KR920000056B1 - 특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제1도는 본 발명에 따른 방법의 2가지 반응원리를 표시한다.
제2도는 업테이크-테스트에 대한 2가지 반응원리를 표시한다.
제3도는 항-T4항제 테스트에 대한 검량곡선을 표시한다.
제4도는 AFP 측정에 대한 검량곡선을 표시한다.
제5도는 T-업테이크 테스트에 대한 검량곡선을 표시한다.
제6도는 T4의 양을 변화시킴에 의한 T-업테이크 테스트에 대한 검량곡선을 표시한다.
본 발명은 수용체(receptor) T1과 T2가 서로 결합할 수 있고 T1이 측정될 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 최소한 2개의 수용체 R1및 R2와 함께 샘플용액을 인큐베이팅(incubating)하고 반응으로 일어나는 응집을 측정하여 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 방법 및 이것에 적당한 시약에 관한 것이다.
특이적 결합성분과 결합할 수 있고 특별한 질병이나 인체의 건강상태에 대한 파라미터(parameter)로서 이용되는 여러물질들이 체액(body fluid) 및 조직내에 존재한다. 이것들에는 특히, 호르몬같은 합텐, 종양마커(marker)같은 단백질, 단백질 호르몬 및 비루스 단백질뿐 아니라 항체가 속한다. 약제에 의한 치료를 검사하기 위해, 혈액내 약제를 측정할 필요가 있다. 이러한 물질은 종종 매우 소량으로 존재하므로, 이것을 검출하기 위해 면역분석원리에 기초한 방법을 사용한다. 여러가지 종류의 방법이 있다. 여러가지 면역학적 측정방법은 균일(homogeneous)방법과 불균일(heterogeneous)방법으로 나누어질 수 있다. 불균일방법의 경우에, 고체상 반응은 라벨링된(labelled) 성분의 결합부분을 결합되지 않은 부분으로부터 분리하는데 항상 관여한다. 이런 형태의 방법에서, 라벨링한 것을 용이하게 측정할 수 있지만 불균일반응이 장시간 일어나는 불리한 점이 있다.
균일방법의 경우, 결합된 라벨링한 것이 결합되지 않은 라벨링한 것으로부터 분리되지 않아서 결합된 라벨링부분과 결합되지 않은 라벨링부분의 차이가 다른 방법으로 표시되어야 한다.
이것에 대해 여러 가능성이 있다. 예를들어, 효소는 이것이 측정될 항원이나 합텐에 결합될때 또는 측정될 물질에 의해 활성화될때 그것의 효소활성을 나타내는 라벨로서 사용될 수 있다. 또다른 가능성으로는 라벨로서 형광물질을 사용하는 것인데,측정될 물질에 결합시킴에 의해 이것의 형광이 다른 과장범위로 변하거나 또는 이것의 편광이 변한다.
이러한 공지방법의 단점은 특히 샘플이 테스트를 방해하는 성분을 함유한다는것인데, 이러한 물질의 제거를 위해 샘플의 전처리가 필요하게 된다. 또한, 시간이 소요되는 최적화처리가 각 파라미터에 대해 필요한데, 예를들어 효소는 파라미터에 따라 변형되어야 한다.
또한, 유럽 특허공개 제79,692호에 측정될 합텐을 함유하고 있는 용액을 합텐으로 피복된 라텍스(latex)입자 또는 합텐으로 피복된 알루민과 접촉시키는 방법이 기재되어 있다. 합텐과 결합할 수 있는 항체를 부가하므로써 응집반응이 일어난다. 라텍스입자나 알부민에 결합된 합텐이 샘플내 합텐과 경쟁하므로, 샘플내에 함유된 함텐의 양이 더 많을수록 응집반응은 더 작게 일어난다. 이 방법의 단점은 측정될 각 물질에 대해 특별한 입자가 제공되어야 하고 각 파라미터가 각각 최적화되어야 한다는 것이다.
응집반응의 분석평가에 기초하는 또다른 단백질 측정방법이 독일연방공화국 특허공개 제27 49 956호에 기재되어 있다. 이 방법에서, 측정될 물질에 대한 항체가 응집할 수 있는 입자에 직접 결합된다. 그러나, 이러한 결합이 항체의 반응성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 이러한 측정방법은 류머티스 인자에 의한 방해에 민감하다.
공지된 모든 경쟁적인 균일 응집 면역분석법의 단점은 시간이 매우 많이 소요되고 원래 물질이 파리머에 대해 특이적으로 최적화되어야 한다는 것이다. 이러한 모든 테스트에서 최적의 차이 및 최적의 민감성에 대해 상반되는 필요조건이 있는데, 왜냐하면 한편으로 샘플과의 경쟁적인 반응을 촉진하기 위해 입자형태인 시약의 농도가 제한되어야 하고 다른 한편으로 입자형태의 시약이 단위시간당 충분한 신호변화를 이루기 위해 많이 라벨되어야 하고 고농도화되어야 하기 때문이다. 이러한 필요조건을 조절하므로써, 샘플의 특정한 전처리에 의해 제거될 수 있는 방해감도 및 민감성이 제한된다.
그러므로, 본 발명의 목적은 상기 언급된 단점을 갖지 않고 감도와 정확성으로 물질을 검출할 수 있게 하는 균일측정방법을 제공하는 것이다.
수용체 R1과 R2가 서로 결합가능하고 R1이 측정될 물질과 특이적으로 결합가능한 최소한 2개의 수용체 R1및 R2와 함께 샘플용액을 인큐베이팅하고 반응으로 일어난 응집을 측정하여 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 방법에 의해 상기 목적이 성취되는데, 특이적 결합쌍의 하나의 성분 P와 측정될 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 성분 K와의 접합체가 수용체 R1으로서 사용되며 P에 대해 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체가 R2로서 사용된다.
본 발명의 방법은 실제적으로 특이적으로 결합할 수 있는 체액이나 조직추출물내의 측정될 모든 물질의 측정에 적당한데, 저농도의 물질을 검출할 수 있을뿐 아니라 고농도의 물질도 검출할 수 있다. 본 발명의 감도와 정확도는 이미 공지되었던 방법에 비해 향상되었다. 본 발명은 간단한 시약으로 빠르고 정확하게 측정하는 가능성을 제공한다.
본 발명은 특이적으로 결합가능한 1가의 물질 및 특이적으로 결합가능한 2가 또는 다가의 물질을 측정하는데 적당하다. 1가의 물질이라 함은 특이적으로 결합가능한 성분에 대해 단지 하나의 결합부위를 갖는 물질을 의미한다. 이러한 것의 예로서, 약제같은 합텐이 언급될 수 있다. HCG 또는 TSH같은 단백질 호르몬, 항원 및 단백질, CEA같은 종양 마커, 비루스 단백질 및 항체와 같이 특이적으로 결합가능한 성분에 대해 두개이상의 결합부위를 가질때 이 물질은 2가 또는 다가 물질로서 표시된다.
본원에서, 에피토프(epitope)는 다른 물질과 특이적 결합을 할 수 있는 결합부위를 의미한다. 에피토프의 예로는 합텐과 항원상의 항원 결정기뿐 아니라 단백질상의 특이적 결합부위가 있다.
측정하기 위해, 샘플용액을 최소한 2개의 수용체 R1및 R2와 함께 인큐베이팅한다. 수용체 R1과 R2는 서로 결합할 수 있고 R1은 측정될 물질과 특이적으로 결합할 수 있다. 여러가지 반응원리가 본 발명에 따른 방법으로 실행될 수 있다. 제1도에는 2가 물질 또는 다가 물질을 검출하는데 적당한 두개의 방법이 표시되어 있다.
제1도 (a)에 표시된 방법의 형태에서 서로 특이적으로 결합할 수 있는 쌍의 하나의 성분 P와 측정될 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 성분 K와의 접합체인 수용체 R1을 샘플용액에 부가한다. 다음에 수용체 R1은 표시된 도면에서 항체인 성분 K에 의해 측정될 물질에 결합한다. 이 방법에서 각각의 항체상에 2개의 수용체 R1이 K를 통해 결합하여 복합체가 형성된다.
P에 대해 최소한 2개, 바람직하게 다수의 결합부위를 갖는 수용체 R2를 수용체 R1과 동시에 또는 일정한 시간하에 부가한다. 결과로서 수용체 R1이 P에 대해 R2에 결합한다. 각 항체가 2개의 수용체 R1을 가져 결국 R2에 결합할 수 있는 2개의 성분 P를 가지므로, 광도측정으로 검사할 수 있는 혼탁도나 혼탁도의 변화를 일으키는 가교결합 또는 응집이 일어난다. 측정될 항체가 용액내에 더 많이 함유되어 있으면 가교결합도 많아지고 또한 혼탁도의 증가폭도 커진다. 그러므로 응집정도는 측정될 물질에 대한 직접측정의 척도이다. 이것은 검량곡선(calibration curve)으로 분석평가된다.
제1도 (b)에 표시된 방법은 예를들어 다수의 특이적 결합부위를 갖는 단백질같은 다가의 물질을 검출하는데 사용된다. 이것의 원리는 제1도의 (a)에서와 같다. 그러나, 이 경우에 측정될 물질이 2개이상의 수용체 R1과 결합할 수 있으므로, 수용체 R2를 부가한후에 선형의 가교결합뿐 아니라 입체적인 가교결합이 일어날 수 있다. 이 경우에도 응집정도가 측정될 물질에 대한 직접측정의 척도이므로 분석평가하는데 검량곡선을 이용한다.
본 발명의 방법은 소위 업테이크-테스트(uptake-test)를 행하는데 적당하다. 이것에 대해 최소한 또 하나의 수용체 R3및 필요한 경우 수용체 R4를 사용한다. 두개의 방법이 제2도에 표시되어 있다. 바람직한 형태의 방법이 제2도 (a)에 표시되어 있다. 여기서, 티록신 결합능력, 즉 TBG(티록신 결합 글로불린)에 의해 이용가능하게 만들어진 유리(Free)결합부위의 수를 측정하는데 하나의 방법이 사용된다. 이것에 대해, 티록신과 비오틴의 접합체인 수용체 R1및 항-T4항체인 수용체 R3를 샘플용액에 부가한다. 이 방법에서 티록신에 대한 유리결합부위를 갖는 샘플용액내 TBG는 수용체 R1에 함유되어 있는 티록신에 대한 결합에 대해 수용체 R3와 경쟁한다. 수용체 R1및 R3와 동시에 또는 인큐베이팅후에 스트렙타비딘인 R2를 부가한다. 수용체 R1과 함께 수용체 R3또는 TBG로부터 형성된 모든 복합체가 스트렙타비딘에 결합할 수 있다. 그러나 가교결합은 단지 2개의 수용체 R2가 수용체 R3에 결합되어 있는 복합체에 의해 일어날 수 있다. 유리결합부위를 갖는 TBG가 샘플용액내에 더 많이 존재하면 더 많은 수용체 R1이 TBG와 결합하고 가교결합이나 응집의 정도 및 혼탁도의 증가정도가 더 적어진다. 그러므로 혼탁도의 증가정도는 티록신에 대한 유리결합부위의 함량을 간접적으로 측정하는 척도이다. 검량곡선을 이용해 평가할 수 있다.
업테이크-테스트의 변형방법이 제2도 (b)에 표시되어 있다. 여기서 제2도 (a)에서 사용된 3개의 수용체외에, 티록신인 또다른 수용체 R4를 사용한다. 수용체 R1, R3및 R4를 부가한후에, 유리결합부위를 갖는 TBG는 수용체 R1과 R4에 대한 결합에 대해 수용체 R3와 경쟁한다. 수용체 R1이 결합되어 있는 복합체는 수용체 R2를 부가한후에 R2와 결합할 수 있다. 수용체 R3와 2개의 수용체 R1과의 복합체는 수용체 R2를 부가한후에 가교결합할 수 있고 연속해서 혼탁도가 증가할 수 있다. 유리결합부위를 갖는 TBG가 샘플용액에 더 많이 존재하면 수용체 R1이 TBG에 더 많이 결합한다. 이러한 TBG와 수용체 R1의 복합체는 가교결합을 만들 수 없으므로 가교결합의 정도가 감소하고 결과적으로 혼탁도의 증가정도가 감소한다. 이런 경우에 혼탁도의 증가정도는 샘플용액내에 존재하는 유리결합부위를 갖는 TBG를 간접적으로 측정하는 척도이다.
그러므로 본 발명에 정의된 방법을 실행하는 여러 변형방법이 있다. 각 경우에 최소한 2종류의 수용체가 필요하다. 측정될 물질은 특이적으로 결합할 수 있는 혹종의 물질일 수 있고 특히, 상기 정의된 바와 같은 2가 또는 다가 항원, 항체 또는 단백질일 수 있다.
제1수용체 R1으로서, 특이적 결합쌍의 성분 P 및 측정될 물질에 특이적으로 결합가능한 성분 K로 구성되는 결합체를 사용한다. 서로 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되었다. 적당한 결합쌍(P-R2)은 특히 비오틴-스트렙타비딘 또는 아비딘; 합텐-항체; 항원-항체; 콘카나발린-항체; 당-렉틴;합텐-결합 단백질, 즉 티록신결합 글로불린 및 티록신-항체 또는올리고펩티드-항체이다.
스트렙타비딘이나 아비딘과 비오틴이 결합쌍으로서 특히 바람직하므로 수용체 R1이 비오틴을 함유하는 것이 특히 바람직하다.
수용체 R1의 성분 K는 측정될 물질과 결합할 수 있다. 성분 K는 측정될 물질에 따라 선택된다. 여러가지 수용체가 이것에 적당하다. 합텐, 단백질, DNA 또는 당을 측정하기 위해, 이들 물질 또는 이것의 단편에 대한 항체나 기타 수용체 예를들어 티록신결합 글로불린처럼 천연적으로 존재하는 결합 단백질을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 성분 K로서 Fab-단편을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 항체 측정을 위해, 성분 K는 바람직하게 항체와 결합할 수 있는 에피토프를 갖는 물질 또는 합텐이다.
본 발명의 방법에 필요한 제2수용체 R2는 P에 대한 최소한 2개의 결합부위를 가지며 바람직하게 P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합쌍의 성분을 갖는다. 수용체 R2는 반응동안에 형성된 복합체의 응집을 일으킨다. 다수의 특이적 결합쌍의 기타 성분이 반응시스템내에 존재하기 때문에, 이러한 성분과 결합할 수 있는 샘플용액내에 원래 존재하는 소량의 물질이 방해가 되지 않는다. 수용체 R2는 예를들어 스트렙타비딘이나 항체와 같이 P에 대한 여러개의 결합부위를 원래 갖고 있는 물질일 수 있다. 수용체 R2는 다가일 수 있고 P에 대해 다수의 결합부위를 갖거나 또는 폴리스트렙타비딘과 같은 P에 대해 상보적인 특이적 결합쌍성분의 중합체일 수 있다. 이와 관련하여, 각각의 성분들은 서로 직접 결합하거나 또는 가교에 의해 함께 결합한다. 이러한 중합체의 제조방법이 당 업자에게 공지되었으므로 더 설명할 필요가 없다.
또다른 구체예에서 수용체 R2는 P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합성분이 결합되어 있는 담체물질로 구성된다. 크기가 보통 50-1000nm인 입자를 담체물질로서 사용할 수 있다. 적당한 물질은 폴리스티렌, 미분된 이산화규소, 적혈구 또는 가교결합된 알부민이다. 이러한 입자를 특이적 결합성분으로 피복하는 것은 당 업자에게 공지된 방법으로 실행된다. 이러한 방법들이 예를들어 유럽 특허 제73 611호 및 미합중국 특허 제4 703 018호에 기재되어 있다.
이런식으로 중합되거나 피복된 수용체 R2는 본 발명의 방법에 일반적으로 사용될 수 있으므로 특이적인 파라미터가 아니다.
본 발명의 방법을 실행하기 위해, 수용체 R1이 R2에 대해 단지 하나의 결합부위를 갖는 것 즉, 각각의 수용체 R1이 단지 하나의 R2와 반응할 수 있는 것이 중요하다. 다른 R2가 단지 수용체 R1에 의해 가교결합할 수 있어 측정될 물질에 의한 것이 아닌 응집이 결과되므로 상기의 조건은 필수적인 전제조건이다.
본 발명의 방법이 업테이크-테스트를 행하는데 이용될때, 측정될 물질의 최소한 두개의 에피토프를 가지며 R1에 결합할 수 있는 또 다른 수용체 R2가 사용된다. 그러므로 수용체 R3의 에피토프는 R1의 성분 K와 결합하게 하는 측정될 물질의 에피토프에 상응한다. 성분 K에 대한 결합부위를 갖는 Fab2-단편 또는 항체를 바람직하게 수용체 R3로서 사용한다. 상기 방법을 행할때 수용체 R3는 R1에 결합하는 것에 대해 샘플과 경쟁한다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 변형방법에서 수용체 R3외에 수용체 R4를 사용한다. 이러한 방법에서 수용체 R4는 수용체 R1의 성분 K이다. 이 방법을 행할때 수용체 R3와 샘플은 수용체 R1과 수용체 R4에 결합하는 것에 대해 경쟁한다.
상기 방법은 하나 이상의 단계로 실행될 수 있다. 응집정도를 측정하므로써 평가한다. 이러한 측정방법이 공지되었다. 예를들어 광도측정에 의한 혼탁도측정, 비탁분석법에 의한 산란광측정, 입자카운팅(counting) 또는 광자관련 분광법(PCS)가 적당하다.
각각의 수용체 및 측정될 물질이 단지 그것의 특별한 반응성분과 특이적으로 반응할 수 있으므로, 모든 수용체와 샘플을 함께 인큐베이팅하여 하나의 단계로 상기 방법을 실행하는 것이 가능하다. 이것은 특히 하나의 자동분석기로 이 방법을 실행할때 유리하다.
본 방법의 모든 방법을 바람직하게 완충용액내에서 실행한다. 이러한 방법들에 대한 완충액시스템이 공지되었다. 특히 GOOD-완충액 및 인산염 완충액이 이것에 적당하다.
본 발명에 따라, 실행하기에 빠르고 간단하며 측정될 물질의 농도에 따라 측정하는 방법이 제공된다. 본 발명에 따라 면역학적 경쟁을 하는 시스템과 신호발생시스템이 분리되므로, 검출의 감도가 증가한다. 이 방법에서 저농도의 물질을 간단한 시약으로 빠르고 정확하게 정량할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예는 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하기 위한 시약인데, 이것은 특이적 결합쌍의 하나의 성분과 측정될 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 성분 K와의 접합체인 수용체 R1, 및 P에 대해 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체 R2를 함유한다.
본 발명의 시약은 각각의 수용체 R1및 R2및 필요하다면 R3및 R4를 미리 혼합한 형태 또는 물리적으로 서로 분리되는 형태로 함유할 수 있다.
이러한 시약은 체액 및 조직추출물내의 여러 파라미터를 측정하는데 적당하다.
바람직한 구체예에서 시약은 부가적으로 완충물질을 함유한다. 이것이 인산염 완충액 또는 GOOD-완충액을 함유하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 도면과 다음 실시예로 설명된다.
제1도는 본 발명에 따른 방법의 2가지 반응원리를 표시한다.
제2도는 업테이크-테스트에 대한 2가지 반응원리를 표시한다.
표시된 모든 변형방법에서 P에 대해 4개의 결합부위를 갖는 수용체 R2로서 스트렙타비딘을 사용한다. 각 경우에 측정될 물질에 특이적으로 결합가능한 수용체와 비오틴과의 접합체를 수용체 R1으로서 사용한다.
제1도 (a)는 항체의 검출에 적당한 변형방법을 표시한다. 이것에 대해, 수용체 R1은 측정될 항체와 결합할 수 있는 에피토프를 함유한다.
제1도 (b)는 다가의 물질, 예를들어 단백질을 측정하는데 사용될 수 있다.
제2도 (a)는 티록신에 대한 업테이크-테스트를 행하는 변형방법을 표시한다. 이 경우, 상기 수용체 R1및 R2외에 항체 항-T4항체인 수용체 R3를 사용한다.
제2도 (b)는 수용체 R1, R2외에 티록신이 수용체 R4로서 사용되는, 업테이크-테스트를 행하는 또 다른 방법이다.
제3도는 항-T4-항체 테스트에 대한 검량곡선을 표시한다.
제4도는 AFP 측정에 대한 검량곡선을 표시한다.
제5도는 T-업테이크 테스트(제2도 (a)와 유사한 원리)에 대한 검량곡선을 표시한다.
제6도는 T4의 양을 변화시킴에 의한 T-업테이크 테스트(제2도 (b)와 유사한 원리)에 대한 검량곡선을 표시한다.
[실시예 1]
a) 스트렙타비딘-라텍스의 제조
15mmol/ℓ 이미다졸 완충액(pH 7.5), 100mmol/ℓ NaCl내 2mg/ml 농도의 스트렙타비딘을 55℃에서 24시간동안 2중량% 농도의 클로로메틸스티렌 입자(라텍스, d=70mm, 미합중국 특허 제4 703 018호에 해당)와 함께 인큐베이팅시키고 교반하였다. 반응혼합물을 2000r.p.m에서 60분간 원심분리한후에 상등액을 제거해내고 침전물을 0.5% 소의 혈청 알부민을 함유하는 200mmol/ℓ 글리신 완충액(pH 7.5)에 재현탁시켰다. 적당하게 희석시켜 1중량%의 스트렙타비딘-라텍스 시약을 제조하였다.
b) 합텐-비오틴 접합체의 제조
이것을 위해, n-부틸옥시카보닐테트라요오드티로닌(DE-A 제28 05 961호)을 Eur. J. Biochem. 131(1980) 333-338에 기재된 바와 같이 펜타메틸렌디아민에 의해 비오틴과 결합시켰다. T4-비오틴 접합체를 얻었다.
[실시예 2]
T4에 대한 항체의 측정
부가적으로 0.1%의 비특이적인 양(sheep)의 면역글로불린(IgG)을 함유하는 생리적 식염수내 T4에 대한 다클론 항체를 샘플로서 사용하였다.
측정방법:
20μl의 샘플과 960μl의 시약 1을 37℃에서 5분간 인큐베이팅하였다. 20μl의 시약 2을 부가하여 응집반응을 개시시킨후에 단위시간당 광학밀도의 변화를 광도계로 405nm에서 측정하였다. 결과를 제3도에 표시하였다.
[실시예 3]
AFP(α-포에토프로테인)의 측정
a) 항-AFP 항체의 Fab-단편과 비오틴의 접합체(항-AFP-Fab-비오틴) 제조 AFP에 대한 다클론항체를 면역수착법(immunosorption)으로 정제하고 Analyt. Biochem. 161(1987) 262-271 또는 Analyt. Biochem. 149(1985) 529-536에 따라 비오틴에 결합시켰다.
b) 테스트방법
시약 1:
사람의 혈청내 AFP흘 샘플로서 사용하였다.
50μl의 샘플과 900μl의 시약 1을 37℃에서 5분간 인큐베이팅하였다. 20μl의 시약 2를 부가하여 응집반응을 개시시킨후에 단위시간당 광학밀도의 변화를 광도계로 405nm에서 측정하였다. 결과를 제4도에 표시한다.
[실시예 4]
T-업테이크 테스트(제2도 (a)에 따른 반응원리)
테스트의 원리는 항-T4항체와 T4-비오틴 접합체가 샘플내 TBG(티록신 결합 글로불린)에 대해 경쟁하는 것이다.
측정방법:
시약 1:
생리적 식염수(A)와 생리적 식염수내 100g/ml TBG(B)를 샘플로서 사용하였다.
20μl의 샘플과 960μl의 시약 1을 37℃에서 5분간 인큐베이팅하였다. 20μl이 시약 2를 부가하여 응집반응을 개시시킨후에 단위시간당 광학밀도의 변화를 광도계로 405nm에서 측정하였다. 결과를 제5도에 표시한다.
[실시예 5]
T-업테이크 테스트(제2도 (b)에 따른 반응원리)
과량의 TBG를 포화시키기 위해 T4를 샘플에 부가하여 측정을 행하였다. 그후에 결합되지 않은 T4를 측정하였다. 이것에 의해, 티록신 결합 지수(TBI)에 정비례하는 검량곡선을 얻었다.
규정된 티록신 결합 지수(TBI) 특정치를 갖는 사람의 혈청을 샘플로서 사용하였다(샘플 A:0.19 TBI, 샘플 B:1.64 TBI).
측정방법:
20μl의 샘플 및 20μl의 시약 1 및 900μl의 시약 2을 37℃에서 5분간 인큐베이팅하였다. 20μl의 시약 3을 부가하여 응집반응을 개시시킨후에 단위시간당 광학밀도의 변화를 광도계로 405nm에서 측정하였다. 결과를 제6도에 표시한다.
Claims (15)
- 샘플용액을 최소한 2개의 수용체 R1및 R2(R1과 R2가 서로 결합할 수 있고 R1이 정량될 물질에 특이적으로 결합할 수 있음)와 함께 인큐베이팅하고 반응으로 일어난 응집을 측정하여 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 방법에 있어서, 특이적 결합쌍의 하나의 성분 P와 측정될 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 성분 K와의 접합체를 수용체 R1으로서 사용하고 P에 대해 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체를 수용체 R2로서 사용하는 것으로 특징되는, 특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법.
- 제1항에 있어서, R1에 결합할 수 있는 최소한 2개의 에피토프를 갖는 물질이 측정되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합쌍의 성분을 갖는 수용체가 수용체 R2로서 사용되는 방법.
- 제1항에 있어서, 특이적 결합쌍 P-R2로서 비오틴-스트렙타비딘 또는 아비딘, 비오틴-비오틴 항체, 항원-항체, 합텐-결합 단백질 또는 올리고펩티드-항체가 사용되는 방법.
- 제1항에 있어서, P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합쌍의 성분이 결합되어 있는 미립자 담체가 수용체 R2로서 사용되는 방법.
- 제5항에 있어서, 폴리스티렌구, 미분된 이산화규소, 적혈구, 또는 가교결합된 알부민이 미립자 담체로서 사용되는 방법.
- 제1항에 있어서, P에 대해 상보적인 다수의 특이적 결합쌍의 성분들의 중합체가 수용체 R2로서 사용되는 방법.
- 제1항에 있어서, 특이적 결합쌍의 성분 P와 측정될 물질에 대해 특이적인 항체의 Fab-단편과의 접합체가 수용체 R1으로서 사용되는 방법.
- 제1항에 있어서, 측정될 물질의 에피토프를 최소한 2개 가지며 R1에 결합할 수 있는 수용체 R3가 부가적으로 사용되는 방법.
- 제9항에 있어서, 수용체 R1의 성분 K에 결합할 수 있는 항체 또는 그것의 Fab2-단편이 수용체 R3로서 사용되는 방법.
- 제1항에 있어서, 수용체 R1의 성분 K에 상응하는 R4가 부가적으로 사용되는 방법.
- 특이적 결합쌍의 하나의 성분 P와 측정될 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 성분 K와의 접합체인 수용체 R1, 및 P에 대해 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체 R2를 함유하는 것을 특징으로 하는, 제1항의 방법에 따라 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하기 위한 시약.
- 제12항에 있어서, 물리적으로 서로 분리되는 수용체 R1과 R2를 함유하는 시약.
- 제12항에 있어서, 측정될 물질의 에피토프에 상응하며 성분 K에 결합할 수 있는 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체 R3를 부가적으로 함유하는 시약.
- 제12항에 있어서, 성분 K에 상응하는 수용체 R4를 부가적으로 함유하는 시약.
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