JP2021506315A - 無細胞系にグルコースメーターを用いて標的分析物を検出する合成生物学的回路 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年12月22日に出願された米国仮特許出願第62/609,525号の優先権の利益を主張するものであり、上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、標的分析物を検出する製品および方法、より具体的には、グルコースを産生または消費する合成生物学的回路を用いて標的分析物を検出する製品および方法に関する。
この説明は、無細胞系の標的分析物を検出する合成生物学的回路を提供する。実施例で示すように、記載される合成生物学的回路の使用により、グルコースモニターおよび試験紙などの容易に入手可能なセンサーおよび試薬を用いて標的分析物を検出することが可能になる。本明細書に記載される実施形態を用いて、容易に様々な合成生物学的回路を生じさせ、様々な標的分析物の検出を可能にできる。例えば、リボレギュレーター、例えば標的核酸配列に応答してレポーター酵素の発現を制御する足がかり配列スイッチなどを用いて、標的RNAまたはDNA配列を検出できる。レポーター酵素の発現が基質のレベルを修飾し、次いで、これを無細胞反応体積中に検出する。好ましい実施形態では、レポーター酵素が無細胞反応体積中のグルコースのレベルを修飾し、グルコースモニターおよび/またはグルコース試験紙を用いて標的分析物を検出することが可能になる。
合成生物学的回路を用いて、無細胞反応で標的分析物に応答してグルコースが生成することを示すため、一連の実験を実施した。いずれの実験でも、市販の血糖メーターおよび付属の試験紙(Bayer Contour Blood Glucose Monitoring System)を用いてグルコースを検出した。
TAATACGACTCACTATAGGGATCTATTACTACTTACCATTGTCTTGCTCTATACAGAAACAGAGGAGATATAGAATGAGACAATGGAACCTGGCGGCAGCGCAAAAGATGCGTAAAGATTATAAAGATGATGATGATAAAGGACATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCGAGAACCTGTACTTCCAATCCTCTGGAGGTGGGGGTTCTGGAACAGCGGTACGGATAGATTATGCAAGCGGGTTAACTGATCGCGAAAACTCTATGTTCAAAGAAATCCAGTTGTCAGGCGTTTTTGCCGATTCAAAAACCTTTGTGGATAGCCATCCCAAATTGCCCCTGGCGGAAATCGCCGAGCTTTACCATGTCCGGCAACAGCAGGCGGGTTTTGACCTCGCCGCTTTTGTTCACCGGTATTTTGAGCTGCCGCCGAGCATTGCCTCCGGTTTTGTCAGCGATACCTCGCGCCCGGTGGAAAAGCATATCGACATTCTCTGGGATGTGCTCACCCGCCAACCGGACAGGCAGGAGGCGGGAACCCTGCTGCCCTTACCTTACCCCTATGTCGTTCCCGGCGGCCGCTTCCGCGAAATTTACTACTGGGACAGCTATTTCACCATGCTCGGTTTGCAGGCATCGAAGCGCTGGGATCTGATGGAGGGTATGGTGAATAATTTTTCACACCTGATCGACACCATCGGCTTTATTCCCAACGGCAATCGCACCTATTACGAGGGCCGCTCCCAGCCGCCTTTTTACGCCCTGATGGTGGAGTTGCTGGCCAATAAACAGGGTGAGTCGGTGCTGCTCGCGCATTTGCCGCATTTGCGCAGGGAATATGAATTCTGGATGGAGGGCGCCGCTAAACTTTCGCCCGCTGCACCCGCGCATCGCCGTGTGGTGCTGCTGCCGGATGGCAGCATACTCAATCGCTACTGGGATGATATAGCCGCGCCGCGCCCGGAATCCTTCCGCGAAGACTACGAACTGGCGGAAGCCATCGGCGGCAACAAGCGCGAGCTGTACCGCCATATTCGCGCGGCGGCAGAATCCGGCTGGGACTTCAGCAGCCGCTGGTTCAAAGATGGCAATGGCATGGCCAGCATCCACACCACCGATATTATCCCGGTGGATTTGAATGCGCTGGTCTTTAACCTGGAGCGGATGCTGGCCCATATTTATGGCTTGCAGGGCGACCAGGATCAGGCCACGCATTACTACCAATTGGCGGAGCAGCGCAAACAGGCGTTGCTGCGCTACTGTTGGAATGCGCAGCAGGGATTTTTCCACGATTACGATTATGTCGCCGCACAACAGACGCCGGTCATGTCGCTGGCGGCGGTTTACCCGCTTTATTTCAGTATGGTCGACCAGCGCACGGGCGACCGGGTCGCCGAACAGATAGAGGCGCATTTTATCCAGGCGGGCGGTGTGACCACGACCCTGGCGACCACAGGCCAGCAGTGGGACGCGCCCAATGGCTGGGCGCCGCTGCAATGGCTGACCATCCAGGGCCTGCGCAATTATCACCACAATTCAGCGGCGGAGCAGATCAAACAGCGCTGGATTGCACTCAACCAGCGCGTTTACCGCAACACCGGAAAGTTGGTGGAAAAATACAACGTCTATGACCTGGATGTGGCCGGCGGCGGTGGCGAATATGAATTACAGGATGGCTTCGGTTGGACCAACGGTGTCTTGTTGCACTTACTCAACGAAAGTACACCCTAA(配列番号1)。
GGGUGAUGGGACAUUCCGAUGUCCCAUCAAUAAGAGCAAGACAAUGGUAAGUAGUAAUAGAUAAG(配列番号2)
によって活性化される。
表1に示すように、ラクターゼ発現を制御する足がかり配列スイッチを用いた反応テンプレートに従い、一連の無細胞反応を組み立てた。
TAATACGACTCACTATAGGGAGTTTGATTACATTGTCGTTTAGTTTAGTGATACATAAACAGAGGAGATATCACATGACTAAACGAAACCTGGCGGCAGCGCAAAAGATGCGTAAAATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAA(配列番号3)。
GGGACAGAUCCACUGAGGCGUGGAUCUGUGAACACUAAACUAAACGACAAUGUAAUCAAACUAAC(配列番号4)
によって活性化される。
2つの異なる足がかり配列スイッチを含有する共通の反応混合物を組み立て、レプリケートに等分した。次いで、最初の組の三重反復反応をトリガーを加えずにインキュベートし、データをバックグラウンドシグナルに対して正規化するのに用いた。図10Aに示されるように、次の組の三重反復反応にトリガーE RNAを加えたところ、グルコースがわずかであるが、有意に増大した。三組目の三重反復反応にトリガーG RNAを加えたところ、さらに大きく明確な量のグルコースが産生された。
チフス、パラチフスA、およびパラチフスB由来のRNA配列を検出する足がかり配列スイッチをそれぞれ設計した。いずれの足がかり配列スイッチも、グルコースを生成するトレハラーゼ酵素の産生を活性化するよう構成した。図11に、スイッチDNA濃度および基質を最適化して、発生シグナルを増強し差を分かりやすくする前の予備データを示すが、3つのいずれの場合にも明白な増大がみられる。図11に示されるデータは、各反応に足がかり配列スイッチが1つだけ存在するものであったため、多重化実験ではない。値は、標的が存在しない対照反応を測定することによって求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。試料を37℃で1時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。
図12に、グルコースメーターが介在する例示的診断ワークフロー(これに限定されない)を示す。提案するワークフローの全般的過程は、段階1−試料採取、段階2−RNA抽出、段階3−等温増幅、段階4−標的RNAの存在下でグルコースを産生する標的特異的センサーと組み合わせた無細胞反応、段階5−グルコースメーターでの試料分析、および段階6−特注ソフトウェアでの結果の解釈の6段階に従う。本明細書に記載される方法の好ましい実施形態は、図12に示す段階のうち1つまたは複数のものを含み得るものであり、諸段階の任意選択の詳細については以下に示す。
試料は患者血液試料またはその他の生体試料であり得る。
a)紙による抽出またはb)磁気ビーズ抽出などの様々なRNA抽出方法を用いることができる。
検出しようとする標的が最初の試料中に低濃度で存在する場合、標的RNAをセンサーに適合するレベルまで増幅することが必要となり得る。これは、NASBAなどの等温増幅法またはほぼ等温の増幅方法を用いて実施する。スマートフォンで制御する恒温器内で反応インキュベーションを実施し得る。
次いで、増幅したRNAを直接、標的RNAが認識されたときだけ有意水準のトレハラーゼを発現するよう設計したセンサーを含有する無細胞反応に加え得る。次いで、トレハラーゼが(反応に添加した)トレハロースからグルコースモノマーへの分解を触媒する。スマートフォンで制御する恒温器内で反応インキュベーションを実施し得る。
次いで、無細胞反応をグルコース試験紙で試験してよく、陽性試料であれば、グルコースメーターによる読取りが可能なグルコースレベルの有意な上昇がみられることが予想される。
スマートフォンアプリを用いてグルコースメーターのデータを解釈し(任意選択で、家庭医または公衆衛生監視プログラムに+/−匿名で転送し)得る。これは任意選択で、段階3)および4)で使用する恒温器を制御するものと同じアプリである。
紙または膜を用いて試料から核酸を捕捉することを検討する実験を実施した。Zouら(2017)(参照により本明細書に組み込まれる)は既に、核酸精製へのセルロース紙の使用について記載している。
溶解段階では、緩衝液を最終濃度1×で使用した。4×緩衝液では、溶解段階でさらに多くの試料を加えることが可能になる。
ばらけた紙ディスクまたは試験紙の形で紙を用いる代わりに、キャップの内側に紙を接着させたチューブを用いた。Whatmanフィルター紙およびポリエーテルスルホン(PES)膜の両方を用いてこの方法を試験し、紙/膜を接着させるのにともに熱接着剤およびパラフィンロウを用いた。この方法は理論的には、キャップを有する任意のタイプおよび容積のチューブ(50mL、15mL、2mL、1.5mL、ストリップPCRチューブなど)に取り入れることができる。
1.溶解、洗浄、および溶出チューブを準備する。緩衝液がRNアーゼI阻害剤を含有する場合、チューブを氷上に保持する。
a.ReCapチューブ内に溶解チューブを設置し、試料添加後に抽出緩衝液の最終濃度が1×になるよう抽出緩衝液を適切な濃度で加える。
b.洗浄チューブに洗浄緩衝液200μLを加える
c.溶出チューブに増幅反応混合物(例えば、PCR反応またはNASBA増幅反応)を設置する。このチューブは氷上に保持するべきである。
2.溶解:
a.ReCapチューブ内で、抽出する試料と抽出緩衝液とを混合して最終濃度を1×にする。
b.1分間、チューブを反転させることによってかき混ぜる。
c.台の上でチューブを穏やかにタップすることにより、蓋に付着していると思われる液体を集める。
3.洗浄
a.ReCapの蓋を洗浄チューブに移す
b.1分間、チューブを反転させることによってかき混ぜる
c.台の上でチューブを穏やかにタップすることにより、蓋に付着していると思われる液体を集める。
4.溶出
a.ReCapの蓋を溶出チューブに移す
b.1分間、チューブを反転させることによってかき混ぜる。
c.台の上でチューブを穏やかにタップすることにより、蓋に付着していると思われる液体を集める。
d.ReCapの蓋を取り外して通常の蓋にする。相当量の熱を必要とする反応によりReCapで使用する接着剤が溶ける可能性があることから、このことは重要である。
5.増幅
a.PCR:標準的PCRプロトコルで反応を実施する。例えば、表3に挙げるNEB Q5ポリメラーゼプロトコルを用いてReCapをアッセイした。
b.等温反応:表4に挙げるNASBA反応を用いてReCapをアッセイした。
100〜1010コピーのmRFP1プラスミドDNA鋳型を抽出緩衝液に添加し、紙に結合させ、洗浄し、50μLのPCR反応中に溶出させた。PCR+対照では、100〜1010コピーのDNA鋳型をQ5ポリメラーゼPCR反応に直接加えた。PCR産物5μLを1%アガロースゲル上で泳動した。図13に示すように、ReCap法では、PCRの感度限界(DNA 107コピー)まで核酸を捕捉することができる。
ReCap抽出に代わる方法として、磁気ビーズによる抽出方法を用い、ReCap紙抽出法の緩衝液(表2に挙げたもの)とともにGenesig Easy DNA/RNA Extractionキットの磁気ビーズ(Tube 3)で実験を実施した。以下のプロトコル段階を用いた:
1.溶解
a.試料および抽出緩衝液を最終濃度1×まで加える。キットに提供されているTube 3(磁気ビーズを含む溶液)を等体積だけ加える。
b.チューブを振盪し、15分間待つ
c.磁化し、液体を全部除去する
2.洗浄
a.洗浄緩衝液200μLを加える。
b.チューブを振盪し、30秒間待つ
c.磁化し、液体を全部除去する。
3.溶出
a.適切な体積の水または増幅混合物中で溶出させる。
合成回路を用いて検出する前に核酸を増幅するのに用いる増幅方法は、等温性またはほぼ等温性のもの(すなわち、NASBA)であるのが好ましい。ReCap紙抽出をNASBAとともに用いることを検討するため、Zikaセンサー(参照により本明細書に組み込まれるPardeeら、2016を参照されたい)を用いて実験を実施した。
グルコースメーターが介在し、合成生物学的回路を用いる検知を金属などの環境分析物の検出に用いてもよい。具体的には、このセンサーおよび方法を環境の監視および改善のほかにも、貴元素または希土類元素などの有価金属の検出/探査に用い得る。
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Claims (87)
- 試料中の標的分析物に応答してグルコースを生成する方法であって、
前記試料と無細胞系の合成生物学的回路とを接触させることを含み、
前記標的分析物が、前記合成生物学的回路を活性化して、無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを修飾する、
方法。 - 前記標的分析物が、前記合成生物学的回路を活性化して、前記無細胞系反応体積中の前記グルコースのレベルを上昇させる、請求項1に記載の方法。
- 前記標的分析物が、前記合成生物学的回路を活性化して、前記無細胞系反応体積中の前記グルコースのレベルを低下させる、請求項1に記載の方法。
- 前記標的分析物が、無機分子または有機分子、任意選択で生体分子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的分析物が、核酸分子、任意選択で標的DNA分子または標的RNA分子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料と前記合成生物学的回路との接触前または接触時に、前記試料中の前記標的分析物の濃度を増大させることをさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中の前記標的分析物の濃度を増大させることが、前記標的DNA分子または前記標的RNA分子の等温増幅を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記標的分析物の濃度を増幅することが、鎖置換増幅(SDA)、ループ媒介増幅(LAMP)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ニッキング酵素増幅反応(NEAR)、またはリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記合成生物学的回路が、前記無細胞系の前記グルコースのレベルを修飾する酵素の発現を、任意選択で前記酵素の転写または翻訳を調節することによって調節する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記合成生物学的回路が、前記無細胞系の前記グルコースのレベルを修飾する酵素のレベルまたは活性を、任意選択で前記酵素の翻訳後調節によって調節する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記合成生物学的回路が遺伝子回路である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子回路が、発現が前記無細胞系の前記グルコースのレベルを修飾する1つまたは複数の酵素をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含むDNA分子を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子回路が、前記1つもしくは複数の酵素をコードする前記DNA分子の転写、または前記1つもしくは複数の酵素をコードする1つもしくは複数のmRNA分子の翻訳を調節する、請求項11に記載の方法。
- 少なくとも2つの合成生物学的回路が、前記グルコースのレベルを修飾する少なくとも2つの酵素の発現を調節し、任意選択で、前記2つの酵素が、異なる速度で前記グルコースのレベルを修飾する、請求項9〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子回路が、1つまたは複数の転写活性化因子または転写抑制因子を含む、請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子回路が、前記酵素をコードするmRNAの翻訳を制御するリボレギュレーターを含む、請求項11〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リボレギュレーターが足がかり配列スイッチであり、前記標的核酸分子が前記足がかり配列スイッチのトリガーであるため、前記標的核酸分子と前記足がかり配列スイッチが結合すると、前記遺伝子回路内の前記酵素をコードする前記mRNAが翻訳される、請求項16に記載の方法。
- 前記無細胞系が、グルコース、または前記酵素が作用してグルコースを生成する基質を含み、任意選択で、前記基質が、1つまたは複数のグルコースモノマーを含むオリゴ糖または多糖を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- i)前記基質がトレハロースであり、前記酵素がトレハラーゼである;
ii)前記基質がマルトースであり、前記酵素がマルターゼである;
iii)前記基質がセロビオースであり、前記酵素がセロビアーゼである;
iv)前記基質がデンプンであり、前記酵素がアミラーゼである;
v)前記基質がラクトースであり、前記酵素がラクターゼ(β−ガラクトシダーゼ)である;
vi)前記基質がスクロースであり、前記酵素がインベルターゼもしくはスクラーゼである;
vii)前記基質がグルコースであり、前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである;または
viii)前記基質がグルコース−6−リン酸であり、前記酵素がグルコース6−ホスファターゼである、
請求項18に記載の方法。 - 前記標的分析物が、微生物病原体、任意選択でウイルスまたは細菌に関連する核酸分子である、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的分析物が、表現型に関連するバイオマーカーであり、任意選択で、前記試料が対象由来のものであり、前記試料中の前記バイオマーカーの存在が、前記対象の前記表現型を示す、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的分析物が、微生物の薬物耐性に関連する核酸分子である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的分析物が、金属、爆発物、汚染物質、タンパク質、および/または毒素である、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が、体液、任意選択で、血液、尿、または唾液である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が、環境試料、任意選択で水試料である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料と前記無細胞系の前記合成生物学的回路とを接触させる前に前記試料を処理することをさらに含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料を処理することが、前記試料を希釈することを含み、任意選択で、前記試料を希釈することが、グルコースの濃度を正常化または低下させる、請求項26に記載の方法。
- 前記試料を処理することが、前記試料を精製し、かつ/または前記試料を濃縮して、前記標的分析物の相対濃度を増大させることを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記試料を処理することが、熱処理、任意選択で、前記試料を加熱して細胞を溶解させることを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記試料を処理して、前記試料中の内因性グルコースおよび/または血糖を除去および/または隔離することを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記試料とグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)およびNADとを接触させて、グルコースおよび/または血糖を除去すること、任意選択で所定量のGDHおよび/またはNADを含む、請求項30に記載の方法。
- レクチンを用いて前記試料中のグルコースおよび/または血糖を隔離することを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記試料と無細胞系の前記合成生物学的回路とを接触させる前に、前記試料を希釈液または緩衝液に加えることを含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記希釈液または緩衝液が、無ヌクレアーゼ水および/または界面活性剤、任意選択でTween−20を、任意選択で0.02%未満、約0.0125%、または0.010%〜0.015%の濃度で含む、請求項25に記載の方法。
- 前記無細胞系が、前記合成生物学的回路と、転写および翻訳のための酵素と、リボソームと、dNTPと、tRNAと、アミノ酸とを含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記無細胞系が、RNアーゼ阻害剤、緩衝剤、1つもしくは複数の補因子、凍結保護物質、および/または界面活性剤、任意選択でTween−20をさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 前記無細胞系が、発現および/または活性が前記合成生物学的回路によって調節される酵素に対する基質を含む、請求項35または36に記載の方法。
- 前記無細胞系を凍結乾燥させ、前記試料および/または反応緩衝液との接触によって再水和する、請求項35〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記無細胞系反応体積中のグルコースを検出し、それにより、前記試料中の前記標的分析物を検出することをさらに含む、請求項1〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを検出し、それにより、前記試料中の前記標的分析物のレベルを定量化することを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記試料を少なくとも5分間、10分間、15分間、20分間、25分間、30分間、35分間、40分間、または45分間にわたって、前記合成生物学的回路と接触させた後、前記無細胞系反応体積中のグルコースを検出することを含む、請求項39または40に記載の方法。
- グルコースを検出する前に前記無細胞系反応体積に緩衝液を添加することをさらに含み、任意選択で、前記緩衝液が、0.1M NaCl、0.1Mリン酸ナトリウム、0.05%Tween−20を含み、pHが約7.3である、請求項39〜41のいずれか1項に記載の方法。
- グルコースメーターを用いて、任意選択でグルコース試験紙を用いて、前記無細胞系反応体積中のグルコースを検出することを含む、請求項39〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記グルコース試験紙が、任意選択でグルコースデヒドロゲナーゼおよびフェリシアン化物を用いて、前記グルコースメーターの電極上で電気シグナルを発生させる、請求項43に記載の方法。
- 前記試料と無細胞系の複数の合成生物学的回路とを接触させることを含み、異なる標的分析物が各合成生物学的回路を活性化してグルコースを生じさせる、請求項1〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の合成生物学的回路のそれぞれが、異なる基質と酵素を用いてグルコースを生成する、請求項45に記載の方法。
- 前記無細胞系の前記複数の合成生物学的回路によって生成されるグルコースの速度および/またはレベルを検出することによって、複数の異なる標的分析物の多重検出が可能になる、請求項46に記載の方法。
- 前記無細胞系反応体積中に検出された前記グルコースのレベルを、対照試料中の前記標的分析物のレベルを示す1つまたは複数の対照レベルと比較することを含む、請求項45〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記無細胞系反応体積中に検出された前記グルコースのレベルを1つまたは複数の対照レベルと比較することを含み、各対照レベルが、前記試料中の1つまたは複数の前記標的分析物の有無を示すものである、請求項45〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中の1つまたは複数の標的分析物の有無を示すデータを使用者に提示することをさらに含み、任意選択で、前記データが、前記試料中の前記1つまたは複数の標的分析物のレベルを示すものである、請求項1〜49のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中の標的分析物に応答してグルコースを生成または消費する合成生物学的回路を含む無細胞系を含む、キット。
- 前記試料を入れ、前記試料と前記無細胞系とを接触させる容器を含む、請求項51に記載のキット。
- 前記標的分析物が、無機分子または有機分子、任意選択で生体分子である、請求項51または52に記載のキット。
- 前記標的分析物が、核酸分子、任意選択で標的DNA分子または標的RNA分子である、請求項53に記載のキット。
- 前記試料中の前記標的分析物の濃度を増大させる試薬を含む、請求項51〜54のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的分析物が核酸分子であり、前記試薬が、前記核酸分子を等温増幅する試薬を含む、請求項55に記載のキット。
- 前記合成生物学的回路が遺伝子回路である、請求項51〜56のいずれか1項に記載のキット。
- 前記遺伝子回路が、発現が前記無細胞系のグルコースを生成または消費する1つまたは複数の酵素をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含むDNA分子を含む、請求項57に記載のキット。
- 前記遺伝子回路が、前記酵素をコードするmRNAの翻訳を制御するリボレギュレーターを含む、請求項58に記載のキット。
- 前記リボレギュレーターが足がかり配列スイッチであり、前記標的核酸分子が、前記足がかり配列スイッチのトリガーであるため、前記標的核酸分子と前記足がかり配列スイッチが結合すると、前記遺伝子回路内の前記酵素をコードする前記mRNAが翻訳される、請求項59に記載のキット。
- 前記無細胞系が、グルコース、または前記酵素が作用してグルコースを生成する基質を含み、任意選択で、前記基質が、1つまたは複数のグルコースモノマーを含むオリゴ糖または多糖を含む、請求項51〜60のいずれか1項に記載のキット。
- i)前記基質がトレハロースであり、前記酵素がトレハラーゼである;
ii)前記基質がマルトースであり、前記酵素がマルターゼである;
iii)前記基質がセロビオースであり、前記酵素がセロビアーゼである;
iv)前記基質がデンプンであり、前記酵素がアミラーゼである;
v)前記基質がラクトースであり、前記酵素がラクターゼ(β−ガラクトシダーゼ)である;
vi)前記基質がスクロースであり、前記酵素がインベルターゼである;
vii)前記基質がグルコースであり、前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである;または
viii)前記基質がグルコース−6−リン酸であり、前記酵素がグルコース6−ホスファターゼである、
請求項61に記載のキット。 - 前記標的分析物が、微生物病原体、任意選択でウイルスまたは細菌に関連する核酸分子であり、前記キットが、前記微生物病原体を検出するためのものである、請求項51〜62のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的分析物が、表現型に関連するバイオマーカーであり、任意選択で、前記試料が対象由来のものであり、前記試料中の前記バイオマーカーの存在が、前記対象の前記表現型を示す、請求項51〜62のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的分析物が、微生物の薬物耐性に関連する核酸分子である、請求項51〜62のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的分析物が、金属、爆発物、汚染物質、タンパク質、および/または毒素である、請求項51〜62のいずれか1項に記載のキット。
- 前記試料を処理して前記試料中の内因性グルコースおよび/または血糖を除去および/または隔離する試薬をさらに含む、請求項51〜66のいずれか1項に記載のキット。
- 前記試薬が、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)とNADとを含む、請求項67に記載のキット。
- 前記試薬が、前記試料中のグルコースおよび/または血糖を隔離するレクチンを含む、請求項67に記載のキット。
- 前記試料と混合する希釈液または緩衝液を含む、請求項51〜69のいずれか1項に記載のキット。
- 前記希釈液または緩衝液が、無ヌクレアーゼ水および/または界面活性剤、任意選択でTween−20を含む、請求項70に記載のキット。
- 前記無細胞系が、合成生物学的回路と、転写および翻訳のための酵素と、リボソームと、dNTPと、tRNAと、アミノ酸とを含む、請求項51〜71のいずれか1項に記載のキット。
- 前記無細胞系が、RNアーゼ阻害剤、緩衝剤、1つもしくは複数の補因子、凍結保護物質、および/または界面活性剤、任意選択でTween−20をさらに含む、請求項72に記載のキット。
- 前記無細胞系が、発現および/または活性が前記合成生物学的回路によって調節される酵素に対する基質を含む、請求項51〜73のいずれか1項に記載のキット。
- 前記無細胞系が凍結乾燥されている、請求項51〜74のいずれか1項に記載のキット。
- 前記無細胞系が、前記容器の蓋の中に含まれている、請求項75に記載のキット。
- 前記容器が、グルコース試験紙を入れるのに適合している、請求項51〜76のいずれか1項に記載のキット。
- 請求項1〜50のいずれか1項に記載の方法を実施するための、請求項51〜77に記載のキット。
- 前記無細胞系の前記合成生物学的回路によって生成されたグルコースを検出するグルコースメーターをさらに含む、請求項51〜78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記試料中の複数の異なる標的分析物に応答してグルコースを生成または消費する複数の合成生物学的回路を含む、請求項51〜79のいずれか1項に記載のキット。
- 前記複数の合成生物学的回路のそれぞれが、異なる基質と酵素を用いてグルコースを生成する、請求項80に記載のキット。
- 前記標的分析物が核酸分子であり、前記方法が、前記試料と前記合成生物学的回路とを接触させる前に前記核酸分子を抽出することをさらに含む、請求項1〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子を抽出することが、前記試料と、前記標的分析物を捕捉する基質、任意選択で、紙基質、膜基質、または磁気ビーズとを接触させることを含む、請求項82に記載の方法。
- 前記標的分析物を捕捉する基質を含む、請求項51〜81のいずれか1項に記載のキット。
- 前記基質が、紙基質または膜基質であり、任意選択で、前記基質がセルロースを含む、請求項84に記載のキット。
- 試料を入れる容器を含み、前記容器が取外し可能な蓋を含み、前記基質が前記取外し可能な蓋に接着している、請求項84または85に記載のキット。
- 複数の容器を含み、前記取外し可能な蓋が、前記複数の容器に適合するよう構成されている、請求項86に記載のキット。
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