JP6782218B2 - 検出装置および検出方法 - Google Patents

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Description

実施形態は、検出装置および検出方法に関する。
Ａ型インフルエンザウイルスのうち、例えばＨ５Ｎ１亜型に代表される鳥インフルエンザは、全身の臓器に感染が広がるため、致死率が高く強毒性と呼ばれている。現状では、Ｈ５Ｎ１亜型はヒトには感染しにくいため、パンデミックとなっていないが、変異によりヒトに感染する新型インフルエンザが発生した場合には、壊滅的な被害が発生することが予想されている。
一方、インフルエンザの迅速検査は、イムノクロマト法などが実用化されているが、強毒性と弱毒性の識別を行う迅速検査技術は、まだ確立しておらず、現状では、PCR（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法による遺伝子増幅後の遺伝子検査が必要とされている。新型インフルエンザが発生してしまった際には、急速に感染が拡大することが予想されるため、迅速検査手法がないと感染の拡大を止めることが難しいと予想される。
また、ウイルスを特異的に検出する技術としては、ウイルス表面のマーカと結合するプローブ分子を用いて捕捉する手法が知られているが、この手法では、夾雑物が、プローブ分子やプローブ分子以外の部分へ、非特異的に吸着してしまった場合との識別が難しく、高感度化が難しいという課題もあった。さらに同じプローブ分子に結合する表面マーカを持ったウイルスがあった場合には、それらを識別できないという課題もあった。
国際公開第２０１７／１２６６１７号
実施形態は、検出ターゲットの迅速な評価が可能な検出装置および検出方法を提供する。
実施形態の検出装置は、センサ素子と、前記センサ素子に固定されたプローブ分子であって、検出ターゲットの表面に露出した受容体と会合するプローブ分子と、を具備する。前記センサ素子は、前記プローブ分子と会合し前記プローブ分子に捕捉された前記受容体が、特定のプロテアーゼによって開裂したことを検出する。
Ａ型インフルエンザウイルスの構造を示す図。 Ａ型インフルエンザの分類を示す図。 インフルエンザウイルスの感染機序を示す図。 （ａ）はヒトの上気道に発現している糖鎖の分子構造を示す図であり、（ｂ）はトリの上気道に発現している糖鎖の分子構造を示す図。 （ａ）及び（ｂ）は、開裂したＨＡのｐＨによる変形を示す模式図。 脂質二重膜の構造を示す模式図。 実施形態の検出装置の概要を示す模式図。 実施形態の検出装置を用いてヒト感染型インフルエンザウイルスを捕捉する様子を示す模式図。 実施形態の検出装置を用いて強毒性インフルエンザウイルスを検出する様子を示す模式図。 実施形態の検出装置を用いてウイルスのＨＡが開裂したことを検出する様子を示す模式図。 実施形態の検出装置を用いてウイルスのＨＡの開劣後の膜融合を検出する様子を示す模式図。 実施形態の検出装置においてセンサ素子上に試薬をハイドロゲルで固定した構造を示す模式図。 実施形態の検出装置において試薬をセンサ素子上のイオン液体に分散させた構造を示す模式図。 （ａ）〜（ｈ）は、イオン液体の一例の分子構造を示す図。 有機電解質オリゴマーの分子構造を示す模式図。 実施形態の検出装置においてセンサ素子の他の例の模式図。 実施形態の検出装置においてグラフェン膜が下地から浮いた構造の模式図。 （ａ）及び（ｂ）は、図１７に示す検出装置におけるグラフェン膜近傍の拡大模式図。 実施形態の検出装置におけるリン脂質膜の保護構造を示す模式図。 実施形態の検出装置におけるリン脂質膜の保護構造を示す模式図。 実施形態の検出装置におけるリン脂質膜の保護構造を示す模式図。 実施形態の検出装置におけるリン脂質膜の保護構造を示す模式図。 （ａ）は疎水性下地上に形成されたリン脂質膜の模式図であり、（ｂ）は親水性下地上に形成されたリン脂質膜の模式図。
以下、図面を参照し、実施形態について説明する。なお、各図面中、同じ要素には同じ符号を付している。
以下に説明する実施形態によれば、検出ターゲットとしてウイルスを検出する検出装置および検出方法が提供される。特にインフルエンザウイルスの強毒性と弱毒性の識別と、トリ感染型とヒト感染型との識別と、を迅速に行え、まだ出現していないヒト感染型の強毒性インフルエンザウイルスを特異的に検出できる検出装置および検出方法が提供される。
図１は、Ａ型インフルエンザウイルスの構造を示す図である。
インフルエンザウイルスは、エンベロープ３１と呼ばれる脂質二重膜（表面膜）に包まれた直径１００ｎｍ程度の小胞であり、エンベロープ３１の内部にゲノムとして１本鎖ＲＮＡ（ribonucleic acid）を持っている。エンベロープ３１の表面には、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）と呼ばれるスパイクタンパク質（膜に突き刺さったタンパク質）が露出している。なお、以下の説明において、ヘマグルチニンをＨＡ、ノイラミニダーゼをＮＡとだけ表す場合もある。
インフルエンザウイルスはＡ型、Ｂ型、Ｃ型の型をもつ。Ｃ型は小児に感染するが、病原性が低く症状が現れないことも多い。またＣ型はヒトだけに感染する。Ｂ型は毎年流行を繰り返すが、遺伝子が安定しており、ウイルスに対する免疫が長く維持されることもあり、流行の規模は小さい。またＢ型もヒトだけに感染する。Ａ型インフルエンザは、変異型が多く、世界的な大流行を起こしやすい。また、Ａ型にはヒト以外にも感染する種類がある。
なお、Ａ型とＢ型は、ＨＡとＮＡを持っており、構造上大きな違いがない。Ｃ型は、ＨＡとＮＡがなく、その代わりにヘマグルチニン−エステラーゼ（ＨＥ）が発現している。
図２は、Ａ型インフルエンザの分類を示す図である。
図３は、インフルエンザウイルスの感染機序を示す図である。
図４は、（ａ）はヒトの上気道に発現している糖鎖の分子構造を示す図であり、（ｂ）はトリの上気道に発現している糖鎖の分子構造を示す図である。
Ａ型インフルエンザウイルスには、トリに感染する種類とヒトに感染する種類がある。これは、インフルエンザが感染する際に、最初に吸着する上気道の細胞に発現している糖鎖の分子構造が、トリとヒトとで異なっていることに起因している。インフルエンザウイルスは、細胞に吸着する際に、ウイルス表面に露出したＨＡが、細胞膜表面に露出した糖鎖を認識して結合する。
図４（ｂ）に示すようにトリの上気道に露出している糖鎖はα２，３構造となっており、図４（ａ）に示すようにヒトの上気道に露出している糖鎖はα２，６構造となっている。これらの違いは、糖鎖先端のシアル酸と２番目のガラクトースがそれぞれ何番目の炭素で結合しているかの違いによる。
α２，３型糖鎖に特異的に結合するＨＡを発現したウイルスはトリに感染し、α２，６型糖鎖に特異的に結合するＨＡを発現したウイルスはヒトに感染する。ＨＡは、受容体または糖鎖認識部位である。
図２に示すように、Ａ型インフルエンザには、主に気道だけに感染が広がる弱毒性インフルエンザと、全身の臓器に感染が広がる強毒性インフルエンザがある。過去に多数の犠牲者を出したスペイン風邪や２００９年に北中米で流行した豚インフルエンザは、季節性インフルエンザと同じ、弱毒性に分類される。一方、家禽ペストとも呼ばれて恐れられているＨ５Ｎ１型などの鳥インフルエンザは、強毒性に分類される。
図３に示すように、ＨＡが糖鎖を認識して結合することでインフルエンザウイルスは宿主の細胞に吸着する。この後、エンドサイトーシスと呼ばれる細胞の食作用によって、インフルエンザウイルスは細胞内に取り込まれる。
エンドサイトーシスによって、インフルエンザウイルスは、エンドソームと呼ばれる小胞内に閉じ込められる。エンドソーム内のプロテアーゼによって、ＨＡが開裂する。またエンドソーム内が酸性となることにより、開裂したＨＡ分子の立体構造が変化して、ウイルスのエンベロープ３１がエンドソーム膜と融合して、細胞内にウイルスのゲノムを放出する。
図５（ａ）及び（ｂ）は、開裂したＨＡのｐＨによる変形を示す模式図である。
ＨＡは、図５（ａ）に示すように３量体を形成している。図５（ｂ）は、ひとつのＨＡを取り出した図である。
ＨＡの変質は、エンドソーム内に存在するプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）による特定部位の切断（開裂）によって始まる。開裂したＨＡは、エンドソーム膜側の糖鎖と結合しているＨＡ１と、ウイルスのエンベロープ３１に固定されているＨＡ２とに分断される。
一方、エンドソーム内は、エンドソーム膜に貫通して形成されているプロトンポンプによってプロトンが送り込まれ、酸性になる。
ｐＨが５．０〜５．５程度と弱酸性になってくると、開裂したＨＡが変形し、開裂部にあった疎水基３２が突き出してくる。
図６は、脂質二重膜の一般的な構造を示す模式図である。
脂質二重膜は、親水性のリン酸基（親水基）５２と、疎水性で長鎖状の脂肪酸（疎水基）５３が結合したリン脂質分子５１からなっている。また、多くの場合、ひとつのリン酸基５２に２本の脂肪酸５３が結合している。生体液のような水溶液中では親水基５２が表面（水溶液側）に露出し、脂肪酸５３（疎水基）はお互いに凝集する傾向がある。ここで疎水性の脂肪酸５３が１本しか付いていない場合、親水性のリン酸基５２が外側に向いた球状のミセル構造を形成するが、脂肪酸５３が２本付いている場合、リン酸基５２と脂肪酸５３の太さが近くなるため、ミセル状に取り囲むことができず、脂肪酸５３同士を向い合せた２分子が層状に整列した構造を取る。これが脂質二重膜である。
前述のウイルス膜（エンベロープ）３１と、ウイルスが感染する細胞膜と、ウイルスを取り込んだエンドソーム膜との、いずれも上記脂質二重膜の構造を持っている。
このように、エンドソーム膜を形成している脂質二重膜が、表裏面のリン酸基５２を除いて大部分が疎水性の脂肪酸５３で形成されていることから、図５（ａ）に示すように、開裂によりＨＡから突き出してきた疎水基３２は、疎水性相互作用によってエンドソーム膜に突き刺さることができる。これがきっかけとなって、エンドソーム膜とウイルスのエンベロープ３１が膜融合する。
ＨＡの開裂はプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）によって起こる。プロテアーゼは、タンパク質のアミノ酸配列を認識して切断する。このプロテアーゼは、ウイルス自身は持っておらず、感染する細胞やその周囲にあるプロテアーゼが利用される。
ヒトの気道には、トリプシンというプロテアーゼが存在し、ヒト感染型のインフルエンザウイルスは、トリプシンで開裂するＨＡを発現している。
また、ヒトの気道の細胞表面には、II型膜貫通型セリンプロテアーゼであるＴＭＰＲＳＳ（transmembrane protease/serine）２も発現しており、ヒト感染型インフルエンザウイルスのＨＡは、ＴＭＰＲＳＳ２によっても開裂する。
しかしながら、これらのプロテアーゼは、気道以外のヒトの臓器には殆ど存在しないため、現状のヒト感染型インフルエンザウイルスは、呼吸器のみに感染が広がり、全身の臓器に感染が広がることは稀である。
全身の臓器には、例えばＦＵＲＩＮというプロテアーゼが存在する。ＦＵＲＩＮは、細胞の一組織であるゴルジ体に大量に存在するプロテアーゼである。
Ｈ５Ｎ１型などのトリ感染型インフルエンザウイルスには、ＦＵＲＩＮによって開裂するアミノ酸配列を持ったＨＡを発現しているものがある。
ＦＵＲＩＮは全身に存在するため、上記の型のインフルエンザに感染すると、感染が全身臓器に広がってしまい、重篤な症状となってしまう。これが家禽ペストあるいは強毒性インフルエンザと呼ばれて恐れられる所以である。
また強毒性インフルエンザの中には、ＦＵＲＩＮでは開裂しないが、ＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬというプロテアーゼで開裂するＨＡを発現したものもある。
上記のように、トリ感染型とヒト感染型の違いは、ＨＡが認識・結合する糖鎖の構造の違いに起因し、弱毒性と強毒性の違いは、ＨＡが開裂するプロテアーゼの違いに起因している。
現状では、ヒト感染型の強毒性インフルエンザウイルスは、まだ現れていないと考えられている。しかしながら、ブタは、トリ感染型のウイルスとヒト感染型のウイルスの双方に感染することができるため、両ウイルスに感染したブタの体内で、トリ感染型とヒト感染型のハイブリッド型が発生してしまう恐れが指摘されている。
本発明の実施形態は、上記に鑑み、パンデミックを引き起こす脅威となっているヒト感染型の強毒性インフルエンザを迅速に特異的に検出する検出装置及び検出方法を提供する。
また、本発明の実施形態は、インフルエンザウイルスが表面に露出したＨＡによって特定の糖鎖構造を認識して結合する性質と、特定のプロテアーゼによってＨＡが開裂する性質とを利用してヒト感染型の強毒性インフルエンザウイルスを特異的に検出することを可能にする。
さらに、本発明の実施形態によれば、図２に示される感染型と毒性の２つの性質で分類される４つの型の全てを特異的に検出することが可能である。
さらに、検出ターゲットとしてはインフルエンザウイルスに限らず、表面に露出した受容体が特定の標的を認識・結合し、同受容体がプロテーゼによって開裂する性質を持ったものであれば検出することが可能である。
図７は、実施形態の検出装置（バイオセンサ）の概要を示す模式図である。
図８は、実施形態の検出装置を用いてヒト感染型インフルエンザウイルスを捕捉する様子を示す模式図である。
図９は、実施形態の検出装置を用いて強毒性インフルエンザウイルスを検出する様子を示す模式図である。
図１０は、実施形態の検出装置を用いてウイルスのＨＡが開裂したことを検出する様子を示す模式図である。
図１１は、実施形態の検出装置を用いてウイルスのＨＡの開劣後の膜融合を検出する様子を示す模式図である。
図７に示すように、実施形態の検出装置は、センサ素子と、センサ素子に固定されたプローブ分子２１とを備えている。センサ素子は例えばグラフェン膜１３を含む電荷検出素子である。プローブ分子２１は、α２，６型糖鎖であり、インフルエンザウイルスの表面に露出したＨＡと会合する。
基板１１上に下地膜１２が設けられ、下地膜１２上にグラフェン膜１３が設けられている。または、下地膜１２を設けずに、基板１１の表面にグラフェン膜１３を設けてもよい。また、基板１１には、図示せぬ回路やトランジスタが形成されていてもよい。
基板１１の材料として、例えば、シリコン、酸化シリコン、ガラス、高分子材料を用いることができる。下地膜１２は、例えばシリコン酸化膜やフッ素樹脂のような絶縁膜である。また、下地膜１２に、グラフェン膜１３を形成するための化学的触媒の機能をもたせることもできる。
また、リン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）がグラフェン膜１３を被覆し、プローブ分子２１は、リンカー２２を介して、グラフェン膜１３とリン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）とのいずれかに固定されている。リンカー２２は、プローブ分子２１とセンサ素子の表面との間の距離を調節する。
なお、図７乃至図１１を含むいくつかの図面では、内部構造が理解しやすいように、意図的にリン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）の一部を図示せず、下地のグラフェン膜１３が見えるようにしてある。また、プローブ分子２１は、単糖が３つ結合した状態で図示しているが、必ずしもこの数である必要もない。
センサ素子は、例えばFET（field effect transistor）構造を有す、少なくとも２つの電極（第１電極１６と第２電極１７）を有する。グラフェン膜１３は、第１電極１６と第２電極１７に電気的に接続されている。第１電極１６と第２電極１７の一方はドレイン電極、他方はソース電極として機能する。グラフェン膜１３を通じて、第１電極１６と第２電極１７との間に電流が流れることができる。
グラフェン膜１３、リン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）、およびプローブ分子２１は、側壁１８によって囲まれたウェルに配置されている。ウェルの上方には、検体液等を供給する注入口１５が形成されている。
ウェルに、被験者から取得した検体液（例えば、咽頭ぬぐい液やうがい水など）を滴下すると、被験者がヒト感染型インフルエンザに感染していた場合、図８に示すように、インフルエンザウイルスのＨＡがプローブ分子（α２，６型糖鎖）２１を認識し、プローブ分子（α２，６型糖鎖）２１に結合する。
また、咳により気中に飛散した飛沫を捕捉した場合も同様である。捕捉した飛沫に、ヒト感染型インフルエンザ感染者の咳による飛沫が含まれていた場合も、図８に示すように、インフルエンザウイルスのＨＡがプローブ分子（α２，６型糖鎖）と結合する。
糖鎖で捕捉されたウイルスはグラフェン膜１３に近接する。一般にインフルエンザウイルスは表面電荷を持っているため、ウイルスの電荷がグラフェン膜１３に近接することによって、グラフェンのポテンシャルが変動し、グラフェン膜１３を流れるソース・ドレイン間電流が変動する。したがって、このソース・ドレイン間電流の変動を読み取ることによって、ヒト感染型のインフルエンザウイルスの有無を判定することができる。
また、強毒性インフルエンザウイルスのＨＡを開裂させて、かつ、全身臓器に存在するプロテアーゼをウェルに供給した場合においては、プローブ分子（α２，６型糖鎖）２１によって捕捉されたインフルエンザウイルスが強毒性であれば、図９に示すように、α２，６型糖鎖と結合したＨＡが開裂する。
ＨＡが開裂すると、図１０に示すように、センサ素子に対するウイルスの固定が不安定になり、これを電気特性の変動として検出することが可能である。
あるいは、検体液２６を酸性にすると、図１１に示すように、開裂したＨＡを変形させて、ＨＡの疎水基がグラフェン膜１３の表面を被覆するリン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）に突き刺さる。このイベントによるセンサ素子の電気特性の変動を検出することで、ＨＡが開裂したことを高い感度で検出することができる。さらに、その後ウイルスのエンベロープ３１が、リン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）と融合するによるセンサ素子の電気特性の変動を検出することで、ＨＡが開裂したことを高い感度で検出することができる。
ここで、ＨＡを変形させるために検体液２６を酸性にするｐＨ調整液としては、例えばAcetate-NaOHのような酸性緩衝液を用いることができる。
また、強毒性インフルエンザウイルスのＨＡを開裂させて、かつ、全身臓器に存在するプロテアーゼとしては、例えばＦＵＲＩＮを用いることができる。
あるいは、強毒性のトリ感染型インフルエンザのＨＡを開裂させることが分かっているＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬを用いれば、この種のトリ感染型強毒性インフルエンザがヒト感染型に変異した新型インフルエンザウイルスが出現した場合にもその新型インフルエンザウイルスを検出することができる。なお、ＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬは、膜貫通型セリンプロテアーゼの一種であるため、グラフェン膜１３の表面を被覆したリン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）に固定しておくことも可能である。
なお、検体である咽頭ぬぐい液や咳による飛沫は、いずれもヒトの上気道からのものであるため、トリプシンを含んでいる可能性がある。
トリプシンが検体液に十分な量含まれていた場合、弱毒性のインフルエンザウイルスであってもＨＡが開裂してしまうため、強毒性インフルエンザウイルスに対する偽陽性が発生してしまう。
この懸念を回避する方法としては、例えば、トリプシン阻害剤をウェルに供給することが可能である。
トリプシン阻害剤が、トリプシンの酵素活性を特異的に阻害して、ＦＵＲＩＮやＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬの酵素活性には影響しないものである場合には、図９に示すように、トリプシン阻害剤を供給し、さらに例えばＦＵＲＩＮを供給して、ＨＡが開裂すれば、強毒性インフルエンザウイルスを検出することができる。
上記手順を用いて、プローブ分子（α２，６型糖鎖）２１でウイルスが固定されたことが検出されていて、かつ、ＦＵＲＩＮとＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬとのいずれかで開裂が認められた場合には、ヒト感染型の強毒性インフルエンザ、すなわち、極めて危険な新型インフルエンザであるものと判断できる。
トリプシン阻害剤が、ＦＵＲＩＮやＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬの酵素活性も阻害してしまう場合には、図８に示すようにトリプシン阻害剤を供給し、プローブ分子（α２，６糖鎖）２１にヒト感染型インフルエンザウイルスを固定した後、洗浄してトリプシン阻害剤とトリプシンをウェルから排除した後、ＦＵＲＩＮやＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬをウェルに供給して、ＨＡの開裂挙動を検出することが可能である。
上記手順を用いて、プローブ分子（α２，６型糖鎖）２１でウイルスが固定されたことが検出されていて、かつ、ＦＵＲＩＮでもＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬでも開裂が認められなかった場合には、ヒト感染型の弱毒性インフルエンザ、すなわち、季節性インフルエンザであるものと判断できる。
これをより確実に判断するためには、さらにトリプシンを供給する。トリプシンの供給により、ＨＡの開裂が認められれば、ヒト感染型弱毒性インフルエンザであることが確認できる。
あるいは、ＦＵＲＩＮとＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬをウェルに供給する第１センサ素子と、トリプシンをウェルに供給する第２センサ素子の２つのセンサ素子を用意して、検体液をそれら両者に供給して、それぞれのセンサ素子で毒性を判定することも可能である。第１センサ素子のウェルと、第２センサ素子のウェルとは、例えば側壁１８によって分離されている。
第１センサ素子での結果が陽性であれば、検出されたウイルスはヒト感染型強毒性インフルエンザであり、第１センサ素子での結果が陰性で、第２センサ素子での結果が陽性であれば、検出されたウイルスはヒト感染型弱毒性インフルエンザである。
ただし、第１センサ素子および第２センサ素子での結果がともに陰性であっても、トリ感染型インフルエンザの存在は否定できない。
そこで、プローブ分子２１としてα２，３型糖鎖を用いて上記の手順を行えば、トリ感染型の強毒性インフルエンザと弱毒性インフルエンザを、上記同様に特異的に検出することができる。
α２，６型糖鎖がプローブ分子２１としてセンサ素子上に固定され、ヒト感染型インフルエンザウイルスを検出可能な素子（領域）と、α２，３型糖鎖がプローブ分子２１としてセンサ素子上に固定され、トリ感染型インフルエンザウイルスを検出可能な素子（領域）とは、同じウェル内に共存させることができる。
前述した、ＨＡを開裂させるためのプロテアーゼ、ＨＡの非特異的な開裂を阻害するためのプロテアーゼ阻害剤、ＨＡの開裂後の膜融合を促進するためのｐＨ調整液などの試薬は、検体液と同様に注入口１５を通じてウェルに供給することができる。または、それら試薬を、基板１１上にウェルとは別に形成された液溜めに入れておいて、そこからウェルに供給しても構わない。
また、ウイルスとプローブ分子の会合をセンサ素子が検出した後、その検出信号を受けて、上記試薬を自動的にウェルに供給するユニットを設けることもできる。
図１２は、センサ素子上に、上記試薬をハイドロゲルで固定した構造を示す模式図である。
このように、上記試薬は、水溶性のハイドロゲル４１としてセンサ素子上に被覆固定しておくこともできる。
図１３は、上記試薬をセンサ素子上のイオン液体に分散させた構造を示す模式図である。
このように、上記試薬を、センサ素子上の親水性のイオン液体４２に分散させておくことも可能である。
図１４（ａ）〜（ｈ）は、イオン液体４２の一例の分子構造を示す図である。
イオン液体４２としては、例えば、図１４（ａ）に示すようなイミダゾリウム系カチオンとホスホネート系アニオンからなるものを使用することができる。この種のイオン液体は生体材料に対して温和であり、糖鎖やリン脂質膜などを著しく損傷させることを回避できる。
さらに、イオン液体は様々な分子構造を選択することができるため、例えば分子サイズの大きく、粘度が高いイオン液体を用いれば、センサ素子上に試薬と共に固定することが容易となる。図１４（ｂ）〜（ｈ）に分子構造を変えたイオン液体の例を示す。
図１５は、有機電解質オリゴマーの分子構造を示す模式図である。
イオン液体４２に例えば図１５に示すような有機電解質オリゴマーをゲル化剤として添加することによっても、イオン液体４２を高粘度化することが可能である。
上記に示したハイドロゲルや親水性イオン液体は、いずれも検体液が供給されると希釈されて、低粘度化する。
また、ハイドロゲルや親水性イオン液体は、センサ素子上に形成された生体材料である糖鎖プローブ分子２１やリン脂質膜１４を濡れた環境で保持できるという効果もある。
図１６は、実施形態によるセンサ素子の他の例の模式図である。
図１６に示すセンサ素子は、上記プローブ分子２１が固定されたターゲット検出素子１０と、プローブ分子が固定されていない参照素子１００とを有する。
ターゲット検出素子１０と参照素子１００は同じ基板１１上に形成されている。プローブ分子２１が固定されたターゲット検出素子１０の横に、プローブ分子が固定されていない参照素子１００が形成されている。
プローブ分子が固定されていない参照素子１００では、ウイルスによる信号は検出されないが、外乱による変動、例えばｐＨ変化などを検出するため、ターゲット検出素子１０に対する外乱ノイズの補正に用いることができる。また、図１６ではターゲット検出素子１０と参照素子１００を別々のウェル内に形成した形態で図示しているが、同一のウェル内に共存させても構わない。
また、本発明の実施形態によれば、インフルエンザウイルスに限らず、表面に露出した受容体が特定の標的を認識・結合し、同受容体がプロテアーゼによって開裂する性質を持ったものであれば、検出することが可能である。
実際、多くのエンベロープウイルスは表面に露出したスパイクタンパク質（タンパク質あるいは糖鎖修飾タンパク質）がプロテアーゼによって開裂することによって、感染細胞へ侵入することが知られている。例えば、ＨＩＶはエンベロープ糖タンパクＧＰ１６０がＦＵＲＩＮによって開裂する。また、ＳＥＲＳコロナウイルスはＳタンパクがトリプシンによって開裂する。
このようにスパイクタンパク質が開裂すると、ウイルスエンベロープが、グラフェン膜１３の表面を被覆したリン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）と膜融合を引き起こす。あるいは開裂によって露出した疎水基がリン脂質膜１４に突き刺さる。
これらの変化は、グラフェン膜１３の近傍で、あるいはグラフェン膜１３に接触して起こるため、グラフェンのポテンシャルが大きく変動する。すなわち、ひとつのウイルスから大きな信号が得られることになり、ウイルスの数が少なくても検出することができる。
グラフェン膜１３は下地膜（絶縁膜）１２上に形成されることに限らず、グラフェン膜１３を下地から浮かせた構造でも構わない。
図１７は、グラフェン膜１３が下地から浮いた構造の検出装置の模式図である。
図１８（ａ）は、グラフェン膜１３近傍の拡大模式図である。
グラフェン膜１３は例えばソース・ドレイン電極で固定された両持ち梁のような状態で、検体液２６（弱酸性緩衝液）中に浮いており、リン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）がグラフェン膜１３の表面だけでなく裏面にも形成されている。また、グラフェン膜１３はメッシュ状に孔加工されている。
そのグラフェン膜１３の孔１３ａにおいては、表裏のリン脂質膜１４（リン脂質単分子膜）が孔１３ａの内部に延伸しており、孔１３ａの内部においてはリン脂質二重膜を形成している。
ここで、前述したような、プロテアーゼによるＨＡの開裂と、酸性環境によるＨＡの変形を引き起こさせてやれば、図１８（ｂ）に示すように、ウイルスのエンベロープ３１とグラフェン膜１３の孔１３ａに形成されたリン脂質膜１４（リン脂質二重膜）が膜融合する。
この膜融合により、ウイルス内部のＲＮＡ等を含む内包物がグラフェン膜１３の下部に放出される。その内包物を検出するセンサ素子をグラフェン膜１３の下方に形成しておけば、ウイルスの膜融合を高感度に検出することができる。あるいは、グラフェン膜１３で上記膜融合を検出しても構わない。
なお、上記までに説明したセンサ素子上に被覆されたリン脂質膜１４は、リン酸基が表面に露出した状態となっていたが、リン酸基の上を親水基で覆うことにより夾雑物の非特異吸着を抑制することも可能である。
図１９〜図２２は、リン酸基上に親水基を被覆した事例を示す模式図である。
例えば、プローブ分子２１として使っている糖鎖も親水性であるため、図１９に示すように、糖鎖プローブ分子２１を高密度に形成することで、夾雑物の非特異吸着を抑制することができる。
また、図２０に示すように、少なくとも夾雑物と結合しないような糖鎖４４を高密度に形成しても構わない。
また、図２１に示すように、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性の鎖状高分子４５をリン脂質膜１４のリン酸部に結合させても構わない。
また、図２２に示すように、例えばアルブミンなどの親水性のブロッキング剤４６をリン脂質膜１４上に被覆しても構わない。
なお、センサ素子として用いた電荷検出素子は、グラフェンに限らず、カーボンナノチューブを使ってもよい。また、ＨＡが開裂したこと（ＨＡの開裂挙動）を電気的に検出することに限らず、光学的または機械的に検出するセンサ素子を用いてもよい。カーボン系電荷検出素子以外に、センサ素子として、例えば、表面プラズモン共鳴素子、SAW（Surface Acoustic Wave）素子、FBAR（Film Bulk Acoustic Resonator）素子、QCM（Quartz Crystal Microbalance）素子、IS-FET（Ion sensitive FET）素子、または、MEMS（Micro Electro Mechanical System）カンチレバー素子などを用いることができる。
図２３（ａ）は疎水性下地１１３上に形成されたリン脂質膜の模式図であり、図２３（ｂ）は親水性下地２１３上に形成されたリン脂質膜の模式図である。
図２３（ａ）に示すように、センサ素子の表面が疎水性下地（例えばグラフェン）１１３の場合にはリン脂質膜は単分子膜として形成される。図２３（ｂ）に示すように、センサ素子の表面が親水性下地２１３の場合にはリン脂質膜は脂質二重膜として形成される。
また、センサ素子としてQCMのように機械的な振動を用いる場合には、ＨＡの開裂を機械的に検出できるため、センサ素子表面には必ずしもリン脂質膜を形成する必要がない。
以上説明した実施形態によれば、ウイルスの表面に露出したスパイクタンパク質と特異的に結合するプローブ分子と、プローブ分子と結合したウイルスのスパイクタンパク質が開裂したことを検出するセンサ素子と、を用いることにより、ウイルスを高感度に検出することができる。さらに、プローブ分子と、スパイクタンパク質を開裂させるプロテアーゼと、を選ぶことによって、特定のウイルスを特異的に検出することが可能となる。
なお、検出ターゲットとしては、ウイルスに限らず、プローブ分子と会合する受容体をもち、その受容体の開裂を発現する機能をもつものであれば検出することができる。例えば、エクソソームのようなウイルス様小胞体の検出も可能である。
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
１０…ターゲット検出素子、１１…基板、１２…下地膜、１３…グラフェン膜、１４…リン脂質膜、１５…注入口、１６，１７…電極、２１…プローブ分子、２５…トリプシン阻害剤、３１…エンベロープ、４１…ハイドロゲル、４２…イオン液体、１００…参照素子

Claims (20)

  1. センサ素子と、
    前記センサ素子に固定されたプローブ分子であって、検出ターゲットの表面に露出した受容体と会合するプローブ分子と、
    を具備し、
    前記センサ素子は、前記プローブ分子と会合し前記プローブ分子に捕捉された前記受容体が、特定のプロテアーゼによって開裂したことを検出する検出装置。
  2. 前記センサ素子は、電荷検出素子、表面プラズモン共鳴素子、SAW（Surface Acoustic Wave）素子、FBAR（Film Bulk Acoustic Resonator）素子、QCM（Quartz Crystal Microbalance）素子、IS-FET（Ion sensitive FET）素子、または、MEMS（Micro Electro Mechanical System）カンチレバー素子であって、
    前記センサ素子は、前記受容体の開裂による前記検出ターゲットの位置の変化と、動きやすさの変化と、前記受容体の形状の変化とのいずれかを検出する請求項１記載の検出装置。
  3. 前記電荷検出素子は、グラフェンまたはカーボンナノチューブを含む請求項２記載の検出装置。
  4. 前記センサ素子の表面にリン脂質膜が被覆され、
    前記センサ素子は、開裂した前記受容体の前記リン脂質膜への侵入と、前記検出ターゲットの表面膜と前記リン脂質膜との融合と、のいずれかを検出する請求項１〜３のいずれか１つに記載の検出装置。
  5. 前記プローブ分子が糖鎖である請求項１〜４のいずれか１つに記載の検出装置。
  6. 前記検出ターゲットはウイルスであり、前記受容体はスパイクタンパク質である請求項１〜５のいずれか１つに記載の検出装置。
  7. 前記ウイルスはインフルエンザウイルスであり、前記スパイクタンパク質はヘマグルチニンである請求項６記載の検出装置。
  8. 前記スパイクタンパク質を開裂させるための第１のプロテアーゼと、
    前記スパイクタンパク質が、前記検出ターゲットとともに混入した第２のプロテアーゼによって開裂することを阻害するためのプロテアーゼ阻害剤と、
    前記スパイクタンパク質の開裂後の膜融合を促進するためのｐＨ調整液と、
    の少なくともいずれかを前記センサ素子上に供給するための注入口を具備した請求項６記載の検出装置。
  9. 前記第１のプロテアーゼが、ヒトの気道以外にも存在するプロテアーゼであり、
    前記プロテアーゼ阻害剤が、トリプシン阻害剤である請求項８記載の検出装置。
  10. 前記第１のプロテアーゼが、ＦＵＲＩＮとＴＭＰＲＳＳ１３／ＭＳＰＬの少なくともいずれかを含む請求項８記載の検出装置。
  11. 前記第１のプロテアーゼが、トリプシンとＴＭＰＲＳＳ２の少なくともいずれかを含む請求項８記載の検出装置。
  12. 前記プローブ分子が、α２，６型糖鎖とα２，３型糖鎖のいずれかである請求項１〜１１のいずれか１つに記載の検出装置。
  13. 前記センサ素子は、前記プローブ分子が固定されたターゲット検出素子と、前記プローブ分子が固定されていない参照素子とを有する請求項１〜１２のいずれか１つに記載の検出装置。
  14. 前記スパイクタンパク質を開裂させるための第１のプロテアーゼと、
    前記スパイクタンパク質が、前記検出ターゲットとともに混入した第２のプロテアーゼによって開裂することを阻害するためのプロテアーゼ阻害剤と、
    前記スパイクタンパク質の開劣後の膜融合を促進するためのｐＨ調整液と、
    の少なくともいずれかを含むゲルが前記センサ素子上に固定され、前記ゲルが水溶性である請求項６記載の検出装置。
  15. 前記ゲルがハイドロゲルを含む請求項１４記載の検出装置。
  16. 前記ゲルが親水性のイオン液体を含む請求項１４記載の検出装置。
  17. 前記イオン液体がアニオンとしてホスホネート系化合物を含む請求項１６記載の検出装置。
  18. センサ素子に固定されたプローブ分子と会合し前記プローブ分子に捕捉された検出ターゲットの表面に露出した受容体が、特定のプロテアーゼによって開裂したことを前記センサ素子で検出する検出方法。
  19. 前記検出ターゲットはウイルスであり、前記受容体はスパイクタンパク質である請求項１８記載の検出方法。
  20. 前記スパイクタンパク質を開裂させるための第１のプロテアーゼと、
    前記スパイクタンパク質が、前記検出ターゲットとともに混入した第２のプロテアーゼによって開裂することを阻害するためのプロテアーゼ阻害剤と、
    前記スパイクタンパク質の開裂後の膜融合を促進するためのｐＨ調整液と、
    の少なくともいずれかを前記センサ素子上に供給する請求項１９記載の検出方法。
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