KR920005963B1 - 특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법
제1도는 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에 대한 3개의 반응 원리를 표시한다.
제2도는 반응식 1a에 따라 T4-POD 접합체를 사용해 T4를 측정하는 것에 대한 검량 곡선을 표시한다. 곡선 1 : 10nmole/1 T4-비오틴 ; 곡선 2 : 1nmole/1 T4-비오틴(테스트시 최종농도)
제3도는 반응식 1b에 따라 T4-POD접합체를 사용해 T4를 측정하는 것에 대한 검량곡선을 표시한다.
제4도는 반응식 1c에 따라 T4-비오틴 접합체 및 스트렙타비딘-POD 접합체를 사용해 T4를 측정하는 것에 대한 검량 곡선을 표시한다.
본 발명은 수용체(receptor) R3가 R1및 R2뿐만아니라 측정될 물질과 특이적으로 결합할 수 있고 R2가 고체상(solid phase)에 결합할 수 있으며 R3가 포식(labelling)을 갖는 최소한 3개의 수용체 R1, R2및 R3와 함께 샘플 용액을 인큐베이팅(incubating)하고 결합된 표식과 결합되지 않은 표식을 분리하며 이러한 두개의 상중 하나에서의 표식을 측정하므로서 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 방법 및 이 방법에 적당한 시약에 관한 것이다.
면역학적으로 활성인, 즉 특이적 결합 성분과 결합할 수 있고 특별한 질병이나 인체의 건강상태에 대한 파라미터(parameter)로서 이용되는 여러 물질들이 체액(body fluid) 및 조직내에 존재한다. 이것들에는 특히, 호르몬 같은 합텐 종양 마커(marker)같은 단백질 호르몬 및 비루스 단백질뿐아니라 항체가 포함된다. 약제에 의한 치료를 위해, 혈액내 약제를 측정할 필요가 있다. 이것의 예로 간질치료제, 항생제, 디지탈리스(digitalis) 및 아편제가 포함된다. 이러한 물질은 종종 매우 소량으로 존재하므로, 이것을 검출하기 위해 면역분석 원리에 따른 방법을 사용한다. 이런 방법으로는 여러가지 변형 방법이 있다. 여러 면역학적 측정방법은 균일(homogeneous)방법과 불균일(heterogeneous) 방법으로 나누어 질 수 있다. 불균일 방법의 경우, 고체상 반응은 표식된 성분의 결합 부분을 결합되지 않은 부분으로 부터 분리할 수 있도록 하는데 항상 관여한다. 균일 방법의 경우, 결합된 표식과 결합되지 않은 표식이 분리되지 않아서 결합된 표식 부분과 결합되지 않은 표식 부분의 차이가 다른 방법으로 표시되어야 한다.
불균일 면역분석을 실행하는데는 기본적으로 2가지 방법이 있는데 하나의 방법은 측정될 물질에 대한 항체를 고정화시키는 것이고 다른 하나의 방법은 측정될 물질 자체를 고정화시키는 것이다. 상기 첫번째 방법에서, 측정될 물질과 표식과의 접합체 및 측정될 물질을 함유하는 샘플 용액을 고정화 항체와 함께 인규베이팅하면 측정될 물질과 표식된 물질이 항체에 대한 결합에 대해 경쟁하게 된다. 용액내에 측정될 물질의 양이 많을수록 표시된 물질이 더 적게 결합될 수 있다. 그러므로, 표식된 물질의 양은 측정된 물질의 양에 대한 간접적 측정의 척도이다. 고체상과 액체상을 분리한후, 표식을 두개의 상중 하나에서 측정할 수 있다.
다른 하나의 방법에서, 측정될 물질을 함유하는 샘플 용액을 측정될 물질에 대해 특이적인 표식된 항체 및 고정화된 샘플 물질과 함께 인큐베이팅하므로써 용액내에 존재하는 측정될 물질과 고정화된 샘플 물질이 항체에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 용액내에 측정될 물질의 양이 많을수록, 고체상위에 있는 고정화된 샘플 물질에 대한 표식된 항체의 결합량은 더 적어진다. 그러므로 결합되어 있는 표식 항체의 양은 샘플 용액내 측정될 물질의 양에 대한 간접적 측정의 척도이다. 또한 고체상과 액체상을 분리한 후에, 결합된 표식의 양을 측정한다.
변형된 항체를 항상 사용해야만 되는 것이 이 방법의 단점이다. 제1방법으로는 항체를 고체상에 결합시키는 것이고 제2방법으로는 항체를 표식 물질에 결합시키는 것이다. 이렇게 변형시키는데는 비용등의 문제가 있으며 이러한 변형으로 항체 특성의 바람직하지 않은 변화, 예를들어 특이성과 친화성의 감소를 일으킬수 있다. 이런 이유로 해서 다클론(polyclonal)항체를 사용할 수 없고 다소 비용이 많이 들더라도 가교 반응성을 낮추고 친화성을 높이기 위해 선택된 단클론(monoclonal)항체를 사용해야하며 이 단클론 항체는 또한 비용이 많이 드는 방법으로 정제되어야 한다. 또한, 각각의 측정을 위해, 바람직하지않은 모든 시약을 특이적으로 선택해야한다. 일반적을 만들어진 표식된 복합체를 항체를 사용함없이 고정화시키는 것이 독일연방공화국 특허 제 31 38 489호에 이미 공지되었지만 이 방법의 경우 표식된 변형된 항체가 필요하다.
그러므로 광범위하게 사용할 수 있고 면역학적으로 활성인 물질의 측정방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적인데, 이 방법에서 항체를 변형시킴없이 사용할 수 있고 단클론 항체를 필수적으로 사용하지 않아도 된다.
그러므로, 본 발명에 따라, 수용체 R3가 R1및 R2뿐만 아니라 측정될 물질과 특이적으로 결합할 수 있고 R2가 고체상에 결합할 수 있으며 R3가 표식을 갖는 3개의 수용체 R1, R2및 R3과 함께 샘플 용액을 인큐베이팅하고 결합된 표식을 결합되지 않은 표식과 분리하며 이러한 두개 상중하나에서 표식을 측정하므로써 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 방법이 제공되는데, 수용체 R1으로서, 측정될 물질의 에피토프(epitope)와 특이적으로 결합하는 결합 부위를 최소한 2개 갖는 수용체를 사용하며 R2로서 특이적 결합쌍의 성분 P1과 물질 S의 접합체를 사용하는데 물질 S는 측정될 물질에 상응하거나 이것의 유도체이며 측정될 물질의 에피토프를 최소한 하나가지므로 성분 P1은 고체상에 결합되거나 또는 고정화되고, R3로서 최소한 물질 S와 표식을 함유하는 복합체를 사용한다.
본 발명의 방법은 특이적으로 결합할 수 있고 체액이나 조직 추출물내에 있는 측정하려고 하는 거의 모든 물질을 측정하는데 이용될 수 있다. 저농도로 존재하는 물질뿐 아니라 고농도로 존재하는 물질도 검출할 수 있다. 본 발명은 간단한 시약만으로 빠르고 정확하게 측정할 수 있는 가능성을 제공한다.
이 방법은 합텐, 즉 특이적으로 결합가능한 성분에 대해 단지 하나의 결합 부위를 갖는 물질을 측정하는데 유용하다. 이것의 예로서, 호르몬 및, 항-간질제, 항생물질, 디지탈리스 및 아편제같은 약제가 언급될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 방법을 행하는 경우, 공지된 방법과는 대조적으로 항체의 질에 대해 많은 요구사항이 필요하지않으므로 다클론 항체가 쉽게 사용될 수 있음을 알았다. 또한 얻은 블랭크(blank)값이 매우 낮으므로 공지된 방법과 비교하여 감도가 증가한다.
본 발명에서 에피토프라함은 다른 물질과 특이적으로 결합해 들어갈 수 있는 결합 부위로서 이해된다. 에피토프의 예로는 합텐 및 항원상의 항원 결정기 및 단백질상의 특이적 결합 부위가 있다.
본 발명의 방법을 실행하는 경우, 3개의 수용체 R1, R2및 R3를 샘플 용액과 함께 인큐베이션한다. 이렇게 하면 수용체 R3는 수용체 R1및 R2뿐아니라 측정할 물질과 특이적으로 결합할 수 있고 표식을 갖는다. 수용체 R2는 고체상과 결합하게 된다. 본 발명의 방법으로 실행할 수 있는 여러가지 반응 원리가 첨부 도면의 제1도에 설명도어있다. 바람직한 변형된 방법이 제1도 a)에 표시된 것이다. 이 경우, 특이적으로 결합하는 쌍의 P1에 대해 상보성인 P2가 다수 벽에 결합되어 있는 반응 용기중에 물질 S와 특이적으로 결합하는 쌍의 성분 P1과의 접합체인 수용체 R2를 부가한다. 접합체는 성분 P1을 거쳐 성분 P2에 결합된다. 연속해서, 측정될 물질의 에피토프에 대해 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체 R1및 물질 S와 표식과의 접합체인 R3를 반응 용기에 부가한다. 용액내에서, R2의 S부분, R3의 S부분 및 측정하려는 물질은 수용체 R1에 대해 경쟁적으로 결합하게 된다. R1이 예를들어 2가의 항체라면, 다음의 복합체가 형성된다. R1의 두 파라토프에 S를 거쳐 R2가 결합되어 있는것, R2의 2개의 파라토프에 측정하려는 물질이 결합되어 있는것, R1의 두 파라토프에 S를 거쳐 R3가 결합되어 있는것뿐아니라 혼합된 복합체 즉 ; R1의 하나의 피라토프에 측정하려는 물질이 결합되어 있고 다른 한 파라토프에 S를 거쳐 R3이나 R2가 결합되어 있는 것, R1의 한 파라토프에 S를 거쳐 R3이 결합되어 있고 다른 한 파라토프에 R2가 결합되어 있는것, R2에 결합된 복합체만이 고정화되며 수용체 R3가 결합된 복합체는 결합된 표식을 측정하므로서만 평가할 수 있다. 용액중에 함유되어 있는 측정물질의 양이 많을 경우, R1에 결합된 R2와 R3의 양이 적어지게되고 따라서 고정화된 복합체의 양 또는 표식을 갖고 있는 복합체의 양이 적어진다. 그러므로, 결합된 표식의 비율은 측정하려는 물질의 간접적인 척도이며 캘리브레이션 커브(calibration curve)를 통해 평가할 수 있다.
변형된 방법 b)를 이용하면 매우 낮은 농도로 샘플 용액에 존재하는 물질을 검출할 수 있다. 이 방법의 첫번째 단계에서, 특이적 결합쌍의 성분 P2에 결합되어 있는 매트릭스를 측정하려는 물질 및 수용체 R1과 함께 인큐베이션한다. 이렇게하면 샘플 용액내에 존재하는 측정하려고 하는 물질이 수용체 R1과 결합할 수 있다. 고체상에 대한 결합은 일어날 수 없다. 두번째 단계에서, 수용체 R2와 R3를 거기에 부가한다. 부가된 수용체들은 측정하려는 물질이 이미 부분적으로 결합되어 있는 수용체 R1에 결합하기 위해 경쟁한다. 측정하려는 물질이 이미 더 많이 결합되어 있으면, 수용체 R1과 R2가 더 적게 결합될 수 있다. 수용체 R2가 또한 매트릭스의 성분 P2와 결합할 수 있는 성분 P1을 함유하기 때문에, 결과적으로 복합체가 고정화된다. 결합된 상을 액체상에서 부터 분리한 후에 캘리브레이션 커브를 통해 표식된 것을 평가한다.
변형된 방법 c)는 표식된 접합체 및 고체상을 형성하는 매트릭스가 모든 측정방법에 대해 동일하게 남아 있을 수 있는 실행 형태를 표시한다. 이것의 첫번째 단계에서, 특이적 결합쌍의 성분 P2를 가지는 매트릭스를 측정하려는 물질 및 수용체 R1과 함께 인큐베이션하면 측정하려는 물질이 수용체 R1에 결합할 수 있다. 두번째 단계에서, 측정하려는 물질과 성분 P1과의 접합체 R2및 표식과 성분 P2와의 접합체 R3'를 동시에 거기에 부가한다. 측정하려는 물질과 성분 P1과의 접합체 R2뿐만아니라 샘플용액으로 부터 측정하려고하는 물질은 수용체 R1에 경쟁적으로 결합한다. 또한, 매트릭스에 결합된 성분 P2뿐만아니라 성분 P2와 표식과의 접합체 R3' 성분 R1하나에 대해 경쟁적으로 결합한다. 상기와 마찬가지로 캘리브레이션 커브를 이용하여 결합되어 표시된 복합체를 평가할 수 있다.
이런 변형된 방법의 경우, R1의 농도, 특히 항체의 농도 및 R2의 농도는 테스트하는 샘플의 농도와 일치한다.
과량으로 존재해야하는 매트릭스에 결합된 성분 P2를 결합하는데 충분한 양만큼의 측정하려는 물질과 성분 P1과의 접합체 R2를 사용할 수 있도록 만들기 위해 성분 P2와 표식과의 접합체는 측정하려는 물질과 성분 P2와의 접합체 R2의 약 1/2 미만을 결합하는 양 만큼 사용되어야 한다. P1을 함유하는 접합체 P2는 측정하려는 물질의 양에 상당한 양, 즉 약 10-5mole/1(예를들어, 테오필린의 경우) 내지 10-10mole/1(예를들어, 디곡신의 경우)로 사용하는 것이 유리하다. 변형된 방법 c)의 경우, 방해적인 가교 결합을 막기 위해 R2는(매트릭스상의 또는 접합체내의) P2에 대해 단지 하나의 결합 부위를 가져야한다. 이것은 변형된 방법 a) 및 b)에는 적용되지 않는다.
이러한 구체예는 한편으로 단지 단 하나의 특이적 결합체, 즉 S와 P1의 결합체만이 이용할 수 있게 만들어져야하고, 다른 한편으로 감도와 재생산성을 현격히 증가시키는 면역학적 반응이 균일하게 일어나는 상당한 이점을 갖는다.
그러므로, 본 발명에 따라 정의된 방법 원리를 가지고 실행할 수 있는 여러가지 변형된 방법이 있을 수 있다. 모든 경우, 최소한 3개의 수용체가 필요하다.
측정하려는 물질은 특이적으로 결합할 수 있는 모든 물질일 수 있고 특히 상기 정의된 바와같이 합텐일수 있다.
첫번째 수용체 R1으로서, 측정하려는 물질의 에피토프와 특이적으로 결합하는 최소한 2개의 결합부위를 갖는 수용체가 사용된다. 이 수용체는 측정하려고 하는 특별한 물질에 따라 선택된다. 이것으로는 바람직한 단클론 항체나 디클론 항체 또는 이것의 Fab2단편이 있다.
수용체 R2는, 측정하려고 하는 물질에 해당되거나 또는 이것의 유도체이며 측정하려는 물질의 최소한 하나의 에피토프를 가지는 물질 S와 특이적 결합쌍의 성분 P1과의 접합체이다. 서로 특이적으로 결합할 수 있는 쌍들이 공지되었다. 특히, 적당한 결합쌍(P1-P2)은 비오틴-스트렙타비딘이나 아비딘 : 합텐-항체 : 항원-항체 : 콘카나발린-항체 : 당-레시틴 : 합텐-결합 단백질, 예를들어 티록신-결합 글로불린 및 티록신이나 올리고펩티드-항체이다.
결합쌍으로서 비오틴 및 스트렙타비딘 또는 아비딘을 사용하는 것이 특히 바람직하며 그래서 수용체 R2가 성분 P1으로서 비오틴을 함유하는 것이 특히 바람직하다.
수용체 R2의 S부분은 측정하려고 하는 변화하지 않은 물질에 상당하는 것이 바람직하다. 그러나, 이것은 또한 측정하려는 물질의 유도체, 예를들어, 단백질 에피토프일 수도 있다. 단지 중요한 것은 S부분이 수용체 R1과 결합할 수 있어 S 및 결합된 측정하려는 물질이 R1대해 동일한 결합 세기로 결합하는 것이 절대적으로 필요하지 않다는 것이다.
접합체를 제조하는 것은 공지된 방법, 예를들어 Eur.J.Biochem., 131, 333-338/1980에 기재된 것과 유사한 방법으로 실행된다.
수용체 R2는 고체상에 결합한다. 한 변형된 방법에서, R2는 직접 또는 스페이서(spacer)를 거쳐 P1을 통해 고체상에 결합할 수 있다. 또 다른 변형된 방법에서는 면역 반응동안에 고체상위에 고정화된 특이적 결합쌍의 성분 P2에 P1이 결합되므로써 고체상에 결합된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, S와 P1의 접합체인 수용체 R2가, 사용된다. 고체상으로서, 다수의 특이적 결합쌍의 성분 P1이 고정화되어 있는 매트릭스가 사용된다. 면역학적 반응에 필요한 성분을 인큐베이션한 후에, P1에 대해 최소한 2개의 결합 부위를 갖는 성분 P2를 부가한다. 이렇게하여, 수용체 R2를 고정화시킨다.
고체상으로는 내부 표면이 P1이나 P2로 흡착 피복된, 폴리스티렌 및 이와 유사한 합성수지로된 미세 적정판 또는 리어젼트 글래스가 특히 바람직하다. 또한 적당한 미립자 물질, 예를들어 분자체 물질, 글라스펄(glas pearls), 합성수지 튜브등이 있다. 고체상으로는 또한 적당한 다공성의 얇은 조각으로된 담체, 예를들어 종이가 있다. 또한 고체상이 예를들어 유럽 특허 명세서 제 0,240,770호 및 U.S 특허 명세서 제 4,141,687호 및 제 4,197,337호에 기재된 바와같은 자기(magnetic) 입자로 구성되는 구체예가 바람직하다. 자기 입자는 이산화크로뮴 및 산화철로 구성된 것이 바람직하다. 성분 P2가 입자에 결합하는 것은 예를들어 유럽 특허 명세서 제 0,240,770호에 기재된 방법으로 행해질 수 있다.
수용체 R3는 최소한 물질 S 및 표식 함유하는 복합체이다. 표식으로서, 효소 또는 형광성, 화학 발광성 또는 방사성 물질이 사용된다. 표식하는 방법이 예를들어 Clin.Chim.Acta, 81, 1-40/1977에 공지되었으므로 또 다른 설명을 필요로하지 않는다. 표식은 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
수용체 R3는 또한 처음 면역학적 반응동안에 물질 S와 특이적 결합쌍의 성분 P1을 함유하는 접합체 및 특이적 결합쌍의 성분 P2와 표식과의 접합체로 부터 형성될 수 있다.
본 방법은 하나 이상의 단계로 행해질 수 있다. 공지된 방법으로 평가한다. 각각의 수용체 및 측정하려는 물질은 각 경우에 단지 이것과 반응하도록 계획된 성분들과 특이적으로 반응할 수 있기 때문에, 모든 수용체와 샘플을 함께 인큐베이션하고 본 방법을 하나의 단계로 실시할 수 있다. 본 발명을 자동 분석기내에서 실시하는 경우에 특히 유리하다. 매우 낮은 농도나 매우 높은 농도의 물질을 검사하기위해, 다단게의 변형된 방법이 바람직하다.
모든 변형된 방법을 완충 용액내에서 실시하는 것이 바람직하다. 이러한 용도에 사용할 완충액 시스템이 공지되었다. 이러한 용도에는 GOOD 완충액과 인산염 완충액이 특히 바람직하다.
본 발명에 따라, 다클론 항체를 사용한 경우에 매우 민감하여 간단하고 빠르게 실행할 수 있는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한 측정하려는 물질에 대해 최소한 2개의 결합 부위를 갖는 수용체 R1, 측정할 물질에 상응하거나 이것의 유도체인 물질 S와 특이적 결합쌍의 성분 P1과의 접합체인 수용체 R2, 및 최소한 성분 P1및 물질 S를 함유하는 복합체인 수용체 R3, 및 이것으로 부터 물리적으로 분리된 고체상을 함유하는, 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하는 시약을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 시약은 다수의 특이적 결합쌍의 성분 P2에 결합되어 있는 고체상뿐아니라 이것과 물리적으로 분리된 수용체 R1, R2및 R3또는 R3'을 함유한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 시약은 성분 P1에 결합되어 있는 고체상 및 이것과 물리적으로 분리된 특이적 결합상의 성분 P2및 수용체 R1, R2및 R3또는 R3'를 함유한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 시약은 제1층중에 고상이 성분 P2및 R3'을 갖고있고 이 제1층에서 부터 물리적으로 분리된 수용체 R1및 R3을 갖는 다층 시약 단체를 갖는다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 첫번째 시약에, 성분 P2로 피복된 자기 입자의 현탁액 및 수용체 R3'(반응도식 1c)의 용액 및 이것과 물리적으로 분리원 수용체 R1및 R2를 함유하는 시약 결합체가 사용된다. P1/P2에 대한 특이적 결합쌍으로서, 바람직하게 비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘이 사용된다.
이 시약은 체액 및 조직 추출물내 다수의 파라미터를 측정하는데 적당하다.
바람직한 구체예에서, 이 시약은 부가적으로 완충 물질을 함유한다. 특히 바람직하게, 이것은 인산염 완충액 또는 GOOD 완충액을 함유한다.
본 발명은 다음의 실시예 및 도면에 대한 언급으로써 더 상세하게 기술될 것이다.
제1도는 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에 관한 3개의 반응 도식을 표시한다.
제2도는 T4-POD접합체(반응 도식 1a)를 사용해 T4를 측정하기 위한 캘리브레이션커브를 표시한다. 커브 1은 10nmol/1 T4-비오틴이고 커브 2는 1nmol/1 T4-비오틴염(테스트시 최종 농도).
제3도는 T4-POD접합체(반응 도식 1b)를 사용해 T4를 측정하기 위한 캘리브레이션커브를 표시한다.
제4도는 T4-비오틴 접합제 및 스트렙타비딘-POD 접합체(반응도식 1c)를 사용해 T4를 측정하기 위한 캘리브레이션 커브를 표시한다.
제1도에 본 발명에 따른 방법의 여러가지 바람직한 구체예의 반응원리가 표시되어 있다. 표시되어 있는 모든 반응 원리에서, 수용체 R1은 항체이다.
제1도 a)는 우선 특이적 결합쌍의 성분 P2가 결합되어있는 고체상을 수용체 R2, 특이적 결합쌍의 성분 P1과 함께 인큐베이션시켜 수용체 R2가 P1를 통해 고체상에 결합하게되는 원리를 표시한다. 두번째 단계에서, 이 고체상은 수용체 R1, R3및 샘플 용액과 함께 인큐베이션된다.
제1도 b)는 첫번째 단계에서, 성분 P2가 결합되어 있는 고체상을 수용체 R2및 샘플 용액과 함께 인큐베이션하는 구체예를 표시한다. 두번째 단계에서, 수용체 R1과 R2를 거기에 부가한다.
제1도 c)는 각 경우에 측정하려는 물질과 관계가 없는, 표식과 성분 P2와의 접합체 및 성분 P2가 결합되어 있는 고체상이 사용되는 구체예를 표시한다. 수용체 R1, R2및 R3뿐아니라 샘플을 고체상 및 표식 접합체와 함께 인큐베이션한다.
[실시예 1]
반응 도식 1a)에 따른 T4의 측정
완충액 A :
120mmol/1 바비투레이트
18.2mmol/1 인산염 완충액(pH 8.6)
1.27mmol/1 8-아닐리노-1-나프탈렌설폰산
0.2중량%의 소의 혈청 알부민
980μl완충액 A 및 T4와 비오틴의 접합체(실시예 4에 따라 제조(최종 농도 1 또는 10mmol/ml.)) 용액20μl를 스트렙타비딘으로 피복된 폴리스티렌 용기(유럽 특허 명세서 제 0,269,092호에 따라 생산)에 넣고 25℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 연속해서, 용기를 세척하고 50μl의 샘플(T4가 축적된 사람의 혈청), 980μl의 완충액 A, 0.1mg/ml의 T4에 대한 다클론 항체와 2.5U/ml T4-퍼옥시다제 접합체(5mU/테스트)의 용액 20μl를 부가하고 25℃에서 30분간 인큐베이션하고 세척한뒤 9.1mmole/1 ABTS(2, 2'-아지노-디-(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산 디암모늄 염)의 용액 1ml을 거기에 부가하였다. 25℃에서 30분간 더 인큐베이션한 후에, T4함량을 측정하기 위해 광학 밀도를 422nm에서 측정하였다. 결과를 제2도에 표시하였다.
[실시예 2]
반응 도식 1b)에 따른 T4의 측정
50μl의 샘플(T4가 측적된 사람의 혈청)을 480μl의 완충액 A 및 T4에 대한 다클론 항체(0.1mg/ml) 용액 20μl와 함께 스트렙타비딘으로 피복된 폴리스티렌 용기내에서 25℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 연속해서, 480μl의 완충액 A 및 T4-비오틴 접합체(5×10-8mole/1, 테스트중 1nmole/1 최종 농도에 상당)와 T4-POD 접합체(2.5U/ml,50mU/테스트)의 용액 20μl를 거기에 부가하고 25℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 용기를 세척하고 연속해서 거기에다 1ml의 ABTSR용액(9.1mmole/1)를 부가하여 25℃에서 30분간 인큐베이션시키고 422nm에서 광학 밀도를 T4함량의 척도로서 측청하였다. 결과를 제3도에 표시하였다.
[실시예 3]
반응 도식 1c)에 따른 T4의 측정
50μl의 샘푤(T4가 축적된 사람의 혈청)을 480μl완충액 A 및 T4에 대한 다클론 항체(0.1mg/ml)의 용액 20μl와 함께 스트렙타비딘으로 피복된 폴리스티렌내에서 25℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 연속해서, 480μl의 완충액 A 및 T4-비오틴 접합체(5×10-7mole/1, 테스트중 10nmole/1 최종 농도에 상당)와 2.5U/ml 스트렙타비딘-POD 접합체(50mU/테스트)의 용액 20μl을 부가하고 25℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 용기를 세척하고 1ml ABTSR용액(9.1mmole/1)을 부가하여 25℃에서 30분간 인큐베이션시키며 422nm에서 광학밀도를 T4함량의 척도로서 측정하였다. 결과를 제4도에 표시하였다.
[실시예 4]
T4-비오틴 접합체의 제조
N-3차-부톡시카보닐테트라요오드티로닌을 Eur.j.Biochem., 131, 333-338/1980에 기술된 방법으로 펜타메틸렌디아민에 의해 비오틴과 결합시켰다.

Claims (15)

  1. 시료용액을 R1이 R2및 R3뿐만아니라 측정하려는 물질과 특이적으로 결합할 수 있고, R2가 고체상으로의 결합을 중개하고, 또 R3이 표식을 갖는 최소한 3가지의 수용체 R1, R2및 R3와 인큐베이션시키고, 결합된 표식과 결합되지 않은 표식을 분리하고, 두 상중 한쪽에 있는 표식을 측정하므로써 특이적으로 결합 가능한 물질을 측정하는 방법에 있어, 수용체 R1, 으로서 측정하려는 물질의 에피토프와 특이적인 결합을 하는 결합부위를 최소한 두개 갖는 수용체를 사용하고, R2로서 특이적으로 결합하는 쌍의 성분 P1과 측정하려는 물질 또는 이것의 유도체에 상응하며 측정하려고 하는 물질의 에피토프를 최소한 하나가지는 물질 S와의 접합체를 사용하고 그러므로서 성분 P1은 고체상에 결합되거나 또는 고정화되고, R3으로서 최소한 하나의 물질 S와 표식을 함유하는 복합체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 특이적으로 결합할 수 있는 물질의 측정방법.
  2. 제1항에 있어서, 수용체 R1으로서, 측정하려는 물질이나 이것의 RFab2단편과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 사용되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 수용체 R2로서, 물질 S가 성분 P1에 의해 결합되어 있는 고체상이 사용되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 수용체 R2로서 물질 S와 특이적 결합쌍의 성분 P1과의 접합체가 사용되고 고체상으로서 P1에 상보적인 여러특이적 결합쌍의 성분 P2가 결합되어 있는 매트릭스가 사용되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 수용체 R2로서 물질 S와 성분 P1과의 접합체가 사용되고 고체상으로서 다수의 성분 P1이 결합되어 있는 매트릭스가 사용되며 P1에 대해 특이적 결합부위를 최소한 두개 갖는 성분 P2를 부가시키므로서 인큐베이션 시킨후에 고정화가 일어나는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 성분 P1으로서 비오틴이 사용되고 성분 P2로서 스트렙타비딘, 아비딘 또는 비오틴에 대한 항체가 사용되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 수용체 R3로서 물질 S와 표식과의 접합체가 사용되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 표식으로서 방사성 물질, 화학발광성물질 또는 형광성 물질이나 효소가 사용되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 수용체 R3로서 물질 S와 특이적 결합쌍의 성분 P1과의 접합체 및 P1에 상보적인 특이적 결합쌍의 성분 P2와 표식과의 접합체가 사용되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 결합쌍 P1-P2로서 비오틴-스트렙타비딘 또는 아비딘, 비오틴-비오틴 항체, 항원-항체, 합텐-결합 단백질 또는 올리고펩티드-항체가 사용되는 방법.
  11. 제4항에 있어서, 고체상으로서, 합성 수지로 구성되며 다수의 결합 성분 P2가 직접 결합되어 있거나 스페이서를 거쳐 결합되어 있는 매트릭스가 사용되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 성분 P1으로서 비오틴이 사용되고 성분 P2로서 스트렙타비딘 도는 아비딘이 사용되는 방법.
  13. 측정하려는 물질에 대해 최소한 2개의 특이적 결합부위를 갖는 수용체 R1, 특이적으로 결합하는 쌍의 성분 P1과 측정하려는 물질에 상응하거나, 또는 이의 유도체이고 측정하려는 물질의 에피토프를 최소한 하나 가지는 물질 S와의 접합체인 수용체 R2, 및 표식과 물질 S를 함유하는 복합체인 수용체 R3, 및 이것으로 부터 물리적으로 분리된, P1이 고정화되어 있는 고체상을 함유하는, 제1항 내지 제12항의 어느 한항의 방법에 의해 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하기 위한 시약.
  14. 측정하려는 물질에 대해 최소한 2개의 특이적 결합부위를 갖는 수용체 R1, 특이적으로 결합하는 쌍의 성분 P1과 측정하려는 물질에 상응하거나 또는 이의 유도체이며 측정하려는 물질의 에피토프를 최소한 하나가지는 물질 S와의 접합체인 수용체 R2, 및 최소한 하나의 표식과 성분 P2를 함유하는 복합체인 수용체 R3' 및 이것으로 부터 물리적으로 분리된, P2가 고정화 되어있는 고체상을 함유하는, 제1항 내지 제12항의 어느 한 항의 방법에 의해 특이적으로 결합가능한 물질을 측정하기 위한 시약.
  15. 특이적 결합쌍의 여러개의 성분 P1이 결합되어있는 고체상뿐 아니라 이것과 물리적으로 분리된 성분 P2및 수용체 R1, R2및 R3또는 R3'를 함유하는, 특이적으로 결합 가능한 물질을 측정하기 위한 시약.
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