JP3327488B2 - 被検体の免疫化学的測定方法 - Google Patents
被検体の免疫化学的測定方法Info
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Description
【０００１】本発明は第一特異結合パートナーを用い、
該特異結合パートナーを担体に固定しそして該特異結合
パートナーに対する被検体（analyte）の結合度合を直
接または間接に標識を有する更なる特異結合パートナー
を用いて測定することより成る検体中の被検体の免疫学
的測定方法に関する。
該特異結合パートナーを担体に固定しそして該特異結合
パートナーに対する被検体（analyte）の結合度合を直
接または間接に標識を有する更なる特異結合パートナー
を用いて測定することより成る検体中の被検体の免疫学
的測定方法に関する。
【０００２】病因体例えばウイルス、細菌、自己抗原ま
たは特定の薬品に対する特異抗体の形成を伴う疾病の通
例の免疫化学的診断方法は、病因体の抗原性構造と複合
体を形成するこれらの抗体の能力に依存する。
たは特定の薬品に対する特異抗体の形成を伴う疾病の通
例の免疫化学的診断方法は、病因体の抗原性構造と複合
体を形成するこれらの抗体の能力に依存する。
【０００３】一般に不均一（heterogeneous）イムノア
ッセイと指称される、これら方法の一部においては、含
有量を検査すべき検体、例えば特異抗体（被検体抗体）
を適当な既知の担体材料に固定された病因体の抗原性構
造と接触させる。検体中に含まれる被検体はその担体材
料に固定された病因体の抗原構造に免疫複合体として結
合されそして検出される。その検出には検体の被検体抗
体と複合体を形成できる検出抗体または他の特異受容体
例えばプロテインＡを用いることができる。
ッセイと指称される、これら方法の一部においては、含
有量を検査すべき検体、例えば特異抗体（被検体抗体）
を適当な既知の担体材料に固定された病因体の抗原性構
造と接触させる。検体中に含まれる被検体はその担体材
料に固定された病因体の抗原構造に免疫複合体として結
合されそして検出される。その検出には検体の被検体抗
体と複合体を形成できる検出抗体または他の特異受容体
例えばプロテインＡを用いることができる。
【０００４】一般に、検出試薬は結合特異抗体の量の計
測による測定を可能にする標識を有する。通常用いられ
る標識は次のものである：放射性同位元素、酵素、蛍光
体、燐光体または発光体、安定不対電子、赤血球、ラテ
ックス粒子、磁性粒子および金属ゾル。
測による測定を可能にする標識を有する。通常用いられ
る標識は次のものである：放射性同位元素、酵素、蛍光
体、燐光体または発光体、安定不対電子、赤血球、ラテ
ックス粒子、磁性粒子および金属ゾル。
【０００５】これらのプロセスにおいては、単一段階お
よび多段階検出方法が知られている。各プロセス段階は
通常分離プロセス（洗浄段階）により停止される。不均
一イムノアッセイの場合、単一段階法の技術は実施が極
めて簡単であるが、すべての疾病マーカー検出に適して
いるわけではない。技術的理由から二段階または多段階
プロセスを使用しなければならないこともしばしばであ
る。
よび多段階検出方法が知られている。各プロセス段階は
通常分離プロセス（洗浄段階）により停止される。不均
一イムノアッセイの場合、単一段階法の技術は実施が極
めて簡単であるが、すべての疾病マーカー検出に適して
いるわけではない。技術的理由から二段階または多段階
プロセスを使用しなければならないこともしばしばであ
る。
【０００６】これらの方法は極めて特異的であるが、検
出されるべき病因体またはそれらに対する抗体が第一プ
ロセス段階で固定された特異受容体との複合体を形成し
た後、続くインキュベーション段階において当業者に知
られた逆反応でその複合体から再び一部解離し、これに
よって検出反応をかいくぐり、その結果特に感度が著し
く低下してしまうという欠点がある。
出されるべき病因体またはそれらに対する抗体が第一プ
ロセス段階で固定された特異受容体との複合体を形成し
た後、続くインキュベーション段階において当業者に知
られた逆反応でその複合体から再び一部解離し、これに
よって検出反応をかいくぐり、その結果特に感度が著し
く低下してしまうという欠点がある。
【０００７】かかる多段階プロセスの診断効率は、固定
された受容体と検出されるべき病因体との間の逆反応速
度が高い場合は、常に著しく激減する。例えば病因体ま
たは薬品に対する低アフィニティー抗体の場合がそうで
ある。これらの問題は特に、固定された特異受容体との
相互作用が変異後に低下を示す、頻繁に変異する病因体
または疾病マーカーの検出方法の場合にも知られてい
る。
された受容体と検出されるべき病因体との間の逆反応速
度が高い場合は、常に著しく激減する。例えば病因体ま
たは薬品に対する低アフィニティー抗体の場合がそうで
ある。これらの問題は特に、固定された特異受容体との
相互作用が変異後に低下を示す、頻繁に変異する病因体
または疾病マーカーの検出方法の場合にも知られてい
る。
【０００８】そこで、前述の欠点を持たない試薬を見出
すことが課題であった。驚くべきことに、検出されるべ
き物質の構造的特徴に対する結合因子の添加により逆反
応速度が実質的に低下することが確認された。この結合
因子は検出されるべき物質に結合できる一以上の部位を
有していなければならず、また物質の免疫化学的検出を
妨げてはならない。検出されるべき物質（被検体）は、
本発明においては、例えば病因体により誘導される抗
体、あるいは抗原自体、例えば病因体それ自体であって
よい。
すことが課題であった。驚くべきことに、検出されるべ
き物質の構造的特徴に対する結合因子の添加により逆反
応速度が実質的に低下することが確認された。この結合
因子は検出されるべき物質に結合できる一以上の部位を
有していなければならず、また物質の免疫化学的検出を
妨げてはならない。検出されるべき物質（被検体）は、
本発明においては、例えば病因体により誘導される抗
体、あるいは抗原自体、例えば病因体それ自体であって
よい。
【０００９】本発明は、従って特異結合パートナーを用
い該特異結合パートナーを担体に固定しそして該特異結
合パートナーに対する被検体の結合度合を直接または間
接に標識を有する更なる特異結合パートナーを用いて測
定するものであって、検出されるべき物質に結合できる
一以上の部位を有し、前記固定された特異結合パートナ
ーに対する親和性を持たず、そして標識されない結合因
子を付加的に用いる、一以上の被検体の免疫化学的測定
方法に関する。
い該特異結合パートナーを担体に固定しそして該特異結
合パートナーに対する被検体の結合度合を直接または間
接に標識を有する更なる特異結合パートナーを用いて測
定するものであって、検出されるべき物質に結合できる
一以上の部位を有し、前記固定された特異結合パートナ
ーに対する親和性を持たず、そして標識されない結合因
子を付加的に用いる、一以上の被検体の免疫化学的測定
方法に関する。
【００１０】本発明の文脈において標識されないとはそ
れが標識を全く有しないかまたは少くとも特異結合パー
トナーに対する被検体の結合度合の測定に用いる標識は
有しないことを意味する。
れが標識を全く有しないかまたは少くとも特異結合パー
トナーに対する被検体の結合度合の測定に用いる標識は
有しないことを意味する。
【００１１】本発明の意味するところでは、添加とは結
合因子が関連のプロセス段階において固相に固定される
か、またはマトリックス化学に基づく当業者に知られた
検出剤の場合には乾燥によりそれに取り込まれすでに固
相に存在することをも意味する。
合因子が関連のプロセス段階において固相に固定される
か、またはマトリックス化学に基づく当業者に知られた
検出剤の場合には乾燥によりそれに取り込まれすでに固
相に存在することをも意味する。
【００１２】結合因子を使用できる方法は、自体すべて
のそれらの実施態様として、当業者に知られている。こ
れらの方法には単一段階および多段階方法が含まれる
が、後者の場合には、個々の段階の間に洗浄段階が挿入
される。
のそれらの実施態様として、当業者に知られている。こ
れらの方法には単一段階および多段階方法が含まれる
が、後者の場合には、個々の段階の間に洗浄段階が挿入
される。
【００１３】重要なことは、第一段階で（好ましくは固
定された）特異結合パートナーに対する被検体の免疫化
学的または同等の結合が行われそして第二の（とはいえ
必ずしも時間的に離す必要はない）段階において直接ま
たは間接的検出が行われるすべての免疫化学的方法に、
本発明方法を適当な形態で使用できることである。
定された）特異結合パートナーに対する被検体の免疫化
学的または同等の結合が行われそして第二の（とはいえ
必ずしも時間的に離す必要はない）段階において直接ま
たは間接的検出が行われるすべての免疫化学的方法に、
本発明方法を適当な形態で使用できることである。
【００１４】それによって結合因子の特定の作用様式を
条件付けるものではないが、ペプチドまたはタンパク質
であってよい被検体が特異固相結合パートナーおよび検
出結合パートナーのほかに少くとも一つの更なるエピト
ープを有していると有利であるように思われる。
条件付けるものではないが、ペプチドまたはタンパク質
であってよい被検体が特異固相結合パートナーおよび検
出結合パートナーのほかに少くとも一つの更なるエピト
ープを有していると有利であるように思われる。
【００１５】好ましくは、結合因子はサンドイッチＥＬ
ＩＳＡなど当業者に知られた方法に用いられ、そして酵
素が、好ましくは色原性または蛍光原性基質または化学
発光性標識と共に、標識系として用いられるのが好まし
い。しかしながら検出方法の態様は結合因子の可能な用
途に大きな影響を及ぼすことはない。
ＩＳＡなど当業者に知られた方法に用いられ、そして酵
素が、好ましくは色原性または蛍光原性基質または化学
発光性標識と共に、標識系として用いられるのが好まし
い。しかしながら検出方法の態様は結合因子の可能な用
途に大きな影響を及ぼすことはない。
【００１６】マイクロタイタープレート、磁性粒子、ラ
テックス粒子またはマトリックス化学に基づくテスト要
素、例えばファイバーまたは膜含有テストモジュールな
どを固相として用いるのが好ましい。前述の如き免疫化
学的方法が異なる被検体、例えばＨＩＶ １／２または
ＨＩＶ １＋２／ＨＣＶの同時測定にも使用できること
も当業者に知られている。かかる態様も本発明に包含さ
れる。
テックス粒子またはマトリックス化学に基づくテスト要
素、例えばファイバーまたは膜含有テストモジュールな
どを固相として用いるのが好ましい。前述の如き免疫化
学的方法が異なる被検体、例えばＨＩＶ １／２または
ＨＩＶ １＋２／ＨＣＶの同時測定にも使用できること
も当業者に知られている。かかる態様も本発明に包含さ
れる。
【００１７】被検体が第二の好ましくは標識された特異
結合パートナーに結合する反応段階で結合因子が添加さ
れる方法が有利である。結合因子の使用は多段階方法に
おいて特に有利な効果を奏し、結合因子は好ましくは第
一洗浄段階後に添加される。さらに、本発明は結合因子
を含有する前記方法に使用するための試薬に関する。更
に、本発明は結合因子が抗体接合体である前記方法に関
する。
結合パートナーに結合する反応段階で結合因子が添加さ
れる方法が有利である。結合因子の使用は多段階方法に
おいて特に有利な効果を奏し、結合因子は好ましくは第
一洗浄段階後に添加される。さらに、本発明は結合因子
を含有する前記方法に使用するための試薬に関する。更
に、本発明は結合因子が抗体接合体である前記方法に関
する。
【００１８】本発明の意味あいにおける結合因子は、検
出されるべき物質に対する生物学的親和性（バイオアフ
ィニティー）を有する一以上の部位を有する特異結合パ
ートナーである。結合因子またはこの結合因子の成分は
抗体の接合体、あるいは抗体自体で構成されていてもよ
い。本発明の意味あいにおける抗体とは、モノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体、あるいは既知の免疫反応
性断片である。
出されるべき物質に対する生物学的親和性（バイオアフ
ィニティー）を有する一以上の部位を有する特異結合パ
ートナーである。結合因子またはこの結合因子の成分は
抗体の接合体、あるいは抗体自体で構成されていてもよ
い。本発明の意味あいにおける抗体とは、モノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体、あるいは既知の免疫反応
性断片である。
【００１９】レクチン、または複数のレクチンの接合
体、またはレクチンと物質−特異的抗体またはそれらの
断片との接合体も同じく適している。結合因子は、測定
方法の各反応段階のいずれの時点で添加してもよいが、
好ましくはその添加は被検体の固相への結合後に行われ
る。
体、またはレクチンと物質−特異的抗体またはそれらの
断片との接合体も同じく適している。結合因子は、測定
方法の各反応段階のいずれの時点で添加してもよいが、
好ましくはその添加は被検体の固相への結合後に行われ
る。
【００２０】特に好ましい結合因子は検出されるべき抗
体の特異免疫グロブリンクラスに対する抗体である。抗
原検出の場合には、結合因子として用いられる抗体は、
固相抗体または接合体抗体と同じエピトープを認識しな
いものであるのが好ましい。少くとも一つの洗浄段階が
用いられる方法が好ましい。
体の特異免疫グロブリンクラスに対する抗体である。抗
原検出の場合には、結合因子として用いられる抗体は、
固相抗体または接合体抗体と同じエピトープを認識しな
いものであるのが好ましい。少くとも一つの洗浄段階が
用いられる方法が好ましい。
【００２１】結合因子は被検体抗体と同種でないのが好
ましい。被検体抗体がヒト抗体である場合には、マウス
またはウサギの抗体または抗体接合体、または抗体断片
の接合体が格別に好ましい。かかる接合体を、それらの
生物学的親和性機能を保存しつつ調製するための当業者
に知られた方法は、例えば化学試薬による、あるいは生
物学的親和性に基づく相互作用による結合である。
ましい。被検体抗体がヒト抗体である場合には、マウス
またはウサギの抗体または抗体接合体、または抗体断片
の接合体が格別に好ましい。かかる接合体を、それらの
生物学的親和性機能を保存しつつ調製するための当業者
に知られた方法は、例えば化学試薬による、あるいは生
物学的親和性に基づく相互作用による結合である。
【００２２】ハイブリッド分子は化学合成、ハイブリド
ーマ技術または遺伝子技術の方法によっても製造でき
る。一以上の規定された病因体に対する、例えばＨＩＶ
１およびＨＩＶ２に対する複数の関連物質（例えば免疫
グロブリンクラスＧおよびＭの抗体）を検出しようとす
るときは、結合因子は例えば、同時に二以上の物質と生
物学的親和性に基づいて相互作用し得る。
ーマ技術または遺伝子技術の方法によっても製造でき
る。一以上の規定された病因体に対する、例えばＨＩＶ
１およびＨＩＶ２に対する複数の関連物質（例えば免疫
グロブリンクラスＧおよびＭの抗体）を検出しようとす
るときは、結合因子は例えば、同時に二以上の物質と生
物学的親和性に基づいて相互作用し得る。
【００２３】本発明による試薬は、人間および動物の診
断分野で多くの方法に用いることができる。例えば、ウ
イルス（例えばＡ、ＢまたはＣ型肝炎ウイルス、および
各種ＨＩＶウイルス）、細菌および寄生虫病原体および
アレルギー障害の構造的特徴に対する様々な免疫グロブ
リンクラスの抗体を検出するための二段階または多段階
テストが挙げられる。更なる例としては、一段階または
多段階検出方法における病因物質、例えばウイルス（例
えばＢ型肝炎ウイルス）、細菌、寄生虫またはアレルゲ
ンおよび疾病のマーカー（例えば腫瘍マーカー）の検出
が挙げられる。本発明を次の実施例により例示するが、
本発明はそれにより限定されるものではない。
断分野で多くの方法に用いることができる。例えば、ウ
イルス（例えばＡ、ＢまたはＣ型肝炎ウイルス、および
各種ＨＩＶウイルス）、細菌および寄生虫病原体および
アレルギー障害の構造的特徴に対する様々な免疫グロブ
リンクラスの抗体を検出するための二段階または多段階
テストが挙げられる。更なる例としては、一段階または
多段階検出方法における病因物質、例えばウイルス（例
えばＢ型肝炎ウイルス）、細菌、寄生虫またはアレルゲ
ンおよび疾病のマーカー（例えば腫瘍マーカー）の検出
が挙げられる。本発明を次の実施例により例示するが、
本発明はそれにより限定されるものではない。
【００２４】
ａ） 本発明による試薬の調製 １mlの０.２Ｍ ＬｉＢＯ ３／２０％ジオキサンを１ml
のＰＢＳ、pH７.２中の４mgのモノクローナル抗−ヒト
ＩｇＧ抗体（Ｆｃ−特異的）に添加し、そしてその混合
物を１５倍モル過剰のＮ−γ−マレイミドブチリルスク
シンイミド（ＧＭＢＳ）で処理し、そして室温で１時間
インキュベートした。未反応のまま残っているヘテロ二
官能性試薬を０.１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液＋５mmol／
リットル ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、pH６.０を用い
たゲルクロマトグラフィー（Sephadex Ｇ−２５）によ
り分離する。
のＰＢＳ、pH７.２中の４mgのモノクローナル抗−ヒト
ＩｇＧ抗体（Ｆｃ−特異的）に添加し、そしてその混合
物を１５倍モル過剰のＮ−γ−マレイミドブチリルスク
シンイミド（ＧＭＢＳ）で処理し、そして室温で１時間
インキュベートした。未反応のまま残っているヘテロ二
官能性試薬を０.１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液＋５mmol／
リットル ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、pH６.０を用い
たゲルクロマトグラフィー（Sephadex Ｇ−２５）によ
り分離する。
【００２５】４mlの１０mmol／リットル燐酸ナトリウム
および１００mmol／リットルＮａＣｌ、pH７.４中の４m
gのモノクローナル抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ−特異
的）を２４倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル−３−
（２−ピリジル−ジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）と共に室温で３０分間インキュベートした後、ジチ
オトレイトール（ＳＰＤＰに対し１００倍モル過剰）を
用いて室温で１５分間還元する。還元完了後、低分子成
分をSephadex Ｇ−２５（０.１Ｍ燐酸ナトリウム、５mm
ol／リットルＮＴＡ、pH６.０）でのゲル濾過により除
去する。
および１００mmol／リットルＮａＣｌ、pH７.４中の４m
gのモノクローナル抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ−特異
的）を２４倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル−３−
（２−ピリジル−ジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）と共に室温で３０分間インキュベートした後、ジチ
オトレイトール（ＳＰＤＰに対し１００倍モル過剰）を
用いて室温で１５分間還元する。還元完了後、低分子成
分をSephadex Ｇ−２５（０.１Ｍ燐酸ナトリウム、５mm
ol／リットルＮＴＡ、pH６.０）でのゲル濾過により除
去する。
【００２６】ＳＨ−活性化抗−ヒトＩｇＧをマレイミド
−活性化抗−ヒトＩｇＧと共に室温で２時間インキュベ
ートし、次いで１／１０容の０.１Ｍ Ｎ−エチルマレイ
ミドで反応を止める。接合体を５０mmol／リットル Ｔ
ＲＩＳ／ＨＣｌ、pH７.４を用いたゲルクロマトグラフ
ィー（ＡＣＡ３４、ＬＫＢ）により精製後、１〜３mg／
mlまで濃縮した。
−活性化抗−ヒトＩｇＧと共に室温で２時間インキュベ
ートし、次いで１／１０容の０.１Ｍ Ｎ−エチルマレイ
ミドで反応を止める。接合体を５０mmol／リットル Ｔ
ＲＩＳ／ＨＣｌ、pH７.４を用いたゲルクロマトグラフ
ィー（ＡＣＡ３４、ＬＫＢ）により精製後、１〜３mg／
mlまで濃縮した。
【００２７】ｂ） ＨＩＶ１（env）−ペプチド−ペル
オキシダーゼ接合体 １０mgのＨＩＶ１（gp４１）ペプチド（ＩＡＦ BioChe
m、カナダ）を１mlの氷酢酸／水（５０：５０、容／
容）に溶解する。５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和後、
１０倍モル過剰のＧＭＢＳをその混合物に添加し、それ
を次いで室温で１時間インキュベートする。未反応のま
ま残っているＧＭＢＳを０.１Ｍ燐酸ナトリウム／５mmo
l／リットル ＮＴＡ、pH６.０を用いたゲル濾過（Sepha
dex Ｇ−２５）により分離する。１０mgの西洋ワサビペ
ルオキシダーゼを５mlの１０mmol／リットル燐酸ナトリ
ウムおよび１００mmol／リットル ＮａＣｌ、pH８.０中
で１００倍モル過剰の２−イミノチオランと共に室温で
１時間インキュベートする。次に遊離変性試薬を０.１
Ｍ燐酸ナトリウム／５mmol／リットル ＮＴＡ、pH６.０
を用いたゲルクロマトグラフィー（Sephadex Ｇ−２
５）により除去する。
オキシダーゼ接合体 １０mgのＨＩＶ１（gp４１）ペプチド（ＩＡＦ BioChe
m、カナダ）を１mlの氷酢酸／水（５０：５０、容／
容）に溶解する。５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和後、
１０倍モル過剰のＧＭＢＳをその混合物に添加し、それ
を次いで室温で１時間インキュベートする。未反応のま
ま残っているＧＭＢＳを０.１Ｍ燐酸ナトリウム／５mmo
l／リットル ＮＴＡ、pH６.０を用いたゲル濾過（Sepha
dex Ｇ−２５）により分離する。１０mgの西洋ワサビペ
ルオキシダーゼを５mlの１０mmol／リットル燐酸ナトリ
ウムおよび１００mmol／リットル ＮａＣｌ、pH８.０中
で１００倍モル過剰の２−イミノチオランと共に室温で
１時間インキュベートする。次に遊離変性試薬を０.１
Ｍ燐酸ナトリウム／５mmol／リットル ＮＴＡ、pH６.０
を用いたゲルクロマトグラフィー（Sephadex Ｇ−２
５）により除去する。
【００２８】両溶出液（ＳＨ−活性化ペルオキシダーゼ
およびマレイミド−変性ＨＩＶ１−ペプチド）を合一
し、そして一夜室温でインキュベートした。１／１０容
の０.１Ｍ Ｎ−エチルマレイミドで反応を止めた後、そ
の接合体から未反応ＨＩＶ１ペプチドをゲルクロマトグ
ラフィー（Sephadex Ｇ−２５）により除去する。濃縮
（２mg／ml）後、ペプチド−ペルオキシダーゼ接合体を
−２０℃で保存する。
およびマレイミド−変性ＨＩＶ１−ペプチド）を合一
し、そして一夜室温でインキュベートした。１／１０容
の０.１Ｍ Ｎ−エチルマレイミドで反応を止めた後、そ
の接合体から未反応ＨＩＶ１ペプチドをゲルクロマトグ
ラフィー（Sephadex Ｇ−２５）により除去する。濃縮
（２mg／ml）後、ペプチド−ペルオキシダーゼ接合体を
−２０℃で保存する。
【００２９】ｃ） ＨＩＶ１抗体検出のための二段階式
酵素イムノアッセイ 抗−ＨＩＶ１抗体検出のための酵素イムノアッセイを次
のようにして行う：２５μｌの検体緩衝液（０.３Ｍ Tr
is／ＨＣｌおよび１％アルブミン、２％Tween２０、pH
７.２）をＨＩＶ１およびＨＩＶ２ペプチドでコートさ
れたテストプレート（REnzygnost Anti ＨＩＶ １＋
２、Behringwerke AG、 Marburg、 独連邦共和国）のウエ
ル中、１００μｌのヒト血清と共に３７℃で３０分間イ
ンキュベートする。５０mmol／リットル ＰＢＳ、０.１
％ Tween２０で４回洗浄後、実施例１ｂ）に従って調製
された１００μｌのＨＩＶ１ペプチド−ペルオキシダー
ゼ接合体（０.１Ｍ Tris／ＨＣｌ、１％アルブミンおよ
び２％プルロニック（Pluronic）Ｆ６４、pH８.１中、
１：１０００）をピペットで添加する。
酵素イムノアッセイ 抗−ＨＩＶ１抗体検出のための酵素イムノアッセイを次
のようにして行う：２５μｌの検体緩衝液（０.３Ｍ Tr
is／ＨＣｌおよび１％アルブミン、２％Tween２０、pH
７.２）をＨＩＶ１およびＨＩＶ２ペプチドでコートさ
れたテストプレート（REnzygnost Anti ＨＩＶ １＋
２、Behringwerke AG、 Marburg、 独連邦共和国）のウエ
ル中、１００μｌのヒト血清と共に３７℃で３０分間イ
ンキュベートする。５０mmol／リットル ＰＢＳ、０.１
％ Tween２０で４回洗浄後、実施例１ｂ）に従って調製
された１００μｌのＨＩＶ１ペプチド−ペルオキシダー
ゼ接合体（０.１Ｍ Tris／ＨＣｌ、１％アルブミンおよ
び２％プルロニック（Pluronic）Ｆ６４、pH８.１中、
１：１０００）をピペットで添加する。
【００３０】（＋３７℃での）３０分間インキュベーシ
ョンをさらに４回洗浄段階を行って停止させた。結合Ｈ
ＩＶ１−特異抗体数と直接相関する結合ペルオキシダー
ゼ活性をＨ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン（Behringwer
ke AG、 Marburg、独連邦共和国）の添加により測定す
る。
ョンをさらに４回洗浄段階を行って停止させた。結合Ｈ
ＩＶ１−特異抗体数と直接相関する結合ペルオキシダー
ゼ活性をＨ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン（Behringwer
ke AG、 Marburg、独連邦共和国）の添加により測定す
る。
【００３１】ｄ） 本発明による試薬の使用 抗−ＨＩＶ１陽性血清および抗−ＨＩＶ陰性血清をｃ）
による酵素イムノアッセイで検査する。一方のケースで
は１０μｌの５０mmol／リットル Tris／ＨＣｌ、pH７.
４（対照系）を、そして他方の例では１０μｌの本発明
に従ってａ）により調製された試薬（本発明系）を１０
mlの接合体溶液に添加する。
による酵素イムノアッセイで検査する。一方のケースで
は１０μｌの５０mmol／リットル Tris／ＨＣｌ、pH７.
４（対照系）を、そして他方の例では１０μｌの本発明
に従ってａ）により調製された試薬（本発明系）を１０
mlの接合体溶液に添加する。
【００３２】検査結果（吸光単位）を表１に示し、そし
て陽性血清のＨＩＶ１抗体の力価測定比較を図１および
図２に示す。
て陽性血清のＨＩＶ１抗体の力価測定比較を図１および
図２に示す。
【００３３】
【表１】
【図１】本発明方法を用いた場合と用いない場合の、陽
性血清のＨＩＶ１抗体の力価測定を対比した図である。
性血清のＨＩＶ１抗体の力価測定を対比した図である。
【図２】本発明方法を用いた場合と用いない場合の、陽
性血清のＨＩＶ１抗体の力価測定を対比した図である。
性血清のＨＩＶ１抗体の力価測定を対比した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/579
Claims (6)
- 【請求項１】 第一特異結合パートナーを用い、該特異
結合パートナーを担体に固定しそして該特異結合パート
ナーに対する被検体の結合度合を直接または間接に標識
を有する更なる特異結合パートナーを用いて測定し、そ
の過程に、検出されるべき物質に結合できる一以上の部
位を有し、前記固定された特異結合パートナーに対する
親和性を持たず、そして測定の信号形成に用いられる標
識によっては標識されない結合因子を付加的に添加す
る、検体中の被検体の免疫化学的測定方法。 - 【請求項２】 結合因子が、被検体が第二特異結合パー
トナーに結合する反応段階で添加される請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 被検体が抗原である請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】 被検体が抗体である請求項１記載の方
法。 - 【請求項５】 結合因子が抗体接合体である請求項１〜
４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 担体に固定されていて被検体に特異的な
第一結合パートナー、および標識を有していて前記被検
体に特異的な第二結合パートナー、並びに前記被検体に
特異的で、その被検体に対して１以上の結合部位を有
し、前記第一特異結合パートナーに対して親和性を持た
ず、前記標識で標識されず、さらに第一結合パートナー
および第二結合パートナーと前記被検体との結合を妨げ
ない結合因子を含有する、請求項１〜５のいずれかに記
載の方法に用いるための試薬。
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| CN106324253A (zh) * | 2016-08-12 | 2017-01-11 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 一种梅毒螺旋体抗体测定试剂盒及其检测方法 |
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| US4495296A (en) * | 1979-05-21 | 1985-01-22 | New York Blood Center, Inc. | Labeled anti-hapten antibodies and their use as a universal reagent for solid phase radio- and/or enzyme-immunoassays |
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| US5011771A (en) * | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
| US4743542A (en) * | 1985-04-11 | 1988-05-10 | Ortho Diagnostic | Method for forestalling the hook effect in a multi-ligand immunoassay system |
| DE3834766A1 (de) * | 1988-10-12 | 1990-04-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| CA2008100A1 (en) * | 1989-01-20 | 1990-07-20 | Hubert Bayer | Method for the determination of immunologically detectable substance |
| CA2044629A1 (en) * | 1989-11-02 | 1991-05-03 | Kimihiko Matsuzawa | Method for the immunological assay of human thrombomodulin, reagent therefor and kit therefor |
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- 1992-06-03 DE DE4218257A patent/DE4218257A1/de not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-05-14 ES ES93107931T patent/ES2117067T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-14 DE DE59308328T patent/DE59308328D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-14 AT AT93107931T patent/ATE164682T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 EP EP93107931A patent/EP0572845B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-02 JP JP13156793A patent/JP3327488B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-06-02 AU AU39966/93A patent/AU668937B2/en not_active Ceased
- 1993-06-02 CA CA002097545A patent/CA2097545C/en not_active Expired - Fee Related
-
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- 1995-05-15 US US08/441,175 patent/US5914243A/en not_active Expired - Lifetime
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| EP0572845B1 (de) | 1998-04-01 |
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|---|---|---|---|
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