BR112020012578A2 - circuitos biológicos sintéticos para a detecção de analitos alvo usando um medidor de glicose em um sistema livre de células - Google Patents

circuitos biológicos sintéticos para a detecção de analitos alvo usando um medidor de glicose em um sistema livre de células Download PDF

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Abstract

São descritos métodos para gerar uma molécula repórter em resposta a um analito alvo em um sistema livre de células. Um circuito biológico sintético é usado para modificar o nível da molécula repórter em resposta à presença do analito alvo. A molécula repórter pode ser glicose ou outra molécula prontamente detectada usando um dispositivo, tal como monitor de glicose ou outro sensor portátil. Também são fornecidos kits compreendendo um sistema livre de células com um circuito biológico sintético que gera ou consome uma molécula repórter em resposta a um analito alvo.

Description

CIRCUITOS BIOLÓGICOS SINTÉTICOS PARA A DETECÇÃO DE ANALITOS ALVO USANDO UM MEDIDOR DE GLICOSE EM UM SISTEMA LIVRE DE
CÉLULAS Pedidos Relacionados
[0001]Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Nº 62/609,525, depositado em 22 de dezembro de 2017; cujo conteúdo completo é incorporado neste documento por referência.
Campo da invenção
[0002]A presente invenção refere-se a produtos e métodos para a detecção de analitos alvo e, mais especificamente, a produtos e métodos para a detecção de analitos alvo usando circuitos biológicos sintéticos que produzem ou consomem glicose.
Fundamentos da Invenção
[0003]O monitor de glicose no sangue é indiscutivelmente o dispositivo de diagnóstico mais utilizado e "revolucionou" a vida de milhões de diabéticos, permitindo a quantificação portátil e, portanto, o gerenciamento pessoal do açúcar no sangue. Com vendas globais anuais de $11 bilhões (USD), o medidor de glicose é um sucesso incomparável para diagnósticos distribuídos. Essa ampla adoção resultou em uma rede global de fabricação, distribuição e consumíveis de dispositivos, além de ampla aceitação por pacientes e médicos. Esse sucesso, no entanto, não foi combinado com diagnósticos portáteis para outros biomarcadores de doenças (por exemplo, ácidos nucléicos, proteínas e outras moléculas pequenas). Embora as razões para isso sejam complexas, um fator importante é a ausência de tecnologia apropriada de sensores portáteis para outras classes de analitos.
[0004]Trabalhos anteriores para redirecionar medidores pessoais de glicose para a detecção de analitos diferentes da glicose foram descritos (Xiang e Lu, 2011; Xiang et al., 2014, Lan et al., 2016). No entanto, os mecanismos moleculares usados nesses relatórios incluíram o uso de aptâmeros ou hibridação de DNA entre vários elementos e o uso de enzimas pré-geradas que podem limitar sua utilidade.
[0005]Permanece a necessidade de novos produtos e métodos para a detecção de analitos alvo que são prontamente adaptados para uso em tecnologias de sensores portáteis.
Sumário da Invenção
[0006]A presente invenção refere-se a métodos e produtos úteis para detectar um analito alvo ativando um circuito biológico sintético em um sistema sem células. Em uma modalidade, a ativação do circuito biológico sintético modifica o nível de uma molécula repórter como a glicose. A detecção da molécula repórter, tal como pela utilização de um medidor de glicose, pode então ser usada para detectar a presença do analito alvo em uma amostra.
[0007]Conforme mostrado na Figura 1, um circuito biológico sintético, como um circuito genético, pode ser usado para ativar a atividade ou expressão de uma enzima repórter em resposta à presença de um analito alvo. Várias combinações de substratos e enzimas podem ser selecionadas que resultam em um aumento ou diminuição no nível de uma molécula repórter dentro da reação. Em uma modalidade preferida, a molécula repórter é glicose e o circuito biológico sintético gera e/ou ativa uma enzima repórter que modifica o nível de glicose no volume da reação. A glicose é gerada dentro do volume de reação livre de células a partir de um substrato que é inerte a um medidor de glicose, como um polissacarídeo. Em uma modalidade, a glicose é convertida em um produto (como D-glucono-1,5- lactona) que, de outra forma, é inerte a um medidor de glicose. Alterações no nível de glicose no volume da reação podem ser facilmente determinadas usando um medidor de glicose e/ou tiras de teste de glicose. Um ensaio exemplar para detectar um analito alvo em uma amostra de sangue de um paciente usando um monitor de glicose é mostrado na Figura 2.
[0008]Além disso, as modalidades descritas neste documento permitem a detecção de vários analitos alvo dentro de uma amostra em uma única reação. Conforme mostrado na Figura 4, vários circuitos biológicos sintéticos podem ser usados em um sistema sem células para gerar diferentes níveis de glicose em resposta a diferentes analitos alvo que são facilmente distinguidos usando um monitor de glicose.
[0009] As modalidades descritas neste documento apresentam uma série de vantagens e podem ser usadas para detectar analitos alvo em diferentes tipos de amostra para diferentes finalidades. Por exemplo, as modalidades descritas neste documento podem ser implementadas em dispositivos portáteis adequados para detectar quantidades clinicamente relevantes de DNA/RNA relacionados à doença em amostras de pacientes. Da mesma forma, a tecnologia pode ser usada para genotipar indivíduos no ponto de atendimento para inferir informações sobre fenótipos, testar a presença de marcadores genômicos nos alimentos (por exemplo, segurança alimentar) ou analisar amostras ambientais (por exemplo, monitoramento ecológico). Além disso, simplesmente alterando o circuito baseado em genes a montante, podem ser detectados analitos de moléculas pequenas, como contaminantes (por exemplo, metais pesados ou pesticidas), explosivos (por exemplo, segurança nacional) ou substâncias ilegais (por exemplo, aplicação da lei) em uma amostra de interesse. Os métodos e produtos descritos neste documento também podem ser usados para detectar códigos de barras moleculares, como aqueles usados para rastrear itens em uma cadeia de suprimentos, criptografando informações e/ou colocando marca d'água em itens de alto valor. As modalidades descritas neste documento permitem o uso de sensores portáteis e baratos, como um monitor de glicose para detectar uma grande variedade de analitos alvo.
[0010]Por conseguinte, em um aspecto, é fornecido um método para gerar glicose em resposta a um analito alvo em uma amostra. Em uma modalidade, o método compreende por em contato da amostra com um circuito biológico sintético em um sistema livre de células. O analito alvo ativa o circuito biológico sintético para modificar um nível de glicose dentro de um volume de reação do sistema livre de células.
[0011]O pcionalmente, o analito alvo ativa o circuito biológico sintético para aumentar o nível de glicose no volume de reação do sistema livre de células ou diminuir o nível de glicose no volume de reação do sistema livre de células.
[0012]Em uma modalidade, o analito alvo é uma molécula inorgânica ou uma molécula orgânica. Em uma modalidade, o analito alvo é uma biomolécula, como uma molécula de ácido nucleico (DNA ou RNA) ou uma proteína.
[0013]Em uma modalidade, o método compreende o tratamento da amostra antes ou durante o contato da amostra com o circuito biológico, a fim de purificar e/ou disponibilizar o(s) analito(s) alvo. Por exemplo, em uma modalidade, o método compreende extrair moléculas de ácido nucleico da amostra. Vários métodos de extração de ácido nucleico conhecidos na técnica podem ser utilizados em combinação com as modalidades descritas neste documento. Em uma modalidade,
o método compreende extrair um analito alvo usando um substrato como um papel ou membrana que captura o analito alvo, como uma molécula de ácido nucleico. Em outra modalidade, o método compreende o uso de esferas magnéticas para a extração do analito alvo. Em uma modalidade, os métodos descritos neste documento compreendem a extração baseada em papel de moléculas de ácido nucleico a partir de uma amostra, opcionalmente, a extração do RNA ReCap conforme descrito neste documento, seguido de amplificação isotérmica baseada em sequência de ácido nucleico (por exemplo, NASBA, RPA, LAMP, etc.), antes de colocar a amostra em contato com o circuito biológico sintético.
[0014]Em uma modalidade, o método compreende aumentar e/ou amplificar a concentração do analito alvo na amostra antes ou durante o contato da amostra com o circuito biológico sintético. Por exemplo, em uma modalidade, o método compreende a amplificação de uma molécula de DNA ou molécula de RNA alvo usando técnicas de amplificação de ácido nucleico conhecidas na técnica opcionalmente como técnicas de amplificação isotérmica.
[0015] Em uma modalidade, o circuito biológico sintético regula a expressão de uma enzima que modifica o nível de glicose no volume de reação livre de células em resposta a um analito alvo, opcionalmente regulando a transcrição ou tradução da enzima. Em uma modalidade, o circuito biológico sintético é um circuito de gene. Por exemplo, em uma modalidade, o circuito do gene compreende um riborregulador, como um comutador toehold, que controla a tradução de um mRNA que codifica a enzima em resposta ao analito alvo. Alternativamente, o circuito biológico sintético pode regular o nível ou a atividade de uma enzima que modifica o nível de glicose no sistema livre de células, opcionalmente pela regulação pós- tradução da enzima.
[0016]Várias combinações de substratos e enzimas podem ser usadas de acordo com as modalidades descritas neste documento que resultam em um aumento ou diminuição no nível de uma molécula repórter dentro do volume de reação do sistema livre de células. Em uma modalidade, o substrato é glicose ou um substrato que é acionado por uma enzima para gerar glicose. Por exemplo, em uma modalidade, o substrato é trealose e a enzima é trealase. Outras combinações de substratos e enzimas serão prontamente aparentes para a pessoa versada na técnica, tendo em vista os ensinamentos da descrição, incluindo, entre outros,
aqueles listados na Figura 18. Em uma modalidade, o cetoacetato de cetona é gerado a partir de HMG-CoA com a enzima HMG-CoA liase. Em outra modalidade, o D-3-Hidroxibutirato é oxidado para acetoacetato usando a enzima 3- Hidroxibutirato = desidrogenase. Em uma modalidade, a B-hidroxibutirato desidrogenase é usada para converter a B-hidroxibutirato em acetoacetato.
[0017]Em uma modalidade, os métodos descritos neste documento incluem o tratamento da amostra antes de colocar à amostra, ou uma fração desta, em contato com o circuito biológico sintético no sistema livre de células. Por exemplo, em uma modalidade, a amostra é tratada para normalizar ou diminuir a concentração de glicose na amostra e/ou aumentar a concentração relativa do analito alvo na amostra. Em uma modalidade, a amostra é tratada para remover e/ou sequestrar glicose endógena e/ou açúcares do sangue na amostra. Opcionalmente, o método compreende o contato da amostra com glicose desidrogenase e NAD para converter glicose endógena em D-glucono-1,5-lactona.
[0018] Em uma modalidade, os métodos descritos neste documento incluem a detecção da molécula repórter no volume de reação do sistema livre células, detectando desse modo o analito alvo na amostra. Em uma modalidade, a molécula repórter é glicose e um medidor de glicose e/ou tira de teste de glicose é usada para detectar glicose no volume de reação do sistema livre de células. Em uma modalidade, a molécula repórter é uma cetona e um medidor de cetona e/ou tira de teste de cetona é usado para detectar cetonas no volume de reação do sistema livre de células.
[0019]As modalidades descritas neste documento também podem ser usadas para detectar uma pluralidade de analitos alvo diferentes em uma reação de detecção multiplex. Por exemplo, em uma modalidade, o método compreende o contato da amostra com uma pluralidade de circuitos biológicos sintéticos em um sistema livre de células, em que um analito alvo diferente ativa cada circuito biológico sintético para modificar o nível de glicose no volume de reação do sistema livre células. Em uma modalidade, comparar o nível de glicose no volume de reação do sistema livre de células com um ou mais níveis de controle pode ser usado para determinar a presença, ausência e/ou nível de uma pluralidade de analitos alvo na amostra.
[0020]Em uma modalidade, os métodos descritos neste documento incluem a apresentação de dados indicativos da presença ou ausência de um ou mais analitos alvo a um usuário. O pcionalmente, os dados são apresentados ao usuário em um dispositivo eletrônico portátil, como um smartphone.
[0021]Em outro aspecto, é fornecido um kit compreendendo um sistema livre de células compreendendo um circuito biológico sintético que gera ou consome uma molécula repórter em resposta a um analito alvo em uma amostra. Em uma modalidade, a molécula repórter é glicose. Em uma modalidade, o kit compreende um recipiente, opcionalmente um recipiente para receber a amostra e/ou colocar a amostra em contato com o sistema livre de células. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes para executar um método conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes que operam para formar um sistema livre de células com um circuito biológico sintético. Em uma modalidade, o sistema livre de células é liofiizado. Em uma modalidade, o kit compreende instruções para executar um método para gerar uma molécula repórter e/ou detectar um analito alvo conforme descrito neste documento.
[0022]Em uma modalidade, o kit compreende produtos e/ou reagentes para processar a amostra, como para extrair moléculas de ácido nucleico da amostra. Em uma modalidade, o kit compreende um substrato para capturar o analito alvo, como um substrato de papel ou membrana, opcionalmente celulose. Em uma modalidade, o substrato é afixado a um recipiente, opcionalmente no interior de um recipiente adequado para receber a amostra. Em uma modalidade, o substrato aderente é afixado no interior de uma cobertura ou tampa removível para o recipiente. Em uma modalidade, o kit compreende esferas magnéticas adequadas para extrair ácidos nucleicos. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes para aumentar a concentração do analito alvo na amostra. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes para amplificar uma molécula de ácido nucleico alvo, opcionalmente para amplificação isotérmica da molécula de ácido nucleico. Em uma modalidade, o kit compreende um aquecedor para tratamento térmico da amostra, opcionalmente para evaporar a amostra ou lisar células na amostra. Em uma modalidade, o tratamento térmico antes do contato da amostra com o sistema livre células desnatura proteínas endógenas, incluindo enzimas modificadoras de glicose.
[0023]Em uma modalidade, o kit compreende um recipiente para receber uma amostra, em que o recipiente compreende uma tampa removível e o substrato é fixado à tampa removível. Em uma modalidade, o kit compreende uma pluralidade de recipientes e a tampa removível é configurada para caber na pluralidade de recipientes. Por exemplo, em uma modalidade, o kit compreende recipientes separados para extração, lavagem e/ou amplificar um analito alvo antes de colocar a amostra em contato com o circuito biológico sintético. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes, como tampões adequados para extrair, lavar e/ou amplificar o analito alvo.
[0024]Em uma modalidade, o kit compreende um circuito biológico sintético compreendendo um circuito de gene. Em uma modalidade, o circuito de gene compreende um riborregulador, como um comutador toehold, que controla a tradução de um mMRNA que codifica uma enzima cuja expressão gera ou consome glicose no sistema livre de células. Em uma modalidade, o kit compreende uma pluralidade de circuitos biológicos sintéticos que geram ou consomem glicose em resposta a uma pluralidade de analitos alvo diferentes na amostra. Opcionalmente, cada circuito biológico sintético gera glicose usando um substrato e enzima diferentes.
[0025]EmM uma modalidade, o kit compreende ainda reagentes para O tratamento e/ou diluição da amostra. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes para remover e/ou sequestrar glicose endógena e/ou açúcares do sangue na amostra. Por exemplo, em uma modalidade, o kit compreende uma quantidade predeterminada de glicose desidrogenase (GDH) e NAD para converter glicose na amostra em D-glucono-1,5-lactona.
[0026]Em uma modalidade, o kit compreende ainda um medidor de glicose e/ou uma tira de teste de glicose. Em outra modalidade, o kit compreende ainda um medidor de cetona e/ou uma tira de teste de cetona.
[0027]O utras características e vantagens da invenção atual serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve-se compreender, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferenciais da presente invenção, são dados somente a título de ilustração, uma vez que várias mudanças e modificações dentro do espírito e do escopo da presente invenção se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.
Breve Descrição das Ilustrações
[0028]As modalidades da invenção serão agora descritas com referência as figuras anexas, nas quais:
[0029]A Figura 1A mostra sensores convencionais baseados em circuitos de gene para detectar analitos alvo que produzem saída de proteínas fluorescentes ou colorimétricas e requerem equipamento especializado para interpretar. Tais métodos de detecção convencionais não são compatíveis com infraestruturas de diagnóstico amplamente disponíveis, como medidores de glicose. As Figuras 1B, 1C,1D e 1E mostram várias modalidades de conversão de um medidor de glicose padrão e tiras de teste em um dispositivo genérico para a detecção de analitos alvo, conforme descrito neste documento, utilizando enzimas geradoras de glicose. À Figura 1B fornece uma lista de enzimas repórteres, seus respectivos substratos e o rendimento de glicose por molécula. A Figura 1C mostra que uma modalidade exemplar de sensores baseados em circuitos de gene pode funcionar regulando a transcrição em que um circuito de gene baseado em TetO é reprimido pela presença de TetR. Essa repressão é aliviada com a adição da molécula pequena aTc, que interrompe a ligação de TetR ao promotor TetO, permitindo a transcrição e tradução de uma enzima geradora de glicose. A Figura 1D mostra um esquema de um circuito de gene exemplar baseado em comutador toehold que serve para regular a tradução. Na presença do RNA trigger correto, o hairpin de RNA 5' do comutador toehold é linearizado, o que permite que o ribossomo se ligue ao sítio de ligação ribossômica (RBS) e induza a tradução da enzima repórter geradora de glicose. A Figura 1E mostra a conversão de substratos oligoméricos de glicose em uma reação livre de células. O estado oligomérico desses substratos significa que eles não são reativos às tiras de teste de glicose até que sejam convertidos em glicose monomérica por uma enzima repórter produzida por um circuito de gene ativado.
[0030]A Figura 2 mostra uma modalidade de um fluxograma para interpretar a saída do sensor de RNA baseado em circuito de gene com um medidor de glicose. Uma amostra pode ser fornecida a partir de um sujeito, como picada no dedo usando uma lanceta. A amostra é então diluída em um frasco de tampão de preparação de amostras que inclui primers específicos para o alvo e mistura de reação de amplificação isotérmica, e o frasco é invertido para misturar. Após a amplificação, a sequência alvo amplificada é transferida para uma microcâmara na tampa removendo um lacre e invertendo o frasco fechado. F oi permitido que reação livre de células com o sensor de RNA continuasse (opcionalmente por 20 a 40 minutos) e é durante esse período que a glicose será produzida se a amostra do paciente for positiva para o analito alvo. A tira de teste de glicose é então inserida na microcâmara e lida no monitor de glicose.
[0031]A Figura 3 mostra a redução controlada de glicose por titulação do co-substrato NAD para glicose desidrogenase (GDH). Quando a GDH é expressa em reações livre de células, a quantidade de glicose catabolizada pela enzima pode ser controlada com precisão, fornecendo as diferentes quantidades de NAD. NAD é reduzido por GDH a NADH e é necessário para o catabolismo da glicose a uma razão 1:1. O GDH pode ser usado como uma enzima repórter de diagnóstico ou para reduzir a glicose endógena presente em uma amostra antes da execução do ensaio.
[0032]A Figura 4 mostra o uso da intensidade do sinal para saídas multiplexadas de reações de diagnóstico livres de células. A adição de modelos de DNA para diferentes enzimas em uma mistura de reação comum permite que a reação gere diferentes níveis de glicose em resposta a diferentes analitos alvo. Isso pode ser usado para operar vários sensores de diagnóstico em uma única reação. Todas as reações foram realizadas utilizando um sistema de expressão livre de células e são idênticas, exceto o DNA adicionado conforme descrito no Exemplo 1. As enzimas foram expressas no sistema a partir do DNA do plasmídeo. À expressão da lactase estava sob o controle de um comutador toehold, com o trigger adicionado. As outras duas enzimas foram expressas a partir de um promotor T7 padrão. Todos os valores são mostrados após a subtração do sinal de fundo, determinado pela medição de uma reação de controle sem nenhum DNA adicionado. As reações livres de células foram incubadas a 37ºC por 1 hora. À concentração de glicose foi medida usando um medidor de glicose no sangue.
[0033]A Figura 5 mostra que a titulação da quantidade de modelo de DNA para uma enzima pode controlar a quantidade de glicose gerada por uma reação. Uma redução na quantidade de DNA modelo resulta em uma produção mais lenta de glicose. Isso pode ser usado em sistemas de diagnóstico para ajustar a saída de diferentes enzimas para criar diferenças claras entre intensidades de sinal para multiplexação. Os valores são mostrados após a subtração do sinal de fundo, determinado usando uma reação de controle negativo sem DNA presente. As amostras foram incubadas a 37ºC durante 1 hora. A concentração de glicose foi medida usando um medidor de glicose no sangue.
[0034]A Figura 6 mostra o efeito da concentração de substrato na produção de glicose. Diferentes níveis de substrato de trealose resultam em diferentes concentrações de glicose na presença de trealase. Os valores são mostrados após a subtração do sinal de fundo, determinado usando uma reação de controle negativo sem DNA presente. As reações livres de células foram incubadas a 37ºC por 1 hora. A concentração de glicose foi medida usando um medidor de glicose no sangue.
[0035]A Figura 7 mostra a expressão da trealase sob o controle de um sensor de RNA baseado em comutador toehold. Isso representa uma reação de diagnóstico simulada em que a presença de RNA trigger induz a tradução da trealase e a produção concomitante de glicose. A trealase converte cada molécula de trealose em duas moléculas de glicose. Os valores são mostrados após a subtração do sinal de fundo, determinado usando uma reação de controle negativo sem DNA presente. As reações livres de células foram incubadas a 37ºC por 1 hora. A concentração de glicose foi medida usando um medidor de glicose no sangue.
[0036]A Figura 8 mostra a expressão da lactase sob o controle de um sensor de RNA baseado em comutador toehold. Aqui, a tradução da enzima repórter lactase é induzida na presença da sequência correta de trigger do RNA, resultando na produção de glicose. A lactase converte cada molécula de açúcar de lactose em uma molécula de glicose (mais uma galactose). Aqui, o vazamento é indetectável, provavelmente devido à menor velocidade de reação dessa enzima. Os valores são mostrados após a subtração do sinal de fundo, determinado usando uma reação de controle negativo sem DNA presente. As reações livres de células foram incubadas a 37ºC por 1 hora. A concentração de glicose foi medida usando um medidor de glicose no sangue.
[0037]A Figura 9 mostra uma modalidade de um método para detectar um analito alvo em uma amostra de paciente. Opcionalmente, um tampão de medidor de glicose (5x NaCl 0,1 M, fosfato de sódio 0,1 M, 0,05% de tween-20, pH 7,3) é adicionado ao volume da reação antes de detectar glicose usando o medidor de glicose.
[0038]A Figura 10 mostra a multiplexação usando dois comutadores toehold diferentes para diferentes analitos alvo em um único volume de reação. A Figura 10B mostra resultados de um experimento semelhante e a detecção multiplexada de duas sequências de RNA alvo diferentes usando duas enzimas geradoras de glicose diferentes. A Figura 10C mostra a detecção multiplexada usando a mesma enzima em que a atividade do repórter foi sintonizada usando diferentes comutadores toehold (comutadores toehold podem ter níveis variáveis de atividade) e diferentes quantidades de DNA que codificam cada um dos comutadores toehold (ou seja, a quantidade de sensor presente).
[0039]A Figura 11 mostra o uso de um circuito biológico sintético que produz glicose para a detecção de alvos tifoides e paratifoides.
[0040]A Figura 12 mostra um fluxo de trabalho mediado por medidor de glicose exemplar para aplicações de diagnóstico.
[0041]A Figura 13 mostra os resultados da PCR de extração de papel ReCap e das reações de controle da PCR.
[0042]A Figura 14 mostra os resultados de um ensaio SYBR Green | com PCR de extração de papel ReCap.
[0043]A Figura 15 mostra os resultados da PCR de extração de esferas magnéticas.
[0044]A Figura 16 mostra os resultados da extração do RNA ReCap seguida pela amplificação do NASBA.
[0045]A Figura 17 mostra um exemplo de fluxo de trabalho mediado por medidor de glicose para a detecção de mercúrio usando um circuito biológico sintético.
Descrição Detalhada da Invenção
[0046]A presente descrição fornece circuitos biológicos sintéticos para a detecção de analitos alvo em um sistema livre de células. Conforme mostrado nos Exemplos, o uso de circuitos biológicos sintéticos conforme descrito permite a detecção de analitos alvo usando sensores e reagentes prontamente disponíveis, como monitores de glicose e tiras de teste. Diferentes circuitos biológicos sintéticos podem ser facilmente gerados para permitir a detecção de diferentes analitos alvo usando as modalidades descritas neste documento. Por exemplo, as sequências alvo de RNA ou DNA podem ser detectadas usando um riborregulador, como um comutador toehold para controlar a expressão de uma enzima repórter em resposta a uma sequência de ácido nucleico alvo. A expressão da enzima repórter modifica o nível de um substrato que é então detectado dentro do volume de reação livre de células. Em uma modalidade preferida, a enzima repórter modifica o nível de glicose no volume de reação livre de células, permitindo a detecção do analito alvo usando um monitor de glicose e/ou tira de teste de glicose.
[0047]Diferentes enzimas repórteres podem ser usadas na mesma reação para permitir a detecção simultânea de múltiplos analitos alvo. Ao selecionar enzimas repórteres que têm taxas diferentes de modificação do nível de uma molécula repórter (como glicose) e pré-carregar diferentes quantidades de substratos para cada enzima, a presença ou ausência de vários analitos alvo resultará em níveis distintos da molécula repórter.
[0048]Conforme usado neste documento, "sistema livre de células" refere- se a um conjunto de reagentes capazes de fornecer ou suportar uma reação biossintética (por exemplo, reação de transcrição, reação de tradução ou ambas) in vitro na ausência de células. Por exemplo, para fornecer uma reação de transcrição, um sistema livre de células compreende DNA contendo promotor, RNA polimerase, ribonucleotídeos e um sistema tampão. Os sistemas livres de células podem ser preparados usando enzimas, coenzimas e outros componentes subcelulares isolados ou purificados a partir de células eucarióticas ou procarióticas, incluindo células recombinantes, ou preparados como extratos ou frações dessas células. Um sistema livre de células pode ser derivado de uma variedade de fontes, incluindo, mas não se limitando a, células eucarióticas e procarióticas, como bactérias, incluindo, mas não se limitando a E. coli, bactérias termofílicas ou criofílicas e semelhantes, gérmen de trigo, reticulócitos de coelho, células L de camundongo, células cancerígenas ascíticas de Ehrlich, células HeLa, células CHO e leveduras em desenvolvimento e semelhantes. Em uma modalidade, os extratos celulares são purificados e/ou tratados para remover a glicose endógena e/ou enzimas de conversão de glicose para obter um sistema livre de células. Exemplos de sistemas livres de células também incluem o sistema PURE xpress € disponível na New England Biolabs Inc.
[0049]Conforme usado neste documento, o termo "reação biossintética" refere-se a qualquer reação que resulte na síntese de um ou mais compostos biológicos (por exemplo, DNA, RNA, proteínas, monossacarídeos, polissacarídeos, etc.). Por exemplo, uma reação de transcrição é uma reação biossintética porque o RNA é produzido. Outros exemplos de reações biossintéticas incluem, mas não estão limitados a, reações de tradução, reações de transcrição e tradução acopladas, síntese de DNA, reações de amplificação isotérmica e reações em cadeia da polimerase.
[0050]O termo "circuito biológico sintético" usado neste documento refere- se a qualquer circuito biológico manipulado em que os componentes biológicos são projetados para desempenhar funções lógicas. E m geral, é necessária uma entrada para ativar um circuito biológico sintético, que subsequentemente produz uma saída em função da entrada. Em algumas modalidades, um circuito biológico sintético compreende pelo menos um material ou construto de ácido nucleico. Em outras modalidades, um circuito biológico sintético está substancialmente livre de ácidos nucleicos. Uma rede de gene sintética é um tipo de circuito biológico sintético. Outros exemplos de circuitos biológicos sintéticos incluem, mas não estão limitados a, uma via de sinalização manipulada, como uma via que amplifica a entrada através da atividade da quinase. Em uma modalidade, o circuito biológico sintético modifica o nível de uma molécula repórter em um volume de reação livre de células em resposta a um analito alvo. Em uma modalidade, o circuito biológico sintético regula a expressão e/ou atividade de uma enzima que gera ou consome uma molécula repórter em um volume de reação livre de célula.
[0051]"Rede de gene sintética" ou "circuito genético sintético" ou "circuito de gene" são usados de forma intercambiável neste documento para se referir a uma composição manipulada que compreende pelo menos um material ou construto de ácido nucleico e pode executar uma função incluindo, mas não limitado a, detecção, uma função lógica, e/ou uma função reguladora. O material ou construto de ácido nucleico pode ser natural ou sintético. O material ou construto de ácido nucleico pode compreender DNA, RNA ou um análogo artificial de ácido nucleico deste. Em algumas modalidades de uma rede de gene sintética compreendendo pelo menos dois materiais ou construções de ácido nucleico, os materiais ou construtos de ácido nucleico podem interagir um com o outro direta ou indiretamente. Uma interação indireta significa que outras moléculas são necessárias ou intermediárias na interação. Alguns exemplos de redes genéticas sintéticas compreendem um ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor. Em uma modalidade, o circuito de gene ou rede de gene compreende um riborregulador, como um comutador toehold.
[0052]Em um aspecto, é fornecido um método para gerar uma molécula repórter em resposta a um analito alvo em uma amostra. De preferência, a molécula repórter é uma molécula como glicose que pode ser detectada usando um sensor prontamente disponível, como um monitor de glicose. Em uma modalidade, o método compreende colocar à amostra em contato com um circuito biológico sintético em um sistema livre de células, em que o analito alvo ativa o circuito biológico sintético para modificar um nível da molécula repórter dentro de um volume de reação do sistema livre de células.
[0053]Em uma modalidade, o analito alvo ativa o circuito biológico sintético para aumentar o nível da molécula repórter dentro do volume de reação do sistema livre de células. Em outra modalidade, o analito alvo ativa o circuito biológico sintético para diminuir o nível da molécula repórter dentro do volume de reação do sistema livre de células. Por exemplo, o analito alvo pode ativar o circuito biológico sintético para produzir uma enzima que aumenta o nível de glicose, quebrando os açúcares poliméricos.
[0054]0s métodos descritos neste documento podem ser utilizados para detectar uma variedade de diferentes analitos alvo. Em uma modalidade, o analito alvo é uma molécula inorgânica, como um metal. Em outra modalidade, o analito alvo é uma molécula orgânica, opcionalmente uma biomolécula. Os circuitos biológicos sintéticos que são ativados por vários alvos inorgânicos ou orgânicos são conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados para uso nos métodos e kits descritos neste documento. P or exemplo, tais circuitos são descritos em Roelof Van der Meer e Belkin (Nat Rev Microbiol., 8 de julho de 2010 (7) 511- 522), Zhou et al. Chem. Rev., 2017, 117 (12), pp 8272-8325 e Wedekind et al. (The Journal of Biological Chemistry 292, 9441-9450 , 9 de junho de 2017), todos os quais são incorporados por referência neste documento.
[0055]Em uma modalidade, o analito alvo é uma biomolécula como um ácido nucleico (DNA ou RNA), proteína, lipídio, metabolito ou molécula de açúcar. O ácido nucleico pode ser um ácido nucleico ou variante associada a um organismo específico e/ou fenótipo. Em uma modalidade, o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico associada a um patógeno microbiano, opcionalmente um vírus ou bactéria. Os métodos e kits descritos neste documento podem, portanto, ser utilizados para a detecção de micróbios específicos, opcionalmente para fins de diagnóstico. Por exemplo, em uma modalidade, o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico associada à resistência microbiana à drogas. Em uma modalidade, os métodos e kits descritos neste documento podem ser utilizados para a detecção de febres entéricas, como tifoide ou paratifoide. Por exemplo, conforme mostrado no Exemplo 4 e Figura 11, os comutadores toehold configurados para ativar a produção de uma enzima trealase para geração de glicose foram capazes de detectar alvos de RNA de tifoide, paratifoide A ou paratifoide B.
[0056]Em uma modalidade, a amostra é de um sujeito e o analito alvo é um biomarcador associado a um fenótipo conhecido. P or exemplo, o biomarcador pode estar associado a uma doença ou à capacidade de resposta a certas terapias ou drogas quimioterapêuticas. Os métodos e produtos descritos neste documento podem ser usados para gerar dados de biomarcadores para um paciente no ponto de atendimento, opcionalmente usando um dispositivo portátil barato, como um medidor de glicose.
[0057]Alternativamente ou além disso, os circuitos biológicos sintéticos descritos neste documento podem ser utilizados para gerar uma molécula repórter em resposta a um metal (por exemplo, Ni, Co, Fe, Hg), material explosivo, herbicida (por exemplo, atrazina), poluente e/ou toxina. A molécula repórter pode então ser detectada usando um dispositivo portátil barato, como um medidor de glicose. À Figura 17 mostra um exemplo de fluxo de trabalho para a detecção de mercúrio usando um circuito de gene com um promotor Tn21, que é ligado e sequestrado por um repressor MerR na ausência de mercúrio. O sistema regulador do gene Tn21-MerR é acoplado operativamente a uma enzima trealase para a produção de glicose, que pode ser detectada usando um medidor de glicose.
[0058]A amostra pode ser submetida a vários tratamentos antes ou durante o contato com o circuito biológico sintético. Em uma modalidade, o tratamento aumenta a concentração do analito alvo na amostra. Alternativamente, ou além disso, a amostra pode ser tratada para remover um ou mais contaminantes ou para diluir a amostra para facilitar a detecção do analito alvo. Em uma modalidade, o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico e o método compreende a amplificação da molécula de ácido nucleico na amostra. Por exemplo, em uma modalidade, o método compreende a amplificação isotérmica de uma molécula de DNA alvo ou da molécula de RNA alvo, antes ou durante o contato com o circuito biológico sintético.
[0059]Em uma modalidade, os métodos e kits descritos neste documento compreendem as etapas e/ou reagentes para processamento de uma amostra antes da detecção de um ou mais analitos alvo usando o circuito biológico sintético. Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico são extraídas da amostra. Vários métodos de extração de ácido nucleico conhecidos na técnica podem ser utilizados em combinação com as modalidades descritas neste documento. Conforme mostrado nos Exemplos, um substrato aderente, como papel à base de celulose, pode ser usado para capturar ácidos nucleicos de uma amostra, como uma amostra de células lisadas. Opcionalmente, as moléculas de ácido nucleico são retidas no substrato durante uma etapa de lavagem, enquanto os contaminantes presentes na amostra são removidos.
[0060]Várias técnicas conhecidas na técnica podem ser usadas para amplificar uma molécula de ácido nucleico dentro da amostra. Isso inclui, mas não está limitado a, reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação mediada por loop (LAMP), ensaio Invader, replicação por círculo rolante (RCA), amplificação mediada por sinal da tecnologia de RNA (SMART), amplificação dependente de helicase (HDA), Reação de Amplificação de Enzima Nicking (NEAR), amplificação de polimerase de recombinase (RPA), amplificação de sinal de endonuclease de corte (NESA) e ativação de nanopartículas assistidas por endonuclease de corte (NENNA), reciclagem de alvo auxiliada por exonuclease, estratégias de amplificação por Junção ou sondas Y, DNAZima dividida e desoxirribozima, reações químicas direcionadas a modelos que levam a sinais amplificados, reações catalíticas de DNA não covalentes, reações em cadeia de hibridação (HCR) e detecção através de automontagem de sondas de DNA para produzir estruturas supramoleculares.
[0061]EmM um aspecto da divulgação, um circuito biológico sintético é construído para modificar o nível de uma molécula repórter, como a glicose, em resposta à presença de um analito alvo. Em uma modalidade, o circuito biológico sintético regula a expressão, nível ou atividade de uma enzima que modifica o nível da molécula repórter no sistema livre de células. O pcionalmente, o circuito biológico sintético pode operar regulando a transcrição ou tradução da enzima ou por regulação pós-traducional da enzima, tal como usando inteínas controladas por moléculas pequenas.
[0062]Em uma modalidade, o circuito biológico sintético é um circuito de gene. Em uma modalidade, o circuito do gene compreende uma molécula de DNA compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica uma ou mais enzimas cuja expressão modifica o nível de uma molécula repórter, como glicose, no sistema livre de células. Em uma modalidade, o circuito de gene regula a transcrição de uma molécula de DNA que codifica uma ou mais enzimas ou a tradução de uma ou mais moléculas de MRNA que codificam uma ou mais enzimas. Opcionalmente, dois ou mais circuitos biológicos sintéticos regulam a expressão de duas ou mais enzimas que modificam o nível de glicose. Em uma modalidade, as duas ou mais enzimas modificam o nível de glicose em taxas diferentes, por exemplo, agindo em diferentes substratos.
[0063]Em uma modalidade, o circuito de gene compreende um ou mais ativadores da transcrição ou repressores da transcrição. Em uma modalidade, o circuito de gene compreende um riborregulador que controla a tradução de uma molécula de MR NA que codifica uma enzima. Em uma modalidade, o riborregulador é um comutador toehold. Por exemplo, em uma modalidade, o analito alvo é um trigger para o comutador toehold, de modo que a ligação do analito alvo ao comutador toehold permite a tradução do MRNA que codifica à enzima no circuito de gene. Uma pessoa versada na técnica seria capaz de projetar facilmente comutadores para várias moléculas alvo de DNA ou RNA.
[0064]Em uma modalidade, o sistema livre de células compreende um ou mais substratos que respondem à atividade do circuito biológico para modificar o nível da molécula repórter. Por exemplo, em uma modalidade, o sistema livre de células compreende glicose ou um substrato que é acionado por uma enzima sob controle do circuito biológico sintético para gerar glicose.
[0065]Em uma modalidade, o substrato compreende um oligossacarídeo ou polissacarídeo compreendendo um ou mais monômeros de glicose. Combinações exemplares de enzimas e substratos adequados para uso nos circuitos biológicos sintéticos descritos neste documento são mostrados na Figura 1B.
[0066]Os métodos e produtos descritos neste documento podem ser usados para analisar qualquer amostra para a qual é desejada informação sobre a presença ou ausência de um analito alvo. Em uma modalidade, a amostra é um fluido biológico, opcionalmente sangue, urina, líquido cefalorraquidiano ou saliva. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra do paciente, como uma amostra de tecido. Em outra modalidade, a amostra é uma amostra ambiental, opcionalmente uma amostra de água. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra de alimento.
[0067]Em algumas modalidades, a amostra é tratada antes de entrar em contato com o circuito biológico sintético no sistema livre de células. Em uma modalidade, o tratamento da amostra compreende diluir a amostra com um tampão/diluente e/ou água livre de nuclease. Em uma modalidade, a amostra é tratada para normalizar ou diminuir a concentração de glicose na amostra. À amostra também pode ser tratada para remover ou reduzir o nível de contaminantes que interferem no sistema livre de células e/ou a detecção da molécula repórter. Em uma modalidade, a amostra é tratada para aumentar a concentração relativa do analito alvo. Alternativamente, ou além disso, a amostra pode ser submetida a um tratamento térmico, como aquecimento, resfriamento e/ou congelamento da amostra. Em uma modalidade, a amostra é aquecida para lisar células contidas na amostra e/ou desnaturar proteínas endógenas, como enzimas que ocorrem naturalmente, que podem interferir na operação do sistema livre de células e/ou circuito biológico sintético.
[0068]Em uma modalidade, a amostra pode ser tratada para normalizar e/ou diminuir o nível de uma molécula repórter como a glicose na amostra antes de colocar a amostra em contato com o circuito biológico sintético. Em uma modalidade, o tratamento da amostra ajuda a controlar a influência da fonte da amostra, que pode potencialmente incluir moléculas repórteres (como glicose ou açúcares naturais do sangue) ou enzimas que podem distorcer a detecção de um analito alvo.
[0069]Em uma modalidade, a amostra é diluída com um diluente ou tampão para reduzir o nível da molécula repórter na amostra. Em uma modalidade, o diluente ou tampão compreendem um surfactante. Em uma modalidade, o surfactante é Tween-20. Em uma modalidade, a diluição da amostra pode levar até níveis diabéticos altos de glicose para abaixo de um limite para os métodos descritos neste documento. Por exemplo, os níveis normais de glicose são 7,8-16,7 mM, mas ocasionalmente podem exceder temporariamente 28 mM em hiperglicemia extrema. A diluição da amostra, por exemplo, 10 vezes traria níveis de glicose entre 0,8 mM e 2,8 mM, o que em algumas modalidades não seria esperado que prejudicasse o uso dos métodos descritos neste documento.
[0070]Em algumas modalidades, a amostra pode ser submetida a etapas adicionais de tratamento para reduzir, remover, sequestrar e/ou normalizar o nível de glicose. Por exemplo, as lectinas de ligação à glicose podem ser usadas para sequestrar a glicose e/ou açúcares do sangue da amostra. Em uma modalidade, a glicose pode ser removida da amostra adicionando uma enzima (por exemplo, glicose desidrogenase) que converteria glicose em uma substância inerte. Esse processo seria limitado pela quantidade de cofator (por exemplo, NAD) fornecido e adaptado para neutralizar a glicose recebida.
[0071]Em uma modalidade, o método compreende tratar a amostra com uma quantidade predeterminada de GDH e/ou NAD para remover uma quantidade predeterminada de glicose da amostra, como uma quantidade média de glicose encontrada em um tipo de amostra específico.
[0072]EmM uma modalidade, o sistema livre de células compreende um circuito biológico sintético, conforme descrito neste documento, enzimas para transcrição e tradução, ribossomos, dNTPs, tRNAs e aminoácidos. Opcionalmente, o sistema livre de células compreende ainda um ou mais de um inibidor de RNAse, um tampão, um ou mais cofatores, um crioprotetor e um surfactante, opcionalmente Tween-20. Em uma modalidade, o sistema livre de células também compreende um substrato para uma enzima cuja expressão e/ou atividade é regulada pelo circuito biológico sintético. Por exemplo, em uma modalidade, o sistema livre de células compreende uma quantidade predeterminada de glicose ou um substrato mostrado na Figura 18. Em uma modalidade, o substrato é um substrato acionado pela enzima para gerar glicose, tal como um oligossacarídeo ou polissacarídeo compreendendo um ou mais monômeros de glicose.
[0073]Os componentes do sistema livre de células podem ser liofilizados e reidratados antes ou como parte de um método conforme descrito neste documento. Por exemplo, em uma modalidade, o sistema livre de células é liofilizado e reidratado por contato com a amostra, um tampão, e/ou diluente.
[0074]Em uma modalidade, os métodos descrito neste documento incluem a detecção de uma molécula repórter, como glicose, cujo nível é modificado pelo circuito biológico sintético. Em uma modalidade, a detecção da presença ou ausência da molécula repórter é indicativa da presença ou ausência do analito alvo na amostra. Em uma modalidade, o método compreende a detecção de um nível de glicose no volume de reação livre de células.
[0075] Em uma modalidade, o nível de glicose no volume de reação livre de células é indicativo do nível do analito alvo na amostra. Em uma modalidade, o nível de glicose no volume de reação livre de células é indicativo da presença ou ausência de uma pluralidade de moléculas alvo detectadas em uma reação multiplex. Em uma modalidade, o nível de glicose no volume de reação livre de células é determinado em uma pluralidade de momentos.
[0076]Embora os medidores de glicose sejam capazes de detectar uma ampla faixa de níveis de glicose, convencionalmente, os medidores só foram usados para gerar uma única leitura (glicose em mg/dL). Os métodos e kits descritos neste documento aproveitam a ampla faixa dinâmica de medidores de glicose para criar largura de banda para saídas multiplexadas. Isso pode ser feito selecionando enzimas com diferentes cinéticas e controlando a concentração do substrato. Ao projetar rendimentos de glicose não sobrepostos para cada circuito biológico sintético, são possíveis diagnósticos multiplexados com um único número de leitura. Em uma modalidade, cada sensor no sistema multiplexado produz uma enzima repórter única que converte um substrato oligomérico de glicose em glicose monomérica que pode ser detectada pelo medidor de glicose. Selecionando enzimas com diferentes cinéticas e ajustando a concentração de substrato, DNA modelo e outros parâmetros moleculares/bioquímicos, a produção de glicose resultante pode ser controlada. Em uma modalidade, as saídas do sensor são projetadas para não se sobreporem, de modo que a produção de glicose aditiva possa ser facilmente usada para determinar quais sensores foram ativados.
[0077]EmM uma modalidade, a amostra é contatada ou incubada com o circuito biológico sintético no sistema livre de células por um período de tempo predeterminado antes da detecção de glicose no volume de reação livre de células.
Em uma modalidade, a amostra é colocada em contato ou incubada com o circuito biológico sintético no sistema livre de células por um período de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45 minutos. Em uma modalidade, a amostra é colocada em contato ou incubada com o circuito biológico sintético no sistema livre de células por um período de 30-180 minutos, opcionalmente entre 30 e 90 minutos ou entre 60 e 90 minutos.
[0078]Em uma modalidade, o método compreende adicionar um tampão ao volume de reação do sistema livre de células antes da detecção de glicose. Em uma modalidade, o tampão é uma composição compreendendo NaCl 0,1 M, fosfato de sódio 0,1 M, Tween-20 a 0,05% e tem um pH de cerca de 7,3. Em uma modalidade, o tampão compreende ou consiste em Tween-20, opcionalmente Tween-20 a cerca de 0,0125% ou Tween-20 a entre 0,01% e 0,02%.
[0079]Em uma modalidade, os métodos descritos neste documento incluem a detecção de um nível de glicose usando um medidor de glicose, opcionalmente usando uma tira de teste de glicose. Em uma modalidade, o método compreende o contato do volume de reação livre de células, ou uma porção deste, com uma tira de teste de glicose.
[0080]Conforme mostrado no Exemplo 3, o uso de mais de um circuito biológico sintético conforme descrito neste documento pode ser usado para detectar uma pluralidade de analitos alvo em um único volume de reação. Em uma modalidade, o método compreende o contato da amostra com uma pluralidade de circuitos biológicos sintéticos em um sistema livre de células, em que um analito alvo diferente ativa cada circuito biológico sintético para modificar o nível de glicose no volume de reação do sistema livre células. Em uma modalidade, cada um da pluralidade de circuitos biológicos sintéticos gera glicose usando um substrato e enzima diferentes. Em uma modalidade, diferenças na taxa e/ou nível da molécula repórter gerada pela pluralidade de circuitos biológicos sintéticos no sistema livre de células permite a detecção multiplex de uma pluralidade de analitos alvo diferentes em uma única reação.
[0081]Conforme mostrado nas Figuras 10A e 10B, os métodos e kits descritos neste documento são úteis para a multiplexação usando duas enzimas separadas que, por exemplo, produzem glicose em taxas diferentes ou, como na Figura 10C, com uma única enzima em que cada alvo ativa a produção de uma única enzima, mas em taxas diferentes.
[0082]O pcionalmente, os métodos descritos neste documento incluem a comparação do nível de glicose detectado no volume de reação do sistema livre de células com um ou mais níveis de controle. Em uma modalidade, o nível de controle é indicativo de um nível predeterminado do analito alvo em uma amostra de controle testada sob condições semelhantes. Em uma modalidade, o método compreende comparar o nível de glicose detectada no volume de reação do sistema livre de células com um ou mais níveis de controle, em que cada nível de controle é indicativo da presença ou ausência de um ou mais analitos alvo na amostra.
[0083]Em uma modalidade, os métodos descritos neste documento incluem a apresentação de dados indicativos da presença ou ausência de um ou mais analitos alvo a um usuário. Por exemplo, os dados podem ser indicativos do nível de um ou mais analitos alvo na amostra. Em uma modalidade, os dados podem ser indicativos de um fenótipo ou outra condição associada à presença de um analito alvo na amostra.
[0084]Em outro aspecto, é fornecido um kit compreendendo um sistema livre de células compreendendo um circuito biológico sintético que gera ou consome uma molécula repórter em resposta a um analito alvo em uma amostra. Em uma modalidade, a molécula repórter é glicose. Em outra modalidade, a molécula repórter é uma cetona. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes, tais como, mas não limitados a, aqueles no sistema livre de células ou reagentes para aumentar a concentração de um analito alvo. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes para executar um método conforme descrito neste documento.
[0085]Em uma modalidade, o kit compreende um recipiente para receber a amostra e/ou colocar à amostra em contato com o sistema livre de células. Em uma modalidade, o recipiente compreende uma tampa e um receptáculo. Opcionalmente, o recipiente é adaptado para receber uma tira de teste de glicose, de modo que um volume de reação livre de células dentro do recipiente esteja em contato com a tira de teste de glicose. Em uma modalidade, o recipiente compreende uma câmara contendo o sistema livre de células. Por exemplo, em uma modalidade, a câmara está localizada na tampa. Opcionalmente, o sistema livre de células pode ser liofilizado e posicionado dentro do recipiente. Em uma modalidade, o sistema livre de células está associado a um substrato, como um papel ou outro material inerte.
[0086]EmM uma modalidade, o kit compreende uma pluralidade de recipientes úteis em um fluxo de trabalho, conforme descrito neste documento. Por exemplo, em uma modalidade, o kit compreende um primeiro recipiente adequado para receber uma amostra e extrair ácidos nucleicos em um substrato aderente. Em uma modalidade, o kit compreende um segundo recipiente adequado para lavar o substrato aderente para remover impurezas. Em uma modalidade, o kit compreende um terceiro recipiente adequado para eluir moléculas de ácido nucleico capturadas no substrato e, opcionalmente, para amplificar as moléculas de ácido nucleico na amostra antes de colocar a amostra em com o circuito biológico sintético. Em uma modalidade, o substrato aderente é afixado a uma tampa ou cobertura que está configurada para caber em um ou mais dos três recipientes. Isso facilita a transferência da amostra que contém o analito alvo entre os diferentes recipientes para processar e/ou amplificar a amostra antes do contato com o circuito biológico sintético.
[0087]Em uma modalidade, o kit compreende reagentes para extrair e/ou lavar um analito alvo de uma amostra. Em uma modalidade, o kit compreende um tampão de extração adequado para lisar células para extrair ácidos nucleicos. Em uma modalidade, o kit compreende um tampão de lavagem adequado para remover impurezas de uma amostra de moléculas de ácido nucleico.
[0088]Em uma modalidade, o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico e o kit compreende reagentes para aumentar a concentração da molécula de ácido nucleico. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes para a amplificação isotérmica da molécula de ácido nucleico. Opcionalmente, os reagentes para aumentar a concentração do analito alvo são combinados com o sistema livre de células dentro do recipiente ou são fornecidos separadamente dentro ou fora do recipiente.
[0089]Em uma modalidade, o circuito biológico sintético é um circuito de gene. Por exemplo, em uma modalidade, o circuito do gene compreende uma molécula de DNA compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica uma ou mais enzimas cuja expressão gera ou consome a molécula repórter no sistema livre de células. Em uma modalidade, o circuito de gene compreende um riborregulador que controla a tradução de um mMRNA que codifica uma enzima cuja expressão gera ou consome a molécula repórter no sistema livre de células. Em uma modalidade, o riborregulador é um comutador toehold. Em uma modalidade, a molécula repórter é glicose.
[0090]Em uma modalidade, o sistema livre de células no kit compreende glicose ou um substrato que é acionado pela enzima para gerar glicose. Por exemplo, em uma modalidade, o sistema livre de células compreende uma quantidade predeterminada de glicose ou um substrato mostrado na Figura 1B. Em uma modalidade, o substrato é um substrato acionado pela enzima para gerar glicose, tal como um oligossacarídeo ou polissacarídeo compreendendo um ou mais monômeros de glicose.
[0091]Em uma modalidade, o kit compreende reagentes para o tratamento da amostra antes de colocar a amostra em contato com o sistema livre de células. Em uma modalidade, o kit compreende reagentes para tratar a amostra para remover e/ou sequestrar glicose endógena e/ou açúcares do sangue na amostra. Por exemplo, em uma modalidade, o kit compreende glicose desidrogenase (GDH) e NAD, opcionalmente uma quantidade predeterminada de GDH e/ou NAD. Em uma modalidade, o kit compreende lectinas para sequestrar glicose e/ou açúcares do sangue na amostra. Em uma modalidade, os reagentes para o tratamento da amostra para remover e/ou sequestrar glicose endógena e/ou açúcares do sangue são fornecidos no kit separado do sistema livre de células.
[0092]Em uma modalidade, o kit compreende um diluente ou um tampão. Em uma modalidade, o diluente ou tampão pode ser usado para diluir a amostra e/ou reidratar um sistema livre de células. Em uma modalidade, o diluente ou tampão compreende água livre de nuclease e/ou um surfactante, opcionalmente Tween-20. Em uma modalidade, o diluente ou tampão é fornecido dentro do recipiente separado do sistema livre de células. Em uso, a amostra e o diluente ou tampão podem ser contatados com o sistema livre de células para ativar o circuito biológico sintético em resposta a uma molécula alvo.
[0093]Em uma modalidade, o sistema livre de células compreende um circuito biológico sintético, conforme descrito neste documento, enzimas para transcrição e tradução, ribossomos, dNTPs, tRNAs e aminoácidos. Opcionalmente, o sistema livre de células compreende ainda um inibidor de RNAse, um tampão,
um ou mais cofatores, um crioprotetor e/ou um surfactante, opcionalmente Tween-
20. Em uma modalidade, o sistema livre de células compreende um substrato para uma enzima cuja expressão e/ou atividade é regulada pelo circuito biológico sintético conforme mostrado na Figura 1B.
[0094]Em uma modalidade, o kit compreende uma pluralidade de diferentes circuitos biológicos sintéticos que são ativados por diferentes analitos alvo. Por exemplo, diferentes kits podem ser fornecidos, isoladamente ou em combinação, para a detecção de diferentes analitos alvo ou combinações de analitos alvo.
[0095]Em uma modalidade, o kit compreende um dispositivo e/ou reagentes adequados para detectar a molécula repórter dentro do volume de reação livre de células. Por exemplo, em uma modalidade, o kit compreende um medidor de glicose e, opcionalmente, uma ou mais tiras de teste de glicose.
Exemplo 1: Uso de circuitos biológicos sintéticos para a produção de glicose em resposta a um analito alvo em um sistema livre de células.
[0096]Uma série de experimentos foi realizada para demonstrar o uso de circuitos biológicos sintéticos para gerar glicose em resposta a um analito alvo em uma reação livre de células. Para todas as experiências, a glicose foi detectada usando um medidor de glicose no sangue disponível comercialmente e tiras de teste associadas (Bayer Contour Blood Glucose Monitoring System).
[0097]Níveis endógenos de glicose dentro de uma amostra podem potencialmente interferir no uso de glicose como molécula repórter, especialmente para a análise de amostras biológicas. Conforme mostrado na Figura 3, é possível efetuar uma redução controlada de glicose dentro de uma amostra usando glicose desidrogenase (G DH) e titulação no cofator NAD. Portanto, GDH e NAD podem ser usados para tratar uma amostra para reduzir ou normalizar o nível de glicose antes da análise, usando o sistema livre de células.
[0098] Em seguida, os experimentos foram realizados usando o sistema livre de células PURE xpress € disponível comercialmente na New England Biolabs (NEB), que inclui componentes purificados reconstituídos necessários para transcrição/tradução de E. coli. Um construto recombinante "Comutador Toehold G" foi gerado com um promotor T7 (em itálico) e comutador Toehold G (sublinhado) operacionalmente conectado ao DNA que codifica à enzima trealase (SEQ ID NO: 1):
TAATACGACTCACTATAGGGATCTATTACTACTTACCATTGTCTTGCTCT ATACAGAAACAGAGGAGATATAGAATGAGACAATGGAACCTGGCGGCAGCG CAAAAGATGCGTAAAGATTATAAAGATGATGATGATAAAGGACATCATCATCA TCATCACAGCAGCGGCGAGAACCTGTACTTCCAATCCTCTGGAGGTGGGGG TTCTGGAACAGCGGTACGGATAGATTATGCAAGCGGGTTAACTGATCGCGAA AACTCTATGTTCAAAGAAATCCAGTTGTCAGGCGTTTTTGCCGATTCAAAAACÇ CTTTGTGGATAGCCATCCCAAATTGCCCCTGGCGGAAATCGCCGAGCTTTAC CATGTCCGGCAACAGCAGGCGGGTTTTGACCTCGCCGCTTTTGTTCACEGGT ATTTTGAGCTGCCGCCGAGCATTGCCTCCEGGTTTTGTCAGCGATACCTCEGCG CCCGGTGGAAAAGCATATCGACATTCTCTGGGATGTGCTCACCCGCCAACEG GACAGGCAGGAGGCGGGAACCCTGCTGCCCTTACCTTACCCCTATGTCGTT CCCEGGCEGEGCCEGCTTCCEGCGAAATTTACTACTGGGACAGCTATTTCACCATGC TCGGTTTGCAGGCATCGAAGCGCTGGGATCTGATGGAGGGTATGGTGAATAA TTTTTCACACCTGATCGACACCATCGGCTTTATTCCCAACGGCAATCGCACCET ATTACGAGGGCCGCTCCCAGCCEGCCETTTTTACGCCCTGATGGTGGAGTTGCT GGCCAATAAACAGGGTGAGTCGGTGCTGCTCGCGCATTTGCCGCATTTGCG CAGGGAATATGAATTCTGGATGGAGGGCGCCGCTAAACTTTCGCCCGCTGCA CCCEGEGCATEGCCGTGTGGTGCTGCTGCCGGATGGCAGCATACTCAATCGC TACTGGGATGATATAGCCGCGCCGCGCCCGGAATCCETTCCGCGAAGACTACÇ GAACTGGCGGAAGCCATCGGCGGCAACAAGCGCGAGCTGTACCGCCATATT CGCGCGGCGGCAGAATCCGGCTGGGACTTCAGCAGCCGCTGGTTCAAAGAT GGCAATGGCATGGCCAGCATCCACACCACCGATATTATCCCGGTGGATTTGA ATGCGCTGGTCTTTAACCTGGAGCGGATGCTGGCCCATATTTATGGCTTGCA GGGCGACCAGGATCAGGCCACGCATTACTACCAATTGGCGGAGCAGCGCAA ACAGGCGTTGCTGCGCTACTGTTGGAATGCGCAGCAGGGATTTTTCCACGAT TACGATTATGTCGCCGCACAACAGACGCCGGTCATGTCGCTGGCGGCGGTT TACCCGCTTTATTTCAGTATGGTCGACCAGCGCACGGGCGACCGGGTEGCCE GAACAGATAGAGGCGCATTTTATCCAGGCGGGCGGTGTGACCACGACCCTG GCGACCACAGGCCAGCAGTGGGACGCGCCCAATGGCTGGGCGCCEGCTGCA ATGGCTGACCATCCAGGGCCTGCGCAATTATCACCACAATTCAGCGGCGGA GCAGATCAAACAGCGCTGGATTGCACTCAACCAGCGCGTTTACCGCAACACC GGAAAGTTGGTGGAAAAATACAACGTCTATGACCTGGATGTGGCCGGCGGC GGTGGCGAATATGAATTACAGGATGGCTTCGGTTGGACCAACGGTGTCTTGT
TGCACTTACTCAACGAAAGTACACCCTAA (SEQ ID NO: 1)
[0099]O comutador toehold G é ativado pela sequência G de RNA trigger abaixo (SEQ ID NO: 2):
GGGUGAUGGGACAUUCCGAUGUCCCAUCAAUAAGAGCAAGACAAUG GUAAGUAGUAAUAGAUAAG (SEQ ID NO: 2)
[00100] Conforme mostrado nas Figuras 4-6, usando diferentes enzimas repórteres como saídas de circuitos biológicos sintéticos, diferentes concentrações de glicose podem ser geradas. Essa característica pode ser usada para diferenciar a atividade de diferentes circuitos biológicos sintéticos (detectando diferentes analitos) em um único volume de reação e medição de glicose (Figura 4). Da mesma forma, a concentração do modelo de DNA e do substrato enzimático pode ser controlada para ajustar o rendimento de glicose de uma enzima repórter (Figuras 5 e 6). Além disso, conforme mostrado na Figura 7, um diagnóstico simulado usando um sistema livre de células e o comutador toehold G resultou na produção de glicose em resposta ao analito alvo (sequência G de RNA trigger) que foi prontamente detectada usando um medidor de glicose no sangue portátil.
Exemplo 2: Uso de um comutador toehold para regular a expressão de lactase em um sistema livre de células
[00101] Uma série de reações livres de células foi montada seguindo um modelo de reação usando um comutador toehold para controlar a expressão de lactase, conforme mostrado na Tabela 1.
Comutador toehold com enzima repórter de beta-galactosídeos (LacZ) * Lactose como substrato da enzima * Volumes de reação em uL Conjunto Master Mix Tratamento | Reagente NEB AINEB B Lactose | Tween- (0,4) (0,3) (mM) 20 (1%) Conc. 2,50 3,33| 200,00] 1460,00 1,00 solução- mãe Conc. 40% do | 30% do 20 mM 0,0125 final volume | volume total total Controle 3,20 2,40 0,04 0,11 0,10 negativo —
EE nasc cala sozinho Controle 3,20 2,40 0,04 0,11 0,10 positivo — — pico de glicose Comutador 3,20 2,40 0,04 0,11 0,10 toehold sozinho Comutador |LacZSwE 3,20 2,40 0,04 0,11 0,10 toehold +|+Trig
RNA Trigger mo mo er Conjunto de Reações Individuais iii | rar Ar nal HA a Ei LacZ LacZ total o 200,00] == 97,00] 25700] Po omM| Jong sn UP úN Controle 5,85 2,15 8,00 negativo — sem células sozinho Controle 5,85 1,75 8,00 positivo — — pico de glicose Comutador 5,85 0,82 1,33 8,00 toehold sozinho Comutador 5,85 0,82 0,62 0,70 8,00 toehold +
RNA Trigger | Totais/ 2340] 040 165] 062) 593/ 32,00] Tabela 1: Montagem da mistura principal e reações individuais para sistemas livres de células com lactase (também conhecida como beta- galactosidase ou LacZ) sob o controle de um comutador toehold. Volumes em microlitros.
[00102] Um construto recombinante "Comutador Toehold E" foi gerado com um promotor T7 (em itálico) e comutador toehold E (sublinhado) operacionalmente conectado ao DNA que codifica a enzima repórter lactase(SEQ ID NO: 3):
TAATACGACTCACTATAGGGAGTTTGATTACATTGTCGTTTAGTTTAGT GATACATAAACAGAGGAGATATCACATGACTAAACGAAACCTGGCGGCAGCG CAAAAGATGCGTAAAATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACA ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCA CATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATEGCE CCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCE CGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGG CCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCC CATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCA CGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTG GCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTITGATGGCGTTAACTCGGCGTTT CATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTG CCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCG CGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATA TGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGAC TACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCC GCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACC TACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCA CCGCGCCTTTCEGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCG CGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATC CCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTG ATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATG GTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCA CGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCA GGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCAT TATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATG TGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCT GACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAAT GGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAA TGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCT GTCGATCCTTCCCEGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACG GCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCT TCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGA GACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTT GGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGG GCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAA CGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGA TCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCA GCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCG GGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGA GCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGA AGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAA CTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTG CAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAG CAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCAC GCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTA ATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATT GGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCA CCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACG CCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCG TTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCG CTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTA CCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCG AGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAG GTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCC GACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACA TGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGC GCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACAT CAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTG CACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTG
GTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCG CCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAA (SEQ ID NO: 3)
[00103] O comutador toehold E é ativado pela sequência E de RNA trigger abaixo (SEQ ID NO: 4):
GGGACAGAUCCACUGAGGCGUGGAUCUGUGAACACUAAACUAAACG ACAAUGUAAUCAAACUAACÍ(SEQ ID NO: 4)
[00104] Conforme mostrado na Figura 8, um diagnóstico simulado usando um sistema livre de células e o comutador toehold E resultou na produção de glicose em resposta ao analito alvo (sequência E de RNA trigger) que foi prontamente detectada usando um medidor de glicose no sangue portátil.
Exemplo 3: Detecção multiplexada de analitos alvo em um único volume de reação
[00105] Uma mistura de reação comum contendo dois comutadores toehold diferentes foi montada e dividida em alíquotas em réplicas. O primeiro conjunto de reações em triplicata foi então incubado sem trigger e foi usado para normalizar os dados contra o sinal de fundo. Conforme mostrado na Figura 10A, o próximo conjunto de reações em triplicata recebeu RNA trigger E e produziu um aumento baixo, mas significativo, da glicose. O terceiro conjunto de reações em triplicata recebeu RNA trigger G para produzir uma quantidade maior e distinta de glicose.
[00106] Portanto, mais de um analito alvo pode ser distinguido usando uma única reação com dois circuitos de gene diferentes. Isso demonstra um aplicativo de diagnóstico simulado onde mais de um patógeno/analito é distinguido usando uma única reação com saídas de glicose que dependem de qual entrada de RNA está presente.
[00107] A Figura 10B mostra os resultados de experimentos semelhantes realizadas para caracterizar a detecção multiplexada de duas sequências de RNA alvo diferentes usando duas enzimas geradoras de glicose diferentes. Cada alvo ativa a produção de uma enzima diferente e cada enzima gera uma quantidade distinta de glicose. O alvo A desencadeia a produção de uma lactase, enquanto o alvo B desencadeia a produção de uma trealase. Todos os comutadores toehold estavam presentes em todas as reações, com a única diferença sendo o alvo adicionado. Os valores na Figura 10B são mostrados após a subtração do sinal de fundo, determinado pela medição de uma reação de controle sem nenhum alvo presente. As amostras foram incubadas a 37ºC durante 1 hora. A concentração de glicose foi medida usando um medidor de glicose no sangue.
[00108] A Figura 10C mostra os resultados gerados usando uma única enzima (uma trealase) para a detecção de dois alvos diferentes em uma reação multiplex, em vez de diferentes enzimas para cada alvo. Cada alvo ativa a produção da mesma enzima, mas em taxas diferentes, devido a diferenças na cinética dos comutadores toehold. Isso resulta em taxas distintas de produção de glicose, dependendo do(s) alvo(s) presente(s), incluindo um sinal mais forte quando ambos estão presentes. Todos os comutadores toehold estavam presentes em todas as reações, com a única diferença sendo o(s) alvo(s) adicionado(s). Os valores são mostrados após a subtração do sinal de fundo, determinado pela medição de uma reação de controle sem nenhum alvo presente. As amostras foram incubadas a 37 ºC durante 1 hora. A concentração de glicose foi medida usando um medidor de glicose no sangue. Conforme mostrado na Figura 10C, amostras contendo o alvo A, alvo B ou alvos A +B foram prontamente distinguidas.
Exemplo 4: Uso de circuitos biológicos sintéticos para a detecção de alvos tifoides e paratifoides
[00109] Os comutadores toehold foram projetados para detectar sequências de RNA tifoide, paratifoide A e paratifoide B, respectivamente. Todos os comutadores toehold foram configurados para ativar a produção de uma enzima trealase para geração de glicose. A Figura 11 mostra dados preliminares antes da otimização da concentração e do substrato do DNA comutador para potencializar e diferenciar os sinais gerados, mas um aumento claro pode ser observado nos três casos. Os dados apresentados na Figura 11 não são um experimento multiplexado, pois apenas um comutador toehold estava presente em cada reação. Os valores são mostrados após a subtração do sinal de fundo, determinado pela medição de uma reação de controle sem nenhum alvo presente. As amostras foram incubadas a 37ºC durante 1 hora. A concentração de glicose foi medida usando um medidor de glicose no sangue.
Exemplo 5: Fluxo de trabalho de diagnóstico mediado por medidor de glicose
[00110] A Figura 12 mostra um fluxo de trabalho de diagnóstico mediado por medidor de glicose exemplar (mas não limitado a). O processo geral do fluxo de trabalho proposto segue 6 etapas; Etapa 1 - Coleta de amostras, Etapa 2 - Extração de RNA, Etapa 3 - Amplificação isotérmica, Etapa 4 - Reação livre de células, acoplada a sensores específicos de alvo que produzem glicose na presença do RNA alvo, Etapa 5 - Análise de amostra em um medidor de glicose e
Etapa 6 - a interpretação dos resultados no software personalizado. As modalidades preferidas dos métodos descritos neste documento podem incluir uma ou mais das etapas mostradas na Figura 12 para as quais os detalhes opcionais são estabelecidos abaixo.
Etapa 1: Coleta de Amostras
[00111] A amostra pode ser uma amostra de sangue do paciente ou outra amostra biológica.
Etapa 2: Extração de RNA
[00112] Vários métodos de extração de RNA podem ser utilizados, como a) extração à base de papel ou b) extração de esferas magnéticas.
[00113] Para extração à base de papel, um papel ou membrana é anexado ao interior da cobertura de um tubo usando cola ou cera. O tampão de lise é adicionado à amostra a uma concentração final de 1x. O tubo é invertido e a cobertura é incubada com o extrato por 1 minuto, após o qual a cobertura é transferida para outro tubo com tampão de lavagem e invertida continuamente por 1 minuto. Finalmente, a cobertura é transferida para outro tubo que contém a mistura de reação isotérmica. O tubo é invertido e incubado com a mistura por mais um minuto para eluiro RNA.
[00114] Para a extração de esferas magnéticas, semelhante ao método de extração em papel, o tampão de lise é adicionado à amostra até uma concentração final de 1x. Uma solução contendo esferas magnéticas será então adicionada à amostra e misturada até ficar uniforme. As esferas magnéticas e o ácido nucleico a elas ligados serão coletados para o lado do tubo usando um ímã, e os resíduos de lise serão removidos. O passo de lavagem subsequente prosseguirá da mesma forma; com o tampão de lavagem sendo adicionado ao tubo, o tubo sendo agitado para homogeneizar a mistura e com as esferas magnéticas mais uma vez sendo coletadas para o lado do tubo usando um ímã. Como etapa final, o RNA será eluído das esferas para água ou diretamente para uma mistura de reação de amplificação isotérmica.
Etapa 3) Reação de Amplificação Isotérmica
[00115] Se o alvo que se pretende detectar for encontrado em baixas concentrações na amostra inicial, pode ser necessário amplificar o RNA alvo para um nível compatível com o sensor. Isso será feito usando um método de amplificação isotérmica ou quase isotérmica, como o NASBA. A incubação da reação pode ser realizada em uma incubadora controlada por smartphone.
Etapa 4) Reação livre de células
[00116] O RNA amplificado pode então ser adicionado diretamente às reações livres de células, que conterão sensores projetados para expressar níveis significativos de trealase somente após o reconhecimento do RNA alvo. A trealase irá então catalisar a decomposição da trealose (fornecida na reação) em monômeros de glicose. A incubação da reação pode ser realizada em uma incubadora controlada por smartphone.
Etapa 5) Medidor de glicose
[00117] As reações livres de células podem ser testadas em tiras de glicose, com a expectativa de que amostras positivas produzam um aumento significativo nos níveis de glicose que podem ser lidos por um medidor de glicose.
Etapa 6) Analisar resultados
[00118] Um aplicativo para smartphone pode ser usado para interpretar os dados do medidor de glicose (e, opcionalmente, encaminhar dados para médicos de família ou para programas de vigilância em saúde pública, +/- anonimamente). Opcionalmente, esse é o mesmo aplicativo que controla a incubadora usada nas etapas 3) e 4) Exemplo 7: Extração de ácido nucleico usando Extração por Reciclagem do Papel da Cobertura (ReCap) ou esferas magnéticas.
[00119] Foram realizadas experiências para investigar a captura de ácidos nucleicos de amostras usando papel ou membrana. Zou et al. (2017) (incorporado neste documento por referência) descreveu anteriormente o uso de papel de celulose para purificação de ácidos nucleicos.
[00120] O papel é aderido à cobertura de um tubo e os ácidos nucleicos são capturados no estágio inicial da lise. A cobertura com os ácidos nucleicos capturados é então transferida para um tubo de lavagem que remove quaisquer inibidores potenciais de reações a jusante, que incluem qualquer glicose residual da amostra de sangue. O estágio final envolve a eluição dos ácidos nucleicos em uma reação de amplificação.
[00121] Também foram realizados experimentos para investigar a captura de ácidos nucleicos de amostras usando extração magnética.
Material e Reagentes
[00122] Tampões foram usados em uma concentração final de 1x durante a etapa de lise. Tampões em 4x permitem que mais amostra seja adicionada na etapa de lise. A) - lx tampão de extração 43 Lo Adiciona Volum Reagente Conc. Final Conc. Inicial |r e Final 100% EDTA 5 [mM NA | Joor306 g |50 |mL | INact [100 |mM [NA | 1168 j|jg [50 mt | Cloreto — de Guanidina 1,5 M M 9,375 mL |50 mL Tris pH8 para ajustar o H20 volume 37,625 mi Ps O | B) - 4x tampão de extração nº 3 Lo Volume Reagente Conc. Final Conc. Inicial | Adicionar Final 100% EDTA [20 [mM | Nº | Joz924 /g |50 mL | INact —— Ja400 ÍmM [NA | 1168 g |50 mL | Cloreto — de Guanidina M M 37,5 mL |j50 mL Tris pH8 para ajustar o H20 volume 0,5 mi ds C) - Tampão de Lavagem Lo Volume Reagente Conc. Final Conc. Inicial Adicionar Final 0,10% 100% NFH20 PR 49,45 Po Teaniso ne
Tabela 2: Tampões para ReCap e extração de esferas magnéticas: A) e B) listam diferentes composições de tampão de extração %3 usado para lise. C) lista a composição do tampão de lavagem. Observe que esses tampões são usados para a extração ReCap e a extração baseada em esferas magnéticas. Para extração de RNA, os tampões foram modificados para conter 0,5% v/v inibidor da RNase murina (NEB).
Fabricação de ReCap
[00123] Em vez de utilizar papel como discos de papel soltos ou varetas medidoras, foram utilizados tubos que têm o papel aderido à parte interna da cobertura do tubo. Esse método foi testado usando papel de filtro Whatman e membrana de polietersulfona (PES), utilizando cola quente e cera de parafina para aderir o papel/membrana. Teoricamente, esse método pode ser adotado para qualquer tipo e volume de tubo com uma cobertura (50mL, 15mL, 2mL, 1,5mL, tubos de PCR em tira, etc.)
[00124] As seguintes etapas de protocolo foram usadas:
1. Instale os tubos de lise, lavagem e eluição. Se os tampões contiverem inibidor da RNase |, mantenha os tubos no gelo.
a. Instale o tubo de lise em um tubo de ReCap, adicione o tampão de extração na concentração apropriada para que a concentração final do tampão de extração seja 1x após a adição da sua amostra.
b. No tubo de lavagem, adicione 200 uL de tampão de lavagem Cc. No tubo de eluição, configure uma mistura de reação de amplificação (por exemplo - uma reação de PCR ou uma reação de amplificação de NASBA). Este tubo deve ser mantido em gelo.
2. Lise: a. Em um tubo de ReCap, combine a amostra a ser extraída com tampão de extração para uma concentração final de 1x.
b. Misture invertendo o tubo por 1 minuto.
Cc. Colete qualquer líquido que possa permanecer aderido à tampa batendo levemente no tubo em um balcão.
3. Lavagem a. Transfira a tampa de ReCap para o tubo de lavagem b. Misture invertendo o tubo por 1 minuto
Cc. Colete qualquer líquido que possa permanecer aderido à tampa batendo levemente no tubo em um balcão.
4, Eluição a. Transfira a tampa de ReCap para o tubo de eluição b. Misture invertendo o tubo por 1 minuto.
Cc. Colete qualquer líquido que possa permanecer aderido à tampa batendo levemente no tubo em um balcão.
d. Remova a tampa de ReCap de uma tampa convencional. Isso é importante, pois qualquer reação que exija calor significativo pode derreter o adesivo usado no ReCap.
5. Amplificação a. PCR: Execute reações em um protocolo padrão de PCR. Por exemplo, o ReCap foi testado usando o protocolo NEB Q5 Polimerase, conforme listado na Tabela 3.
b. Reação isotérmica: O ReCap foi testado usando uma reação NASBA conforme listado na Tabela 4.
Reação padrão de PCR Q5 Tampão de reação 5X Q5 10 L potenciador GC 10mM aNTPs 10uM primer fwd 10uM primer rev Polimerase Q5 NF H20 Volume Final |Desnaturação ——= 98 —=————lamin = | 30 ciclos [98 ——15seg — | 30 seg/kb Extensão final [espera “4 —Jespera =| Tabela 3: Protocolo de amplificação por PCR. ul de reação NASBA [ | ComposiçãoFinal
Tampão de reação | 0,335 % 8,38 ul Mistura de Nucleotídeo 0,165 % 4,13 L Inibidor de RNase | 0,005 Primer 1 (500 nM) Primer 2 (500 nM) NF H20 0,035 Mistura de Enzimas 0,25 % 6,25 ul Amplicon de RNA * Lo | volume total a úúa Tabela 4: Protocolo isotérmico NASBA
[00125] As reações de NASBA foram realizadas a 62ºC por 2 minutos, momento em que a mistura de enzimas foi adicionada e a reação foi realizada a 41ºC por 1 hora.
Extração e Amplificação ReCap
[00126] 1070 a 10710 cópias do modelo de DNA do plasmídeo mRFP1 foram adicionadas ao tampão de extração, ligadas ao papel, lavadas e eluídas em 50 uL de reações de PCR. No controle PCR +1070 a 10710 cópias do molde de DNA foram adicionadas diretamente à reação de PCR da polimerase Q5. 5 ul dos produtos de PCR foram executados em um gel de agarose à 1%. Conforme mostrado na Figura 13, o método ReCap é capaz de capturar ácidos nucleicos até o limite de sensibilidade da PCR (1077 cópias de DNA).
[00127] O corante SYBR Verde | foi adicionado às mesmas reações mostradas na Figura 13 e a fluorescência de desfecho foi medida usando um leitor de placas padrão com 0-10710 cópias de MRFP1. Os resultados são mostrados na Figura 14. Como SY BR Verde | é um corante intercalante fluorescente para ds DNA, as Unidades de Fluorescência Relativa (RFUs) podem ser usadas para comparar os rendimentos de dsDNA de diferentes reações de amplificação.
Extração e Amplificação de Esferas Magnéticas
[00128] Como alternativa à extração ReCap, foram realizadas experimentos usando métodos de extração baseados em esferas magnéticas com esferas magnéticas do Kit de extração Genesig Easy DNA/RNA (Tubo 3), juntamente com os tampões (listados na Tabela 2) do método de extração por papel ReCap. As seguintes etapas de protocolo foram usadas:
1. Lise a. Adicione a amostra e tampão de extração a uma concentração final de 1x. Adicione um volume igual de tubo 3 (solução com esferas magnéticas) conforme fornecido no kit.
b. Agite o tubo e aguarde 15 minutos Cc. Magnetize e remova todo o líquido
2. Lavagem a. Adicione 200 uL de tampão de lavagem.
b. Agite o tubo e aguarde 30 segundos Cc. Magnetize e remova todo o líquido.
3. Eluição a. Eluir no volume apropriado de água ou mistura de amplificação.
[00129] Semelhante aos experimentos realizados para o ReCap, 1070- 10710 cópias do plasmídeo mRFP1 foram adicionadas a 50 ul de tampão de extração, ligadas a esferas magnéticas, lavadas e eluídas no tampão de PCR da polimerase Q5. Os produtos da reação foram executados em um gel de agarose a 1%. Conforme mostrado na Figura 15, a extração bem-sucedida usando esferas magnéticas foi vista dentro da faixa de detecção por PCR (1077-10710).
Amplificação isotérmica e reação livre de células
[00130] Os métodos de amplificação usados para amplificar ácidos nucleicos antes da detecção usando um circuito sintético são preferencialmente isotérmicos ou quase isotérmicos (isto é, NASBA). As experiências foram realizadas usando sensores de zika (ver Pardee et al. 2016, incorporados por referência neste documento) para investigar o uso da extração por papel ReCap como NASBA.
[00131] 10710 cópias do RNA trigger 3 do vírus Zika foram adicionadas em 50 uL de tampão de extração, ligadas ao papel, lavadas e eluídas em uma reação NASBA de 25 ul. As reações NASBA foram então adicionadas a uma razão de 1:7 a 1,8 ul de reações livre de células contendo sensores toehold de Zika que produzem a enzima LacZ somente após o reconhecimento do RNA trigger de Zika. A enzima LacZ produzida cliva um substrato (CPRG) para produzir vermelho de clorofenol, que pode ser detectado a 570nM.
[00132] Conforme mostrado na Figura 16, a extração do ReCap é compatível com a amplificação do NASBA e a detecção toehold livre de células.
Exemplo 8: Detecção ambiental de mercúrio usando circuitos biológicos sintéticos
[00133] A detecção mediada por medidor de glicose usando circuitos biológicos sintéticos também pode ser usada para a detecção de analitos ambientais, como metais. Especificamente, os sensores e métodos podem ser usados para monitoramento e remediação ambiental bem como para detecção/prospecção de metais valiosos, como elementos preciosos ou de terras raras.
[00134] Os métodos atuais de detecção de mercúrio ambiental dependem de equipamentos caros, como espectroscopia de absorção atômica (AA), cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e espectroscopia de massa MS para determinar os níveis de contaminação por mercúrio presentes em amostras de água, tecidos e solo.
[00135] Para fins de detecção de mercúrio, as amostras podem incluir amostras de água, tecido e solo. O método de extração depende do tipo de amostra. Por exemplo, para extração com base no solo, é comum uma combinação de métodos de centrifugação e filtragem (ver, por exemplo, Reis et al. 2014). Para extração de mercúrio de amostras de tecido, as amostras podem ser liofilizadas e submetidas a micro-ondas (ver, por exemplo, Hinojosa Reyes et al. 2009)
[00136] Para extração de mercúrio da água, as amostras são mais comumente sujeitas a um método de coagulaçãáo/filtragem.
[00137] Conforme mostrado na Figura 17, as amostras extraídas podem ser testadas com sensores baseados em circuitos de genes que produzem enzima fluorescente verde ou trealase em resposta à presença de mercúrio.
[00138] Os sensores de mercúrio são projetados usando o Promotor Tn21, que é ligado e sequestrado por um repressor MerR na ausência de mercúrio. Uma vez presente o mercúrio, o repressor se desprende e expõe o promotor Tn21, permitindo a transcrição de genes a jusante pela RNA polimerase de E. coli (RNAP). O design do sensor é testado usando o repórter fluorescente GFP antes de acoplar o sistema regulador do gene Tn21-MerR a uma enzima Trealase para uso com um medidor de glicose. A enzima trealase catalisa a decomposição da trealose em monômeros de glicose na presença de mercúrio. Os níveis de glicose produzidos são medidos em tiras de teste de glicose com um medidor de glicose. Opcionalmente, um aplicativo para smartphone auxilia na interpretação dos resultados do medidor de glicose e na análise de dados.
[00139] Todas as publicações, sequências biológicas ou identificadores de sequência, patentes e pedidos de patente são incorporados por referência neste documento na sua totalidade para a mesma extensão como se cada pedido de publicação, sequência biológica, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporada por referência na sua totalidade.
Referências Hinojosa Reyes et al. Robust microwave-assisted extraction protocol for determination of total mercury and methylmercury in fish tissues. Analytica Chimica Acta Volume 631, Edição 2, 12 de janeiro de 2009, páginas 121-128.
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Claims (87)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para gerar glicose em resposta a um analito alvo em uma amostra, o método caracterizado pelo fato de que compreende: contatar a amostra com um circuito biológico sintético em um sistema livre de células, em que o analito alvo ativa o circuito biológico sintético para modificar um nível de glicose dentro de um volume de reação do sistema livre de células.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito alvo ativa o circuito biológico sintético para aumentar o nível de glicose no volume de reação do sistema livre de células.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito alvo ativa o circuito biológico sintético para diminuir o nível de glicose dentro do volume de reação do sistema livre de células
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula inorgânica ou uma molécula orgânica, opcionalmente uma biomolécula.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico, opcionalmente uma molécula de DNA alvo ou uma molécula de RNA alvo.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aumentar a concentração do analito alvo na amostra, antes ou durante o contato da amostra com o circuito biológico sintético.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o aumento da concentração do analito alvo na amostra compreende amplificação isotérmica da molécula de DNA alvo ou da molécula de RNA alvo.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a amplificação da concentração do analito alvo compreende amplificação de deslocamento de fita (SDA), amplificação mediada por loop (LAMP), amplificação dependente de helicase (HDA), Reação de Amplificação de Enzima Nicking (NEAR) ou amplificação da recombinase polimerase (RPA).
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o circuito biológico sintético regula a expressão de uma enzima que modifica o nível de glicose no sistema livre de células, opcionalmente regulando a transcrição ou tradução da enzima.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o circuito biológico sintético regula o nível ou a atividade de uma enzima que modifica o nível de glicose no sistema livre de células, opcionalmente por regulação pós-translacional da enzima.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o circuito biológico sintético é um circuito de gene.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o circuito de gene compreende uma molécula de DNA compreendendo um promotor operavelmente ligado a um ácido nucleico codificando uma ou mais enzimas cuja expressão modifica o nível de glicose no sistema livre de células.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o circuito de gene regula a transcrição da molécula de DNA codificando as uma ou mais enzimas ou a tradução de uma ou mais moléculas de MRNA codificando as uma ou mais enzimas.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois circuitos biológicos sintéticos regulam a expressão de pelo menos duas enzimas que modificam o nível de glicose, opcionalmente em que as duas enzimas modificam o nível de glicose a taxas diferentes.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que o circuito de gene compreende um ou mais ativadores transcricionais ou repressores transcricionais.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que o circuito de gene compreende um riborregulador que controla a tradução de um mRNA codificando a enzima.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o riborregulador é um comutador toehold e a molécula de ácido nucleico alvo é um gatilho para o comutador toehold, de modo que a ligação da molécula de ácido nucleico alvo ao comutador toehold permita tradução do mRNA codificando a enzima no circuito de gene.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células compreende glicose ou um substrato que é acionado pela enzima para gerar glicose, opcionalmente em que o substrato compreende um oligossacarídeo ou polissacarídeo compreendendo um ou mais monômeros de glicose.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que:
i) o substrato é trealose e a enzima é trealase; ii) o substrato é maltose e a enzima é maltase; iii) o substrato é celobiose e a enzima é celobiase; iv) o substrato é amido e a enzima é amilase; v) o substrato é lactose e a enzima é lactase (beta-galactosidase); vi) o substrato é sacarose e a enzima é invertase ou sacarase; vii) o substrato é glicose e a enzima é glicose desidrogenase; ou viii) o substrato é glicose-6-fosfato e a enzima é glicose 6-fosfatase.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico associada a um patógeno microbiano, opcionalmente um vírus ou uma bactéria.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é um biomarcador associado a um fenótipo, opcionalmente em que a amostra é de um sujeito e a presença do biomarcador na amostra é indicativa do fenótipo no sujeito.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico associada à resistência a droga microbiana.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é um metal, material explosivo, poluente, proteína e/ou toxina.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a amostra é um fluido biológico, opcionalmente sangue, urina ou saliva.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra ambiental, opcionalmente uma amostra de água.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que compreende ainda tratar a amostra antes de contatar a amostra com o circuito biológico sintético no sistema livre de células.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o tratamento da amostra compreende diluir a amostra, opcionalmente em que a diluição da amostra normaliza ou abaixa a concentração de glicose.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o tratamento da amostra compreende purificar a amostra e/ou concentrar a amostra para aumentar a concentração relativa do analito alvo.
29. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o tratamento da amostra compreende um tratamento térmico, opcionalmente aquecendo a amostra para lisar células.
30. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento da amostra para remover e/ou sequestrar glicose endógena e/ou açúcares de sangue na amostra.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a amostra com glicose desidrogenase (GDH) e NAD para remover glicose e/ou açúcares de sangue, opcionalmente uma quantidade predeterminada de GDH e/ou NAD.
32. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende o uso de lectinas para sequestrar glicose e/ou açúcares de sangue na amostra.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar a amostra a um diluente ou tampão antes de contatar a amostra com o circuito biológico sintético em um sistema livre de células.
34. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o diluente ou tampão compreende água e/ou um surfactante livre de nuclease, opcionalmente Tween-20, opcionalmente a uma concentração inferior a 0,02%, cerca de 0,0125% ou entre 0,010% e 0,015%.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células compreende o circuito biológico sintético, enzimas para transcrição e tradução, ribossomos, dNTPs, tRNAs e aminoácidos.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células compreende ainda um inibidor de RNAse, um tampão, um ou mais cofatores, um crioprotetor e/ou um surfactante, opcionalmente Tween-20.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células compreende um substrato para uma enzima cuja expressão e/ou atividade é regulada pelo circuito biológico sintético.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células é liofiizado e reidratado por contato com a amostra e/ou um tampão de reação.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende ainda detectar glicose no volume de reação do sistema livre de células, desse modo detectando o analito alvo na amostra.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que compreende detectar um nível de glicose no volume de reação do sistema livre de células, desse modo quantificando um nível do analito alvo na amostra.
41. Método, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que compreende detectar glicose no volume de reação do sistema livre de células após contatar a amostra com o circuito biológico sintético por um período de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 , 40 ou 45 minutos.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar um tampão ao volume de reação do sistema livre de células antes de detectar glicose, opcionalmente em que a composição do tampão compreende NaCl 0,1 M, fosfato de sódio 0,1 M, Tween-20 0,05% e tem um pH de cerca de 7,3.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 42, caracterizado pelo fato de que compreende detectar glicose no volume de reação do sistema livre de células usando um medidor de glicose, opcionalmente usando uma tira de teste de glicose.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a tira de teste de glicose gera um sinal elétrico em um eletrodo no medidor de glicose, opcionalmente usando glicose desidrogenase e ferricianeto.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a amostra com uma pluralidade de circuitos biológicos sintéticos em um sistema livre de células, em que um analito alvo diferente ativa cada circuito biológico sintético para gerar glicose.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que cada um da pluralidade de circuitos biológicos sintéticos gera glicose usando um substrato e enzima diferentes.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a detecção da taxa e/ou do nível de glicose gerada pela pluralidade de circuitos biológicos sintéticos no sistema livre de células permite a detecção multiplexada de uma pluralidade de diferentes analitos alvo.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que compreende comparar o nível de glicose detectado no volume de reação do sistema livre de células com um ou mais níveis de controle indicativos de um nível do analito alvo em uma amostra de controle.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que compreende comparar o nível de glicose detectado no volume de reação do sistema livre de células com um ou mais níveis de controle, em que cada nível de controle é indicativo da presença ou ausência de um ou mais analitos alvo na amostra.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que compreende ainda apresentar dados indicativos da presença ou ausência de um ou mais analitos alvo na amostra para um usuário, opcionalmente em que os dados são indicativos do nível dos um ou mais analitos alvo na amostra.
51. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um sistema livre de células compreendendo um circuito biológico sintético que gera ou consome glicose em resposta a um analito alvo em uma amostra.
52. Kit, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente para receber a amostra e contatar a amostra com o sistema livre de células.
53. Kit, de acordo com a reivindicação 51 ou 52, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula inorgânica ou uma molécula orgânica, opcionalmente uma biomolécula.
54. Kit, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico, opcionalmente uma molécula de DNA alvo ou uma molécula de RNA alvo.
55. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 54, caracterizado pelo fato de que compreende reagentes para aumentar a concentração do analito alvo na amostra.
56. Kit, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico e os reagentes compreendem reagentes para amplificação isotérmica da molécula de ácido nucleico.
57. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 56, caracterizado pelo fato de que o circuito biológico sintético é um circuito de gene.
58. Kit, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o circuito de gene compreende uma molécula de DNA compreendendo um promotor operavelmente ligado a um ácido nucleico codificando uma ou mais enzimas cuja expressão gera ou consome glicose no sistema livre de células.
59. Kit, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o circuito de gene compreende um riborregulador que controla a tradução de um mMRNA codificando a enzima.
60. Kit, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o riborregulador é um comutador toehold e a molécula de ácido nucleico alvo é um gatilho para o comutador toehold, de modo que a ligação da molécula de ácido nucleico alvo ao comutador toehold permita tradução do MRNA codificando a enzima no circuito de gene.
61. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 60, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células compreende glicose ou um substrato que é acionado pela enzima para gerar glicose, opcionalmente em que o substrato compreende um oligossacarídeo ou polissacarídeo compreendendo um ou mais monômeros de glicose.
62. Kit, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que: i) o substrato é trealose e a enzima é trealase; ii) o substrato é maltose e a enzima é maltase; iii) o substrato é celobiose e a enzima é celobiase; iv) o substrato é amido e a enzima é amilase; v) o substrato é lactose e a enzima é lactase (beta-galactosidase); vi) o substrato é sacarose e a enzima é invertase; vii) o substrato é glicose e a enzima é glicose desidrogenase; ou viii) o substrato é glicose-6-fosfato e a enzima é glicose 6-fosfatase.
63. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 62, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico associada a um patógeno microbiano, opcionalmente um vírus ou uma bactéria e o kit é para a detecção do patógeno microbiano.
64. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 62, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é um biomarcador associado a um fenótipo, opcionalmente em que a amostra é de um sujeito e a presença do biomarcador na amostra é indicativa do fenótipo no sujeito.
65. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 62, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico associada à resistência a droga microbiana.
66. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 62, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é um metal, material explosivo, poluente, proteína e/ou toxina.
67. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 66, caracterizado pelo fato de que compreende ainda reagentes para tratar a amostra para remover e/ou sequestrar glicose endógena e/ou açúcares de sangue na amostra.
68. Kit, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que os reagentes compreendem glicose desidrogenase (GDH) e NAD.
69. Kit, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que os reagentes compreendem lectinas para sequestrar glicose e/ou açúcares de sangue na amostra.
70. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 69, caracterizado pelo fato de que compreende um diluente ou tampão para misturar com a amostra.
71. Kit, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o diluente ou tampão compreende água e/ou um surfactante livre de nuclease, opcionalmente Tween-20.
72. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 71, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células compreende o circuito biológico sintético, enzimas para transcrição e tradução, ribossomos, dNTPs, tRNAs e aminoácidos.
73. Kit, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células compreende ainda um inibidor de RNAse, um tampão, um ou mais cofatores, um crioprotetor e/ou um surfactante, opcionalmente Tween-20.
74. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 73, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células compreende um substrato para uma enzima cuja expressão e/ou atividade é regulada pelo circuito biológico sintético.
75. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 74, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células é liofilizado.
76. Kit, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o sistema livre de células está contido em uma tampa do recipiente.
77. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 76, caracterizado pelo fato de que o recipiente é adaptado para receber uma tira de teste de glicose.
78. Kit, de acordo com as reivindicações 51 a 77, caracterizado pelo fatoa de que é para realizar o método de qualquer uma das reivindicações 1 a 50.
79. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 78, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um medidor de glicose para detectar glicose gerada pelo circuito biológico sintético no sistema livre de células.
80. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 79, caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de circuitos biológicos sintéticos que geram ou consomem glicose em resposta a uma pluralidade de analitos alvo diferentes na amostra.
81. Kit, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que cada um da pluralidade de circuitos biológicos sintéticos gera glicose usando um substrato e enzima diferentes.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é uma molécula de ácido nucleico e o método compreende ainda extrair a molécula de ácido nucleico antes de contatar a amostra com o circuito biológico sintético.
83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a extração da molécula de ácido nucleico compreende contatar a amostra com um substrato para capturar o analito alvo, opcionalmente um substrato de papel, um substrato de membrana ou contas magnéticas.
84. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 81, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um substrato para capturar o analito alvo.
85. Kit, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o substrato é um substrato de papel ou um substrato de membrana, opcionalmente em que o substrato compreende celulose.
86. Kit, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um recipiente para receber uma amostra, em que o recipiente compreende uma tampa removível e o substrato é fixado à tampa removível.
87. Kit, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o kit compreende uma pluralidade de recipientes e a tampa removível é configurada para caber na pluralidade de recipientes.
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