CN102520191B - 一种运用elisa测定蛋白质浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法。该方法将待测蛋白质的抗体与酶标记抗体混合获得混合抗体，运用ELISA测定蛋白质浓度。本发明提供的方法准确度较高，重现性较好，简化操作步骤，节约测定时间。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法。
背景技术
酶联免疫吸附测试(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。ELISA法作为一种重要的疾病诊断技术，具有成本低，特异性强、灵敏度高，安全无污染等优点，因此被广泛应用于科研及医疗领域。
由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性；而另一方面，又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化第五分子发生反应，产生放大作用，因此，ELISA法具有很高的敏感性。
通常间接法ELISA首先用抗原包被固相载体，然后加入特异性抗体即一抗，使之与固相抗原结合，再加入酶标记的二抗，使之与一抗结合，反应后加入底物显色，颜色的深浅与标本中抗原的量成正比，可通过酶标仪显示具体数据。这一过程有多次洗板操作，难免引起误差，且较耗费时间。因此，在不影响检测范围的前提下，对这一技术进行改进具有现实意义。
目前，改进ELISA的方法很多，主要有以下几点：
对基材的改性，通常采用紫外照射，等离子体处理等方法来处理酶标板表面以提高其对抗原的结合能力，但这些方法都需要特殊设备，成本高，操作较为复杂。
对试剂的优化，以单克隆抗体取代多克隆抗体，以及使用敏感度高的显色体系都可以提高检测的灵敏度，但需要花费大量的人力物力进行研究。
对操作过程的改进，双抗体夹心法一直是ELISA法的经典方法之一，双位点一步法在此基础上改进，大大节约了检测时间，但是对于高浓度的抗原检测，会出现“HOOK”效应(吸光值随浓度增大先升高后明显降低的现象)，造成标本假低值，甚至出现假阴性的错误结果。
因此，需要在准确测量抗原样品浓度的基础上，提供一种简化操作步骤，节约时间、准确度较高的运用ELISA测定蛋白质浓度的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法。该方法将待测蛋白质的抗体与酶标记抗体混合获得混合抗体，运用ELISA测定蛋白质浓度。本发明提供的方法准确度较高，重现性较好，简化操作步骤，节约测定时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法，包括如下步骤：
取待测蛋白质的抗体经第一稀释后获得第一抗体；
取酶标记抗体经第二稀释后获得第二抗体；
取所述第一抗体与所述第二抗体混合获得混合抗体，所述第一抗体与所述第二抗体的摩尔浓度之比为1∶0.0625～1∶2；
取待测蛋白质的标准品获得系列浓度的标准溶液，取所述标准溶液包被基板，第一孵育、洗板、封闭后，加入所述混合抗体，第二孵育后加入所述酶的底物显色，终止反应后，测得吸光度值，获得标准曲线；
取待测蛋白质获得待测溶液，取所述待测溶液包被基板，第三孵育、洗板、封闭后，加入所述混合抗体，第四孵育后加入所述酶的底物显色，终止反应后，测得吸光度值，与所述标准曲线比较，获得所述蛋白质的浓度。
本发明提供的方法中，获得的混合抗体肉眼观察无看见浑浊，在500～600nm检测，吸收峰与混合前所述带测蛋白质的抗体、所述酶标记抗体的吸收峰相比，均未出现明显尖锐的峰，即均无显著变化。因此，本发明提供的混合抗体能够用于ELISA法测定蛋白质含量。
作为优选，所述第一稀释倍数为2500～5000倍。
作为优选，所述第二稀释倍数为300～10000倍。
作为优选，所述第一抗体与所述第二抗体的体积比为1～10∶10～1。
优选地，所述第一抗体与所述第二抗体的体积比为1∶1。
作为优选，所述吸光度值在400～600nm下测定。
优选地，所述吸光度值在405nm下测定。
作为优选，所述第一孵育或第三孵育具体为于30～40℃孵育2～4h。
作为优选，所述封闭加入牛血清白蛋白于30～40℃孵育0.5～1.5h。
作为优选，所述第二孵育或第四孵育具体为于30～40℃孵育0.5～1.5h。
作为优选，所述显色具体为0～30℃显色5～30min。
作为优选，所述待测蛋白质的抗体为所述待测蛋白质的单克隆抗体。
一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，因此，本发明提供的酶标二抗可以为普遍使用的酶标抗体，作为优选，所述酶标记抗体与所述待测蛋白质的抗体同源，即二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可)；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗，即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
作为优选，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在抗体产品说明书中有描述，如果一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM；如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)，那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果一抗是小鼠IgG1，那么可以选择抗IgG1的二抗。在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。
所述酶标记抗体中的酶可以为辣根过氧化酶HRP、碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP等。作为优选，所述酶标记抗体的酶选用碱性磷酸酶。
本发明提供一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法。该方法将待测蛋白质的抗体与酶标记抗体混合获得混合抗体，运用ELISA测定蛋白质浓度。本发明提供的方法准确度较高，重现性较好，简化操作步骤，节约测定时间。
附图说明
图1示本发明实施例1中人血清白蛋白标准溶液不同浓度对应的吸光度值，其中，横坐标为人血清白蛋白浓度，单位为ng/mL；纵坐标为405nm下的吸光度值；
示对照组，
示试验组；
图2示根据本发明实施例1中人血清白蛋白标准溶液的浓度及对应的吸光度值制作的标准曲线，其中，横坐标为人血清白蛋白浓度，单位为ng/mL；纵坐标为405nm下的吸光度值；
示对照组，示试验组；对照组的r值为0.9940，试验组的r值为0.9981。
具体实施方式
本发明公开了一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法，包括如下步骤：
取待测蛋白质的抗体经第一稀释后获得第一抗体；
取酶标记抗体经第二稀释后获得第二抗体；
取所述第一抗体与所述第二抗体混合获得混合抗体，所述第一抗体与所述第二抗体的摩尔浓度之比为1∶0.0625～1∶2；
取待测蛋白质的标准品获得系列浓度的标准溶液，取所述标准溶液包被基板，第一孵育、洗板、封闭后，加入所述混合抗体，第二孵育后加入所述酶的底物显色，终止反应后，测得吸光度值，获得标准曲线；
取待测蛋白质获得待测溶液，取所述待测溶液包被基板，第三孵育、洗板、封闭后，加入所述混合抗体，第四孵育后加入所述酶的底物显色，终止反应后，测得吸光度值，与所述标准曲线比较，获得所述蛋白质的浓度。
作为优选，所述第一稀释倍数为2500～5000倍。
作为优选，所述第二稀释倍数为300～10000倍。
作为优选，所述第一抗体与所述第二抗体的体积比为1～10∶10～1。
优选地，所述第一抗体与所述第二抗体的体积比为1∶1。
作为优选，所述吸光度值在400～600nm下测定。
优选地，所述吸光度值在405nm下测定。
作为优选，所述第一孵育或第三孵育具体为于30～40℃孵育2～4h。
作为优选，所述封闭加入牛血清白蛋白于30～40℃孵育0.5～1.5h。
作为优选，所述第二孵育或第四孵育具体为于30～40℃孵育0.5～1.5h。
作为优选，所述显色具体为0～30℃显色5～30min。
作为优选，所述待测蛋白质的抗体为所述待测蛋白质的单克隆抗体。
在本发明的一些实施例中，抗体的稀释液可以为1％BSA、0.1％Proclin(防腐剂)于0.01M pH值为7.4的PBS中，为减低本底还可考虑加入0.2％Tween20。
在本发明的一些实施例中，待测蛋白质的稀释液可以为磷酸盐缓冲液，pH值为9～10，优选为9.6。
本发明提供的方法，具体可以为：
制备混合抗体：将待测蛋白质的单克隆抗体稀释2500～5000倍，酶标记抗体稀释300～10000倍，以体积比1～10∶10～1混合均匀，置于4℃待用。
制备标准溶液：将待测蛋白质的标准品稀释获得系列浓度的标准溶液。
制备待测溶液：将待测蛋白质稀释获得待测溶液。
包被：每孔加入50～200μL标准溶液或待测溶液，30～40℃温育2～4h。
洗板：弃去孔内溶液，每孔加入200μL洗涤缓冲液，静置浸泡3～5min后弃去，于干净的吸水纸或毛巾上拍干，如上共洗4次。
封闭：每孔加入120μL 1％BSA封闭液，放入已预热的湿盒中，30～40℃温育0.5～1.5h，封闭非特异性结合位点。
同上洗板操作后，每孔加入已制备好的混合抗体50～200μL，30～40℃温育0.5～1.5h。
同上洗板操作后，于各反应孔中加入底物溶液50～200μL，20～30℃显色5～30min。
终止反应：于各反应孔中加入NaOH终止液50μL，立即充分震荡混匀。
结果测定：于5min之内在预热好的酶标仪上测读OD 405nm值。
将系列浓度的标准溶液的相应吸光度值制作标准曲线，将待测溶液的吸光度值与标准曲线比较，获得待测蛋白质的浓度。
准确度检测：
将已知浓度为450ng/mL的鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体稀释5000倍，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗依次稀释300倍，600倍，1200倍，2400倍，以体积比1∶1混合均匀(此时二者的摩尔浓度比依次为1∶2，1∶1，1∶0.5，1∶0.25)，置于4℃冰箱待用。
将人血清白蛋白用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)进行逐级稀释，得到浓度依次为1ng/mL，5g/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL的蛋白溶液。以每孔100μL用量将上述梯度溶液以及未知浓度的人血清白蛋白样品包被于酶标板中，于37℃烘箱温育3h。弃去板中包被溶液，用洗涤缓冲液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔120μL加入含1％牛血清白蛋白的封闭液，于37℃封闭1h。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。
试验组：每孔加入100μL预先制备的混合抗体，于37℃温育1h，平行测定三次。
对照组：每孔加入100μL稀释10000倍的鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体，于37℃温育1h，洗涤后，再加入稀释600倍、1200倍、2400倍、4800倍的碱性磷酸酶标记的二抗，于37℃温育1h，平行测定三次。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入100μL 1mg/mL对硝基苯磷酸二钠溶液后，于37℃反应相同时间后每孔加入50μL 3mol/L的氢氧化钠水溶液终止反应。在酶标仪上于405nm读取各孔吸光值。
试验组测定结果显示，测得人血清白蛋白的浓度平均值依次为449.78ng/mL，463.21ng/mL，446.31ng/mL，458.87ng/mL，与人血清白蛋白的浓度450ng/mL差异不显著(P≥0.05)；对照组测定结果显示，测得人血清白蛋白的浓度依次为458.27ng/mL、486.85ng/mL、466.21ng/mL、479.30ng/mL与人血清白蛋白的浓度450ng/mL差异显著(P≤0.05)，表明本发明提供的方法准确度较高。
本发明提供一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法。该方法将待测蛋白质的抗体与酶标记抗体混合获得混合抗体，运用ELISA测定蛋白质浓度。本发明提供的方法准确度较高，重现性较好，简化操作步骤，节约测定时间。
本发明提供的方法中所用试剂均可由市场购得。其中，人血清白蛋白、鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体、人CD3分子、鼠抗人CD3分子单克隆抗体、人癌胚抗原CEA、鼠抗CEA单克隆抗体、人β2微球蛋白、鼠抗人β2微球蛋白单克隆抗体、购自sigma公司；辣根过氧化物酶酶标记的羊抗鼠IgG二抗、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗购自bioworld公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
将鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体稀释5000倍，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗依次稀释9600倍，以体积比1∶1混合均匀(此时二者的摩尔浓度比依次为1∶0.0625)置于4℃冰箱待用。
将人血清白蛋白用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)进行逐级稀释，得到浓度依次为1ng/mL，5g/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，5000ng/mL，10000ng/mL的蛋白溶液。以每孔100μL用量将上述梯度溶液包被于酶标板中，于37℃烘箱温育3h。弃去板中包被溶液，用洗涤缓冲液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔120μL加入含1％牛血清白蛋白的封闭液，于37℃封闭1h。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。
试验组：每孔加入100μL预先制备的混合抗体，于37℃温育1h，平行测定三次。
对照组：每孔加入100μL稀释10000倍的鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体，于37℃温育1h，平行测定三次。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入100μL稀释19200倍的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗，于37℃温育1h。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入100μL 1mg/mL对硝基苯磷酸二钠溶液后，于37℃反应相同时间后每孔加入50μL 3mol/L的氢氧化钠水溶液终止反应。在酶标仪上于405nm读取各孔吸光值。
结果如图1所示，对照组的线性范围是1～500ng/mL，本发明提供的方法试验组的线性范围是1～1000ng/mL，在相同的浓度范围(1～500ng/mL)，本发明提供的方法的线性相关系数r更接近1。此外，试验组中，无论以何种摩尔浓度比混合，开始吸光值随着HSA浓度的增大而逐渐增加，当人血清白蛋白浓度达到5μg/mL时，OD值达到饱和，几乎不再升高。且随着浓度的继续增大，没有出现“HOOK”效应(吸光值随着浓度增大先升高后明显降低)。一抗浓度固定不变，调节二抗浓度，从而改变其摩尔浓度比，在相同显色时间时，二抗浓度越大，其OD值也越大，说明不仅与HSA浓度相关，也与结合的碱性磷酸酶的量有关。
试验组的标准曲线为：y＝0.0005x+0.0008，r值为0.9981；
对照组的标准曲线为：y＝0.0006x+0.0165，r值为0.9940；
拟合浓度范围为1～500ng/mL。
试验组三次测定结果显示，测得人血清白蛋白的浓度依次为445.80ng/mL，453.26ng/mL，449.17ng/mL，三次结果无显著差异(P≥0.05)，与人血清白蛋白的浓度450ng/mL差异不显著(P≥0.05)；对照组三次测定结果显示，测得人血清白蛋白的浓度依次为483.14ng/mL、469.25ng/mL、476.18ng/mL，三次结果差异较显著(P≤0.05)，与人血清白蛋白的浓度450ng/mL差异显著(P≤0.05)。
实施例2
将鼠抗人CD3分子单克隆抗体稀释1000倍，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠1gG二抗稀释9000倍，以体积比1∶9混合均匀置于4℃冰箱待用。
将人CD3分子用碳酸盐缓冲液(pH＝9.0)进行逐级稀释，得到浓度依次为2.5ng/mL，5g/mL，10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，80ng/mL，160ng/mL的蛋白溶液。以每孔200μL用量将上述梯度溶液包被于酶标板中，于30℃烘箱温育4h。弃去板中包被溶液，用洗涤缓冲液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔120μL加入含1％牛血清白蛋白的封闭液，于30℃封闭1.5h。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。
试验组：每孔加入200μL预先制备的混合抗体，于30℃温育1.5h，平行测定三次。
对照组：每孔加入200μL稀释10000倍的鼠抗人CD3分子单克隆抗体，于30℃温育1.5h，平行测定三次。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入200μL稀释10000倍的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗，于30℃温育1.5h。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入200μL 1mg/mL对硝基苯磷酸二钠溶液后，于30℃反应相同时间后每孔加入50μL 3mol/L的氢氧化钠水溶液终止反应。在酶标仪上于405nm读取各孔吸光值。
试验组的标准曲线为：y＝0.0136x+0.0025，r值为0.9928；
对照组的标准曲线为：y＝0.0149x+0.0039，r值为0.9879；
拟合浓度范围为2.5～40ng/mL。
试验组三次测定结果显示，测得人CD3分子的浓度依次为29.1ng/mL，29.8ng/mL，29.7ng/mL，三次结果间无显著差异(P≥0.05)，与人CD3分子的浓度30ng/mL差异不显著(P≥0.05)；对照组三次测定结果显示，测得人CD3分子的浓度依次为34.3ng/mL、38.2ng/mL、37.1ng/mL，三次结果间差异较显著(P≤0.05)，与人CD3分子的浓度30ng/mL差异显著(P≤0.05)。
实施例3
将鼠抗人癌胚抗原CEA单克隆抗体稀释4500倍，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠1gG二抗稀释300倍，以体积比9∶1混合均匀置于4℃冰箱待用。
将人癌胚抗原CEA用碳酸盐缓冲液(pH＝10.0)进行逐级稀释，得到浓度依次为1ng/mL，5g/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，的蛋白溶液。以每孔50μL用量将上述梯度溶液包被于酶标板中，于40℃烘箱温育2h。弃去板中包被溶液，用洗涤缓冲液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔120μL加入含1％牛血清白蛋白的封闭液，于40℃封闭0.5h。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。
试验组：每孔加入50μL预先制备的混合抗体，于40℃温育0.5h，平行测定三次。
对照组：每孔加入50μL稀释5000倍的鼠抗人癌胚抗原CEA单克隆抗体，于40℃温育0.5h，平行测定三次。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入50μL稀释3000倍的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗，于40℃温育0.5h。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入50μL 1mg/mL对硝基苯磷酸二钠溶液后，于40℃反应相同时间后每孔加入50μL 3mol/L的氢氧化钠水溶液终止反应。在酶标仪上于405nm读取各孔吸光值。
试验组的标准曲线为：y＝0.0132x+0.0077，r值为0.9891；
对照组的标准曲线为：y＝0.0166x+0.0134，r值为0.9780；
拟合范围为10～500ng/mL。
试验组三次测定结果显示，测得人癌胚抗原CEA的浓度依次为24.2ng/mL，25.1ng/mL，25.5ng/mL，三次结果间无显著差异(P≥0.05)，与人癌胚抗原CEA的浓度25ng/mL差异不显著(P≥0.05)；对照组三次测定结果显示，测得人癌胚抗原CEA的浓度依次为27.4ng/mL、29.2ng/mL、27.1ng/mL，三次结果间差异较显著(P≤0.05)，与人癌胚抗原CEA的浓度25ng/mL差异显著(P≤0.05)。
实施例4
将鼠抗人β2微球蛋白单克隆抗体稀释1000倍，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠1gG二抗稀释5000倍，以体积比1∶5混合均匀置于4℃冰箱待用。
将人β2微球蛋白用碳酸盐缓冲液(pH＝10.0)进行逐级稀释，得到浓度依次为1ng/mL，5g/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL的蛋白溶液。以每孔150μL用量将上述梯度溶液包被于酶标板中，于32℃烘箱温育2.8h。弃去板中包被溶液，用洗涤缓冲液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔120μL加入含1％牛血清白蛋白的封闭液，于32℃封闭1.2h。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。
试验组：每孔加入150μL预先制备的混合抗体，于32℃温育1.2h，平行测定三次。
对照组：每孔加入150μL稀释6000倍的鼠抗人β2微球蛋白单克隆抗体，于32℃温育1.2h，平行测定三次。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入150μL稀释6000倍的辣根过氧化物酶的羊抗鼠二抗，于32℃温育1.2h。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入150μL 1mg/mL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液后，于32℃反应相同时间后每孔加入50μL 3mol/L的硫酸水溶液终止反应。在酶标仪上于450nm读取各孔吸光值。
试验组的标准曲线为：y＝0.0047x+0.0004，r值为0.9810；
对照组的标准曲线为：y＝0.0056x+0.0012，r值为0.9754；
拟合浓度范围为10～500ng/mL。
试验组三次测定结果显示，测得人β2微球蛋白的浓度依次为293.16ng/mL，298.90ng/mL，301.55ng/mL，三次结果间无显著差异(P≥0.05)，与人β2微球蛋白的浓度300ng/mL差异不显著(P≥0.05)；对照组三次测定结果显示，测得人β2微球蛋白的浓度依次为318.30ng/mL、330.54ng/mL、339.43ng/mL，三次结果间差异较显著(P≤0.05)，与人β2微球蛋白的浓度300ng/mL差异显著(P≤0.05)。
实施例5
将鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体稀释1000倍，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠1gG二抗稀释8000倍，以体积比1∶8混合均匀置于4℃冰箱待用。
将人血清白蛋白用碳酸盐缓冲液(pH＝9.2)进行逐级稀释，得到浓度依次为1ng/mL，5g/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，5000ng/mL，10000ng/mL的蛋白溶液。以每孔100μL用量将上述梯度溶液包被于酶标板中，于35℃烘箱温育2.5h。弃去板中包被溶液，用洗涤缓冲液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔120μL加入含1％牛血清白蛋白的封闭液，于35℃封闭0.8h。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。
试验组：每孔加入100μL预先制备的混合抗体，于35℃温育0.8h，平行测定三次。
对照组：每孔加入100μL稀释9000倍的鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体，于35℃温育0.8h，平行测定三次。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入100μL稀释9000倍的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗，于35℃温育0.8h。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入100μL 1mg/mL对硝基苯磷酸二钠溶液后，于35℃反应相同时间后每孔加入50μL 3mol/L的氢氧化钠水溶液终止反应。在酶标仪上于405nm读取各孔吸光值。
试验组的标准曲线为：y＝0.0005x-0.0004，r值为0.9986；
对照组的标准曲线为：y＝0.0006x+0.0017，r值为0.9932；
拟合浓度范围为1～500ng/mL。
试验组三次测定结果显示，测得人血清白蛋白的浓度依次为496.33ng/mL，501.21ng/mL，498.57ng/mL，三次结果间无显著差异(P≥0.05)，与人血清白蛋白的浓度500ng/mL差异不显著(P≥0.05)；对照组三次测定结果显示，测得人血清白蛋白的浓度依次为475.60ng/mL、481.29ng/mL、463.26ng/mL，三次结果见差异较显著(P≤0.05)，与人血清白蛋白的浓度500ng/mL差异显著(P≤0.05)。
实施例6
将鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体稀释4500倍，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠1gG二抗稀释2000倍，以体积比5∶1混合均匀置于4℃冰箱待用。
将人血清白蛋白用碳酸盐缓冲液(pH＝9.8)进行逐级稀释，得到浓度依次为1ng/mL，5g/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL的蛋白溶液。以每孔120μL用量将上述梯度溶液包被于酶标板中，于38℃烘箱温育3h。弃去板中包被溶液，用洗涤缓冲液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体，以每孔120μL加入含1％牛血清白蛋白的封闭液，于38℃封闭0.6h。弃去封闭液，于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。
试验组：每孔加入120μL预先制备的混合抗体，于38℃温育0.6h，平行测定三次。
对照组：每孔加入120μL稀释5400倍的鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体，于38℃温育0.6h，平行测定三次。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入100μL稀释12000倍的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗，于38℃温育0.6h。
弃去板中抗体溶液，用洗板液洗涤4次后于吸水纸上拍干多孔板中残余液体。每孔加入120μL 1mg/mL对硝基苯磷酸二钠溶液后，于38℃反应相同时间后每孔加入50μL 3mol/L的氢氧化钠水溶液终止反应。在酶标仪上于500nm读取各孔吸光值。
试验组的标准曲线为：y＝0.0002x-0.0055，r值为0.9955；
对照组的标准曲线为：y＝0.0003x-0.0041，r值为0.9819；
拟合浓度范围为1～500ng/mL。
试验组三次测定结果显示，测得人血清白蛋白的浓度依次为353.41ng/mL，350.84ng/mL，346.39ng/mL，三次结果间无显著差异(P≥0.05)，与人血清白蛋白的浓度350ng/mL差异不显著(P≥0.05)；对照组三次测定结果显示，测得人血清白蛋白的浓度依次为358.10ng/mL、360.25ng/mL、363.72ng/mL，三次结果间差异较显著(P≤0.05)，与人血清白蛋白的浓度350ng/mL差异显著(P≤0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种运用ELISA测定蛋白质浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待测蛋白质的抗体经第一稀释后获得第一抗体；
取酶标记抗体经第二稀释后获得第二抗体；
取所述第一抗体与所述第二抗体混合获得混合抗体，所述第一抗体与所述第二抗体的摩尔浓度之比为1∶0.0625～1∶2；
取待测蛋白质的标准品获得系列浓度的标准溶液，取所述标准溶液包被基板，第一孵育、洗板、封闭后，加入所述混合抗体，第二孵育后加入所述酶的底物显色，终止反应后，测得所述系列浓度的标准溶液的吸光度值，获得标准曲线；
取待测蛋白质获得待测溶液，取所述待测溶液包被基板，第三孵育、洗板、封闭后，加入所述混合抗体，第四孵育后加入所述酶的底物显色，终止反应后，测得吸光度值，与所述标准曲线比较，获得所述蛋白质的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一稀释倍数为2500～5000倍。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二稀释倍数为300～10000倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗体与所述第二抗体的体积比为1～10∶10～1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸光度值在400～600nm下测定。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一孵育或第三孵育具体为于30～40℃孵育2～4h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述封闭加入牛血清白蛋白于30～40℃孵育0.5～1.5h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二孵育或第四孵育具体为于30～40℃孵育0.5～1.5h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显色具体为0～30℃显色5～30min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测蛋白质的抗体为所述待测蛋白质的单克隆抗体。
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