CN103025885B

CN103025885B - 用于检测和定量宽范围分析物的个人葡萄糖计

Info

Publication number: CN103025885B
Application number: CN201180036296.7A
Authority: CN
Inventors: 陆艺; 向宇
Original assignee: University of Illinois
Current assignee: University of Illinois
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2031-05-26
Also published as: EP2576806A4; CN103025885A; EP2576806A1; US20120315621A1; EP2576806B1; CA2800257A1; US8945943B2; CA2800257C; US20130065224A1; AU2011258173B2; WO2011150186A1; AU2011258173A1

Abstract

公开了一种开发高灵敏度和选择性传感器的通用方法，所述传感器仅使用个人葡萄糖计(PGM)就可以实现对宽范围靶的便携、低成本和定量检测。所述方法使用对靶因子特异的识别分子、可将酶底物转化为葡萄糖的酶以及PGM。还提供了传感器，其可以包括附着有识别分子从而可检测靶因子的固体支持物，其中所述识别分子在存在所述靶因子下可特异性结合所述靶因子，但是不显著结合其他因子，以及可催化物质转化为葡萄糖的酶，其中所述酶直接或间接附着到所述识别分子，其中在存在所述靶因子下所述酶可以将所述物质转化为葡萄糖。所公开的传感器可以是横流装置的一部分。还提供了使用这些传感器检测靶因子的方法。

Description

用于检测和定量宽范围分析物的个人葡萄糖计

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年5月26日提交的美国临时申请No.61/348,615的优先权，其全文以引用的方式纳入本文。

技术领域

本申请涉及传感器、包括该传感器的试剂盒以及制造和使用该传感器的方法。所述传感器允许检测宽范围的靶因子，例如核酸（例如DNA和RNA）、蛋白质、毒素、病原体、细胞和金属，并且可以与随时可用的个人葡萄糖计组合使用。

政府资助

本发明是在美国能源部给予的DE-FG02-08ER64568、美国国立卫生研究院给予的ES16865和美国国立科学基金会给予的CTS-0120978政府资助下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。

背景技术

用于定量的便携且价廉的传感器的开发可以使目前的传感技术在检测对人健康和环境有重要影响的物质中实现现场和即时应用^1-7。其还可以进一步产生家用和个人传感器，用于与日常生活和健康相关的分析物。这种成功的实例之一是葡萄糖计，其已经作为血葡萄糖的常规传感器市售近30年，并被证明是监控糖尿病或低血糖的重要器件^8,9。所述个人葡萄糖计(PGM)以其公众广泛可用、口袋大小的便携性、低成本、定量结果可靠和操作简单的优势而众所周知。因此，其在个人健康护理中广泛应用并提供巨大且增长的市场。PGM可以从商业来源容易且廉价地获得，并且已经被整合到移动电话中，例如iPhone和LG模式。

尽管PGM是成功的，但是开发可以检测除葡萄糖外的多种分析物且还显示出葡萄糖计优势——广泛可用性、便携性、低成本和定量分析——的传感器系统，仍然是一个巨大挑战。最近几年，已经开发了使用光谱学^3-6、电化学^1,2、磁共振⁷和其他分析技术的可以高选择性和高灵敏度地定量检测多种分析物的传感器。虽然这些传感技术中的一部分使用简单的仪器，但是大多数仍然需要实验室开发的便携装置，这对公众来说是不广泛的且不是市售的。也开发了通过可见的颜色改变来简单和现场地检测多种分析物的比色传感器^10-13，因此不需要仪器。但是，这些传感器是定性的或半定量的，因此不能提供定量结果。

发明内容

本申请公开了可以用于检测靶因子的传感器和制造所述传感器的方法。在一个实例中，所述传感器包括固体支持物，例如珠或膜。允许检测所述靶因子的识别分子结合或固定在所述固体支持物上。在存在所述靶因子下所述识别分子可特异性结合所述靶因子，但是不显著结合其他因子。这种识别分子的实例包括抗体、核酸分子（例如DNA、RNA、包括核酶/脱氧核酶的功能性核酸和适体）、肽核酸、聚合物、肽和蛋白质、细胞以及有机小分子。

所述传感器还可以包括可以催化物质（例如蔗糖、纤维素、海藻糖、淀粉或麦芽糖）转化为葡萄糖的酶。在一个实例中，所述酶例如作为可以结合所述识别分子的酶分析物类似物缀合物的一部分附着到可检测所述靶因子的识别分子上，使得在存在所述靶因子下，所述酶从所述固体支持物释放（例如，由于与所述靶因子的竞争，所述酶分析物类似物缀合物可以被释放），然后可以催化物质（例如蔗糖、纤维素、海藻糖、淀粉或麦芽糖）转化为可以被检测的葡萄糖（例如使用个人葡萄糖计）。在另一个实例中，所述靶因子可结合所述识别分子，所述酶分析物类似物缀合物结合已经结合所述识别分子的靶因子，从而形成“夹心”。因此，在存在所述靶因子下，结合所述靶因子的酶可以催化物质（例如蔗糖、纤维素、海藻糖、淀粉或麦芽糖）转化为可以被检测的葡萄糖（例如使用个人葡萄糖计，PGM）

在一个实例中，所公开的传感器是横流装置的一部分。所述横流装置可以包括样品或芯吸垫（其可与所述样品接触）、包含所述传感器的缀合垫(conjugationpad)、包含可被转化为葡萄糖的物质（例如蔗糖）的膜和吸收垫（通过毛细管作用吸引所述样品穿过所述缀合垫和膜，并收集所述样品以及产生的葡萄糖）。例如，所述横流装置可以与所述样品接触，随后与葡萄糖计接触以检测所述样品中靶因子的存在情况，其中所述样品中靶的存在情况由对葡萄糖的检测指示。

本公开还提供了包括所公开的传感器和横流装置的试剂盒。例如，该试剂盒还可以包括一种或多种缓冲液、将检测的葡萄糖水平与存在的靶因子量关联的图表或可以被所述酶转化为葡萄糖的物质（例如蔗糖、海藻糖、纤维素、麦芽糖或淀粉）。

还提供了使用所公开的传感器检测靶因子的方法。在一个实例中，所述方法包括使一个或多个传感器与样品（例如生物样品或环境样品）在足以使所述样品中靶因子结合所述识别分子的条件下接触。

在某些实例中，所述结合可释放之前已结合所述识别分子的酶（例如酶分析物类似物缀合物）。随后，所述固体支持物与所述释放的酶分离。所释放的酶与可以被所述酶转化为葡萄糖的物质接触，从而生成葡萄糖。检测所述生成的葡萄糖（例如使用PGM），其中检测到葡萄糖指示所述样品中存在所述靶因子，没有检测到葡萄糖指示所述样品中不存在所述靶因子。所述方法还可以包括对所述靶因子进行定量，其中检测到的葡萄糖水平指示存在的靶因子量（例如相对量或绝对量）。

在其他实例中，在靶因子结合所述识别分子后，所述酶与所述靶因子-识别分子-固体基质复合物在允许所述酶（例如酶分析物类似物缀合物）结合所述靶因子的条件下接触，从而形成“夹心”型结构。然后，所结合的酶与可以被所述酶转化为葡萄糖的物质（例如酶的底物）接触，从而生成葡萄糖。检测所生成的葡萄糖（例如使用PGM），其中检测到葡萄糖指示所述样品中存在所述靶因子，没有检测到葡萄糖指示所述样品中不存在所述靶因子。所述方法还可以包括对所述靶因子进行定量，其中检测到的葡萄糖水平指示存在的靶因子量（例如相对量或绝对量）。

在另一些实例中，所述方法可以包括使具有传感器的横流装置与样品在足以使所述样品中靶因子流过所述横流装置并结合存在于所述横流装置上的识别分子的条件下接触。所述识别分子可以缀合于可催化物质转化为葡萄糖的酶。这导致靶因子-识别分子或靶因子-识别分子-酶复合物的形成，其中所述复合物的形成导致可将物质转化为葡萄糖的所述酶的释放。使所述酶与可以被所述酶转化为葡萄糖的物质相互作用，从而生成葡萄糖。检测（例如定量）所产生的葡萄糖，其中检测到葡萄糖指示所述样品中存在所述靶因子，没有检测到葡萄糖指示所述样品中不存在所述靶因子。

可以用本文提供的所述公开的传感器和方法检测的示例性靶因子包括金属、营养金属离子（例如钙、铁、钴、镁、锰、钼、锌、镉或铜）、微生物、细胞因子、激素、细胞（例如肿瘤细胞）、DNA、RNA、孢子（例如炭疽孢子）或毒素。例如，所述靶因子可以是重金属，例如汞(Hg)、镉(Cd)、砷(As)、铬(Cr)、铊(Tl)、铀(U)、钚(Pu)或铅(Pb)。在其他实例中，所述靶因子为微生物，例如病毒、细菌、真菌或原生动物（例如微生物抗原或核酸分子如DNA或RNA）。在一个实例中，所述靶因子为孢子，例如细菌孢子、真菌孢子或植物孢子。例如，杆菌(Bacillus)和梭菌(Clostridium)（例如肉毒梭菌(C.botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)和炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)）可产生可被检测到的孢子。

本公开前述的和其他的对象和特征在以下的详细描述中会更清楚，详细描述参照附图进行。

附图说明

图1A和1B的示意图示出了，基于识别分子A和识别分子B和靶因子（分析物）之间的相互作用使用葡萄糖计进行所述靶因子检测的示例性机制。

图2A和2B的示意图示出了，基于抗体A和抗体B和靶因子（分析物）之间的相互作用使用葡萄糖计进行所述靶因子检测的示例性机制。

图3A和3B的示意图示出了，基于功能性核酸(FNA)A和FNAB和靶因子（分析物）之间的相互作用使用葡萄糖计进行所述靶因子检测的示例性机制。

图4A和4B的示意图示出了，基于核酸分子A和核酸分子B和靶因子（分析物）之间的相互作用使用葡萄糖计进行所述靶因子检测的示例性机制，其中所述靶因子为核酸分子。

图5A-5C的示意图示出了，基于功能性DNA和对应靶因子之间的相互作用使用葡萄糖计进行分析物检测的示例性机制。(A)DNA-转化酶缀合物通过与可以对目的靶作出特异性响应的功能性DNA进行DNA杂交被固定于磁珠。(B)一旦加入含有所述靶因子的样品，功能性DNA和所述靶因子之间的相互作用就扰乱DNA杂交并且导致DNA-转化酶缀合物从磁珠释放到溶液中。(C)用磁铁除去磁珠后，溶液中的所述DNA-转化酶缀合物可以有效地催化蔗糖水解为葡萄糖，其可通过葡萄糖计定量。释放到溶液中的DNA-转化酶缀合物与存在于所述样品中的靶因子的浓度成比例。因此，所述葡萄糖计的读数可以用于定量所述靶因子的浓度。

图6的数字图像示出了所述缀合产物的PAGE（4-20%的梯度胶）图像。左：荧光图像，1：巯基-DNA和的转化酶，无接头；2:转化酶；3:巯基-DNA和转化酶，有接头；4:除去DNA后的3；5:胺DNA和转化酶，无接头；6:转化酶；7:胺-DNA和转化酶，有接头；8:除去DNA后的7。右：蛋白染色图像，1：巯基-DNA和转化酶，无接头；2:转化酶；3:巯基-DNA和转化酶，有接头；4:除去DNA后的3。

图7的曲线图示出了溶液中实际葡萄糖浓度和葡萄糖计检测浓度的相关性。

图8A和8B的示意图示出了，通过(A)异双官能接头(磺基-SMCC)和(B)同双官能接头(PDITC)使DNA和转化酶缀合的示例性方法。

图9A-9D的示意图示出了，DNA-转化酶缀合物通过与(A)可卡因适体(SEQIDNO:4)、(B)腺苷适体(SEQIDNO:6)、(C)IFN-γ适体(SEQIDNO:6)和(D)UO₂ ²⁺DNAzyme(SEQIDNO:11)在链亲和素包被的MB上杂交而固定，以及随后存在这些分析物下DNA-转化酶缀合物的释放。

图10A-10B的图示出了使用葡萄糖计得到的缓冲液中(A)可卡因和(B)腺苷传感器的性能。

图11的图示出了使用葡萄糖计得到的适体对传感器的性能的作用。对于存在1mM靶下的可卡因和腺苷传感器：(-):图中下划线部分是截短的；(+)所述适体没有被截短。可卡因适体对照在SEQIDNO:5示出；腺苷适体对照在SEQIDNO:7示出。

图12的图示出了使用葡萄糖计得到的20%人血清样品中可卡因传感器的性能。

图13A和13B的图示出了使用葡萄糖计得到的(A)缓冲液和(B)20%人血清中IFN-γ传感器的性能。

图14A和14B的图示出了使用葡萄糖计得到的UO₂ ²⁺传感器的性能(A)及其选择性(B)。选择性：1:50nMUO₂ ²⁺;2:1μMUO₂ ²⁺;3:1μMPb²⁺;4:1μMCd²⁺;5:100μMCa²⁺/Mg²⁺;6:1μMZn²⁺/Cu²⁺;7:1μMCo²⁺/Ni²⁺;8:1μMVO⁺;9:1μMTh⁴⁺。葡萄糖计的信号显示为mg/dL。

图15的示意图示出了通过所述DNA-转化酶缀合物方式用个人葡萄糖计(PGM)进行的靶DNA检测的机制。

图16A的图示出了使用PGM检测靶DNA。所述检测在0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.3）、0.1MNaCl、0.05%Tween-20中进行。图中的线指示了所述PGM的上限（600mg/dL葡萄糖）。

图16B的条形图示出了使用PGM进行的DNA检测的单错配选择性。所述检测在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.3）、0.1MNaCl、0.05%Tween-20中进行。

图17A和B的图示出了使用PGM检测HBVDNA片段。所述检测在0.15M磷酸钠缓冲液（pH7.3）、0.25MNaCl、0.05%Tween-20中进行。(A)HBVDNA片段检测；(B)所述检测的单错配选择性。

图18的示意图示出了通过由DNA-脱硫生物素和DNA-转化酶缀合物的组装进行的脱硫生物素-转化酶缀合。

图19的示意图示出了使用PGM进行的生物素检测的机制。

图20的图示出了使用PGM进行的生物素检测的结果。

图21的示意图示出了生物素-转化酶缀合。

图22的示意图示出了使用葡萄糖计进行的PSA检测的分步机制。

图23A和B的图示出了使用PGM对(A)缓冲液B中的PSA和(B)缓冲液B中的25%人血清进行定量。

图24的示意图示出了用于检测样品中靶因子的以适体-转化酶缀合物改良的横流装置。

序列表

附随的序列表中列出的核苷酸序列使用37C.F.R.1.822定义的核苷酸碱基的标准字母缩写表示。每条核酸序列仅示出一条链，但是应认为互补链通过任何对所显示的链的提及而被包括在内。除非另有指明，所有链均以5′到3′示出。

SEQIDNO:1是生物素修饰的DNA。

SEQIDNO:2是巯基修饰的DNA。

SEQIDNO:3是胺修饰的DNA。

SEQIDNO:4是可卡因适体。

SEQIDNO:5是可卡因适体对照。

SEQIDNO:6是腺苷适体。

SEQIDNO:7是腺苷适体对照。

SEQIDNO:8是针对IFN-γ的生物素修饰的DNA。

SEQIDNO:9是针对IFN-γ的巯基修饰的DNA。

SEQIDNO:10是IFN-γ适体。

SEQIDNO:11是UO₂ ²⁺-依赖的DNAzyme。

SEQIDNO:12是UO₂ ²⁺-依赖的DNAzyme的底物。

SEQIDNO:13是乙肝病毒(HBV)靶序列。

SEQIDNO:14是有G错配的HBV靶序列。

SEQIDNO:15是有A错配的HBV靶序列。

SEQIDNO:16是有T错配的HBV靶序列。

SEQIDNO:17是有两个错配的HBV靶序列。

SEQIDNO:18是针对HBV的巯基修饰的DNA。

SEQIDNO:19是HBV靶序列。

SEQIDNO:20是有A错配的HBV靶序列。

SEQIDNO:21是有G错配的HBV靶序列。

SEQIDNO:22是有C错配的HBV靶序列。

SEQIDNO:23是胺修饰的DNA。

SEQIDNO:24是巯基修饰的DNA。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语与本公开发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非上下文另有明确指示，单数形式的术语“a”、“an”和“the”包括复数的指示对象。类似地，除非上下文另有明确指示，词“或”意欲包括“和”。“包括”意指“包含”。因此“包括A或B”意指“包含A”或者“包含B”或者“包含A和B”。

以下描述了用于本公开的实施方案的实施和/或测试的适合方法和材料。这样的方法和材料仅是说明性的，并非意欲进行限制。可以使用与本文描述的那些相似或等价的其他方法和材料。例如，本公开所属领域已知的常规方法描述于多种综述性和更具体的参考文献中，包括例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual，2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989;Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborPress,2001;Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates,1992(andSupplementsto2000);Ausubeletal.,ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,4thed.,Wiley&Sons,1999;HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1990;andHarlowandLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，出于所有目的以引用的方式全文纳入本文。与本文提及的GenBank登录号有关的所有序列，以引用的方式以其在2010年5月26日显示的形式全部纳入本文，纳入的程度为适用的规定和/或法律所容许。

为帮助阅览本公开的各个实施方案，提供了如下的具体术语的解释：

抗体(Ab)：至少包括轻链或重链免疫球蛋白可变区域并可特异性结合抗原（例如靶因子）表位的多肽。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或抗体片段以及本领域已知的其他抗体。在某些实例中，抗体是靶因子（例如微生物抗原、孢子、细胞表面受体或毒素）特异性的，因此可以被用作本文提供的传感器中的识别分子。

抗体由重链和轻链组成，所述重链和轻链每个具有可变区域，称作重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。总之，所述VH区和VL区共同负责结合被所述抗体识别的抗原。这包括完整免疫球蛋白及本领域已知的其变体和部分，例如Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合，而在dsFv中，链被突变以引入二硫键以稳定所述链的缔合。该术语还包括重组形式，例如嵌合抗体（例如人源化鼠抗体）和异源缀合物抗体（例如双特异性抗体）。还参见，PierceCatalogandHandbook,1994-1995(PierceChemicalCo.,Rockford,IL);Kuby，Immunology,3rdEd.,W.H.Freeman&Co.,NewYork,1997。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由其中转染有单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的。单克隆抗体通过本领域普通技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造抗体形成细胞。这些融合细胞及其子代被称为“杂交瘤”。单克隆抗体包括人化的单克隆抗体。

抗原：可刺激免疫响应的分子。抗原通常是蛋白或多糖。表位是抗原决定簇，即引起特异性免疫响应的分子上的具体化学基团或肽序列。抗体可结合特定的抗原表位。抗体与特定的抗原或抗原表位的结合可以用于测定样品中是否存在特定抗原（例如靶抗原或目的抗原）。

结合：两种物质或分子之间的缔合，例如一个核酸分子与另一个（或其自身）的杂交、抗体与肽的缔合、蛋白与另一个蛋白或核酸分子的缔合或半抗原与抗体之间的缔合。结合可以通过本领域技术人员已知的任何方法检测，例如使用本文提供的方法。

当具体的因子（“特异性结合因子”）可以与具体的分析物特异性地反应，例如与抗体特异性地发生免疫反应或特异性结合具体的靶因子时，就称为一个分子“特异性结合”到另一个分子。所述结合是，例如，抗体分子与抗原决定簇之间或者寡聚核苷酸（例如功能性核酸）与靶因子（例如DNA或RNA）之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性一般从所述抗体有差别地结合其特异性抗原和不相关抗原的能力的参考点来测定，并因此区分两种不同抗原，尤其是两种有独特表位的抗原。可特异性结合特定表位的抗体被称为“特异性抗体”。如果足量的寡核苷酸分子与其靶核酸分子形成碱基对或杂交，则所述寡核苷酸分子结合或稳定结合靶核酸分子，以允许检测所述结合。

在具体实例中，当两种组分之间复合物形成的结合常数超过约10⁴L/mol，例如超过约10⁶L/mol，超过约10⁸L/mol或超过约10¹⁰L/mol时，就称所述两种化合物特异性结合。两种组分的结合常数可以使用本领域已知的方法测定。

检测：确定具体因子存在或不存在，在某些实例中，如果检测到所述因子，则还包括对所述因子进行定量。

葡萄糖计：指用于确定血液中葡萄糖的大致浓度的任何医疗装置。葡萄糖计包括任何市售的葡萄糖计，例如个人葡萄糖计(PGM)。这样的葡萄糖计一般以mg/dl或mmol/l显示葡萄糖的水平。本公开不限于具体品牌的葡萄糖计，但实例包括

固定：结合到表面，例如固体支持物。在一个实施方案中，所述固体表面是珠形式。所述表面可以包含可特异性结合靶因子的固定识别分子。在某些实例中，可催化物质转化为葡萄糖的酶（直接或间接地）结合于使得可进行靶因子检测的识别分子。在一个实例中，一旦所述靶因子与固定到所述固体支持物的分子结合，可以催化物质转化为葡萄糖的所述酶就从所述固体支持物释放（或被释放从而其可移动到所固体支持物的另一部分，例如从横流装置的一部分到另一部分）。将因子固定到固体支持物的方法是本领域已知的。例如，在固体表面固定肽的方法可见于WO94/29436和美国专利No.5,858,358。在某些实例中，通过如下方式将因子固定到支持物，简单地将溶液中的因子施加到所述支持物上，并使所述溶液干燥，从而将所述因子固定到所述支持物上。

转化酶：(EC3.2.1.26)可以催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的酶。还被称为β-果糖呋喃苷酶。转化酶的核酸和蛋白质序列是公众可获得的。例如，登录号：D10265;AY378100REGION:43839..44963;Z46921REGION:37385..38983和AB534221公开了示例性的转化酶核酸序列，登录号：BAA01107.1;AAR07688.1;BAA25684.1;CAA87030.1和BAJ07824.1公开了示例性的转化酶蛋白序列，在2010年5月26日由提供的所有上述序列均以引用的方式纳入本文。在某些实例中，转化酶与公众可获得的转化酶序列具有至少80%的序列同一性，例如至少85%、90%、95%或98%的序列同一性，并且是可以催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的转化酶。

横流装置：横流色谱中使用的测试条形式的分析装置，其中样品流体，例如怀疑含有靶因子的液体，通过所述测试条（常常由吸水材料制造，例如纸、硝酸纤维素和纤维素）流动（例如通过毛细管作用）。所述测试样品和任何悬浮的分析物（包括靶因子）可以沿所述条流到检测区，在所述检测区中所述靶因子（如果存在）与本文提供的传感器的识别分子相互作用以指示所述靶因子的存在、不存在和/或量。

已经公开了许多横流分析装置，包括如下文献示出的那些:美国专利No.4,313,734；4,435,504；4,775,636；4,703,017；4,740,468；4,806,311；4,806,312；4,861,711；4,855,240；4,857,453；4,943,522；4,945,042；4,496,654；5,001,049；5,075,078；5,126,241；5,451,504；5,424,193；5,712,172；6,555,390；6,368,876；7,799,554；EP0810436；以及WO92/12428；WO94/01775；WO95/16207；和WO97/06439，其各自以引用的方式纳入本文。

在一个实例中，横流装置可以为一步(one-step)横流测定，其中样品流体被置于吸水条（尽管也可以使用非吸水材料，并通过在所述材料上施加表面活性剂提供吸水性）上的样品或芯吸区域，并可沿所述条迁移直到所述样品接触到与所述液体中靶因子相互作用的识别分子。所述靶因子结合所述识别分子后，所述可将物质转化为葡萄糖的酶被释放（例如从所述识别分子），并可与所述物质相互作用，从而生成葡萄糖，指示所述相互作用已经发生并且所述靶因子存在于所述样品中。所产生的葡萄糖可以用PGM检测。

在某些实例中，多个分立的结合配偶体可以被置于所述条上（例如成平行线或作为所述装置的其他分离部分）以检测所述液体中的多个靶因子。所述测试条还可以包括对照指示剂，其提供所述测试已经充分进行的信号，即使没有获得指示分析物存在（或不存在）的阳性信号。

横流装置可以包括样品施加区域或芯吸垫，其是所述流体或液态样品被引入的地方。在一个实例中，可以通过外部施加例如用滴管或其他点样器将所述样品引入到所述样品施加区域。在另一个实例中，所述样品施加区域可以直接浸在所述样品中，例如当测试条浸在装有样品的容器中时。在另一个实例中，所述样品可以被倾倒或挤压到所述样品施加区域。

横流装置可以包括缀合垫——固定所述识别分子（例如可将物质转化为葡萄糖的识别分子-酶）的横流装置区域。横流装置可以具有多于一个的缀合区域，例如，“第一级缀合区域”、“第二级缀合区域”等。通常会将不同的捕获因子固定在所述第一级、第二级或其他缀合区域。多个缀合区域在所述横流基质上相互之间可以为任何方向；例如第一级缀合区域可以在第二级（或其他）缀合区域的远侧或近侧，反之亦然。或者，第一级缀合区域和缀合（或其他）捕获区域可以相互为垂直方向，使得所述两个（或更多）缀合区域形成乘号或加号或其他符号。例如，Apiluxetal.(Anal.Chem.82:1727-32,2010),Dungchaietal.(Anal.Chem.81:5821-6,2009)和Dungchaietal.(AnalyticaChemicaActa674:227-33,2010)提供了示例性的横流装置，其具有中心样品区域和在所述样品区域的远侧的一个或多个缀合区域，该装置提供了可以发生独立反应的独立测试区（例如，每个测试区有不同的识别分子，还可以包括含有可转化为葡萄糖的物质的膜和接收所生成的葡萄糖的吸收垫，其中每个吸收垫可用PGM独立地读数），所述样品区域和缀合区域可例如形成“Y”、四叶式交叉或辐条轮样式。

横流装置可以包括含有可转化为葡萄糖的物质（例如蔗糖）的膜，和通过毛细管作用吸引所述样品穿过所述缀合垫和膜并收集所述样品的吸收垫。

传感器：用于检测靶例如靶分析物/因子的存在情况的装置。所述公开的传感器包括对靶因子特异的、附着到固体支持物的识别分子和可催化物质转化（例如在存在所述靶因子下）为葡萄糖的酶。所述酶可以直接或间接地附着到所述识别分子上。

靶因子：需要检测的任何物质，包括但不限于化学化合物、金属、病原体、毒素、核酸（例如DNA或RNA）或蛋白质（例如细胞因子、激素或抗原），以及具体的细胞（例如癌细胞或细菌细胞）、病毒或孢子。

用于检测靶因子的传感器

本文提供了可用于检测目的分析物（本文中称为靶因子）的传感器。这样的传感器可以使用本文提供的方法设计以检测宽范围的靶，可显著地促进合理设计以及增加传感器开发的效率。通过组合可特异性结合靶因子的分子（本文称为识别分子）、可将物质（例如酶底物）转化为葡萄糖的酶和市售的个人葡萄糖计(PGM)，提供了用于设计对宽范围分析物特异的便携、低成本且可定量传感器的通用平台。在一个实例中，所述方法基于靶因子诱导的所述酶从固体支持物的释放，或者基于也可结合所述靶因子的酶-识别分子复合物的使用，其中所述酶可以有效地将PGM-惰性物质（例如蔗糖）转化为PGM-可检测的葡萄糖。

本文报告了使用这种通用方法，定量可卡因、腺苷、干扰素-γ(IFN-γ)和UO₂ ²⁺的灵敏且具有选择性的具体传感器实例，其仅需市售的PGM进行所述检测。可卡因是成瘾药物，其检测对于药物滥用的管理是重要的^32,43；腺苷是重要的代谢产物，参与许多生物过程⁴⁶；IFN-γ是与人免疫系统相关的细胞因子⁴⁷，IFN-γ释放测定目前用于诊断肺结核⁴⁸，肺结核是传染性疾病，估计潜伏于三分之一的世界人口中，潜伏感染者中的10%可在生命中变得活跃；UO₂ ²⁺是对人和环境都有危险的放射性重金属离子⁴⁹。使用此平台，通过本文描述的通用方法可以实现用于使用PGM的多种分析物的许多其他传感器。

本文公开了可检测靶因子的传感器。在一个实例中，这样的传感器包括固体支持物，其上附着有可检测靶因子的识别分子。例如，所述识别分子在存在所述靶因子下可以高特异性地结合所述靶因子，但是不显著结合其他因子。在某些实例中，所述传感器还包括可催化物质（酶底物）转化为葡萄糖（或可被任意葡萄糖计检测的任何其他产物）的酶。例如，所述酶可以是可将蔗糖转化为葡萄糖的转化酶、蔗糖酶或蔗糖酶-异麦芽糖酶，可将麦芽糖转化为葡萄糖的麦芽糖酶，可将海藻糖转化为葡萄糖的海藻糖酶，可将乳糖转化为葡萄糖的乳糖酶，可将淀粉转化为葡萄糖的淀粉酶或葡糖淀粉酶或者可以是可将纤维素转化为葡萄糖的纤维素酶。所述酶还可以是任意来源的α-或β-葡糖苷酶或脱支酶。在一个实例中，所述酶附着到可检测靶因子的识别分子，使得在存在所述靶因子下，所述酶从所述固体支持物释放并可将物质转化为葡萄糖，所述葡萄糖可被检测且在某些实例中可被定量。在另一个实例中，所述酶最初不是所述传感器的一部分，而是在所述靶因子结合所述识别分子后，已经与所述酶缀合的第二识别分子（其可以与附着到所述固体支持物的识别分子相同或不同）结合于已结合到所述第一识别分子的靶因子，所述第一识别分子已经结合到所述固体支持物上，从而形成“夹心”型。然后，所述结合的酶可以将所述物质转化为葡萄糖，所述葡萄糖可被检测且在某些实例中可被定量

本领域技术人员应该认识到，使用其他技术将一种靶因子的浓度信息转变为另一种靶因子的浓度信息——随后使用本申请的方法检测所述另一种靶因子的浓度信息——的任何方法都可以被使用。例如，如果靶因子A可以通过某种技术定量地产生物质B，则可以简单地使用本申请的方法检测物质B，然后将物质B的浓度转化为样品中靶因子A的浓度。

图1A-B提供了所述传感器及其使用方法的概况。在图1A和1B中，识别分子A和识别分子B（本文称为可以高特异性地结合靶因子的识别分子）可以是相同或不同的分子，其中两者都可以结合分析物（本文中称为靶因子）。使用缀合方法，使可催化物质（酶底物）转化为葡萄糖的酶与分析物类似物（即所述靶因子的类似物；图1A）或识别分子B（图1B）缀合，以分别形成酶-分析物类似物缀合物（图1A）或酶-识别分子B缀合物（图1B）。所述酶底物可以被酶催化转化为葡萄糖，所产生的葡萄糖可以通过葡萄糖计定量。所述测试因子（分析物）可以是可被识别分子A和识别分子B识别的任何物质。

所述分析物类似物可以是可结合识别分子A的任何物质，并与所述靶因子与识别分子A之间的结合相竞争的任何物质。分析物类似物的实例包括但不限于：抗体与抗原；适体与对应的靶；核酶与对应的辅因子或靶；DNAzyme或催化性DNA或DNA酶与对应的辅因子或靶；以及核酸或其他类似物，例如肽核酸、锁核酸和任何的化学修饰的类似物。所述酶-分析物类似物缀合物和所述酶-识别分子B缀合物是通过使用常规的缀合方法，将所述酶分别与所述分析物类似物或识别分子B缀合而制备的。

图1A示出了示例性的基于释放的测定。最初，酶-分析物类似物缀合物通过酶-分析物类似物缀合物与识别分子A之间的相互作用结合到所述固体支持物。当含有测试因子的样品被施加到所述固体支持物时，由于酶-分析物类似物缀合物和测试因子之间对结合识别分子A的竞争，所述酶-分析物类似物缀合物会被释放。所释放的酶-分析物类似物缀合物的浓度可以与所述样品中的测试因子浓度成比例。在除去所述固体支持物后，留在溶液中的酶-分析物类似物缀合物可以催化所述酶底物转化为葡萄糖，所述葡萄糖通过葡萄糖计检测，其读数与所述分析物浓度成比例。

图1B示出了示例性的基于结合的测定。最初，识别分子A被固定到所述固体支持物。当含有或怀疑含有测试因子（分析物）的样品被施加到固体支持物时，所述分析物结合识别分子A。随后，加入酶-识别分子B缀合物，其会结合识别分子A上的分析物，形成夹心结构。结合的酶-识别分子B缀合物的量可以与所述样品中分析物的浓度成比例。在将酶底物（例如蔗糖）施加到固体支持物上后，所述结合的酶-识别分子B缀合物可以将酶底物转化为葡萄糖，所述葡萄糖通过葡萄糖计检测，其读数与所述分析物浓度成比例。所以，在该实例中，所述酶没有与识别分子A结合，也没有从所述固体支持物释放或分离。所述酶实际上与所述靶因子结合，并且所述靶因子可以结合识别分子A和B两者。这样，在存在更多所述靶因子下，更多酶将结合到所述固体支持物，所述固体支持物可以将更多蔗糖转化为葡萄糖，得到更大的葡萄糖计读数。

如图2A和2B所示，图1A和1B中的所述识别分子可以是抗体（例如抗体A和抗体B）。通过图2A或2B示出的方法，具有抗体的任何靶因子均可通过葡萄糖计被定量。如图2A和2B所示，抗体A和抗体B都可以结合所述分析物（靶因子）；它们可以是相同抗体或对相同分析物特异的不同抗体。

图2A示出了基于释放的方法。使用常规缀合方法将抗体A固定到所述固体支持物。加入所述酶-类似物缀合物（例如转化酶-抗体缀合物），其会结合抗体A。所述酶-类似物缀合物可以使用常规方法制备。使含有分析物（例如怀疑含有所述靶因子）的样品，在允许所述靶因子特异性结合抗体A的条件下，与所述固体支持物接触，从而因竞争而取代所述酶-类似物缀合物。释放的酶-类似物缀合物的量可以与所述样品中靶因子的浓度成比例。在除去所述固体支持物后，所述酶-抗体缀合物可以将所述酶底物（例如蔗糖）转化为葡萄糖，所述葡萄糖通过葡萄糖计检测，其读数与所测试的样品中靶因子浓度成比例。

图2B示出了基于结合的方法。使用常规方法将抗体A固定到所述固体支持物。将含有分析物（例如怀疑含有所述靶因子）的样品，在允许所述靶因子特异性结合抗体的条件下，与所述固体支持物接触。加入酶-抗体B缀合物（例如转化酶-抗体B缀合物），其会结合已与抗体A结合的分析物（靶因子），形成夹心结构。所述酶-抗体B缀合物可以使用常规方法制备。结合的酶-抗体B缀合物的量可以与所述样品中靶因子的浓度成比例。在将酶底物（例如蔗糖）溶液施加到所述固体支持物后，所述结合的酶-抗体B缀合物可以将所述酶底物（例如蔗糖）转化为葡萄糖，所述葡萄糖通过葡萄糖计检测，其读数与所测试的样品中靶因子浓度成比例。

如图3A和3B所示，图1A和1B中的识别分子可以是功能性核酸，例如适体、DNAzyme或适体酶(aptazyme)（例如功能性核酸(FNA)A和B）。如图3A和3B所示，FNAA和FNAB都可以结合所述分析物（靶因子）；它们可以是相同FNA或对相同分析物特异的不同FNA。

图3A示出了基于释放的方法。使用常规固定方法将FNAA固定到所述固体支持物。加入所述酶-类似物缀合物（例如转化酶-分析物类似物缀合物），其会结合FNAA。所述酶-类似物缀合物可以使用常规方法制备。使含有分析物（例如怀疑含有所述靶因子）的样品，在允许所述靶因子特异性结合FNAA的条件下，与所述固体支持物接触，从而因竞争而取代所述酶-类似物缀合物。释放的酶-类似物缀合物的量可以与所述样品中靶因子的浓度成比例。在除去所述固体支持物后，所述酶-抗体缀合物可以将所述酶底物（例如蔗糖）转化为葡萄糖，所述葡萄糖通过葡萄糖计检测，其读数与所测试的样品中靶因子浓度成比例.

图3B示出了基于结合的方法。使用常规方法将FNAA固定到所述固体支持物。使含有分析物（例如怀疑含有所述靶因子）的样品，在允许所述靶因子特异性结合FNAA的条件下，与所述固体支持物接触。加入酶-FNAB缀合物（例如转化酶-FNAB缀合物），其会结合已与FNAA结合的分析物（靶因子），形成夹心结构。所述酶-FNAB缀合物可以使用常规方法制备。结合的酶-FNAB缀合物的量可以与所述样品中靶因子的浓度成比例。在将酶底物（例如蔗糖）溶液施加到所述固体支持物后，所述结合的酶-FNAB缀合物可以将所述酶底物（例如蔗糖）转化为葡萄糖，所述葡萄糖通过葡萄糖计检测，其读数与所测试的样品中靶因子浓度成比例。

因为所述靶分析物可以是可被图1A和1B示出的识别分子A和B识别的任何物质，所以本公开不受限于使用具体的识别组分。例如，除抗体（图2A和2B）和功能性核酸（图3A和3B）外，它们可以包括肽、蛋白质、聚合物以及可识别靶分析物的更小分子。例如，如图4A和4B所示，可以通过核酸之间的杂交检测核酸。在该实例中，所述靶因子为核酸，图1A和1B的识别分子A和识别分子B被替换为可与所述分析物杂交的核酸。还应该认识到，还可以使用组合的方法，例如用抗体和功能性核酸分别代替识别分子A和识别分子B（图1A和1B）（或者反之亦然）。

如图4A和4B所示，在图1A和1B中的识别分子可以是核酸（例如DNA），所述分析物（靶因子）也可以是核酸。如图4A和4B所示，核酸A和核酸B两者都可以结合所述分析物（靶因子）；它们可以是相同核酸或对相同的核酸靶因子特异的不同核酸。

图4A示出了基于释放的方法。使用常规固定方法将DNAA固定到所述固体支持物。加入所述酶-类似物缀合物（例如转化酶-分析物类似物缀合物），其会结合DNAA。所述酶-类似物缀合物可以使用常规方法制备。使含有分析物（例如怀疑含有所述靶因子）的样品，在允许所述靶因子特异性结合DNAA的条件下，与所述固体支持物接触，从而因竞争而取代所述酶-类似物缀合物。释放的酶-类似物缀合物的量可以与所述样品中靶因子的浓度成比例。在除去所述固体支持物后，所述酶-抗体缀合物可以将所述酶底物（例如蔗糖）转化为葡萄糖，所述葡萄糖通过葡萄糖计检测，其读数与所测试的样品中靶因子浓度成比例.

图4B示出了基于结合的方法。使用常规方法将DNAA固定到所述固体支持物。使含有分析物（例如怀疑含有所述靶因子）的样品，在允许所述靶因子特异性结合DNAA的条件下，与所述固体支持物接触。加入酶-DNAB缀合物（例如转化酶-DNAB缀合物），其会结合已与DNAA结合的分析物（靶因子），形成夹心结构。所述酶-DNAB缀合物可以使用常规方法制备。结合的酶-DNAB缀合物的量可以与所述样品中靶因子的浓度成比例。在将酶底物（例如蔗糖）溶液施加到所述固体支持物后，所述结合的酶-DNAB缀合物可以将所述酶底物（例如蔗糖）转化为葡萄糖，所述葡萄糖通过葡萄糖计检测，其读数与所测试的样品中靶因子浓度成比例。

图5示出了所公开的传感器的具体实例。所述传感器设计是基于以下两者：作为信号发生器的分析物诱导的DNA从固定在磁珠上的功能性DNA双链体的释放，以及，作为信号放大器的DNA-转化酶缀合物。一旦具体的靶结合所述DNA，与所述适体或所述DNAzyme的底物部分互补的单链DNA(ssDNA)就被释放，这是由于所述适体的结构转换或所述DNAzyme的催化反应。因为所述ssDNA与转化酶共价地缀合，所以所述转化酶与所述ssDNA一起被释放。然后，所释放的转化酶可以催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖，葡萄糖可被PGM进一步检测并可用于定量所述样品中分析物的浓度。

固体支持物

形成所述传感器的基础的固体支持物可以由已知材料形成，例如任何不溶于水的材料。在某些实例中，可用于形成所述固体支持物表面的材料的适合特性包括：可进行表面活化，使得一旦活化，所述支持物表面能够共价地连接可高特异性结合所述靶因子的识别分子，例如例如寡核苷酸或蛋白质；是化学惰性的，使得所述支持物上未被所述可高特异性结合靶因子的分子占据的区域不发生非特异性的结合，或者当发生非特异性结合时，这些材料可以被容易地从所述表面除去而不会除去所述可高特异性结合靶因子的分子。

固相可按其吸引和固定因子（例如可高特异性结合所述靶因子的识别分子）的固有能力来选择。或者，所述固相可以有具有吸引并固定因子例如识别分子的能力的因素。所述因素可以包括带电荷的物质，其带有相对于例如所述识别分子本身或相对于缀合到所述识别分子的带电荷的物质相反的电荷。在另一个实施方案中，可将特异性结合部件固定在所述固相上，以固定其结合配偶体（例如识别分子）。因此，在该实例中，所述特异性结合部件使所述识别分子间接地结合到固相材料。

固体支持物表面可以通过导致因子（例如对所述靶因子特异的识别分子）共价连接到所述支持物的化学过程而活化。但是，也可以使用任何其他适合的方法来将因子（例如识别分子）固定到固体支持物，包括但不限于离子相互作用、疏水性相互作用、共价相互作用等。导致识别分子固定到固相上的具体力对于本文描述的方法和装置是不重要的。

在一个实例中，所述固体支持物是颗粒，例如珠。这种颗粒可以由金属（例如金、银、铂）、金属化合物颗粒（例如氧化锌、硫化锌、硫化铜、硫化镉）、非金属化合物（例如硅或聚合物）以及磁性颗粒（例如氧化铁、氧化锰）组成。在某些实例中，所述珠是乳胶或玻璃珠。所述珠的大小不是关键的；示例性的大小包括直径5nm到5000nm。在一个实例中，这种颗粒直径为约1μm。

在另一个实例中，所述固体支持物是疏松材料，例如纸、膜、多孔材料、不溶于水的凝胶、与水不混溶的离子液体、不溶于水的聚合物（例如有机聚合物）等。例如，所述固体支持物可以包括膜，例如允许某些材料通过而截留其他材料的半多孔膜。在一个实例中，所述膜包括硝酸纤维素。在一个具体实例中，所述固体支持物是横流装置的一部分，所述横流装置包括含有本文所公开的传感器的区域。

在某些实施方案中，多孔固体支持物例如硝酸纤维素是片状物形式或条状物形式，例如见于横流装置中的这些。这种片状物或条状物的厚度可以在大限度内变化，例如至少0.01mm、至少0.1mm或至少1mm，例如约0.01到5mm、约0.01到2mm、约0.01到1mm、约0.01到0.5mm、约0.02到0.45mm、约0.05到0.3mm、约0.075到0.25mm、约0.1到0.2mm或约0.11到0.15mm。这种片状物或条状物的孔的大小可以类似地在大限度内变化，例如约0.025到15微米，或更特别是约0.1到3微米；但是，孔的大小不应成为选择所述固体支持物的限制性因素。固体支持物的可适用的流速也可以在大限度内变化，例如约12.5到90sec/cm（即50到300sec/4cm）、约22.5到62.5sec/cm（即90到250sec/4cm）、约25到62.5sec/cm（即100到250sec/4cm）、约37.5到62.5sec/cm（即150到250sec/4cm）或约50到62.5sec/cm（即200到250sec/4cm）。在本文描述的装置的具体实施方案中，所述流速为约62.5sec/cm（即250sec/4cm）。在本文描述的装置的其他具体实施方案中，所述流速为约37.5sec/cm（即150sec/4cm）。

在一个实例中，所述固体支持物由有机聚合物组成。用于所述固体支持物的适合材料包括但不限于：聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚乙烯吡咯烷、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯-丙烯、聚乙烯-乙烯醇、聚甲基戊烯、聚三氟氯乙烯、聚砜、羟基化的双向拉伸聚丙烯、胺化的双向拉伸聚丙烯、硫醇化双向拉伸聚丙烯、乙烯丙烯酸、亚甲基甲基丙烯酸及其共聚物的掺合物。

在其他的实例中，所述固体支持物是含有例如涂层的材料，所述涂层含有本文提供的成分的任意一种或多种或其混合物。

根据本公开可以使用多种固体支持物。除非物理学上另受约束，固体支持物可以以任何适合的形状被使用，例如薄膜、片状物、条状物或板状体，或者其可以被包被或结合或层压到适当的惰性支持物上，所述惰性支持物例如纸、玻璃、塑料薄膜或织物。

所述固体支持物可以是可附加对所述测试因子特异的分子的任何形式，例如微量滴定板、ELISA板、测试管、无机片状物、试纸、横流装置等。一个实例包括对所述靶因子特异的分子的线性阵列，在本领域中通常称为试纸(dipstick)。另一种适合的形式包括独立单元的二维样式（例如64*64阵列的4096方块）。本领域技术人员应该理解，包括但不限于的槽形（矩形）和圆形阵列的其他阵列形式同样适合使用。在一个实例中，所述阵列形成在聚合物介质上，所述介质是线、膜或薄膜。有机聚合物介质的实例是厚度大约为1mil.（0.001英寸）到约20mil.的聚丙烯片状物，但所述薄膜的厚度不是关键的并可以在相当宽的范围内变化。

在一个实例中，所述形式是珠，例如二氧化硅珠。在另一个实例中，所述形式是硝酸纤维素膜。在另一个实例中，所述形式是滤纸。在仍然另一个实例中，所述形式是玻璃载玻片。在一个实例中，所述固体支持物是聚丙烯线。一根或多根聚丙烯线可被附加到塑料试纸型装置；聚丙烯膜可被附着到玻璃载玻片。

在一个实例中，所述固体支持物是微量滴定板。例如，传感器可被附加到微量滴定板的孔中（例如其中某些孔可以含有检测靶X的传感器，而其他孔可以含有检测靶Y的传感器；或者几个孔可以包括相同传感器，其中可同时分析多个样品）。可能含有目的分析物的测试样品被放置于含有本文所公开传感器的微量滴定板的孔中，使用本文提供的方法检测所述靶的存在情况。所述微量滴定板形式的一个优势是可以同时测试多个样品（和对照），每个样品在相同板的一个或多个不同孔中；因此，可允许高通量分析许多样品。

在某些实例中，所公开的传感器被附着到多于一个的固体支持物。例如，如图24所示，含有识别分子-酶复合物的传感器可被附着到珠，然后所述珠可以被附着到横流装置的缀合垫。

在某些实施方案中，本文论述的支持物和装置的每一个（例如ELISA、横流装置）均可以被安排用于，通过加入对其他目的分析物特异的识别分子来检测多个分析物。例如，微量滴定板的某些孔可以包括对其他目的分析物特异的识别分子。某些横流装置实施方案可以包括含有对其他目的分析物特异的识别分子的二级、三级或更多的捕获区域。

横流装置

在一个实例中，所述固体支持物是横流装置，其可被用于确定流体样品中一种或多种靶因子的存在情况和/或量。横流装置是具有测试条的分析装置，怀疑（或已知）含有靶因子的测试样品流体通过所述测试条流动。横流装置用于简化和自动化用户样品界面和处理。横流装置的一个实例是怀孕测试条。基于怀孕测试条的原理，可以开发包括本公开的传感器的横流装置。在某些实例中，通过使用例如横流装置，可以将样品直接地与所述横流装置接触或施加到所述横流装置，不需要进一步的液体转移或混合。这种装置可被用于例如定性地或定量地检测靶因子。

横流装置是本领域众所周知的，并且具有多种物理形式。本公开涵盖以适当功能关系支持和/或容纳横流装置的基本组分的任何物理形式。在一个实例中，使用了美国专利No.7,799,554、Liuetal.(Angew.Chem.Int.Ed.45:7955-59,2006)、Apiluxetal.(Anal.Chem.82:1727-32,2010)、Dungchaietal.(Anal.Chem.81:5821-6,2009)或Dungchaietal.(AnalyticaChemicaActa674:227-33,2010)（以上所有均以引用的方式纳入本文）中公开的横流装置，例如使用MilliporeHi-FlowPlusAssemblyKit制造的横流装置。有大量市售横流型测试及专利公开了对大分析物（分子量大于1000道尔顿）进行检测的方法（参见例如美国专利No.5,229,073;5,591,645;4,168,146;4,366,241;4,855,240;4,861,711;和5,120,643;欧洲专利No.0296724;WO97/06439;和WO98/36278）。也有用于检测小分析物（分子量100-1000道尔顿）的横流型测试（参见例如美国专利No.4,703,017;5,451,504;5,451,507;5,798,273;和6,001,658）。

横流装置的构建和设计是本领域熟知的，例如描述于MilliporeCorporation,AShortGuideDevelopingImmunochromatographicTestStrips,2ndEdition,pp.1-40,1999，其可通过请求(800)645-5476而获得；以及Schleicher&Schuell,EasytoWorkwithBioScience，ProductsandProtocols2003,pp.73-98,2003，其可通过请求Schleicher&SchuellBioScience,Inc.,10OpticalAvenue,Keene,NH03431,(603)352-3810而获得；以上两者都以引用的方式纳入本文。

本文描述的装置通常包括吸收材料的条状物（例如微孔膜），其可由区域内彼此相连的不同物质制成，其可以是邻接的和/或重叠的。在某些实例中，所述吸收条状物可以被固定到支持性的非相互作用材料（例如非编织聚酯）上，目的是例如给所述条状物提供增加的刚性。每个条状物内的区域可以不同地含有，检测和/或定量所测试的具体分析物所需要的特异性识别分子和/或其他试剂（例如可被酶转化为葡萄糖的酶底物，例如蔗糖）。因此，这些区域可以被视为所述测试装置内的功能性部分或功能性区域。

这些装置一般包括样品施加区域和一个或多个分离的靶因子捕获区域（缀合垫），其中提供了本文公开的固定化传感器，所述传感器包括对靶因子具有特异性结合亲和力的识别分子。例如，含有至少两个分离的靶因子捕获区域（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多）的横流装置可被用于检测单一样品中大量不同的靶因子。任何被施加在所述样品施加区域的的液体（例如流体生物样品）沿着从所述样品施加区域到所述捕获区域的流动路线流动。一旦所述靶因子结合所述识别分子，可催化物质转化为葡萄糖的所述酶就被释放（这种酶和物质的实例参见表2）。所述酶流动到含有所述适当物质的下游膜。所述物质（例如蔗糖）被转化为葡萄糖，所述葡萄糖流动到下游吸收垫，其可作为液体储存器。在所述横流条带上的产生的葡萄糖可用PGM检测，例如通过将所述装置插入PGM。

在一个可检测多种靶的横流装置的实例中，所述装置包括单一芯吸垫或样品施加区域，和多个缀合垫、膜和吸收垫（使得每个缀合垫与具体的膜和吸收垫相关联）。例如，每个缀合垫可以包括对具体的靶因子特异的不同识别分子。因此，因所述靶因子产生的并存在于每个吸收垫上的葡萄糖可用于检测具体靶因子的存在情况。

为使得PGM在许多不同样品中能够检测宽范围的非葡萄糖靶，可生成包括识别分子的横流装置，所述识别分子可与可催化物质（例如蔗糖）转化为葡萄糖的酶（例如转化酶）缀合。在一个实例中，所述识别分子为对所述靶有高特异性的核酸适体（例如DNA适体）。在另一个实例中，所述识别分子是对所述靶特异的抗体。理想地，识别分子能够以高灵敏度和选择性识别靶。这种分子是已知的，并可以使用已知方法容易地获得。可催化物质（例如蔗糖）转化为葡萄糖的所述酶（例如转化酶）可与所述识别分子缀合，产生例如适体-酶缀合物（例如适体-转化酶缀合物）或Ab-酶缀合物（例如Ab-转化酶缀合物）。在一个具体实例中，所述识别分子是对病原体例如乙肝表面抗原（HBsAg）或HIV的Tat蛋白特异的DNA适体，并与转化酶缀合。这种适体可使用已知方法生成⁴⁹。本文提供了其他示例性的识别分子和可催化物质（例如蔗糖）转化为葡萄糖的酶。

所述横流装置可以包括芯吸垫、缀合垫、膜、吸收垫及其组合。这些垫可以相互邻接或重叠，并可被附着到背面。可用于横流装置的组件的示例性材料在表1示出。但是，本领域技术人员应该认识到，在具体横流装置中使用的具体材料将依赖于许多变量，包括例如要检测的分析物、样品容量、需要的流速以及其他变量，可以相应地常规选择有用的材料。

表1：用于横流装置的示例性材料

将已知或怀疑含有一种或多种靶因子的样品例如通过浸没或点样施加到所述芯吸垫（其通常在所述装置的近端，但当例如包括多个缀合垫以检测多个靶时可以例如在所述装置的中部）或与所述芯吸垫接触。样品可使用本领域技术人员熟知的方法收集或获得。含有要检测的测试因子的样品可从任意来源获得。在测试之前可以将所述样品稀释、纯化、浓缩、过滤、溶解、重悬或其他处理以使结果最佳化。所述流体样品从远侧迁移通过所述条的所有功能性区域。所述流体在单独的功能性区域的最终分布依赖于所用材料的吸附能力和尺寸。

所述芯吸垫确保所述样品以可控制方式移动通过所述装置，使得其以单方向流动。所述芯吸垫最初接受所述样品，并可起到从所述样品移除微粒的作用。在可用于构建样品垫的多种材料中（见表1），如果在具体应用中大的床体积（例如250μl/cm²）是一个因素，那么纤维素样品垫可能是有利的。在一个实例中，所述芯吸垫由Millipore纤维素纤维样品垫制造（例如10-25mm垫，例如15mm垫）。芯吸垫可以用一种或多种释放试剂处理，例如缓冲液、盐、蛋白质、去污剂和表面活性剂。这种释放试剂可以用于例如促进缀合垫组分的再增溶作用，和封闭横流装置的其他组件例如硝酸纤维素膜中的非特异性结合位点。代表性的释放试剂包括例如海藻糖或葡萄糖(1%-5%)、PVP或PVA(0.5%-2%)、Tween20或TritonX-100(0.1%-1%)、酪蛋白(1%-2%)、SDS(0.02%-5%)和PEG(0.02%-5%)。

在将所述样品与所述芯吸垫接触后，所述样品液体由于毛细管力而从底部迁移到顶部（或从中心向外）。然后，所述样品流到所述缀合垫，其功能之一是保留所述识别分子-酶复合物。所述识别分子-酶缀合物可以通过点样固定到所述缀合垫（例如所述识别分子-酶缀合物例如转化酶/适体缀合物可被悬浮在水或其他适合缓冲液中并点样到所述缀合垫并可被干燥）。所述缀合垫可由已知材料（见表1）制造，例如玻璃纤维，例如10-25mm例如13mm的玻璃纤维。当所述样品到达所述缀合垫时，存在于所述样品中的靶因子可以结合已固定到所述缀合垫的识别分子-酶，导致所述酶（例如所述识别分子-酶复合物）从所述缀合垫的释放。所述识别分子-酶缀合物被释放，因为所述识别分子（例如适体或Ab）对所述靶因子具有比对所述固定表面更高的亲和力（例如所述表面被更低结合亲和力的靶因子类似物修饰）。在一个具体的公开实施方案中，与所述缀合垫缔合的所述识别分子-酶是例如固定到珠的固定化的DNA适体-转化酶缀合物或固定化的Ab-转化酶缀合物。

然后，所释放的酶（例如所述识别分子-酶复合物）流到所述膜，所述膜包被有可被与所述识别分子缀合的酶转化为葡萄糖的因子（例如蔗糖）。然后，所释放的酶（例如转化酶）催化由被蔗糖（或可被所缀合的酶转化为葡萄糖的其他因子，见表2）包被的膜中的蔗糖（或可被所述酶转化为葡萄糖的其他化合物）产生葡萄糖。所述膜部分可由已知材料（见表1）制造，例如HiFlowPlusCelluloseEsterMembrane，例如10-40mm例如25mm的HiFlowPlusCelluloseEsterMembrane。可用于将所述蔗糖或其他物质附着到所述膜的方法包括点样（例如所述蔗糖或其他物质可被悬浮在水或其他适合缓冲液中并点样到所述膜并可被干燥）。

最终，在所述膜产生的葡萄糖随着所述流移动并到达所述吸收垫，然后其在此被连接的PGM检测。所述吸收垫的作用是通过毛细管作用吸引所述样品穿过所述缀合垫和膜并收集所述样品。这种作用对于确保所述样品溶液从所述样品垫或芯吸垫单向地通过缀合垫和膜流到所述吸收垫是有用的。所述多种材料的任一种可用于制备吸收垫，参见例如表1。在某些装置实施方案中，吸收垫可以是纸（即纤维素纤维）。本领域技术人员可以基于例如其厚度、压缩性、可制造性和床体积的匀一性来选择纸吸收垫。制造的吸收垫的吸收容量可以通过改变吸收垫的尺寸（通常是长度）来调整。在一个实例中，所述吸收垫是10-25mm，例如15mm。

由所述PGM检测的葡萄糖、释放的酶或识别分子-酶复合物以及靶因子的量是相互成比例的，因此所述靶因子可由所述葡萄糖计的读数定量。为了更准确定量所述靶因子，可以从结果中减去所述样品中的初始葡萄糖浓度。由于所述识别分子（例如适体或Ab）对其靶的高选择性，所述样品中其他组分的干扰是极微小的。

一具体的示例性横流装置在图24示出。所述横流装置包括吸水的横流条，其可以以外壳材料（例如塑料或其他材料）的形式存在。所述横流条被分为近侧芯吸垫、缀合垫（含有固定化的适体-转化酶缀合物）、包被有蔗糖的膜和远侧吸收垫。沿着条的流动路线是从近侧芯吸垫，通过缀合垫，到包被有蔗糖的膜，以最终收集在吸收垫中。

在对图24示出的横流装置的具体实施方案的操作中，将含有（或怀疑含有）目的靶例如金属靶因子的流体样品施加到所述芯吸垫，例如逐滴施加或通过将所述装置的末端浸没在所述样品中。如果所述样品是全血，那么可将可选的显影流体加入到所述血液样品以导致红细胞的溶血，并且在某些情况中以使所述全血样品适当稀释。所述样品例如通过毛细管作用从所述芯吸垫到达所述缀合垫。在所述缀合垫中，所述目的靶结合所述固定化的适体-转化酶缀合物。例如，如果所述识别分子对IFN-γ是特异的，那么所述样品中的IFN-γ会结合所述缀合垫中含有的固定化的IFN-γ适体-转化酶缀合物。在这种结合后，所述缀合物的转化酶被释放，并可以随后流动到所述膜，在此所述转化酶可以与存在于所述膜上的蔗糖相互作用，从而产生葡萄糖。所产生的葡萄糖可以随后流动到所述吸收垫，其可被葡萄糖计读出，其中葡萄糖的存在指示所测试的样品中靶因子的存在。

可检测所述靶因子的识别分子

可特异性结合所述靶因子并因此可检测所述靶因子的识别分子可以是核酸分子、蛋白质、肽核酸、聚合物、有机小分子、抗体等。例如，特异性结合所述靶因子的分子可以是特异性结合所述靶因子的任何物质，并且一旦发生这种结合，所述分子就发生改变，例如折叠、结合或释放，这在某些实例中导致缀合到所述分子的酶的释放。

在一个实例中，所述特异性结合所述靶因子的分子是抗体（例如单克隆抗体或多克隆抗体或其片段）或抗原。对多种靶因子特异的抗体是市售的，或者可使用常规方法生成。

在一个实例中，所述特异性结合所述靶因子的分子是以高特异性结合所述靶因子的蛋白质。

在另一个实例中，所述特异性结合所述靶因子的分子是核酸或其他类似物，例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或任何化学修饰的核苷酸类似物。例如，所述核酸分子可由DNA或RNA组成，例如包含天然存在的和/或修饰的碱基的DNA或RNA。在一个实例中，当所述靶是核酸分子（例如DNA或RNA）时，所述识别核酸分子可以具有与所述靶核酸分子序列互补的序列，使得所述靶核酸与识别分子可以互相杂交。在一个实例中，所述核酸分子是核酶，其可检测对应的辅因子或靶因子。核酶是具有催化活性例如RNA剪接活性的RNA分子。当核酶起作用时，为了其酶活性，它们经常需要辅因子，例如金属离子(例如Mg²⁺)。这种辅因子可以是基于核酶活性而被检测的靶因子。因此，因为辅因子支持核酶活性，因此核酶活性可以是所述辅因子或靶因子存在的指示剂。

功能性DNA

除蛋白质外，最近几年已经发现核酸也具有催化活性。所述催化活性的核酸可以是催化性DNA/RNA，也称为DNAzyme/RNAzyme、脱氧核酶/核酶和DNA酶/RNA酶。催化活性核酸还可含有修饰的核酸。可以选择核酸从而以高亲和力和特异性地结合宽范围的分析物。这些结合核酸被称为适体。

适体是以高亲和力和特异性识别靶的核酸（例如DNA或RNA）。适体酶（也称为变构DNA/RNAzyme或变构（脱氧）核酶）是被效应子（所述靶分子）调节的DNA/RNAzyme。它们一般含有可识别效应子的适体域和催化域。所述效应子可以通过所述适体域和所述催化域之间的特异性相互作用减少或增加所述适体酶的催化活性。因此，所述适体酶的活性可用于监测所述效应子的存在情况并对其定量。另外，通过引入接近DNAzyme催化核心的适体基序来设计DNA适体酶的通常策略是可用的(Wangetal.,J.Mol.Biol.,318:33-43,2002)。高切割活性需要效应子分子的存在，所述效应子分子一旦结合所述适体基序，其就可以变构地调节所述适体酶催化核心部分的活性。

体外选择方法可用于获得具有超高亲和力的宽范围靶分子的适体，其具有高达皮摩尔范围的解离常数(BrodyandGold,J.Biotechnol.74:5-13,2000;Jayasena,Clin.Chem.,45:1628-1650,1999;WilsonandSzostak,Annu.Rev.Biochem.68:611-647,1999)。例如，已经开发了这样的适体，其可识别金属离子例如Zn(II)(Ciesiolkaetal.,RNA1:538-550,1995)和Ni(II)(Hofmannetal.,RNA,3:1289-1300,1997)；核苷酸例如三磷酸腺苷(ATP)(HuizengaandSzostak,Biochemistry,34:656-665,1995)和鸟嘌呤(Kigaetal.,NucleicAcidsResearch,26:1755-60,1998)；辅因子例如NAD(Kigaetal.,NucleicAcidsResearch,26:1755-60,1998)和黄素(flavin)(LauhonandSzostak,J.Am.Chem.Soc.,117:1246-57,1995)；抗生素例如紫霉素(Wallisetal.,Chem.Biol.4:357-366,1997)和链霉素(WallaceandSchroeder，RNA4:112-123,1998)；蛋白质例如HIV反转录酶(Chaloinetal.,NucleicAcidsResearch,30:4001-8,2002)和丙肝病毒RNA依赖的RNA聚合酶(Biroccioetal.,J.Virol.76:3688-96,2002)；毒素例如霍乱全毒素(cholerawholetoxin)和葡萄球菌肠毒素B(BrunoandKiel,BioTechniques,32:pp.178-180and182-183,2002)；以及细菌孢子例如炭疽(BrunoandKiel,Biosensors&Bioelectronics,14:457-464,1999)。与抗体相比，基于DNA/RNA的适体更容易获得并可被更廉价地产生，因为它们可在体外在短时期内（天vs.月）并用有限成本获得。另外，DNA/RNA可被变性和复性许多次而不损失其生物识别能力。

一般地，基于DNA/RNAzyme或基于适体酶的传感器具有三部分：

(1)核酸酶（例如DNA/RNAzyme和适体酶）和辅因子，例如催化底物切割的金属离子；

(2)所述核酸酶的核酸底物，其中所述底物序列的一些内部部分与所述酶序列的一些部分互补；

(3)附着于与所述底物的3'和5'末端互补的多核苷酸的物质。

在一个实例中，所述核酸分子是功能性核酸，例如适体、DNAzyme或适体酶。适体是可结合特异性靶例如本文提供的靶因子的双链DNA或单链RNA。例如，所述腺苷适体结合作为其对应靶的腺苷。在另一个实例中，特异性结合所述靶因子的分子是DNAzyme或催化性DNA或DNA酶。DNAzyme是具有酶活性的DNA分子。它们与核酶类似，但是由DNA而不是RNA组成。因此，DNAzyme也称为脱氧核酶、催化DNA或DNA酶。像核酶一样，DNAzyme需要辅因子，例如金属离子，以具有催化活性。因此，DNAzyme还可用于检测靶因子金属离子。适体酶是适体和DNAzyme或核酶的组合。当所述靶因子结合触发DNAzyme/核酶活性或者抑制DNAzyme/核酶活性的适体时，适体酶工作。

在一个实例中，特异性结合所述靶因子的分子是功能性DNA¹⁴。包括DNAzyme^15,16（也称为脱氧核酶、催化性DNA或DNA酶）和DNA适体的功能性DNA^17,18，通过被称为体外选择¹⁶或指数富集的配基系统进化(SELEX)¹⁸的过程选自具有约10¹⁵个随机序列DNA（通常2-25kDa）库。这些DNAzyme和适体对多种靶分别呈现特异性的催化活性和强烈的结合亲和力。所述靶可为从金属离子和有机小分子到生物分子，甚至病毒或细胞^14,19。因此，功能性DNA可以作为所述传感器中识别靶因子的源。

鉴定对具体靶因子有特异性的功能性DNA的方法在本领域是常规的并已经在以下几个专利中被描述（所有这些专利均以引用的方式纳入本文）。例如美国专利No.7,192,708;7,332,283;7,485,419;7,534,560;和7,612,185，以及美国专利公开No.20070037171和20060094026，其描述了鉴定可结合具体离子例如铅和钴的功能性DNA分子的方法。另外，提供了具体实例。虽然所述实例中的一些描述了有荧光团的功能性DNA分子，但是这种标记对本文描述的传感器不是必需的。

另外，因为所述功能性DNA的二级结构是可预知的，所以可直接将信号转导部分纳入其中并将功能性DNA与其靶之间的相互作用转变为可物理检测的信号。已经开发了许多用于宽范围分析物的功能性DNA传感器^14,20-28，其使用多种分析技术，例如比色法^10,29-33、荧光^34-38、电化学^39-44和磁共振⁴⁵。但是，直到现在，基于实验室的装置对于这些设计中的定量检测是必需的。

可将物质转化为葡萄糖的酶

可将分子（酶底物）转化为葡萄糖（6-(羟甲基)氧丙环-2,3,4,5-四醇，然后其可以使用PGM检测）的任何酶均可用于本文提供的传感器和方法。虽然本文已经提供了使用转化酶的具体实例，但是本领域技术人员应该理解也可以使用其他酶。例如，任何的葡糖苷酶（α或β）均可用于从所述对应的酶底物产生葡萄糖。具体实例在如下表2示出。

表2：本公开的示例性酶

为在本文描述的传感器中应用这些酶，如下实例中描述的转化酶可被这些酶之一代替，蔗糖可被以上列出的对应酶底物代替。

虽然本文列出了示例性的GENBANK号，但是本公开不限于使用这些序列。许多其他酶序列也是公众可获得的，因此可容易地用于所公开的方法。在一个实例中，与任何本文列出的GENBANK号具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%序列同一性的、保留催化酶底物转化为葡萄糖的能力的酶，可用于本文所公开的传感器。另外，可与所公开的传感器一起使用的这种酶可从商业来源例如Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得。

将所述酶或固体支持物与所述识别分子缀合

将可特异性结合所述靶因子（例如抗体、聚合物、蛋白质或核酸）的识别分子与所述酶或与所述固体支持物（例如缀合垫）缀合的方法是常规的。所使用的缀合方法可以是可将酶与其他分子共价或非共价地结合的任何化学作用。在某些实例中，简单地通过将所述识别分子-酶复合物悬浮在溶液中，将所述溶液施加到所述垫并使所述溶液干燥，而将识别分子-酶复合物附着到固体支持物例如横流装置的缀合垫。

在一个实例中，所述方法使用形成共价键的反应，所述共价键包括但不限于胺与异硫氰酸酯之间的共价键、胺与酯之间的共价键、胺与羧基之间的共价键、巯基与马来酰亚胺之间的共价键、巯基与巯基之间的共价键、叠氮化物与炔之间的共价键以及叠氮化物与腈之间的共价键。在另一个实例中，所述方法使用形成非共价相互作用的反应，包括但不限于抗体与抗原之间的非共价相互作用、适体与对应靶之间的非共价相互作用以及有机螯合剂与金属离子之间的非共价相互作用。

在一个具体实例中，转化酶——能够有效催化蔗糖水解反应的酶——通过马来酰亚胺-巯基或异硫氰酸酯-胺反应与DNA缀合；然后，所述DNA-转化酶缀合物通过与磁珠上功能性DNA的DNA杂交作用被固定到所述磁珠上。在具体分析物存在下，通过分析物诱导的DNAzyme催化反应或适体结构转换，所述DNA-转化酶缀合物可从所述磁珠上的功能性DNA双链体释放。所述释放的DNA-转化酶缀合物可有效地催化蔗糖转化为葡萄糖，随后可通过PGM定量葡萄糖并与所述样品中所述分析物的浓度建立关联。

靶因子

所公开的传感器可被设计用于检测任何目的靶因子。因此，本文提供的方法和装置可用于检测任何目的靶因子，例如本文提供的具体实例。如上所述，选择可检测所述靶因子的适当识别分子，使得技术人员可开发用于检测具体靶因子的传感器。下文提供了示例性的靶因子；但是本领域技术人员应该理解，使用所公开的方法用所公开的传感器和装置（例如本文提供的横流装置）也可以检测其他的靶因子。

金属

在一个实例中，所述靶因子是金属（例如具有高导电性的元素、化合物或合金），例如重金属或营养金属(nutritionalmetal)。金属占据周期表的大部分，同时非金属元素只见于元素周期表的右侧。从硼(B)到钋(Po)所画的对角线将金属与非金属分离。在这条线上的大多数元素是准金属，有时称为半导体。这条分割线左下的元素称为金属，同时这条分割线右上的元素称为非金属。

重金属包括具有相对高密度并且在低浓度时具有毒性、高毒性或有毒的任何金属化学元素。重金属的实例包括，例如汞(Hg)、镉(Cd)、砷(As)、铬(Cr)、铊(Tl)、铀(U)、钚(Pu)和铅(Pb)。

营养金属离子包括在动物营养中是重要的以及对具体生物功能必需的那些，包括钙、铁、钴、镁、锰、钼、锌、镉和铜。

病原体/微生物

使用本文提供的传感器和方法可以检测任何病原体或微生物。例如，可以检测具体的抗微生物抗原和核酸分子（例如DNA或RNA）以及细菌孢子。在某些实例中，检测了具体的微生物细胞或具体的病毒。在某些实例中，例如通过使用包含例如对靶蛋白特异的抗体或DNA适体的传感器来检测所述靶表面蛋白质（例如受体），而检测了完整微生物。在其他实例中，例如通过从样品（例如已知或怀疑含有所述微生物的样品）中获得核酸，然后将所产生的核酸（例如DNA或RNA或两者）与本文公开的传感器（其包含可与所述靶核酸杂交的互补核酸序列）接触，而检测了对靶微生物特异的保守DNA或RNA。

示例性的病原体包括但不限于病毒、细菌、真菌、线虫和原生动物。下文提供了可使用本文提供的传感器检测的病原体的非限制性列表。

例如，病毒包括正链RNA病毒和负链RNA病毒。示例性的正链RNA病毒包括但不限于：微小核糖核酸病毒（例如口蹄疫病毒科（Aphthoviridae）[例如口蹄疫病毒(FMDV)]）、心病毒科（Cardioviridae）;肠病毒科(Enteroviridae)(例如柯萨奇病毒(Coxsackieviruses)、艾柯病毒(Echoviruses)、肠道病毒和脊髓灰质炎病毒);鼻病毒科(Rhinoviridae)(鼻病毒);肝病毒科(Hepataviridae)(甲肝病毒);披膜病毒类(Togaviruses)(其实例包括风疹(rubella);甲病毒属(alphaviruses)(例如西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒和委内瑞拉马脑炎病毒));虫媒病毒(其实例包括登革热病毒、西尼罗河病毒和日本脑炎病毒);杯状病毒科（Calciviridae）(其包括诺如病毒(Norovirus)和札幌病毒(Sapovirus));以及冠状病毒(其实例包括SARS冠状病毒，例如乌尔巴尼株(Urbanistrain))。

示例性的负链RNA病毒包括但不限于：正粘液病毒（Orthomyxyoviruses）(例如流感病毒)、杆状病毒(Rhabdoviruses)(例如狂犬病病毒)以及副粘病毒(Paramyxoviruses)(其实例包括麻疹病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒)。

病毒还包括DNA病毒。DNA病毒包括但不限于：疱疹病毒(例如水痘-带状疱疹病毒，例如Oka株；细胞巨化病毒；单纯疱疹病毒(HSV)1型和2型)、腺病毒(例如腺病毒1型和腺病毒41型)、痘病毒(例如牛痘病毒)和细小病毒(例如细小病毒B19)。

另一组病毒包括逆转录病毒。逆转录病毒的实例包括但不限于：人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、例如C亚型；HIV-2；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；猫白血病病毒(FeLV)；猴免疫缺陷病毒(SIV)；和鸟类肉瘤病毒。

在一个实例中，所述传感器可以区分传染性与非传染性病毒。

病原体还包括细菌。细菌可被分类为革兰氏阴性或革兰氏阳性。示例性的革兰氏阴性细菌包括但不限于：大肠杆菌(Escherichiacoli)（例如K-12和O157:H7）、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)和霍乱弧菌(Vibriocholerae)。示例性的革兰氏阳性细菌包括但不限于：炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎球菌、淋球菌和链球菌性脑膜炎。

原生动物、线虫和真菌也是病原体类型。示例性的原生动物包括但不限于疟原虫属(Plasmodium)、利什曼原虫属(Leishmania)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、贾第鞭毛虫属(Giardia)、内阿米巴属(Entamoeba)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、等孢子球虫属(Isospora)、肠袋虫属(Balantidium)、毛滴虫属(Trichomonas)、锥虫属(Trypanosoma)、纳氏虫属(Naegleria)和弓形体属(Toxoplasma)。示例性的真菌包括但不限于粗球孢子菌(Coccidiodesimmitis)和皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)。

在一个实例中，检测了细菌孢子。例如，杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium)细菌可产生可检测的孢子。因此，肉毒梭菌(C.botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)和炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)的孢子也可以被检测（例如检测炭疽孢子）。应该认识到，使用本文提供的方法和装置还可以检测绿色植物的孢子。

蛋白质

本公开的传感器还允许检测多种蛋白质，例如细胞表面受体、细胞因子、抗体、激素以及毒素。在具体实例中，可特异性结合所述蛋白质靶的识别分子是蛋白质（例如抗体）或核酸（例如功能性核酸）。

在一个实例中，所述蛋白质是细胞因子。细胞因子是由免疫细胞分泌的对其他细胞有效应的小蛋白质。实例包括白介素(IL)和干扰素(IFN)和趋化因子，例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、IFN-β、转化生长因子(TGF-β)和肿瘤坏死因子(TNF)-α。

在一个实例中，所蛋白质是激素。激素是将信号从一个细胞传送到另一个细胞的化学信使。实例包括植物和动物激素，例如内分泌激素或外分泌激素。具体实例包括促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促甲状腺激素(TSH)、生长激素、黄体激素等。

在另一个实例中，所述蛋白质是毒素。毒素是有毒物质，由细胞或生物例如植物、动物、微生物（包括但不限于细菌、病毒、真菌、立克次氏体或原生动物）产生。具体实例包括肉毒杆菌毒素、蓖麻毒素、白喉毒素、志贺氏菌毒素、霍乱毒素和炭疽毒素。在另一个实例中，所述毒素是环境毒素。

在另一个实例中，蛋白质是在靶微生物或细胞例如细菌细胞、病毒、孢子或肿瘤细胞表面发现的蛋白质。这种蛋白质例如受体可能对所述微生物或细胞是特异的（例如HER2、IGF1R、EGFR或下文“核酸”中提到的其他肿瘤特异性受体）。在一个实例中，所述蛋白质是前列腺特异性抗原（PSA，例如GenBank登录号NP_001025218）。

核酸

本公开的传感器还允许检测核酸分子，例如DNA和RNA，例如对具体的目标病原体或细胞有特异性的DNA或RNA序列。例如，靶病原体可以具有对所述病原体特异的保守DNA或RNA序列（例如本领域已知的HIV、禽流感和猪流感的保守序列），并且靶细胞可以具有对所述细胞独特的特异性DNA或RNA序列，或提供区分靶细胞与另外的细胞的途径（例如区分肿瘤细胞与良性细胞）。

在某些实例中，选择与疾病或病况相关的靶序列，使得对所述靶核酸和本文提供的传感器之间杂交的检测可用于推断与所述疾病或病况相关的信息（例如对从其获得所述样品的受试者的诊断或预后信息）。

在具体非限制性实例中，选择与肿瘤（例如癌症）相关的靶核酸序列。已经在瘤细胞，尤其是癌细胞，例如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳癌、结肠癌、神经系统癌等中鉴定了大量染色体异常（包括易位和其他重新排列、重复(reduplication)（扩增）或缺失）。

示例性的靶核酸包括但不限于：位于染色体18q11.2的断裂点(breakpoint)区域的SYT基因（滑膜肉瘤软组织肿瘤中共有）；HER2，也称为c-erbB2或HER2/neu(代表性的人HER2基因组序列提供于GENBANK^TM登录号NC_000017，核苷酸35097919-35138441)(HER2在人乳癌、卵巢癌、胃癌和其他癌症中扩增)；p16(包括D9S1749、D9S1747、p16(INK4A)、p14(ARF)、D9S1748、p15(INK4B)和D9S1752)(在某些膀胱癌中缺失)；EGFR(7p12；例如GENBANK^TM登录号NC_000007，核苷酸55054219-55242525)，MET(7q31;例如GENBANK^TM登录号NC_000007，核苷酸116099695-116225676)，C-MYC(8q24.21；例如GENBANK^TM登录号NC_000008，核苷酸128817498-128822856)，IGF1R(15q26.3;例如GENBANK^TM登录号NC_000015，核苷酸97010284-97325282)，D5S271(5p15.2)，KRAS(12p12.1；例如GENBANK^TM登录号NC_000012，互补链(complement)，核苷酸25249447-25295121)，TYMS(18p11.32；例如GENBANK^TM登录号NC_000018，核苷酸647651-663492)，CDK4(12q14；例如GENBANK^TM登录号NC_000012，核苷酸58142003-58146164，互补链)，CCND1(11q13，GENBANK^TM登录号NC_000011，核苷酸69455873-69469242)，MYB(6q22-q23，GENBANK^TM登录号NC_000006，核苷酸135502453-135540311)，脂蛋白脂肪酶(LPL)(8p22；例如GENBANK^TM登录号NC_000008，核苷酸19840862-19869050)，RB1(13q14；例如GENBANK^TM登录号NC_000013，核苷酸47775884-47954027)，p53(17p13.1；例如GENBANK^TM登录号NC_000017，互补链，核苷酸7512445-7531642)，N-MYC(2p24；例如GENBANK^TM登录号NC_000002，互补链，核苷酸15998134-16004580)，CHOP(12q13；例如GENBANK^TM登录号NC_000012，互补链，核苷酸56196638-56200567)，FUS(16p11.2；例如GENBANK^TM登录号NC_000016，核苷酸31098954-31110601)，FKHR(13p14；例如GENBANK^TM登录号NC_000013，互补链，核苷酸40027817-40138734)，aALK(2p23；例如GENBANK^TM登录号NC_000002，互补链，核苷酸29269144-29997936)，Ig重链，CCND1(11q13；例如GENBANK^TM登录号NC_000011，核苷酸69165054-69178423)，BCL2(18q21.3；例如GENBANK^TM登录号NC_000018，互补链，核苷酸58941559-59137593)，BCL6(3q27；例如GENBANK^TM登录号NC_000003，互补链，核苷酸188921859-188946169)，AP1(1p32-p31；例如GENBANK^TM登录号NC_000001，互补链，核苷酸59019051-59022373)，TOP2A(17q21-q22；例如GENBANK^TM登录号NC_000017，互补链，核苷酸35798321-35827695)，TMPRSS(21q22.3；例如GENBANK^TM登录号NC_000021，互补链，核苷酸41758351-41801948)，ERG(21q22.3；例如GENBANK^TM登录号NC_000021，互补链，核苷酸38675671-38955488)；ETV1(7p21.3；例如GENBANK^TM登录号NC_000007，互补链，核苷酸13897379-13995289)，EWS(22q12.2；例如GENBANK^TM登录号NC_000022，核苷酸27994017-28026515)；FLI1(11q24.1-q24.3；例如GENBANK^TM登录号NC_000011，核苷酸128069199-128187521)，PAX3(2q35-q37；例如GENBANK^TM登录号NC_000002，互补链，核苷酸222772851-222871944)，PAX7(1p36.2-p36.12；例如GENBANK^TM登录号NC_000001，核苷酸18830087-18935219)，PTEN(10q23.3；例如GENBANK^TM登录号NC_000010，核苷酸89613175-89718512)，AKT2(19q13.1-q13.2；例如GENBANK^TM登录号NC_000019，互补链，核苷酸45428064-45483105)，MYCL1(1p34.2；例如GENBANK^TM登录号NC_000001，互补链，核苷酸40133685-40140274)，REL(2p13-p12；例如GENBANK^TM登录号NC_000002，核苷酸60962256-61003682)以及CSF1R(5q33-q35；例如GENBANK^TM登录号NC_000005，互补链，核苷酸149413051-149473128)。

在所述靶分子是核酸分子的实例中，要测试的样品可以用可使所述细胞或病原体破裂的试剂来处理。所述核酸分子可被提取或分离，然后被暴露于本文公开的传感器，例如含有与转化酶（或表2中列出的其他酶）缀合的互补DNA的传感器。也就是说，所述传感器包括DNA分子作为识别分子，所述DNA分子具有与所述靶DNA或RNA序列互补的序列，使得所述互补核酸序列可以与所述靶核酸杂交，从而可检测所述靶核酸。

消遣性药物和其他药物

本公开的传感器还允许检测多种药物，例如药用药物或消遣性药物。例如，使用本公开的传感器和装置可以检测咖啡因、可卡因、鸦片剂和类罂粟碱（例如羟考酮）、大麻（例如通过检测四氢大麻醇(THC)）、海洛因、甲基苯丙胺、强效纯可卡因(crack)、乙醇或烟草（例如通过检测尼古丁）的存在情况。在具体实例中，可特异性结合所述药物靶的识别分子是核酸（例如功能性核酸）。

细胞

本公开的传感器还允许检测多种细胞，例如肿瘤细胞或癌细胞以及其他疾病细胞。在一个实例中，所述传感器可以区分相同细胞类型的肿瘤细胞和正常细胞，例如区分正常乳房细胞和乳房癌细胞。肿瘤是异常生长，其可以是恶性的或良性的、实体的或流动的（例如血原性的）。在某些实例中，通过使用传感器检测细胞，所述传感器包括对表面蛋白（例如所述细胞表面的受体）特性的识别分子。在其他实例中，通过使用传感器来检测细胞，所述传感器包括对肿瘤细胞中发现的核酸有特异性的识别分子。

血液肿瘤的实例包括但不限于：白血病，其包括急性白血病（例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性粒细胞性白血病和成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病）、慢性白血病（例如慢性髓细胞（粒细胞）白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病）、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病（Hodgkin'sdisease）、非霍奇金淋巴瘤（包括低、中和高级）、多骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、外套细胞淋巴瘤和脊髓发育不良。

实体瘤例如肉瘤和癌(carcinomas)的实例包括但不限于：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌症、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、Wilms'瘤、宫颈癌、睾丸瘤、膀胱癌和中枢神经系统肿瘤（例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅神经胶质瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜神经胶质瘤(menangioma)、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤）。

因此，在某些实例中，本文提供的传感器和装置可使用本公开的方法检测这些肿瘤细胞。

试剂盒

本公开还提供了包括一个或多个本文公开的传感器（例如为横流装置一部分的传感器）的试剂盒。例如，试剂盒可以包括可检测至少2种不同靶因子的至少2个不同传感器，例如至少3个、至少4个、至少5个或至少10个不同的传感器。在一个具体实例中，试剂盒可以包括可检测至少2种不同靶因子的至少2个不同的横流装置，例如至少3个、至少4个、至少5个或至少10个不同的横流装置。

所述试剂盒可以包括传感器或横流装置以及运载工具，例如盒、袋、包、塑料箱（例如模塑的塑料或其他透明包装）、包装材料（例如密封的或可密封的塑料、纸或金属包装）或其他容器。在某些实例中，试剂盒组分将被封闭在单独的包装单元中，例如盒或其他容器，所述包装单元可以具有可放置所述试剂盒的一种或多种组分的隔间。在其他实例中，试剂盒包括一个或多个容器，例如管形瓶、管等，其可以保存例如一种或多种要测试的生物样品、阳性和/或阴性对照样品或溶液（例如含有所述靶因子的阳性对照样品）、稀释剂（例如磷酸盐缓冲液或盐水缓冲液）、PGM和/或洗涤溶液（例如Tris缓冲液、盐水缓冲液或蒸馏水）。

这样的试剂盒还可以包括其他组分，例如缓冲液、用于将检测的葡萄糖水平与存在的靶因子量建立关联的图表、可被所述酶转化为葡萄糖的物质或其组合。例如，所述试剂盒可以包括含有一个或多个本文公开的传感器的管形瓶以及含有可被所述酶转化为葡萄糖的物质的单独的管形瓶。可被所述酶转化为葡萄糖的示例性物质包括但不限于蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维素和淀粉。在一个实例中，所述试剂盒包括这些糖的非天然前体，例如O-甲基葡萄糖。例如，O-甲基葡萄糖可以存在于葡萄糖计，在所述酶反应后，O-甲基葡萄糖被转化为葡萄糖，并可以被葡萄糖计检测。

其他试剂盒实施方案包括注射器、手指刺破装置、酒精拭子、方形纱布、棉球、绷带、乳胶手套、带有可变数量的槽的孵育托盘、粘合板封闭器、数据报告表，其可用于加工、收集和/或处理生物样品。试剂盒还可以可选地含有用于将样品引入到横流装置的器具，包括例如滴管、移液管、毛细管、橡皮球（例如用于毛细管）等。另一些试剂盒实施方案可以包括处理工具，其用于丢弃用过的装置和/或与所述装置一起使用的其他物品（例如患者样品等）。这些处理工具可以非限制地包括，能够容纳来自被丢弃材料（例如塑料、金属）的泄漏物的容器，或者其他不渗透的包、盒或容器。

在某些实例中，试剂盒包括传感器或横流装置的使用说明书。所述说明书可以提供关于怎样将样品施加到所述传感器或装置、等待结果显影所必需或适当的时间量的指导，以及关于怎样读取和理解测试结果的详细资料。这些说明书还可以包括标准，例如用于比较测试结果的标准表、曲线图或图像。这些标准可以可选地包括使用所述传感器或装置定量靶分析物所必需的信息，例如将检测到的葡萄糖的量与因而存在于所述样品中的靶分析物的量建立关联的标准曲线。

使用所述传感器检测靶因子的方法

本文提供了使用本文公开的传感器和装置检测靶因子的方法。在一个实例中，所述方法包括将一个或多个传感器与样品在足以使可能存在于所述样品中的靶因子结合所述识别分子（其被固定到所述固体支持物例如横流装置）的条件下接触。包括横流装置的本公开的传感器，可用于检测靶因子的方法中，目的是例如诊断疾病或感染，或检测对具体金属或药物的暴露。

在某些实例中，这种结合可以使所述酶（例如所述酶分析物类似物缀合物）从所述固体支持物释放（例如由于所述靶因子和酶分析物类似物缀合物之间的竞争性结合）。所述固体支持物从所述释放的酶分离或被除去。然后，所述释放的酶与可以被所述酶转化为葡萄糖的物质接触，从而生成葡萄糖。然后，例如使用PGM检测所产生的葡萄糖，其中检测到葡萄糖指示所述样品中存在所述靶因子，没有检测到葡萄糖指示所述样品中不存在所述靶因子。

在其他实例中，所述靶因子结合所述识别分子后，在足以使所述酶结合已与所述识别分子结合的靶因子的条件下孵育所述酶（例如酶分析物类似物缀合物）。这导致形成了“夹心”型结构，其中所述识别分子结合所述固体支持物和所述靶因子，所述酶（直接或间接地，例如经酶分析物类似物缀合物）结合所述靶因子（在某些实例中还有所述识别分子）。在该实例中，所述固体支持物不需从所述酶分离或除去。然后，所述结合的酶与可以被所述酶转化为葡萄糖的物质接触，从而生成葡萄糖。然后，例如使用PGM检测所产生的葡萄糖，其中检测到葡萄糖指示所述样品中存在所述靶因子，没有检测到葡萄糖指示所述样品中不存在所述靶因子。

在某些实例中，例如当所述传感器是横流装置的一部分时，所述方法可以包括，使所述横流装置与样品，在足以使所述样品中靶因子流过所述横流装置并结合存在于所述横流装置上的识别分子的条件下接触。所述识别分子可附着到可将物质转化为葡萄糖的酶（例如转化酶或表2中的其他酶）。因此，所述靶因子可结合所述识别分子-酶复合物，从而形成靶因子-识别分子复合物，其中所述靶因子-识别分子复合物的形成导致了可将所述物质转化为葡萄糖的酶的释放。然后，使所述酶与可以被所述酶转化为葡萄糖的物质（例如蔗糖或表2列出的其他酶底物）相互作用，从而生成葡萄糖。检测所产生的葡萄糖，其中检测到葡萄糖指示所述样品中存在所述靶因子，没有检测到葡萄糖指示所述样品中不存在所述靶因子。

所述方法还可以包括定量所述靶因子，其中检测到的葡萄糖水平指示存在的靶因子的量。

在某些实例中，所述酶包括转化酶、蔗糖酶或蔗糖酶-异麦芽糖酶并且可被所述酶转化为葡萄糖的物质包括蔗糖，或者所述酶包括麦芽糖酶并且可被所述酶转化为葡萄糖的物质包括麦芽糖，或者所述酶包括海藻糖酶并且可被所述酶转化为葡萄糖的物质包括海藻糖，或者所述酶包括纤维素酶并且可被所述酶转化为葡萄糖的物质包括纤维素，或者所述酶包括淀粉酶并且并且可被所述酶转化为葡萄糖的物质包括淀粉。

样品

可以使用可能含有（或已知含有或怀疑含有）靶因子的任何生物或环境样本。生物样品通常从受试者获得，可以包括基因组DNA、RNA（包括mRNA）、蛋白质或其组合。实例包括组织或肿瘤活组织检查、细针吸出物、支气管肺泡灌洗、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、手术样本、淋巴结流体、腹水流体、外周血（例如血清或血浆）、尿、唾液、口腔拭子和尸检材料。采集这些样品的技术是本领域已知的（例如对于采集血清样品参见Schlugeretal.J.Exp.Med.176:1327-33,1992）。血清或其他血液级分可以以常规方式制备。样品还可以包括发酵流体和组织培养流体。

环境样品包括从环境介质中获得的那些，例如水、气、土、尘、木、植物或食物。

在其他实例中，样品包括对照样品，例如已知含有或不含有具体量的所述靶因子的样品。

在一个实例中，所述样品是食物样品，例如肉、水果或蔬菜样品。例如，使用本文提供的方法，可以检测食品中的掺杂物，例如病原体或毒素或其他有害产物。

一旦获得样品，所述样品就可被直接使用、浓缩（例如通过离心或过滤）、纯化、液化、在流体中稀释或其组合。在某些实例中，从所述样品中提取蛋白质或核酸或病原体，并使用本文提供的方法分析所产生的制品（例如包括分离的DNA和/或RNA的制品）。

实施例1

材料和方法

链亲和素包被的磁珠、PD-10尺寸排阻柱和Amicon-100K离心过滤器分别购自BangsLaboratoriesInc.(Fishers,IN)、GEHealthcareLifeScienceLtd.(Piscataway，NJ)和MilliporeInc.(Billerica,MA)。来自VII级面包酵母(S.cerevisiae)的转化酶、人重组干扰素-γ(IFN-γ)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)、1,4-亚苯基二异硫代氰酸酯(PDITC)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和其他用于缓冲液的化学品以及溶剂，购自Sigma-AldrichInc.(St.Louis,MO)。如下的寡核苷酸购自IntegratedDNATechnologiesInc.(Coralville,IA)：

生物素修饰的DNA（生物素-DNA)：

TCACAGATGAGTAAAAAAAAAAAA-生物素′(SEQIDNO:1)

巯基修饰的DNA（巯基-DNA)：

HS-AAAAAAAAAAAAGTCTCCCGAGAT-FAM′(SEQIDNO:2)

胺修饰的DNA（胺-DNA）

H₂N-AAAAAAAAAAAACCCAGGTTCTCT-FAM′(SEQIDNO:3)

可卡因适体(Coc-Apt)：

TTTTTTACTCATCTGTGAATCTCGGGAGACAAGGATA AATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC(SEQIDNO:4)

可卡因适体对照（除去下划线部分的Coc-Apt)：

TTTTTTACTCATCTGTGAATCTCGGGAGAC(SEQIDNO:5)

腺苷适体(Ade-Apt)：

TTTTTTACTCATCTGTGAAGAGAACCTGGGGGAGTA TTGCGGAGGAAGGT(SEQIDNO:6)

腺苷适体对照（除去下划线部分的Ade-Apt)：

TTTTTTACTCATCTGTGAAGAGAACCTGGG(SEQIDNO:7)

针对IFN-γ的生物素修饰的DNA（针对IFN-γ的生物素-DNA)：

生物素-AAAAAAAAAAAATCACAGATGAGTAGT(SEQIDNO:8)

针对IFN-γ的巯基修饰的DNA：

5′-HS-AAAAAAAAAAAAACAACCAACCCCA-FAM(SEQIDNO:9)

IFN-γ适体(IFN-γApt)：

TGGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTAAAAAAAAAAAAAACTACTCATCTGTGA(SEQIDNO:10)

UO₂ ²⁺-依赖的DNAzyme(39E)：

CACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT(SEQIDNO:11)

UO₂ ²⁺-依赖的DNAzyme的底物(39S)：

ACTCATCTGTGAACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTGATCTCGGGAGAC(SEQIDNO:12)（rA是指所述核苷酸是RNA核苷酸，而其他核苷酸是DNA核苷酸）

使用的缓冲液：

缓冲液A：0.1M磷酸钠(PBS)缓冲液，pH7.3，0.1MNaCl

缓冲液B：0.1M硼酸钠缓冲液，pH9.2

缓冲液C：0.01M4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH7.4，0.1MKCl，0.001MMgCl₂，0.05%Tween-20

缓冲液D：0.05M2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液，pH5.5，0.2MNaCl

DNA-转化酶缀合物的合成（图2）⁵⁶

(1)使用异型双官能接头磺基-SMCC进行缀合

向30μL含有1mM巯基-DNA的Millipore水中，加入2μLpH为5.5的1MPBS缓冲液和2μL含有30mMTCEP的Millipore水，并混合。将所述混合物保持在室温1小时，然后通过PD-10柱使用缓冲液A纯化。该步骤是用于还原二硫键并恢复巯基-DNA的活性巯基基团（如从商业来源获得的被二硫键保护）。

对于转化酶缀合，将400μL含有20mg/mL转化酶的缓冲液A与1mg磺基-SMCC混合。振荡5分钟后，将所述溶液室温下放置在摇床上1小时。将所述混合物离心并除去不溶的过量磺基-SMCC。然后，使用缓冲液A通过PD-10柱纯化所述澄清溶液。将磺基-SMCC-活化的转化酶的纯化溶液与如上所述的巯基-修饰的DNA的溶液混合。将所述溶液混合物的体积在真空中减少至1/5。所产生的溶液在室温保持48小时。为了除去未反应的游离巯基-DNA，将所述溶液使用缓冲液A通过Amicon-100K纯化7次。

(2)使用同型双官能接头PDITC进行缀合

向60μL含有1mM胺-DNA的Millipore水中，加入30μL缓冲液B并混合。再将该溶液与溶解在1mLDMF中的20mgPDITC混合。将所产生的溶液放置在摇床上并于室温在黑暗中保持2小时。此后，将所述溶液与6mLMillipore水和6mL1-丁醇混合。离心15min，丢弃上层有机相。然后，将水相用4mL1-丁醇萃取3次，然后使用缓冲液A通过PD-10柱纯化以提供PDITC-活化的胺-DNA溶液。根据脱盐后的MALTI-TOF质谱，PDITC活化的DNA的收率超过90%。将一份10mg转化酶加入到缓冲液A中的活化DNA溶液中，将所述溶液的体积在真空中减少至1/5。将所产生的溶液分别在40℃保持5小时，在室温保持24小时。为了除去未反应的PDITC活化的胺-DNA，将所述溶液使用缓冲液A通过Amicon-100K纯化7次。

图6示出了上述缀合产物的PAGE图像。将所述DNA用FAM（荧光素）修饰，使得所述DNA和DNA-转化酶缀合物可以通过荧光成像。在另外凝胶中，将转化酶和DNA-转化酶缀合物通过考马斯亮蓝染色。DNA-转化酶缀合物呈现为迁移很慢的宽荧光带（因为缀合到每个蛋白的DNA数量可以变化），而游离的转化酶在该荧光图像中是不可见的。但是，在所述蛋白染色图像中，在DNA-转化酶缀合物和游离转化酶之间几乎观察不到差异，除了所述缀合物有很弱的拖尾（图6中几乎不可见）。这可以归因于转化酶的分子量(135-270kDa)对于在PAGE中迁移来说太大，即使所述蛋白与DNA(7kDa)缀合。

使用市售个人葡萄糖计制备用于检测的传感器

分别使用如上所述合成的巯基-DNA缀合的转化酶和胺-DNA缀合的转化酶在缓冲液A中制备可卡因和腺苷的传感器；同时对于干扰素-γ(IFN-γ)和UO₂ ²⁺的传感器，使用了巯基-DNA缀合的转化酶。对于IFN-γ传感器，使用Amicon-100K将所述巯基-DNA缀合的转化酶相对于缓冲液C缓冲液置换2次。对于UO₂ ²⁺传感器，为避免UO₂ ²⁺和磷酸阴离子之间的强相互作用，用Amicon-100K将所述巯基-DNA缀合的转化酶相对于缓冲液D缓冲液置换3次。

将一份1mL链亲和素包被磁珠（MB）的溶液靠近磁性架放置1分钟。将澄清溶液丢弃并用1mL缓冲液A、C或D代替（缓冲液A、C和D分别被用于可卡因/腺苷适体传感器、IFN-γ适体传感器和UO₂ ²⁺DNAzyme传感器）。该缓冲液更换步骤重复2次。然后，将12μL含有0.5mM生物素-DNA的Millipore水加入到所述MB溶液并在室温充分混合0.5小时。此后，使用缓冲液洗涤所述MB两次以除去过量的生物素-DNA。之后，将12μL含有0.5mM功能性DNA（Coc-Apt、Ade-Apt或等量39S和39E的混合物）的Millipore水加入到所述MB溶液并在室温充分混合0.5小时。在使用缓冲液洗涤3次以移除过量DNA后，将缀合的DNA-转化酶（使用Amicon-100K浓缩至20μL）加入到所述溶液并在室温充分混合0.5小时。将过量的DNA-转化酶缀合物可通过缓冲液洗涤3次而洗去，并且其可通过使用Amicon-100K浓缩所述洗涤溶液而被再利用。然后，将所述固定有DNA-转化酶缀合物的MB分散在1mL缓冲液A或C中，在除去缓冲液后，所述溶液每40μL中含有的MB可用于检测一个样品。使用相同质量比的材料可以容易地将所述制品按比例扩大。为检测20%人血清样品（使用缓冲液稀释的血清），将所述MB在使用前用20%人血清洗涤2次。

使用市售个人葡萄糖计检测可卡因、腺苷和UO₂ ²⁺的步骤

对于使用适体传感器的检测，将含有适当量分析物的40μL缓冲液A（对于可卡因和腺苷传感器）或C（对于IFN-γ传感器）加入到如上制备的固定有DNA-转化酶缀合物的MB，并充分混合25分钟。此后，使用磁性架分离所述溶液，将20μL上清液转移到20μL的缓冲液A中的1M蔗糖中。在室温静置30分钟（对于可卡因和腺苷传感器）或2小时（对于IFN-γ传感器）后，使用市售个人葡萄糖计测量5μL的所述溶液。对于20%人血清中可卡因的检测，所述反应时间从30分钟增加到1小时。对于20%人血清中IFN-γ的检测，所述时间保持为2小时。

对于UO₂ ²⁺检测，将含有适当量UO₂ ²⁺的40μL缓冲液D加入到如上制备的固定有DNA-转化酶缀合物的MB，并充分混合30分钟。此后，使用磁性架分离所述溶液。将约0.1μL的3MNaOH加入到20μL上清液中以调节pH到7（这是重要的，因为葡萄糖计只能检测pH接近7的溶液）。然后，将所述转移的上清液与20μL的含有1M蔗糖和2mMEDTA的缓冲液A混合。在室温静置1.5小时后，使用市售个人葡萄糖计测量5μL的所述溶液。

溶液中实际葡萄糖浓度和PGM检测信号之间的关联

PGM中读出的葡萄糖浓度可能不是所述溶液中的实际葡萄糖浓度。为解决此问题，通过使用PGM测量缓冲液A中带有不同量葡萄糖的样品进行了对照实验。PGM中获得的信号与所述缓冲液中的实际葡萄糖浓度很好地相关，显示出线性响应，在20-480mg/dL的范围比实际值高约32%（图7）。

实施例2

转化酶与ssDNA的缀合

该实施例描述了将转化酶缀合到单链(ss)DNA的方法。本领域技术人员应该理解，其他可催化物质转化为葡萄糖的酶，例如可将纤维素转化为葡萄糖的纤维素酶，可被用于代替转化酶。

转化酶（来自面包酵母），也称为β-呋喃果糖苷酶，是可催化蔗糖水解的酶⁵⁰。其可被用于信号放大，因为纳摩尔水平的该酶能够在室温在合理时间长度内有效地将高达毫摩尔水平的蔗糖转化为果糖和葡萄糖，并且不需要基于实验室的装置。另外，使用广泛可得的个人葡萄糖计(PGM)可以检测仅所产生的果糖和葡萄糖，而蔗糖在PGM中是完全“沉默的”，由于其非还原特性而不产生任何信号或干扰。因此，转化酶可被用于传感器设计中的信号放大，所述传感器可在PGM中显示“接通”响应（例如对靶因子存在的响应）。

为控制功能性DNA与其靶之间相互作用造成的转化酶释放，将所述酶与DNA缀合。虽然转化酶已被广泛地用作工业酶并通过化学固定在固体支持物而被开发为可重复使用的催化剂，但是很少有关于将该酶与其他功能性分子例如DNA缀合的报道^51-53。因为转化酶的活化位点由天冬氨酸和谷氨酸组成^54,55，所以选择转化酶的反应性胺基基团作为缀合的反应位点，以保留所述酶在反应后的催化活性。使用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)和1,4-亚苯基二异硫代氰酸酯(PDITC)分别将巯基修饰的DNA和胺修饰的DNA与转化酶在温和条件下缀合⁵⁶。

如图8A和8B所示，在所述异型双官能接头(磺基-SMCC)方法中，转化酶被磺基-SMCC通过胺和NHS酯之间的反应活化，然后共价地与巯基修饰的DNA通过巯基-马来酰亚胺反应而缀合；而在所述同型双官能接头方法中，胺修饰的DNA被PDITC活化，然后与转化酶的反应性胺基基团反应。根据PAGE（见图6），在存在过量DNA时，两种方法都得到了足够量的DNA-转化酶缀合物。没有计算准确收率，因为在所述缀合反应中很难控制与每个蛋白缀合的DNA数量。在除去未缀合的游离DNA后，所产生的含有DNA-转化酶缀合物和游离转化酶的产物可被直接用于传感器制备，在此过程中所述游离转化酶会被洗掉，对所述传感器的性能没有影响。

实施例3

将功能性DNA和DNA-转化酶缀合物固定到磁珠

该实施例描述了将实施例2生成的转化酶-ssDNA分子固定到磁珠的方法。本领域技术人员应该理解，其他支持物可被用于代替所述磁珠，例如膜、玻璃基质或其他类型的珠，例如金珠；固定到这些表面的方法是本领域已知的。

磁珠(MB)已被广泛用于许多生物学应用，例如分离、预浓缩和测定^57,58。这种珠容易使用并可以使用磁性架从样品中将其除去，不需要离心、沉淀或过滤程序。对于无需基于实验室的装置而可以现场和家庭使用的传感器来说，可以使用MB。

采用了链亲和素包被的MB，因为其对于生物素修饰的DNA的固定是高效的^59,60。链亲和素和生物素之间的结合强度高达K_d=10^-15M^-1，使得被固定的DNA可以在用于传感应用的温和条件中留存并使非特异性释放最少。

图5和图9A-9D示出了，功能性DNA和DNA-转化酶缀合物通过DNA杂交固定到链亲和素包被的MB。首先，生物素修饰的单链DNA（生物素-DNA）通过链亲和素-生物素相互作用被固定。然后，该生物素-DNA可以将适体或所述DNAzyme-底物双链体捕获到所述表面。最终，DNA-转化酶缀合物与MB上的功能性DNA杂交。

一旦加入具体的靶，由于功能性DNA与其靶之间的相互作用，所述DNA-转化酶缀合物被释放。在除去MB后，溶液中所释放的DNA-转化酶缀合物有效地将随后加入的蔗糖转化为果糖和葡萄糖，将所述信号扩大到可用PGM检测的水平。所述生物素-DNA的存在改进了所述传感器设计，因为已经观察到，图9A-9D中所示传感器的性能比使用生物素修饰的功能性DNA而没有所述接头生物素-DNA用于固定的传感器好得多。由所述杂交的生物素-DNA提供的空间可能有助于功能性DNA“站立”并更好地在MB上保留其活性。

实施例4

由个人葡萄糖计(PGM)监测的功能性DNA传感器的性能

该实施例描述了用实施例3描述的传感器来检测多种靶因子的方法。本领域技术人员应该理解，可以使用相似方法用其他传感器检测其他靶因子。

如图5所示，由功能性DNA引起的分析物诱导的DNA-转化酶缀合物的释放是用于开发可以使用PGM定量检测特异性靶的适体和DNAzyme传感器两者的通用平台。此处，我们将该技术分别应用于可卡因适体^13,32,43、腺苷适体^13,38,46,61、干扰素-γ(IFN-γ)适体^62-64和UO₂ ²⁺-依赖的DNAzyme^49,65,66，以检测对应的分析物。

(1)基于可卡因适体的传感器

将通过链亲和素-生物素相互作用固定到MB的生物素-DNA与通过马来酰亚胺-巯基反应获得的DNA-转化酶缀合物通过所述可卡因DNA适体连接，所述DNA适体在每个末端分别延伸18和12个核苷酸用于有效杂交（图9A）。所述设计在存在可卡因下允许所述适体的靶特异性结构转换^37,38，并导致用于信号放大的DNA-转化酶缀合物的释放（图9A）。根据从PGM获得的结果，在加入1mM可卡因并随后除去MB后，所述溶液通过所释放的DNA-转化酶缀合物从加入的蔗糖产生了比不存在可卡因下7倍的葡萄糖（图10A）。这种增强的催化活性是由于所述分析物诱导的DNA-转化酶缀合物的释放。事实上，由PGM检测的葡萄糖最终浓度依赖于所述样品中可卡因的浓度，存在越多可卡因就有越高水平的葡萄糖产生，直到达到平台。可卡因浓度和PGM显示的信号之间的关系在图10A示出。从所述滴定曲线的数据基于3σ_b/斜率（σ_b，空白样品的标准差）得到低达5.3μM可卡因的检测限，显示出所述传感器的高灵敏度。相比之下，其他化合物例如腺苷和尿苷即使在毫摩尔范围也不能诱导葡萄糖产生的增强，指示可卡因适体的高选择性被保留在所述传感器设计中。

为确认所述可卡因适体在所述传感器性能中的作用，进行了使用适体-截短DNA而不是没有平截的可卡因适体作为接头的对照实验，显示即使存在1mM可卡因下也未增强葡萄糖产生，而在正常可卡因适体的情况中观察到7倍的增强（图11）。另外，为测试复合样品基质的免疫性，所述传感器还被应用于检测20%人血清中的可卡因。如图12所示，由PGM检测的葡萄糖浓度与所述血清样品中可卡因浓度对应良好。得到10μM的检测限。

注意到，所述整个定量测定可以在1.5小时内完成并且仅需要广泛可得的PGM，不需要任何其他仪器。因此，所述传感器适合于现场和家庭的定量应用。

(2)基于腺苷适体的传感器

与如上基于可卡因适体的传感器的设计相似，使用腺苷适体作为所述固定的生物素-DNA和DNA-转化酶缀合物之间的接头，用于设计腺苷传感器（图9B）。不像所述可卡因传感器，此处所述DNA-转化酶缀合物，通过胺反应性的同型双官能接头PDITC与转化酶和DNA两者上的反应性胺基团反应而合成。不同缀合方法的使用证明了其他缀合方法在所述传感器设计中的兼容性。

在存在1mM腺苷下，除去MB后产生的溶液通过PGM测量显示出将蔗糖转化为葡萄糖的酶活性有3倍增强（图10B），类似地通过适体的结构转换机制^37,38将DNA-转化酶缀合物从MB释放到溶液（图9B）。使用含有增加量腺苷(0-1mM)的样品的滴定曲线显示，由PGM检测的葡萄糖浓度相应地增长（图10B）。通过3σb/斜率的定义，所述传感器的检测限估计为20μM腺苷。该传感器对腺苷的选择性非常高，因为其他核苷酸例如尿苷和胞苷对葡萄糖的产生没有显示出任何影响。由于在制备储存溶液时的溶解性问题没有对鸟苷进行研究。腺苷适体的存在被发现对所述传感器的性能有着重要作用，因为如果除去所述适体的下划线部分，则在PGM中没有观察到高于空白的响应（图11）。

与所述可卡因传感器相似，该传感器可以通过仅使用PGM在1小时内定量检测溶液中的腺苷浓度。因此，其可作为现场和家庭分析的有效传感器。

(3)基于干扰素-γ(IFN-γ)适体的传感器

除有机小分子例如腺苷和可卡因外，大蛋白分子IFN-γ作为本文描述的基于适体的传感器设计的靶而被研究。其设计与如上所述的基于适体的传感器相似，但是在所述生物素-DNA和所述适体的IFN-γ结合部分之间带有额外的A₁₂接头，以使生物素-DNA对大IFN-γ分子与所述适体之间的结合的干扰最小（图9C）。在缓冲液溶液中，所述传感器还显示，在存在增加量的IFN-γ下，由所释放的DNA-转化酶缀合物产生的葡萄糖增加（图13A）。在存在200nMIFN-γ下，观察到PGM中信号增强至空白的约3倍。可以检测低达2.8nMIFN-γ。该灵敏度与所述适体的结合亲和力相似^62-64，表明所述设计充分地保留了所述适体的活性。

相比之下，所述适体的非-靶蛋白HSA显示出可以忽略的通过PGM检测的葡萄糖浓度。进一步地，还研究了通过所述传感器对20%人血清中的IFN-γ的检测，以显示所述传感器在带有大量血清蛋白的复合样品基质中的性能（图13B）。与在缓冲液中相比，在20%血清中PGM信号达到平稳状态时的IFN-γ浓度更低。这可能是由于，一旦IFN-γ结合，DNA-转化酶缀合物更容易释放，因为在稀释的血清溶液中所述DNA杂交可能更弱。然而，检测限是相似的，根据3σ_b/斜率的定义，为3.2nM。

由于IFN-γ在人免疫和相关疾病例如结核病的诊断中的重要作用，该工作中仅使用PGM而没有任何其他仪器的传感器设计，可被应用于作为疾病标志的IFN-γ的即时或家庭定量。

(4)基于UO₂ ²⁺依赖的DNAzyme的传感器

与上述基于适体的传感器设计不同，对于基于DNAzyme的传感器，为确保DNA-转化酶缀合物从MB有效释放，将所述固定在MB的生物素-DNA与所述DNA-转化酶缀合物分别通过UO₂ ²⁺依赖的DNAzyme(39E)底物(39S)通过12碱基对的杂交而连接（图9D）。进一步加入39E以与39S杂交不能导致39S切割以及随后的DNA-转化酶缀合物释放，除非存在UO₂ ^2+49,65,66。如同所预期的，一旦加入最的UO₂ ²⁺至1μM，磁性除去MB后所产生的溶液催化葡萄糖产生的活性是没有UO₂ ²⁺的空白的近2倍。随着所述样品中UO₂ ²⁺(0-1μM)的量增加，相应地通过PGM检测到更多的葡萄糖（图14A）。基于3σ_b/斜率的定义获得的检测限为9.8nMUO₂ ²⁺。

此处，所述UO₂ ²⁺（2小时）传感器比所述基于适体的传感器（1小时内）需要相对更长的响应时间，可能因为所述DNA-转化酶缀合物释放更低效。这可能是由于UO₂ ²⁺与链亲和素的结合或者是由于MB上固定的DNAzyme活性降低的结果。然而，所述传感器仍然展示出超过其他相关金属离子的对UO₂ ²⁺的优异选择性（图14B），表明所述原始DNAzyme39E的特异性被保留在所述传感器设计中。这些结果揭示，除适体外，所述设计还可以应用于基于DNAzyme的传感器，并且对于潜在的现场和家庭应用中仅使用PGM实现对金属离子的便携、低成本和定量检测。

实施例5

通过个人葡萄糖计检测DNA

如图4B中概括所示，该实施例描述了包括功能性DNA以检测靶乙肝病毒DNA的传感器的产生和测试。本领域技术人员应该理解，可以使用相似方法来产生其他基于功能性DNA的传感器以检测其他靶核酸。

链亲和素包被的磁珠（MB，直径1μm）和Amicon离心过滤器分别购自BangsLaboratoriesInc.(Fishers,IN)和MilliporeInc.(Billerica,MA)。来自面包酵母(S.cerevisiae)的VII级转化酶、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、牛血清白蛋白（BSA）和其他用于缓冲液的化学品以及溶剂，购自Sigma-Aldrich,Inc.(St.Louis,MO)。如下的寡核苷酸从IntegratedDNATechnologiesInc.(Coralville,IA)获得：

生物素-DNA：5-TCACAGATGAGTAAAAAAAAAAAA-生物素-3(SEQIDNO:1)

巯基-DNA：5-HS-AAAAAAAAAAAAGTCTCCCGAGAT-3(SEQIDNO:2)

靶DNA：

5′-ACTCATCTGTGAATCTCGGGAGACTTTTTT-3′(SEQIDNO:13)

靶DNAG错配：

ACTCATGTGTGAATCTCGGGAGACTTTTTT(SEQIDNO:14)

靶DNAA错配：

ACTCATATGTGAATCTCGGGAGACTTTTTT(SEQIDNO:15)

靶DNAT错配：

ACTCATTTGTGAATCTCGGGAGACTTTTTT(SEQIDNO:16)

靶DNA2错配：

ACTCAAGTGTGAATCTCGGGAGACTTTTTT(SEQIDNO:17)

针对乙肝病毒(HBV)的生物素-DNA：

生物素-AAAAAAAAAAAAACCTTTAACCTAA(SEQIDNO:18)

针对HBV的巯基-DNA：

TCCTCCCCCAACTCCTCCCAAAAAAAAAAAAA-SH(SEQIDNO:18)

针对HBV的靶DNA：

TGGGAGGAGTGGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGT(SEQIDNO:19)

针对HBV的靶DNAA错配：

TGGGAGGAGTGGGGGGAGGAGATTAGGTAAAAGGT(SEQIDNO:20)

针对HBV的靶DNAG错配：

TGGGAGGAGTGGGGGGAGGAGATTAGGTGAAAGGT′(SEQIDNO:21)

针对HBV的靶DNAC错配：

TGGGAGGAGTGGGGGGAGGAGATTAGGTCAAAGGT(SEQIDNO:22)

使用的缓冲液：

缓冲液A：0.1MNaCl，0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.3，0.05%Tween-20

缓冲液B：0.25MNaCl，0.15M磷酸钠缓冲液，pH7.3，0.05%Tween-20

DNA-转化酶缀合物

向30μL含有1mM巯基-DNA或针对HBV的巯基-DNA的Millipore水中，加入2μLpH为5.5的1M磷酸钠缓冲液和2μL的含有30mMTCEP的Millipore水，并混合。将所述混合物保持在室温1小时，然后通过Amicon-10K使用无Tween-20缓冲液A纯化8次。对于转化酶缀合，将400μL含有20mg/mL转化酶的无Tween-20缓冲液A与1mg磺基-SMCC混合。振荡5分钟后，将所述溶液室温下放置在摇床上1小时。然后，将所述混合物离心并除去不溶的过量磺基-SMCC。然后，将所得澄清溶液通过Amicon-100K使用无Tween-20缓冲液A纯化8次。将磺基-SMCC-活化的转化酶的纯化溶液与上述的巯基-DNA溶液混合。所产生的溶液在室温保持48小时。为了除去未反应的巯基-DNA，将所述溶液通过Amicon-100K使用无Tween-20缓冲液A纯化8次。

使用PGM的DNA检测

将一份2mL1mg/mL链亲和素包被的MB相对于缓冲液A进行缓冲液置换2次，然后分散在2mL缓冲液A中。将生物素-DNA加入到所述溶液以达到5μM的终浓度，将所述混合物在室温充分混合30min。此后，通过磁性架将所述MB从所述混合物分离。再用缓冲液A将所述MB洗涤3次，然后将其从每份50μL含有1mg/mLMB的缓冲液A中分离。向每份MB剩余物中加入100μL含有多个DNA浓度的DNA样品的缓冲液A，将所述混合物在室温充分混合2小时。在使用含有2mg/mLBSA的缓冲液A洗涤所述MB剩余物3次以除去未结合DNA并通过BSA封闭非特异性结合位点后，加入100μL含有5mg/mLDNA-转化酶缀合物的缓冲液A，将所述混合物在室温充分混合30min。在使用缓冲液A洗涤所述MB剩余物5次后，向所述MB剩余物中加入100μL含有0.5M蔗糖的缓冲液A，然后在室温充分混合16小时。用葡萄糖计测试一份5μL的最终溶液。

使用PGM的HBVDNA片段检测

将一份2mL1mg/mL链亲和素包被的MB相对于缓冲液B进行缓冲液置换2次，然后分散在2mL缓冲液B中。将针对HBV的生物素-DNA加入到所述溶液以达到5μM的终浓度，将所述混合物在室温充分混合30min。此后，通过磁性架将所述MB从所述混合物分离。再用缓冲液B将所述MB洗涤3次，然后将其从每份50μL含有1mg/mLMB的缓冲液B中分离。向每份MB剩余物中加入100μL含有多个DNA浓度的DNA样品的缓冲液B，将所述混合物在室温充分混合1小时。在使用含有2mg/mLBSA的缓冲液B洗涤所述MB剩余物3次以移除未结合DNA并通过BSA封闭非特异性结合位点后，加入100μL含有5mg/mLDNA-转化酶缀合物的缓冲液B，将所述混合物在室温充分混合30min。在使用缓冲液B洗涤所述MB剩余物5次后，向所述MB剩余物中加入25μL含有1M蔗糖的缓冲液B，然后在室温充分混合3小时。用葡萄糖计测试一份5μL的最终溶液。

所述检测的原理

使用个人葡萄糖计(PGM)进行DNA检测的挑战是，建立样品中DNA浓度和通过PGM检测的葡萄糖浓度之间的联系。为克服该挑战，利用所述DNA-转化酶缀合物作为所述联系（图15）。首先，与所述转化酶缀合的捕获DNA能够通过DNA杂交识别靶DNA。其次，所述转化酶可以有效地催化蔗糖水解为葡萄糖，其可被PGM检测并转换为靶DNA的浓度。

通过PGM检测12-mer的靶DNA

如图16所示，通过所述DNA-转化酶缀合物方法实现使用PGM的DNA检测。在存在低浓度靶DNA下，很少的DNA-转化酶缀合物可结合到所述MB的表面。因此，仅检测到非常低的葡萄糖计信号。但是，随着所述样品中靶DNA的量增加，所述DNA-转化酶缀合物被更有效地固定到所述MB，导致通过所述酶反应产生更高量的葡萄糖。在存在10nM靶DNA下观察到多于40倍的葡萄糖产生的增强。在这些实验条件下达到的检测限为约50pm。由于所述MB的巨大表面积，DNA结合的能力是巨大的，发现所述检测的动态范围为至少10^-12-10^-8M靶DNA。

另外，所述检测显示出对所述靶DNA的非常好的选择性。如图17所示，在相同条件下在所述靶DNA中有1或2个错配时，通过PGM检测，所述DNA样品几乎不产生葡萄糖信号。所述优异的序列特异性归因于所述靶DNA与生物素-DNA之间12-bpDNA的杂交。

通过PGM检测乙肝病毒(HBV)DNA片段

所述相同方法被用于通过PGM检测样品中乙肝病毒(HBV)DNA片段的浓度。为使通过所述DNA-转化酶缀合物的葡萄糖产生更迅速，靶DNA和DNA-转化酶缀合物之间更长序列的DNA杂交(20bpvs.12bp)、更高离子强度的缓冲液以及浓度更高的蔗糖和最终MB溶液被用于增强结合所述表面的靶DNA片段的亲和力和所述最终溶液中DNA-转化酶缀合物的浓度。作为结果，与上述的12-mer靶DNA的16小时相比，对于此处HBVDNA片段检测可以在3小时内获得PGM的响应。

如图17A所示，在存在50nMHBVDNA片段下，可以实现葡萄糖产生的约30倍增强。根据IUPAC的定义计算了40pm的检测限。所述检测还是序列特异性的。在相同条件下与完全匹配的样品相比，在存在1个错配时，所述HBVDNA片段样品仅能产生可通过葡萄糖计检测的很弱的葡萄糖信号（图17B）。

实施例6

通过个人葡萄糖计(PGM)检测生物素

如图2A中一般性所示的，该实施例描述包括抗体以检测靶生物素的传感器的产生和测试。本领域技术人员应该理解，可以使用相似方法来产生其他基于抗体的传感器以检测其他靶分子。

链亲和素包被的磁珠(MB)、Amicon离心过滤器、来自面包酵母(S.cerevisiae)的VII级转化酶和其他材料如实施例5所述获得。如下的寡核苷酸从IntegratedDNATechnologies,Inc.(Coralville,IA)获得：

胺-DNA：5-NH2-AGAGAACCTGGGTTTTTT-3(SEQIDNO:23)

巯基-DNA：5-HS-AAAAAAAAAAAACCCAGGTTCTCT-3(SEQIDNO:24)

缓冲液A：0.1MNaCl、0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.3）、0.05%Tween-20

缀合化学作用

(1)DNA-脱硫生物素缀合

向0.4mL含有0.2mM胺-DNA的无Tween-20缓冲液A中，加入溶解在50μL乙醇中的5mg正-羟基琥珀酰亚胺基-DL-脱硫生物素，将所述混合物在室温充分混合4小时。然后，将所述DNA-脱硫生物素缀合物通过Amicon-10K使用无Tween-20缓冲液A纯化8次。

(2)DNA-转化酶缀合

向30μL含有1mM巯基-DNA的Millipore水中，加入2μLpH为5.5的1M磷酸钠缓冲液和2μL含有30mMTCEP的Millipore水，并混合。将所述混合物保持在室温1小时，然后通过Amicon-10K使用无Tween-20缓冲液A纯化8次。对于转化酶缀合，将400μL含有20mg/mL转化酶的无Tween-20缓冲液A与1mg磺基-SMCC混合。振荡5分钟后，将所述溶液在室温下放置在摇床上1小时。然后，将所述混合物离心并除去不溶的过量磺基-SMCC。然后，将所述澄清溶液通过Amicon-100K使用无Tween-20缓冲液A纯化8次。将磺基-SMCC-活化的转化酶的纯化溶液与上述的巯基-DNA溶液混合。所产生的溶液在室温保持48小时。为了移除未反应的巯基-DNA，将所述溶液通过Amicon-100K使用无Tween-20缓冲液A纯化8次。

(3)脱硫生物素-转化酶缀合：

如图18所示，通过DNA-脱硫生物素和DNA-转化酶缀合物在缓冲液A中杂交的组装来制备脱硫生物素-转化酶缀合物。

使用PGM的生物素检测的程序

将一份1mL1mg/mL链亲和素包被的MB相对于缓冲液A进行缓冲液置换2次，然后分散在1mL缓冲液A中。将DNA-脱硫生物素缀合物加入到所述溶液以达到5μM的终浓度，将所述混合物在室温充分混合1小时。此后，将所述MB用缓冲液A进一步洗涤3次，分散在1mL10mg/mLDNA-转化酶中，然后在室温充分混合30min。将所述DNA-转化酶溶液回收，将所述MB使用缓冲液A洗涤5次，然后分散在1mL缓冲液A中。使用从每份30μL含有1mg/mLMB的缓冲液A中分离的MB进行一次测定。向每份MB剩余物中，加入30μL的缓冲液A中多个生物素浓度的生物素样品，将所述混合物在室温充分混合15分钟。在通过磁性架除去MB后，将含有释放的转化酶的溶液与30μL1M蔗糖混合30min。用葡萄糖计测试一份5μL的最终溶液。

检测的原理

如图19所示，首先将脱硫生物素-转化酶缀合物固定到链亲和素包被的MB。一旦加入靶生物素，所述脱硫生物素-转化酶缀合物就从所述MB释放，因为生物素比其类似物脱硫生物素对链亲和素具有更强的亲和力。所述样品中生物素浓度与所释放的脱硫生物素-转化酶缀合物的浓度是成比例的，所述脱硫生物素-转化酶缀合物进一步催化蔗糖水解以产生葡萄糖。因此，PGM的葡萄糖浓度读数可用于计算所述样品中生物素的浓度。

使用PGM的生物素检测的结果

为了在存在靶下从所述MB表面释放所述转化酶缀合物，所述靶对所述MB表面功能性基团比对所述转化酶缀合物应呈现更强的亲和力。此处使用生物素和脱硫生物素组成的对来说明所述构思。脱硫生物素是生物素的类似物，但其对链亲和素的亲和力低于生物素几个数量级，因此生物素可以有效地将脱硫生物素从链亲和素释放，即使脱硫生物素已经与链亲和素结合。

如图20所示，在存在增加量的生物素下，通过PGM检测到葡萄糖计信号增强更多，因为更多的脱硫生物素-转化酶缀合物被释放并催化蔗糖产生更高量的葡萄糖。在存在过量生物素(15-64μM)下，观察到葡萄糖计信号增强多于30倍。基于3空白测量获得了0.25μM生物素的检测限。所述测定还显示了对生物素的优异特异性，因为加入脱硫生物素对葡萄糖计信号增强仅有非常轻微的影响。基于释放的免疫测定的一个优势是不需要洗涤步骤，因此比对应的基于结合的测定更简单并且耗时更少。

实施例7

通过个人葡萄糖计(PGM)检测前列腺特异性抗原(PSA)

如图2B中一般性所示，该实施例描述了包括抗体以检测靶PSA的传感器的产生和测试。本领域技术人员应理解，可以使用相似方法以产生其他基于抗体的传感器以检测其他靶蛋白质。

用于抗体的环氧-包被磁珠(DynabeadsM-270)缀合试剂盒和Amicon离心过滤器分别购自InvitrogenInc.(Carlsbad,CA)和MilliporeInc.(Billerica,MA)。来自面包酵母(S.cerevisiae)的VII级转化酶、前列腺特异性抗原(PSA)和其他用于缓冲液的化学品以及溶剂购自Sigma-Aldrich,Inc.(St.Louis,MO)。EZ-LinkNHS-PEG4-生物素和链亲和素从PierceInc.(Rockford,IL)获得。抗人PSA的小鼠单克隆抗体(ab403)购自AbcamInc.(Cambridge,MA)。生物素化的抗人激肽释放酶3的山羊IgG抗体(BAF1344)来自R&DSystem(Minneapolis,MN)。

缓冲液A：0.1MNaCl、0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.3）、0.05%Tween-20

缓冲液B：PBS缓冲液（pH7.0）、0.1g/LBSA、0.025%Tween-20。

缀合化学作用:

(1)生物素-转化酶缀合（图21）：

向1mL含有20mg/mL转化酶的无Tween-20缓冲液A中，加入约5mgEZ-LinkNHS-PEG4-生物素，将所述混合物在室温充分混合4小时。然后，将所述生物素-转化酶缀合物通过Amicon-100K使用无Tween-20缓冲液A纯化8次。

(2)缀合到磁珠的抗PSA的抗体（图21）：

这是按照供应商提供的方法来完成的（溶液C1、C2、HB、LB和SB全部来自所述供应商提供的试剂盒）：向200μL溶液C1和250μL溶液C2的混合物中，加入5mgDynabeadsM-270（用1mL溶液C1洗涤后）和50mgab403抗体，充分混合，并在室温置于滚柱(roller)上一天。然后，通过磁铁分离所述DynabeadsM-270磁珠(MB)，除去所述上清液。再将所述MB分散在800μL溶液HB中，然后通过磁铁分离并除去上清液。分别使用等量的溶液LB、SB和SB替代HB，重复该步骤。最终，将所述MB分散在1mL溶液SB中以得到5mg/mL的浓度。

使用PGM的PSA检测

将所述缀合有PSA抗体的MB相对于缓冲液B进行缓冲液置换以达到3mg/mL的终浓度。然后，使用每份50μL的该溶液进行一次测定。在通过磁铁分离并除去上清液后，将所述MB分散在50μL含有不同浓度PSA的缓冲液B中或分散在含有25%人血清的缓冲液B中，然后在室温置于滚柱上1小时。然后，分离所述MB并除去所述上清液。向所述剩余固体加入50μL含有1mg/LBAF1344抗体的缓冲液B，然后在室温混合0.5小时。再将所述MB分离，分散在50μL的2μM链亲和素中，然后混合并置于滚柱上0.5小时。之后，再次将所述MB分离，分散在50μL含有4μM生物素-转化酶缀合物的缓冲液B中。在滚柱上室温混合0.5小时后，将所述MB从所述上清液中分离并用缓冲液B洗涤4次。最终，向所述MB中加入50μL含有0.5M蔗糖缓冲液B，在4小时后通过PGM测试5μL所述溶液。

检测的原理

如图22所示，首先用带有/不带有PSA的样品处理抗PSA的抗体Ab403包被的MB。然后，加入在与Ab403不同的位点结合PSA的BAF1344抗体，形成夹心复合物。因为所述BAF1344抗体是生物素化的，随后加入链亲和素和生物素-转化酶缀合物最终产生如图22右侧示出的结构。所述固定的转化酶缀合物可以催化蔗糖产生葡萄糖，通过PGM检测的葡萄糖量可被用于计算所述样品中PSA的浓度。

使用PGM的PSA检测的结果

使用所述基于MB的检测方法在缓冲液B和25%人血清（用缓冲液B稀释）两者中进行了PSA检测。如图23A和23B所示，在两种情况中，样品中PSA的量增加导致了PGM读出更高的葡萄糖，至少在0-100ng/mLPSA的范围内有接近线性关系。在缓冲液B和25%人血清中获得了分别0.4ng/mL和1.5ng/mL的检测限。因为在缓冲液B和人血清中分别有高浓度的BSA和人血清白蛋白(HSA)，所述结果指示所述检测对PSA是非常敏感的并且不会被作为对照的BSA和HSA影响。另外，ng/mL水平的检测限指示所述方法可用于检测PSA以诊断前列腺癌。

实施例8

横流装置

该实施例描述了示例性的横流装置，所述横流装置用于使用本文公开的传感器检测测试样品中的靶因子。本领域技术人员应理解，通过附着其他识别分子以及通过使用其他可催化物质转化为葡萄糖的酶可以产生相似的装置。例如，该实施例描述的横流装置使用适体-转化酶缀合物（例如图5A所示）；但是，所述传感器可以使用抗体或其他识别分子（例如DNA）来替代适体。

图24示出了可通过PGM读数的横流装置，用于使用含有适体-转化酶缀合物的横流装置检测许多不同样品中宽范围的非葡萄糖靶。所述适体-转化酶缀合物通过核酸和酶之间的化学缀合而制备⁵¹。转化酶是可催化蔗糖转化为葡萄糖的酶。

如图24所示，所述横流装置含有芯吸垫、缀合垫、膜和吸收垫。将含有或怀疑含有一种或多种靶因子的样品施加到所述芯吸垫。在将样品施加到所述芯吸垫前，如果需要，可向所述样品中加入液体，或者可以将所述样品浓缩。所述芯吸垫确保所述样品的可控（单向）流动。所述样品由于毛细管力按照图24指示的流动方向从横流装置的底部向顶部迁移。当所述样品中靶因子到达所述缀合垫时，与所述缀合垫缀合的适体-转化酶（或可催化物质（例如蔗糖）转化为葡萄糖的其他识别分子-酶）识别所述靶因子，并将所述适体-转化酶从所述缀合垫释放到移动相，因为所述适体对所述靶因子比对所述固定表面有更高的亲和力（例如，所述表面被更低结合亲和力的靶因子的类似物修饰）。然后，所述释放的适体-转化酶或单独的转化酶（或可催化物质（例如蔗糖）转化为葡萄糖的其他识别分子-酶）随着所述流动移动，并在被蔗糖包被的膜部分催化蔗糖（或可被转化为葡萄糖的其他物质）产生葡萄糖。最终，所述产生的葡萄糖随着流动移动并到达所述吸收垫，然后在此被连接的PGM检测。

通过PGM检测的葡萄糖、释放的适体-转化酶和靶因子的量是相互成比例的。这使得可通过葡萄糖计的读数定量所述靶因子。为了定量靶因子，可以从结果中减去所述样品中的初始葡萄糖浓度。由于所述适体对其靶的高选择性，所述样品中其他组分的干扰是极微小的。

图5A-C示出了样品中靶与所述缀合垫中适体-转化酶缀合物之间特异性相互作用的更多细节，所述相互作用导致所述转化酶释放到移动相中。

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鉴于本公开的原理可被应用于许多可能的实施方案，应该认识到，所述阐释的实施方案仅是本公开的实例，不应该被视为限制本发明的范围。而是，本公开的范围由如下的权利要求书限定。因此，我们要求落在权利要求书范围和主旨内的发明为我们的发明。

Claims

1.一种传感器，包括

附着有识别分子从而可检测靶因子的固体支持物，其中所述识别分子在存在所述靶因子下特异性结合所述靶因子，但是不显著结合其他因子；

可催化物质转化为葡萄糖的酶，其中所述酶直接或间接附着到所述识别分子；以及

可被酶转化为葡萄糖的物质，其中在存在所述靶因子下所述酶可以将所述物质转化为葡萄糖，所述葡萄糖用葡萄糖计直接检测。

2.权利要求1的传感器，其中所述酶直接附着到所述识别分子。

3.一种传感器，包括

附着有适体从而可检测靶因子的固体支持物，其中所述适体在所述靶因子的存在下特异性结合所述靶因子，但是不显著结合其他因子；

可催化物质转化为葡萄糖的酶；其中所述酶间接附着到所述适体，所述酶是分析物-类似物的缀合物的一部分，所述分析物-类似物的缀合物可结合所述适体，其中在存在所述靶因子下所述酶从所述固体支持物释放，然后可以将所述物质转化为葡萄糖。

4.权利要求1的传感器，其中所述酶间接附着到所述识别分子，所述酶是所述靶因子的分析物-类似物的缀合物的一部分，所述分析物-类似物的缀合物可结合与所述识别分子结合的所述靶因子，其中在存在所述靶因子下所述酶可以将所述物质转化为葡萄糖。

5.权利要求1-4任一项的传感器，其中所述固体支持物包括珠或膜。

6.权利要求1-4任一项的传感器，其中所述固体支持物包括玻璃或硝酸纤维素。

7.权利要求1,2或4任一项的传感器，其中所述识别分子包括核酸分子、蛋白质、聚合物或可特异性结合所述靶因子的抗体。

8.权利要求7的传感器，其中所述核酸分子包括DNA、RNA、肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。

9.权利要求7或8的传感器，其中所述核酸分子包括功能性核酸。

10.权利要求9的传感器，其中所述功能性核酸包括适体或DNAzyme。

11.权利要求7的传感器，其中所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体或抗体片段。

12.权利要求1-4任一项的传感器，其中所述靶因子包括金属、微生物、细胞因子、激素、细胞、核酸分子、蛋白质、消遣性药物或毒素。

13.权利要求12的传感器，其中所述金属为

重金属，其包括汞(Hg)、镉(Cd)、砷(As)、铬(Cr)、铊(Tl)、铀(U)、钚(Pu)或铅(Pb)。

14.权利要求12的传感器，其中所述微生物为病毒、细菌、真菌或原生动物。

15.权利要求12的传感器，其中所述激素为外分泌激素。

16.权利要求12的传感器，其中所述细胞为癌细胞。

17.权利要求1-4任一项的传感器，其中所述酶为：

可将蔗糖转化为葡萄糖的转化酶、蔗糖酶或蔗糖酶-异麦芽糖酶，

可将麦芽糖转化为葡萄糖的麦芽糖酶，

可将海藻糖转化为葡萄糖的海藻糖酶，

可将淀粉转化为葡萄糖的淀粉酶，或

可将纤维素转化为葡萄糖的纤维素酶。

18.一种横流装置，其包括：

权利要求1-17任一项的固体支持物；

样品或芯吸垫；

缀合垫，其中将权利要求1-17任一项的传感器缀合到所述缀合垫；

膜，其包括可被转化为葡萄糖的物质；和

吸收垫。

19.权利要求18的横流装置，其中所述传感器包括DNA适体-转化酶缀合物或抗体-转化酶缀合物，其中所述DNA适体或抗体对靶因子是特异的，其中可被转化为葡萄糖的物质为蔗糖。

20.权利要求19的横流装置，其中所述靶因子为金属、微生物抗原、孢子或微生物核酸序列。

21.一种试剂盒，其包括：

权利要求1-17任一项的一个或多个传感器或者权利要求18-20任一项的横流装置；以及

一种或多种缓冲液，将检测的葡萄糖水平与存在的靶因子量建立关联的图表，或可以被所述酶转化为葡萄糖的物质。

22.权利要求21的试剂盒，其中可被所述酶转化为葡萄糖的所述物质包括蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维素或淀粉。

23.一种检测靶因子的非诊断方法，其包括

将权利要求1-3和5-17任一项的一个或多个传感器与样品在足以使所述样品中的靶因子可将所述酶从所述固体支持物释放的条件下接触；

分离所述固体支持物与所释放的酶；

将所述释放的酶与可以被所述酶转化为葡萄糖的物质接触，从而生成葡萄糖；

检测葡萄糖，其中检测到葡萄糖指示所述样品中存在所述靶因子，没有检测到葡萄糖指示所述样品中不存在所述靶因子；

其中所述靶因子包括金属、细胞因子、激素、消遣药物或毒素。

24.一种检测靶因子的非诊断方法，其包括

将权利要求1-2或4-17任一项的一个或多个传感器或权利要求18-20任一项的横流装置与样品在足以使所述样品中的靶因子结合所述识别分子的条件下接触，从而形成靶因子-识别分子复合物；

将所述靶因子-识别分子复合物与酶接触，其中所述酶与第二识别分子缀合，从而形成靶因子-识别分子-酶识别分子复合物；

将所述酶与可以被所述酶转化为葡萄糖的物质接触，从而生成葡萄糖；

25.权利要求24的非诊断方法，其中所述识别分子和所述第二识别分子是不同分子，但是都可特异性结合所述靶因子。

26.一种检测靶因子的非诊断方法，其包括

将权利要求18-20任一项的一个或多个横流装置与样品在足以使所述样品中的靶因子流过所述横流装置并结合到存在于所述横流装置上的识别分子或适体的条件下接触；

形成靶因子-识别分子复合物，其中所述靶因子-识别分子或适体复合物的形成导致可将物质转化为葡萄糖的酶的释放；

使所述酶与可以被所述酶转化为葡萄糖的物质相互作用，从而生成葡萄糖；

27.权利要求23的非诊断方法，还包括定量所述靶因子，其中检测到的葡萄糖水平指示存在的靶因子量。

28.权利要求23的非诊断方法，其中所述样品包括生物样品、食物样品或环境样品。

29.权利要求23的非诊断方法，其中

所述酶包括转化酶、蔗糖酶或蔗糖酶-异麦芽糖酶，并且可被所述酶转化为葡萄糖的所述物质包括蔗糖，或者

所述酶包括麦芽糖酶，并且可被所述酶转化为葡萄糖的所述物质包括麦芽糖，或者

所述酶包括海藻糖酶，并且可被所述酶转化为葡萄糖的所述物质包括海藻糖，或者

所述酶包括纤维素酶，并且可被所述酶转化为葡萄糖的所述物质包括纤维素，或者

所述酶包括淀粉酶，并且可被所述酶转化为葡萄糖的所述物质包括淀粉。

30.权利要求23的非诊断方法，其中使用个人葡萄糖计检测所述葡萄糖。

31.权利要求23、24或26的非诊断方法，其中所述金属为：

32.权利要求23、24或26的非诊断方法，其中所述激素为外分泌激素。

33.权利要求9的传感器，其中所述功能性核酸包括适体酶。

34.权利要求1-4任一项的传感器，其中所述靶因子包括孢子。

35.权利要求12的传感器，其中所述金属为

营养金属，其包括钙、铁、钴、镁、锰、钼、锌、镉或铜。

36.权利要求23、24或26的非诊断方法，其中所述金属为

营养金属，其包括钙、铁、钴、镁、锰、钼、锌、镉或铜。