JP2001264333A - インフルエンザウイルスの型の同定・識別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 以下の工程： (a) 共鳴ミラー装置のキュベット内にインフルエンザウ
イルスに対するレセプター糖鎖を固定し、(b) 当該レセ
プター糖鎖にインフルエンザウイルス検体を反応させ、
(c) レセプター糖鎖とインフルエンザウイルスとの結合
により生じる共鳴角度変化を結合曲線に表し、(d) レス
ポンス強度をモニタリングすることを含むことを特徴と
する、インフルエンザウイルスの型の同定・識別方法。 【効果】 本発明によれば、インフルエンザウイルスと
レセプター糖鎖との相互作用を共鳴ミラー法により解析
し、ウイルスの型を同定・識別する方法が提供される。
本発明によれば、患者が感染しているインフルエンザウ
イルスの型を微量（μＭ以下のオーダー）の試料で、し
かも分単位という短時間で、精度良く同定・識別でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インフルエンザウ
イルスの型の同定・識別方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インフルエンザウイルスは外皮をもち、
ＨＡ（血赤球凝集素：ヘマグルチニン）とＮＡ（ノイラ
ミニダーゼ）の２種の酵素タンパクの突起で被われてい
る。ＨＡは血球凝集性の抗原で、ヒトの細胞に吸着・侵
入する際にその細胞表面にあるシアル酸を含むレセプタ
ー糖鎖と結合して、ウイルス粒子が細胞内に取り込まれ
るときに重要な役割を果たしている。インフルエンザの
抗原性はＨＡとＮＡの組み合わせで決まり、Ａ，Ｂ，Ｃ
の３型に大別される。Ａ型はさらに香港型など４種の亜
型が知られている。Ａ型では従来より10年程度の周期で
異なった亜型が登場したり、また同じ亜型でも年々少し
ずつ抗原性が変わっていく（抗原シフト）。このため抗
原型に完全に適合したワクチンの生産が難しく、予防効
果が問題となっている。

【０００３】インフルエンザウイルスの型の分類は、上
記のように抗原性による分類のほか、インフルエンザウ
イルスのレセプター糖鎖への結合性の違いによる分類が
ある。ヒトとトリではインフルエンザウイルスに対する
レセプター糖鎖末端のシアル酸の結合様式が異なってお
り、この違いによりトリからヒトへは直接感染はしない
とこれまで考えられていた。しかしながら、最近、トリ
からヒトへ直接感染するインフルエンザウイルス亜型
（H5N1型）が報告され [サイエンス(Science) 、第279
巻、第393-396 頁 (1998)] 、インフルエンザウイルス
感染機構の解明には分子認識論的な解析が必要になって
きている。

【０００４】これまで、インフルエンザウイルスの型の
抗原型の同定・識別には、沈殿法や凝集法といったよう
な非常に古い方法があるが、精度が悪く、検査に長時間
要する。最近、発表されたインフルエンザウイルス感染
検査試薬は、Ａ型とＢ型を区別するものであるが、精度
に問題がある。また、その感染が社会的に問題になって
いるＡ型は特定されても、亜型（例えばH2N9型)につい
ては識別できない。インフルエンザウイルスの遺伝子の
研究により、新しい流行の原因となっている遺伝子（mR
NA遺伝子)上の変異の特定を行い、そのウイルスの型を
同定する方法もあるが、この方法は高度の知識と技術が
必要であり、また時間がかかり（月単位）、微量かつ短
時間で精度良く行うことが必要な医療現場での使用には
適さない。

【０００５】一方、共鳴ミラー法（Resonant Mirror De
tector method ；ＲＭＤ法）は、近年、生体物質間相互
作用の解析、例えば、免疫タンパク質のIgG(イムノグロ
ブン）のFv画分のタンパク質間の相互作用の解析に用い
られている [「バイオテクノロジーとバイオ工学」 (Bi
otechnology and Bioengineering) 、第59巻、第517-51
9 頁(1998)] 。このＲＭＤ法による生体物質間相互作用
の検出は、微量（μMオーダー）、短時間（分オーダ
ー）で可能であり、その解析も比較的容易であるという
特色をもっている。

【０００６】本発明者らは、先に、このＲＭＤ法（IAsy
s)を用いて、インフルエンザウイルス粒子の表面から切
り出したウイルス表面タンパク質であるヘマグルチニン
分子とインフルエンザウイルスレセプター糖鎖の相互作
用に関する研究を行っており、トリ卵中のウイルスから
得たヘマグルチニン分子が、トリ型糖鎖レセプターと強
い相互作用をもち、ヒト型レセプター糖鎖とは、ごくわ
ずかな相互作用しかしないことを見い出した（生命研ニ
ュース、Vol.7 No.3 (1999年5 月) 。しかしながら、こ
の方法は、インフルエンザウイルスからヘマグルチニン
分子を精製するのに複雑な化学的・生化学的処理を行わ
ねばならず、操作が煩雑であり、時間も要する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、インフルエンザウイルスの型を迅速かつ精度良く同
定・識別する手段を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、インフルエンザウ
イルスに対するレセプター糖鎖にインフルエンザウイル
スとは結合しない糖脂質を混合し、この混合糖脂質を共
鳴ミラー装置のセンサー表面に固定化する条件を検討す
ることによって、インフルエンザウイルスからヘマグル
チニン分子を単離精製することなく、インフルエンザウ
イルス自身を検体としてそのウイルスの型を迅速にかつ
精度よく同定・識別できることを見い出し、本発明を完
成させるに至った。

【０００９】即ち、本発明は、以下の工程： (a) 共鳴ミラー装置のキュベット内にインフルエンザウ
イルスに対するレセプター糖鎖を固定し、(b) 当該レセ
プター糖鎖にインフルエンザウイルス検体を反応させ、
(c) レセプター糖鎖とインフルエンザウイルスとの結合
により生じる共鳴角度変化を結合曲線に表し、(d) レス
ポンス強度をモニタリングすることを含むことを特徴と
する、インフルエンザウイルスの型の同定・識別方法で
ある。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明方法では、まず、共鳴ミラ
ー装置のキュベット内にインフルエンザウイルスと反応
するレセプター糖鎖（以下、レセプター糖鎖という。）
を固定する。共鳴ミラー装置は、IAsys装置（Affinity
Sensors社製）等の市販のものを使用すればよく、特に
限定はされない。この装置ではセンサー表面の誘電率、
屈折率の変化を、共鳴角度の変化として検出することが
できる。

【００１１】使用するレセプター糖鎖としては、シアリ
ル (2-3)ネオラクトテトラオシルセラミド（トリ型）、
シアリル (2-3)ラクトテトラオシルセラミド（トリ
型）、シアリル (2-6)ネオラクトテトラオシルセラミド
（ヒト型）、シアリル (2-6)ラクトテトラオシルセラミ
ド（ヒト型）等を挙げることができるが、これらに限定
はされない。

【００１２】レセプター糖鎖は、一定量のインフルエン
ザウイルスと結合しない糖脂質と混合し、この混合糖脂
質をキュベットに入れることによって、キュベット内の
底面（本明細書において、センサー表面ともいうことも
ある）に単層でかつ一様に並ぶような密度で固定する。
混合糖脂質中の両脂質の混合比が適当で、センサー表面
に固定化されたレセプター糖鎖の密度が適当であると、
レセプター糖鎖とウイルス表面に存在するヘマグルチニ
ン分子との間に一点結合が起こり、再現性のよい測定が
可能となる。

【００１３】ここで、レセプター糖鎖とインフルエンザ
ウイルスと結合しない糖脂質の混合比は、1:1,000 〜1:
100,000 となるようにすればよい。レセプター糖鎖に混
合するインフルエンザウイルスと結合しない糖脂質とし
ては、例えばシアル酸をもたないアシアロ糖脂質を用い
ることができるが、これに限定はされない。

【００１４】レセプター糖鎖がセンサー表面で複層とな
ったり、糖鎖の列が乱れたり、隙間ができたりすると、
信頼性の高い結果が得られない。すなわち、センサー表
面のレセプター糖鎖の密度が大きいと、ウイルス表面に
存在するヘマグルチニン分子との間に多点結合が起こ
り、この結果、結合曲線に基づき、擬一次反応として定
量的な解析（例えば、速度定数の算出) を行うことが困
難となる。また密度が小さいと、結合するウイルス分子
の数が減少するため、レスポンス強度が弱くなり、好ま
しくない。

【００１５】一方、センサー表面に固定したレセプター
糖鎖と反応させるインフルエンザウイルス検体（以下、
ウイルス検体という）は、適度な濃度に調整することに
よって、反応後にキュベットから緩衝液にて洗い流し、
キュベットの繰返し使用を可能にすることができる。か
かるウイルス検体の濃度としては、ウイルス表面タンパ
ク質濃度（最終）で0.001 μM 〜1 μM とすることが例
示される。

【００１６】ウイルス検体の濃度が大きすぎると、セン
サー表面への非特異的吸着の原因となり、キュベットか
らウイルスを完全に洗い流すことが出来ず、また濃度が
小さすぎると十分なレスポンス強度が得られないため、
良好な測定および解析が行えない。

【００１７】実際の医療現場では、患者から採取した咽
頭ぬぐい液やうがい液を遠心分離または濾過などで濃縮
し、これを上記の濃度に緩衝液にて調整したものをウイ
ルス検体として用いればよい。本発明では、ウイルス検
体中に100 個程度のウイルスが存在すれば、測定が可能
である。

【００１８】本発明において、センサー表面でのレセプ
ター糖鎖とウイルス分子の相互作用の変化は、両者の結
合により生じる共鳴角度変化から得られる結合曲線のレ
セポンス強度（振幅）をモニタリングすることにより行
う。得られた結合曲線のレスポンス強度（振幅）が大き
いと、ウイルス分子とレセプター糖鎖との相互作用が強
く、レセポンス強度（振幅）が小さいと、両者の相互作
用が弱いと判断できる。

【００１９】また、現在約３０種類が知られている種々
のレセプター糖鎖について、その結合曲線から速度定数
（結合定数）を算出し、データベースを作成しておく
と、医療現場で患者から採取したウイルス検体の同定・
識別や未知のウイルスの認識を短時間にすることが可能
である。従って、新しい型のインフルエンザウイルスが
ヒトの細胞にどれくらい結合しやすいかどうかの情報を
得るのにも役立つ。以下、本発明について実施例を挙げ
てさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。

【００２０】

【実施例】〔実施例１〕 (1) レセプター糖鎖の固定 レセプター糖鎖として、トリ型のシアリル (2-3)ネオラ
クトテトラシルセラミド（図１ (A)）を用い、IAsys装
置（Affinity Sensors社製）の試料用の疎水性キュベッ
ト（Hydrophobic Cuvette)上に、以下のようにして固定
させた。まず、上記の糖脂質100μg をクロロホルム100
μl に溶かした液を、糖脂質とアシアロＧＭ１の混合比
が1:10,000になるように、アシアロ糖脂質溶液と混合し
た。一方、上記キュベット中にイソプロパノール100μl
を入れておき、上記希釈液をIAsys装置のレゾナンスス
ペクトルが変化しないことを確認しながら適量を滴下
し、その後水を加え、キュベット中の溶液を約200μlに
した。続いて水にて洗浄し、有機溶媒（クロロホルムと
イソプロパノール）をほとんど除去し、キュベットの表
面が糖脂質の単層でなめらかに覆われるように処理し
た。最終的にキュベット表面を水で洗浄し、その後10mM
のリン酸緩衝液(pH7.4) でキュベットを満たした。上記
の操作は全て室温（25℃）で行なった。

【００２１】(2) ウイルスのレセプター糖鎖への結合 次に、公知の方法でニワトリの発育卵 (10日目) のしょ
う尿液中で培養・精製した香港Ａ型インフルエンザウイ
ルスPR／8（H1/N1 型)を10mMのリン酸緩衝液（pH7.4)に
溶かし、このウイルス希釈液を検体として用いた。検体
中のウイルス活性の確認は、ＨＡタイターにて行い、ま
た、ウイルス表面のタンパク質濃度はＢＣＡ法で決定し
た。ウイルス検体の濃度は、ウイルスをセンサー表面か
ら洗い流すことができ、かつ十分なレスポンス強度が得
られる範囲で出来るだけ薄い濃度となるよう、最終タン
パク質濃度で0.01μM になるよう調整した。これを緩衝
液で満たされたキュベットに滴下し、固定化したレセプ
ター糖鎖へのウイルスの結合をセンサー表面の屈折率変
化として検知した。

【００２２】図２に、共鳴ミラー装置のセンサー表面へ
のレセプター糖鎖の固定化、およびウイルス分子のレセ
プター糖鎖への結合を表す模式図を示す。また、得られ
た結合曲線を図３に示す。図３によれば、レスポンス強
度が強く、インフルエンザウイルスPR／8はトリ型レセ
プターと強く相互作用することがわかる。尚、結合曲線
より見かけの速度定数（kapp) を求めると、1.4x 10
^-3(S^-1) であった。

【００２３】〔実施例２〕レセプター糖鎖として、シア
リル(2-3) ネオラクトテトラオシルセラミドとシアル酸
がガラクトース基に結合する様式のみが異なるヒト型の
シアリル (2-6)ネオラクトテトラシルセラミド（図１
（B)）を用いる以外は、実施例１と同様にしてウイルス
のレセプター糖鎖への結合試験を行った。得られた結合
曲線を図４に示す。図３の結合曲線と比較すると、明ら
かにレスポンス強度が弱く、インフルエンザウイルスPR
／8はヒト型レセプターとの相互作用が弱いことがわか
る。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、インフルエンザウイル
スとレセプター糖鎖との相互作用を共鳴ミラー法により
解析し、ウイルスの型を同定・識別する方法が提供され
る。本発明によれば、患者が感染しているインフルエン
ザウイルスの型を微量（μＭ以下のオーダー）の試料
で、しかも分単位という短時間で、精度良く同定・識別
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】トリ型レセプター糖鎖であるシアリル (2-3)ネ
オラクトテトラオシルセラミド（Ａ）) 、ヒト型レセプ
ター糖鎖であるシアリル (2-6)ネオラクトテトラオシル
セラミド（Ｂ）の構造をそれぞれ示す。

【図２】共鳴ミラー装置のセンサー表面へのレセプター
糖鎖の固定化、およびウイルス分子のレセプター糖鎖へ
の結合様式を示す。

【図３】シアリル (2-3)ネオラクトテトラオシルセラミ
ド（トリ型）をレセプター糖鎖とした場合の結合曲線を
示す。

【図４】シアリル (2-6)ネオラクトテトラオシルセラミ
ド（ヒト型）をレセプター糖鎖とした場合の結合曲線を
示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の工程： (a) 共鳴ミラー装置のキュベット内にインフルエンザウ
   イルスに対するレセプター糖鎖を固定し、(b) 当該レセ
   プター糖鎖にインフルエンザウイルス検体を反応させ、
   (c) レセプター糖鎖とインフルエンザウイルスとの結合
   により生じる共鳴角度変化を結合曲線に表し、(d) レス
   ポンス強度をモニタリングすることを含むことを特徴と
   する、インフルエンザウイルスの型の同定・識別方法。
2. 【請求項２】 当該レセプター糖鎖を、キュベット内に
   単層でかつ一様に並ぶような密度で固定することを特徴
   とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 当該レセプター糖鎖に、一定量のインフ
   ルエンザウイルスとは結合しない糖脂質を混合させ、こ
   の混合糖脂質をキュベットに入れることによって、レセ
   プター糖鎖をキュベット内に固定させることを特徴とす
   る、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 当該レセプター糖鎖とインフルエンザウ
   イルスとは結合しない糖脂質の混合比が、1:1,000 〜1:
   100,000 である、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 インフルエンザウイルスとは結合しない
   糖脂質が、アシアロ糖脂質である、請求項３に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 インフルエンザウイルス検体の濃度が、
   反応後にキュベットから緩衝液にて洗い流すことがで
   き、かつレスポンス強度をモニタリングすることができ
   る限度に調整されていることを特徴とする、請求項１に
   記載の方法。
7. 【請求項７】 インフルエンザウイルス検体の濃度が、
   ウイルス表面タンパク質濃度で0.001 μM 〜1 μM であ
   る、請求項６に記載の方法。