KR920000057B1 - 특이적으로 결합가능한 물질의 측정 방법 및 시약 - Google Patents

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뵈링거 만하임 게엠베하
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Abstract

내용 없음.

Description

특이적으로 결합가능한 물질의 측정 방법 및 시약
제1도는 본 발명의 방법으로 실행할 수 있는 여러 반응원리를 표시한다.
본 발명은 수용체(receptor) R1과 R2가 서로 결합할 수 있고 R3가 측정될 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 최소한 3개의 수용체 R1, R2및 R3와 한께 샘플 용액을 인큐베이팅(incubating)하고 반응으로 일어나는 응집을 측정하여 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 방법 및 이것에 적당한 시약에 관한 것이다.
특이적 결합 성분과 결합할 수 있고 특별한 질병이나 인체의 건강상태에 대한 파라미터(parameter)로서 이용되는 여러 물질들이 체액(body fluid) 및 조직내에 존재한다. 이것들에는 특히, 호르몬 같은 합텐, 종양 마커(marker) 같은 단백질, 단백질 호르몬 및 비루스 단백질뿐 아니라 항체가 속한다. 또한 약제에 의한 치료를 검사하기 위해, 혈액내 약제를 측정할 필요가 있다. 이러한 물질은 종종 매우 소량으로 존재하므로, 이것을 검출하기위해 면역분석 원리에 따른 방법을 사용한다.
이런 목적에 대해, 여러 가지 종류의 방법이 있다. 여러가지 면역학적 측정방법은 균일(homogeneous) 방법과 불균일(heterogeneous)방법으로 나누어질 수 있다. 불균일 방법의 경우에, 고체상 반응은 라벨링된(labelled) 성분의 결합 부분을 결합되지 않는 부분으로 부터 분리하는데 항상 관여한다. 이런 형태의 방법에서, 라벨링한 것을 양호하게 측정할 수 있지만 이것은 불균일 반응이 장시간 일어나는 불리한 점이 있다.
균일 방법의 경우, 결합된 라벨링한 것이 결합되지 않은 라벨링한 것으로 부터 분리되지 않아서 결합된 라벨링 부분과 결합되지 않은 라벨링 부분의 차이가 다른 방법으로 표시되어야 한다.
이런 것을 위해 여러 가능성이 있다. 그러므로, 예를들어 복합된 효소는 이것이 측정될 항원이나 합텐에 결합될 때 또는 측정될 물질에 의해 활성화될 때 그것의 효소 활성을 나타내는 라벨로서 사용될 수 있다. 또 다른 가능성으로는 라벨로서 형광 물질을 사용하는 것인데, 측정될 물질에 결합시키므로써 이것의 형광이 다른 파장 범위로 변하거나 또는 이것의 편광이 변한다. 이러한 공지방법의 단점은 특히 샘플이 테스트를 방해하는 성분을 함유한다는 사실인데, 이러한 물질의 제거를 위해 샘플의 전처리가 필요하게 된다. 또한, 각 파라미터에 대한 최적화처리가 필요한데, 예를들어 효소는 파라미터에 따라 변형되어야 한다.
또한, 유럽 특허공개 제0,079,962호에 측정될 합텐을 함유하고 있는 용액을 합텐으로 피복된 라텍스(latex) 입자 또는 합텐으로 피복된 알루민과 접촉시키는 방법이 기재되어 있다. 합텐과 결합할 수 있는 항체를 부가하므로써 응집 반응이 일어난다. 샘플내의 합텐은 항체의 결합 부위에 대해 합텐으로 피복된 라텍스 입자나 합텐으로 피복된 알루민과 경쟁한다. 샘플내에 함유된 합텐의 양이 많을수록 응집반응이 적게 일어난다. 이 방법의 단점은 측정될 각 물질에 대해 특정 입자가 이용가능하도록 만들어져야하고 각 파라미터가 각각 최적화되어야다는 사실이다.
응집 반응을 분석평가하여 단백질을 검출하는 또 다른 방법이 독일연방공화국 특허공개 제2,749,956호에 기재되어 있다. 측정될 물질에 대한 항체는 응집할 수 있는 입자에 직접 결합된다. 그러나, 항체의 반응성은 이러한 결합으로 손상된다. 더구나, 이러한 측정방법은 류머티스 인자에 의한 방해에 민감하다.
원래의 물질이 파라미터에 대해 특이적으로 최적화되어야 하는 것이 공지된 모든 경쟁적인 균일 응집 면역분석법의 단점이다. 이러한 모든 테스트의 경우, 최적의 차이 및 최적의 민감성에 대해 상반되는 필요조건이 있는데, 왜냐하면 한편으로 샘플과의 경쟁적인 반응이 상당히 가능하도록 입자형태의 시약의 농도가 제한되고 다른한편 단위 시간당 충분한 신호 변화를 이루기 위해 입자 형태의 시약이 고농도화되고 많이 라벨링되기 때문이다. 이러한 필요조건을 조절하므로써, 샘플의 특정한 전처리에 의해 극복될 수 있는 방해감도 및 민감성이 제한된다.
그러므로, 본 발명의 목적은 상기 언급된 단점을 해결하고 높은 감도와 정확성으로 물질을 검출할 수 있게하는 균일 측정방법을 제공하는 것이다.
그러므로, 본 발명에 따라, 수용체 R1과 R2가 서로 결합가능하고 R3가 측정될 물질과 특이적으로 결합가능한 최소한 3개의 수용제 R1, R2및 R3와 함께 샘플 용액을 인큐베이팅하고 반응으로 일어난 응집을 측정하여 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 방법이 제공되는데, 수용체 R1으로서 특이적 결합쌍의 성분 P와 물질 S의 접합체가 사용되며 물질 S는 측정될 물질에 상응하거나 이것의 유도체이고 측정될 물질의 에피토프(epitope)를 표시하며, 수용체 R2로서 P에 대해 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체가 사용되고, R3로서 최소한 하나의 결합부위가 측정될 물질의 에피토프나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체가 사용된다.
본 발명의 방법은 실제적으로 특이적으로 결합할 수 있는 체액이나 조직 추출물내의 측정될 모든 물질의 측정에 사용될 수 있는데, 저농도의 물질 뿐 아니라 고농도의 물질도 검출할 수 있다. 본 방법의 감도와 정확도는 이미 공지되었던 방법에 비해 향상되었다. 본 발명은 간단한 시약으로 빠르고 정확하게 측정하는 가능성을 제공한다.
본 발명은 특히 특이적으로 결합가능한 1가의 물질을 측정하는데 적당하다. 1가의 물질이라 함은 특이적으로 결합가능한 성분에 대해 단지 하나의 결합 부위를 갖는 물질을 의미한다. 이러한 것의 예로서, 약제같은 합텐이 언급될 수 있다. 특이적으로 결합가능한 성분에 대해 여러개의 결합부위를 갖는 물질, 예를들어 HCG 또는 TSH같은 단백질 호르몬, 항원 및 단백질, CEA 같은 종양 마커, 비루스 단백질 및 항체가 또한 측정될 수 있다.
본원에서, 에피토프는 다른 물질과 특이적 결합을 할 수 있는 결합 부위를 의미한다. 에피토프의 예로는 합텐과 항원상의 항원 결정기 뿐 아니라 단백질상의 특이적 결합 부위가 포함된다.
이것을 위해, 샘플 용액을 3개의 수용체, R1, R2및 R3와 함께 인큐베이팅한다. 수용체 R1과 R2는 서로 결합할수 있고 R3는 측정될 물질과 특이적으로 결합 할 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 실행될 수 있는 여러 반응 원리가 제1도에 표시되어 있다.
방법은 제1도 (a)에 표시된 바와 같이 실행하는 형태이다. 이런 경우, 서로 특이적으로 결합하는 성분 P와 측정될 물질S의 접합체인 수용체 R1및 측정될 물질과 특이적으로 결합가능한 수용체인 R3를 샘플 용액에 부가한다. 용액내에서, R1의 S부분과 측정될 물질은 R3에 대한 결합에 대해 경쟁적이다. 예를들어 R3가 2가의 항체라면, 다음의 복합체가 형성된다.
두개의 파라토프에 R1이 S에 의해 결합된 R3, 두개의 파라토프에 측정될 물질이 결합된 R3및 하나의 파라토프에 측정될 물질이 결합되고 다른 하나의 파라토프에 R1이 S에 의해 결합된 R3. 기타 두개의 수용체와 동시에 또는 일정한 시간후에, P에 대해 최소한 두개, 바람직하게 다수의 결합 부위를 갖는 수용체 R2를 부과한다. 그러므로 수용체 R1이 P에 의해 수용체 R2에 결합하게 된다. 용액에 존재하는 복합체중 R2에 결합된 최소한 하나의 수용체 R1이 결합되어 있는 복합체 및 두개의 수용체 R1이 R2에 결합되어 있는 복합체는 광도계로 검출할 수 있는 혼탁도나 혼탁도 변화를 일으키는 응집을 만들 수 있다. 측정될 물질이 용액내에 더 많이 존재하며 R1이 더 적게 결합되고 응집이 더 적게 일어나면, 혼탁도의 증가폭이 적어진다. 그러므로, 응집 정도는 측정될 물질에 대한 간접적 측정의 척도이다. 이것은 검교정 곡선(calibration curve)으로 분석평가 될 수 있다.
실시방법 b)는 2가의 물질, 예를들어 항체의 검출에 이용된다 이것의 원리는 방법 a)의 경우와 동일하다. 여기서도 역시 R1이 R3의 두개의 결합 부위에 결합된 복합체가 응집을 일으킬 수 있다.
방법 c)의 경우, 측정될 물질과 특이적으로 결합가능한 수용체와 특이적 결합쌍의 성분과의 접합체가 R3로서 사용된다. 샘플 용액을 R1및 R3와 함께 인큐베이팅하는 경우, 측정될 물질과 R1이 R3의 결합 부위에 대해 경쟁한다. 이 경우 수용체 R1이나 또는 측정될 물질의 분자가 R2-3에 결합할 수 있다. R2와 함께 인큐베이팅한 후에, 수용체 R3의 P부분이 R2에 결합한다. 만약 R3의 기타 결합 부위에 측정될 물질이 결합한다면, R2에 의한 가교결합이 불가능하다. 그러나, 접합체 R1이 R3의 기타 결합 부위에 결합한다면, 수용체 R1은 R2의 제2결합 부위에 결합하여 가교결합이 생긴다. 이러한 구체예의 경우에도 또한 R1이 더 적게 결합되고 측정될 물질이 용액내에 더 많이 존재하여, 결과적으로 응집이 더 적게 형성된다.
실시 방법 d)는 실시 방법 a)의 변형 방법이지만, 측정될 물질이나 S각각에 대한 두개의 결합 부위외에 P 형태의 또다른 결합 부위를 갖는 수용체가 수용체 R3로서 사용된다. 샘플 용액을 R1및 R3와 함께 인큐베이팅하는 경우에, 방법 a)의 경우와 같은 복합체가 형성된다. 그러나, 방법 a)와 다르게, 두개의 파라토프에 R1이 결합되어 있는 수용체 R3뿐 아니라 R1이 하나의 파라토프에 결합되고 측정될 물질이 다른 하나의 파라토프에 결합되어 있는 수용체 R3가 응집을 일으킬 수 있다. 그러므로, 이러한 구체예는 고농도 물질의 검출에 특히 적당하다.
그러므로, 본 발명에 따라 정의된 방법 원리에 대해, 그것을 실행하는 여러가지 변형된 방법이 있다. 어떤 경우에, 최소한 3개의 수용체가 필요하다. 측정될 물질은 특이적으로 결합할 수 있는 혹종의 물질, 특히 상기된 바와같은 합텐, 1가, 2가 또는 다가 항원, 항체 또는 단백질일 수 있다.
제1수용체 R1으로서, 특이적 결합쌍의 성분 P 및 측정될 물질이나 이것의 유도체에 해당하고 측정될 물질의 에피토프를 최소한 하나 갖고 있는 물질 S로 구성되는 접합체를 사용한다. 서로 특이적으로 결합가능한 물질이 공지되었다. 사용할 수 있는 결합쌍(P-R2)의 예로는 특히 비오틴-스트렙비단 또는 아비딘; 합텐-항체; 항원-항체; 콘카발린-항체; 당-렉틴; 합텐-결합 단백질, 예를들어 티록신-결합 글로불린 및 티록신 또는 올리고펩티드-항체가 있다. 결합쌍으로서, 스트렙타비딘-또는 아비딘-비오틴이 특히 바람직하게 사용된다. 특히 바람직하게, 수용체 R1은 비오틴을 함유한다.
수용체 R1의 S 부분은 바람직하게 변화하지 않는 측정될 물질에 상응 할수 있다. 이것은 또한 측정될 물질의 유도체나 또는 측정될 물질의 일부분, 예를들어 단백질 에피토프일 수 있다. 중요한 것은 S 부분이 R3와 결합할 수 있다는 것이지만 측정될 물질과 S가 결합력으로 R3에 결합하는 것이 반드시 필요하지 않다.
접합체의 제조는 예를들어 Eur. j. Biochem., 131. 333-333/1980에 기술된 방법과 유사한 공지의 방법으로 실행된다.
본 발명의 방법에 필요한 제2수용체 R2는 P에 대한 최소한 두개의 결합 부위를 가지며 바람직하게 P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합쌍의 성분을 갖는다. 수용체 R2는 반응으로 형성된 복합체의 응집을 일으킨다. 이러한 다수의 특이적 결합쌍의 기타 성분이 반응 시스템내에 존재하므로, 샘플 용액에 원래 존재하는 이러한 성분과 결합할 수 있는 소량의 물질이 방해를 일으키지 않는다. 수용체 R2는 원래 여러개의 결합 부위를 갖는 물질, 예를들어 스트렙타비딘이나 항체일 수 있다.
수용체 R2는 또한 다가일 수 있고 P에 대해 다수의 결합 부위를 가지거나 또는 예를들어 폴리스트렙타비딘과 같은 P에 대해 상보적인 특이적 결합쌍 성분의 중합체일 수 있다. 각각의 성분들은 직접 결합하거나 가교에 의해 서로 결합한다. 이러한 중합체를 제조하는 방법은 공지되었으므로 상세하게 설명할 필요가 없다.
또다른 구체예에서, 수용제 R2는 P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합 성분이 결합되어 있는 담체 물질로 구성된다. 담체 물질로서, 크기가 보통 50-1000nm인 입자를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 물질의 예로는 폴리스티렌, 미분된 이산화규소, 적혈구, 콜로이드상 금-입자 또는 가교결합된 알부민이 포함된다. 특이적 결합성분으로 이들 입자를 피복하는 것을 공지돤 방법에 따라 실행한다. 이런 종류의 방법이 예를들어 유럽 특허 제0,073,611호 및 미합중국 특허 제4,703,018호에 기재되어 있다.
이렇게 피복하거나 중합시킨 수용체 R2가 본 발명의 방법에 일반적으로 사용될 수 있으므로 특이적인 파라미터가 아니다.
수용체 R1이 R2에 대해 하나의 결합부위를 갖는 것, 즉 각각의 수용체 R1이 단지 하나의 R2와 반응하는 것이 본 발명의 방법을 실행하는데 중요하다. 이것이 중요한 전제조건인데 왜냐하면 다른 R2가 수용체 R1에 의해 가교결합할 수 있어서 측정될 물질 S에 기인하지 않은 응집을 일으키기 때문이다.
본 발명에 필수적인 제3성분인 최소한 두개의 결합 부위를 갖는 수용체 R3인데, 이 결합부위중 최소 하나다 측정될 물질의 에피토프나 또는 S의 에피토프와 특이적으로 결합한다. 이 수용체는 측정될 물질에 따라 선택된다. 여러 수용체가 이것에 적당하다. 합텐, 단백질, DNA 또는 당을 측정하기 위해, 상기 물질이나 그것의 단편에 대한 항체나 기타 수용체 예를들어 티록신-결합 글로블린 같은 천연적으로 존재하는 결합 단백질을 사용하는 것이 특히 유리하다. DNA 측정을 위해, 수용체 R3로서 상보적인 DNA를 사용하는 것이 또한 유리하다.
측정될 물질이 R3에 대해 하나의 결합 부위를 가질때, 바람직한 구체예에서, 수용체 R3는 측정될 물질이나 S의 에피토프에 대한 하나의 결합 부위외에 R1에 사용된 성분 P 형태인 특이적 결합쌍의 성분에 대해 다른 결합 부위를 갖는다. R3는 바람직하게 특이적 결합쌍의 성분 P와 측정될 물질이나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 하나의 결합 부위를 갖는 물질과의 접합체, 특히 바람직하게 측정될 물질이나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 Fab-단편과 P와의 접합체 또는 측정될 물질이나 S의 에피토프에 대해 두개의 결합 부위를 갖는 수용체와 특이적 결합쌍의 성분 P와의 접합체이다.
수용체 R3는 또한 측정될 물질이나 S의 에피토프와 결합하는 두개의 동등한 결합 부위를 가질 수 있다. 사용될 수 있는 수용체 R3의 예로는 단클론(monoclonal) 및 다클론(polyclonal) 항체, Fab2-단련 및 특이적 결합쌍의 성분과 Fab-단편과의 접합체가 포함된다. 수용체 R3가 두개 이상의 결합 부위를 갖는다면, 항체, F(ab)2-또는 f(ab′)2-단편과 성분 P와의 접합체가 사용될 수 있다. 측정될 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 비오티닐화된 항체 및 항체 단편이 특히 바람직하다.
또다른 바람직한 구체예에서, 수용체 R3는 측정하는 동안 우선 예를 들어 TBG에 대한 항체 및 2분자의 TBG 또는 Fab-단편에 대한 항체 및 2개의 Fab-단편으로 부터 형성된다.
이 방법은 하나 이상의 단계로 실행될 수 있다. 응집 정도를 측정하므로써 평가한다. 이런 방법들은 공지되어 있다. 그러므로, 예를들어 광도 측정에 의한 혼탁도 측정, 비탁 분석법에 의한 산란광 측정, 입자 카운팅(counting) 또는 광자 관련 분광법(PCS)을 사용할 수 있다.
각 경우에, 각각의 수용체 및 측정될 물질이 단지 이것에 특정된 반응 성분과 특이적으로 결합하므로, 모든 수용체와 샘플을 함께 인큐베이팅 하여 하나의 단계로 이 방법을 실행하는 것이 가능하다. 이것은 특히 하나의 자동분석기로 본 방법을 실행하는 경우에 유리하다.
저농도 또는 고농도의 물질을 검출하기 위해서는, 다단계 방법이 바람직하다. 샘플 용액내에 고농도로 존재하는 물질을 검출하는 경우에, 다음에 기술된 구체예가 바람직하다. 이 경우 수용체 R1을 수용체 R3와 우선 반응시킨다. 이때에 측정될 물질에 상응하는 수용체 R1의 S부분과 R3가 함께 반응한다. 계속해서, 샘플 용액을 여기에 부가한다. 샘플 용액내에 존재하는 측정될 물질은 이미 결합된 수용체 R1과 치환된다. 샘플 용액내 측정될 물질의 양이 많기 때문에, 띠러한 치환 반응이 충분한 속도로 일어나다. 연속해서, 수용체 R2를 부가한 다음 혼탁도 증가를 측정한다. 본 테스트를 실행하는 이러한 방법은 민감성이 더 적지만, 고농도의 샘플에 매우 적합하다.
본 발명에 따른 방법의 또다른 바람직한 구체예는 매우 낮은 농도의 물질을 검출하는데 적당하다. 예로서, 호르몬 및 약제가 언급될 수 있다. 이경우 수용체 R2를 우선 수용체 R3와 미리 혼합하고 연속해서 샘플을 여기에 부가한다. 그러므로 샘플내에 존재하는 측정될 물질이 수용체 R3와 반응한다. 수용체 R2와 결합하게 되는 수용체 R1이 존재하지 않으므로 응집이 일어나지 않을 수 있다. 계속해서, 수용체 R3및 수용체 R2와 결합할 수 있는 수용체 R1을 부가한다. 일정시간이 지난후에, 혼탁도 증가를 측정한다. 이 방법의 감도는 매우 높다.
평균 농도의 파라미터에 대해서는 완전히 경쟁적인 테스트법이 또한 적당하다. 이 경우에, 수용체 R1, 수용체 R3및 샘플 용액을 동시에 인큐베이팅한다. 측정될 물질과 수용체 R1의 접합체에 있는 S부분은 수용체 R3에 대한 결합에 대해 경쟁적이다. 수용체 R2를 부가한 후에, 응집을 측정한다.
본 발명 방법의 이러한 방법은 합텐에 특이적인 단백질과 결합할 수 있는 합텐의 검출에 또한 적당하며, 결합 단백질은 합텐에 대해 단지 하나의 결합 부위를 갖는다. 하나의 예로는 티록신결합성 단백질에 의해 특이적으로 결합하는 티록신이 있다.
모든 방법을 바람직하게 완충 용액내에서 실행한다. 이들 방법에 대한 완충액 시스템이 공지되었다. 이 목적에 특히 바람직한 완충액은 GOOD 완충액 및 인산염 완충액이다.
본 발명에 따라, 간단하게 빠르게 실행할 수 있고 측정될 물질의 농도에 따른 측정 신호를 제공하는 방법이 제공된다. 본 발명에 따라. 면역학적 경쟁을 하는 시스템과 신호발생 시스템이 분리되므로, 검출하는 감도가 증가한다. 간단한 시약을 사용하여 저농도의 합텐을 빠르고 정확하게 정량할 수 있다.
본 발명은 또한 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 시약을 제공하는데, 이것은 측정될 물질에 상응하거나 이것으 유도체이고 측정될 물질의 에피토프를 최소 하나 갖는 물질 S와 특이적 결합쌍의 성분 P와의 접합체인 수용체 R1, P에 대해 최소한 두개의 결합부위를 갖는 R2및 최소 하나의 결합 부위가 측정될 물질이나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 최소한 두개의 결합 부위를 갖는 제1수용체 R3를 함유한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 시약은 물리적으로 서로 분리되는 각각의 수용체 R1, R2과 R3를 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 수용제 R1과 R3를 미리 혼합할 수 있어 이 시약은 R1과 R3의 혼합물 및 물리적으로 분리되는 수용체 R2를 함유한다. 수용체 R2와 R3를 미리 혼합하는 것이 또한 가능하여 시약은 R2와 R3의 혼합물 및 이것으로 부터 물리적으로 분리되는 R1을 함유한다.
본 발명의 시약은 체액 및 조직 추출물내의 여러 파라미터를 측정하는데 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 시약은 부가적으로 완충 물질을 함유하며 특히 바람직하게 이것은 인산염 완충액 또는 GOOD 완충액을 함유한다.
본 발명을 다음 실시예 및 도면에 기초해 설명하였는데 제1도는 본 발명에 따른 방법의 여러가지 바람직한 구체예의 반응 원리를 나타낸다.
설명된 모든 방법에서, 수용체 R2는 P에 대해 두개의 결합 부위를 갖는다. 각 경우에, 수용체 R1으로서, 측정될 물질과 성분 P의 접합체를 사용한다.
제1도 (a)는 수용체 R3에 대해 단지 하나의 결하 부위를 갖는 물질을 검출하는데 적당한 방법을 표시한다.
수용체 R3로서, 측정될 물질에 대해 2가인 수용체를 사용한다. 방법 2b은 예를들어 항체같은 2가의 물질을 측정하는데 사용된다. 수용체 R3로서, 측정될 물질과 특이적으로 결합가능한 2가의 수용체를 사용한다.
방법 1c는 1가지 물질을 검출하는데 적당하다. 수용체 R3로서, 측정될 물질에 대해 하나의 결합 부위를 갖는 수용체와 성분 P와의 접합체를 사용한다.
방법 1d는 1가의 물질을 검출하는데 적당하다. 수용체 R3로서, 측정될 물질에 대해 결합 부위를 갖는 수용체와 성분 P와의 접합체를 사용한다.
[실시예 1]
a) 스트렙타비딘 라텍스의 제조
2mg/ml 농도의 스트렙타비단을 2중량% 농도의 클로로메틸스티렌 입자(라텍스, 0=70nm, 미합중국 특허 제4,703,010호에 해당)와 함께 15mMol/l 이미다졸 완충액(pH 7.5)과 100mMol/l 염화 나트륨내 55℃에서 24시간동안 인큐베이팅시키고 교반하였다. 반응 혼합물을 20,000r.p.m.으로 60분간 원심분리하고 상등액을 제거해 내며 침전물을 0.5%소의 혈청알부민을 함유하는 200mMol/l 글리신 완충액(pH 7.5)에 용해시켰다. 적당하게 희석시켜 1중량%의 스트렙타비딘 라텍스 시약을 제조하였다.
b) 헵탄-비오틴 접 합체의 제조
본 목적을 위해, n-부틸옥시카보닐테트라요오도티로닌과 1-메틸-3-(3′-카복시프로필)크산틴 (독일연방공화국 특허 제2,805,961호 참조)을 Eur. j. Biochem., 131, 333-338/1980에 기재된 바와같이 펜타메틸레니아민에 의해 비오틴과 결합시켰다. T4-비오틴 접합체를 얻었다. 테오필린을 유사한 방법으로 비오틴에 결합시켰다.
[실시예 2]
T4의 측정
2% 폴리에틸렌 글리콜 40000과 합해진 0.1mol/l 인산염 완충제(pH 7.5) 900μl, 샘플(수성의 T4표준물)20μl, T4에 대한 다클론 항체의 0.1mg/ml 용액 20μl, 1% 라텍스 시약(실시예 1 참조) 20μl로 구성되는 시약을 37℃에서 5분간 인큐베이팅시키고 연속해서 10-6mol/l의 농도인 T4와 비오틴의 접합체 20μl를 부가하였다.
혼탁도 증가의 키네틱스(kinetics)을 측정하고 흡광도 변화를 단위 시간(5분)당 405nm에서 측정하였다. 다음의 측정치를 얻었다.
[표 1]
Figure kpo00001
[실시예 3]
테오필린의 측정
100mMol/l 트리스 완충액(pH 7.5) 300μl, 1% 라텍스 시약(실시예 1 참조) 7μl, 테오필린에 대한 다클론 항체(Fab2농도 5mg/ml) 7μl를 혼합하여 시약을 제조하고 37℃에서 5분간 인큐베이팅 시켰다. 연속해서, 5×10-6mol/l의 테오필린과 비오틴의 접합체를 부가하고 흡광도 변화를 4.2분의 시간차로 450nm에서 측정하였다. 결과를 표 2에 표시한다.
[표 2]
Figure kpo00002
[실시예 4]
공지 기술과의 비교
본 발명의 방법을 유럽 특허 제0,073,611호에 기재된 것에 상응하는 방법과 비교하였다. 피복된 “담체”로서, “담체”당 4분자의 T4를 함유하는 스트렙타비딘을 사용하였다.
T4와 비오틴의 접합체(농도 10-4mol/l) 20μl와 20μl의 스트렙타비딘(농도 2.5×10-5mol/l)을 함께 혼합시키고 30분간 인큐베이팅시켜 상기 “담체”를 제조하다. 반응이 완결된 후에, 시약은 비오틴에 의해 스트렙타비딘에 결합된 T4를 함유하였다.
비교 실험의 실행
4% 폴리에틸렌 글리콜 40,000 및 50mMole 인산염 완충액(pH 7.5) 820μl를 상기 기술된 바와같이 제조된 스트렙타비딘 시약 40μl과 함께 혼합시키고 샘플(0mol/l T4)을 거기에 부가하였다. 동시에, T4에 대한 다클론 항체에 대한 3mg/l의 항체 용액 100μl를 부가하고 흡광도 변화를 3분 간격으로 340nm에서 검사하였다.
본 발명의 방법; 방법 A
4% 폴리에틸렌 글리콜 40,000 및 50mMol/l의 인산염 완충액(pH 7.5) 820μl를 T4와 비오틴의 접합체(메탄올내 10-4mol/l 농도) 20μl 및 T4에 대한 다클론 항체(3mg/ml) 100μl와 함께 혼합하고 5분간 인큐베이팅시켰다. 20μl의 스트렙타비딘(농도 2.5×10-5mol/l)을 부가한 후에, 흡광도 변화를 3분 간격으로 340nm에서 검사하였다.
본 발명의 방법; 방법 B
4% 폴리에틸렌 글리콜 40,000 및 50mMol/l 인산염 완충제(pH 7.5) 820μl를 20μl의 스트렙타비딘(2.5×10-5mol/l) 및 200mMol 인산염 완충액(pH 7.5) 및 T4에 대한 다클론 항체(31mg/ml) 10μl와 함께 혼합하고 37℃에서 5분간 인큐베이팅시켰다. T4와 비오틴의 접합체(농도 10-4mol/l)20μl을 부가한 후에, 흡광도 변화를 3분 간격으로 340nm에서 검사하였다.
비교 실험의 결과는 다음과 같다.
비교실험:35mE
본 발명의 방법, 방법A:646 mE
본 발명의 방법, 방법B:414 mE
본 발명에 따른 방법으로써, 동일한 조건하에서 공지 기술에 따른 방법과 비교하여 더 높은 감도를 얻을 수 있음을 알았다.

Claims (21)

  1. 샘플 용액을 최소한 3개의 수용체 R1, R2및 R3(R1과 R2는 서로 결합가능하고 R3는 측정될 물질과 특이적으로 결합가능함)와 함께 인큐베이팅하고 반응으로 일어난 응집을 측정하여 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 방법에 있어서, 수용체 R1으로서, 특이적 결합쌍의 성분 P와 측정될 물질에 상응하거나 이것의 유도체이고 측정될 물질의 에피토프(epitome)를 최소한 하나 갖는 물질 S와의 접합체를 사용하며 수용체 R2로서, P에 대해 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체를 사용하고 수용체 R3서, 최소한 하나의 결합부위가 측정될 물질의 에피토프나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체를 사용하는 것으로 특징되는, 특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법.
  2. 제1항에 있어서, R3로서, 측정될 물질의 에피토프나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 제2결합부위를 갖는 수용체가 사용되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, P에 대한 결합부위를 제2결합부위로 갖는 수용체가 R3로서 사용되어 측정될 물질이 수용체 R3에 대해 단지 하나의 결합부위를 갖는 방법.
  4. 제3항에 있어서, R3와 결합가능한 하나의 에피토프를 갖는 물질이 측정되고 R3로서, 측정될 물질의 에피토프나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 결합부위를 갖는 물질과 특이적 결합쌍의 성분 P와의 접합체가 사용되는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 수용체 R3로서, 측정될 물질의 에피토프나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 Fab-단편과 P와의 접합체가 사용되는 방법.
  6. 제3항에 있어서, R3와 결합가능한 하나의 에피토프를 갖는 물질이 측정되고 R3로서, 측정될 물질의 에피토프나 S의 에피토프에 대해 두개의 결합부위를 갖는 수용체와 특이적 결합쌍의 성분 P와의 접합체가 사용되는 방법.
  7. 전기한 항중 어느 한 항에 있어서, 수용체 R1으로서, 측정될 물질과 P와의 접합체가 사용되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 수용체 R3로서, P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합쌍의 성분들을 갖는 수용체가 사용되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 결합쌍 P-R2로서, 비오틴-스트렙타비딘 또는 아비딘, 비오틴-비오틴 항체, 항원-항체, 결합 단백질-합텐 또는 올리고펩티드-항체가 사용되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 수용체 R2로서, P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합쌍의 성분들이 결합되어 있는 미립자 담체가 사용되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 미립자 담체로서 폴리스티렌구, 미분된 이산화규소, 적혈구, 콜로이드상 금-입자 또는 가교결합된 알부민이 사용되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 수용체 R2로서, P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합쌍의 성분들의 중합체가 사용되는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 수용체 R3로서, 측정될 물질에 대해 특이적인 항체 또는 이것의 F(ab)2-단편이 사용되는 방법.
  14. 측정될 물질에 상응하거나 이것의 유도체이고 측정될 물질의 에피토프를 최소한 하나 갖는 물질 S와 특이적 결합쌍의 성분 P와의 접합체인 수용체 R1, P에 대해 최소한 두개의 결합부위를 갖는 R2및 최소하나의 결합부위가 측정될 물질이나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 최소한 두개의 결합부위를 갖는 수용체 R3를 함유하는 것을 특징으로하는, 제1항의 방법에 따라 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하기 위한 시약.
  15. 제14항에 있어서, 서로 특이적으로 결합하는 쌍의 성분과 측정될 물질과의 접합체, 특이적 결합쌍의 기타 다수의 성분들을 갖는 응집가능한 수용체 및 측정될 물질에 대해 특이적인 수용체를 함유하고 이들이 물리적으로 서로 분리되는 시약.
  16. 제14항에 있어서, 물리적으로 서로 분리되는 수용체 R1, R2및 R3를 함유하는 시약.
  17. 제14항에 있어서, 물리적으로 서로 분리되는 수용체 R1과 R3의 혼합물 및 이것과 물리적으로 분리리는 수용체 R2를 함유하는 시약.
  18. 제14항에 있어서, 수용체 R2와 R3의 혼합물 및 이것과 물리적으로 분리되는 수용체 R1을 함유하는 시약.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 R3로서, 측정될 물질의 에피토프나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 결합부위를 갖는 물질과 특이적 결합쌍의 성분 P와의 접합체를 함유하는 시약.
  20. 제19항에 있어서, 수용체 R3로서, 측정될 물질의 에피토프나 S의 에피토프와 특이적으로 결합하는 Fab-단편과 P와의 접합체를 함유하는 시약.
  21. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R3로서, 측정될 물질으 에피토프나 S의 에피토프에 대해 두개의 결합부위를 갖는 수용체와 특이적 결합쌍의 성분 P와의 접합체를 함유하는 시약.
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