JP3833358B2 - 被検体の亜集団の測定のための均一検出方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サンプル液中に存在する粒子担体物質上に固定化され被検体に対する特異的結合能を有する第１受容体に結合させ、第２被検体特異的受容体と共に凝集させることによりサンプル液中の被検体を測定する方法、およびそのような方法を実施するための新規試薬の組み合わせに関する。この方法は、被検体の亜集団の定性的および／または定量的測定に特に適する。
【０００２】
【従来の技術】
凝集の原理に基づく免疫学的検出方法については、かなり前から公知である。これらの方法では、測定すべき被検体と、被検体に対する受容体または結合相手とを、該反応相手の凝集が生じる条件下で混合する。免疫反応により生じた凝集により粒子凝集体が生成するが、その光散乱特性は出発物質のものと異なるため、被検体濃度の測定が可能となる。
【０００３】
測定すべき被検体に対するいくつかの受容体を免疫検出方法で使用することも公知である。例えば、ドイツ特許出願公開明細書第36 33 497号は、少なくとも２つの抗体結合部位を有する抗原物質の免疫測定方法を記載しており、この方法では、この物質を含有する液体サンプルを、固定化された未標識の第１特異的抗体および第２特異的標識抗体と順次または１工程でインキュベーションして、検出すべき物質とその２つの抗体との検出可能な固相結合三重複合体を形成させる。第１の測定で全測定範囲にわたり抗原濃度を測定し、ついで該サンプルを第２測定に付す。
【０００４】
米国特許発明明細書第 4,595,661号に記載されているサンドイッチおよびネフェロ免疫学的試験は、フック効果を抑制するために、免疫学的試験で通常存在する非常に特異的な抗体だけでなく、被検体に対してより低い親和性を有するさらに少なくとも１つの抗体を含有する。
【０００５】
欧州特許出願公開明細書第 0 572 845号は、第１固定化特異的結合相手と、直接的または間接的に標識を保持する第２特異的結合相手とを用いるサンプル中の被検体の免疫化学的測定方法を開示しており、この方法では、検出すべき被検体に対する複数の結合可能部位を有し、固定化特異的結合相手に対する親和性を有さず、標識されていない結合因子をさらに加える。
【０００６】
ドイツ特許出願公開明細書第43 09 393.0号は、粒子担体物質上に固定化されている第１被検体特異的受容体と、被検体に対する少なくとも２つの結合部位を有する第２可溶性被検体特異的受容体とを用いる被検体の測定方法を開示している。
【０００７】
日本国未審査特許出願公開第4-344465号、第1-301165号および第59-92353号も、いくつかの被検体特異的受容体を免疫学的検出方法で使用することを開示している。
【０００８】
しかしながら、前記方法はいずれも、被検体の亜集団の均一検出方法（例、糖タンパク質中の特定の炭水化物構造の存在の定量的測定）としては不適当である。公知の均一イムノアッセイはいずれも、被検体の全量を測定するよう機能するにすぎない。すなわち、測定する必要があると考えられる被検体の亜集団をサンプル調製工程で単離し、ついで実際の試験で測定するのである。しかしながら、そのような方法は長時間かかる上、例えば、測定すべき亜集団が単離中に失われることにより誤差が生じることがある。これらの不利な点を避けるため、不均一イムノアッセイは、現在のところ、結合／遊離分離により行わなければならないが、このために、均一イムノアッセイと比べて相当複雑になってしまう。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、最新技術の不利な点が少なくとも部分的に除かれている、被検体の亜集団の新規測定方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この目的は、サンプル液中の被検体の測定方法であって、該サンプル液を（ａ）該被検体上に１個だけ存在する第１エピトープに結合する、粒子担体物質上に固定化されている第１受容体、および（ｂ）該被検体上の第２エピトープに結合する、該第２エピトープに対する少なくとも２つの結合部位を有する第２受容体と共にインキュベーションすることを含んでなり、該第１エピトープが該第２エピトープと異なっており、両受容体に対する結合により該被検体を測定することを特徴とする方法により達成される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、測定すべき被検体（例、高分子）上に１個しか存在しないエピトープに対する第１受容体が、粒子担体物質の表面に結合するという概念に基づく。固定化第１受容体を被検体へ加えると、それは粒子担体物質に結合する。しかしながら、第１受容体により認識されるエピトープは被検体上に１個しか存在しないため、架橋は生じない。被検体上の別の特異的構造を認識し所望により数個存在していてもよくこの構造に対する少なくとも２つの結合部位を有する第２受容体を加えると、担体物質の粒子がこの第２受容体により架橋される。検出すべき被検体の１つの亜集団内にのみ存在する構造を認識する第２受容体を選べば、特異的に認識されるべき構造を有する被検体のその部分についてのみ架橋が生じる。架橋の程度および速度は、この被検体亜集団の濃度に依存する。これらの濃度の測定は、例えば、適当な波長での吸光度の増加により分光光度的に行うことができる。このように、結合／遊離分離または単離工程を要することなく、被検体の亜集団を非常に簡単に検出することが可能である。
【００１２】
反応相手を加える順序は重要ではない。すなわち、まずサンプルと第１固定化受容体とを混合し、ついで第２受容体を加えてもよいし、あるいは、両方の受容体を同時にサンプルへ加えてもよい。
【００１３】
本発明方法では、それぞれが異なるエピトープ（すなわち、被検体上の表面構造）を認識し、好ましくは、高い親和性でこれらに結合する２つの被検体特異的受容体を用いる。測定を可能にする試験条件下で被検体に十分に強く結合する、結合能を有するすべての物質が、本発明方法で考慮される。
【００１４】
第１受容体を粒子担体物質上に固定化する。適当な粒子担体物質としては、例えば、ラテックス粒子、無機物質（例、金属、金属酸化物、炭素粒子）、リポソーム、細胞（例、細菌細胞）などが挙げられる。そのような担体物質上に受容体を固定化することや、得られた結合体を凝集試験で使用することは、最新技術から公知である。ラテックス粒子が、特に好ましい粒子担体物質である。
【００１５】
第１受容体としては、被検体上に１個だけ存在するエピトープと反応しうる、結合能を有するすべての物質が適当であり、例えば、抗体、その断片および誘導体、レクチン、アプタマー（aptamer）、膜受容体などが挙げられる。第１固定化受容体の特に好ましい具体例としては、モノクローナル抗体、単一特異性ポリクローナル抗体および／または該抗体の断片が挙げられる。そのような抗体は、例えば、ペプチド配列などの被検体表面上に１個だけ存在する前もって決定されている構造を含有する免疫原を用いることにより製造することができる。適当な抗体は、例えば、唾液アミラーゼ（米国特許発明明細書第 4,939,082号）、クレアチンキナーゼＭＢ（WO94/25617）、濾胞刺激ホルモン（欧州特許第 86 102 589.8号）、黄体形成ホルモン（米国特許発明明細書第 5,248,593号）およびヒトコリオゴナドトロピン（Boehringer Mannheim, Cat. No. 1200933）に対するモノクローナル抗体である。第１受容体のさらに好ましい具体例は、被検体上に１個だけ存在する炭水化物構造を認識するレクチンである。
【００１６】
凝集で作用する第２受容体としては、被検体上に存在する第２エピトープに対する少なくとも２つの結合部位を有する、結合能を有するすべての物質（前記を参照されたし）が考慮され、このエピトープは、好ましくは、被検体の一部または亜集団上にのみ見いだされる。一本鎖抗体、アプタマー、膜受容体などの単一結合部位のみを有する物質は、二量化または重合により適当な第２受容体に変換することができる。第２受容体の具体例としては、とりわけ、特定のタンパク質のリン酸化部分の測定のためのホスホチロシン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンに対するモノクローナル抗体；血清アルブミン、ヘモグロビンなどの非酵素的グリケーション化タンパク質の測定のための適当な特異性を有するレクチンコンカナバリンＡまたはモノクローナル抗体；アシアロ糖タンパク質の測定のための適用例で記載するレクチンＲＣＡ１２０およびシアル酸化糖タンパク質の測定のためのＳＮＡが挙げられる。異なる構造を有する糖タンパク質を検出するために、それらの特異性に応じて、さらに多数のレクチンを同様に使用することができる。
【００１７】
第２受容体は、好ましくは、可溶性で未固定化形態であり、被検体の亜集団に対して特異的である。すなわち、第２受容体は、第１受容体に結合することにより粒子担体物質上に固定化されている１つの特定の形態の被検体のみを認識し、一方、他の形態の固定化被検体は認識されない。
【００１８】
抗体およびレクチンを受容体の組み合わせとして使用する場合、場合によっては、抗体上に存在する炭水化物を修飾して、レクチンに対するその結合能を破壊するのが有用かもしれない。これは、例えば、過ヨウ素酸塩で酸化し、ついで酸化中に生成したアルデヒド基をエタノールアミンで処理して不活性化することにより達成することができる。
【００１９】
本発明方法の好ましい具体例については、添付図面の図１でより詳しく説明する。この方法では、モノクローナル抗体Ｒ１でコーティングされたラテックス粒子（Ｌｘ）を、測定すべき被検体を含有するサンプルと混合する。測定すべき被検体は、被検体全量のｎ％およびｍ（＝１００−ｎ）％の比率の集団で存在する少なくとも２つの亜集団（Ａ１およびＡ２）の混合物として存在する。被検体の両亜集団は、ラテックス粒子に結合する。架橋は生じない。
【００２０】
つぎの反応工程では、被検体の亜集団Ａ２に特異的な第２可溶性受容体Ｒ２を加える。Ｒ２の添加により、ラテックス粒子の架橋が生じ、その結果、測定媒体の光学的性質が変化する。被検体の亜集団Ａ２の濃度は、この変化の速度および／または程度により測定することができる。
【００２１】
被検体は、好ましくは、散乱光の強度を測定することにより（ネフェロ分析）、または媒体中を通過する光の強度の喪失を測定することにより（タービジメトリー）測定する。
【００２２】
測定すべき被検体または測定すべき被検体亜集団の濃度は、測定媒体中の光学的吸光度の増加に比例する。好ましくは、得られた結果を定量するために、検量線を作成する。このためには、好ましくは、測定すべき被検体または測定すべき被検体亜集団の含有量が判明しているサンプルを測定する。測定すべき未知サンプル中の被検体または被検体亜集団の含量は、凝集率を測定した後、検量線から読み取る。
【００２３】
測定すべき被検体がタンパク質の場合、使用する第２受容体としては、このタンパク質の１つの亜集団に特異的であり、この亜集団は、二次的修飾の有無により、該タンパク質の残りの亜集団と異なっているものを使用することができる。そのような二次的修飾は、例えば、グリコシル化、ある型のグリコシル化、例えば、ある炭水化物の部分構造（例、シアル酸残基）の存在、リン酸化または硫酸化であってもよい。
【００２４】
本発明方法により測定しうる被検体亜集団の一例は、アポリポタンパク質Ｂのアシアロ形態などのリポタンパク質のある種のグリコシル化形態である。この場合、１個だけ見いだされる表面構造に特異的な第１受容体としてはリポタンパク質に対する抗体を、第２受容体としては、例えば、トウゴマ（Ricinus communis）からのレクチンＲＣＡ１２０などのレクチンなどを使用することができる。シアロアポリポタンパク質Ｂの測定のためには、サンブーカス・ニグラ（Sambucus nigra）からのレクチンＳＮＡを同様に使用することができる。
【００２５】
さらに、本発明方法の適用の具体例は、例えばグリコシル化、リン酸化、硫酸化、ファルネシルまたはミリストイル残基などの脂質残基の存在、補欠分子族の存在などの二次的修飾を有するタンパク質亜集団の検出、または不完全に合成されたタンパク質の検出である。この場合、第１受容体として、それぞれのタンパク質に対する特異的抗体を使用することができ、第２受容体として、ある炭水化物基に対するレクチンまたは例えばホスホチロシンに特異的なさらなる抗体を使用することができる。
【００２６】
本発明方法の具体的な適用は、アルコール症者の血清中の非グリコシル化トランスフェリンの検出である。この場合、１個だけ見いだされるトランスフェリン上の表面構造を認識する抗体を、第１受容体として使用する。架橋には、すなわち第２受容体としては、グリコシル化により通常隠される該タンパク質の表面構造に結合する抗体を使用する。通常グリコシル化されているトランスフェリンは、この第２受容体には認識されない。なぜなら、グリコシル化は該抗体に対する結合を妨げるからである。
【００２７】
本発明のさらなる主題は、本発明方法を実施するための試薬キットであって、（ａ）測定すべき被検体上に１個だけ存在するエピトープに結合する、粒子担体物質上に固定化されている第１受容体、
（ｂ）第１エピトープとは異なる被検体上の第２エピトープに結合する、該第２エピトープに対する少なくとも２つの結合部位を有する第２受容体、および
（ｃ）所望により適当な緩衝液
を含んでなる試薬キットである。
【００２８】
以下、実施例により、本発明をさらに説明することとする。
【００２９】
【実施例】
実施例１
アシアロおよびシアロアポリポタンパク質Ｂの測定
１.１ 試薬
第１受容体の調製では、ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ'(３−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド）を用いる標準的方法により、直径２８２nmのカルボキシ活性化ラテックス粒子１０mgをモノクローナルマウス抗アポリポタンパク質ＢＩｇＧ（Boehringer Mannheim, Cat. No. 1484 273）に結合させた。該抗体上に存在する炭水化物基を酸化するために、該ラテックス懸濁液を１０mM過ヨウ素酸ナトリウムで室温で２０分間処理した（MarshallおよびNeuberger Structural analysis of the carbohydrate groups of glycoproteins: periodate oxidation methods: Gottschalk, A.編, Glycoproteins 2nd ed., Amsterdam, Elsevier, 1972, Part A, pp.331-341と比較されたし）。ついで、該懸濁液を５０mMトリス緩衝液（pＨ９）中の１％エタノールアミンで５分間処理して、該酸化中に生成したアルデヒド基を不活性化した。該処理後、該ラテックスを遠心分離し、保存緩衝液中に取った。
【００３０】
第２受容体としては、トウゴマ（Ricinus communis）からのレクチンＲＣＡ１２０（Boehringer Mannheim, order no. 0223719）およびサンブーカス・ニグラ（Sambucus nigra）からのＳＮＡ（Vector, Cat. No. L-300）を使用した。
【００３１】
Lindgrenら（Lipid 10 (1975), 750-756）の方法に従う超遠心分離により、精製低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を調製した。
【００３２】
１.２ 試験混合物および測定
種々の量のサンプル（１.２５〜１０μl ＬＤＬ、所望によりシアリダーゼ処理されていてもよい）を、１２５μl緩衝液、２５μlラテックス（０.１％）および／または種々の量のレクチンＲＣＡ１２０またはＳＮＡに加えた。ＬＤＬ（アポＢ）を含まない血清およびアポＢ含量が判明している血清（アポＢで検量した血清）を対照として使用した。インキュベーションは光度計中３７℃で行った。測定は、５４６nmでの吸光度をモニターすることにより行った。
【００３３】
この実験の結果を、以下の表１に示す。
【００３４】
１.３ 結果の評価
表１は、抗体／レクチンＲＣＡ１２０の受容体の組み合わせを用いる本発明方法により、アポＢのアシアロ亜集団の測定が可能であることを示す。抗体／レクチンＳＮＡの受容体の組み合わせを用いると、シアロアポリポタンパク質Ｂ亜集団の測定が可能である。
【００３５】
得られた結果を定量するために、検量線を作成する。このために、ＬＤＬ調製物をシアリダーゼで処理することにより完全に脱シアル酸化し、さらにＬＤＬサンプルをシアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−ＮＡＮＡで処理することにより完全にシアル酸化する。アシアロアポＢの含量が判明しているこれらの２つのサンプルは検量線の作成に用いることができ、また、これらのサンプルからアポリポタンパク質Ｂ調製物を調製することができる。個々の未知調製物のアシアロまたはシアロアポＢの含量は、凝集率を測定した後、検量線から読み取る。
【００３６】
【表１】

【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明方法の好ましい具体例を示す図。

Claims (13)

1. サンプル液中の被検体の測定方法であって、該サンプル液を（ａ）該被検体上に１個だけ存在する第１エピトープに結合する、粒子担体物質上に固定化されている単一の第１受容体、および（ｂ）該被検体上の第２エピトープに結合する、該第２エピトープに対する少なくとも２つの結合部位を有する第２受容体と共にインキュベーションすることを含んでなり、該第１エピトープが該第２エピトープと異なっており、両受容体に対する結合により該被検体を測定することを特徴とする方法。
2. 粒子担体物質が、無機粒子、ラテックス粒子、リポソームおよび細胞から選ばれる、請求項１に記載の方法。
3. 抗体、抗体断片および抗体誘導体、レクチン、アプタマーおよび膜受容体よりなる群から選ばれる結合能を有する物質を受容体として使用する、請求項１または２に記載の方法。
4. 第１受容体として、モノクローナル抗体、単一特異性ポリクローナル抗体および／または該抗体の断片を使用する、請求項３に記載の方法。
5. 第１受容体としてレクチンを使用する、請求項３に記載の方法。
6. 抗体／レクチンの受容体の組み合わせを使用する、請求項４または５に記載の方法。
7. レクチンがもはや結合することができない修飾された炭水化物基を有する抗体を使用する、請求項６に記載の方法。
8. 均一アッセイにより測定を行う、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 被検体が少なくとも２つの被検体亜集団の混合物として存在し、測定すべき被検体の１つの亜集団に特異的な第２受容体を使用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 被検体の全量に対する亜集団の比率を測定する、請求項９に記載の方法。
11. 測定すべき被検体がタンパク質であり、使用する第２受容体が該タンパク質の１つの亜集団に特異的であり、該亜集団が、二次的修飾の有無により、残りの亜集団とは異なっている、請求項９または１０に記載の方法。
12. 二次的修飾が、グリコシル化、ある型のグリコシル化、リン酸化、硫酸化、脂質残基の存在または補欠分子族の存在である、請求項１１に記載の方法。
13. 被検体の測定のための試薬キットであって、
    （ａ）測定すべき被検体上に１個だけ存在するエピトープに結合する、粒子担体物質上に固定化されている単一の第１受容体、
    （ｂ）第１エピトープとは異なる被検体上の第２エピトープに結合する、該第２エピトープに対する少なくとも２つの結合部位を有する第２受容体、および
    （ｃ）所望により適当な緩衝液
    を含んでなる試薬キット。

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