度为1mg/ml的荧光素CY5-NHS EASTER，之后在4℃下避光反应2h。
2)加入1mol/L氯化铵稀释至氯化铵的浓度为50mmol/L，室温反应2h。
3)反应结束后用磷酸缓冲盐溶液进行透析，除去多余的荧光素CY5-NHS EASTER。
4)为确保cTnI抗体、NT-PROBNP抗体及D-Dimer抗体上标记了不同浓度的 荧光素，对结束透析的荧光素标记的抗体的荧光强度进行测量，当cTnI抗体、 NT-PROBNP抗体及D-Dimer抗体标记的荧光素浓度基本为成倍增加后，进行下一 步操作。
磁珠与荧光素标记的抗体偶联：
1)取带氨基的磁珠3mg，并用pH为5，浓度为0.05mol/L的MES缓冲液清洗 两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
2)加入5mg的EDC及5mg的HS，并补加MES缓冲液到100ul，活化30min。
3)磁分离后，用MES缓冲液清洗磁珠两次，并在每次清洗之后进行磁分离操 作。
4)向磁分离后的磁珠中加入100ul的BS缓冲液，荧光标记后的抗体200ug偶 联4h。
5)磁分离后，用MES缓冲液清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作。
6)加入浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA封闭剂进行封闭 2h。
7)磁分离后，用浓度为1％且包含质量份数为0.05％的吐温20的BSA保存液 清洗两次，并在每次清洗之后进行磁分离操作，得到第一免疫组合物。
8)重复上述步骤，获得检测不同待测物的第一免疫组合物，并将多种第一免疫 组合物等量混合，得到第一免疫试剂。
(2)第二免疫试剂的制备
第一试剂的制备：
1)分别取cTnI抗体、NT-PROBNP抗体及D-Dimer抗体各100ug，分别加入等 体积的碳酸氢钠，且碳酸氢钠的浓度为0.1mol/L，得到cTnI抗体溶液2、NT-PROBNP 抗体溶液2及D-Dimer抗体溶液2。
2)用无水二甲基亚砜溶解BNHS，使得BNHS的浓度为10mmol/L，取BNHS溶 液，分别中各加入2ul的BNHS溶液，并在37℃反应30min。
3)反应结束后用脱盐柱出去未与抗体结合的BNHS，得到第二试剂。
第二试剂的制备：
链霉亲和素标记的藻红蛋白稀释至5ug/ml，得到第二试剂。
3、cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer的检测步骤
1)制备待测样本：
取浓度为5ug/ml的第一免疫试剂50ul，并向其中加入标准样本50ul，37℃下 孵育5min，之后进行清洗和磁分离操作，得到第一磁珠复合物；
向第一磁珠复合物中加入1ug/ml的第一试剂100ul，37℃下孵育3min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到第二磁珠复合物；
向第二磁珠复合物中加入5ug/ml的第二试剂100ul，37℃下孵育2min，之后进 行清洗和磁分离操作，得到待测样本。
3、灵敏度检测和线性范围检测
1)线性范围的确定
分别使用不同浓度的cTnI标准品、不同浓度的NT-PROBNP标准品和不同浓 度的D-Dimer标准品进行检测，得到标准品浓度与检测信号之间的关系如下表20， 并以浓度为横坐标，信号强度为纵坐标，绘制曲线，获得表20中的线性范围。
表20 三种标准品的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000331
用浓度接近线性区间下限的低值样本，将浓度接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为8个浓度点(计算方法如表2)，进一步确定线性范围如下表21所 示，其中，cTnI的高值浓度和低值浓度分别为105ng/ml和0.02ng/ml；CK-MB的高 值浓度和低值浓度分别为35200pg/ml和50pg/ml；Myo的高值浓度和低值浓度分别 为85mg/ml和0.05mg/ml。
以线性范围为横坐标(单位分别为ng/ml、pg/ml和mg/ml)，回归浓度为纵坐标 (单位分别为ng/ml、pg/ml和mg/ml，获得表21中的回归方程，且获得表21中的 回归常数。
表21 三种检测项目的浓度/信号值/线性范围数据统计表
Figure BDA0001931377930000341
根据上表21可知，cTnI标准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.918x +0.733，且回归常数R2＝0.997，则线性范围0.008-100ng/ml较为可靠；NT-PROBNP 标准品的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.970x+138.5，且回归常数 R2＝0.999，则线性范围10-35000pg/ml较为可靠；D-Dimer标准品的数据确定在线性 范围内，根据表21中的数据确定在线性范围内，回归方程为y＝0.953x+0.453，且 回归常数R2＝0.998，则线性范围0.02-80mg/L较为可靠。
2)灵敏度的确定
用试剂测试空白样本(5％BSA)，重复测试20次，计算20次测试结果的平均值 X和标准差SD，X+2SD应不大于空白限值。
cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer的灵敏度检测表如表22。
表22 cTnI/NT-PROBNP/D-Dimer灵敏度检测表
Figure BDA0001931377930000342
Figure BDA0001931377930000351
从表22中可知，cTnI、NT-PROBNP、D-Dimer的灵敏度分别为0.008ng/ml、 10pg/ml及0.02mg/ml。
实施例4、实施例5和实施例6的结果比较见下表23，从表中可知，与实施例 4相比，偶联聚乙烯微球后，有利于提高检测灵敏度及拓宽线性范围。
表23 实施例4、实施例5和实施例6的结果比较表
Figure BDA0001931377930000352
比较实施例1和实施例4中的数据可知，在磁珠上连接荧光强度不同的抗体能 够对不同的待测物进行联检。而比较实施例1-实施例6可知，在抗体上连接检测结 合体后，虽然不同的检测结合体对检测结果的提升程度不同，但与不使用检测结合 体相比，有利于提高检测灵敏度和拓宽线芯范围，能够更好的满足不同待测物的检 测需求。
综上，本发明公开了一种多重检测免疫试剂及其制备方法、试剂盒、系统及应 用，免疫试剂包括多种第一免疫组合物，每种第一免疫组合物包括：固相载体；第 一免疫结合物，用于进行特异性免疫反应；第一荧光标记物，连接在第一免疫结合 物上；其中，每种第一免疫组合物具有不同的荧光强度。通过上述方式，本发明能 够降低多重检测过程对磁珠种类和性能的依赖，并降低生产成本。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用 本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其 他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (21)

1.一种用于多重检测的免疫试剂，其特征在于，所述免疫试剂包括多种第一免疫组合物，每种所述第一免疫组合物包括：
固相载体；
第一免疫结合物，用于进行特异性免疫反应；
第一荧光标记物，连接在所述第一免疫结合物上；
其中，每种所述第一免疫组合物具有不同的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的免疫试剂，其特征在于，所述第一免疫结合物包括抗原和/或抗体。
3.根据权利要求2所述的免疫试剂，其特征在于，所述抗体包括与不同抗原决定簇结合的检测抗体和/或捕获抗体，所述抗原包括蛋白质、多肽、激素、糖类、酶、药物或核酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的免疫试剂，其特征在于，所述固相载体包括微孔板、玻璃片、微流控芯片、磁珠中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的免疫试剂，其特征在于，所述第一免疫组合物中的所述第一荧光标记物的种类不同；或者所述第一荧光标记物的种类相同，而荧光强度不同，以使每种所述第一免疫组合物具有不同的荧光强度。
6.根据权利要求1所述的免疫试剂，其特征在于，多种所述第一免疫组合物的多种所述固相载体的粒径不同，且每种所述第一荧光标记物相同。
7.根据权利要求1所述的免疫试剂，其特征在于，所述第一荧光标记物包括荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，花菁类荧光染料，香豆素类荧光染料，氟硼类荧光染料，酞菁类荧光染料中的一种或以上的组合。
8.根据权利要求1所述的免疫试剂，其特征在于，所述第一免疫组合物还包括：
检测结合体，通过偶联或物理吸附的方式与所述第一免疫结合物连接。
9.根据权利要求8所述的免疫试剂，其特征在于，所述检测结合体包括自身具有偶联基团的检测结合体和/或修饰有偶联基团的检测结合体，且所述偶联基团包括羧基、羟基、氨基、甲苯磺酰基、氯甲基、巯基、醛基、酰肼、硅羟基、琥珀酰亚胺酯或环氧基中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的免疫试剂，其特征在于，所述检测结合体包括有机高分子结合体、无机物结合体或有机高分子-无机物杂化结合体。
11.根据权利要求10所述的免疫试剂，其特征在于，所述有机高分子结合体的材质包括聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺或乳胶中的一种或两种及以上的混合物；所述无机物结合体的材质包括二氧化硅；所述有机高分子-无机物杂化结合体为所述有机高分子结合体和所述无机物结合体的混合物。
12.根据权利要求8述的免疫试剂，其特征在于，所述检测结合体为球体，所述检测结合体的粒径为1μm-10μm。
13.一种用于多重检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
试剂盒本体；
第一试剂容纳位，设置在所述试剂盒本体上，用于容纳权利要求1-11项所述的免疫试剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
第二试剂容纳位，设置在所述试剂盒本体上，用于容第二免疫组合物，所述第二免疫组合物包括第二免疫结合物和标记在所述第二免疫结合物上的第二荧光标记物，所述第二免疫试剂与所述第一免疫试剂配合以进行不同待测物的检测。
15.一种多重检测免疫分析系统，其特征在于，所述系统包括：
试剂盒，所述试剂盒包括权利要求13所述的试剂盒；
样本分析仪，所述样本分析仪通过使用所述试剂盒中的免疫试剂进行不同待测物的检测，并输出检测结果。
16.一种用于多重检测的免疫试剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
提供预设种类的第一免疫结合物，预设种类的所述第一免疫结合物分别用于检测不同的待测物；
向每种所述第一免疫结合物中分别加入第一荧光标记物，使得第一荧光标记物分别标记每种所述第一免疫结合物；
向连接了荧光标记物的每种所述第一免疫结合物中加入固相载体，使得每种所述第一免疫结合物与固相载体连接，得到相应的第一免疫组合物；
将预设种类的所述第一免疫组合物混合，并将固相载体加入到所述第一免疫组合物的混合物中，反应一段时间后得到用于多重检测的免疫试剂；
其中，标记每种所述第一免疫结合物的第一荧光标记物的荧光强度不同；或者，多种所述第一免疫组合物的多种所述固相载体的粒径不同，且每种所述第一荧光标记物相同。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述向每种所述第一免疫结合物中分别加入第一荧光标记物之前，所述方法还包括：
向至少一种所述第一免疫结合物中加入封闭剂，并反应一段时间，其中，所述封闭剂包括多羟基糖类化合物、蛋白质类化合物或含有伯氨基(-NH2)的小分子化合物中的至少一种。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，
所述多羟基糖类化合物为葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、葡聚糖、甘露醇或聚蔗糖中的至少一种；
所述蛋白质类化合物为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白、明胶、酪蛋白水解物、免疫球蛋白、奶粉、人或动物血清中的至少一种；
所述小分子化合物为三羟甲基氨基甲烷、乙醇胺、羟胺、己胺或甘氨酸中的至少一种。
19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
向至少一份所述第一免疫结合物中加入检测结合体，以使所述第一免疫结合物与所述检测结合体连接。
20.权利要求1-11任一项所述的免疫试剂在免疫荧光分析中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
所述免疫试剂用于对甲状腺功能相关蛋白、心血管功能相关蛋白、心肌肌钙蛋白、肝纤维化相关蛋白、肿瘤相关蛋白、性腺功能相关蛋白、肾功能相关蛋白、骨代谢功能相关蛋白、糖代谢功能相关蛋白、传染病相关蛋白、自身免疫功能相关蛋白、产前筛查项目相关蛋白、药物检测相关蛋白、4型人类疱疹病毒相关蛋白、炎症相关蛋白中的至少一种进行检测。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112782404A (zh) * 2020-12-24 2021-05-11 湖南博奥瑞康生物科技有限公司 基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007020565A (ja) * 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
US20080200562A1 (en) * 2005-05-02 2008-08-21 Anp Technologies Polymer Conjugate Enhanced Bioassays
CN101995459A (zh) * 2009-08-26 2011-03-30 刘萍 包被板封闭液
CN102062735A (zh) * 2009-11-18 2011-05-18 江苏迈迪基因生物科技有限公司 急性冠状动脉综合症的生物标志物检测法及诊断试剂盒
CN103743897A (zh) * 2014-02-08 2014-04-23 于方治 基于多项目混合荧光免疫反应的分光分析法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080200562A1 (en) * 2005-05-02 2008-08-21 Anp Technologies Polymer Conjugate Enhanced Bioassays
JP2007020565A (ja) * 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
CN101995459A (zh) * 2009-08-26 2011-03-30 刘萍 包被板封闭液
CN102062735A (zh) * 2009-11-18 2011-05-18 江苏迈迪基因生物科技有限公司 急性冠状动脉综合症的生物标志物检测法及诊断试剂盒
CN103743897A (zh) * 2014-02-08 2014-04-23 于方治 基于多项目混合荧光免疫反应的分光分析法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112782404A (zh) * 2020-12-24 2021-05-11 湖南博奥瑞康生物科技有限公司 基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒

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