JP3958796B2 - 抗原特異的IgG検出 - Google Patents
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Description
本発明は、とくにIgMクラスの免疫グロブリンの存在下におけるIgGクラスの免疫グロブリンの特異的検出方法に関する。
哺乳類生物の免疫系は、外来物質の移入に応答して、免疫グロブリンと呼ばれる抗体を産生する。それらは、抗原とも呼ばれる外来物質から防御する。免疫グロブリンは5種類のクラスに分けることができる。M、G、A、EおよびDクラスの免疫グロブリンの間で区別されている。これら5つの免疫グロブリンクラスのそれぞれはμ、γ、α、εおよびδ鎖と呼ばれる重鎖の組成が異なっている。
各免疫グロブリンクラスは生物内で異なる機能を持つ。Mクラスの免疫グロブリンは、抗原との最初の接触で、いわゆる一次免疫後に現れる。しかしながら、これらの免疫グロブリンの濃度は感染の進行と共に急速に低下する。Gクラスの免疫グロブリンは、一次免疫後に最初はゆっくりと生成し、同じ抗原による二回目の感染があった場合は大量に生じる。Aクラスの免疫グロブリンは、生物の粘膜表面に認められ、そこでの防御過程を担っている。Eクラスの免疫グロブリンは、主としてアレルギー反応を担っている。Dクラスの免疫グロブリンの正確な機能は今のところわかっていない。
個々の免疫グロブリンクラスは、血中に著しく異なる濃度で存在する。例えばGクラスの免疫グロブリン(IgG)は正常ヒト血清では8〜18mg/mlの血清含有量に相当する約75%を占める主要クラスである。これに次いで頻繁に存在する免疫グロブリンはIgAであり、その平均血清濃度は0.9〜4.5mg/mlである。Mクラスの免疫グロブリンは、0.6〜2.8mg/mlの濃度で存在し、Dクラスの免疫グロブリンは0.003〜0.4mg/mlの濃度で存在する。IgE抗体の比率は最も低く、それらは0.02〜0.05μg/mlの濃度で血清中に存在するにすぎない。
多くの疾患の鑑別診断には、特定の抗原に特異的な1または複数の全く特定の免疫グロブリンクラスの抗体を検出することが重要である。ウイルス、細菌および寄生虫感染症の十分な診断は、クラス特異的抗体試験によるか、特定の免疫グロブリンクラスの存在を排除すること(例えばIgG抗体とIgA抗体を検出するが、IgM抗体は検出しない方法)によってのみ確約されうる。これは、新たな感染症または急性感染症とより早期に起こった感染症とを区別すること、ならびに感染症の経過を臨床的にモニターすることにとりわけ重要である。抗体のクラス特異的検出は、HIV、A型肝炎、B型肝炎、トキソプラズマ症、風疹およびクラミジア感染症にとってとりわけ重要である。特定の抗原に特異的な抗体のクラス特異的検出は、防御抗体の力価の決定のためおよび免疫化の成功をチェックするためにも必要である。すなわち、診断の見地から、とくに非急性期の段階の感染に関与する、IgG抗体やIgA抗体などの抗体の検出に大きな関心が寄せられている。
抗原に特異的な特定クラスの抗体を検出する種々の方法は、現状として記載されている。したがって、特定クラスの抗原特異的抗体は、特異的抗原で被覆された固相に特異的抗体を結合させることによってしばしば検出される。固相に結合されている抗原に特異的な免疫グロブリン(Ig)は、特定クラスのヒトIgに対して特異的に指向する抗体を、検出対象のIg分子に結合させることによって検出される。ヒトIgに対する抗体には標識が与えられ、それにより検出が行われる。しかしながら、このような試験法は、ヒトIgに対するクラス特異的標識抗体との反応前に、全ての非特異的非結合Igが洗浄によって除去される場合にのみ可能である。したがって自動システムにしばしば必要とされるような1ステップ試験法は不可能である。
米国特許第4,292,403号明細書に記載の方法によれば、決定対象の試料抗体に結合するクラス特異的抗体を固相上に固定化し、続いて特異的抗体を加え、結合抗原を、抗原に対して特異的であるさらなる標識抗体に結合させることにより、特定の免疫グロブリンクラスの抗原特異的抗体を検出する。しかしながら、この方法の不利な点は、決定対象のクラスのすべての抗体をクラス特異的固定化抗体に結合させなければならないことである。試料抗体は、抗原特異的には結合しない。これにより、抗原特異的抗体の遊離の結合部位が十分でないかもしれないので、試験感度の低下を招くおそれがある。この試験操作においては、いくつかの洗浄ステップも必要である。この方法では、1ステップ試験操作は不可能である。
1ステップ試験での抗体検出が実行できる1つの可能性は、いわゆるブリッジ試験により提供される。該ブリッジ試験の概念は、欧州特許出願公開EP-A-0 280 211号明細書に記載されている。この方法では、例えば、決定対象の抗体に特異的に結合できる抗原などの第1レセプターを固相に結合する。決定対象の抗体は、固相結合型抗原に結合する。また、さらなる特異的抗原が標識を与えられた試験混合物中に存在する。抗体は、標識により検出される。この試験ではすべての抗原特異的抗体が検出され、特定のクラスの抗体だけが検出されるわけではない。
欧州特許出願公開第EP−A−0 307 149号明細書および米国特許第5,254,458号明細書には、ブリッジ試験原理に基づく、抗原に対して特異的に生成した抗体の検出方法が開示されている。この場合、特定の抗原エピトープ由来の、組換えにより製造したペプチドを用いて、検出対象の抗体を結合させる。ペプチドは固相に固定化される。試料抗体がペプチドに結合する。さらなる標識ペプチドを試料抗体に結合させて、検出を行なう。試験の特異性を高めるために、異なる生物において組換えペプチドを発現させる。また、この方法においては、すべてのクラスの抗体がペプチドに結合する。例えば、IgG抗体とIgM抗体の区別は不可能である。
欧州特許出願公開第EP−A−0 386 713号明細書は、それぞれがアリコートの試料および標識HIV抗原と接触させられる2つの固相担体上に異なるHIV抗原が固定化された2つの固相担体を用いて、HIVに対する抗体を検出する方法であって、前記試験のうちの少なくとも1つにおける陽性反応によって抗体の存在を検出する、HIVに対する抗体の検出方法を記載している。遺伝子組換えによって製造したポリペプチドがHIV抗原として開示される。組換えタンパク質または合成ペプチドを用いてHIV抗体を検出することもできるウエスタンブロット分析に基づく方法が欧州特許出願公開第EP−A−0 627 625号明細書に開示されている。しかしながら、いずれの方法も、抗原特異的抗体のクラス特異的検出は不可能である。
前記方法では、特定の免疫グロブリンクラスの抗原特異的抗体を1ステップ法で検出することはできない。標識抗原および固相に結合しうる抗原を用いるブリッジ試験コンセプトに基づいて最新技術から公知である免疫学的検出方法であれば、1ステップ試験が可能である。しかしながら、現時点では、この単純な原理を用いてIgGクラスとIgMクラスの抗体を一括して検出することだけが可能である。
したがって、目的は、非急性の感染に関与する、特異的抗原に対する抗体、すなわち、とくにIgGクラスの抗体の検出方法を改良したものを提供することがである。同時に、該方法は、同じ特異性を有するIgM抗体を検出しないことが確約されるべきである。この方法は、自動化システムにおいて有利に利用できるように、1ステップ試験原理からなることが好ましい。
本目的は、抗体に特異的に結合することができる少なくとも2種のレセプターR1およびR2と試料とをインキュベートすることにより、免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定方法であって、R1は固相に結合しているか結合可能であり、R2は標識を有するものである、決定対象の抗体によって特異的に認識される単量体型の結合パートナーと標識とのコンジュゲートをR2として用いることを特徴とする、本発明の免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定方法によって達成される。
本発明の方法により、同じ抗原特異性を有するIgMクラスの抗体が存在する試料における免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定が可能になる。
検出対象のIgG抗体と同じ特異性を有する試料中のIgA、IgD、およびIgE抗体は、IgG抗体よりもはるかに低い濃度で存在する。とくにIgDクラスとIgEクラスは、IgG濃度より数桁低い濃度で存在するため、検出方法におけるそれらの反応性が測定結果を変える可能性はまったく、あるいはほとんどない。IgA抗体は、全IgG量の約10%に相当する濃度で存在する。したがって、おそらくIgA抗体も本発明の方法において決定されるであろう。本方法の主目的は、非急性の感染に関与する抗体を検出することであるため、非急性の感染の抗体であるIgG抗体とIgA抗体とを併せた検出でも問題ない。IgG抗体が非急性の感染における主な免疫グロブリンクラスであるため、以下の説明では、IgG検出という用語を用いる。急性感染においてのみ大量に存在する同じ抗原特異性のIgM抗体は検出されてはならないということが必須である。
驚くべきことに、本発明の、2重抗原試験原理に基づくブリッジ試験における単量体型の結合パートナーの使用は、特定の抗原に対して特異的に指向するIgGクラスの独占的検出が可能であるということが判明した。驚くべきことに、同一試料中に存在する、同じ特異性を有するIgMクラスの抗体は、単量体ペプチドとまったく反応しないか、無視できるほど弱い程度にしか反応しないため、IgG検出を妨げることがない。「無視できるほど弱い」という用語は、IgM抗体の抗原結合部位が、単量体型の結合パートナーによって検出可能的に結合されないことをいう。これはおそらく、個々の分子型で存在するIgG抗体と比較して、単量体エピトープに対する五量体型のIgM抗体のより一層低い親和性のためであろう。
したがって、前記IgM抗体が干渉しないため、本発明の方法においては、引き続きIgM抗体を分離するための試験操作がまったく必要としない。したがって、本発明の方法の顕著な長所は、試験操作の簡便化がある。
試験試薬が液相中に存在するいわゆる湿式試験(wet tests)とは異なり、タンパク質または抗体の検出に適したあらゆる標準的乾式試験フォーマットを用いることもできる。例えば、欧州特許出願公開EP−A−0 186 799号明細書に記載されているようなこれらの乾式試験または試験片(test strips)においては、試験成分を担体に接触させる。したがって、本発明の方法を試験片フォーマットで実施する場合、洗浄ステップは不要であるが、本発明の方法は湿式試験として実施することが好ましい。
すべてのレセプターと試料とを合わせてインキュベートし、該方法を1ステップで行なうことが可能である。これは、インキュベート後に1つの洗浄ステップを任意に要求する。
通常、2種の異なるレセプターR1およびR2を用いて、本発明の方法を行なう。湿式試験を用いる場合、レセプターR2は液相中に存在する。R1は液相中に存在していてもよいし、すでに固相に結合した状態であってもよい。R1とR2がともに液相中に存在する場合、両者は同じ濃度であることが好ましい。R1:R2の濃度比は、0.5:1.0ないし1.0:5.0が好適であることが判明している。最適濃度比は、当該分野に熟練せる者によって容易に求めることができる。
固相に結合しうるが、まだ固相に結合していない状態のレセプターをR1として用いる場合、次いで、試料をレセプターR1およびR2とともにインキュベートする。このプロセスにおいて、試料抗体はR1およびR2に結合する。このインキュベーションは、固相の存在下で行われる。このプロセスで、固相−R1−試料−抗体−R2を含有する複合体が形成される。
続いて、固相を液相から分離し、固相を任意に洗浄し、R2の標識を決定する。標識は通常、固相中で決定するが、液相中で決定することもできる。
R1およびR2と試料とのインキュベートを固相の非存在下で行なう場合、続いて試験混合物全体を固相と接触させ、任意に洗浄を実施し、標識を決定しなければならない。
レセプターR2がすでに固相に結合型で存在する場合、試料とレセプターR2とを固相結合レセプターR1に加え、合わせてインキュベートする。さらなる操作は前記プロセスと同様である。
しかしながら、本発明の方法はいくつかのステップに分けて実施することも可能である。この場合、まず試料をレセプターR1およびR2とともにインキュベートするのが好都合である。続いて、生成したR1とR2と決定対象の抗体との複合体を、他のレセプターとともにインキュベートし、それにより、いくつかのステップに分けて方法を実施することができる。さらなる試験操作は前記方法と同様である。
レセプターR2は、単量体型の結合パートナーと標識とのコンジュゲートである。本発明の単量体型の結合パートナーは、決定対象の抗体に対して厳密に1個のエピトープ領域のみ、または1つの結合部位のみ、すなわち決定対象のIgG抗体と免疫学的に特異的に反応する構造を含んでいる。結合パートナーの単量体構造は、検出対象の抗原特異的IgG抗体のみが単量体型の結合パートナーに結合し、同じ特異性の干渉性IgM抗体は結合しないことを確約するのに重要である。
エピトープ領域は、例えば、抗原または抗イデオタイプ抗体から得ることができる。単量体型の結合パートナーの場合、エピトープ領域は、糖および/または脂質構造体、またはペプチド、脂質、および/または糖成分の混合構造から得ることもできる。決定対象のIgGクラスの抗体が、同じ特異性のIgM抗体の存在下で特異的に結合する結合部位を有するものであれば、エピトープ領域から得ることができる構造体はいずれのものでも用いることができる。結合部位、すなわち単量体型で用いられる結合パートナーに関する必要条件は、IgGに対する特異的結合能力が保持されることだけである。この条件は、糖または脂質構造が結合部位に存在する場合にも当てはまる。
また、本発明によれば、検出対象のIgG抗体が特異的に結合する結合部位と隣接またはオーバーラップする単量体型の結合パートナーを用いることが可能である。したがって、その結合部位が、検出対象のエピトープとオーバーラップする交差反応性IgG抗体を検出することも可能である。したがって、単量体型の結合パートナーの混合物を用いて、抗原特異的IgG抗体を検出することが好ましい。
単量体型の結合パートナーとして、ペプチドを用いることが好ましい。分析対象がタンパク質である場合、結合部位を、その配列がタンパク質抗原のタンパク質配列の一部であって、本発明の場合はIgG抗体である、このタンパク質に対する抗体が特異的に結合するペプチドとする。これらのペプチドに加えて、結合部位は、決定対象のIgG抗体への結合の、前記ペプチドと実質的に同等な特異性および/または親和性を持つアミノ酸配列を有するペプチドを含むものと解する。これらのペプチドは、個々のアミノ酸残基の置換、欠失、または挿入により前記ペプチドから得ることができることが好ましい。
同じ特異性のIgM抗体の存在下でも、決定対象のIgGクラス抗体が特異的に結合する結合部位を有するものであれば、あらゆるペプチドを用いることができる。結合部位すなわち用いるペプチドに関する必要条件は、IgGに特異的に結合する能力が保持されているということだけである。結合部位を、その配列がタンパク質抗原(分析対象物)のタンパク質配列の一部であって、本発明の場合はIgG抗体であり、このタンパク質に対する抗体が特異的に結合するペプチドとする。これらのペプチドに加えて、結合部位は、決定対象のIgG抗体への結合の前記ペプチドと実質的に同等な特異性および/または親和性を持つアミノ酸配列を有するペプチドを含むものとする。これらのペプチドは、各アミノ酸残基の置換、欠失、または挿入により前記ペプチドから得ることができることが好ましい。
また、特異的結合部位に対応する本発明のペプチドは、1または複数のアミノ酸が化学反応によって誘導体化されているペプチド誘導体を包含すると理解される。本発明のペプチド誘導体の例は、具体的には、骨格および/または反応性アミノ酸側鎖基、例えば遊離アミノ基、遊離カルボキシル基および/または遊離ヒドロキシル基などが誘導体化されている分子である。アミノ基の誘導体の具体例は、スルホンアミドまたはカルボキサミド、チオウレタン誘導体および例えば塩酸塩などのアンモニウム塩である。カルボキシル基誘導体は、塩類、エステルおよびアミドである。ヒドロキシル基誘導体の例は、0-アシルまたは0-アルキル誘導体である。ペプチドは、当業者に知られている方法に従って化学合成によって製造されることが好ましく、ここでとりわけて説明する必要はない。原理的には、該ペプチドは組換え法によって製造することもできるが、より長いポリペプチドは、しばしば二量体化または多量体化しやすくなるため、単量体性を確保するために、化学合成法によってペプチドを製造することが好ましい。
また、ペプチド誘導体という用語は、1または複数のアミノ酸が20種類の「標準」アミノ酸の天然に存在するまたは天然には存在しないアミノ酸ホモログによって置換されているようなペプチドをも包含する。かかるホモログの例は、4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリジン、3-メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン、β-アラニンおよび4-アミノ酪酸である。該ペプチド誘導体は、それらが由来するところのペプチドと本質的に同等な、決定対象のIgG抗体への結合特異性および/または親和性を持たなければならない。
特異的結合部位に対応する本発明のペプチドは、決定対象のIgG抗体への結合の特異性および/または親和性が前記ペプチドまたはペプチド誘導体と実質的に同等なペプチド模倣物質とも呼ばれ、以下の説明ではペプチド模倣物ともいう。ペプチド模倣物は、決定対象の抗体との相互作用に関してペプチドに置換することができ、かつ、とくにプロテイナーゼおよびペプチダーゼに対してネイティブのペプチドより高い安定性を有しうる化合物である。ペプチド模倣物の製造方法については、ギアニスとコルター(Giannis and Kolter)、Angew.Chem.,105(1993),1303-1326;およびリーら(Lee et al.)、Bull.Chem.Soc.Jpn.,66(1993),2006-2012に記載されている。
結合部位の長さ、すなわち本発明の単量体ペプチドの長さは通常、少なくとも4アミノ酸である。この長さは、4〜20アミノ酸、好ましくは6〜15アミノ酸、とくに好ましくは9〜12アミノ酸である。ペプチド模倣物またはペプチド誘導体の場合、分子のサイズと同様の長さが必要である。
単量体型の結合パートナーとしての本発明の単量体ペプチドは、決定対象のIgG抗体が特異的に結合するエピトープを含む。しかしながら、該特異的エピトープにもはや対応しないさらなる隣接ペプチド配列がペプチドのN末端および/またはC末端に存在していてもよい。さらに、当該分野に熟練せる者にとって公知のスペーサー基をペプチドに付与することも可能である。必要条件としては、単量体型の結合パートナーとしてのペプチドが実際に単量体として存在すること、および決定対象のIgG抗体に結合する能力が保持されることだけである。
レセプターR2のさらなる成分が標識である。例えば、化学発光性、蛍光性もしくは放射活性の物質、または金属ゾル、ラテックスもしくは金粒子など、直接的に検出可能な物質を標識として用いることが好ましい。例えば、ハプテンなど、酵素またはその他の生体分子も標識として好ましい。ハプテンのなかでもジゴキシゲニンがとくに好ましい標識である。標識のプロセスは、当該分野に熟練せる者にとって公知であり、本明細書ではとくに説明しない。標識は、化学発光性、蛍光性もしくは放射活性の物質、または金属ゾル、ラテックスもしくは金粒子を測定するか、酵素によって変換された基質を測定することにより、公知方法で直接的に検出される。
標識は、間接的に検出することもできる。この場合、それ自体が後でシグナル生成基に結合されるさらに別のレセプターが、ジゴキシゲニンなどのハプテンなどのR2標識に特異的に結合する。例えば、化学発光性、蛍光性もしくは放射活性の物質、または酵素もしくは金粒子などのシグナル生成基は、当該分野に熟練せる者にとって公知の方法によって検出される。例えば、抗体または抗体断片を、R2の標識に特異的に結合するさらに別のレセプターとして用いることができる。この間接的標識検出方法を用いる場合、R2標識としては、ジゴキシゲニンまたはその他のハプテンが好ましく、検出は、ジゴキシゲニンに対するまたはハプテンに対するペルオキシダーゼ結合抗体を介して行なう。
レセプターR1の必須成分の1つは、決定対象のIgG抗体に特異的に結合しうる結合パートナーである。レセプターR1は、固相に直接的に結合させることができるか、それ自体が固相に結合しうるものである。レセプターR2の場合のような単量体型の結合パートナーを、決定対象のIgG抗体に特異的に結合しうる結合パートナーとして用いることができる。しかしながら、単量体型では存在しない結合パートナーを用いることも可能であり、すなわち、該結合パートナーは、1を超えるエピトープまたは結合部位を有するものであってよい。結合パートナーが、決定対象のIgG抗体に特異的に結合する能力が保持されていることが重要である。しかしながら、単量体型の結合パートナー、とりわけ好ましくはペプチドも、レセプターR1として用いることができる。R1に含まれるペプチドは、R2のペプチドと同じ方法で製造することができる。
レセプターR1およびR2に含まれている抗体特異的結合パートナーまたはペプチドは、同一のものであっても異なるものであってもよいが、両者ともに、決定対象のIgG抗体に同時に結合しうるものでなければならない。
R1は、固相に直接的に結合させることができる。固相へのR1の直接結合は、当該分野に熟練せる者にとって公知の方法によってこれを行なうことができる。R1は、特異的結合系を用いて、固相に間接的に結合させることもできる。この場合、R1は、前記ペプチドと特異的結合系の反応パートナーとから構成されるコンジュゲートである。この場合、特異的結合系は、互いに特異的に反応しうる2つのパートナーであるものと解する。この場合、結合力は、免疫反応または別の特異的反応に基づくことができる。ビオチンとアビジンまたはビオチンとストレプトアビジンの組み合わせが特異的結合系として好ましく用いられる。これら以外の好ましい組み合わせとしては、ビオチンとアンチビオチン、ハプテンとアンチハプテン、抗体のFc断片とFc断片に対する抗体、または炭水化物とレクチンなどが挙げられる。次いで、この特異的結合可能ペアの反応パートナーの1つを、レセプターR1を形成するコンジュゲートの一部とする。
そして特異的結合系の他方の反応パートナーは、固相に存在する。特異的結合系の他方の反応パートナーは、当業者に知られている従来の方法で不溶性担体材料に結合できる。この場合は、共有結合ならびに吸着性の結合も好適である。とりわけ好適な固相は、内表面が特異的結合系の反応パートナーでコーティングされたポリスチレン製または類似のプラスチック製の試験管もしくはマイクロタイタープレートである。ラテックス粒子、モレキュラーシーブ物質、ガラスビーズなどの粒状物質、プラスチックチューブなども好適であり、とりわけ好ましい。紙などの多孔性層状担体も担体として使用できる。
本発明の方法の好ましい態様においては、単量体型の結合パートナーと特異的結合系の反応パートナーとから構成されるコンジュゲートをR1として用いる。この好ましい態様においては、レセプターR1およびR2ならびに決定対象のIgG抗体を含む試料を合わせてインキュベートする。このプロセスにおいて、レセプターR1およびR2のペプチド成分が、決定対象のIgG抗体と特異的に反応する。R1の1成分である、特異的結合系の反応パートナーによって、R1と試料抗体とR2とから構成されるこの複合体を、特異的結合系の他方の反応パートナーで被覆した固相に結合させる。その結果、R1と試料抗体とR2とから構成される複合体全体が固相に結合する。固相を液相から分離し、任意に固相を洗浄した後、当該分野に熟練せる者にとって公知の方法によってR2の標識を検出する。この試験操作により、同じ特異性を有するIgG抗体の存在下で、IgG抗体を特異的に検出することができる。
本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては、レセプターR1およびR2以外に別のレセプターを用いる。この試験操作においては、単量体型の結合パートナーと例えば、ビオチンなど特異的結合系の反応パートナーとから構成されるコンジュゲートをR1として用いる。この場合、レセプターR1およびR2ならびに決定対象のIgG抗体を含む試料を合わせてインキュベートする。このプロセスにおいて、レセプターR1およびR2のペプチド成分が、決定対象のIgG抗体と特異的に反応する。特異的結合系の他方の反応パートナー(例えば、ストレプトアビジン)で被覆した固相への結合は、R1の成分である、特異的結合系の反応パートナーによってこれを行なう。その結果、R1とR2と試料抗体とから構成される複合体全体が固相に結合する。固相を液相から分離し、任意に固相を洗浄した後、固相に結合した複合体を、R2の標識を特異的に認識する別のレセプターとともにインキュベートする。追加レセプターを、酵素などのシグナル生成基に結合させる。さらに任意の洗浄ステップを経た後、この場合は酵素によって変換された基質により、シグナル生成基を介して、試料抗体を検出する。この試験操作を用いる場合、ジゴキシゲニンをR2標識として用いることが好ましい。この場合の追加レセプターは、ジゴケシゲニンに対する抗体または抗体断片とペルオキシダーゼ酵素とから構成される。この試験操作においては、R1およびR2と試料と追加レセプターとのインキュベートも同時に行なうことができる。
この試験操作は、自動化システムへの応用にも非常によく適しているが、2つ以上の洗浄ステップを要する。この試験操作の主な利点は、例えば、gp41、p17などに対するHIV抗体などのいくつかの抗原特異的抗体の検出に使われる場合に明白になる。この場合、追加レセプターがR2標識を特異的に認識するため、そのレセプターをユニバーサルな標識として用いることができる。
当該分野に熟練せる者にとって公知のあらゆる生物学的液体を試料として用いることができる。全血、血清、血漿、尿、唾液などの体液を試料として用いることが好ましい。
また、試料に加えて、固相および前記レセプター、さらに緩衝液、塩類、界面活性剤、BSAなどのタンパク質添加剤など、用途によって必要になる添加剤が試験混合物に含まれていてよい。これら必要な添加剤は当該分野に熟練せる者にとって公知であるか、当該分野に熟練せる者によって容易に選定することができる。
IgM抗体またはリウマチ因子が抗原特異的IgG検出を干渉することがないように、さらに別の干渉低減手段を任意に用いることが可能である。これらの手段としては、例えば、欧州特許第EP−B−0 341 439号明細書に開示されているアプローチにおけるジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスリトール(DTE)、またはβ-メルカプトエタノールなどの還元性物質の使用が挙げられる。また、抗Fd抗体を任意に用いて、リウマチ因子による干渉を排除することができる。前記コンセプトは、国際公開第96/14338号パンフレットに開示されている。前記さまざまな干渉低減手段は、単独で用いてもよいし、適宜組み合わせてもよい。
本発明のさらに別の主題は、緩衝液、塩類、界面活性剤など免疫アッセイのための慣用の試験添加剤に加えて、単量体型の結合パートナーと標識とから構成される、決定対象の抗体に結合しうるレセプターR2を含む免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定のための試薬が挙げられる。
本発明のさらに別の主題として、免疫アッセイのための通常の試験添加剤に加えて、決定対象の抗体に結合しうる2つのレセプターR1およびR2を含む免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定ための試薬であって、R1が固相に結合可能であり、R2が標識を保持し、レセプターR2の必須成分の1つが単量体型の結合パートナーである、免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体決定試薬が挙げられる。
本発明のさらに別の主題として、免疫アッセイのための通常の試験添加剤に加えて、決定対象の抗体に結合しうる2つのレセプターR1およびR2を含む免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定のための試薬であって、R1が固相に結合可能であり、R2が標識を保持し、両レセプターの必須成分の1つが単量体型の結合パートナーである、免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体決定試薬が挙げられる。
さらに、本発明の主題としては、免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定のための単量体型の結合パートナーの使用が挙げられる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例
1.単量体エピトープおよび多量体エピトープを用いる場合の<HIV2>MAB(IgGおよびIgM)との反応性
試験手法の説明:
ビオチン標識およびジゴキシゲニン標識単量体(試験A)または多量体(試験B)抗原(HIV2)を試料抗体およびストレプトアビジン被覆固相と共にインキュベートする(25℃または37℃で約60〜180分のインキュベーション、本実施例では25℃で120分)。洗浄ステップの後、壁に結合した免疫複合体を抗ジゴキシゲニン-ペルオキシダーゼコンジュゲートと反応させる(25℃または37℃で約30〜120分のインキュベーション、本実施例では25℃で60分)。さらなる洗浄ステップの後、ペルオキシダーゼコンジュゲート-標識免疫複合体を基質反応によって検出する(25℃で60分のゴンジュゲートインキュベーション)。一般的なコンジュゲートインキュベーションは、25℃または37℃で約30〜120分で行なうことができる。
反応ステップ(基質反応を除く)は、約0.05〜0.4%の界面活性剤(ここでは0.2%ポリドカノール)および約0.5%タンパク質/タンパク質誘導体添加剤(ここではとりわけラクトアルブミン由来のペプトンとBSA)を含むトリス/HCl緩衝液(pH7.5、50〜150mM。本実施例では100mM)で行なう。
この場合の試料抗体は、HIV2エピトープに対するモノクローナルマウス抗体(IgMおよびIgG)を抗HIV陰性ヒト血清に約2〜20μg/mlとなるように希釈したものである。
単量体型のHIV2特異的結合パートナーを使用することで、HIV2に対するIgG抗体の特異的検出が可能になる。同じ抗原特異性のIgMクラスの抗体は認識されない(試験A)。
多量体型のHIV2特異的結合パートナーを使用すると、IgGとIgMを区別することができない(試験B)。
2.チンパンジーのHIV2血清変換に関与する血清抗体との反応性
実験操作は実施例1と同じである。
単量体型の結合パートナーを使用することで、HIV2感染後の血清変換の検出が可能になる。試験Aの利点は、感染3週間後にとくに明白になる。すなわち、単量体型の結合パートナーによって検出されないIgM抗体のみが存在する。試験Aは、IgG抗体出現後に限り陽性シグナルを示す。多量体型のエピトープを用いる試験Bは、同じ特異性のIgGとIgMを区別することができない。
3.患者のHIV1血清変換の血清抗体との反応性
実験操作は、HIV1の抗体を除き、実施例1と同じである。
試験Aは、HIV1の感染の場合でも(実施例2記載のHIV2に類似)、IgG抗体の信頼できる検出を可能とする。
4.単量体エピトープを含むペプチドを有する風疹に対するIgGの検出試験手法の説明:
製造者の説明書にしたがって、ベーリンガーマンハイム ゲーエムベーハー、ドイツ社製のElecsys▲R▼2010装置で、風疹特異的IgGを単量体型の本発明の結合パートナーにより検出する。下記試薬を使用した:
試薬R1:風疹E1抗原の環状ペプチド、ビオチン化。
Tris緩衝液、pH7.5、0.2% Myrij、
0.2% BSA
試薬R2:風疹E1抗原の環状ペプチド、ルテニル化。
Tris緩衝液、pH7.5、0.2% Myrij、
0.2% BSA、0.1% R−IgG。
ヒト血清試料を試料として用いた。
試験を下記ステップで行なう:
1.30μlの試料+65μlのR1+65μlのR2
2.37℃、9分のインキュベート
3.40μlのSA被覆磁気粒子の添加
4.37℃、9分のインキュベート
5.検出反応:電気化学発光シグナルを測定する
抗原特異的IgGを含む試料のみを陽性として認識する。抗原特異的IgMを含む試料(No.1.3およびNo.1.4)は本発明により陽性として認識されない。
Claims (9)
- 抗体に特異的に結合することができる少なくとも2種の異なるレセプターR1およびR2と試料とをインキュベートすることによる免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定方法であって、R1は固相に結合しているかまたは固相に結合可能であり、R2は標識を有するものであり、決定対象の抗体により特異的に認識されるモノマー型の結合パートナーのコンジュゲートおよび標識がR2として用いられる、免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定方法。
- R1の必須成分がモノマー型の結合パートナーである、請求項1記載の方法。
- ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、ビオチン/アンチビオチン、ハプテン/アンチハプテン、抗体のFc断片/該Fc断片に対する抗体、炭水化物/レクチンを特異的結合系として用いてR1と固相とを結合させる、請求項1または2記載の方法。
- 該レセプターR2を化学発光性、蛍光性もしくは放射活性の物質で、または酵素もしくは他の生体分子で標識する、請求項1〜3いずれか記載の方法。
- 該試料を、R1およびR2と同時にインキュベートする、請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 試験混合物を、レセプターR2の標識に特異的に結合し、R2の標識に特異的なレセプターと標識とのコンジュゲートである別のレセプターとインキュベートし、ついで該標識を決定する、請求項1〜5いずれか記載の方法。
- 決定対象の抗体により特異的に認識されるR1におけるモノマー型の結合パートナーの量が、決定対象の抗体により特異的に認識されるR2におけるモノマー型の結合パートナーの量よりも大きいか、または同じである、請求項1〜6いずれか記載の方法。
- 免疫アッセイのための慣用の試験添加剤に加えて、モノマー型の結合パートナーと標識とから構成される、決定対象の抗体に結合可能なレセプターR2を含んでなる、前記請求項のいずれか記載の免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体を決定するための試薬。
- 免疫グロブリンGクラスの抗原特異的抗体の決定のためのモノマー型の結合パートナーの使用。
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