JP2888526B2 - 抗体のサンドイッチイムノアッセイ法 - Google Patents
抗体のサンドイッチイムノアッセイ法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、コーティング抗原または標識抗原を用い
た、抗体の検出のためのサンドイッチイムノアッセイを
行うための方法に関する。この場合、コーティング抗原
および標識抗原は遺伝的に関連性を有さない生物（「異
なる生物種」）から産生されたものである。さらに詳し
くは、本発明は、哺乳動物流体または組織中のある種の
抗原（「Ｘ」）に対する抗体を検出するための固相法お
よび装置に関するものであり、その際、検出しようとす
る抗体は、固相に結合した抗原「Ｘ」と、異なる生物種
に由来し標識を結合させた抗原「Ｘ」またはその共通の
エピトープとの間にサンドイッチにはさまれる。本発明
の方法および装置は、医師または獣医師が、患者が特定
の生物または抗原に対し免疫応答を有するか否かを速や
かにかつ特異的に決定することができ、それによってそ
の生物または抗原に過去もしくは現在にさらされている
ことを示すことができるので、試験所医学に有用であ
る。とりわけ本発明の方法および装置は、後天性免疫不
全症候群（AIDS）と関連するHTLV IIIに対する免疫応
答、従ってそれへの接触を速やかにかつ特異的に検出す
るのに有用である。
た、抗体の検出のためのサンドイッチイムノアッセイを
行うための方法に関する。この場合、コーティング抗原
および標識抗原は遺伝的に関連性を有さない生物（「異
なる生物種」）から産生されたものである。さらに詳し
くは、本発明は、哺乳動物流体または組織中のある種の
抗原（「Ｘ」）に対する抗体を検出するための固相法お
よび装置に関するものであり、その際、検出しようとす
る抗体は、固相に結合した抗原「Ｘ」と、異なる生物種
に由来し標識を結合させた抗原「Ｘ」またはその共通の
エピトープとの間にサンドイッチにはさまれる。本発明
の方法および装置は、医師または獣医師が、患者が特定
の生物または抗原に対し免疫応答を有するか否かを速や
かにかつ特異的に決定することができ、それによってそ
の生物または抗原に過去もしくは現在にさらされている
ことを示すことができるので、試験所医学に有用であ
る。とりわけ本発明の方法および装置は、後天性免疫不
全症候群（AIDS）と関連するHTLV IIIに対する免疫応
答、従ってそれへの接触を速やかにかつ特異的に検出す
るのに有用である。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 抗体の検出のためのたいていのイムノアッセイでは、
抗原でコーティングした固相を、該コーティング抗原に
特異的な抗体を捕捉するために用いている。捕捉した抗
体は、ついで酵素や放射性同位体のような検出システム
が結合した抗抗体を用いて定量および／または同定す
る。
抗原でコーティングした固相を、該コーティング抗原に
特異的な抗体を捕捉するために用いている。捕捉した抗
体は、ついで酵素や放射性同位体のような検出システム
が結合した抗抗体を用いて定量および／または同定す
る。
第二のタイプのイムノアッセイもまた抗原でコーティ
ングした固相を用い、抗原特異的抗体を捕捉する。しか
しながら、第一のタイプのイムノアッセイと違って、こ
の第二のタイプのイムノアッセイは、検出システムとし
て働く放射標識や酵素と交差反応する抗原を用いて定量
および／または同定を行う。この第二のタイプのイムノ
アッセイにおいて、ビーズにコーティングした抗原と標
識を有する抗原とは共に同一であり、同じ生物種に由来
するものであり、同じ汚染物質を含んでいる。以下の記
載において、同じ生物または関連種から得られた抗原は
「同種」抗原と称することにする。
ングした固相を用い、抗原特異的抗体を捕捉する。しか
しながら、第一のタイプのイムノアッセイと違って、こ
の第二のタイプのイムノアッセイは、検出システムとし
て働く放射標識や酵素と交差反応する抗原を用いて定量
および／または同定を行う。この第二のタイプのイムノ
アッセイにおいて、ビーズにコーティングした抗原と標
識を有する抗原とは共に同一であり、同じ生物種に由来
するものであり、同じ汚染物質を含んでいる。以下の記
載において、同じ生物または関連種から得られた抗原は
「同種」抗原と称することにする。
たとえば、HTLV IIIに対する抗体（抗HTLV III）を検
出するために現在行なわれているイムノアッセイでは広
範囲の試料希釈を必要とし、固相をコーティングするた
めにヒトH9細胞株から精製したウイルスを用い、最後に
非特異的プローブを用いる（たとえば抗ヒトIgG、西洋
ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）に結合）。これらのイ
ムノアッセイにおいては、粉砕ウイルスでコーティング
した固相に未知の試料を接触させて抗HTLV IIIの存在に
関しスクリーニングする。HTLV IIIに対する抗体は、つ
いでウイルスをコーティングした固相に結合する。粉砕
ウイルスは多くの抗原を生じさせ、これらが固相上にコ
ーティングされるので、試料中の抗体のうち粉砕ウイル
ス調製物中の汚染物質に対して反応性のものすべてもま
たコーティング固相に結合するであろう。一担抗体が固
相に結合すると、プローブとして標識抗体（第一のタイ
プのイムノアッセイ）を用いようが標識同種抗原（第二
のタイプのイムノアッセイ）を用いようが、有為の数の
「偽陽性」を生じてしまうであろう。
出するために現在行なわれているイムノアッセイでは広
範囲の試料希釈を必要とし、固相をコーティングするた
めにヒトH9細胞株から精製したウイルスを用い、最後に
非特異的プローブを用いる（たとえば抗ヒトIgG、西洋
ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）に結合）。これらのイ
ムノアッセイにおいては、粉砕ウイルスでコーティング
した固相に未知の試料を接触させて抗HTLV IIIの存在に
関しスクリーニングする。HTLV IIIに対する抗体は、つ
いでウイルスをコーティングした固相に結合する。粉砕
ウイルスは多くの抗原を生じさせ、これらが固相上にコ
ーティングされるので、試料中の抗体のうち粉砕ウイル
ス調製物中の汚染物質に対して反応性のものすべてもま
たコーティング固相に結合するであろう。一担抗体が固
相に結合すると、プローブとして標識抗体（第一のタイ
プのイムノアッセイ）を用いようが標識同種抗原（第二
のタイプのイムノアッセイ）を用いようが、有為の数の
「偽陽性」を生じてしまうであろう。
従って、本発明の目的は、特異性を有する、すなわち
上記「偽陽性」の問題を克服した、抗HTLV IIIを検出お
よび／または定量するためのイムノアッセイ法および装
置を提供することにある。
上記「偽陽性」の問題を克服した、抗HTLV IIIを検出お
よび／または定量するためのイムノアッセイ法および装
置を提供することにある。
イムノアッセイとは違って、特異性の問題の幾つかを
克服する競合結合アッセイが存在する。たとえば、抗HT
LV IIIについての競合タンパク質結合アッセイでは組換
え抗原を用い、HTLV IIIエンベロープ（ENV）抗原およ
びHTLV IIIコア抗原に対する抗体を互いに区別すること
ができる。しかしながら、この方法は時間がかかり、一
般に一晩かかって行なわれる。しかも、これには２つの
固相、すなわちp41エンベロープ抗原をコーティングし
たビーズおよびp24コア抗原をコーティングしたビーズ
が必要である。
克服する競合結合アッセイが存在する。たとえば、抗HT
LV IIIについての競合タンパク質結合アッセイでは組換
え抗原を用い、HTLV IIIエンベロープ（ENV）抗原およ
びHTLV IIIコア抗原に対する抗体を互いに区別すること
ができる。しかしながら、この方法は時間がかかり、一
般に一晩かかって行なわれる。しかも、これには２つの
固相、すなわちp41エンベロープ抗原をコーティングし
たビーズおよびp24コア抗原をコーティングしたビーズ
が必要である。
従って、本発明の目的とするところは、アッセイが速
やかに行なわれるのみならず、２つの固相を必要とする
ことなく競合結合アッセイの特異性をも有する、抗HTLV
IIIに対するイムノアッセイを提供することである。
やかに行なわれるのみならず、２つの固相を必要とする
ことなく競合結合アッセイの特異性をも有する、抗HTLV
IIIに対するイムノアッセイを提供することである。
（課題を解決するための手段） 本発明は、試験試料中の特定の抗原に対する抗体を検
出するためのサンドイッチイムノアッセイを行う方法で
あって、検出しようとする抗体に特異的な第一の抗原を
固相上に固定化し、試験試料中の検出しようとする抗体
を該第一の抗原に結合させることによって固定化し、さ
らに該固定化された抗体を標識を有する第二の抗原と結
合させる際に、該第二の抗原を該第一の抗原とは異なる
生物種に由来するものとすることを特徴とする方法に関
する。
出するためのサンドイッチイムノアッセイを行う方法で
あって、検出しようとする抗体に特異的な第一の抗原を
固相上に固定化し、試験試料中の検出しようとする抗体
を該第一の抗原に結合させることによって固定化し、さ
らに該固定化された抗体を標識を有する第二の抗原と結
合させる際に、該第二の抗原を該第一の抗原とは異なる
生物種に由来するものとすることを特徴とする方法に関
する。
とりわけ本発明は、試験試料中の抗原特異的抗体の検
出方法であって、 （ａ）検出しようとする抗体に特異的な第一の組換え体
由来抗原を固相上に固定化し、 （ｂ）工程（ａ）で得た固相を、抗原特異的抗体を含ん
でいるかまたは含んでいると思われる水相試験試料と接
触させ、 （ｃ）工程（ｂ）で得た固相を、標識を付着した第二の
組換え体由来抗原を含む水相と接触させ、その際、該第
二の組換え体由来抗原は該第一の組換え体由来抗原とは
異なる由来とし、 （ｄ）水相を固相から分離させ、ついで （ｅ）固相上または液相中に存在する標識を測定して試
験試料中に存在する抗体を検出および／または滴定する ことを特徴とする方法に関する。
出方法であって、 （ａ）検出しようとする抗体に特異的な第一の組換え体
由来抗原を固相上に固定化し、 （ｂ）工程（ａ）で得た固相を、抗原特異的抗体を含ん
でいるかまたは含んでいると思われる水相試験試料と接
触させ、 （ｃ）工程（ｂ）で得た固相を、標識を付着した第二の
組換え体由来抗原を含む水相と接触させ、その際、該第
二の組換え体由来抗原は該第一の組換え体由来抗原とは
異なる由来とし、 （ｄ）水相を固相から分離させ、ついで （ｅ）固相上または液相中に存在する標識を測定して試
験試料中に存在する抗体を検出および／または滴定する ことを特徴とする方法に関する。
さらに本発明は、記載した方法および装置の変更にも
関するものであって、コーティング抗原と標識抗原とは
異なる生物種に由来するものであるが、少なくとも１個
の抗原決定基（「エピトープ」）を共通に有している限
り必ずしも同一であることを必要としないものに関す
る。
関するものであって、コーティング抗原と標識抗原とは
異なる生物種に由来するものであるが、少なくとも１個
の抗原決定基（「エピトープ」）を共通に有している限
り必ずしも同一であることを必要としないものに関す
る。
（発明の構成および効果） 本発明は、生物学的流体を含む試験試料中の抗原特異
的抗体を検出するためのイムノアッセイを行う方法に関
する。
的抗体を検出するためのイムノアッセイを行う方法に関
する。
本明細書にいう「イムノアッセイ」とは、最終的に標
識に結合した分析対象物の量を直接測定することにより
分析対象物を検出または定量する方法を意味する。この
イムノアッセイは、競合タンパク質アッセイとは区別さ
れなければならず、後者では、分析対象物の検出または
定量が、生物学的流体からの非標識分析対象物により結
合部位から競合的に置換された標識分析対象物の量に関
係付けられる。
識に結合した分析対象物の量を直接測定することにより
分析対象物を検出または定量する方法を意味する。この
イムノアッセイは、競合タンパク質アッセイとは区別さ
れなければならず、後者では、分析対象物の検出または
定量が、生物学的流体からの非標識分析対象物により結
合部位から競合的に置換された標識分析対象物の量に関
係付けられる。
本明細書において「生物学的流体」とは、全血、血
清、血漿、尿、だ液、髄液（CSF）、羊水、組織抽出物
およびそれらの希釈物または濃縮物などのような哺乳動
物に由来する流体をいう。
清、血漿、尿、だ液、髄液（CSF）、羊水、組織抽出物
およびそれらの希釈物または濃縮物などのような哺乳動
物に由来する流体をいう。
本発明のイムノアッセイ装置および方法では固相およ
び標識の両方を用いる。
び標識の両方を用いる。
本明細書において「固相」とは、抗原を共有結合手段
または非共有結合手段により付着させることのできる表
面を有するすべての非溶液相物質をいう。共有結合手段
による付着は、一般に、（ｉ）臭化シアンなどのハロゲ
ン化シアンや（ii）グルタールアルデヒドを用いること
によるような、技術の分野でよく知られた試薬を用いた
付着手段をいう。非共有結合手段による付着とは、吸収
または吸着をいう。いかなる非共有結合手段で抗原を付
着させることも本発明の範囲に含まれるものであるが、
とりわけ本発明の抗原を本発明の固相に吸着により付着
させることが好ましい。
または非共有結合手段により付着させることのできる表
面を有するすべての非溶液相物質をいう。共有結合手段
による付着は、一般に、（ｉ）臭化シアンなどのハロゲ
ン化シアンや（ii）グルタールアルデヒドを用いること
によるような、技術の分野でよく知られた試薬を用いた
付着手段をいう。非共有結合手段による付着とは、吸収
または吸着をいう。いかなる非共有結合手段で抗原を付
着させることも本発明の範囲に含まれるものであるが、
とりわけ本発明の抗原を本発明の固相に吸着により付着
させることが好ましい。
本発明に用いることのできる固相の例としては、プラ
スチック、ガラスまたはラテックスの微粒子またはビー
ズ；プラスチックまたはガラスの試験管；セルロースま
たは修飾セルロース物質；ガラスまたはプラスチックの
繊維状物質などが挙げられる。固相物質として特に適し
たプラスチックの例はポリスチレンである。固相は、試
験管、マイクロタイターウエルなどのような反応容器中
に適合するに充分な大きさを有するポリスチレンビーズ
であるのが最も好ましい。
スチック、ガラスまたはラテックスの微粒子またはビー
ズ；プラスチックまたはガラスの試験管；セルロースま
たは修飾セルロース物質；ガラスまたはプラスチックの
繊維状物質などが挙げられる。固相物質として特に適し
たプラスチックの例はポリスチレンである。固相は、試
験管、マイクロタイターウエルなどのような反応容器中
に適合するに充分な大きさを有するポリスチレンビーズ
であるのが最も好ましい。
本明細書において「標識」とは、シグナルを生じるこ
とができるか、または検出可能な分子種を生じるように
他の分子に対し挙動することのできるものであれば、抗
原に結合したいかなる分子または元素同位体をもいうも
のとする。「シグナルを生じることができる」分子と
は、125Iなどの放射性同位体、フルオレセイン、フルオ
レセイン類似体、フルオレセイン誘導体、フィコビリン
タンパク質、ウンベリフェロン、およびウンベリフェロ
ン類似体および誘導体などの蛍光物質をいう。「検出可
能な分子種を生じるように他の分子に対し挙動すること
のできる」分子とは、技術の分野で知られた種々の酵素
をいい、基質に直接作用するか、または基質に作用する
他の酵素と共役して発色団、すなわち器具によりまたは
視覚により検出することができる蛍光分子を生じる。
とができるか、または検出可能な分子種を生じるように
他の分子に対し挙動することのできるものであれば、抗
原に結合したいかなる分子または元素同位体をもいうも
のとする。「シグナルを生じることができる」分子と
は、125Iなどの放射性同位体、フルオレセイン、フルオ
レセイン類似体、フルオレセイン誘導体、フィコビリン
タンパク質、ウンベリフェロン、およびウンベリフェロ
ン類似体および誘導体などの蛍光物質をいう。「検出可
能な分子種を生じるように他の分子に対し挙動すること
のできる」分子とは、技術の分野で知られた種々の酵素
をいい、基質に直接作用するか、または基質に作用する
他の酵素と共役して発色団、すなわち器具によりまたは
視覚により検出することができる蛍光分子を生じる。
本明細書において「発色団」とは、電磁スペクトルに
おいて約340nm〜約720nmに吸収ピークを有する分子をい
う。
おいて約340nm〜約720nmに吸収ピークを有する分子をい
う。
本明細書において好ましい標識は、放射性同位体およ
び酵素である。とりわけ放射性同位体の125Iを標識とし
て用いるのが好ましい。
び酵素である。とりわけ放射性同位体の125Iを標識とし
て用いるのが好ましい。
本明細書において「プローブ」とは、抗体が結合する
ことができ、化学的方法もしくは組換え技術により標識
を共有結合的に付着させた異種の抗原、エピトープまた
はハプテンをいう。
ことができ、化学的方法もしくは組換え技術により標識
を共有結合的に付着させた異種の抗原、エピトープまた
はハプテンをいう。
本発明のイムノアッセイは、２工程手順かまたは１工
程手順で行うことができる。
程手順で行うことができる。
２工程手順においては、第一の工程は、一つの生物源
に由来する抗原をコーティングした固相を、該抗原に対
する未知の量の抗体を含有する水相試験試料とともにイ
ンキュベートすることからなる。該抗原に対する抗体
は、その２個の結合部位のうちの一つを介してコーティ
ング抗原に結合し、固相の一部（「固相抗体」）とな
る。第二の工程では固相をまず洗浄し、ついで標識抗原
を含有する水相とともにインキュベートする。その場
合、標識抗原は、固相をコーティングしている抗原とは
異なる生物種に由来するものである。インキュベートの
間に異なる生物種に由来する標識抗原（プローブ）は、
抗体の第二の抗原結合部位を介して水相から固相に捕捉
される。その後、水相中の未反応試薬と固相とを分離す
る。標識の存在は、固相中かまたは液相中かで任意に測
定する。試験試料中に存在する抗体の量は、固相に結合
した標識抗原の量および水相中に残っている標識抗原の
量の両方に数学的に関連付けられる。しかしながら、試
験試料中の抗体の存在または量を決定するのに固相を利
用するのが好ましい。
に由来する抗原をコーティングした固相を、該抗原に対
する未知の量の抗体を含有する水相試験試料とともにイ
ンキュベートすることからなる。該抗原に対する抗体
は、その２個の結合部位のうちの一つを介してコーティ
ング抗原に結合し、固相の一部（「固相抗体」）とな
る。第二の工程では固相をまず洗浄し、ついで標識抗原
を含有する水相とともにインキュベートする。その場
合、標識抗原は、固相をコーティングしている抗原とは
異なる生物種に由来するものである。インキュベートの
間に異なる生物種に由来する標識抗原（プローブ）は、
抗体の第二の抗原結合部位を介して水相から固相に捕捉
される。その後、水相中の未反応試薬と固相とを分離す
る。標識の存在は、固相中かまたは液相中かで任意に測
定する。試験試料中に存在する抗体の量は、固相に結合
した標識抗原の量および水相中に残っている標識抗原の
量の両方に数学的に関連付けられる。しかしながら、試
験試料中の抗体の存在または量を決定するのに固相を利
用するのが好ましい。
本明細書において「水相」とは、抗原のビーズへの結
合または抗体の抗原への結合に悪影響を与えない有機液
体とバランスを保ちながら約50％〜約100％の水を含有
する液相をいう。そのような有機液体としては、低分子
量アルコール、ポリエチレングリコール、ジメチルホル
ムアミドなどが挙げられる。
合または抗体の抗原への結合に悪影響を与えない有機液
体とバランスを保ちながら約50％〜約100％の水を含有
する液相をいう。そのような有機液体としては、低分子
量アルコール、ポリエチレングリコール、ジメチルホル
ムアミドなどが挙げられる。
１工程手順は、一つの生物種に由来する抗原をコーテ
ィングしたビーズ、試験試料および異なる生物種に由来
する標識抗原を同時に加えることからなる。一定のイン
キュベーション時間を測定した後、固相と未反応試薬と
を分離し、上記２工程手順で説明したようにして測定を
行う。
ィングしたビーズ、試験試料および異なる生物種に由来
する標識抗原を同時に加えることからなる。一定のイン
キュベーション時間を測定した後、固相と未反応試薬と
を分離し、上記２工程手順で説明したようにして測定を
行う。
本発明のアッセイでは、検出しようとする抗体に特異
的な抗原のみが反応して抗原−抗体−抗原サンドイッチ
を形成し、そのことにより高度の特異性を有するイムノ
アッセイが可能となる。さらに詳しくは、サンドイッチ
の全体は固相−抗原−抗体−異種抗原−標識からなる。
本発明のイムノアッセイ装置および方法は、固相に付着
させる抗原とプローブ（標識抗原）とが同一源に由来す
る従来のサンドイッチイムノアッセイよりも特異性が優
れている。とりわけ、単一の生物種から精製した抗原は
該生物からの痕跡量の汚染物質を含んでおり、これがア
ッセイ中にイムノアッセイの固相に結合したり組み込ま
れたりする。これらの固相汚染物質はさらに、試験試料
中に存在するかもしれない該汚染物質に対する抗体を結
合させることができる。しかしながら、同じ抗原を異な
る生物種から精製しプローブとして標識したときには、
異なる種類の汚染物質が含まれることになる。従って、
異種抗原とその１組の汚染物質を標識したときには、固
相に結合した第一の汚染物質に対する抗体は標識汚染物
質と結合して偽陽性を生じることはないであろう。両方
の生物に共通した抗原それ自身のみが、抗原−抗体−異
種抗原サンドイッチを形成することができる。従って、
標識抗原のみが固相抗体に結合することができ、真の陽
性の結果をもたらす。それゆえ、このことが本発明のイ
ムノアッセイ法に特異性を付与するのであり、従来技術
によって記載されたようなイムノアッセイ法によっては
達成しえないものである。
的な抗原のみが反応して抗原−抗体−抗原サンドイッチ
を形成し、そのことにより高度の特異性を有するイムノ
アッセイが可能となる。さらに詳しくは、サンドイッチ
の全体は固相−抗原−抗体−異種抗原−標識からなる。
本発明のイムノアッセイ装置および方法は、固相に付着
させる抗原とプローブ（標識抗原）とが同一源に由来す
る従来のサンドイッチイムノアッセイよりも特異性が優
れている。とりわけ、単一の生物種から精製した抗原は
該生物からの痕跡量の汚染物質を含んでおり、これがア
ッセイ中にイムノアッセイの固相に結合したり組み込ま
れたりする。これらの固相汚染物質はさらに、試験試料
中に存在するかもしれない該汚染物質に対する抗体を結
合させることができる。しかしながら、同じ抗原を異な
る生物種から精製しプローブとして標識したときには、
異なる種類の汚染物質が含まれることになる。従って、
異種抗原とその１組の汚染物質を標識したときには、固
相に結合した第一の汚染物質に対する抗体は標識汚染物
質と結合して偽陽性を生じることはないであろう。両方
の生物に共通した抗原それ自身のみが、抗原−抗体−異
種抗原サンドイッチを形成することができる。従って、
標識抗原のみが固相抗体に結合することができ、真の陽
性の結果をもたらす。それゆえ、このことが本発明のイ
ムノアッセイ法に特異性を付与するのであり、従来技術
によって記載されたようなイムノアッセイ法によっては
達成しえないものである。
本発明の装置および方法は生物学的流体中のいかなる
抗体をも検出および／または滴定するのに用いることが
できるものであるが、本発明は、HTLV IIIのp41エンベ
ロープ抗原に対する抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（HbsAg）
に対する抗体、またはＢ型肝炎コア抗原（HbcAg）に対
する抗体を検出または滴定するのに用いるのが好まし
い。本発明の装置および方法は、HTLV IIIのp41抗原に
対する抗体を検出および／または滴定するのに用いるの
が最も好ましい。これはHTLV IIIに感染した個体におけ
る第一の、そして最も普遍的な抗体応答であると信じら
れている。
抗体をも検出および／または滴定するのに用いることが
できるものであるが、本発明は、HTLV IIIのp41エンベ
ロープ抗原に対する抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（HbsAg）
に対する抗体、またはＢ型肝炎コア抗原（HbcAg）に対
する抗体を検出または滴定するのに用いるのが好まし
い。本発明の装置および方法は、HTLV IIIのp41抗原に
対する抗体を検出および／または滴定するのに用いるの
が最も好ましい。これはHTLV IIIに感染した個体におけ
る第一の、そして最も普遍的な抗体応答であると信じら
れている。
p41抗原のような純粋な抗原を調製するために一層好
ましい方法は、組換えDNA技術によるものである。組換
えDNA技術における第一の工程は、所望のp41抗原をコー
ドしている一定の長さのcDNAを得ることである。このた
めの一つの方法は、HTLV IIIウイルスからmRNAを単離
し、インビトロで逆転写酵素を用いて所望のp41抗原を
コードしているcDNAを得ることである。
ましい方法は、組換えDNA技術によるものである。組換
えDNA技術における第一の工程は、所望のp41抗原をコー
ドしている一定の長さのcDNAを得ることである。このた
めの一つの方法は、HTLV IIIウイルスからmRNAを単離
し、インビトロで逆転写酵素を用いて所望のp41抗原を
コードしているcDNAを得ることである。
別法として、DNAを化学的に合成することもできる。
多数のオリゴヌクレオチドを製造することができ、これ
からDNAポリメラーゼおよびDNAリガーゼを用いて所望の
cDNAを合成的に構成することができる。いずれの末端を
制限エンドヌクレアーゼで消化しても、プラスミド中へ
挿入するための適当な粘着制限部位を得ることができ
る。
多数のオリゴヌクレオチドを製造することができ、これ
からDNAポリメラーゼおよびDNAリガーゼを用いて所望の
cDNAを合成的に構成することができる。いずれの末端を
制限エンドヌクレアーゼで消化しても、プラスミド中へ
挿入するための適当な粘着制限部位を得ることができ
る。
上記合成DNAまたはcDNAは、制限エンドヌクレアーゼ
により、またはオリゴdCのような適当なヌクレオチドお
よび末端トランスフェラーゼを用いることにより、末端
にテール（粘着端を備えている）を付すことができる。
により、またはオリゴdCのような適当なヌクレオチドお
よび末端トランスフェラーゼを用いることにより、末端
にテール（粘着端を備えている）を付すことができる。
いかなるテーリング法をも用いることができ、ついで
pUC-9（ファルマシア社、ピスカタウエー、ニュージャ
ージー）のようなプラスミドを採ってきてPstI（シグマ
・ケミカル社、セントルイス、MO）のような制限エンド
ヌクレアーゼにより単一部位で開裂させることができ
る。開裂させたpUC-9は、所望のペプチドをコードして
いるDNAのオリゴdCテール断片に相補的なオリゴdCのテ
ールを付すことができる。開裂したプラスミドと抗原を
コードしているDNAとはアニールし結合させることがで
きる。大腸菌（E.coli）のような宿主細胞は、適当な組
換えプラスミドとともにインキュベートすることにより
p41抗原産生細胞に形質転換することができる。こうし
て形質転換した大腸菌宿主細胞は、ついでp41抗原を大
量に発現させるために適当な条件下で培養する。p41タ
ンパク質の精製は、実施例６に記載のようにして行うこ
とができる。核酸を含む種々の取り扱い方法は、マニア
チス（Maniatis）らのモレキュラー・クローニング、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、３〜17
（1982）に記載されている。
pUC-9（ファルマシア社、ピスカタウエー、ニュージャ
ージー）のようなプラスミドを採ってきてPstI（シグマ
・ケミカル社、セントルイス、MO）のような制限エンド
ヌクレアーゼにより単一部位で開裂させることができ
る。開裂させたpUC-9は、所望のペプチドをコードして
いるDNAのオリゴdCテール断片に相補的なオリゴdCのテ
ールを付すことができる。開裂したプラスミドと抗原を
コードしているDNAとはアニールし結合させることがで
きる。大腸菌（E.coli）のような宿主細胞は、適当な組
換えプラスミドとともにインキュベートすることにより
p41抗原産生細胞に形質転換することができる。こうし
て形質転換した大腸菌宿主細胞は、ついでp41抗原を大
量に発現させるために適当な条件下で培養する。p41タ
ンパク質の精製は、実施例６に記載のようにして行うこ
とができる。核酸を含む種々の取り扱い方法は、マニア
チス（Maniatis）らのモレキュラー・クローニング、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、３〜17
（1982）に記載されている。
同様に、上記技術を利用して、cDNA断片を得ることの
できる他のあらゆるタンパク質または糖タンパク質を発
現させることができる。しかしながら、本発明の抗原を
提供するタンパク質または糖タンパク質として特に好ま
しいのは以下のものである。HTLV III（HIVとしても知
られている）のp41エンベロープタンパク質、p41コアタ
ンパク質およびgp120表面糖タンパク質；表面抗原（Hbs
Ag）、コア抗原（HbcAg）およびｅ抗原（HbeAg）のよう
なＢ型肝炎ウイルスの種々の抗原。これらのタンパク質
の精製は、実施例６に記載の技術を用いて行うことがで
きる。
できる他のあらゆるタンパク質または糖タンパク質を発
現させることができる。しかしながら、本発明の抗原を
提供するタンパク質または糖タンパク質として特に好ま
しいのは以下のものである。HTLV III（HIVとしても知
られている）のp41エンベロープタンパク質、p41コアタ
ンパク質およびgp120表面糖タンパク質；表面抗原（Hbs
Ag）、コア抗原（HbcAg）およびｅ抗原（HbeAg）のよう
なＢ型肝炎ウイルスの種々の抗原。これらのタンパク質
の精製は、実施例６に記載の技術を用いて行うことがで
きる。
同様に、上記技術を利用して、p41のような抗原をコ
ードするDNAを含有している適当な組換えプラスミドを
酵母に供することにより酵母を抗原産生生物に形質転換
することができ、これにより本発明の異種生物が提供さ
れる。
ードするDNAを含有している適当な組換えプラスミドを
酵母に供することにより酵母を抗原産生生物に形質転換
することができ、これにより本発明の異種生物が提供さ
れる。
本発明の抗原に適した異種生物の例としては、大腸菌
およびバシラス・メガテリウムのような細菌、酵母、マ
ウス細胞株、およびH9のようなヒト細胞株［メッシング
（Messing）らのMethods Enzymol.,101、20〜78（198
3）参照］が挙げられる。いかなる２種の生物により産
生された抗原からも本発明において充分な結果が得られ
るが、プラスチックビーズ上にコーティングするための
p41抗原を産生する生物としては酵母が、標識に結合さ
せるためのp41抗原を産生させるための生物としては大
腸菌が特に好ましい。
およびバシラス・メガテリウムのような細菌、酵母、マ
ウス細胞株、およびH9のようなヒト細胞株［メッシング
（Messing）らのMethods Enzymol.,101、20〜78（198
3）参照］が挙げられる。いかなる２種の生物により産
生された抗原からも本発明において充分な結果が得られ
るが、プラスチックビーズ上にコーティングするための
p41抗原を産生する生物としては酵母が、標識に結合さ
せるためのp41抗原を産生させるための生物としては大
腸菌が特に好ましい。
また固相上にコーティングされる抗原と標識に結合さ
れる抗原とは、両抗原が少なくとも１個の抗原決定基
（「エピトープ」）を共通に有しており、本発明の高度
に特異的な抗原−抗体−抗原サンドイッチを生成させる
ことができる限り完全に同一でなくてもよい。
れる抗原とは、両抗原が少なくとも１個の抗原決定基
（「エピトープ」）を共通に有しており、本発明の高度
に特異的な抗原−抗体−抗原サンドイッチを生成させる
ことができる限り完全に同一でなくてもよい。
たとえばp41抗原の場合には、p41の免疫優性ドメイン
および疎水性カルボキシル末端ドメインを含むように完
全なp41抗原をクローニングし生物中で発現させること
できる。疎水性カルボキシル末端ドメインは、固相に付
着するのを能力を助長する。標識に用いるp41抗原は、p
41抗原のアミノ末端側の半分だけからなっていてよく、
疎水性の領域を欠いてはいるが免疫優性ドメインは含ん
でいるので、抗体は両方のp41抗原と結合して本発明の
高度に特異的な抗原−抗体−抗原サンドイッチを生成す
ることができる。
および疎水性カルボキシル末端ドメインを含むように完
全なp41抗原をクローニングし生物中で発現させること
できる。疎水性カルボキシル末端ドメインは、固相に付
着するのを能力を助長する。標識に用いるp41抗原は、p
41抗原のアミノ末端側の半分だけからなっていてよく、
疎水性の領域を欠いてはいるが免疫優性ドメインは含ん
でいるので、抗体は両方のp41抗原と結合して本発明の
高度に特異的な抗原−抗体−抗原サンドイッチを生成す
ることができる。
プローブ中の抗原のエピトープ（すなわち標識に結合
したエピトープ）もまた組換え技術により任意に発現さ
せることができる。同様に、本発明のエピトープを発現
させるために組換え技術を用いることができ、その際、
エピトープの発現は酵素標識をすでに付したままで行
う。
したエピトープ）もまた組換え技術により任意に発現さ
せることができる。同様に、本発明のエピトープを発現
させるために組換え技術を用いることができ、その際、
エピトープの発現は酵素標識をすでに付したままで行
う。
本発明の他の応用例としては、組合わせアッセイを行
うために同じ構成（configuration）を用いることが挙
げられ、これは多数の抗原を同時に検出するために、２
またはそれ以上の抗原を固相上にコーティングし、異な
る生物種に由来する２またはそれ以上の抗原をプローブ
として用いるものである。
うために同じ構成（configuration）を用いることが挙
げられ、これは多数の抗原を同時に検出するために、２
またはそれ以上の抗原を固相上にコーティングし、異な
る生物種に由来する２またはそれ以上の抗原をプローブ
として用いるものである。
さらに本発明は、高度に変異性のタンパク質の保存
（conserved）領域に対する抗体を試料が含んでいるか
どうかを決定するのに応用することができる。たとえば
HTLV IIIからのgp120は２つの距離的に関連するHTLV II
I株から精製することができ、一方の株からのgp120は固
相をコーティングするのに用い、他方の株からのgp120
はプローブ、すなわち標識抗原として用いる。
（conserved）領域に対する抗体を試料が含んでいるか
どうかを決定するのに応用することができる。たとえば
HTLV IIIからのgp120は２つの距離的に関連するHTLV II
I株から精製することができ、一方の株からのgp120は固
相をコーティングするのに用い、他方の株からのgp120
はプローブ、すなわち標識抗原として用いる。
従って、本発明のイムノアッセイ法および装置は多く
の利点を有する。特に本発明のイムノアッセイは、異種
抗原を用いない従来のイムノアッセイよりも特異性が高
い。さらに本発明に記載したHTLV IIIに対する抗体を検
出するためのイムノアッセイ法および装置は、標識ヤギ
抗ヒトIgG、IgMまたはIgAなどの比較的非特異的なプロ
ーブを用いる従来のヒト抗HTLV IIIのためのイムノアッ
セイよりも実質的に特異性が高い。加えて本アッセイは
簡単に行うことができる。さらに本発明の抗HTLV IIIイ
ムノアッセイでは、従来技術では必要とされた試験試料
の1:100または1:400倍希釈を必要としない。
の利点を有する。特に本発明のイムノアッセイは、異種
抗原を用いない従来のイムノアッセイよりも特異性が高
い。さらに本発明に記載したHTLV IIIに対する抗体を検
出するためのイムノアッセイ法および装置は、標識ヤギ
抗ヒトIgG、IgMまたはIgAなどの比較的非特異的なプロ
ーブを用いる従来のヒト抗HTLV IIIのためのイムノアッ
セイよりも実質的に特異性が高い。加えて本アッセイは
簡単に行うことができる。さらに本発明の抗HTLV IIIイ
ムノアッセイでは、従来技術では必要とされた試験試料
の1:100または1:400倍希釈を必要としない。
つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（抗p41のための同位体２工程直接イムノアッ
セイ法） 本実施例では、放射性標識を用いた抗p41の検出のた
めの２工程直接イムノアッセイを行う。放射性標識抗原
を、グリーンウッド（Greenwood）らのJ.Biochem.,89:1
14〜123（1963）に記載の方法に従って調製する。
セイ法） 本実施例では、放射性標識を用いた抗p41の検出のた
めの２工程直接イムノアッセイを行う。放射性標識抗原
を、グリーンウッド（Greenwood）らのJ.Biochem.,89:1
14〜123（1963）に記載の方法に従って調製する。
ポリスチレンビーズ（1/4インチ）を、リン酸バッフ
ァー（0.5μg/ml、pH7.0）中、45℃で２時間、酵母に由
来し発現されたp41抗原でコーティングする。ついで未
知の量の抗p41を含むヒト血清試料（200μｌ）をビーズ
に加え、40℃で２時間、水平面でインキュベートする。
ビーズを脱イオン化水（4ml）で３回洗浄する。洗浄し
たビーズについで125Iで標識した酵母由来のp41抗原（2
00μｌ）を加え、40℃で１時間インキュベートする。ビ
ーズを脱イオン化水（5ml）で３回洗浄し、ついで試験
管に移してアボット・ラボラトリーズ（ノース・シカ
ゴ、イリノイ）により製作されたANSRガンマカウンター
のようなガンマシンチレーションカウンター上で放射能
をカウントする。血清試料中に存在する抗p41の量が多
ければ多いほど、検出される放射性は大きくなる。
ァー（0.5μg/ml、pH7.0）中、45℃で２時間、酵母に由
来し発現されたp41抗原でコーティングする。ついで未
知の量の抗p41を含むヒト血清試料（200μｌ）をビーズ
に加え、40℃で２時間、水平面でインキュベートする。
ビーズを脱イオン化水（4ml）で３回洗浄する。洗浄し
たビーズについで125Iで標識した酵母由来のp41抗原（2
00μｌ）を加え、40℃で１時間インキュベートする。ビ
ーズを脱イオン化水（5ml）で３回洗浄し、ついで試験
管に移してアボット・ラボラトリーズ（ノース・シカ
ゴ、イリノイ）により製作されたANSRガンマカウンター
のようなガンマシンチレーションカウンター上で放射能
をカウントする。血清試料中に存在する抗p41の量が多
ければ多いほど、検出される放射性は大きくなる。
この同じイムノアッセイはまた、大腸菌に由来するp4
1でコーティングしたポリスチレンビーズを用いても行
うことができる。この方法を用いる場合、125Iで標識し
た酵母由来p41を用いる。両アッセイとも抗p41の検出の
ためにうまく機能する。
1でコーティングしたポリスチレンビーズを用いても行
うことができる。この方法を用いる場合、125Iで標識し
た酵母由来p41を用いる。両アッセイとも抗p41の検出の
ためにうまく機能する。
実施例２（抗p41のための酵素２工程直接イムノアッセ
イ法） 本実施例では、酵素を用いた抗p41のための２工程直
接イムノアッセイを行う。西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRPO）標識抗原を、ナカネ（Nakane）らのJ.Histoche
m.Cytochem.,22:1084〜1091（1974）に記載の方法に従
って調製するか、またはp41をビオチン化し［ホフマン
（Hofmann,K）らのBiochem.（1982）参照］、HRPOで標
識したウサギ抗ビオチンと反応させる。
イ法） 本実施例では、酵素を用いた抗p41のための２工程直
接イムノアッセイを行う。西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRPO）標識抗原を、ナカネ（Nakane）らのJ.Histoche
m.Cytochem.,22:1084〜1091（1974）に記載の方法に従
って調製するか、またはp41をビオチン化し［ホフマン
（Hofmann,K）らのBiochem.（1982）参照］、HRPOで標
識したウサギ抗ビオチンと反応させる。
ポリスチレンビーズを実施例１に記載したようにして
p41抗原（酵母由来）でコーティングする。このビーズ
にヒト血清試料（200μｌ）を加え、結合させた固相お
よび水相を40℃で２時間、水平面でインキュベートす
る。ついでビーズを脱イオン化水（5ml）で３回洗浄す
る。つぎに、直接またはビオチン／抗ビオチンシステム
を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したp41抗
原（大腸菌由来）（200ml）をビーズに加え、ビーズを
約40℃で１時間インキュベートする。ビーズを脱イオン
化水（5ml）で３回洗浄し、試験管に移して発色させ
る。試験管中のビーズにはｏ−フェニレンジアミン（OP
D）基質溶液［ｏ−フェニレンジアミン・HCl錠（12.8m
g）を含有、0.02％過酸化水素を含有する0.1Mクエン酸
−リン酸バッファー（pH5.5〜6.0）（5ml）で希釈］（3
00μｌ）を加え、室温で30分間インキュベートする。そ
の後、1N硫酸（1.0ml）を試験管に加える。生じた色を
分光光度計上で読み取り、約492nm波長での吸光度を測
定する。試料中の光p41の量が多くなればなるほど、測
定される吸光度は高くなる。
p41抗原（酵母由来）でコーティングする。このビーズ
にヒト血清試料（200μｌ）を加え、結合させた固相お
よび水相を40℃で２時間、水平面でインキュベートす
る。ついでビーズを脱イオン化水（5ml）で３回洗浄す
る。つぎに、直接またはビオチン／抗ビオチンシステム
を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したp41抗
原（大腸菌由来）（200ml）をビーズに加え、ビーズを
約40℃で１時間インキュベートする。ビーズを脱イオン
化水（5ml）で３回洗浄し、試験管に移して発色させ
る。試験管中のビーズにはｏ−フェニレンジアミン（OP
D）基質溶液［ｏ−フェニレンジアミン・HCl錠（12.8m
g）を含有、0.02％過酸化水素を含有する0.1Mクエン酸
−リン酸バッファー（pH5.5〜6.0）（5ml）で希釈］（3
00μｌ）を加え、室温で30分間インキュベートする。そ
の後、1N硫酸（1.0ml）を試験管に加える。生じた色を
分光光度計上で読み取り、約492nm波長での吸光度を測
定する。試料中の光p41の量が多くなればなるほど、測
定される吸光度は高くなる。
実施例１の同位体イムノアッセイでも指摘したよう
に、p41の一方が他方に対して異種の源である限り、本
実施例においてビーズのために選択されるp41の源は、
標識のために選択されるp41の源と逆にすることができ
る。
に、p41の一方が他方に対して異種の源である限り、本
実施例においてビーズのために選択されるp41の源は、
標識のために選択されるp41の源と逆にすることができ
る。
実施例３（抗p41のための１工程アッセイ） 本実施例では、放射標識または酵素標識を用いた１工
程アッセイを行う。
程アッセイを行う。
ポリスチレンビーズを実施例１記載のp41（酵母由
来）でコーティングする。反応容器中のビーズにヒト血
清試料（100μｌ）および125Iかまたは西洋ワサビペル
オキシダーゼで標識したp41（大腸菌由来）（100μｌ）
を加え、40℃で約２時間インキュベーションを続ける。
ついでビーズを脱イオン化水（5ml）で３回洗浄し、放
射能をカウントするか（実施例１のごとく）または発色
させて492nmでの吸光度を測定する（実施例２のごと
く）ために試験管に移す。
来）でコーティングする。反応容器中のビーズにヒト血
清試料（100μｌ）および125Iかまたは西洋ワサビペル
オキシダーゼで標識したp41（大腸菌由来）（100μｌ）
を加え、40℃で約２時間インキュベーションを続ける。
ついでビーズを脱イオン化水（5ml）で３回洗浄し、放
射能をカウントするか（実施例１のごとく）または発色
させて492nmでの吸光度を測定する（実施例２のごと
く）ために試験管に移す。
実施例４（抗HBsAgのための２工程直接イムノアッセイ
法） 本実施例では、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体のため
の２工程直接イムノアッセイ法を詳述する。本実施例で
は、ナカネ（Nakane）らのJ.Histochem.Cytochem.,22:1
084〜1091（1974）に記載の方法により西洋ワサビペル
オキシダーゼ（HRPO）を調製した。別法としてHBsAgを
ヌゴー（Ngo）らの方法によりビオチン化し、HRPOで標
識した抗ビオチン（マウスモノクローナルまたはウサギ
ポリクローナル）かまたはアビジンと反応させることが
できる［ヌゴーらのJ.Appl.Biochem.Biotech.,7、443〜
454（1982）参照］。HRPO標識アビジンは、シグマ・ケ
ミカル社（セントルイス、MO）から市販されている。
法） 本実施例では、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体のため
の２工程直接イムノアッセイ法を詳述する。本実施例で
は、ナカネ（Nakane）らのJ.Histochem.Cytochem.,22:1
084〜1091（1974）に記載の方法により西洋ワサビペル
オキシダーゼ（HRPO）を調製した。別法としてHBsAgを
ヌゴー（Ngo）らの方法によりビオチン化し、HRPOで標
識した抗ビオチン（マウスモノクローナルまたはウサギ
ポリクローナル）かまたはアビジンと反応させることが
できる［ヌゴーらのJ.Appl.Biochem.Biotech.,7、443〜
454（1982）参照］。HRPO標識アビジンは、シグマ・ケ
ミカル社（セントルイス、MO）から市販されている。
本実施例は、ヒト血漿由来のHBsAgをビーズをコーテ
ィングするのに用い、形質転換マウスＬ細胞からの組換
え由来HBsAgをたとえばHRPO標識に結合させてプローブ
として用いた他は実施例２の手順に従って行った。
ィングするのに用い、形質転換マウスＬ細胞からの組換
え由来HBsAgをたとえばHRPO標識に結合させてプローブ
として用いた他は実施例２の手順に従って行った。
下記に示した反応曲線が、本実施例により典型的な結
果として得られた。
果として得られた。
抗HBsAg濃度 492nmでの吸光度 陰性対照 0.022 陽性対照 1.536 150mIU/ml 1.588 75mIU/ml 0.832 40mIU/ml 0.599 15mIU/ml 0.220 8mIU/ml 0.141 4mIU/ml 0.082 実施例５（抗p41のための定量３工程イムノアッセイ
法） 本実施例は抗p41のための３工程直接イムノアッセイ
法であり、バシラス・メガテリウムで発現し由来する組
換えp41をコーティングした微粒子をフィルター上に沈
積させ固相として用いた（フィルター上に沈積させたコ
ーティング微粒子からなる固相について記載した米国特
許第4,632,901号明細書参照）。
法） 本実施例は抗p41のための３工程直接イムノアッセイ
法であり、バシラス・メガテリウムで発現し由来する組
換えp41をコーティングした微粒子をフィルター上に沈
積させ固相として用いた（フィルター上に沈積させたコ
ーティング微粒子からなる固相について記載した米国特
許第4,632,901号明細書参照）。
本実施例では、試験試料（300μｌ）を試料希釈液（2
00μｌ）に加え、吸収パッドの上に位置するフィルター
の上に注ぎ、３分間インキュベートする。希釈試料を流
し微粒子を含有するフィルターを、ついでヌゴーらのJ.
Appl.Biochem.Biotech.,7、443〜454（1982）に記載の
方法で調製したビオチン化p41と３分間反応させた。そ
の後、アルカリホスファターゼ標識抗ビオチン抗体かま
たはアルカリホスファターゼ標識アビジンを含有する溶
液をフィルターに加える。３分間インキュベートした
後、フィルターをバッファー塩溶液（pH6.5〜9.5、0.9
％NaCl）で充分に洗浄する。ついで基質溶液をフィルタ
ーに加えると、固定化されたアルカリホスファターゼと
反応して色原体を生じ、p41に対する抗体の存在、従っ
てHTLV IIIウイルスに接触があったことを示す。
00μｌ）に加え、吸収パッドの上に位置するフィルター
の上に注ぎ、３分間インキュベートする。希釈試料を流
し微粒子を含有するフィルターを、ついでヌゴーらのJ.
Appl.Biochem.Biotech.,7、443〜454（1982）に記載の
方法で調製したビオチン化p41と３分間反応させた。そ
の後、アルカリホスファターゼ標識抗ビオチン抗体かま
たはアルカリホスファターゼ標識アビジンを含有する溶
液をフィルターに加える。３分間インキュベートした
後、フィルターをバッファー塩溶液（pH6.5〜9.5、0.9
％NaCl）で充分に洗浄する。ついで基質溶液をフィルタ
ーに加えると、固定化されたアルカリホスファターゼと
反応して色原体を生じ、p41に対する抗体の存在、従っ
てHTLV IIIウイルスに接触があったことを示す。
基質としてはアルカリホスファターゼによる加水分解
で色原体を生じ得る有機ホスフェート化合物が適してい
るが、好ましい基質は、置換フェニル、ナフチルおよび
インドールホスフェートである。アルカリホスファター
ゼ標識に対する基質として特に好ましいのは、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、３−イ
ンドリルホスフェートおよび類似体またはその誘導体で
ある。
で色原体を生じ得る有機ホスフェート化合物が適してい
るが、好ましい基質は、置換フェニル、ナフチルおよび
インドールホスフェートである。アルカリホスファター
ゼ標識に対する基質として特に好ましいのは、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、３−イ
ンドリルホスフェートおよび類似体またはその誘導体で
ある。
実施例６（HTLV IIIのp41およびp24抗原の精製および特
徴付け） 大腸菌で産生されたHTLV IIIp41組換えタンパク質を
アフィニティカラムおよびイオン交換クロマトグラフィ
ーを用いて精製する。細菌溶解物の上澄み液を、モノク
ローナル抗HTLV IIIp41を結合させたセファロース4Bビ
ーズからなるアフィニティカラム上に通した。カラムを
0.5％トリトンX-100のバッファーで洗浄し、結合したHT
LV IIIp41を5M NaIを含有する同じバッファーで溶出し
た。溶出したタンパク質溶液を充分に透析してNaIを除
き、0.1％ツイーン20および7M尿素を含有するエタノー
ルアミンバッファー（バッファーＡ）と1:1で混合し、D
EAE陰イオン交換カラムに加えた。カラムをバッファー
Ａ中で充分に洗浄し、ついで結合したタンパク質をバッ
ファーＡ中の100〜500mM NaCl勾配を用いて溶出した。p
41活性のピークフラクションをプールし透析して尿素を
除いた。
徴付け） 大腸菌で産生されたHTLV IIIp41組換えタンパク質を
アフィニティカラムおよびイオン交換クロマトグラフィ
ーを用いて精製する。細菌溶解物の上澄み液を、モノク
ローナル抗HTLV IIIp41を結合させたセファロース4Bビ
ーズからなるアフィニティカラム上に通した。カラムを
0.5％トリトンX-100のバッファーで洗浄し、結合したHT
LV IIIp41を5M NaIを含有する同じバッファーで溶出し
た。溶出したタンパク質溶液を充分に透析してNaIを除
き、0.1％ツイーン20および7M尿素を含有するエタノー
ルアミンバッファー（バッファーＡ）と1:1で混合し、D
EAE陰イオン交換カラムに加えた。カラムをバッファー
Ａ中で充分に洗浄し、ついで結合したタンパク質をバッ
ファーＡ中の100〜500mM NaCl勾配を用いて溶出した。p
41活性のピークフラクションをプールし透析して尿素を
除いた。
同様に大腸菌で産生された組換えp24を、モノクロー
ナル抗HTLV IIIp24を結合させたセファロース4Bビーズ
からなるアフィニティカラム上に溶菌上澄みを流すこと
により精製する。カラムを0.1％トリトンX-100を含有す
るバッファーで洗浄し、結合したp24を4M塩酸グアニジ
ン（GuHCl）を含有する同じバッファーで溶出する。溶
出したタンパク質溶液を充分に透析し、ついで第二のア
フィニティカラムに再び加えて上記のようにして溶出す
る。p24のピークフラクションをプールし透析してGuHCl
を除く。
ナル抗HTLV IIIp24を結合させたセファロース4Bビーズ
からなるアフィニティカラム上に溶菌上澄みを流すこと
により精製する。カラムを0.1％トリトンX-100を含有す
るバッファーで洗浄し、結合したp24を4M塩酸グアニジ
ン（GuHCl）を含有する同じバッファーで溶出する。溶
出したタンパク質溶液を充分に透析し、ついで第二のア
フィニティカラムに再び加えて上記のようにして溶出す
る。p24のピークフラクションをプールし透析してGuHCl
を除く。
組換えタンパク質をさらに特徴付けるために、精製p2
4コアまたはp41エンベロープ抗原をドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDSPAGE）およ
びシャプバッハ（Schupbach）らのScience、224、503〜
505（1984）記載の方法によるウエスタンブロッティン
グ分析に供する。
4コアまたはp41エンベロープ抗原をドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDSPAGE）およ
びシャプバッハ（Schupbach）らのScience、224、503〜
505（1984）記載の方法によるウエスタンブロッティン
グ分析に供する。
Claims (10)
- 【請求項１】試験試料中の特定の抗原に対する抗体を検
出するためのサンドイッチイムノアッセイを行う方法で
あって、検出しようとする抗体に特異的な第一の抗原を
固相上に固定化し、試験試料中の検出しようとする抗体
を該第一の抗原に結合させることによって固定化し、さ
らに該固定化された抗体を標識を有する第二の抗原と結
合させる際に、該第二の抗原を第一の抗原とは異なる生
物種に由来するものとすることを特徴とする方法。 - 【請求項２】試験試料中の抗原特異的抗体の検出方法で
あって、 （ａ）検出しようとする抗体に特異的な第一の組換え体
由来抗原を固相上に固定化し、 （ｂ）工程（ａ）で得た固相を、抗原特異的抗体を含ん
でいるかまたは含んでいると思われる水相試験試料と接
触させ、 （ｃ）工程（ｂ）で得た固相を、標識を付着した第二の
組換え体由来抗原を含む水相と接触させ、その際、該第
二の組換え体由来抗原は該第一の組換え体由来抗原とは
異なる由来とし、 （ｄ）水相を固相から分離させ、ついで （ｅ）固相上または液相中に存在する標識を測定して試
験試料中に存在する抗体を検出および／または滴定する ことを特徴とする方法。 - 【請求項３】標識が酵素または放射性同位体である特許
請求の範囲第（２）項記載の方法。 - 【請求項４】第一および第二の組換え体由来抗原が、試
験試料中の抗原特異的抗体により交差反応を起こすに充
分な抗原決定基を有している限り、第一および第二の組
換え体由来抗原が共にHTLV IIIのp24抗原、HTLV IIIのp
41抗原、HTLV IIIのgp120抗原、HBsAg、HBcAg、HBeAg、
およびそれらの抗原性断片すなわちエピトープよりなる
群から選ばれたものである特許請求の範囲第（２）項記
載の方法。 - 【請求項５】工程（ａ）および工程（ｂ）を同時に行う
特許請求の範囲第（２）項記載の方法。 - 【請求項６】固相がポリスチレンビーズである特許請求
の範囲第（２）項記載の方法。 - 【請求項７】ヒト血清中のHTLV IIIのp41抗原に対する
抗体の検出方法であって、 （ａ）ポリスチレンビーズを酵母由来の精製p41抗原で
コーティングし、 （ｂ）ヒト血清試料を該コーティングビーズに加え、 （ｃ）約40℃で約２時間インキュベートし、 （ｄ）該ビーズを脱イオン化水で洗浄し、 （ｅ）該ビーズに精製および標識したp41抗原または精
製および標識したその断片すなわちエピトープを加え、
その際、p41抗原またはその断片すなわちエピトープ
は、ビーズ上のp41抗原を産生させるのに用いたのとは
異なる生物種に由来するようにし、また該断片すなわち
エピトープは、ヒト血清中のp41抗原に対する抗体と交
差反応ができるように、工程（ａ）の抗原と共通する充
分な抗原決定基を有しているようにする、 （ｆ）約40℃で約１時間インキュベートし、 （ｇ）該ビーズを脱イオン化水で洗浄し、 （ｈ）未反応の試薬をビーズから分離し、ついで （ｉ）ビーズ上に存在するマーカーを測定する ことを特徴とする方法。 - 【請求項８】工程（ａ）のp41抗原が酵母中で産生され
たものであり、工程（ｅ）の標識p41抗原が大腸菌中で
産生されたものである特許請求の範囲第（７）項記載の
方法。 - 【請求項９】工程（ｅ）のp41抗原がマウス細胞中で産
生されたものである特許請求の範囲第（７）項記載の方
法。 - 【請求項１０】マーカーが125Iである特許請求の範囲第
（７）項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US115135 | 1980-01-24 | ||
| US11513587A | 1987-10-30 | 1987-10-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01148963A JPH01148963A (ja) | 1989-06-12 |
| JP2888526B2 true JP2888526B2 (ja) | 1999-05-10 |
Family
ID=22359490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63275987A Expired - Lifetime JP2888526B2 (ja) | 1987-10-30 | 1988-10-29 | 抗体のサンドイッチイムノアッセイ法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0313986B1 (ja) |
| JP (1) | JP2888526B2 (ja) |
| KR (1) | KR890007076A (ja) |
| AT (1) | ATE132267T1 (ja) |
| AU (1) | AU614783B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341341C (ja) |
| DE (1) | DE3854834T2 (ja) |
| ES (1) | ES2084581T3 (ja) |
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| CA2073452A1 (en) * | 1990-01-16 | 1991-07-17 | Donald E. Senn | Combination assay for antibody or antigen |
| AU2247192A (en) * | 1991-06-13 | 1993-01-12 | Pacific Biotech, Inc. | Assay for the detection of specific ligands |
| EP0627625A1 (en) * | 1993-06-04 | 1994-12-07 | Abbott Laboratories | Immunoassay for differential diagnosis |
| US6653066B1 (en) | 1994-06-17 | 2003-11-25 | Trinity Biotech | Device and method for detecting polyvalent substances |
| GB9719357D0 (en) * | 1997-09-11 | 1997-11-12 | Ortho Clinical Diagnostics | Immunoassay Utilizing Two Incubations With Labelled Antigen |
| DE19933104A1 (de) * | 1999-07-15 | 2001-01-18 | Ingo Klimant | Phosphoreszierende Mikro- und Nanopartikel als Referenzstandard und Phosphoreszenzmarker |
| EP2631653A1 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-28 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family |
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|---|---|---|---|---|
| NL7501215A (nl) * | 1975-02-01 | 1976-08-03 | Akzo Nv | Methode voor het aantonen en bepalen van een antigeen of antilichaam. |
| US4748110A (en) * | 1985-09-25 | 1988-05-31 | Abbott Laboratories | Immunoassay for HTLV-III antigens |
| JP2634203B2 (ja) * | 1987-09-04 | 1997-07-23 | インターナショナル ミュレックス テクノロジーズ コーポレイション | イムノアツセイおよびそれに使用される生物学的構築体 |
-
1988
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- 1988-10-20 AT AT88117476T patent/ATE132267T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-20 ES ES88117476T patent/ES2084581T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-20 DE DE3854834T patent/DE3854834T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-26 CA CA000581350A patent/CA1341341C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-27 AU AU24401/88A patent/AU614783B2/en not_active Ceased
- 1988-10-29 KR KR1019880014129A patent/KR890007076A/ko not_active Application Discontinuation
- 1988-10-29 JP JP63275987A patent/JP2888526B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
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| EP0313986A2 (en) | 1989-05-03 |
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| DE3854834T2 (de) | 1996-06-27 |
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| AU614783B2 (en) | 1991-09-12 |
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| DE3854834D1 (de) | 1996-02-08 |
| CA1341341C (en) | 2002-02-19 |
| AU2440188A (en) | 1989-05-25 |
| ATE132267T1 (de) | 1996-01-15 |
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