JP7323198B2 - 無細胞系にグルコースメーターを用いて標的分析物を検出する合成生物学的回路 - Google Patents
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Description
本願は、2017年12月22日に出願された米国仮特許出願第62/609,525号の優先権の利益を主張するものであり、上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、標的分析物を検出する製品および方法、より具体的には、グルコースを産生または消費する合成生物学的回路を用いて標的分析物を検出する製品および方法に関する。
この説明は、無細胞系の標的分析物を検出する合成生物学的回路を提供する。実施例で示すように、記載される合成生物学的回路の使用により、グルコースモニターおよび試験紙などの容易に入手可能なセンサーおよび試薬を用いて標的分析物を検出することが可能になる。本明細書に記載される実施形態を用いて、容易に様々な合成生物学的回路を生じさせ、様々な標的分析物の検出を可能にできる。例えば、リボレギュレーター、例えば標的核酸配列に応答してレポーター酵素の発現を制御する足がかり配列スイッチなどを用いて、標的RNAまたはDNA配列を検出できる。レポーター酵素の発現が基質のレベルを修飾し、次いで、これを無細胞反応体積中に検出する。好ましい実施形態では、レポーター酵素が無細胞反応体積中のグルコースのレベルを修飾し、グルコースモニターおよび/またはグルコース試験紙を用いて標的分析物を検出することが可能になる。
合成生物学的回路を用いて、無細胞反応で標的分析物に応答してグルコースが生成することを示すため、一連の実験を実施した。いずれの実験でも、市販の血糖メーターおよび付属の試験紙(Bayer Contour Blood Glucose Monitoring System)を用いてグルコースを検出した。
TAATACGACTCACTATAGGGATCTATTACTACTTACCATTGTCTTGCTCTATACAGAAACAGAGGAGATATAGAATGAGACAATGGAACCTGGCGGCAGCGCAAAAGATGCGTAAAGATTATAAAGATGATGATGATAAAGGACATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCGAGAACCTGTACTTCCAATCCTCTGGAGGTGGGGGTTCTGGAACAGCGGTACGGATAGATTATGCAAGCGGGTTAACTGATCGCGAAAACTCTATGTTCAAAGAAATCCAGTTGTCAGGCGTTTTTGCCGATTCAAAAACCTTTGTGGATAGCCATCCCAAATTGCCCCTGGCGGAAATCGCCGAGCTTTACCATGTCCGGCAACAGCAGGCGGGTTTTGACCTCGCCGCTTTTGTTCACCGGTATTTTGAGCTGCCGCCGAGCATTGCCTCCGGTTTTGTCAGCGATACCTCGCGCCCGGTGGAAAAGCATATCGACATTCTCTGGGATGTGCTCACCCGCCAACCGGACAGGCAGGAGGCGGGAACCCTGCTGCCCTTACCTTACCCCTATGTCGTTCCCGGCGGCCGCTTCCGCGAAATTTACTACTGGGACAGCTATTTCACCATGCTCGGTTTGCAGGCATCGAAGCGCTGGGATCTGATGGAGGGTATGGTGAATAATTTTTCACACCTGATCGACACCATCGGCTTTATTCCCAACGGCAATCGCACCTATTACGAGGGCCGCTCCCAGCCGCCTTTTTACGCCCTGATGGTGGAGTTGCTGGCCAATAAACAGGGTGAGTCGGTGCTGCTCGCGCATTTGCCGCATTTGCGCAGGGAATATGAATTCTGGATGGAGGGCGCCGCTAAACTTTCGCCCGCTGCACCCGCGCATCGCCGTGTGGTGCTGCTGCCGGATGGCAGCATACTCAATCGCTACTGGGATGATATAGCCGCGCCGCGCCCGGAATCCTTCCGCGAAGACTACGAACTGGCGGAAGCCATCGGCGGCAACAAGCGCGAGCTGTACCGCCATATTCGCGCGGCGGCAGAATCCGGCTGGGACTTCAGCAGCCGCTGGTTCAAAGATGGCAATGGCATGGCCAGCATCCACACCACCGATATTATCCCGGTGGATTTGAATGCGCTGGTCTTTAACCTGGAGCGGATGCTGGCCCATATTTATGGCTTGCAGGGCGACCAGGATCAGGCCACGCATTACTACCAATTGGCGGAGCAGCGCAAACAGGCGTTGCTGCGCTACTGTTGGAATGCGCAGCAGGGATTTTTCCACGATTACGATTATGTCGCCGCACAACAGACGCCGGTCATGTCGCTGGCGGCGGTTTACCCGCTTTATTTCAGTATGGTCGACCAGCGCACGGGCGACCGGGTCGCCGAACAGATAGAGGCGCATTTTATCCAGGCGGGCGGTGTGACCACGACCCTGGCGACCACAGGCCAGCAGTGGGACGCGCCCAATGGCTGGGCGCCGCTGCAATGGCTGACCATCCAGGGCCTGCGCAATTATCACCACAATTCAGCGGCGGAGCAGATCAAACAGCGCTGGATTGCACTCAACCAGCGCGTTTACCGCAACACCGGAAAGTTGGTGGAAAAATACAACGTCTATGACCTGGATGTGGCCGGCGGCGGTGGCGAATATGAATTACAGGATGGCTTCGGTTGGACCAACGGTGTCTTGTTGCACTTACTCAACGAAAGTACACCCTAA(配列番号1)。
GGGUGAUGGGACAUUCCGAUGUCCCAUCAAUAAGAGCAAGACAAUGGUAAGUAGUAAUAGAUAAG(配列番号2)
によって活性化される。
表1に示すように、ラクターゼ発現を制御する足がかり配列スイッチを用いた反応テンプレートに従い、一連の無細胞反応を組み立てた。
TAATACGACTCACTATAGGGAGTTTGATTACATTGTCGTTTAGTTTAGTGATACATAAACAGAGGAGATATCACATGACTAAACGAAACCTGGCGGCAGCGCAAAAGATGCGTAAAATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAA(配列番号3)。
GGGACAGAUCCACUGAGGCGUGGAUCUGUGAACACUAAACUAAACGACAAUGUAAUCAAACUAAC(配列番号4)
によって活性化される。
2つの異なる足がかり配列スイッチを含有する共通の反応混合物を組み立て、レプリケートに等分した。次いで、最初の組の三重反復反応をトリガーを加えずにインキュベートし、データをバックグラウンドシグナルに対して正規化するのに用いた。図10Aに示されるように、次の組の三重反復反応にトリガーE RNAを加えたところ、グルコースがわずかであるが、有意に増大した。三組目の三重反復反応にトリガーG RNAを加えたところ、さらに大きく明確な量のグルコースが産生された。
チフス、パラチフスA、およびパラチフスB由来のRNA配列を検出する足がかり配列スイッチをそれぞれ設計した。いずれの足がかり配列スイッチも、グルコースを生成するトレハラーゼ酵素の産生を活性化するよう構成した。図11に、スイッチDNA濃度および基質を最適化して、発生シグナルを増強し差を分かりやすくする前の予備データを示すが、3つのいずれの場合にも明白な増大がみられる。図11に示されるデータは、各反応に足がかり配列スイッチが1つだけ存在するものであったため、多重化実験ではない。値は、標的が存在しない対照反応を測定することによって求めたバックグラウンドシグナルを減算した後のものが示されている。試料を37℃で1時間インキュベートした。血糖メーターを用いてグルコース濃度を測定した。
図12に、グルコースメーターが介在する例示的診断ワークフロー(これに限定されない)を示す。提案するワークフローの全般的過程は、段階1-試料採取、段階2-RNA抽出、段階3-等温増幅、段階4-標的RNAの存在下でグルコースを産生する標的特異的センサーと組み合わせた無細胞反応、段階5-グルコースメーターでの試料分析、および段階6-特注ソフトウェアでの結果の解釈の6段階に従う。本明細書に記載される方法の好ましい実施形態は、図12に示す段階のうち1つまたは複数のものを含み得るものであり、諸段階の任意選択の詳細については以下に示す。
試料は患者血液試料またはその他の生体試料であり得る。
a)紙による抽出またはb)磁気ビーズ抽出などの様々なRNA抽出方法を用いることができる。
検出しようとする標的が最初の試料中に低濃度で存在する場合、標的RNAをセンサーに適合するレベルまで増幅することが必要となり得る。これは、NASBAなどの等温増幅法またはほぼ等温の増幅方法を用いて実施する。スマートフォンで制御する恒温器内で反応インキュベーションを実施し得る。
次いで、増幅したRNAを直接、標的RNAが認識されたときだけ有意水準のトレハラーゼを発現するよう設計したセンサーを含有する無細胞反応に加え得る。次いで、トレハラーゼが(反応に添加した)トレハロースからグルコースモノマーへの分解を触媒する。スマートフォンで制御する恒温器内で反応インキュベーションを実施し得る。
次いで、無細胞反応をグルコース試験紙で試験してよく、陽性試料であれば、グルコースメーターによる読取りが可能なグルコースレベルの有意な上昇がみられることが予想される。
スマートフォンアプリを用いてグルコースメーターのデータを解釈し(任意選択で、家庭医または公衆衛生監視プログラムに+/-匿名で転送し)得る。これは任意選択で、段階3)および4)で使用する恒温器を制御するものと同じアプリである。
紙または膜を用いて試料から核酸を捕捉することを検討する実験を実施した。Zouら(2017)(参照により本明細書に組み込まれる)は既に、核酸精製へのセルロース紙の使用について記載している。
溶解段階では、緩衝液を最終濃度1×で使用した。4×緩衝液では、溶解段階でさらに多くの試料を加えることが可能になる。
ばらけた紙ディスクまたは試験紙の形で紙を用いる代わりに、キャップの内側に紙を接着させたチューブを用いた。Whatmanフィルター紙およびポリエーテルスルホン(PES)膜の両方を用いてこの方法を試験し、紙/膜を接着させるのにともに熱接着剤およびパラフィンロウを用いた。この方法は理論的には、キャップを有する任意のタイプおよび容積のチューブ(50mL、15mL、2mL、1.5mL、ストリップPCRチューブなど)に取り入れることができる。
1.溶解、洗浄、および溶出チューブを準備する。緩衝液がRNアーゼI阻害剤を含有する場合、チューブを氷上に保持する。
a.ReCapチューブ内に溶解チューブを設置し、試料添加後に抽出緩衝液の最終濃度が1×になるよう抽出緩衝液を適切な濃度で加える。
b.洗浄チューブに洗浄緩衝液200μLを加える
c.溶出チューブに増幅反応混合物(例えば、PCR反応またはNASBA増幅反応)を設置する。このチューブは氷上に保持するべきである。
2.溶解:
a.ReCapチューブ内で、抽出する試料と抽出緩衝液とを混合して最終濃度を1×にする。
b.1分間、チューブを反転させることによってかき混ぜる。
c.台の上でチューブを穏やかにタップすることにより、蓋に付着していると思われる液体を集める。
3.洗浄
a.ReCapの蓋を洗浄チューブに移す
b.1分間、チューブを反転させることによってかき混ぜる
c.台の上でチューブを穏やかにタップすることにより、蓋に付着していると思われる液体を集める。
4.溶出
a.ReCapの蓋を溶出チューブに移す
b.1分間、チューブを反転させることによってかき混ぜる。
c.台の上でチューブを穏やかにタップすることにより、蓋に付着していると思われる液体を集める。
d.ReCapの蓋を取り外して通常の蓋にする。相当量の熱を必要とする反応によりReCapで使用する接着剤が溶ける可能性があることから、このことは重要である。
5.増幅
a.PCR:標準的PCRプロトコルで反応を実施する。例えば、表3に挙げるNEB Q5ポリメラーゼプロトコルを用いてReCapをアッセイした。
b.等温反応:表4に挙げるNASBA反応を用いてReCapをアッセイした。
100~1010コピーのmRFP1プラスミドDNA鋳型を抽出緩衝液に添加し、紙に結合させ、洗浄し、50μLのPCR反応中に溶出させた。PCR+対照では、100~1010コピーのDNA鋳型をQ5ポリメラーゼPCR反応に直接加えた。PCR産物5μLを1%アガロースゲル上で泳動した。図13に示すように、ReCap法では、PCRの感度限界(DNA 107コピー)まで核酸を捕捉することができる。
ReCap抽出に代わる方法として、磁気ビーズによる抽出方法を用い、ReCap紙抽出法の緩衝液(表2に挙げたもの)とともにGenesig Easy DNA/RNA Extractionキットの磁気ビーズ(Tube 3)で実験を実施した。以下のプロトコル段階を用いた:
1.溶解
a.試料および抽出緩衝液を最終濃度1×まで加える。キットに提供されているTube 3(磁気ビーズを含む溶液)を等体積だけ加える。
b.チューブを振盪し、15分間待つ
c.磁化し、液体を全部除去する
2.洗浄
a.洗浄緩衝液200μLを加える。
b.チューブを振盪し、30秒間待つ
c.磁化し、液体を全部除去する。
3.溶出
a.適切な体積の水または増幅混合物中で溶出させる。
合成回路を用いて検出する前に核酸を増幅するのに用いる増幅方法は、等温性またはほぼ等温性のもの(すなわち、NASBA)であるのが好ましい。ReCap紙抽出をNASBAとともに用いることを検討するため、Zikaセンサー(参照により本明細書に組み込まれるPardeeら、2016を参照されたい)を用いて実験を実施した。
グルコースメーターが介在し、合成生物学的回路を用いる検知を金属などの環境分析物の検出に用いてもよい。具体的には、このセンサーおよび方法を環境の監視および改善のほかにも、貴元素または希土類元素などの有価金属の検出/探査に用い得る。
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Claims (12)
- 試料中の標的核酸分子に応答してグルコースを修飾する方法であって、前記方法は、前記試料と無細胞系反応体積中の遺伝子回路とを接触させることを含み、
前記遺伝子回路が、その発現が前記反応体積中のグルコースのレベルを修飾する酵素をコードするDNA分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むDNA分子を含み、かつ
前記標的核酸分子が、前記反応体積中の遺伝子回路を活性化して、前記酵素をコードするmRNA分子の翻訳を調節し、前記反応体積中のグルコースのレベルを修飾し、かつ
前記遺伝子回路が、前記酵素をコードするmRNA分子の翻訳を制御するリボレギュレーターをさらに含み、前記リボレギュレーターが足がかり配列スイッチであり、前記標的核酸分子が前記足がかり配列スイッチのトリガーであるため、前記標的核酸分子と前記足がかり配列スイッチが結合すると、前記遺伝子回路内の前記酵素をコードする前記mRNAが翻訳される、方法。 - 前記標的核酸分子が、前記遺伝子回路を活性化して、前記無細胞系反応体積中の前記グルコースのレベルを上昇させる、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸分子が、前記遺伝子回路を活性化して、前記無細胞系反応体積中の前記グルコースのレベルを低下させる、請求項1に記載の方法。
- 前記無細胞系反応体積が、グルコース、または前記酵素が作用してグルコースを生成する基質を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基質が、1つまたは複数のグルコースモノマーを含むオリゴ糖または多糖を含む、請求項4に記載の方法。
- i)前記基質がトレハロースであり、前記酵素がトレハラーゼである;
ii)前記基質がマルトースであり、前記酵素がマルターゼである;
iii)前記基質がセロビオースであり、前記酵素がセロビアーゼである;
iv)前記基質がデンプンであり、前記酵素がアミラーゼである;
v)前記基質がラクトースであり、前記酵素がラクターゼ(β-ガラクトシダーゼ)である;
vi)前記基質がスクロースであり、前記酵素がインベルターゼもしくはスクラーゼである;
vii)前記基質がグルコースであり、前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである;または
viii)前記基質がグルコース-6-リン酸であり、前記酵素がグルコース6-ホスファターゼである、
請求項4または5に記載の方法。 - 前記無細胞系反応体積が、前記遺伝子回路と、転写および翻訳のための酵素と、リボソームと、dNTPと、tRNAと、アミノ酸とを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記無細胞系反応体積を凍結乾燥させ、前記試料および/または反応緩衝液との接触によって再水和する、請求項7に記載の方法。
- 前記無細胞系反応体積中のグルコースを検出し、それにより、前記試料中の前記標的核酸分子を検出することをさらに含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- グルコースを検出することは、グルコースメーターおよび/またはグルコース試験紙を用いることを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを検出し、それにより、前記試料中の前記標的核酸分子のレベルを定量化することを含む、請求項9または10に記載の方法。
- 試料中の標的核酸分子に応答してグルコースを生成または消費する遺伝子回路を含む無細胞系反応体積を含む、キットであって、
前記遺伝子回路が、その発現が前記無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを修飾する酵素をコードするDNA分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むDNA分子を含み、かつ前記標的核酸分子が、前記無細胞系反応体積中の遺伝子回路を活性化して、前記酵素をコードするmRNA分子の翻訳を調節し、前記無細胞系反応体積中のグルコースのレベルを修飾し、かつ
前記遺伝子回路が、前記酵素をコードするmRNA分子の翻訳を制御するリボレギュレーターをさらに含み、前記リボレギュレーターが足がかり配列スイッチであり、前記標的核酸分子が前記足がかり配列スイッチのトリガーであるため、前記標的核酸分子と前記足がかり配列スイッチが結合すると、前記遺伝子回路内の前記酵素をコードする前記mRNAが翻訳される、キット。
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