DE3820556A1

DE3820556A1 - Verfahren zur bestimmung von allergenspezifischen antikoerpern in koerperfluessigkeiten

Info

Publication number: DE3820556A1
Application number: DE19883820556
Authority: DE
Inventors: Winfried Dr Phil Albert; Michael Dr Rer Nat Grol; Peter Dr Rer Nat Stahl
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1988-06-16
Filing date: 1988-06-16
Publication date: 1989-12-21

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von allergenspezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten nach dem Prinzip des Immunoassays sowie ein hierzu ge eignetes Reagenz.

Ein Anteil von etwa 15 bis 25% der Bevölkerung leidet an Allergien. Die häufigste Form der Allergie ist dabei die atopische Allergie, auch Allergie vom Soforttypus, anaphylaktischer Typ oder Typ I-Reaktion genannt. Bei dieser Form der Allergie treten die charakteristischen Symptome wie Heufieber, Asthmaanfall oder Urticaria unmittelbar nach Kontakt mit der die Allergie auslösen den und als Allergen bezeichneten Substanz auf. Typi sche Allergene sind Bestandteile des Kots der Haus staubmilbe, Tierepithelien, Pollen, verschiedene Nah rungsmittel, Schimmelpilze und Insektengifte.

Über den Mechanismus der allergischen Reaktion ist be kannt, daß hier Immunglobuline der Klasse IgE wesentlich beteiligt sind. Die IgE-Antikörper binden mit hoher Affinität an Mastzellen und basophile Leukozyten. Wenn ein Allergen in Kontakt mit zellgebundenen IgE-Antikör pern kommt, werden physiologisch aktive zelluläre Me diatoren wie z.B. Histamin, Leukotriene, Prostaglandine u. a. freigesetzt. Dadurch läuft eine Reaktionskaskade ab, die die typischen Symptome verursacht. Hierzu zählen z. B. Kontraktion der Muskulatur der Atemwege, bis hin zu einem Asthmaanfall, Erweiterung der Blutgefäße und damit Rötung und Schwellung, Absonderung von Schleim, Juckreiz und Schmerz. Bei hochempfindlichen Personen kann es z. B. nach einem Insektenstich oder nach Injek tion von Penicillin oder Procain zu einer anaphylakti schen Reaktion, die bis zum anaphylaktischen Schock oder sogar zum Tod führen kann, konmen. Nach neuesten Erkenntnissen sind auch spezifische und unspezifische Immunglobuline der Klasse IgG, insbesondere der Klasse IgG₄ an der allergischen Reaktion beteiligt.

Zur Diagnose von Allergien ermittelt man die im Blut vorhandenen spezifischen und unspezifischen IgE- und IgG-Antikörper. Zur Bestimmung von spezifischen oder unspezifischen Antikörpern werden sowohl in vivo Test methoden, als auch in vitro Testmethoden angewendet. Als in vivo Testmethoden sind insbesondere Haut- und Provokationstests bekannt. Diese Tests können für Patienten stark belastend sein, insbesondere wenn die Gefahr eines anaphylaktischen Schocks besteht.

Aus diesen Gründen hat man versucht, die in vivo-Tests durch in vitro-Testmethoden zu ersetzen. Dabei werden zur Diagnose von Allergien einmal die Bestimmung der Gesamtkonzentration an IgE im Blut und zum anderen eine Bestimmung von allergenspezifischen IgE- bzw. IgG-Anti körpern durchgeführt. Die Bestimmung der Gesamt-IgE- Konzentration kann nur einen allgemeinen Hinweis auf das Bestehen einer allergischen Reaktion bieten und ist daher nur begrenzt aussagekräftig. Insbesondere erwünscht sind daher Methoden, mit denen allergenspezifisches IgE bzw. IgG nachgewiesen werden kann. Einerseits ist dies notwendig, um festzustellen, auf welche Allergene der Patient reagiert und damit eine wirkungsvolle Behandlung einleiten zu können und andererseits, um den Erfolg einer Hyposensibilisierung überwachen zu können.

Zum Nachweis von allergenspezifischen IgE-Antikörpern sind bereits einige in vitro-Bestimmungen bekannt. Diese Methoden basieren häufig auf dem Prinzip des Immunoassays, wobei jeweils das Allergen an die feste Phase gebunden vorliegt. Das immobilisierte Allergen wird dann mit der Patientenprobe in Kontakt gebracht, wobei das allergenspezifische IgE an das immobilisierte Allergen bindet und unspezifisches IgE ausgewaschen wird. Anschließend wird der festphasengebundene Komplex aus Allergen und allergenspezifischem IgE mit markierten Anti-IgE-Antikörpern in Kontakt gebracht, die an das allergenspezifische IgE binden. Nach Auswaschung von überschüssigem markiertem Anti-IgE-Antikörper wird die Menge an gebundenem markiertem Anti-IgE-Antikörper be stimmt. Das Ergebnis ist ein direktes Maß für die Menge an allergenspezifischem IgE, das in der Probe vorhanden ist. Die Markierung erfolgt dabei üblicherweise durch ein Enzym oder eine radioaktive Substanz. Eine solche Variante ist beispielsweise in An. Clin. Biochem. 24 (1987), 232-245, beschrieben.

Der Nachteil dieser bekannten Nachweisverfahren liegt darin, daß das Allergen, das für die Durchführung der Verfahren notwendig ist, modifiziert wird z. B. indem es an einer Festphase immobilisiert vorliegt. Durch die Bindung z. B. an die Festphase tritt stets eine Verände rung des natürlichen Allergenepitopmusters auf, was auch zu einer Veränderung der Bindefähigkeit führt. Außerdem können nur allergenspezifische Antikörper nachgewiesen werden, für die immobilisierte Allergene angeboten werden. Es hat sich gezeigt, daß die Qualität handelsüblicher Allergenextrakte selbst innerhalb der gleichen Charge außerordentlich schwankt. Unterschiede der allergenen Potenz für bestimmte Allergenextrakte wie z. B. Hausstaub oder Schimmelpilze um den Faktor 1000 können auftreten.

Dies ist dadurch begründet, daß die Allergenextrakte meist eine komplexe Mischung von unterschiedlichen Ein zelallergendeterminanten darstellen. Bis zu 80 ver schiedene Epitope pro Allergen sind beschrieben worden.

Es wäre daher vorteilhaft, wenn man die Allergene, die auch für die in vivo Methoden eingesetzt werden, für einen in vitro Test verwenden könnte, ohne eine Abnahme der allergenen Potenz in Kauf nehmen zu müssen.

Es war daher Aufgabe der Erfindung, ein Nachweisverfah ren zur Bestimmung von allergenspezifischen Antikörpern zur Verfügung zu stellen, bei denen die insbesondere zum Hauttest, zum Provokationstest oder zur Hyposensi bilisierung verwendeten, nicht modifizierten z. B. inmobilisierten Allergene ohne jede Modifizierung eingesetzt werden können. Darüber hinaus war es Aufgabe der Erfindung, ein Testverfahren zur Verfügung zu stellen, das einfach und schnell durchzuführen ist und in möglichst kurzer Zeit die gewünschten Ergebnisse liefert.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Be stimmung von allergenspezifischen Antikörpern in Kör perflüssigkeiten nach dem Prinzip des Immunoassays durch Inkubation mit mindestens zwei Rezeptoren R ₁ und R ₂, die mit dem zu bestimmenden Antikörper bindefähig sind, wobei R ₂ eine Markierung trägt, Trennung der festen von der flüssigen Phase und Messung der Markie rung in einer der beiden Phasen, das dadurch gekenn zeichnet ist, daß man als R ₁ das mit dem zu bestimmenden Antikörper spezifisch bindefähige Allergen und als R ₂ ein Konjugat aus einem gegen den Fc-Teil von IgE oder IgG gerichteten Antikörper und einer Markierung verwendet.

Überraschenderweise gelingt es mit dem erfindungsge mäßen Verfahren, bei Verwendung von nicht immobilisier ten Allergenen, allergenspezifische Antikörper genau und auch in sehr geringen Mengen nachzuweisen. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet die Möglichkeit, allergenspezifische Antikörper praktisch gegen alle Allergene, die im Handel sind, und insbesondere gegen Allergene, die für in vivo-Methoden verwendet werden, nachzuweisen.

Das Reaktionsprinzip einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Fig. 1 dargestellt. Dabei reagiert das als Rezeptor R ₁ bezeichnete Allergen mit den in der Probe vorhandenen allergenspezifischen Antikörpern. Abhängig von Anzahl und Art der Epitope auf dem Allergen reagieren jeweils mehrere, in der Probe vorhandene allergenspezifische Antikörper mit dem Allergen. Durch Zugabe von Rezeptor R ₃, der entweder an eine Festphase gebunden ist (Fig. 1a) oder die Bindung an die Festphase vermittelt (Fig. 1b) und einen Antikör per, der gegen den Fc-Teil von IgE bzw. IgG gerichtet ist, enthält und von Rezeptor R ₂, der ein Konjugat aus einem gegen den Fc-Teil von IgE bzw. IgG gerichteten Antikörper und einer Markierung ist, wird das Allergen, an das die in der Probelösung befindlichen allergenspe zifischen Antikörper gebunden sind, an einer Festphase immobilisiert, wobei die nicht an der Immobilisierung beteiligten, am Allergen gebundenen Antikörper das mit einer Markierung versehene Konjugat tragen. Nach Abtren nung der festen von der flüssigen Phase kann dann der Anteil an allergenspezifischen Antikörpern über den An teil an gebundener Markierung bestimmt werden.

Für dieses erfindungsgemäß definierte Verfahrensprinzip gibt es mehrere Durchführungsvarianten.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe entweder gleichzeitig oder nacheinander mit mindestens zwei Rezeptoren inkubiert. Dabei ist der erste Rezeptor R ₁ das mit dem zu bestimmenden Antikörper spezifisch bindefähige Allergen. Hier können alle Substanzen verwendet werden, deren allergene Wirkung bekannt ist. Insbesondere geeignet sind die in der in vivo-Diagnostik verwendeten Allergene. Wenn das Verfahren zur Überprüfung des Erfolgs einer Hyposensibilisierungs behandlung verwendet wird, so werden bevorzugt die für die Hyposensibilisierung verwendeten Allergene ebenfalls im Testverfahren eingesetzt.

Das Allergen wird in flüssiger Phase eingesetzt.

Der zweite, für das erfindungsgemäße Verfahren erfor derliche Rezeptor R ₂ ist ein Konjugat aus einem Anti- IgE- bzw. -IgG-Antikörper bzw. dessen Fragment und einer Markierung. Bevorzugt wird als Markierung ein Enzym, eine fluoreszierende, chemilumineszierende oder radioaktive Substanz verwendet. Verfahren zur Markie rung von Antikörpern und Antikörperfragmenten sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner weiteren Er läuterung. Die Bestimmung von gebundener Markierung und die Auswertung erfolgen ebenfalls nach dem Fachmann geläufigen Methoden.

In einer weiteren Ausführungsform kann der Rezeptor R ₂ auch aus einem Konjugat aus Anti-IgE- bzw. IgG-Anti körpern und einem partikulären Träger bestehen. Als partikuläre Träger geeignet sind z. B. Latexpartikel, Bentonit oder Erythrozyten. Durch Reaktion mit dem Kom plex aus Allergen und allergenspezifischem Antikörper kommt es dann durch netzwerkartige Verbindung zu einer Agglutination, die turbidimetrisch nachgewiesen werden kann. Diese Form der Markierung wird insbesondere bevorzugt, wenn das Verfahren nur mit zwei Rezeptoren - dem Allergen und einem markierten Antikörper - durchge führt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfin dungsgemäße Verfahren mit einem weiteren Rezeptor R ₃, der die Bindung an die feste Phase vermittelt, durch geführt. Der Rezeptor R ₃ besteht zum einen Teil aus einem gegen den Fc-Teil von IgE bzw. IgG gerichteten Antikörper. Dieser Antikörper ist so derivatisiert, daß er entweder an eine feste Phase gebunden vorliegt oder aber an eine feste Phase kuppelbar ist.

Als Antikörper wird hierzu bevorzugt ein Antikörper verwendet, dessen Paratop mit solchen Epitopen des Fc- Teils von IgE- bzw. IgG-Antikörpern bindet, daß eine Bindung eines weiteren Rezeptors R ₂ an den Fc-Teil unmöglich gemacht wird. Dadurch werden unspezifische Anlagerungen verhindert und die Genauigkeit des Testes noch weiter erhöht.

Der für den Rezeptor R ₃ verwendete Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein. Unter Antikörper werden in diesem Zusammenhang auch Antikör perfragmente verstanden.

Der Rezeptor R ₃ vermittelt die Bindung des Komplexes aus Allergen und zu bestimmenden Antikörpern an eine feste Phase. Dazu kann in einer Ausführungsform der Rezeptor R ₃ an eine feste Phase gebunden sein. Die Bin dung erfolgt dabei nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden. Sowohl eine kovalente als auch eine adsorptive Bindung ist geeignet. Bevorzugt wird jedoch wegen der hierbei erzielbaren höheren Ausbeute und der vereinfachten Arbeitsweise eine lediglich adsorptive Bindung, beispielsweise an Kunststoff. Als feste Phase besonders geeignet sind Reagenzgläschen oder Mikroti terplatten aus Polystyrol und ähnlichen Kunststoffen, die adsorptiv an der Innenoberfläche mit R ₃ beschichtet sind. Weiterhin geeignet sind auch teilchenförmige Sub stanzen, z. B. Molekularsiebmaterialien, Glasperlen, Kunststoffschläuche und dergleichen. Ebenfalls geeignet sind als feste Phase auch poröse schichtförmige Träger wie Papier.

In einer anderen Variante des erfindungsgemäßen Verfah rens besteht der Rezeptor R ₃ aus einem Konjugat des Anti-IgE- bzw. -IgG-Antikörpers mit einem Bindungspart ner eines spezifisch bindenden Paares. Dieser Bindungs partner eines spezifisch bindenden Paares vermittelt dann die Bindung an die feste Phase. Dazu kann der andere Bindungspartner an der festen Phase gebunden sein, so daß die Immobilisierung durch Bindung der beiden Partner miteinander erfolgt. Besonders bevorzugt wird dazu eine Festphase, an der Streptavidin gebunden ist und ein biotinylierter Rezeptor R ₃ verwendet, so daß Biotin als Partner des spezifisch bindenden Paares Biotin/Streptavidin die Bindung an die mit Streptavidin beschichtete Festphase vermittelt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die feste Phase ebenfalls mit einem Bindungspartner eines spezifisch bindenden Paares beschichtet. Die Bestimmungs reaktion wird dann in homogener Phase durchgeführt und nach Abschluß der Reaktion wird dann eine zweite spezi fisch bindefähige Substanz zugegeben, die sowohl Bin dungsstellen für den an den Antikörper gebundenen Bindungspartner aufweist als auch Bindungsstellen für den an die feste Phase gebundenen Bindungspartner. Diese Substanz bewirkt dann die Immobilisierung des Konjugates. Als Bindungspartner, mit denen der Rezeptor R ₃ konjugiert werden kann, sind z. B. Biotin, Avidin, Haptene, Antigene sowie Protein A u. a. geeignet. Die zur Immobilisierung an der festen Phase gebundene bzw. zugegebene Substanz enthält dann den jeweils spezifisch mit diesem Bindungspartner bindenden anderen Partner, also insbesondere Avidin, Streptavidin, Biotin und Immunglobulin. Ebenso sind derartige Bindungspaare geeignet für die Bindung zwischen der festen Phase und der die Bindung vermittelnden zweiten Substanz.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gibt es verschiedene Varianten. Das Verfahren kann ein stufig oder mehrstufig durchgeführt werden. Das erfin dungsgemäße Verfahren ist für die verschiedensten Durchführungsarten, die dem Fachmann bekannt sind, ge eignet.

So kann in einer bevorzugten Ausführungsform zuerst eine den zu bestimmenden Antikörper enthaltende Probe mit dem als Rezeptor R ₁ bezeichneten spezifischen Allergen inkubiert werden. Im zweiten Schritt wird dann Rezeptor R ₃ sowie Rezeptor R ₂ zugegeben und nochmals inkubiert. Nach der üblichen Behandlung des Reaktionssystems wird dann nach Abtrennung der gebundenen von der ungebunde nen Markierung die Markierung in einer der Phasen in bekannter Weise bestimmt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird zuerst eine den zu bestimmenden Antikörper enthaltende Probe mit dem an die feste Phase gebundenen Rezeptor R ₃ inkubiert. Dabei werden die in der Probelösung vorhandenen Anti körper der IgE- bzw. IgG-Klasse über ihren Fc-Teil an R ₃ gebunden. Nach dem Auswaschen wird anschließend die Lösung mit dem Allergen, das mit den zu bestinmenden allergenspezifischen Antikörpern bindet, inkubiert. Dabei binden nur die allergenspezifischen, an R ₃ ge bundenen IgE- bzw. IgG-Antikörper diese Allergenmole küle. Nach erneutem Auswaschen wird nochmals eine die zu bestimmenden Antikörper enthaltende Probelösung zu gegeben und inkubiert. Da bevorzugt alle an der festen Phase vorhandenen Bindungsstellen für IgE- bzw. IgG-Anti körper durch die erste Inkubation abgesättigt sind, binden die entsprechenden, in der Probelösung vorhan denen allergenspezifischen Antikörper an die immobili sierten Allergenmoleküle. Gleichzeitig oder nach er neutem Auswaschen wird dann der Reaktionslösung, die den Komplex aus R ₃, zu bestimmendem allergenspezifi schen Antikörper und Allergen enthält, eine Lösung von R ₂ zugegeben. R ₂ wird über den Antikörperanteil an den Fc-Teil der am Allergen gebundenen, zu bestimmenden Antikörper gebunden. Um eine genaue Bestimmung ohne Verfälschungen durch unspezifische Anlagerungen durch führen zu können, muß ausgeschlossen werden, daß R ₂ an andere als die zu bestimmenden allergenspezifischen Antikörper bindet. Um dies sicherzustellen, wird in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für R ₃ ein Anti-IgE- bzw. -IgG-Antikörper verwendet, dessen Paratop mit solchen Epitopen des Fc-Teils von IgE- bzw. IgG-Antikörpern binden, daß eine Bindung eines weiteren Rezeptors R ₂ an den Fc-Teil unmöglich gemacht wird.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung wird die unspezifische Bindung dadurch verhindert, daß man nach Inkubation von R ₃ mit der Probe, wobei die zu bestimmenden Antikörper an R ₃ ge bunden werden, Fc-Fragmente von IgE- bzw. IgG-Antikör pern im Überschuß zugibt, so daß alle noch vorhandenen Bindungsstellen der an R ₃ gebundenen, zu bestimmenden Antikörper abgedeckt werden.

Nach Trennung der festen von der flüssigen Phase wird die Menge an gebundener Markierung in an sich bekannter Weise bestimmt. Gleichzeitig mit dem Bestimmungsverfah ren wird eine zweite Bestimmung durchgeführt, bei der statt der Probe eine Vergleichslösung eingesetzt wird, die sicher keine für das fragliche Allergen spezifischen Antikörper enthält. Geeignet sind dazu z. B. Seren von Nichtallergikern. Durch Vergleich der für die beiden Proben erhaltenen Werte kann dann die Konzentration des allergenspezifischen Antikörpers in der Probe bestimmt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren einstufig durchgeführt. Dabei werden bevorzugt in einem Reaktionsgefäß, das an eine Festphase gebunden einen Partner eines spezifisch bindenden Paares enthält, die Probe zusammen mit den Rezeptoren R ₂ und R ₃ inkubiert. Dabei binden die in der Probe vorhandenen allergenspezifischen Antikörper an das zugegebene Allergen. Weiterhin binden die Rezeptoren R ₂ und R ₃ jeweils an den Fc-Teil des zu bestimmenden allergenspezifischen Antikörpers. Die Konzentration der beiden Rezeptoren R ₂ und R ₃ wird so gewählt, daß gewähr leistet ist, daß an jedem Allergenkomplex genügend R ₃ und R ₂ gebunden wird, um einerseits die Festphasen bindung zu sichern und andererseits ausreichend spezi fisch gebundenen R ₂ für die Nachweisreaktion zur Verfü gung zu haben. Dies bedeutet, daß R ₂ weder in einem großen Überschuß, noch in einem großen Unterschuß gegenüber R ₃ vorhanden sein darf. Das optimale Verhält nis von R ₂ zu R ₃ kann experimentell über die Optimierung des Meßsignals ermittelt werden. Das Verhältnis von R ₂ zu R ₃ liegt vorzugsweise im Bereich von 1:1.

Besonders bevorzugt wird für diese Verfahrensvariante als Rezeptor R ₃ ein Konjugat aus dem Anti-IgE- bzw. Anti-IgG-Antikörper und einem Bindungspartner eines spezifisch bindenden Paares verwendet. Die Reaktion zwischen Allergen, zu bestimmendem Antikörper und den Rezeptoren R ₂ und R ₃ verläuft dann praktisch in homo gener Phase. Entweder liegt der andere Bindungspartner an die Festphase gebunden vor, so daß die Reaktion mit dem an der Festphase gebundenen Bindungspartner sehr viel langsamer stattfindet oder nach beendeter Reaktion wird eine Substanz zugegeben, die sowohl mit dem an der Festphase gebundenen Bindungspartner als auch mit dem Bindungspartner des Rezeptors R ₃ bindefähig ist, um die gebildeten Allergen-Antikörper-Komplexe zu immobilisieren. Die Auswertung erfolgt dann in an sich bekannter Weise über die gebundene Markierung.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können allergen spezifische Antikörper in Körperflüssigkeiten genau und spezifisch nachgewiesen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert darüber hinaus die Möglichkeit, die zur Hyposensibilisierung oder zum Provokationstest verwendeten Allergene patientenspezifisch zu testen und zu standardisieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung von allergenspezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen Rezeptor R ₁, der ein mit dem zu bestimmen den Antikörper spezifisches Allergen ist und einen Rezeptor R ₂, der ein Konjugat aus einem gegen den Fc-Teil von IgE oder IgG gerichteten Antikörper und einer Markierung ist, physikalisch voneinander getrennt enthält.

Mit diesem Reagenz kann das Verfahren zur Bestimmung eines allergenspezifischen Antikörpers für jedes Allergen, das dem Arzt zur Verfügung steht, durchgeführt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Reagenz noch einen weiteren Rezeptor R ₃, der einen gegen den Fc-Teil in IgE oder IgG gerichteten Antikörper enthält und die Bindung an die feste Phase vermittelt.

Die Erfindung wird durch die Figur und die folgenden Beispiele erläutert.

Fig. 1a zeigt ein Schema für das Reaktionsprinzip einer bevorzugten Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Verfahrens. Nach Umsetzung einer Probelösung mit 3 Rezeptoren R ₁, R ₂ und R ₃, von denen R ₁ das mit dem zu bestimmenden allergenspezifischen Antikörper spezifische Allergen ist, R ₂ ein Konjugat aus einem gegen den Fc-Teil von IgE bzw. IgG gerichteten Antikörper und einer Markierung und R ₃ ein die Bindung an die Festphase vermittelnder Rezeptor, der einen gegen den Fc-Teil von IgE bzw. IgG gerichteten Antikörper enthält, ist, bildet sich der dargestellte Komplex. An das Allergen 1 sind die in der Probelösung enthal tenen, zu bestimmenden allergenspezifischen Antikörper 3 gebunden. Die Immobilisierung erfolgt über an den Fc-Teil eines allergen spezifischen Antikörpers gebundene Rezeptoren 5, die an eine Festphase 7 gebunden sind. An die übrigen allergenspezifischen Antikörper 3 sind markierte Rezeptoren 9 gebunden.

Fig. 1b zeigt ein Schema für das Reaktionsprinzip einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Nach Umsetzung einer Probelösung mit 3 Rezeptoren R ₁, R ₂ und R ₃, von denen R ₁ das mit dem zu bestimmenden allergenspezifischen Antikörper spezifische Allergen ist, R ₂ ein Konjugat aus einem gegen den Fc-Teil von IgE bzw. IgG gerichteten Antikörper und einer Markierung und R ₃ ein Konjugat aus einem gegen den Fc-Teil von IgE bzw. IgG gerichteten Antikörper und Biotin ist, in Gegenwart einer Festphase, an der Biotin gebunden ist, bildet sich der darge stellte Komplex. An das Allergen 1 sind die in der Probelösung enthaltenen, zu bestimmen den allergenspezifischen Antikörper 3 gebun den, an die wiederum Rezeptoren R ₂ 9 und R ₃ 5 gebunden sind. Die Immobilisierung erfolgt durch Zugabe von Streptavidin 11, das dann den gebildeten Komplex über die Bindung mit dem in R ₃ enthaltenen Biotin und dem an der Festphase gebundenen Biotin fixiert.

Die beiden in den Beispielen erwähnten monoklonalen Antikörper gegen humanes IgE sind bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, GB hinterlegt unter folgenden Bezeichnungen:
MAK 323 : ECACC 88022505
MAK 748 : ECACC 88022506.

Beispiel 1

Es wurden monoklonale Maus-Antikörper gegen humanes Immunglobulin E hergestellt.

Balb/c-Mäuse wurden mit humanem IgE (100 µg in 0,3 ml komplettem Freund′schem Adjuvans) intraperitoneal pri mär immunisiert. In vier- bis sechswöchigen Abständen wurde die Immunisierung mit je 50 µg IgE in 0,2 ml inkomplettem Freund′schem Adjuvans intraperitoneal und einmal mit 50 µg IgG in 0,2 ml physiologischer Koch salzlösung intravenös verstärkt.

Am Tag vor der Fusion wurden die Balb/c-Mäuse durch cervicale Dislokation getötet. Unter sterilen Bedin gungen wurden 4 bis 5 ml PBS in die Bauchhöhle ge spritzt und nach einer Minute wieder abgesaugt. Die ausgespülten Zellen wurden in DMEM gewaschen und in DMEM-Vollmedium in einer Dichte von 5×10⁴ pro Einzel tüpfel auf 24 Tüpfelkulturplatten verteilt.

Einer immunisierten Maus wurde unter aseptischen Bedin gungen die Milz entnommen. Das Milzgewebe wurde zer schnitten und die freigesetzten Zellen in DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) suspendiert (ca. 5×10⁷ Zellen). Zu der Zellsuspension wurden 5×10⁷ Zel len der Maus-Myelom-Linie Ag8.653, die unter der Be zeichnung CRL-1580 bei ATCC erhältlich ist, gegeben. Das Zellgemisch wurde durch Zentrifugation sedimentiert und die überstehende Flüssigkeit vollständig abgesaugt. Zu dem Zellsediment wurden 0,8 ml einer 50%igen PEG- Lösung (Polyethylenglykol) bei 37°C zugegeben und eine Minute lang gleichmäßig verteilt und anschließend 5 ml DMEM bei Raumtemperatur zugegeben und 5 Minuten lang gleichmäßig verteilt. Nach Zugabe von weiteren 20 ml DMEM wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimen tiert, in 96 ml frischem DMEM Vollmedium (DMEM +15% phoetales Kälberserum + Glutamin + Pyruvat) resuspen diert und auf 4×24 Tüpfelkulturplatten verteilt, die mit Maus-Bauchhöhlen-Makrophagen vorbeschickt worden waren. Die Kulturen wurden am 2., 3., 5., 7., 10. und 12. Tag mit HAT-DMEM-Vollmedium (DMEM-Vollmedium, das 4×10^-7 M Aminopterin, 1×10^-4 M Thymidin und 3×10^-5 M Hypoxanthin enthält) gefüttert.

Mikrotiterplatten wurden mit Anti-Maus-Ig vom Schaf (10 µg/ml 0,9%ige NaCl-Lösung; 150 µl Antikörperlösung pro Tüpfel) beschichtet und nach einer Stunde bei Raum temperatur dreimal mit einer Lösung, die 1% RSA und 0,9% NaCl enthielt, gewaschen. Je 100 µl Kulturüber stand wurden in die beschichteten Tüpfel pipettiert und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Absaugen der Überstände wurden die Tüpfel mit 100 µl einer Lösung, die ein Konjugat aus IgE und Peroxidase ent hielt und der 100 µg humanes IgG/ml zugemischt worden waren, beschickt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden je 100 µl ABTS-Lösung, das als Substrat diente, pipettiert und die Farbentwicklung nach 20minütiger Reaktionszeit photometrisch bestimmt.

Hybridomzellen aus Primärkulturen wurden getrennt in Suspension gebracht (ca. 1×10⁵/ml DMEM) und mittels eines Zellsorters auf 4×24 Zellkulturplatten, deren Tüpfel mit DMEM-Vollmedium und 10³ pro Tüpfel Maus- Makrophagen vorbeschickt waren, so ausgesät, daß in jeden Tüpfel nur eine Hybridomzelle gelangte. Pro Zell kulturplatte wuchsen 20 bis 60% der Tüpfel-Hybridom klone aus.

Ab dem 14. Tag nach der Fusion war in allen 96 Teilkul turen Hybridomwachstum erkennbar. 12 Teilkulturen, deren Überstände bei der Überprüfung im Anti-IgE-Elisa deutlich positive Reaktionen ergaben, wurden auf ca. 5×10⁶ Zellen expandiert und über den Cytofluorograph durch Einzelzellablage kloniert. Die Überstände von heranwachsenden Klonen wurden erneut auf ihren Gehalt an Anti-IgE im Elisa geprüft. Ca. 40 Klone mit posi tiver Reaktion wurden durch Kryopräservation in flüs sigem N₂ gesichert. Die Antikörper von 23 Einzelklonen wurden auf ihre Feinspezifität durch Elisa untersucht. Die Antikörper aller 23 Klone reagierten mit humanem IgE, nicht aber mit menschlichem IgG, IgA, IgM oder IgD und auch nicht mit anderen Bestandteilen im menschlichen Blutplasma.

Beispiel 2

Im Serum eines Allergikers wurde die Menge an Antikör pern gegen Katzenepithelien untersucht. Dazu wurden die folgenden Reagenzien verwendet:

Konjugatpuffer:
0,1 M Tris-HCl, pH 7,6,
0,04 M KCl,
0,2% RSA (Rinderserumalbumin)
3,0% Polyethylenglykol (PEG) 40 000
0,02% Dimethyl-aminoantipyrin,
0,01% Merthiolat.

Inkubationspuffer:
0,1 M Tris-HCl, pH 7,6,
0,04 M KCl,
0,2% RSA,
3,0% PEG 40 000,
0,01% Merthiolat.

Waschlösung:
0,9% NaCl-Lösung,
1,6% Zusatz (Proteine, Detergenz).

Es wurde das Serum eines Allergikers RAST-Klasse 3 sowie ein Nichtallergiker-Serum verwendet. Je 500 µl Serum wurden eine Stunde bei Raumtemperatur in Lurantubes, die mit gemäß Beispiel 1 erhaltenem monoklonalem Antikörper gegen IgE (MAK M 323, ECACC 88022505) beschichtet waren, inkubiert. Es wurde dreimal mit Waschlösung gewaschen. Anschließend wurden 500 µl einer Lösung von Katzenepi thelien Nummer 240A/86 (Allergopharm, Ch. 025969) in einer Verdünnung von 1:100 in Inkubationspuffer zuge geben und 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde dreimal mit Waschlösung gewaschen. Es wurden jeweils weitere 500 µl Serum zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und danach dreimal mit Waschlösung gewaschen. Dann wurden 500 µl einer Lösung, die 100 mU/ml eines Konjugats aus dem Fab-Fragment des gemäß Beispiel 1 erhaltenen monoklo nalen Antikörpers gegen IgE MAK M 323 und β-Galactosi dase (50 U/ml) verdünnt in Konjugatpuffer enthielt, zugegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur inku biert. Anschließend wurde dreimal mit Waschlösung gewaschen. Zur Bestimmung der gebundenen Markierung wurden 500 µl Chlorphenolrot-Galactosid 50 mM zugegeben und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Extinktion wurde dann bei 550 nm gegen den Substratleerwert gemessen. Zur Bestinmung der unspezifischen Bindung wird der Test mit Serum durchgeführt, wobei jedoch statt mit Allergen mit Inkubationspuffer inkubiert wird.

Für die Inkubation mit Inkubationspuffer wurde eine Extinktionsdifferenz Δ E von 0,276 gemessen. Die Extink tionsdifferenz für die Inkubation mit der Allergenlö sung Δ E war gleich 0,435. Damit betrug die Differenz zwischen beiden Werten, die der Bindung von allergen spezifischen Antikörpern zuzuschreiben ist, 0,159 E. Bei der Auswertung des Nichtallergikerserums ergab sich kein Anstieg der Extinktion gegenüber der Inkubation mit Inkubationspuffer statt Allergen.

Beispiel 3

Wie im Beispiel 2 beschrieben, wurde eine Antikörperbe stimmung gegen Katzenepithelien durchgeführt, wobei an stelle von MAK M 323 der MAK 7H8 (ECACC 88022506) ver wendet wurde.

Dabei wurde für die Inkubation mit Inkubationspuffer Δ E=0,460, für die Inkubation mit der Allergenlösung Δ E=0,599 gemessen. Die Differenz, die der Bindung von allergenspezifischen Antikörpern zuzuschreiben ist betrug Δ E=0,139. Bei der Auswertung des Nichtallergi kerserums ergab sich wie im Beispiel 2 kein Extink tionsanstieg.

Beispiel 4

Es wurde die Menge an allergenspezifischen Antikörpern in einem Humanserum bestimmt, wobei das Testverfahren einstufig durchgeführt wurde.

Für die Durchführung wurden als Konjugatpuffer und In kubationspuffer Lösungen verwendet, die dieselbe Zu sammensetzung wie im Beispiel 2 hatten. Als Waschlösung wurde eine Lösung, die 0,025% NaCl und 1 mg/l Kupfer sulfat enthielt, verwendet. Die Inkubation erfolgte in Tubes, die mit Thermo-RSA und Streptavidin beschichtet waren. Die Beschichtung erfolgte wie in DE 36 40 412 beschrieben. Die Beladekonzentration betrug 10 000 µg/ml.

Je 100 µl Serum (Allergikerserum RAST-Klasse 3; Nicht allergikerserum) wurden mit 150 µl Inkubationspuffer und 250 µl eines Lösung von Katzenepithelien Nr. 240A/86 Allergopharm, Ch. 025969 (Verdünnung 1 : 100 in Inkubations puffer) eine Stunde bei Raumtemperatur in Thermo-RSA- Streptavidintubes inkubiert. Eine Lösung eines Konjuga tes aus dem Fab-Fragment des gemäß Beispiel 1 erhalte nen Antikörpers M323 und aus Peroxidase mit 300 U/ml in Konjugatpuffer wurde mit einer Lösung des gemäß Bei spiel 1 erhaltenen Antikörpers M323 in biotinylierter Form mit einer Konzentration von 0,5 µg/ml in Inkubations puffer 1 : 1 gemischt und 500 µl dieser Mischung wurden in die Thermo-RSA-Streptavidintubes pipettiert und 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde dreimal mit Waschlösung gewaschen. Zur Auswertung wurden 1000 µl ABTS-Lösung (1,9 mmol/l) als Substrat zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion wurde bei 405 nm gegen den Substratleer wert gemessen.

Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung wurde der Test wie oben beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch statt Allergen Inkubationspuffer verwendet wurde. Die folgenden Extinktionsdifferenzen wurden erhalten:

Beispiel 5

Es wurde eine Bestimmung allergenspezifischer Antikör per unter Verwendung von Latexpartikeln als fester Phase durchgeführt.

Als Inkubationspuffer wurde eine Lösung, die 0,1 M Tris HCl, pH 7,5; 0,04 M KCl; 3% PEG 6000 und 0,5% Pluronic F 68 enthielt, verwendet.

Zur Beschichtung der als Markierung verwendeten Latex partikel wurden Antikörper, die gemäß Beispiel 1 erhal ten worden waren, in 5 ml 15 mM Imidazolpuffer, pH 7,5, der 20 mM NaCl enthielt, zu 0,5 mg/ml angelöst. Nach Zugabe von 180 µl Latexsuspension wurde 2 Stunden bei 4°C gerührt. Anschließend wurde 40 Minuten zentrifugiert und der Überstand in 50 mM Glycinpuffer +0,15% Tween 20 resuspendiert. Der Waschvorgang wurde dreimal wiederholt, wobei beim zweiten und dritten Waschen kein Tween 20 mehr verwendet wurde. Nach Beendigung des dritten Waschschrittes wurde der Niederschlag in 1,7 ml 200 mM Glycinpuffer aufgenommen. Man erhielt eine Suspension, die 1% Latexpartikel enthielt.

10 µl Allergikerserum RAST-Klasse 3 und 50 µl einer Lösung von Katzenepithelien Nr. 240A/86 Allergopharm Ch. 025969, die 1:10 000 in Inkubationspuffer verdünnt war, wurden direkt in eine Küvette pipettiert und zusammen bei 37°C 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 20 µl der Latexsuspension zugegeben. Nach Zugabe von 920 µl Inkubationspuffer wurde die Extinktion bei 623 nm bei 37°C im Spektralphotometer gemessen. Jede Küvette wurde im Zyklus von einer Minute 15 Minuten lang gemessen.

Zur Bestimmung unspezifischer Agglutinationen wurde der Test, wie oben beschrieben, durchgeführt, wobei statt Serum Inkubationspuffer verwendet wird. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von allergenspezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten nach dem Prin zip des Immunoassays durch Inkubation mit minde stens zwei Rezeptoren R ₁ und R ₂, die mit dem zu bestimmenden Antikörper bindefähig sind, wobei R ₂ eine Markierung trägt, Trennung der festen von der flüssigen Phase und Messung der Markierung in einer der beiden Phasen, dadurch gekennzeichnet, daß man als R ₁ das mit dem zu bestimmenden Antikörper spezifisch bindefähige Allergen und als R ₂ ein Konjugat aus einem gegen den Fc-Teil von IgE oder IgG gerich teten Antikörper und einer Markierung verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die den zu bestimmenden Antikörper enthaltende Probe mit einem weiteren Rezeptor R ₃ inkubiert, der die Bindung an die feste Phase vermittelt und ein gegen den Fc-Teil von IgE oder IgG gerichteter Antikörper ist, der in geeigneter Weise derivati siert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als R ₃ ein gegen den Fc-Teil von IgE oder IgG gerichteter Antikörper, der an eine Festphase gebunden ist, verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als R ₃ ein Konjugat aus einem gegen den Fc-Teil von IgE oder IgG gerichteter Antikörper und einem Partner eines spezifisch bindenden Paares verwendet, wobei die Immobilisierung dann in einem weiteren Inku bationsschritt über den zweiten Partner des spe zifisch bindenden Paares erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der für R ₃ verwendete Antikörper ein Antikör per ist, dessen Paratop mit solchen Epitopen des Fc-Teils von IgE- bzw. IgG-Antikörpers bindet, daß eine Bindung eines weiteren Rezeptors R ₂ an den Fc-Teil unmöglich gemacht ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß R ₂ und R ₃ denselben Antikörper enthalten.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Inkubation der Probe mit R ₃ vor In kubation der Probe mit R ₂ der Lösung Fc-Fragmente von Anti-IgE- bzw. -IgG-Antikörpern zusetzt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zuerst R ₃ mit einem Teil der Probe, an schließend mit R ₁ dann mit dem Rest der Probe und mit R ₂ inkubiert.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor R ₂ als Markierung ein Enzym, eine fluoreszierende, chemilumineszierende oder radio aktive Substanz aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierung für den Rezeptor R ₂ partikuläre agglu tinierbare Träger verwendet.

11. Reagenz zur Bestimmung von allergenspezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Rezeptor R ₁, der ein für den zu bestimmenden Anti körper spezifisches Allergen ist und einen Rezep tor R ₂, der ein Konjugat aus einem gegen den Fc-Teil von IgE oder IgG gerichteten Antikörper und einer Markierung ist, enthält.

12. Reagenz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter hin einen Rezeptor R ₃ enthält, der einen gegen den Fc-Teil von IgE oder IgG gerichteten Antikörper enthält und die Bindung an die feste Phase vermit telt.