WO2007026669A1 - ウイルスレセプター糖鎖認識特異性の判別方法 - Google Patents

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WO2007026669A1
WO2007026669A1 PCT/JP2006/316928 JP2006316928W WO2007026669A1 WO 2007026669 A1 WO2007026669 A1 WO 2007026669A1 JP 2006316928 W JP2006316928 W JP 2006316928W WO 2007026669 A1 WO2007026669 A1 WO 2007026669A1
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sugar chain
sialo
virus
chain
carrier
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PCT/JP2006/316928
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Inventor
Yasuo Suzuki
Akira Asai
Takashi Suzuki
Kazuya Hidari
Takeomi Murata
Taiichi Usui
Sou Takeda
Kohei Yamada
Toshitada Noguchi
Original Assignee
Shizuoka Prefectural Universities Corporation
National University Corporation Shizuoka University
Yamasa Corporation
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Definitions

  • the present invention relates to a method for discriminating a receptor sugar chain recognition specificity of a virus, a novel sialoglycan-containing polymer and carrier that can be used in the method, and an efficient production method thereof.
  • Influenza may be mild or symptomatic like a normal cold, or it may lead to a serious symptom such as a Spanish cold.
  • influenza is a common infectious disease, as bird flu has recently become a problem.
  • the host area of influenza virus is known to cover many animal species.
  • type A viruses have wild water birds such as ducks, turkeys, poultry such as chicks and quails, and animals such as pigs, horses, tusks, feathers, whales and seals as hosts.
  • HA hemagglutinin: hemaggluton
  • N A neuroaminidase
  • the antigenicity of influenza virus is determined by the combination of HA and NA, and is roughly classified into A, B, and C ⁇ 3 types. It is known that there are four subtypes of type A, including Hong Kong type. In type A, it is known that different subtypes appear with a period of about 10 years, and the antigenicity gradually changes year by year even in the same subtype (antigen shift). For this reason, the preventive effect that makes it difficult to produce a vaccine perfectly adapted to the prototype is a problem.
  • the classification of influenza virus types includes the classification based on antigenicity as described above and the difference in the binding properties of influenza virus to receptor sugar chains (Non-Patent Document 1). This classification is based on the difference in the binding mode of sialic acid at the end of the receptor sugar chain, and the recognition, binding or affinity of influenza virus receptor sugar chain. It is based on the difference in sex.
  • the most effective method for evaluating whether or not the avian influenza virus can infect humans is a method for confirming the binding property of the influenza virus to the receptor sugar chain. That is, even when avian influenza virus infects humans, the variation of the infected host is not always reflected in the genetic variation. However, since a mutation that binds to the receptor sugar chain is essential for infection, if the recognition specificity of the influenza virus to the receptor sugar chain or its mutation can be easily determined, the influenza virus In addition to discriminating types, it is also possible to predict the possibility of changes in the infected host and the spread of epidemics due to viral mutations.
  • Patent Document 1 a receptor sugar chain for influenza virus is immobilized in a cuvette of a resonance mirror device, and an influenza virus specimen is reacted with the receptor sugar chain. Then, the change in resonance angle caused by the binding between the receptor sugar chain and influenza virus is represented in a binding curve, and the response intensity is monitored. It is said that the recognition specificity of influenza virus receptor sugar chains can be determined from the response intensity.
  • sugar ceramides sialinole (2-3) neolatatotetraosylceramide (tri-type), sialy (2-3) ratatotetraosylceramide (tri-type), sialyl (2-6) neo Lactotetraosylceramide (human type), sialyl (2-6) ratatotetraosylceramide (human type), etc.
  • sugar ceramides and glycolipids that do not bind to influenza virus are further mixed. Is it extremely complicated to fix the mixed glycolipid to the bottom of the cuvette? We have prepared a complex receptor sugar chain by one complicated method.
  • a resonance mirror device it is necessary to use a special and large-sized device called a resonance mirror device. For this reason, it can be used in large-scale research facilities, but for example, it was difficult to use it at the site where patients occurred, at airports, poultry farms, fields such as stations, and at clinical sites such as hospitals.
  • Non-Patent Document 1 “Glycosylation process in virus infection” (Yasuo Suzuki, Biochemistry, Vol. 76, No. 3, pp. 227-233, 2004)
  • Patent Document 1 JP 2001-264333 A
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-73397
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 10-310610
  • Patent Document 4 Japanese Translation of Special Publication 2003-535965
  • Patent Document 5 Japanese Patent Publication No. 11-503525
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-115616
  • the present inventors have developed an ELISA method, an immunochromatography method, etc. that develop a method for easily determining the recognition specificity of a receptor sugar chain of influenza virus with an inexpensive and simple instrument. Application of immunoassay was attempted.
  • each problem has the following problems. Without solving these problems, it is impossible to establish a method for determining the recognition specificity of influenza virus to the receptor sugar chain. there were.
  • Patent Documents 2 to 4 As a receptor sugar chain-containing compound to which influenza virus can bind, various reports have been reported (Patent Documents 2 to 4), but a method for discriminating the recognition specificity of influenza virus to a receptor sugar chain has been reported. There is no report on a suitable receptor sugar chain-containing compound. Furthermore, in consideration of safety during measurement, it is essential that an inactivated virus sample can be used. However, even if an inactivated virus sample is used without treatment such as concentration, it is preferable to have any receptor sugar chain-containing compound that can bind to such a sample. Whether it is completely unknown.
  • An example of a receptor sugar chain-containing compound is a method disclosed in Patent Document 2 as a method for synthesizing a shear sugar chain-containing polyglutamic acid.
  • This method uses the transglycosylation reaction of
  • the desired sialoglycan-containing polymer was obtained by condensing with polydalamic acid and sialylating the oligosaccharide moiety using rat-derived sialyltransferase.
  • this method has the following disadvantages and is not a method that is industrially satisfactory.
  • Patent Documents 5 and 6 As a method for fixing a receptor sugar chain-containing compound to a carrier, a method using an appropriate linker is generally used (Patent Documents 5 and 6).
  • the method using a linker is not a simple method and is not a preferable method because it is a chemical reaction and an undesirable side reaction occurs.
  • the method using a linker is not a simple method and is not a preferable method because it is a chemical reaction and an undesirable side reaction occurs.
  • a sugar sugar chain-containing polyglutamic acid as the receptor sugar chain-containing polymer, there has been no report on the method for binding the sugar sugar chain-containing polyglutamic acid to the carrier.
  • sialoglycan-containing polymer particularly a sialoglycan-containing polyglutamic acid, which is a complex of a sialoglycan and a polymer that is not a single sialloglycan
  • This Sialoglycan-containing polyglutamic acid is modified by the synthesis scheme, synthesizes trisaccharide, and finally condenses with polyglutamic acid.
  • a liquid containing a sialo sugar chain-containing polymer is not used by a method of binding using a suitable linker or the like.
  • the polyglutamic acid containing a sialo sugar chain can be efficiently immobilized on the surface of the carrier.
  • the binding specificity of influenza virus to the receptor sugar chain was examined by a method applying ELISA, and the degree of binding was measured.
  • the inventors have found that it is possible to discriminate the recognition specificity of a virus for a receptor sugar chain, and it is possible to discriminate changes in an infected host due to virus mutation. That is, as a result of the above investigation, two or more types of carriers in which two or more types of sialoglycan-containing polymers are immobilized on the surface of one carrier or two or more types of polymers having different sialose glycans are immobilized on the surface of each carrier. Use two or more of the above The present inventors completed the present invention by discovering that changes in the infected host due to virus mutation can be identified by contacting the virus sample with each of the polymers containing the sialoglycan, measuring the degree of binding of each, and comparing the results. . Therefore, the present invention is as follows.
  • a method for discriminating the receptor sugar chain recognition specificity of a virus wherein the virus sample is brought into contact with a carrier on which a sialo sugar chain-containing polymer is immobilized, and the degree of binding thereof is measured.
  • a method of discriminating the receptor sugar chain recognition specificity of the virus wherein the virus sample is brought into contact with a carrier on which a sialo sugar chain-containing polymer is immobilized, and the degree of binding thereof is measured.
  • a method for discriminating changes in an infected host due to a virus mutation comprising a carrier in which two or more types of saccharosaccharide chain-containing polymers are immobilized on the surface of one carrier, or a different sialoglycan chain-containing polymer Using two or more types of carriers immobilized on the surface of each carrier, the virus sample is brought into contact with each of the two or more types of sialoglycan-containing polymers, the degree of binding of each is measured, and the results are compared.
  • a method of discriminating a change in an infected host due to a virus mutation characterized by discriminating a change in the infected host due to a virus mutation
  • Shiaro sugar chain-containing polymer Shiaro oligosaccharides force Shiarirurakuto system I type sugar chain (SA Q; 2- 6 (3 ) Gal J 8 1- 3GlcNAc J 8 1), Shiarirurakuto system ⁇ sugar Chain (SA Q; 2 — 6 (3) Gal j8 1— 4GlcNA C j 8 1—), sialyl gandario sugar chain (SA a 2-6 (3) Gal ⁇ 1—3GalNAc j8 1—) and shear
  • the virus sample power The above [1] or a sample of influenza virus
  • Z is a hydroxyl group or a sialoglycan binding site represented by formula ( ⁇ ), n represents an integer of 10 or more.
  • n represents an integer of 10 or more.
  • Ac is a acetyl group
  • X is a hydroxyl group.
  • R represents a hydrocarbon.
  • a sialose sugar represented by the following formula ( ⁇ ) and having a sialose sugar chain bound to ⁇ -polyglutamic acid Chain-containing polymer.
  • Z is a hydroxyl group or a sialoglycan binding site represented by the formula (IV), and n represents an integer of 10 or more.
  • n represents an integer of 10 or more.
  • Ac is a acetyl group
  • X is a hydroxyl group or Acetylamino group
  • R represents a hydrocarbon.
  • Z is a hydroxyl group or a sialo-glycan binding site represented by formula (VI), n represents an integer of 10 or more.
  • n represents an integer of 10 or more.
  • Ac is a acetyl group
  • X is Hydroxyl group or acetylamino group
  • R ′ represents a hydrocarbon other than phenol.
  • Z is a hydroxyl group or a sialo-glycan binding site represented by formula (VI), n represents an integer of 10 or more.
  • n represents an integer of 10 or more.
  • Ac is a acetyl group
  • X is Hydroxyl group or acetylamino group
  • R ′ represents a hydrocarbon other than phenol.
  • a Sialo sugar chain-containing polymer represented by the following formula (VII), wherein a Sialo sugar chain is bound to ⁇ -polyglutamic acid.
  • z is a hydroxyl group or a sialo-glycan binding site represented by formula (vm), and n is 1
  • a method for producing a sialo-sugar chain-containing polymer which also has the following process capability.
  • Step 3 Step of chemically binding the sialo sugar chain synthesized in Step 1 and polyglutamic acid (Step 3)
  • Sialo sugar chain strength Sialyl lactate type I sugar chain (SA 0: 2-6 (3) Gal j81— 3G1CNA Cj 8 1—), Sialyl lactate type II sugar chain (SAa2-6 (3) Galj81 — 4GlcNA Cj 81—), Siary From Luganglio sugar chain (3 80; 2—6 (3) 0 & 1
  • the production method of the above-mentioned [16] which is at least one sugar chain selected from the group force.
  • Cialyl lacto type I sugar chain (SA Q; 2-6 (3) Gal J 8 1-3 GlcNAc J 8 1—), Cialyl lacto type II sugar chain (SA a 2-6 (3) Gal j8 1— 4GlcNA C j 8 1—), sialyl gandario glycans (SA ⁇ 2— 6 (3) Gal j8 1— 3GalNAc ⁇ 1) and sialyl latatos glycans (SA «2-6 (3) Gall -4Glc) Group force A carrier immobilized on the surface by irradiating with ultraviolet light a polymer containing a sialo sugar chain in which at least one selected sialo sugar chain is bonded to polyglutamic acid.
  • kits for use in a method for discriminating receptor sugar chain recognition specificity of a virus according to [1] or [2] above or a mutation thereof, comprising the carrier according to [14] above.
  • the polyglutamic acid is ⁇ -polyglutamic acid or ⁇ -polyglutamic acid [11] The manufacturing method described.
  • the Sialo sugar chain of the Sialo sugar chain-containing polymer is a Sialyl lacto type I sugar chain (SA a 2-6 (3) Gal j8 1-3G1CNA C j 8 1-), Sialyl lacto type II sugar chain ( SA a 2—6 (3) Gal j8 1—4GlcNA C j 8 1—), sialyl gandario glycans (SA a 2—6 (3) Gal j8 1—3GalNAc ⁇ 1—) and sialyl ratatoses [13]
  • the carrier according to [13] which is at least one sugar chain selected from a group force consisting of sugar chains (SA «2-6 (3) Gall-4Glc).
  • the discrimination method of the present invention uses a carrier having immobilized a sialo sugar chain-containing polymer, particularly a sialo saccharide chain-containing polyglutamic acid, brought into contact with the virus, and determined the degree of binding using an immunological method.
  • the specificity of the test virus for the recognition of the receptor sugar chain is determined by measuring the above.
  • the discrimination method of the present invention can be easily carried out with a simple instrument. With the present invention, for example, it is possible to distinguish between human and avian infectious types of influenza virus, and the possibility of a change or epidemic of an infected host due to a virus mutation is possible. It became possible for the first time to predict sex.
  • Patent Documents 2 to 6 there are various methods for linking a sialo sugar chain to a carrier, including a saro sugar chain-containing polymer itself.
  • Patent Documents 2 to 6 there is a report that it is possible to determine the receptor sugar chain recognition specificity of a virus even using an inactivated virus sample. It is not considered that it can be discriminated again, and was achieved for the first time by the present inventors.
  • the sialo sugar chain-containing polyglutamic acid and the method for producing the same of the present invention is an efficient method using inexpensive raw materials. For this reason, it is possible to significantly reduce the cost of the polydaltamic acid containing the sialo sugar chain of the present invention, the carrier reagent and the kit on which it is immobilized, and the inspection can be carried out without requiring a large amount of expenses.
  • the kit of the present invention can also be used in countries such as developing countries.
  • an immunological measurement method such as ELISA, a biological measurement method, or the like can be applied to the carrier and kit. Therefore, the preparation of the carrier is easy and the determination operation is also simple. For this reason, the present invention can be practiced everywhere, and various kinds of nearby places where samples are brought in from places of occurrence such as poultry farms, slaughterhouses, hospitals, airports, stations, etc. that do not require the use of large equipment. It can be used in inspection facilities.
  • FIG. 1 is a graph showing the receptor sugar chain recognition specificity of an avian influenza A virus in one example of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the specificity of the human A influenza virus for recognition of the receptor sugar chain in the Example.
  • FIG. 3 is a graph showing the specificity of the human influenza B virus for recognition of the receptor sugar chain in the Example.
  • FIG. 4 is a graph showing the specificity of human influenza A virus for recognition of receptor sugar chains.
  • ⁇ is Poly (Neu5Ac ⁇ 2-6 Lac ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA), ⁇ is Poly (Neu5Ac ⁇ 2— 3 Lac ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA), ⁇ is Poly (La c j8-5- The results of aminopentyl / y-PGA) are shown.
  • FIG. 5 is a graph showing the specificity of avian influenza A virus for recognition of receptor sugar chains.
  • ⁇ is Poly (Neu5Ac ⁇ 2-6 Lac ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA), ⁇ is Poly (Neu5Ac ⁇ 2— 3 Lac ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA), ⁇ is Poly (La c j8-5- The results of aminopentyl / y-PGA) are shown.
  • FIG. 6 is a graph showing the specificity of human influenza A virus for recognition of receptor sugar chains.
  • ⁇ is Poly (Neu5Ac ⁇ 2— 6LacNAc ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA), ⁇ is Poly (Neu5Ac ⁇ 2— 3LacNAc ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA), ⁇ is Poly (Lac ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA) result.
  • FIG. 7 is a graph showing the specificity of avian influenza A virus for recognition of receptor sugar chains.
  • ⁇ is Poly (Neu5Ac ⁇ 2— 6LacNAc ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA)
  • ⁇ is Poly (Neu5Ac ⁇ 2— 3LacNAc ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA)
  • ⁇ is Poly (Lac ⁇ — 5— aminopentyl / ⁇ -PGA) result.
  • FIG. 8 is a graph showing the specificity of human influenza A virus for recognition of receptor sugar chains.
  • ⁇ is higher amount Poly (Neu5Ac o; 2-6LacNAc j8-5-aminopentyl / ⁇ -PGA), is higher molecular weight Poly (Neu5Ac o; 2-3LacNAc j8-5-amino pentyl / ⁇ -PGA) The results are shown.
  • FIG. 9 is a graph showing the specificity of avian influenza A virus for recognition of receptor sugar chains.
  • ⁇ is higher molecular weight Poly (Neu5Ac o; 2-6LacNAc j8— 5—aminopentyl / ⁇ -PGA)
  • ⁇ is higher molecular weight Poly (Neu5Ac a 2-3LacNAc j8—5—ami nopentyl / ⁇ -PGA) Results are shown.
  • FIG. 10 is a graph showing the specificity of human influenza A virus for recognition of receptor sugar chains.
  • ⁇ is Poly (Neu5 Ac ⁇ 2— 6LacNAc ⁇ - ⁇ -aminophenyl / ⁇ -PGA), ⁇ is Poly (Neu5 Ac ⁇ 2— 3LacNAc ⁇ -p-aminophenyl / y-PGA), ⁇ is Poly (Neu5 Ac a 2 — 6LacNAc j8—p-aminophenyl / a-PGA), Kokuyo shows the results for Pol y (Neu5Ac a 2-3—LacNAc ⁇ -p-aminophenyl / —PGA).
  • FIG. 11 is a graph showing the receptor sugar chain recognition specificity of the avian influenza A virus in the Example.
  • C SPob NeuSAc o ⁇ — eLacNAc jS—p— amino phenyl / ⁇ — PGA)
  • ⁇ is Poly (Neu5 Ac 2— 3LacNAc j8— p— aminophen ylZ ⁇ -PGA)
  • ⁇ is Poly (Neu5 Ac a 2— 6LacNAc j8-p-aminophenyl / -PGA), and the country shows the respective results for Poly (Neu5 Ac2-3LacNAc j8-p-aminophenyl / -PGA).
  • FIG. 12 shows an NMR chart of Poly (Neu5Ac a 2-3LacNAc j3-p-aminophenylZ a-PGA).
  • FIG. 13 shows an NMR chart of Poly (Neu5Ac a 2-6LacNAc ⁇ -p-aminophenylZ ⁇ -PGA).
  • FIG. 14 shows an NMR chart of Poly (LacNAci3-p-aminophenyl / y-PGA).
  • FIG. 15 shows an NMR chart of Poly (Neu5Ac a 2-3LacNAc ⁇ -p-aminophenyl / y-PGA).
  • FIG. 16 shows an NMR chart of Poly (Neu5Ac a 2-6LacNAc ⁇ -p-aminophenyl / y-PGA).
  • FIG. 17 shows the NMR chart of Poly (5-aminopentyl ⁇ -lactoside / ⁇ -PGA).
  • FIG. 18 shows an NMR chart of Poly (5-aminopentyl ⁇ -N-acetyllactosaminide / y-PGA).
  • FIG. 19 shows an N MR chart of Poly (Neu5Aco; 2-3Lac j8 -5 -aminopentyl / ⁇ -PGA).
  • FIG. 20 shows an N MR chart of Poly (Neu5Ac ⁇ 2-6Lac ⁇ -5-aminopentyl / y-PGA).
  • FIG. 21 shows an NMR chart of Poly (Neu5Aca2-3LacNAc j8-5-aminopentyl / y-PGA).
  • FIG. 22 shows an NMR chart of Poly (Neu5Ac ⁇ 2-6LacNAc j8-5-aminopentyl / —PGA).
  • a novel sialo sugar chain-containing polymer (2) a method for producing a sialo sugar chain-containing polymer, and (3) a reagent in which the sialo sugar chain-containing polymer is immobilized on a carrier
  • the present invention will be described in detail in the order of a kit and (4) a method for discriminating specificity of a receptor sugar chain of a virus.
  • novel Sialo Sugar Chain-Containing Polymer As the sialo sugar chain-containing polymer that can be used in the discrimination method of the present invention, the following novel sialo sugar chain-containing polymers can be used in addition to the known sialo sugar chain-containing polymers. This novel sialo sugar chain-containing polymer can be prepared at a lower cost than known polymers and has a structure similar to that of natural mucin, and thus is suitable for the discrimination method of the present invention.
  • Z is a hydroxyl group or a sialoglycan binding site represented by formula ( ⁇ ), n represents an integer of 10 or more.
  • n represents an integer of 10 or more.
  • Ac is a acetyl group
  • X is a hydroxyl group.
  • R represents a hydrocarbon.
  • Z is a hydroxyl group or a sialo-glycan binding site represented by formula (IV), n represents an integer of 10 or more.
  • n represents an integer of 10 or more.
  • Ac is a acetyl group
  • X is Hydroxyl group or acetylamino group
  • R represents a hydrocarbon.
  • Z is a hydroxyl group or a sialo-glycan binding site represented by formula (VI), n represents an integer of 10 or more.
  • Ac is a acetyl group
  • X is Hydroxyl group or acetylamino group
  • R ′ represents a hydrocarbon other than phenol.
  • Z is a hydroxyl group or a sialoglycan binding site represented by the formula (VIII), n represents an integer of 10 or more.
  • Ac is a acetyl group
  • X is A hydroxyl group or an acetylamino group
  • R ′ represents a hydrocarbon other than phenylene.
  • the hydrocarbon represented by R or R ' may be any of a saturated hydrocarbon group and an unsaturated hydrocarbon group, preferably those having 1 to 20 carbon atoms. Specific examples include an alkyl group, an alkyl group, an alkyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, and a cycloalkyl-substituted alkyl group.
  • examples of the alkyl group, the alkyl group, and the alkyl group include straight-chain or branched-chain groups having 1 to 20 carbon atoms.
  • Specific examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and n Linear alkyl groups such as propyl, n-butyl, n-pentyl, n-hexyl, n-octyl, n-decyl, n-dodecyl, n-tetradecyl; isopropyl, isobutyl, t-butyl And branched chain alkyl groups such as 2-ethylhexyl group.
  • alkenyl group examples include a bur group, a propenyl group, and a allyl group.
  • alkyl group examples include an ethur group, a propynyl group, and a butur group.
  • examples of the cycloalkyl group include those having 3 to 10 carbon atoms, and those having 3 to 8 carbon atoms such as cyclopropyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group and the like are particularly preferable.
  • aryl groups include those having 6 to 14 carbon atoms, such as a phenol group, a tolyl group, and a naphthyl group.
  • aralkyl group examples include an aralkyl group having 7 to 14 carbon atoms, specifically, a benzyl group and a phenethyl group.
  • Cycloalkyl-substituted alkyl groups include C3-C8 cycloalkyl-substituted C1-C10 alkyl groups such as cyclopropylmethyl group, cyclopentylmethyl group, cyclohexylmethyl group, cyclopropylethyl group, cyclopentylethyl group, cyclohexylethyl group, A cyclopropylpropyl group, a cyclopentylpropyl group, a cyclohexylpropyl group, etc. are mentioned.
  • the hydrocarbon may have a substituent.
  • substituents include a hydroxyl group, an azide group, a cyano group, an alkoxy group, a cycloalkyloxy group, an aryloxy group, A carboxyl group etc. are mentioned.
  • the carboxyl group may be esterified.
  • the Sialo sugar chain-containing polymer of the present invention may be either a salt type or a free acid type.
  • the salt form include alkali metal salts (eg, sodium salt, potassium salt, etc.); alkaline earth metal salts (eg, calcium salt, magnesium salt, etc.); organic base salts (eg, trimethylamine salt, triethylamine salt, pyridine salt) , Picoline salt, dicyclohexylamine salt, etc.). Further, it may be a hydrate or a solvate with alcohol or the like.
  • the molecular weight of the sialosaccharide chain-containing polymer of the present invention is, for example, in the range of 20 to 5 million.
  • the glutamic acid unit polymerization degree (n) is, for example, in the range of 10 to: LOOOO.
  • the rate of introduction of sialyl oligosaccharides with respect to dartamic acid residues is in the range of 10-80%.
  • Specific examples of such a sialo-sugar chain-containing polymer include the following compounds.
  • PGA polyglutamic acid
  • Neu5Ac sialic acid
  • LacNAc N-acetylylatotosamine
  • Lac ratatose
  • the enzyme used is an unpurified product.
  • microorganism-derived enzymes can be easily produced in large quantities using Escherichia coli as a host compared to animal-derived enzymes.
  • glycosyltransferases derived from microorganisms when glycosyltransferases derived from microorganisms are used, glycopeptides or glycoproteins are used as glycosyl receptors. In many cases, it cannot be done. For this reason, it is desirable to perform condensation with polyglutamic acid after synthesizing sialyl oligosaccharides.
  • the method for producing a sialo-sugar chain-containing polymer of the present invention is characterized by the following process power. (Process 1)
  • Step 1 is a reaction system containing a sugar acceptor (for example, sugar monopara-tropenol, 5-aminoalkyl sucrose, etc.) and a sugar donor (various sugar nucleotides) with a suitable glycosyltransferase added.
  • a sugar acceptor for example, sugar monopara-tropenol, 5-aminoalkyl sucrose, etc.
  • a sugar donor variant sugar nucleotides
  • the glycosyltransferase to be added to the reaction system is not particularly limited as long as it has an activity of transferring a sugar residue of a sugar nucleotide to a sugar receptor.
  • galactosyltransferase, glucosyltransferase, fucosyltransferase, Mannosyl transferase, sialyl transferase and the like can be mentioned.
  • enzymes may be in any form as long as they have the desired enzyme activity.
  • the enzyme gene is cloned, expressed in large quantities in microbial cells, and the enzyme is produced in large quantities and is obtained by enzyme production using so-called DNA recombination technology. It ’s the most convenient!
  • the enzyme preparation include microbial cells, processed products of the cells, enzyme preparations obtained from the processed products, and the like.
  • the microbial cells can be prepared by using a medium in which the microorganism can grow, culturing by a conventional method, and collecting the cells by centrifugation or the like.
  • the medium may be bouillon medium, LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% salt) or 2 XYT medium (1 6% tryptone, 1% yeast extratate, 0.5% salt) can be used.
  • the obtained culture solution is centrifuged to collect microbial cells, whereby microbial cells having the desired enzyme activity can be prepared.
  • Examples of the treated microbial cells include disrupted cells obtained by treating the cells according to a general treatment method, or modified cells of the cell walls or cell membranes.
  • Common treatment methods for bacterial cells include mechanical disruption (by Warinda blender, French press, homogenizer, mortar, etc.), freeze-thaw, autolysis, drying (by freeze-drying, air drying, etc.), enzyme treatment (lysozyme). Etc.), ultrasonic treatment, chemical treatment (by acid, alkali treatment, etc.).
  • Examples of the enzyme preparation include a crude enzyme or a purified enzyme obtained from the above treated bacterial cell.
  • the crude enzyme or purified enzyme is obtained by subjecting the fraction having the enzyme activity from the above-mentioned treated product of cells to usual enzyme purification means (salting out treatment, isoelectric point precipitation treatment, organic solvent precipitation treatment, dialysis treatment, various chromatography treatments). Etc.).
  • the working concentration can be appropriately set in the range of 1 to 200 mM, preferably 5 to 50 mM.
  • 5-aminoalkyl sucrose is used as the sugar acceptor, as shown in the examples described later, the reverse reaction of cellulase is used to alkylate the saccharide hydroxyl group. It is pretty.
  • the synthesis of the sialo-sugar chain is carried out in such a reaction system containing the sugar receptor and sugar nucleotide that the glycosyltransferase is added in an amount of 0.001 unit Zml or more, preferably about 0.01 to 10 units Zml.
  • the reaction can be carried out by reacting at 5 to 50 ° C., preferably 10 to 40 ° C. for 1 to about LOO time, with stirring if necessary.
  • the Sialo sugar chain produced in this way can be isolated and purified using a normal oligosaccharide separation and purification means. For example, it can be isolated and purified by appropriately combining reverse phase ODS column chromatography or ion exchange column chromatography.
  • Step 2 is a step of chemically condensing the sialo sugar chain synthesized in Step 1 to the carboxyl group side chain of polyglutamic acid.
  • a sugar acceptor having a p-trope group is used as a sugar acceptor in Step 1
  • a nitro group is reduced to an amino group and then converted into an amino group, and then the 5-aminoalkyl as a sugar acceptor.
  • sucrose is used, the protecting group of the amino group is deprotected by a conventional method, and then polyglutamic acid is treated with a condensing agent in the presence of a base such as triethylamine or triptylamin to produce a polymer containing a sialo sugar chain.
  • a base such as triethylamine or triptylamin
  • the conditions used for the reduction reaction of the p-trofuryl group may be those usually applied to the reduction of the aromatic-tro group.
  • it can be carried out by treating with noradium carbon in an organic solvent such as water, methanol or ethanol in the presence of hydrogen or a hydrogen donor such as ammonium formate or cyclohexene.
  • the polyglutamic acid used as the raw material polymer may be either a-type or ⁇ -type.
  • the active polymer of the carboxyl group (chloroformic acid ⁇ -tropeol) is used in the presence of a base (such as triethylamine or tributylamine) in an organic solvent (such as dimethylformamide or dimethylsulfoxide).
  • a base such as triethylamine or tributylamine
  • organic solvent such as dimethylformamide or dimethylsulfoxide.
  • the amount of aminoalkyl sucrose or the product of the above reduction reaction may be added according to the sugar substitution rate of the target sialoglycan-containing polymer. Usually, glutamic acid units of polyglutamic acid are used. 0.1 equivalent or more is sufficient. The amount of base used for the condensation reaction may be 1 equivalent or more with respect to the glutamic acid unit of polyglutamic acid.
  • the condensation reaction can be carried out at -10 ° C to 100 ° C. If necessary, it is also possible to add a catalyst for a general reaction such as 4-N, N dimethylaminopyridine or 1-hydroxy-1H-benzotriazole.
  • a catalyst for a general reaction such as 4-N, N dimethylaminopyridine or 1-hydroxy-1H-benzotriazole.
  • Step 3 is a step of isolating and purifying the sialo sugar chain-containing polymer synthesized in Step 2 to obtain the target sial sugar chain-containing polymer.
  • Isolation and purification of the sialosaccharide chain-containing polymer synthesized in step 2 is usually performed by the method used for protein purification. For example, dialysis or gel filtration can be combined as appropriate. It can be isolated and purified.
  • the carrier for immobilizing the sialo sugar chain-containing polymer is not particularly limited, and for example, plates, fine particles and the like can be used.
  • the plate include a plate having a well (for example, a microtiter plate), a silica gel plate for thin layer chromatography, and the like.
  • the fine particles include beads and chips.
  • the material of the carrier is not particularly limited, and various papers, synthetic resins, metals, ceramics, glass and the like can be used. Among them, in particular, a plate having a well (eg, Corning-Costar, Lab coat 2503, Cambridge, MA) that can fix a polymer containing a sugar sugar chain to a carrier by ultraviolet irradiation is desirable.
  • the above-mentioned Saro sugar chain in the Sialo sugar chain-containing polymer is, for example, a sialylacto type I sugar chain (SAQ; 2-6 (3) Gal J 81-3GlcNAc J 81-), a sialylacto type sugar chain (SAQ). ; 2- 6 (3) Galj81- 4GlcNA Cj 81-), Xia Lil cancer Dario based oligosaccharides (SAa2- 6 (3) G alj81- 3GalNAc ⁇ 1-) and Xia Rirura Tato scan oligosaccharides (SA «2-6 (3) Gall— 4G1 c—).
  • sialylacto type I sugar chains SA a 2-6 (3) Gal j81-3GlcNA Cj 81—
  • sialylacto type II sugar chains SAa2-6 (3) Galj81-4 GlcNAciS 1-
  • the sialic acid may be a derivative of sialic acid.
  • SA or “Neu5Ac” does not mean “N-acylneuraminic acid”.
  • the terminal sialic acid binding mode is, for example, rSA «2-3G aljSl-" (hereinafter referred to as “2-3 type"), "SAa2-6Galj81-” (hereinafter referred to as “ 2-6 ”) and“ SAa2-8Galj81— ”(hereinafter referred to as“ 2-8 ”).
  • the polymer in the sugar chain-containing polymer is not particularly limited, and for example, a chemically synthesized polymer such as polyglutamic acid, polyacrylamide, and polystyrene, a natural glycoprotein such as fetuin, and a sugar chain-containing lipid are used. it can.
  • examples of the sugar chain-containing lipids include chemically synthesized glycolipids having a lipid moiety having fatty acids and derivatives thereof, natural ganariosides or glycolipids such as cereal paragloboside, sialyl ratatotetraosylceramide, and chemically synthesized perennialosides or glycolipids. Etc. Among them, especially polydaltami Either ⁇ -type or ⁇ -type acid is preferred.
  • a specific example of the above-mentioned sialo sugar chain-containing polymer is a sialo sugar chain-containing polyglutamic acid obtained by introducing a sialyl oligosaccharide into polyglutamic acid.
  • the molecular weight is, for example, in the range of 20 to 5 million
  • the glutamic acid unit polymerization degree is, for example, 10 to: LOOOO
  • the introduction rate of sialyloligosaccharide to the glutamic acid residue is in the range of 10 to 80%. It is.
  • examples of the sialoglycosylated polyglutamic acid obtained by introducing sialyloligosaccharide into polyglutamic acid include the following known sialoglycan-containing polymers.
  • Such a shear sugar chain-containing polyglutamic acid can be prepared by a known method other than the production method of the present invention described above. Specifically, synthesized para by transglycosylation of j8-galactosidase - Torofue - Le glycoside introduced (Para - - Torofue Rutoru N Asechiru 13-1 la Kutosaminido) polyglutamic acid, further, alpha 2, 3 (New ) — And ⁇ 2,6- ( ⁇ ) -Sialyltransferase can be used to prepare the introduced oligosaccharide by sialylation. Specific examples of this preparation method will be described later as reference examples.
  • Immobilization of the sialo sugar chain-containing polymer to the carrier can also be performed using a hydrophobic bond, an ionic bond, a covalent bond, or the like.
  • a hydrophobic bond for example, an ionic bond, a covalent bond, or the like.
  • ultraviolet irradiation treatment is the most effective and simple method.
  • a solution containing a polyglutamic acid containing a sialo sugar chain is brought into contact with the plate, and in this state, the carrier is irradiated with ultraviolet rays. Thereafter, by removing the liquid, it is possible to immobilize the sialo sugar chain-containing polyglutamic acid on the surface of the support.
  • the ultraviolet irradiation treatment it is preferable to set the conditions in advance because the reaction time varies depending on the intensity of ultraviolet rays and the distance to the plate.
  • the carrier on which the thus prepared Sialo sugar chain-containing polymer is immobilized is preferably subjected to a blocking treatment in order to prevent non-specific adsorption of viruses.
  • the blocking treatment can be performed using, for example, ushi serum albumin (BSA), defatted BSA, ovalbumin, force zein, a commercially available blocking agent, and the like.
  • the degree of binding can be measured by applying an immunological measurement method such as an ELISA method, an immune chromatographic method, or an immune agglutination method.
  • an immunological measurement method such as an ELISA method, an immune chromatographic method, or an immune agglutination method.
  • sandwich type immunoassay an antiviral primary antibody against the virus and a labeled secondary antibody against the primary antiviral antibody are used.
  • Body or labeled protein A may be used.
  • it is possible to measure the degree of binding according to the degree of aggregation by using a fine particle carrier such as a bead as the carrier, which is not limited to the sandwich type immunoassay.
  • methods for detecting virus-specific components by methods other than immunoassay methods for example, detection of viral spiking proteins hemadalchun and neuraminidase, detection of their biological activity, etc. may be available. it is obvious.
  • the anti-viral primary antibody is not particularly limited, and may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the polyclonal antibody include anti-influenza virus heron serum.
  • Monoclonal antibodies include those that react with all type A viruses, such as monoclonal antibodies against type A virus nucleoprotein.
  • the origin of the antibody is not particularly limited, and for example, antibodies of various origins such as a rabbit antibody, a mouse antibody, a rat antibody, a goat antibody, an Inu antibody, and a Hedge antibody can be used.
  • the antibody class is not particularly limited, and all of IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE can be applied.
  • the label of the labeled secondary antibody or labeled protein A is not particularly limited, and examples thereof include enzyme labels (for example, horseradish peroxidase), fluorescent labels, and radioactive labels.
  • the origin of the antibody is not particularly limited, and various origins such as a rabbit antibody, a mouse antibody, a rat antibody, a goat antibody, an Inu antibody, and a Hedge antibody can be used.
  • the antibody class is not particularly limited, and all of IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE can be applied.
  • an enzyme-labeled rabbit IgG antibody is preferable.
  • the virus to be discriminated is not particularly limited, and can be applied to various viruses corresponding to the sialoglycan-containing polymer used.
  • influenza virus paramyxovirus group, parainfluenza virus group, rotavirus, adenovirus, coronavirus, poliovirus, etc.
  • influenza virus include highly pathogenic Avian influenza virus, human influenza A virus, and human influenza B virus.
  • the virus sample used for the measurement may be an inactivated virus sample. Good.
  • it can be measured by the method of the present invention even if it is used as it is without concentrating virus culture grown chicken egg chorioallantoic fluid inactivated by ether treatment.
  • the measurement procedure itself may be performed in accordance with known means of the means employed!
  • an immunological measurement method is it possible to react a polymer containing a fixed isosialoglycan with a test virus sample, and if necessary, react with a labeled antibody after BF separation (two-step method)?
  • the solid phase antibody, the test sample and the labeled antibody are reacted at the same time (one-step method).
  • the receptor sugar chain recognition specificity of the virus in the sample can be detected by a method known per se thereafter.
  • a carrier having two or more kinds of the sugar sugar chain-containing polymers immobilized on the surface may be used as the carrier.
  • the degree of binding of the virus! / Is measured for each of two or more types of the polymer containing the sialoglycan chain, and the results are compared to determine the receptor sugar chain recognition specificity of the virus, that is, the virus. It is possible to determine the type of infection and to detect changes in the infected host due to the mutation. That is, in a plate having a plurality of wells, a different type of sialo-sugar chain-containing polymer is used for each well or each row of wells.
  • the virus is supplied to each well, and the recognition specificity of each well is compared to determine the infection type of the virus and the change in the infected host due to its mutation.
  • a plurality of carriers prepared by fixing different types of sialosaccharide chain-containing polymers for each carrier are prepared.
  • the degree of binding of the virus is measured for each carrier to which two or more types of the above-mentioned polymers containing the sialoglycan are bound, and the results are compared and the infection type of the virus and the infection host due to the mutation thereof are compared. Detect changes.
  • a fine particle carrier such as a bead
  • a virus is supplied for each carrier, and the recognition specificity between the fine particle carriers is compared by, for example, the degree of aggregation. In this way, the infection type of the virus may be determined.
  • the kit of the present invention is placed in a carrier on which the above-mentioned Sialo sugar chain-containing polymer is immobilized, and further, an antiviral antibody (for example, against virus) for detecting a virus trapped on the carrier.
  • an antiviral antibody for example, against virus
  • the antibody is as described above.
  • Kakaramram MMiigghhttyyssiill SSii6600 ((((ii)) 44 .. 66 XX 225500mmmm))
  • Solvent solvent 9900% CCHH CCNN
  • Kakaramram :: YYMMCC PPrroo CC1188RRSS (( ⁇ ii)) 66 .. 00 XX 115500mmmm))
  • Lac Lactose (Gal ⁇ 1— 4Grlc
  • LacNAc N-acetyllactosamine (Gal ⁇ 1— 4GlcNAc)
  • Neu5Ac N-ac etylneur aminic acid
  • CMP ⁇ CMP ⁇ N ⁇ acetylneuraminic acid
  • PBS 10 mM Phosphate buffered saline (pH7.4)
  • IPTG Isopropyl- beta- D- thiogalactopyrano side
  • Example 1 3, 1 SLN-a PGA (Poly (Neu5 Ac H2-3 LacN Ac j8-p-aminoph enylZ-PGA)) and 6,-SLN-a PGA (Poly (Neu5 Ac a 2 ⁇ 6LacNAc ⁇ 1 p-aminophenyl / 1 PGA))
  • ⁇ 1,4-GalT was prepared using the expression plasmid pTGF-A described in the method of Noguchi et al. (JP 2002-335988).
  • E. coli JM109 carrying pGTF-A was inoculated into 50 ml of 2 X YT medium containing 100 gZml of ampicillin, and cultured with shaking at 30 ° C. When the cell concentration reached X 10 8 Zml, IPTG was added to the culture solution to a final concentration of 0. ImM, and the shaking culture was continued at 30 ° C for 16 hours.
  • the cells were collected by centrifugation (9, OOO X g, 20 minutes) and suspended in 5 ml of a buffer (10 mM Tris hydrochloride (pH 8.0), ImM EDTA).
  • a buffer (10 mM Tris hydrochloride (pH 8.0), ImM EDTA).
  • the microbial cells were crushed by sonication, and the microbial cell residues were removed by centrifugation (20, OOO X g, 10 minutes), and the resulting supernatant fraction was used as an enzyme solution.
  • the j8 1,4-GalT activity in the enzyme solution was measured by the method described in JP 2005-335988 A.
  • the preparation of a 2,3-SiaT was carried out using the expression plasmid pMal-siaT described in the method of Noguchi et al. (JP 2002-335988).
  • Escherichia coli JM109 carrying pMal-siaT was inoculated into 50 ml of 2 X YT medium containing 100 g / ml ampicillin and cultured at 30 ° C with shaking. When the cell concentration reached X 10 8 cells / ml, IPTG was added to the culture solution to a final concentration of 0.1 mM, and the shaking culture was continued at 30 ° C for 16 hours.
  • the cells are collected by centrifugation (9, OOO X g, 20 minutes), and 5 ml of buffer solution (lOOmM) is collected. It was suspended in squirrel hydrochloric acid (pH 8.0), 10 mM MgCl 2. Disrupt cells by sonication
  • the cell residue was removed by centrifugation (20, OOO X g, 10 minutes), and the resulting supernatant fraction was used as an enzyme solution.
  • the a 2,3-SiaT activity in the enzyme solution was measured by the method described in JP 2005-335988 A.
  • Chromosomal DNA from Photobatarum 'Damcella subsp. Damsela was prepared by the following procedure. First, the lyophilized cells of the bacterium were suspended in 100 / zL of 50 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 8.0) and 20 mM EDTA, and then added with 10 L of 10% SDS solution at room temperature. Let it stand for 5 minutes to lyse. Then, the lysate of the lysate is extracted from the phenol and ethanol precipitation, and then dissolved in 20 ⁇ M of anther buffer (10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), ImM EDTA). Chromosomal DNA was prepared.
  • DNA amplification of the region containing the bst gene by PCR was performed by heat denaturation (94 ° C, 1 min) and annealing (47 ° C) using reaction solution 100 1 using DNA Thermal Cycler Dice (Takara Bio Inc.). C, 1 minute) and an extension reaction (72 ° C, 2 minutes) were repeated 36 times.
  • the reaction solution contains lOxPyrobest Buffer (Takara Bio Inc.) 10 1, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dTTP, , Primer DNA (A) Pleasure (B) 0.2 M each and Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) 2.5 units.
  • lOxPyrobest Buffer (Takara Bio Inc.) 10 1, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dTTP, , Primer DNA (A) Pleasure (B) 0.2 M each and Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) 2.5 units.
  • the amplified DNA was subjected to the method described in the literature (Molecular Cloning (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). After separation by agarose gel electrophoresis, a 2.3 kb DNA fragment was purified. Using this DNA as a saddle type, the two types of primer DNAs (C) and (D) shown below were used to amplify the photobatterium damsella bst gene by PCR.
  • Primer (C) 5, 1 CTTGGATCCTGTAATAGTGACAATACCAGC-3
  • Primer (D) 5,-TAAGTCG ACTTAAGCCC AG AAC AG AAC ATC-3
  • Amplification of the bst gene by PCR was performed by heat denaturation (94 ° C, 1 min), annealing (52 ° C, 1 min) using DNA Thermal Cycler D ice (Takara Bio). ) And an extension reaction (72 ° C, 2 minutes) was repeated 30 times.
  • the reaction solution contains lOxPyrobest Buffer (Takara Bio Inc.) 101, concentration 0.2 mM dATP, concentration 0.2 mM dGTP, concentration 0.2 mM dCTP, concentration 0.2 mM dTTP. 0.1 ng, primer DNA (C) and (D) 0.2 M each, and 2.5 units of Pyrobest DN A polymerase (Takara Bio Inc.).
  • DNA was separated by agarose gel electrophoresis, and a 1.5 kb DNA fragment was purified.
  • the obtained DNA fragment was cleaved with restriction enzymes BamHI and Sail, and ligated with plasmid pTrc l 2-6 (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-103973) digested with restriction enzymes BamHI and Sail using T4 DNA ligase.
  • Escherichia coli ⁇ 12 ⁇ 109 obtained from Takara Bio Inc.
  • plasmid ⁇ 12-6-pst AN was isolated from the resulting kanamycin resistant transformant.
  • Escherichia coli JM109 carrying plasmid pl 2-6-pst AN was added to a medium containing 2 ⁇ gZml kanamycin (2% peptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl, 0.15% Darco Inoculated into 100 ml and cultured with shaking at 30 ° C. After 5 hours, IPTG was added to the culture solution to a final concentration of 0.2 mM, and shaking culture was continued at 18 ° C for 20 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (9, OOOxg, 10 minutes) and suspended in 2.5 ml of a buffer (20 mM sodium acetate (pH 5.5)) to obtain a suspension.
  • a buffer (20 mM sodium acetate (pH 5.5)
  • the ⁇ 2,6 sialyltransferase activity was determined by measuring the conversion activity of CMP-NeAc and N-acetylyllactosamine to 6'-SialylLacNAc by the method shown below. Specifically, an ⁇ 2,6-sialyltransferase enzyme preparation was added to 25 mM Tris-HCl buffer (pH 5.5), 50 mM CMP-NeAc, and 10 mM N-acetyllactosamine. Incubate at ° C for 10 minutes. The reaction is stopped by boiling for 3 minutes, and the sugar content is measured by HPAEC-CD (High-performance anion-exchange chromatography coupled with conductivity detection).
  • HPAEC-CD High-performance anion-exchange chromatography coupled with conductivity detection
  • the synthesized solution was adsorbed onto an ODS column (340 mL, equilibrated with 50 mM triethylamine hydrogen carbonate), and the target product was eluted with 5-10% MeOH—50 mM triethylamine hydrogen carbonate.
  • the 3'-SLN-pNP elution fraction was collected, and the collected elution fraction was concentrated and then azeotroped 5 times with water to remove triethylamine bicarbonate.
  • the ODS column recovered solution was made up to 150 mL, adsorbed on a DEAE column (330 mL), and eluted with 0.05N ammonium hydrogen carbonate aqueous solution to recover the 3′-SLN-pNP elution fraction.
  • the synthesized solution was adsorbed on an ODS column (300 mL, equilibrated with 50 mM triethylamine hydrogen carbonate), and the target product was eluted with 5-10% MeOH-50 mM triethylamine hydrogen carbonate.
  • the 6'-SLN-pNP elution fraction was collected, and the collected elution fraction was concentrated and then azeotroped 5 times with water to remove triethylamine bicarbonate.
  • the ODS column recovered solution was made up to 150 mL, adsorbed on a DEAE column (300 mL), and eluted with 0.05N aqueous ammonium hydrogen carbonate solution to recover the 6'-SLN-pNP elution fraction.
  • the dialyzed sample was collected and applied to an ion exchange column (Dowe X AG 50W-8X, 3 ml). After adsorption, it was eluted with 30 ml of ultrapure water, and the total amount of adsorbed solution was recovered (40-45 ml). The recovered solution was concentrated to 0.8 m 1 by evaporator concentration (bath temperature 40 ° C) and freeze-dried (shelf temperature 20 ° C, ⁇ ) to obtain 37.4 mg of 3'-SLN- ⁇ PGA. The obtained 3′-SLN-aPGA was subjected to 1 H-NMR analysis, and the sugar residue substitution degree was calculated based on the following formula. As a result, it was calculated to be 68% (see FIG. 12).
  • the dialyzed sample was collected and applied to an ion exchange column (Dowex AG 50W-8X, 3 ml). After adsorption, elution was performed with 30 ml of ultrapure water, and the total amount of adsorbed solution was recovered (40-45 ml). The recovered solution was concentrated to 0.8 ml by evaporator concentration (bath temperature 40 ° C) and freeze-dried (shelf temperature 20 ° C, ⁇ ) to obtain 39.6 mg of 6'-SLN- ⁇ PGA. The obtained 6′-SLN-aPGA was subjected to 1 H-NMR analysis, and the sugar residue substitution degree was calculated based on the following formula. As a result, it was calculated as 66% (see FIG. 13).
  • Example 2 3, -SLN- ⁇ PGA (Poly (Neu5AcQ; 2- 3LacNAc J 8-p- aminoph enyl / y - PGA)) and 6 '- SLN - y PGA ( Poly (Neu5Ac a 2- 6LacNAc ⁇
  • LacNAc—pNP (550 mg, 1. 09 mmol) was dissolved in methanol (10: 1, 44 ml).
  • the dialyzed sample was collected and applied to an ion exchange column (Dowex AG 50 W-8X, 3 ml). After adsorption, elution was performed with 30 ml of ultrapure water, and the total amount of adsorbed solution was recovered (45 ml). The collected liquid was concentrated to 0.8 ml by evaporator concentration (bath temperature 40 ° C) and freeze-dried (shelf temperature 20 ° C, ⁇ ) to obtain 9. Omg of 3, -SLN- ⁇ PGA. The obtained 3, —SLN— y PGA was subjected to —NMR analysis, and the rate of sialylation was determined based on the following formula. As a result, it was calculated to be 99% (see FIG. 15).
  • the collected sample was placed in a dialysis tube and dialyzed against 1000 ml of distilled water and ultrapure water.
  • the dialyzed sample was collected and applied to an ion exchange column (Dowex AG 50 W-8X, 3 ml). After adsorption, elution was performed with 30 ml of ultrapure water, and the total amount of adsorbed solution was recovered (45 ml).
  • the collected solution was concentrated to 0.8 ml by evaporator concentration (bath temperature 40 ° C) and freeze-dried (shelf temperature 20 ° C, ⁇ ) to obtain 7.4 mg of 6, -SLN- ⁇ PGA.
  • the resulting 6, - SLN- performed 1 H- NMR analysis for YPGA, based on the following formula, the result of obtaining the Shiariru rate was calculated to be 99% (see Figure 16).
  • Trichoderma reesei-derived senolase (cellulase XL-522) was purchased from Nagase Chemtetus. ⁇ 2, 3- ( ⁇ ) —Sialyltransferase (Rat, Recombinant, Spodoptera frugiperda), ⁇ 2, 6- (N) —Sialyltransferase (Rat, Recombinant, Spodoptera frugiperda) were purchased from CALBIOCHEM . Alkaline phosphatase was purchased from Boehringer Mannheim.
  • Lactose Monohydrate, 5-amino- 1-pentanol is fluorescent! 3 ⁇ 4 medicine (Purchased from Shin. ⁇ -PGA, CMP— Neu5Ac, LacNAc were used after purification from commercial products.
  • Trifluoroacetic Anhvdride and MnCl 4 ⁇ were purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ⁇
  • OP, HOBt, and BSA were purchased from Sigma-Aldrich.
  • the enzyme activity of cellulase derived from T. reesei was determined by quantifying the amount of pNP released from Lac jS-pNP.
  • absorbance at 405 nm using a plate reader. was measured and the released pNP was quantified.
  • Enzyme activity 1U was defined as the amount of enzyme that liberates 1 ⁇ mol of pNP per minute.
  • ⁇ Partial purification of cellulase derived from T. reesei> Treat the crude enzyme solution of cellulase derived from T. reesei (1000ml, 875kU) with 25% saturated ammonium sulfate and centrifuge at 4 ° C using a high-speed microcentrifuge (KUBOTA 1720; using RA-200J rotor, manufactured by KUBOTA). (6010 g X 20 min) and the supernatant was recovered. This was treated with 75% saturated ammonium sulfate, centrifuged under the same conditions, and the resulting precipitate was dissolved in 10 mM sodium phosphate buffer (PH 6.0).
  • Partially purified enzyme (50 mg, Lac jS—pNP hydrolyzing activity 35 U, Gal jS pNP hydrolyzing activity 19 U) is dissolved in 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.0 (1. Oml) and equilibrated with the same solvent in advance. Oita Gal-amidine affinity column chromatography ( ⁇ 1.2 ⁇ 1.7 cm) was applied. At a flow rate of lOmlZh, lml was dispensed into each Eppendorf tube, and the non-adsorbed part was washed with 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.0 (30 ml). The adsorbed part was eluted with 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.0 (20 ml) containing 1.
  • Lactose (54.3 g, 151 mmol) and 5-trifluoroacetamido-1 -penta nol (30. Og, 151 mmol) were dissolved in 50 mM sodium acetate buffer pH 5.0 (151 ml) as a substrate, and galactosidase was removed there. reesei-derived cellulase (4500 U) was added to start the reaction.
  • the reaction solution 101 was collected over time, and 190 ⁇ 1 of demineralized water was collected, then the reaction was stopped by boiling at 100 ° C for 10 minutes, and filtered through a 0.45 m filter. The filtrate was then analyzed by HPLC.
  • each fraction was measured by the absorbance of 21 Onm derived from the N-acetyl group.
  • LacNAc was recovered in an amount of 17.2 g and a recovery rate of 86%.
  • the adsorption part was eluted by switching to 80% ethanol (5.0 L). After fractionating each 60 ml Ztube, each fraction was measured at an absorbance of 210 nm.
  • the fraction containing the desired product was concentrated, and the desired product, 5-aminopentyl
  • the moving bed that passed through the column was sampled approximately every 2.0 ml.
  • Fractions containing the desired product were concentrated to obtain the objective 5-aminopentyl ⁇ -N-acetyllactosaminide in a yield of 82 mg and a yield of 99%. This was subjected to 1 H-NMR.
  • the reaction was carried out for 24 hours at room temperature with stirring. After the reaction was completed, PBS was added so that the reaction solution became 7.5 ml. Then, apply 2.5 ml of the reaction solution per PD-10 column to a PD-10 ( ⁇ 1.7X5.0 cm, Sephadex G-25) column equilibrated with PBS. (5-aminopentyl ⁇ -lactoside / ⁇ -PGA) was eluted. Next, this fraction was dialyzed against 2.5 L of ultrapure water for 3 days. Meanwhile, the exchange of ultrapure water was performed 6 times. After dialysis, it was concentrated and lyophilized. Next, this was subjected to structural analysis by 1 H-NMR.
  • H-l ' 4. 35-4. 19 (1H, H- a), 3.30 (t, 1H, H-2), 3.20 (2H, He), 2.76 (dd, 1H , H—3, eq), 2. 41 (2H, ⁇ — ⁇ ), 2. 20 -1. 98 (2H, H-j8), 2. 03 (s, 3H, -NHAc "), 1. 82 (t, 1H, H -3 "ax), 1. 63 (2H, H— d), 1. 53 (2H, H—b), 1.
  • CMP-Neu5Ac 16. OmM, MnCl 2.5mM, BSAO. 1%, MOPS buffer (pH
  • H-l ' 4. 35-4. 20 (1H, H- a), 3. 18 (2H, H— e), 2. 73 (dd, 1H, H-3 "eq), 2. 40 (2H, ⁇ — ⁇ ), 2. 20— 1. 98 (2H, H— j8), 2. 03 (s, 3HX2, -NHAc, -NHAc "), 1. 82 (t, 1H, H— 3 ,, ax), 1.52 (2HX2, H—b, d), 1.30 (2H, H— c)
  • CMP-Neu5Ac 16. OmM, MnCl 2.5mM, BSAO. 1%, MOPS buffer (pH
  • Sialylation rate (%) ((B + C) / 2 X 100) / (A / 2)
  • sialyl-glycopolymers prepared by the method of Reference Example were adsorbed on a microtiter plate by the following method.
  • the 96-well microtiter plate (Corning—Costar, Labcoat2503, Cambridge, MA) 100 ⁇ l of a sial sugar chain-containing polymer in PBS was added in an amount of 100 ⁇ l (double dilution: 200 ⁇ g / ml, double dilution with PBS as the maximum concentration).
  • the plate was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then the plate was placed on the glass surface of an ultraviolet irradiation device (VILBER LOURMAT, France) and irradiated with ultraviolet rays (254 nm) for 1 minute.
  • VILBER LOURMAT ultraviolet irradiation device
  • the sial sugar chain-containing polymer solution in the well was discarded with the plate tilted. Then, 2% BS A (Sigma, Grade 96%) was added to the plate at 100 / zl and subjected to blocking treatment at room temperature for 1 hour.
  • each well was washed 5 times with 100 ⁇ l of PBS, and three types of inactivated influenza virus (avian A virus: AZduckZHonk Kong / 24/76 (H3N2), 32 ⁇ AU (hemagglutination titer) ); Human type A virus: AZMemphisZlZ71 (H3N2), 32HAU; Human type B virus: B / Lee / 40) 100 ⁇ l of PBS solution was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 12 hours with gentle shaking.
  • avian A virus AZduckZHonk Kong / 24/76 (H3N2), 32 ⁇ AU (hemagglutination titer)
  • Human type A virus AZMemphisZlZ71 (H3N2), 32HAU
  • Human type B virus B / Lee / 40
  • the avian influenza A virus (AZduckZHong Kong / 24/76) (H3N2) is shown in the graph of Figure 1
  • the human influenza A virus (A / Memp his / 1/71) (H3N2) Is shown in the graph of FIG. 2
  • human influenza B virus (BZLeeZ40) is shown in the graph of FIG. 1 to 3
  • the vertical axis of the graph represents the absorbance at a wavelength of 492 nm (Absorbance at 492 nm)
  • the horizontal axis of the graph represents the concentration of the sial sugar chain-containing polymer (mgZL).
  • SA a 2, 3-glycopolymer indicates the following 2-3 type of sialosaccharide chain-containing polymer
  • SA a 2, 6-glycopolymerj indicates the following 2-6.
  • the type of polymer containing a sialo sugar chain is shown.
  • the avian influenza A virus strongly recognized the 2-3 type sialo-glycan-containing polymer. Recognition was low.
  • the human influenza A virus strongly recognizes the 2-6 type sialosaccharide chain-containing polymer. Sex was low.
  • the human influenza B virus strongly recognized the 2-6 type sialosaccharide chain-containing polymer, but the recognizability to the 2-3 type sialosaccharide chain-containing polymer. Was weak.
  • Each of the various sugar sugar chain-bound polyglutamic acid polymers (2 ⁇ g / ml) was diluted with PBS solution twice, and then added to each well of a microplate (Corning-Costar; Labcoat 2503, Cambrige, MA) at 100 / zL. Next, the plate was allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours, and then the plate was placed on the glass surface of an ultraviolet irradiation device and irradiated with ultraviolet rays (254 nm) for 10 minutes. After irradiation, discard the polymer solution containing the sialo-glycan in the wells and add 2% BSA (Album bovine Fraction V, Sigma, St.
  • the avian influenza virus strongly recognized the 2-3 type sialosaccharide chain-containing polymer.
  • the recognition of the polymer was low.
  • human influenza virus strongly recognized type 2-6 sialoglycan-containing polymers, but the ability to recognize type 2-3 sialoglycan-containing polymers was low. Then, by determining the slope of the binding curve for each sialo-glycan-containing polymer, it is possible to determine whether or not there is a change in the infected host due to virus mutation.
  • the supernatant was applied to a Toyopearl HW-40S column (trade name, 5 X 100cm, Tosohichi Co., Ltd.), and the eluate was fractionated (20 mLZ), and a portion of the eluate was measured for absorbance at 300 nm. Quantify nitrophenol residues, and then measure the absorbance at 485 nm by the phenol-sulfuric acid method to quantify hydrocarbons. Collect the fraction (120 mL) containing Parrani trophel N-acetyl- 13-latatosaminide, concentrate, and gradually add methanol. The deposited precipitate is collected by filtration and dried under reduced pressure to give 292 mg of para-trophenyl N-acetyl- 13-ratatosamide crystals.
  • reaction solution is sequentially filtered through Celite and filter paper, and the filtrate is concentrated and applied to a chromatographic ODS DM1020T column chromatograph that has been equilibrated in advance with 12% methanol.
  • Fractions of the eluate were collected (30 mLZ), and the amino-reduced disaccharide derivative and the expected peak fraction that matched both 210 nm and 300 nm were concentrated, freeze-dried, and 70.7 mg para-aminophenol. Crystals of N-acetyl- ⁇ -latatosaminide are obtained.
  • para-aminophenol-1 N-acetylyl- ⁇ -latatosaminide 6 Omg obtained in the above (2) is dissolved in 0.4 mL of dimethyl sulfoxide and added thereto, followed by stirring at room temperature for 24 hours.
  • the reaction solution was applied to a Sephadex G-25 column (trade name, 2.0 X 26 cm, Amersham Pharmacia Biotech) and 0.1M sodium phosphate buffer (pH7) containing 0.1M sodium chloride. Elute in step 4) (flow rate 1. OmLZ min).
  • the present invention it is possible to easily determine the specificity of a receptor sugar chain of a virus with a simple device or instrument. Therefore, according to the present invention, for example, the specificity of the recognition of a receptor sugar chain of a virus can be accurately determined even in a clinical setting such as a hospital if the test is performed, and its application is wide.

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Abstract

　簡単な装置若しくは器具で容易にウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別する方法を提供する。ウイルスのレセプター糖鎖認識特異性及びウイルス変異による感染宿主の変化の判別方法において、シアロ糖鎖含有ポリマーを表面に固定した担体に、前記ウイルスを接触させ、その結合度合いを測定することにより前記ウイルスのレセプター糖鎖認識特異性及びその変異による感染宿主の変化を判別でき、ウイルスのサーベーランス等に好適な方法である。

Description

明 細 書
ウィルスレセプター糖鎖認識特異性の判別方法
技術分野
[0001] 本発明は、ウィルスのレセプター糖鎖認識特異性の判別方法、該方法に使用可能 な新規なシァロ糖鎖含有ポリマー及び担体並びにそれらの効率的な製造法に関す る。
背景技術
[0002] インフルエンザは、通常の風邪のような軽 、症状のものもあれば、スペイン風邪のよ うな重篤な症状にいたる場合もある。また、最近、鳥インフルエンザが問題になってい るように、インフルエンザは、人獣共通の感染症である。インフルエンザウイルスの宿 主域は、多くの動物種に及ぶことが知られている。例えば、 A型ウィルスは、ヒトの他 に、カモ等の野生水鳥、七面鳥、 -ヮトリ、ゥズラ等の家禽、ブタ、ゥマ、ゥシ、フエレツ ト、クジラ、ァザラシ等の動物を宿主とする。
[0003] インフルエンザウイルスの外皮は、 HA (血赤球凝集素：へマグルチュン）および N A (ノイラミニダーゼ）の 2種の酵素タンパクの突起で被われて ヽる。 HAは血球凝集 性の抗原で、宿主細胞に吸着'侵入する際にその細胞表面にあるシアル酸を含むレ セプター糖鎖と結合して、ウィルス粒子が細胞内に取り込まれるときに重要な役割を 果たしている。
[0004] インフルエンザウイルスの抗原性は、 HAと NAの組み合わせで決まり、 A, B, C< 3型に大別される。 A型には、さらに香港型など 4種の亜型があることが知られている 。 A型では、従来より 10年程度の周期で異なった亜型が登場したり、また同じ亜型で も年々少しずつ抗原性が変わっていく（抗原シフト）ことが知られている。このため抗 原型に完全に適合したワクチンの生産が難しぐその予防効果が問題となっている。
[0005] 一方、インフルエンザウイルスの型の分類は、上記のように抗原性による分類の他、 インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への結合性の違いによる分類がある（非特 許文献 1)。この分類は、レセプター糖鎖末端のシアル酸の結合様式の相違に基づく ものであり、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖の認識性、結合性若しくは親和 性の高低の相違に基くものである。
[0006] 例えば、高病原性 A型トリインフルエンザウイルス（H5N1亜型、 H9N1、 H7N7な ど）は、 rSA o^— SGal iS— (SA:シアル酸）」の結合様式を強く認識する力 「SA a 2— 6Gal |8—」の結合様式への認識性、結合性若しくは親和性は低い。一方、ヒト A 型および B型のインフルエンザウイルスは、 rSA o^— eGal jS—」の結合様式を強く 認識するが、「SA « 2— 3Gal |8—」の結合様式への認識性、結合性若しくは親和性 が低い。
[0007] トリインフルエンザウイルスがヒトへ感染するか否かの可能性を評価判定するための 最も効果的な方法は、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への結合性を確認 する方法である。すなわち、トリインフルエンザウイルスがヒトへ感染した場合であって も、その感染宿主の変異は遺伝子上の変異に反映されるとは限らない。しかし、レセ プター糖鎖への結合性の変異は、感染するためには必須であることから、インフルェ ンザウィルスのレセプター糖鎖への認識特異性又はその変異を簡便に判別すること ができれば、インフルエンザウイルスの型の判別に加え、ウィルスの変異による感染 宿主の変化や流行拡大の可能性をも予測することができる。
[0008] 従来、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性を判別する方法と しては、共鳴ミラー法を用いた方法がある（特許文献 1)。この方法では、共鳴ミラー装 置のキュベット内にインフルエンザウイルスに対するレセプター糖鎖を固定し、前記レ セプター糖鎖にインフルエンザウイルス検体を反応させる。そして、前記レセプター 糖鎖とインフルエンザウイルスとの結合により生じる共鳴角度変化を結合曲線に表し 、レスポンス強度をモニタリングする。前記レスポンス強度により、インフルエンザウイ ルスのレセプター糖鎖の認識特異性が判別できるとされている。
[0009] し力しながら、この方法では、レセプター糖鎖を担体へ固定することが面倒である。
すなわち、レセプター糖鎖として糖セラミド (シァリノレ (2- 3)ネオラタトテトラオシルセ ラミド（トリ型）、シァリル（2— 3)ラタトテトラオシルセラミド（トリ型）、シァリル（2— 6)ネ オラクトテトラオシルセラミド (ヒト型）、シァリル（2— 6)ラタトテトラオシルセラミド (ヒト型 )等)を使用し、これら糖セラミドとインフルエンザウイルスと結合しない糖脂質とをさら に混合し、この混合糖脂質をキュベット内の底面に固定ィ匕させるという極めて煩雑か つ複雑な方法で固定ィ匕レセプター糖鎖を調製している。さらに、共鳴ミラー装置とい う特殊で大型の装置を用いる必要がある。このため、大規模研究施設では使用でき るが、例えば、患者が発生した現場、空港、養鶏場、駅等のフィールド、病院等の臨 床現場で使用することは困難であった。
[0010] 最近、毒性の強いトリインフルエンザウイルスが世界的に流行し、このトリインフルェ ンザウィルスがヒトからヒトへ感染するウィルス (新型インフルエンザウイルス）へと変異 し、世界的な流行 (パンデミック)を引き起こす可能性も指摘されている。このため、安 価で、かつ簡易な器具で容易にインフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識 特異性を判別可能な方法の早急な開発が熱望されている。
[0011] 非特許文献 1：「ウィルス感染における糖鎖認識プロセス」（鈴木康夫、「生化学」第 76 卷、第 3号、 pp. 227- 233, 2004)
特許文献 1：特開 2001— 264333号公報
特許文献 2：特開 2003 - 73397号公報
特許文献 3 :特開平 10— 310610号公報
特許文献 4：特表 2003— 535965号公報
特許文献 5：特表平 11― 503525号公報
特許文献 6：特開 2004 - 115616号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明者らは、安価で、かつ簡易な器具で容易に、インフルエンザウイルスのレセ プター糖鎖の認識特異性を判別する方法を開発すベぐ ELISA法、免疫クロマトグ ラフィ一法等の免疫学的測定法の応用を試みた。
[0013] しかし、免疫学的測定法を応用したインフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への 認識特異性を判別する方法を確立するためには、次に挙げるような様々な課題を解 決する必要性があることが明らかとなった。 (1)レセプター糖鎖含有ィ匕合物の選別 ( 課題 1)、 （2)レセプター糖鎖含有ィ匕合物の効率的な製造法の確立 (課題 2)、 （3)レ セプター糖鎖含有ィ匕合物を担体に固定ィ匕するための方法の確立 (課題 3)、（4)測定 結果よりインフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性の判別、宿主の 変異を予想し、サーベーランス用の試薬あるいはキットとしての有用性の確認 (課題 4 )など。
[0014] より具体的に、それぞれの課題には、以下に示す問題があり、これらを解決すること なしに、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性を判別する方法の 確立は不可能であった。
[0015] (課題 1)
従来、インフルエンザウイルスが結合可能なレセプター糖鎖含有ィ匕合物としては、 種々報告されて 、るものの（特許文献 2〜4)、インフルエンザウイルスのレセプター 糖鎖への認識特異性を判別する方法に好適なレセプター糖鎖含有ィ匕合物に関して は報告がない。さら〖こ、測定時の安全性を考慮すると、不活ィ匕したウィルスサンプル が使用可能であることが必須である。しかし、不活ィ匕したウィルスサンプルを、望まし くは濃縮などの処理をしなくて用いた場合でも、そのようなサンプルと結合可能なレセ プター糖鎖含有ィ匕合物がどのようなものかに関しては、まったく不明である。
[0016] (課題 2)
レセプター糖鎖含有ィ匕合物の一例としてシァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を合成す る方法として特許文献 2に開示された方法が挙げられる。この方法では、 |8ガラクトシ ダーゼの糖転移反応を利用して p— -トロフエ-ル N—ァセチルー β—ラタトサミニド を合成し、 ρ— -トロフエ-ル基を ρ—ァミノフエ-ル基へと還元する。その後、ポリダル タミン酸と縮合させ、ラット由来のシァリルトランスフェラーゼを用いてオリゴ糖部分を シァリルイ匕することにより目的とするシァロ糖鎖含有ポリマーを取得していた。
[0017] しかし、この方法は、次のような欠点を有し、産業的には満足できる方法ではなかつ た。（1)合成収率が極めて悪い、（2)基質特異性の関係で、糖転移酵素として微生 物由来の酵素は使用できず、調製が非常に面倒な高価な動物由来のものし力使用 できな 、、 (3)ポリグルタミン酸残基に対するシァロ糖鎖の導入率を制御するのが難 しぐ大過剰の ρ—ァミノフエ-ルイ匕されたオリゴ糖が必要であったり、シァロ糖鎖をポ リグルタミン酸と直接縮合する場合、副反応を抑えるために、カルボキシル基を保護 する必要がある、（4)ポリグルタミン酸骨格がプロテア一ゼゃぺプチダーゼにより分解 されるため、用いるシァリルトランスフェラーゼとしては精製酵素を用いる必要がある。 [0018] (課題 3)
レセプター糖鎖含有ィ匕合物を担体に固定ィ匕する方法としては、適当なリンカ一を用 いる方法が一般的である（特許文献 5及び 6)。しかし、リンカ一を用いる方法は、簡便 な方法とは言えず、かつ化学反応であって、好ましくない副反応が生じるため、好ま しい方法とは言えない。さらに、レセプター糖鎖含有ポリマーとしてシァロ糖鎖含有ポ リグルタミン酸を使用する場合を例に挙げれば、シァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸の 担体への結合法に関しては、まったく報告されて 、な 、。
[0019] (課題 4)
現在まで、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性の判別、ウイ ルス変異による感染宿主の変化を予想可能とする試薬あるいはキットは報告されて いないし、巿販もされていない。
課題を解決するための手段
[0020] 本発明者らは、前記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、以下の知見を 得、本発明を完成させた。 （1)免疫学的測定等を応用してウィルスを捕捉する際、シ ァロ糖鎖単独ではなぐシァロ糖鎖とポリマーの複合体であるシァロ糖鎖含有ポリマ 一、特にシァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸が好適であり、不活ィ匕したウィルスサンプル でも使用可能である、（2)このシァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸は、合成スキームを変 更し、三糖を合成後、最後にポリグルタミン酸と縮合することで、効率的に合成できる 、（3)シァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸の担体への固定ィ匕法としては、適当なリンカ一 等を用いて結合させる方法ではなぐシァロ糖鎖含有ポリマーを含む液を担体と接触 させ、続けて紫外線照射することで、シァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を担体表面に 効率よく固定ィ匕できる。また、（4)できあがった固定ィ匕シァロ糖鎖含有ポリグルタミン 酸を用い、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への結合特異性を ELISA法を 応用した方法で検討した結果、その結合度合 、を測定することによりウィルスのレセ プター糖鎖認識特異性を判別できること、及びウィルス変異による感染宿主の変化を 判別できることを見出した。すなわち、上記検討の結果、 2種類以上のシァロ糖鎖含 有ポリマーを 1つの担体の表面に固定した担体もしくは異なるシァロ糖鎖含有ポリマ 一をそれぞれの担体の表面に固定した 2種類以上の担体を用い、前記 2種類以上の シァロ糖鎖含有ポリマー毎に前記ウィルスサンプルを接触させ、それぞれの結合度 合いを測定し、それらの結果を比較すれば、ウィルス変異による感染宿主の変化を 判別できることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の通りで ある。
[0021] 〔1〕ウィルスのレセプター糖鎖認識特異性の判別方法であって、シァロ糖鎖含有ポリ マーを表面に固定した担体に、前記ウィルスサンプルを接触させ、その結合度合い を測定することにより前記ウィルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別する方法。
[0022] 〔2〕ウィルス変異による感染宿主の変化を判別する方法であって、 2種類以上のシァ 口糖鎖含有ポリマーを 1つの担体の表面に固定した担体もしくは異なるシァロ糖鎖含 有ポリマーをそれぞれの担体の表面に固定した 2種類以上の担体を用い、前記 2種 類以上のシァロ糖鎖含有ポリマー毎に前記ウィルスサンプルを接触させ、それぞれ の結合度合 、を測定し、それらの結果を比較してウィルス変異による感染宿主の変 化を判別することを特徴とする、ウィルス変異による感染宿主の変化を判別する方法
[0023] 〔3〕前記シァロ糖鎖含有ポリマーにおける前記シァロ糖鎖力 シァリルラクト系 I型糖 鎖（SA Q；2— 6 (3) Gal J8 1— 3GlcNAc J8 1 ）、シァリルラクト系Π型糖鎖（SA Q；2 — 6 (3) Gal j8 1— 4GlcNAC j8 1— )、シァリルガンダリオ系糖鎖（SA a 2— 6 (3) Gal β 1— 3GalNAc j8 1— )およびシァリルラタトース糖鎖（SA a 2— 6 (3) Gall— 4Glc 一）からなる群力 選択される少なくとも一つの糖鎖である上記〔1〕又は〔2〕記載の判 別方法。
[0024] 〔4〕前記シァロ糖鎖含有ポリマーにおける前記ポリマー力 ポリグルタミン酸である上 記〔1〕又は〔2〕記載の判別方法。
[0025] [5]前記結合度合!/、の測定が、前記ウィルスに対する抗ウィルス抗体を用いた免疫 学的測定法による測定である上記〔1〕又は〔2〕記載の判別方法。
[0026] 〔6〕前記ウィルスサンプル力 インフルエンザウイルスのサンプルである上記〔1〕又は
〔2〕記載の判別方法。
[0027] 〔7〕下記式 (I)で表され、 γ ポリグルタミン酸にシァロ糖鎖を結合させたシァロ糖鎖 含有ポリマー。 COOH
OCCCCHIII CH2
H H一
CH2
C— CO
Figure imgf000009_0001
OCHI
ΝΗ— C—一 CO-Z
Η
H2N H
CO-Z
Figure imgf000009_0002
Figure imgf000009_0003
(式 (I)中、 Zは水酸基又は式 (Π)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以上 の整数を示す。式 (Π)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 Rは 炭化水素を示す。 )
〔8〕下記式 (ΠΙ)で表され、 γ—ポリグルタミン酸にシァロ糖鎖を結合させたシァロ糖 鎖含有ポリマー。
[化 2]
COOH CC OCCHIII
H H一
Figure imgf000010_0001
H2N H
CO-Z
(III)
Figure imgf000010_0002
(IV)
(式 (ΠΙ)中 Zは水酸基又は式 (IV)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以 上の整数を示す。式 (IV)中 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 R は炭化水素を示す。 )
〔9〕下記式 (V)で表され、 a ポリグルタミン酸にシァロ糖鎖を結合させたシァロ糖 鎖含有ポリマー。 [化 3]
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
(VI)
(式 (V)中、 Zは水酸基又は式 (VI)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以 上の整数を示す。式 (VI)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 R'はフエ-レンを除く炭化水素を示す。 )
(式 (V)中、 Zは水酸基又は式 (VI)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以 上の整数を示す。式 (VI)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 R'はフエ-レンを除く炭化水素を示す。 )
〔10〕下記式 (VII)で表され、 α —ポリグルタミン酸にシァロ糖鎖を結合させたシァロ 糖鎖含有ポリマー。
[化 4]
Figure imgf000012_0001
(VII)
Figure imgf000012_0002
(VIII)
(式 (vn)中、 zは水酸基又は式 (vm)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 1
0以上の整数を示す。式 (VIII)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ 基、 R'はフエ二レンを除く炭化水素を示す。 )
[0031] 〔11〕以下の工程力もなる、シァロ糖鎖含有ポリマーの製造法。
(工程 1)
糖転移酵素を用いて目的とするシァロ糖鎖を合成する工程
(工程 2)
工程 1で合成したシァロ糖鎖とポリグルタミン酸とをィ匕学的に結合させる工程 (工程 3)
工程 2で合成したシァロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシァロ糖鎖含 有ポリマーを取得する工程
[0032] 〔12〕シァロ糖鎖力 シァリルラクト系 I型糖鎖（SA 0:2— 6(3) Gal j81— 3G1CNACj8 1— )、シァリルラクト系 II型糖鎖（SAa2— 6(3)Galj81— 4GlcNACj81— )、シァリ ルガングリォ系糖鎖（3八0；2— 6 (3) 0&1 |8 1—30&^八(^ 1ー）ぉょびシァリルラク トース糖鎖 (SA a 2-6 (3) Gall—4Glc— )からなる群力ら選択される少なくとも一つ の糖鎖である上記〔16〕記載の製造法。
[0033] 〔13〕〔1〕記載又は〔2〕記載の判別方法に用いる担体であって、シァロ糖鎖含有ポリ マーを表面に固定した担体。
[0034] 〔14〕シァリルラクト系I型糖鎖（SA Q；2— 6 (3) Gal J8 1— 3GlcNAc J8 1—）、シァリル ラクト系 II型糖鎖（SA a 2— 6 (3) Gal j8 1— 4GlcNAC j8 1— )、シァリルガンダリオ系 糖鎖（SA α 2— 6 (3) Gal j8 1— 3GalNAc β 1一）およびシァリルラタトース糖鎖（SA « 2-6 (3) Gall -4Glc)力 なる群力 選択される少なくとも一つのシァロ糖鎖をポ リグルタミン酸に結合させたシァロ糖鎖含有ポリマーを紫外線照射することで表面に 固定した担体。
[0035] 〔15〕前記担体が複数のゥエルを有し、異なる種類のシァロ糖鎖含有ポリマーが複数 固定されている上記〔13〕又は〔14〕記載の担体。
[0036] 〔16〕上記〔1〕又は〔2〕記載のウィルスのレセプター糖鎖認識特異性又はその変異を 判別する方法に用いるキットであって、上記〔14〕記載の担体を含むキット。
〔17〕担体が複数のゥエルを有し、 1つの担体に異なる種類のシァロ糖鎖含有ポリマ 一が複数固定されたものである、上記〔16〕記載のキット。
[0037] 〔18〕 2つ以上の担体を含有し、異なる種類のシァロ糖鎖含有ポリマーがそれぞれの 担体に固定されたものである、上記〔16〕記載のキット。
[0038] 〔19〕前記シァロ糖鎖含有ポリマーにおける前記ポリマー力 α—ポリグルタミン酸で ある〔4〕記載の判別方法。
〔20〕前記インフルエンザウイルス力 不活化されたインフルエンザウイルスである〔6〕 記載の判別方法。
〔21〕グルタミン酸単位重合度が 10〜10, 000である〔7〕〜〔 10〕いずれかに記載の シァロ糖鎖含有ポリマー。
〔22〕グルタミン酸残基に対するシァロ糖鎖の導入率が 10〜80%である〔7〕〜〔10〕 に記載のシァロ糖鎖含有ポリマー。
〔23〕ポリグルタミン酸が、 α—ポリグルタミン酸又は γ —ポリグルタミン酸である〔11〕 記載の製造法。
〔24〕グルタミン酸単位重合度が 10〜： L0, 000である〔11〕記載の製造法。
〔25〕グルタミン酸残基に対するシァロ糖鎖の導入率が 10〜80%である〔11〕記載の 製造法。
〔26〕前記シァロ糖鎖含有ポリマーの前記シァロ糖鎖が、シァリルラクト系 I型糖鎖 (S A a 2— 6 (3) Gal j8 1— 3G1CNAC j8 1—）、シァリルラクト系 II型糖鎖（SA a 2— 6 (3 ) Gal j8 1— 4GlcNAC j8 1— )、シァリルガンダリオ系糖鎖（SA a 2— 6 (3) Gal j8 1— 3GalNAc β 1—)およびシァリルラタトース糖鎖（SA « 2 - 6 (3) Gall— 4Glc)から なる群力 選択される少なくとも一つの糖鎖である〔13〕記載の担体。
〔27〕前記ポリグルタミン酸が、 α—ポリグルタミン酸又は γ —ポリグルタミン酸である〔 13〕又は〔14〕記載の担体。
〔28〕担体が複数のゥエルを有するプレートである〔13〕又は〔14〕記載の担体。
〔29〕さらに、前記ウィルスに対する抗ウィルス抗体を含む〔16〕記載のキット。
〔30〕〔13〕ないし〔29〕のいずれかに記載の担体の製造方法であって、前記担体に、 シァロ糖鎖含有ポリマーを含む液を接触させ、この状態で紫外線を前記担体に照射 し、その後、前記液を除去することにより、前記担体表面に前記シァロ糖鎖含有ポリ マーを固定する担体の製造方法。
発明の効果
[0039] このように、本発明の判別方法は、シァロ糖鎖含有ポリマー、特にシァロ糖鎖含有 ポリグルタミン酸を固定した担体を用い、これにウィルスを接触させ、その結合度合い を、免疫学的方法等で測定することにより被検ウィルスのレセプター糖鎖認識特異性 を判別するものである。本発明の判別方法は、簡易な器具で容易に実施でき、本発 明によってたとえば、インフルエンザウイルスのヒト感染型かトリ感染型かの判別にカロ え、ウィルス変異による感染宿主の変化や流行の可能性をも予測することが初めて 可能となった。
[0040] 従来、シァロ糖鎖含有ポリマー自体、ある!/ヽはシァロ糖鎖の担体への結合法は種 々報告されている（特許文献 2〜6)。しかし、本発明のように、不活性化したウィルス サンプルを用いてもウィルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別できるとした報告は なぐまた判別可能であるとも考えられておらず、本発明者らによって初めて達成され たことである。
[0041] また、本発明のシァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸及びその製造法は、安価な原料を 使用し、かつ効率的な方法である。このため、本発明のシァロ糖鎖含有ポリダルタミ ン酸、それを固定ィ匕した担体試薬及びキットのコストを大幅に下げることが可能で、多 額の経費を必要とせず検査をすることができ、発展途上国のような国でも本発明のキ ット等は使用可能である。
[0042] さらに、本発明のウィルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別するため担体及びキ ットは、 ELISA等の免疫学的測定法や生物学的測定方法等を応用することが可能 であるため、担体の調製が容易で、判定操作も簡単である。このため、本発明はどこ でも実施することが可能であり、また大型の装置を使用する必要もなぐ養鶏場、屠 殺場、病院、空港、駅など発生現場からサンプルが持ち込まれる近場の各種検査施 設で使用可能なものである。
図面の簡単な説明
[0043] [図 1]は、本発明の一実施例におけるトリ A型インフルエンザウイルスのレセプター糖 鎖認識特異性を示すグラフである。
[図 2]は、前記実施例におけるヒト A型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識 特異性を示すグラフである。
[図 3]は、前記実施例におけるヒト B型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識 特異性を示すグラフである。
[図 4]は、ヒト A型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフ である。〇は Poly (Neu5Ac α 2— 6Lac β— 5— aminopentyl/ γ - PGA)、參 は Poly (Neu5Ac α 2— 3Lac β— 5— aminopentyl/ γ - PGA)、 Δは Poly (La c j8 - 5 - aminopentyl/ y - PGA)の結果を示す。
[図 5]は、トリ A型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフ である。〇は Poly (Neu5Ac α 2— 6Lac β— 5— aminopentyl/ γ - PGA)、參 は Poly (Neu5Ac α 2— 3Lac β— 5— aminopentyl/ γ - PGA)、 Δは Poly (La c j8 - 5 - aminopentyl/ y - PGA)の結果を示す。 [図 6]は、ヒト A型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフ である。〇は Poly (Neu5Ac α 2— 6LacNAc β— 5— aminopentyl/ γ - PGA) 、參は Poly (Neu5Ac α 2— 3LacNAc β— 5— aminopentyl/ γ - PGA)、 Δは Poly (Lac β— 5— aminopentyl/ γ - PGA)の結果を示す。
[図 7]は、トリ A型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフ である。〇は Poly (Neu5Ac α 2— 6LacNAc β— 5— aminopentyl/ γ - PGA) 、參は Poly (Neu5Ac α 2— 3LacNAc β— 5— aminopentyl/ γ - PGA)、 Δは Poly (Lac β— 5— aminopentyl/ γ - PGA)の結果を示す。
[図 8]は、ヒト A型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフ である。〇はより高分量の Poly(Neu5Ac o; 2— 6LacNAc j8 - 5 - aminopentyl/ γ -PGA) ,參はより高分子量の Poly(Neu5Ac o; 2— 3LacNAc j8—5— amino pentyl/ γ—PGA)の結果を示す。
[図 9]は、トリ A型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフ である。〇はより高分子量の Poly(Neu5Ac o; 2— 6LacNAc j8— 5— aminopentyl / γ -PGA) ,參はより高分子量の Poly(Neu5Ac a 2— 3LacNAc j8— 5— ami nopentyl/ γ—PGA)の結果を示す。
[図 10]は、ヒト A型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフ である。〇は Poly (Neu5 Ac α 2— 6LacNAc β -ρ- aminophenyl/ γ - PGA )、參は Poly (Neu5 Ac α 2— 3LacNAc β -p- aminophenyl/ y - PGA)、□ は Poly (Neu5 Ac a 2— 6LacNAc j8— p— aminophenyl/ a - PGA)、國は Pol y (Neu5Ac a 2— 3LacNAc β - p - aminophenyl/ — PGA)のそれぞれの 結果を示す。
[図 11]は、前記実施例におけるトリ A型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認 識特異性を示すグラフである。 C^SPob NeuSAc o^— eLacNAc jS—p— amino phenyl/ γ― PGA)、參は Poly (Neu5 Ac 2— 3LacNAc j8— p— aminophen ylZ Ύ - PGA)、□は Poly (Neu5 Ac a 2— 6LacNAc j8— p— aminophenyl/ ― PGA)、國は Poly (Neu5 Ac 2— 3LacNAc j8— p— aminophenyl/ ― PGA)のそれぞれの結果を示す。 [図 12]は、 Poly (Neu5Ac a 2~3LacNAc j3— p— aminophenylZ a— PGA)の NMRチャートを示す。
[図 13]は、 Poly (Neu5Ac a 2~6LacNAc β— p— aminophenylZ α— PGA)の NMRチャートを示す。
[図 14]は、 Poly(LacNAci3 - p - aminophenyl/ y—PGA)の NMRチャートを示 す。
[図 15]は、 Poly (Neu5Ac a 2~3LacNAc β - p - aminophenyl/ y—PGA)の NMRチャートを示す。
[図 16]は、 Poly (Neu5Ac a 2~6LacNAc β - p - aminophenyl/ y—PGA)の NMRチャートを示す。
[図 17]は、 Poly(5— aminopentyl β -lactoside / γ—PGA)の NMRチヤ一 トを示す。
[図 18]は、 Poly (5— aminopentyl β— N— acetyllactosaminide / y—PGA )の NMRチャートを示す。
[図 19]は、 Poly(Neu5Aco;2— 3Lac j8 -5 -aminopentyl / γ— PGA)の N MRチャートを示す。
[図 20]は、 Poly (Neu5Ac α 2— 6Lac β— 5— aminopentyl / y - PGA)の N MRチャートを示す。
[図 21]は、 Poly(Neu5Aca2— 3LacNAc j8 -5 -aminopentyl / y -PGA )の NMRチャートを示す。
[図 22]は、 Poly (Neu5Ac α 2— 6LacNAc j8— 5— aminopentyl / — PGA )の NMRチャートを示す。
発明を実施するための最良の形態
[0044] 以下、説明の都合上、（1)新規なシァロ糖鎖含有ポリマー、（2)シァロ糖鎖含有ポリ マーの製造法、（3)シァロ糖鎖含有ポリマーを担体へ固定ィ匕した試薬及びキット、（4 )ウィルスのレセプター糖鎖認識特異性の判別方法の順で、本発明を詳細に説明す る。
[0045] (1)新規なシァロ糖鎖含有ポリマー 本発明の判別方法で使用可能なシァロ糖鎖含有ポリマーとしては、公知のシァロ 糖鎖含有ポリマー以外にも、以下の新規のシァロ糖鎖含有ポリマーも使用可能であ る。この新規のシァロ糖鎖含有ポリマーは、公知のポリマーより極めて安価に調製す ることができ、 oenし力も天然のムチンと類似の構造を有するため、本発明の判別方法に 好適である。
[0046] そのような、新規のシァロ糖鎖含有ポリマーの具体例としては、下記式 (I)、 (III)、 ( V)、および (VII)のものを例示することができる。シァロ糖鎖含有ポリマー中、シァロ 糖鎖置換グルタミン酸残基と未置換グルタミン酸残基とは、任意の比率で混在し、そ の比率は糖残基置換度（Degree ofc OC CcH l- l-—— substitution (DS) )で示す。
H H
[0047] [化 1] 一 2 2
C
o
Z
COOH CH2
CHCII 2
NH — CO-
NH
CH2 H
CH2
H2N C一 H
CO-Z
(I) CCII
o - Z H
Figure imgf000019_0001
(II)
(式 (I)中、 Zは水酸基又は式 (Π)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以上 の整数を示す。式 (Π)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 Rは 炭化水素を示す。 )
[化 2]
COOH
Figure imgf000019_0002
H2N
(III)
Figure imgf000020_0001
(IV)
(式 (III)中、 Zは水酸基又は式 (IV)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以 上の整数を示す。式 (IV)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 Rは炭化水素を示す。 )
[化 3]
NH2—
Figure imgf000020_0002
(V)
Figure imgf000020_0003
(VI) (式 (V)中、 Zは水酸基又は式 (VI)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以 上の整数を示す。式 (VI)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 R'はフエ-レンを除く炭化水素を示す。 )
[0050] [化 4]
Figure imgf000021_0001
(VII)
Figure imgf000021_0002
(VIII)
(式 (VII)中、 Zは水酸基又は式 (VIII)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 1 0以上の整数を示す。式 (VIII)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ 基、 R'はフエ二レンを除く炭化水素を示す。 )
[0051] 式中、 R又は R'で表される炭化水素としては、炭素数 1〜20のものが好ましぐ飽 和炭化水素基及び不飽和炭化水素基の 、ずれでもよ 、。具体的にはアルキル基、 ァルケ-ル基、アルキ-ル基、シクロアルキル基、ァリール基、ァラルキル基、シクロ アルキル置換アルキル基等が挙げられる。
[0052] ここで、アルキル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基としては、炭素数 1〜20の直鎖又 は分枝鎖のものが挙げられる。アルキル基の具体例としては、メチル基、ェチル基、 n プロピル基、 n ブチル基、 n ペンチル基、 n—へキシル基、 n—ォクチル基、 n デシル基、 n—ドデシル基、 n—テトラデシル基等の直鎖アルキル基;イソプロピル 基、イソブチル基、 t ブチル基、 2—ェチルへキシル基等の分枝鎖アルキル基が挙 げられる。
[0053] ァルケ-ル基の具体例としてはビュル基、プロぺニル基、ァリル基等が挙げられる。
アルキ-ル基の具体例としては、ェチュル基、プロピニル基、ブチュル基などが挙げ られる。シクロアルキル基としては、炭素数 3〜10のものが挙げられ、特に炭素数 3〜 8のもの、例えばシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基等が好まし い。
[0054] ァリール基としては炭素数 6〜14のもの、例えばフエ-ル基、トリル基、ナフチル基 等が挙げられる。ァラルキル基としては、炭素数 7〜 14のァラルキル基、具体的には ベンジル基、フ ネチル基などが挙げられる。シクロアルキル置換アルキル基として は C3— C8シクロアルキル置換 C1— C10アルキル基、例えばシクロプロピルメチル 基、シクロペンチルメチル基、シクロへキシルメチル基、シクロプロピルェチル基、シク 口ペンチルェチル基、シクロへキシルェチル基、シクロプロピルプロピル基、シクロべ ンチルプロピル基、シクロへキシルプロピル基等が挙げられる。
[0055] また、当該炭化水素は置換基を有していても良ぐそのような置換基としては、ヒドロ キシル基、アジド基、シァノ基、アルコキシ基、シクロアルキルォキシ基、ァリールォキ シ基、カルボキシル基等が挙げられる。カルボキシル基はエステルイ匕されていてもよ い。
[0056] 本発明のシァロ糖鎖含有ポリマーは、塩型、遊離酸型のいずれであってもよい。塩 型としては、例えは、アルカリ金属塩 (例えばナトリウム塩、カリウム塩等）；アルカリ土 類金属塩 (例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）；有機塩基塩 (例えばトリメチルァ ミン塩、トリェチルァミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロへキシルァミン塩等）等が 挙げられる。また、水和物あるいはアルコール等との溶媒和物であってもよい。
[0057] また、本発明のシァロ糖鎖含有ポリマーの分子量は、例えば、 2000〜500万の範 囲である。グルタミン酸単位重合度（n)は、例えば、 10〜： LOOOOの範囲である。ダル タミン酸残基に対するシァリルオリゴ糖の導入率は、 10〜80%の範囲である。 [0058] このようなシァロ糖鎖含有ポリマーの具体的化合物としては、たとえば、以下の化合 物が例示される。
• Poly (Neu5Ac 2- -6LacNAcj8 -5 ― aminop entyl/ Ύ -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -3LacNAcj8 -5 ― aminop entyl/ Ύ -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -6LacNAcj8 -5 ― aminop entyl/ a -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -3LacNAcj8 -5 ― aminop entyl/ a -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -6LacNAcj8 P— ― aminophenyl/ Ύ -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -3LacNAcj8 P— ― aminophenyl/ Ύ -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -6L·acβ -5 ― aminopentyl/ Ύ -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -3L·acβ -5 ― aminopentyl/ Ύ -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -6L·acβ -5 ― aminopentyl/ a -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -3L·acβ -5 ― aminopentyl/ a -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -6L·acβ P— ― aminophenyl/ Ύ -PGA)
• Poly (Neu5Ac 2- -3L·acβ P— ― aminophenyl/ Ύ -PGA)
(PGA:ポリグルタミン酸、 Neu5Ac:シアル酸、 LacNAc:N ァセチルーラタトサミ ン、 Lac:ラタトース）
[0060] (2)シァロ糖鎖含有ポリマーの製造法
シァロ糖鎖含有ポリマーを低コストで大量に調製するためには、用いる酵素が未精 製品であることが望ましい。ただし、そのような粗酵素を合成反応に使用するために は、反応基質としてポリグルタミン酸に結合したオリゴ糖を用いることは好ましくない。 したがって、シァロ糖鎖 (シァリルオリゴ糖)を合成した後、最終段階でシァロ糖鎖とポ リグルタミン酸とを縮合させることが望ましい。また、微生物由来の酵素は、動物由来 酵素と比較して大腸菌等を宿主として大量に生産することが容易であるが、微生物 由来の糖転移酵素を用いる場合は糖ペプチドや糖タンパク質を糖受容体とすること ができないことが多い。このため、この点でもシァリルオリゴ糖を合成した後に、ポリグ ルタミン酸との縮合を行うことが望ま 、。
[0061] したがって、本発明のシァロ糖鎖含有ポリマーの製造法は、次の工程力 なることを 特長とする。 (工程 1)
糖転移酵素を用いて非還元末端にシアル酸を含む目的とするシァロ糖鎖を合成す る工程
(工程 2)
工程 1で合成したシァロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に 縮合させる工程
(工程 3)
工程 2で合成したシァロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシァロ糖鎖含 有ポリマーを取得する工程
[0062] (工程 1)
工程 1は、糖受容体 (たとえは、糖一パラ-トロフエノール、 5—アミノアルキルイ匕糖 等)と糖供与体 (各種糖ヌクレオチド)を含有する反応系に合目的な糖転移酵素を添 カロして、目的とするシァロ糖鎖を合成する工程である。
[0063] 反応系に添加する糖転移酵素としては、糖ヌクレオチドの糖残基を糖受容体に転 移させる活性を有するものであればよぐ例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グ ルコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラー ゼ、シァリルトランスフェラーゼ等があげられる。
[0064] これらの酵素は目的とする酵素活性を有する限りどのような形態であってもよい。酵 素調製の簡便さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化し、微生 物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を行う、いわゆる DNA組換え技術を 用いた酵素生産で得ることが最も都合がよ!、。
[0065] 酵素標品としては具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物か ら得られる酵素調製物などを例示することができる。微生物の菌体の調製は、当該微 生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で 行うことができる。具体的に、大腸菌（Escherichia coli)に属する細菌を例に挙げ 説明すれば、培地としてはブイヨン培地、 LB培地（1%トリプトン、 0. 5%イーストェキ ストラタト、 1%食塩)または 2 XYT培地（1. 6%トリプトン、 1%イーストエキストラタト、 0. 5%食塩)などを使用することができる。当該培地に種菌を接種後、 30〜50°Cで 1 0〜50時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微 生物菌体を集菌することにより、目的の酵素活性を有する微生物菌体を調製すること ができる。
[0066] 微生物の菌体処理物としては、一般的な処理法に従って菌体を処理して得られる 菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。 菌体の一般的な処理法としては、機械的破壊 (ワーリンダブレンダー、フレンチプレス 、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥 (凍結乾燥、風乾な どによる）、酵素処理 (リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理 (酸、アルカリ処 理などによる）などが挙げられる。
[0067] 酵素調製物としては、上記菌体処理物から得られる粗酵素または精製酵素を例示 することができる。粗酵素または精製酵素は、上記菌体処理物から当該酵素活性を 有する画分を通常の酵素の精製手段 (塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱 処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施すことによって得られる。
[0068] 糖ヌクレオチドおよび糖受容体は、それぞれ市販の製品を使用することができる。
使用濃度としては l〜200mM、好ましくは 5〜50mMの範囲力 適宜設定できる。 なお、糖受容体として 5—アミノアルキルイ匕糖を使用する場合には、後述する実施例 に示すように、セルラーゼの逆反応を利用して、糖類の水酸基をアルキルアミノィ匕す ることち可會である。
[0069] シァロ糖鎖の合成は、上記の糖受容体及び糖ヌクレオチドを含有する反応系に、 糖転移酵素を 0. 001ユニット Zml以上、好ましくは、 0. 01〜10ユニット Zml程度に なるようにそれぞれ添カ卩し、 5〜50°C、好ましくは 10〜40°Cで 1〜： LOO時間程度、必 要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
[0070] このようにして製造したシァロ糖鎖は、オリゴ糖の通常の分離精製手段を用いて単 離精製できる。例えば、逆相 ODSカラムクロマトグラフィーやイオン交換カラムクロマト グラフィーなどを適宜組み合わせることで単離精製できる。
[0071] (工程 2)
工程 2は、工程 1で合成したシァロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に 化学的に縮合させる工程である。 [0072] 工程 1で、糖受容体として p -トロフエ-ル基を有する糖受容体を使用した場合に は、ニトロ基を還元してアミノ基へと変換後、糖受容体として 5—アミノアルキルイ匕糖を 使用した場合には、ァミノ基の保護基を常法により脱保護した後、トリェチルァミンや トリプチルァミンなどの塩基存在下、ポリグルタミン酸を縮合剤と処理して、シァロ糖鎖 含有ポリマーを製造する。
[0073] p -トロフ -ル基の還元反応に用いる条件としては、通常、芳香族-トロ基の還 元に適用する条件であればよい。具体例としては、水やメタノール、エタノールなどの 有機溶媒中で、水素あるいはギ酸アンモ-ゥム、シクロへキセンなどの水素供与剤存 在下、ノラジウム炭素と処理することで実施できる。
[0074] 原料ポリマーとして用いるポリグルタミン酸は、 a 型、 γ 型のいずれであっても よい。
[0075] 縮合工程は、有機溶媒 (ジメチルホルムアミドゃジメチルスルホキシドなど）中、原料 ポリマーを塩基（トリェチルアミンゃトリブチルァミンなど）存在下、カルボキシル基の 活性エステル化剤（クロロギ酸 ρ -トロフエ-ルゃジスクシミジルカーボネート、カル ボニルジイミダゾールなど）で処理した後、 5—アミノアルキル化糖又は上記還元反応 の生成物と反応処理することで実施される。
[0076] 5 アミノアルキルイ匕糖又は上記還元反応の生成物の使用量は、 目的とするシァロ 糖鎖含有ポリマーの糖置換率に応じて添加すればよぐ通常、ポリグルタミン酸のグ ルタミン酸単位に対して 0. 1当量以上あればよい。また、縮合反応に用いる塩基の 使用量は、ポリグルタミン酸のグルタミン酸単位に対して 1当量以上あればよい。
[0077] 縮合反応は— 10°C〜100°Cで実施することができる。また、必要に応じて 4— N, N ジメチルァミノピリジンや 1—ヒドロキシ一 1H—ベンゾトリアゾールなどの一般的 にァシルイ匕反応の触媒を添カ卩しても力まわな 、。
[0078] (工程 3)
工程 3は、工程 2で合成したシァロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、 目的とするシァ 口糖鎖含有ポリマーを取得する工程である。
工程 2で合成されたシァロ糖鎖含有ポリマーの単離精製は、通常、タンパクの精製 に用いる方法で行えばよぐ例えば、透析やゲルろ過などを適宜組み合わせることで 単離精製することができる。
[0079] (3)シァロ糖鎖含有ポリマーを担体へ固定ィ匕した試薬
シァロ糖鎖含有ポリマーを固定ィ匕するための担体としては、特に制限されず、例え ば、プレート、微粒子等が使用可能である。前記プレートとしては、例えば、ゥエルを 有するプレート（例えば、マイクロタイタープレート）、薄層クロマトグラフィー用シリカゲ ルプレート等があげられる。前記微粒子としては、例えば、ビーズ、チップ等があげら れる。前記担体の材質は、特に制限されず、各種の紙、合成樹脂、金属、セラミックス 、ガラス等が使用できる。その中でも特に、紫外線照射により、シァロ糖鎖含有ポリマ 一を担体に固定できる、ゥエルを有するプレート（たとえば、 Corning— Costar, Lab coat2503, Cambridge, MA)など力 ^望まし!/ヽ。
[0080] シァロ糖鎖含有ポリマーにおける前記シァロ糖鎖は、例えば、シァリルラクト系 I型 糖鎖（SAQ；2— 6(3)GalJ81— 3GlcNAcJ81—）、シァリルラクト系Π型糖鎖（SAQ； 2— 6(3)Galj81— 4GlcNACj81— )、シァリルガンダリオ系糖鎖（SAa2— 6(3)G alj81- 3GalNAc β 1—)およびシァリルラタトース糖鎖（SA «2-6(3) Gall— 4G1 c—)があげられる。これらのなかでも、シァリルラクト系 I型糖鎖（SAa 2— 6 (3) Gal j81— 3GlcNACj81— )およびシァリルラクト系 II型糖鎖（SAa2— 6(3)Galj81— 4 GlcNAciS 1-)が好ましい。また、本発明の前記シァロ糖鎖含有ポリマーにおいて、 シアル酸は、シアル酸の誘導体であってもよい。なお、「SA」又は「Neu5Ac」は、「シ アル酸 (N― acylneuraminic acid)」を不す。
[0081] 前記シァロ糖鎖において、末端のシアル酸の結合様式は、例えば、 rSA«2-3G aljSl—」（以下、「2— 3型」という）、「SAa2— 6Galj81—」（以下、「2— 6型」という） および「SAa2— 8Galj81—」（以下、「2— 8型」という）があげられる。
[0082] シァロ糖鎖含有ポリマーにおける前記ポリマーは、特に制限されず、例えば、ポリグ ルタミン酸、ポリアクリルアミド、及びポリスチレン等の化学合成ポリマー、フェツイン等 の天然糖タンパク質、並びに糖鎖含有脂質等が使用できる。前記糖鎖含有脂質とし ては、脂質部分が脂肪酸及びその誘導体を持つ化学合成糖脂質、シリアルパラグロ ボシド、シァリルラタトテトラオシルセラミド等の天然ガンダリオシドまたは糖脂質、並び に化学合成ガンダリオシドまたは糖脂質等が挙げられる。その中でも特にポリダルタミ ン酸が好ましぐ α 型、 γ 型のいずれであってもよい。
[0083] 前記シァロ糖鎖含有ポリマーの具体例としては、シァリルオリゴ糖をポリグルタミン 酸に導入して得られるシァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸がある。その分子量は、例え ば、 2000〜500万の範囲であり、グルタミン酸単位重合度は、例えば、 10〜： LOOOO の範囲であり、グルタミン酸残基に対するシァリルオリゴ糖の導入率は、 10〜80%の 範囲である。シァリルオリゴ糖をポリグルタミン酸に導入して得られるシァロ糖鎖含有 ポリグルタミン酸としては、前記した新規なシァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸以外にも、 例えば下記の公知のシァロ糖鎖含有ポリマーがある。
(2— 3型）
ポリ [パラ一ァミノフエ-ル（Ν ァセチルノイラミニルー（2— 3)—Ν ァセチルー β —ラタトサミ -ド） L グルタミン一 co グルタミン酸] [Poly (Neu5Ac a 2— 3Gal β 1 - 4GlcNAc β - p AP/Gln - co - Glu) ]
(2— 6型）
ポリ [パラ一ァミノフエ-ル（N ァセチルノイラミニルー（2— 6)—N ァセチルー β —ラタトサミ -ド） L グルタミン一 co グルタミン酸] [Poly (Neu5Ac a 2— 6Gal β 1 - 4GlcNAc β - ρ AP/Gln - co - Glu) ]
[0084] このようなシァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸は、上記した本発明の製造法以外にも、 公知の方法により調製できる。具体的には、 j8ガラクトシダーゼの糖転移反応により 合成したパラ-トロフエ-ル配糖体（パラー-トロフエ-ルトル N ァセチルー 13ーラ クトサミニド）をポリグルタミン酸に導入し、さらに、 α 2、 3 （Ν)—及び α 2、 6— (Ν) ーシァリルトランスフェラーゼを用いて、導入したオリゴ糖をシァリルイ匕することにより 調製することもできる。この調製方法の具体例は、参考例として後述する。 |8ガラタト シダーゼの糖転移反応によりパラ-トロフエ二ル配糖体を合成する方法としては、 Τ. ウスィ（T. Usui)ら [カーボハイドレート リサーチ（Carbohydr Res)、第 244卷、第 315〜第 323頁（1993) ]の方法が挙げられる。パラ-トロフエ-ル配糖体をポリダル タミン酸に導入する方法としては、 X.ゼン (X. Zeng)ら [カーボハイドレート リサ一 チ（Carbohydr Res)、第 312卷、第 209頁〜第 217頁（1998) ]の方法が挙げられ る。オリゴ糖をシァリルイ匕する方法としては、 X.ゼン (X. Zeng)ら [アーチブス ノ ィ オケミストリー バイオフイジタス（Arch. Biochem. Biophys. )、第 383卷、第 28 〜第 37頁（2000) ]の方法が挙げられる。
[0085] シァロ糖鎖含有ポリマーの担体への固定化は、疎水結合、イオン結合、共有結合 等を用いて行うことも可能である。たとえば、シァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を、ゥェ ルを有する合成樹脂プレート (例えば、マイクロタイタープレート）に固定ィ匕する場合 には、紫外線照射処理が最も効果的で、簡便な方法である。
[0086] ここで、前記担体に、ある特定の物質を固定する場合は、その物質を含む溶液を担 体に接触させ、前記液を除去した後、紫外線を照射するのが一般的である。しかしな がら、この方法では、シァロ糖鎖含有ポリマーを担体に固定することができないことを 本発明者等は突き止めた。そして、この問題を解決するために、一連の研究を続け たところ、シァロ糖鎖含有ポリマーを含む溶液を前記担体に接触させ、この状態で紫 外線を照射した後、前記液を除去すれば、シァロ糖鎖含有ポリマーを担体表面に固 体できることを、見出した。
[0087] 具体的には、シァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を含む液をプレートと接触させ、この 状態で紫外線を前記担体に照射する。その後、前記液を除去することにより、前記担 体表面に前記シァロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を固定ィ匕することができる。なお、紫 外線照射処理において、紫外線の強度、プレートまでの距離により反応時間が異な るので予め条件を設定することが好まし 、。
[0088] このようにして調製したシァロ糖鎖含有ポリマーを固定した担体は、ウィルスの非特 異的吸着を防止するために、ブロッキング処理されていることが望ましい。前記ブロッ キング処理は、例えば、ゥシ血清アルブミン (BSA)、脱脂 BSA、卵白アルブミン、力 ゼイン、市販のブロッキング剤などを用いて実施することができる。
[0089] (4)ウィルスのレセプター糖鎖認識特異性の判別方法及びキット
本発明の判別方法において、前記結合度合いの測定は、 ELISA法、免役クロマト グラフィ一法、免役凝集法など免疫学的測定法を応用して行うことが可能である。例 えば、より高感度に測定するためには、サンドイッチ型の免疫学的測定法による測定 を好適な例として挙げることができる。サンドイッチ型の免疫学的測定法では、前記ゥ ィルスに対する抗ウィルス 1次抗体と、前記抗ウィルス 1次抗体に対する標識 2次抗 体もしくは標識プロテイン Aとを用いればよい。しかし、サンドイッチ型の免疫学的測 定法に限定されるものではなぐ前記担体として、ビーズ等の微粒子担体を使用する ことで、凝集の程度により前記結合度合いを測定することも可能である。さらに、免疫 学的測定法以外の方法によるウィルス特異的成分の検出法 (例えば、ウィルススパイ クタンパク質であるへマダルチュンおよびノィラミニダーゼの検出、それらが持つ生物 活性の検出など)も利用可能であることも明らかである。
[0090] 上述したサンドイッチ型免疫学的測定法をより具体的に説明すれば、前記抗ウィル ス 1次抗体は、特に制限されず、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のい ずれであってもよい。前記ポリクローナル抗体としては、例えば、抗インフルエンザゥ ィルスゥサギ血清がある。また、モノクローナル抗体としては、例えば、 A型ウィルスの ヌクレオプロテインに対するモノクローナル抗体のような全ての A型ウィルスと反応す るものがある。なお、抗体の由来は、特に制限されず、例えば、ゥサギ抗体、マウス抗 体、ラット抗体、ャギ抗体、ィヌ抗体、ヒッジ抗体等のさまざまの由来のものが使用で きる。抗体のクラスも特に制限されず、 IgG, IgM, IgA, IgD, IgEの全てが適用でき る。
[0091] 前記標識 2次抗体もしくは標識プロテイン Aの標識は、特に制限されず、例えば、 酵素標識 (例えば、 horseradish peroxidase)、蛍光標識、放射能標識等がある。 なお、抗体の由来は、特に制限されず、例えば、ゥサギ抗体、マウス抗体、ラット抗体 、ャギ抗体、ィヌ抗体、ヒッジ抗体等のさまざまの由来のものが使用できる。抗体のク ラスも特に制限されず、 IgG, IgM, IgA, IgD, IgEの全てが適用できる。前記標識 2 次抗体としては、酵素標識ゥサギ IgG抗体が好ま 、。
[0092] 本発明において、判別対象となるウィルスは、特に制限されず、用いるシァロ糖鎖 含有ポリマーに対応し、様々なウィルスに適用可能である。例えば、インフルエンザゥ ィルス、パラミクソウィルス群、パラインフルエンザウイルス群、ロタウィルス、アデノウィ ルス、コロナウィルス、ポリオ一マウィルス等が例示される。前記インフルエンザウィル スとしては、高病原性 A型トリインフルエンザウイルス、ヒト A型インフルエンザウイルス およびヒト B型インフルエンザウイルス等が挙げられる。
[0093] 測定に使用するウィルスサンプルは、不活化処理したウィルスサンプルであっても よい。たとえば、エーテル処理により不活ィ匕したウィルス培養発育鶏卵漿尿液を濃縮 することなぐそのまま用いても本発明方法で測定可能である。
[0094] 測定手順自体は、採用した手段の公知の手段に準じて行えばよ!、。たとえば、免 疫学的測定法を応用した場合には、固定ィ匕シァロ糖鎖含有ポリマーと被検ウィルス サンプルを反応させ、必要により BF分離後、さらに標識抗体を反応させる（ツーステ ップ法)か、固相抗体、被検試料及び標識抗体を同時に反応させ (ワンステップ法)る 。そして、以後のそれ自体公知の方法によりサンプル中のウィルスのレセプター糖鎖 認識特異性を検出することができる。
[0095] なお、免疫学測定法の詳細については、たとえば以下の文献を参照すればよい。
(1)入江 寛編「続ラジオィムノアツセィ」（(株)講談社、昭和 54年 5月 1日発行）
(2)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 2版）（(株)医学書院、 1982年 12月 15日 発行）
(3)臨床病理 臨時増刊 特集第 53号「臨床検査のためのィムノアツセィー技術と応 用一」（臨床病理刊行会、 1983年発行）
(4)「バイオテクノロジー事典」（(株）シーエムシー、 1986年 10月 9日発行）
[0096] (5)「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 70」
(Immunochemical techniques (Part A) )
(6)「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 73」
(Immunochemical techniques (Part B) )
(7)「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 74」
(Immunochemical techniques (Part C) )
(8)「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 84」
(Immunochemical techniques (Part D : Selected Immunoassay) )
(9)「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 92」
(Immunochemical techniques (Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )
[ (5)〜（9)はアカデミックプレス社発行]
[0097] 高病原性 A型トリインフルエンザウイルスは、 2— 3型のシァロ糖鎖を強く認識する 一方、 2— 6型のシァロ糖鎖の認識、結合性若しくは親和性が低い。これとは逆に、ヒ ト A型およびヒト B型インフルエンザは、 2— 6型のシァロ糖鎖を強く認識する一方、 2 3型のシァロ糖鎖の認識、結合性若しくは親和性が低い。したがって、本発明方法 において、 2— 3型および 2— 6型の双方のシァロ糖鎖含有ポリマーを用い、それぞ れのシァロ糖鎖含有ポリマーに対する結合度合いを測定し、それらを比較することで 、トリ感染型インフルエンザとヒト感染型インフルエンザとの判別が可能である。
[0098] また、本発明の判別方法にお!、て、例えば、前記担体として、 2種類以上の前記シ ァロ糖鎖含有ポリマーを表面に固定した担体を用いてもよい。この場合、 2種類以上 の前記シァロ糖鎖含有ポリマー毎に前記ウィルスの結合度合!/、を測定し、それらの 結果を比較することで、前記ウィルスのレセプター糖鎖認識特異性、すなわち前記ゥ ィルスの感染型を判別し、またその変異による感染宿主の変化を検出することができ る。すなわち、複数のゥエルを有するプレートにおいて、前記ゥエル毎、あるいはゥェ ルの列毎に異なる種類のシァロ糖鎖含有ポリマーを固定したものを用いる。そして、 各ゥエルにウィルスを供給し、各ゥエルの認識特異性を比較することで、ウィルスの 感染型及びその変異による感染宿主の変化を判定する。これ以外にも、例えば、複 数の担体において、前記担体毎に異なる種類のシァロ糖鎖含有ポリマーを固定した ものを準備する。このように 2種類以上の前記シァロ糖鎖含有ポリマーを結合させた 担体毎に前記ウィルスの結合度合 、を測定し、それらの結果を比較して前記ウィル スの感染型及びその変異による感染宿主の変化を検出する。この場合、前記担体と しては前述したとおり、ビーズ等の微粒子担体を使用することができ、担体ごとにウイ ルスを供給し、微粒子担体間の認識特異性を、例えば凝集の程度により比較するこ とで、ウィルスの感染型を判定してもよい。
[0099] つぎに、本発明のキットは、前記シァロ糖鎖含有ポリマーを固定した担体にカ卩え、さ らに、担体に捕捉されたウィルスを検出するための抗ウィルス抗体 (例えば、ウィルス に対する抗ウィルス 1次抗体と抗ウィルス 1次抗体に対する標識 2次抗体もしくは標識 プロテイン A)を含むことが好ましい。前記抗体については、前述のとおりである。
[0100] (実施例）
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例によ つつてて、、ななんんらら制制限限さされれなないい。。
<< HHPPLLCC >>
ササンンププルルははすすべべてて 00.. 4455 μμ ΐΐののフフィィルルタターーでで濾濾過過ししたた後後、、分分析析ししたた。。分分析析条条件件はは下下記記 にに示示ししたたももののをを用用いいたた。。
カカララムム ：： MMiigghhttyyssiill SSii6600 (( ((ii)) 44.. 66 XX 225500mmmm))
カカララムム温温度度 ：：4400°°CC
Figure imgf000033_0001
検検出出波波長長 ：：221100nnmm
溶溶媒媒 ：：9900%% CCHH CCNN
33
ああるるいいはは、、
カカララムム ：： YYMMCC PPrroo CC1188RRSS (( <<ii)) 66.. 00 XX 115500mmmm))
カカララムム温温度度 ：：4400°°CC
Figure imgf000033_0002
検出波長 ：300nm
溶媒 ：20% MeOH- 50mM TEAA
[0101] < NMR>
分析機器 ： JEOL EX- 270 NMR spectrometer,
JEOL lamda 500FT NMR spectrometer
Bruker AV— 500 NMR spectrometer
外部標準 ： TPS [sodium3— (trimethylsilyl) -propionate]
溶媒 ： D O
2
温度 ：25°Cあるいは 60°C
サンプル管 ： φ 3または 5mm
[0102] (略称）
pNP： p― nitrophenol
Lac： Lactose (Gal β 1— 4Grlcノ
LacNAc： N― acetyllactosamine (Gal β 1— 4GlcNAc)
Neu5Ac： N― ac etylneur aminic acid CMP― NeuAc： CMP一 N— acetylneuraminic acid
y— PGA : y― polyglutamic acids
BOP Benzotriazol— 1— yloxytris― ( dime thy lamino ) phosphonium hexafl uorophosphate
HOBt： 1― Hydro xybenzotriazole hydrate
PBS : 10 mM Phosphate buffered saline (pH7. 4)
TPS Sodium 3― (trimethylsilyl)― propionate
DP : Degree of polymerization ( —ポリグノレタミン酸重合度）
DS : Degree of substitution (DPを 100%とした場合の糖残基置換度％)
IPTG： Isopropyl― beta— D— thiogalactopyrano side
EDTA： Ethylene diamine tetrac etic acid
dATP : 2*― deoxyadenosine o —triphosphate
dGTP： 2 '― deoxyguanosine 5'— triphosphate
dCTP : 2'― deoxycytidine o —triphosphate
dTTP : 2'― deoxythymidine o —triphosphate
Pd— C : Palladium on carbon
DMF： Dimethylformamide
Et N： Triethy amine
3
pNPCF： para― Nitrophenyl choroformate
DMAP : N， N― dimethyl— 4— aminopyridin
DMSO : Dimethyl sulfoxide
AP： Alkanine Phosphatase
[0103] 実施例 1 : 3，一 SLN - a PGA (Poly (Neu5 Acひ 2— 3LacN Ac j8— p— aminoph enylZ - PGA) )および 6， - SLN - a PGA (Poly (Neu5 Ac a 2~ 6LacNAc β 一 p— aminophenyl/ 一 PGA) )の調製
[0104] 下記式 (IX)に示す合成経路で 3，—SLN— ひ PGAおよび 6，—SLN— a PGAを 調製した。
Figure imgf000035_0001
GlcNAc-pNP 3'(6')-SLN-pNP
Reduction 3'(6')-SLN-pAP
Coupling reagent PGA
Figure imgf000035_0002
(IX)
[0105] (1) β 1 , 4-Galactosyltransferase ( β 1, 4— GalT)の調製
β 1, 4— GalTの調製は、野口らの方法（特開 2002— 335988)に記載されている 発現プラスミド pTGF— Aを用いて行った。 pGTF— Aを保持する大腸菌 JM109菌を 、 100 gZmlのアンピシリンを含有する 2 X YT培地 50mlに植菌し、 30°Cで振とう 培養した。菌体濃度力 X 108個 Zmlに達した時点で、培養液に最終濃度 0. ImM になるように IPTGを添加し、さらに 30°Cで 16時間振とう培養を続けた。培養終了後 、遠心分離（9, OOO X g, 20分）により菌体を回収し、 5mlの緩衝液（10mMトリス塩 酸 (pH8. 0)、 ImM EDTA)に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さら に遠心分離 (20, OOO X g, 10分）により菌体残さを除去し、得られた上清画分を酵 素液とした。酵素液における j8 1, 4— GalT活性は特開 2005— 335988号公報に 記載されて!ヽる方法で測定した。
[0106] (2) « 2, 3 - Sialyltransf erase ( α 2, 3— SiaT)の調製
a 2, 3— SiaTの調製は、野口らの方法（特開 2002— 335988)に記載されている 発現プラスミド pMal - siaTを用 、て行つた。 pMal - siaTを保持する大腸菌 JM 109 菌を、 100 g/mlのアンピシリンを含有する 2 X YT培地 50mlに植菌し、 30°Cで振 とう培養した。菌体濃度力 X 108個/ mlに達した時点で、培養液に最終濃度 0. 1 mMになるように IPTGを添カ卩し、さらに 30°Cで 16時間振とう培養を続けた。培養終 了後、遠心分離（9, OOO X g, 20分）により菌体を回収し、 5mlの緩衝液（lOOmMト リス塩酸 (pH8. 0)、 10mM MgCl )に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕
2
し、さらに遠心分離 (20, OOO X g、 10分）により菌体残さを除去し、得られた上清画 分を酵素液とした。酵素液における a 2, 3— SiaT活性は特開 2005— 335988号公 報に記載されて ヽる方法で測定した。
[0107] (3) « 2, 6- Sialyltransf erase ( α 2, 6— SiaT)の調製
フォトバタテリゥム 'ダムセラ subsp. damsela (NBRC No. 15633又は ATCC 33539)からの染色体 DNAは次の手順により調製した。まず、該菌の凍結乾燥菌体 を 100 /z Lの 50mM トリス塩酸緩衝液（ρΗ 8. 0) , 20mM EDTAに懸濁したの ちに 10 Lの 10%SDS溶液を添カ卩して室温で 5分静置により溶菌させる。そして、こ の溶菌液力 フエノール抽出ならびにエタノール沈殿により得られた沈殿を 20 μしの ΤΕバッファー（10mM トリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) , ImM EDTA)に溶解するこ とにより、該菌から染色体 DNAを調製した。
[0108] 以上のように調製した DNAを铸型として、以下に示す 2種類のプライマー DNA(A )および (B)を常法に従って合成した。これら 2種類のプライマーを用い、 PCR法によ りフォトバクテリウム*ダムセラの j8—ガラクトシド α 2, 6—シァリルトランスフェラーゼを コードする bst遺伝子（Submitted to NCBI、 Accession No. AB012285)を 含む領域の DNAを増幅した。
[0109] プライマー（A) ： 5， 一 GTGTGGC ATAGTACGC ACTT - 3，
プライマー（B) ： 5， -AGGTCGCCACATTTACGATG - 3，
[0110] PCR法による bst遺伝子を含む領域の DNA増幅は、反応液 100 1を DNA The rmal Cycler Dice (タカラバイオ社）を用いて、熱変性（94°C、 1分）、アニーリング (47°C、 1分）、及び伸長反応（72°C、 2分)からなるステップを 36回繰り返すことによ り行った。前記反応液は、 lOxPyrobest Buffer (タカラバイオ社）を 10 1、 0. 2m Mの dATP、 0. 2mMの dGTP、 0. 2mMの dCTP、 0. 2mMの dTTPを含み、铸型 DNAを 0. lng、プライマー DNA (A)ぉょび（B)各々0. 2 M、 Pyrobest DNA ポリメラーゼ（タカラバイオ社)を 2. 5units、含むものとした。
[0111] 増幅後の DNAを、文献（Molecular Cloningゝ （Maniatisら編、 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) )の方法に従 つてァガロースゲル電気泳動により分離し、 2. 3kbの DNA断片を精製した。該 DN Aを铸型として、以下に示す 2種類のプライマー DNA (C)および（D)を使って、 PCR 法によりフォトバタテリゥム 'ダムセラの bst遺伝子を増幅した。
[0112] プライマー（C) ： 5，一 CTTGGATCCTGTAATAGTGACAATACCAGC - 3， プライマー（D) ： 5， - TAAGTCG ACTTAAGCCC AG AAC AG AAC ATC - 3，
[0113] PCR法による bst遺伝子の増幅は、反応液 100 1を DNA Thermal Cycler D ice (タカラバイオ社)を用いて、熱変性（94°C、 1分）、アニーリング（52°C、 1分）、及 び伸長反応（72°C、 2分)からなるステップを 30回繰り返すことにより行った。前記反 応液は、 lOxPyrobest Buffer (タカラバイオ社）を 10 1、濃度 0. 2mMの dATP、 濃度 0. 2mMの dGTP、濃度 0. 2mMの dCTP、濃度 0. 2mMの dTTPを含み、铸 型 DNAを 0. lng、プライマー DNA (C)および（D)各々 0. 2 M、 Pyrobest DN Aポリメラーゼ（タカラバイオ社)を 2. 5units、含むものとした。
[0114] 遺伝子増幅後、 DNAをァガロースゲル電気泳動により分離し、 1. 5kbの DNA断 片を精製した。得られた DNA断片を制限酵素 BamHI及び Sailで切断し、同じく制 限酵素 BamHI及び Sailで消化したプラスミド pTrc l 2— 6 (特開 2001— 103973)と T4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌 Κ12 Μ109菌（ タカラバイオ株式会社より入手)を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換 体よりプラスミド Ρ 12— 6— pst A Nを単離した。
[0115] プラスミド p l 2— 6—pst A Nを保持する大腸菌 JM109株を、 25 μ gZmlのカナマ イシンを含有する培地（2%ペプトン、 1 %酵母エキス、 0. 5%NaCl、 0. 15%ダルコ ース） 100mlに植菌し、 30°Cで振とう培養した。 5時間後培養液に最終濃度 0. 2mM になるように IPTGを添加し、さらに 18°Cで 20時間振盪培養を続けた。培養終了後、 遠心分離（9, OOOxg, 10分）により菌体を回収し、 2. 5mlの緩衝液（20mM酢酸ナ トリウム (pH5. 5) )に懸濁して懸濁液を得た。ブランソン社製超音波破砕機 (モデル 450ソ-ファー）を用いて懸濁液を氷冷下で超音波処理し（50W, 2分， 3回）、 4°C、 12, OOOxgの条件下で 20分間遠心分離し、可溶性画分 (上清)を回収した。
[0116] このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品における ex 2, 6シァリルトラ ンスフヱラーゼ活性を測定した。その結果、 0. 44 units/min/ml 酵素液であつ た。
[0117] なお、 α 2, 6シァリルトランスフェラーゼ活性は、以下に示す方法で CMP— NeuA cと N—ァセチルラクトサミン力も 6'— SialylLacNAcへの転換活性を測定、算出した ものである。すなわち、濃度 25mMトリス塩酸緩衝液 (pH5. 5)、濃度 50mMの CM P— NeuAc、濃度 10mMの N—ァセチルラクトサミンに α 2, 6シァリルトランスフェラ ーゼ酵素標品を添加して 37°Cで 10分反応させる。反応液を 3分間の煮沸にて反応 停止し、 HPAEC— CD (High— performance anion― exchange chromato graphy coupled with conductivity detection)による糖分 を行つ。分離に はダイオネタス社製の Carbopac PA1カラム（4 X 250mm)を用い、溶出液として（ A)濃度 0. 1Mの NaOH溶液と（B)濃度 0. 1Mの NaOH,濃度 0. 5Mの酢酸ナトリ ゥム溶液の濃度勾配（0— 10分： B = 0%、 10— 25分： B=45%、 25— 30分： B= l 00%)を用いる。 HPAEC— CD分析結果力 反応液中の LacNAc消費量および 6' — SialylLacNAcの生成量を算出し、 37°Cで 1分間に 1 moleの NeuAcを N—ァ セチルラタトサミンに転移させる活性を lunitとする。
[0118] (4) 3，— SLN— pNP (p— nitrophenyl— Neu5Ac a 2— 3LacNAc)の合成
lOOmMの Tris— HCl(pH8. 0) , 20mMの MgCl , 20mMの GlcNAc— pNP (p
2
-nitrophenyl-GlcNAc) , 30mMの UDP— Gal, 5. 0% (v/v) Acetonitrile, 0. lUZmlの j8 1, 4— GalTを含む溶液 75mlを 37°Cで 6時間インキュベーションし た。この反応液に 20mMの MnCl , 30mMの CMP— NeuAc, lUZmlのアルカリ
2
ホスファターゼ（タカラバイオ社）， 0. 22U/mlの α 2, 3— SiaTを添カロして 100mlに した。反応液は 37°Cで 20時間インキュベーションした後、 5分間煮沸し、遠心分離 (8 , OOOrpm, 20分）して上清を回収した。
[0119] 合成液を ODSカラム（340mL, 50mM炭酸水素トリエチルァミンで平衡化）に吸着 させ、 5— 10%MeOH— 50mM炭酸水素トリエチルァミンで目的物を溶出した。 3' — SLN— pNP溶出フラクションを回収し、回収した溶出フラクションを濃縮後、水で 5 回共沸し、炭酸水素トリエチルァミンを除去した。 ODSカラム回収液を 150mLとし、 DEAEカラム（330mL)に吸着し、 0. 05N炭酸水素アンモ-ゥム水溶液で溶出し、 3'— SLN— pNP溶出フラクションを回収した。これを濃縮し、さらに水で 5回共沸し、 炭酸水素アンモ-ゥムを除去した。残渣に MeOH(20mL)を力卩ぇ共沸脱水した。こ れを真空乾燥し（50°C、 3h)、 3，ーSLN—pNPを963mg(79%,残留 MeOHO.8 分子含む)を得た。
[0120] (得られた3，ーSLN— pNPのNMR)
— NMR(D O)： δ 8.26 (2Η, d, J = 9.3Hz), 7.20 (2H, d, J = 9.3Hz), 5
2
.35(1H, d, J = 8.4Hz), 4.61 (1H, d, J = 7.9Hz), 4. 16— 3.59(19H, m) , 2.78 (1H, dd, J=4.6, 12.5Hz), 2.04 (3H, s), 2.02 (3H, s), 1.82(1H , t, J=12.2Hz)
[0121] (5)6，— SLN— pNP(p— nitrophenyl— Neu5Aca2— 6LacNAc)の合成
lOOmMの Tris— HCl(pH8.0), 20mMの MgCl , 20mMの GlcNAc— pNP,
2
30mMの UDP— Gal, 5.0% (v/v) Acetonitrile, 0. lU/mlの j81, 4— GalT を含む溶液 75mlを 37°Cで 6時間インキュベーションした。この反応液に 20mMの M nCl , 30mMの CMP— NeuAc, lU/mlのアルカリホスファターゼ（タカラバイオ社
2
), 0.22U/mlの α2, 6— SiaTを添カ卩して 100mlにした。反応液は 37°Cで 20時 間インキュベーションした後、 5分間煮沸し、遠心分離 (8, OOOrpm, 20分)して上清 を回収した。
[0122] 合成液を ODSカラム（300mL, 50mM炭酸水素トリエチルァミンで平衡化）に吸着 させ、 5— 10%MeOH— 50mM炭酸水素トリエチルァミンで目的物を溶出した。 6' — SLN— pNP溶出フラクションを回収し、回収した溶出フラクションを濃縮後、水で 5 回共沸し、炭酸水素トリエチルァミンを除去した。 ODSカラム回収液を 150mLとし、 DEAEカラム（300mL)に吸着し、 0.05N炭酸水素アンモ-ゥム水溶液で溶出し、 6'— SLN— pNP溶出フラクションを回収した。これを濃縮し、さらに水で 5回共沸し、 炭酸水素アンモ-ゥムを除去した。残渣に MeOH(20mL)を力卩ぇ共沸脱水した。こ れを真空乾燥し（50°C、 2h)、 6'—SLN—pNPをl.05g(86%, 残留 MeOHO. 8分子含む)を得た。
[0123] (得られた6，ーSLN— pNPのNMR)
— NMR(D O)： δ 8.26 (2Η, d, J = 9.3Hz), 7.21 (2H, d, J = 9.3Hz), 5
2
.39(1H, d, J = 8.5Hz), 4.50(1H, d, J = 7.9Hz), 4. 10(1H, dd, J=8.5, 10.5Hz), 4.04-3.56(18H, m), 2.70(1H, dd, J=4.6, 12.4Hz), 2.06 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.75(1H, t, J=12.2Hz)
[0124] (6)3，— SLN— pAP(p— aminophenyl— Neu5Aco;2— 3LacNAc)の合成
3，— SLN— pNP(503mg, 0.6mmol)を蒸留水（30mL)に溶解し、 10%Pd— C (50mg)、ギ酸アンモ-ゥム（378mg, 6. Ommol)を加え室温で攪拌した。 2時間後 に HPLC分析を行い、原料が完全に消失していることを確認した後、反応を開放系と し、室温で 21時間攪拌した。 Pd— Cをろ過して除き、ろ液を濃縮後、水（3ml)—トリ ェチルァミン（lmlXl, 0.5mlX2)で 3回共沸して 3，— SLN— pAP— Et N塩とし
3 た後、 DMF(3mL)で 3回共沸脱水し、残渣を DMFの 2.4mL溶液（0.25M)に調 製した。
[0125] (アンモ -ゥム塩の NMR)
— NMR(D O)： δ 6.97 (2Η, d, J = 8.9Hz), 6.88 (2H, d, J = 8.9Hz), 5
2
.04 (1H, d, J = 8.5Hz), 4.60(1H, d, J = 7.9Hz), 4. 14(1H, dd, J=3.1, 9.9Hz), 4.04-3.58(18H, m), 2.78 (1H, dd, J=4.6, 12.5Hz), 2.05 ( 3H, s), 2.05 (3H, s), 1.82(1H, t, J=12.2Hz)
[0126] (7)6，— SLN— pAP(p— aminophenyl— Neu5Aco;2— 6LacNAc)の合成
6，— SLN— pNP(502mg, 0.6mmol)を蒸留水（30mL)に溶解し、 10%Pd— C (50mg)、ギ酸アンモ-ゥム（378mg, 6. Ommol)をカ卩ぇ室温で攪拌した。 2.5時間 後に HPLC分析を行い、原料が完全に消失していることを確認した後、反応を開放 系とし、室温で 21時間攪拌した。 Pd— Cをろ過して除き、ろ液を濃縮後、水（3ml) - トリェチルァミン（lml XI, 0.5mlX2)で3回共沸して6，—SLN—pAP—Et N塩と
3 した後、 DMF(3mL)で 3回共沸脱水し、残渣を DMFの 2.4mL溶液（0.25M)に 調製した。
[0127] (アンモ -ゥム塩の NMR)
— NMR(D O)： δ 6.97 (2Η, d, J = 8.8Hz), 6.86 (2H, d, J = 8.8Hz), 5
2
.07(1H, d, J = 8.5Hz), 4.48 (1H, d, J = 7.9Hz), 4.03— 3.54(19H, m) , 2.69(1H, dd, J=4.6, 12.4Hz), 2.07 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.74 (1H , t, J=12.2Hz) [0128] (8)3' - SLN - a PGA (Poly (Neu5Ac a 2 - 3LacNAc β— p— aminophenyl Z a—PGA))の合成
aPGA(13mg, 0. Immol as glu unit) , Et Ν(17^1, 0. 12mmol)を DMF
3
(1. Oml)に溶解し、 0。Cで DMAP(1. 2mg, 0. 0 Immol), pNPCF(24mg, 0. 1 2mmol)を加え、同温で lh攪拌した。 3，— SLN— pAP(0. 25M, 0.4ml, 0. lm mol)の DMF溶液および HOBt(31mg, 0. 2mmol) , Et Ν(14^1, 0. Immol)を
3
それぞれ加え、室温で 24時間攪拌した。反応液に水（200 1)を加えた後、 IN— N aOH(l. 6ml)をカ卩えて、室温で 1時間攪拌した。生じた沈殿を遠心分離（15, OOOr pm, 5min)で除いた。
[0129] 上清 1. 5mlを透析チューブに入れ、 200mlの蒸留水で透析した。 3'— SLN— a PGA液を回収し、エバポレーター濃縮（バス温 40°C)で 0. 8mlとし、ゲル濾過（Sep hadex G-50F, 8ml)にかけた。サンプルをアプライした後、超純水 10mlで溶出 し、アプライから全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、 1000mlの 蒸留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム（Dowe X AG 50W-8X, 3ml)にかけた。吸着後 30mlの超純水で溶出し、吸着液力も全 量を回収した（40〜45ml)。回収液をエバポレーター濃縮で（バス温 40°C)で 0. 8m 1とし、凍結乾燥（棚温 20°C、ー晚）して 37.4mgの 3'— SLN— α PGAを得た。得ら れた 3'—SLN— aPGAについて、 H— NMR分析を行い、下記式に基づき糖残基 置換度を求めた結果、 68%と算出された (図 12参照)。
糖残基置換度 (%) = (AX100)/(C- (3A/4) -4B)
[0130] (得られた 3， -SLN- a PGAの NMR)
— NMR(D O, 60°C)： δ 7. 26 (brs) , 6. 93(brs), 5. 00(brs), 4. 57(brs),
2
4. 12(d, J = 9. 6Hz), 4. 07— 3. 50 (m), 2. 78(d, J = 8. 2Hz), 2.41 (brs), 2. 29-1. 92 (m), 1. 81(t, J=12. 0Hz)
[0131] (9)6' - SLN- aPGA(Poly(Neu5Aca2-6LacNAcj8 -p- aminophenyl Z a—PGA))の合成
aPGA(13mg, 0. Immol as glu unit), Et Ν(17^1, 0. 12mmol)を DM
3
F(l. Oml)に溶解し、 0。Cで DMAP(1. 2mg, 0. 0 Immol), pNPCF(24mg, 0. 12mmol)を加え、同温で 1時間攪拌した。 6'— SLN— pAP(0. 25M, 0. 4ml, 0. Immol)の DMF溶液および HOBt(31mg, 0. 2mmol) , Et Ν(14^1, 0. Immol
3
)をそれぞれ加え、室温で 19時間攪拌した。反応液に水（200 1)をカ卩えた後、 1N -NaOH(l. 6ml)を加えて、室温で lh攪拌した。生じた沈殿を遠心分離（15, 000 rpm, 5min)で除いた。
[0132] 上清 1. 5mlを透析チューブに入れ、 200mlの蒸留水で透析した。 6'— SLN— a PGA液を回収し、エバポレーター濃縮（バス温 40°C)で 0. 8mlとし、ゲル濾過（Sep hadex G-50F, 8ml)にかけた。サンプルをアプライした後超純水 10mlで溶出し 、アプライ力も全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、 1000mlの蒸 留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム（Dowex AG 50W-8X, 3ml)にかけた。吸着後 30mlの超純水で溶出し、吸着液力も全量 を回収した（40〜45ml)。回収液をエバポレーター濃縮で（バス温 40°C)で 0. 8mlと し、凍結乾燥（棚温 20°C、ー晚）して 39. 6mgの 6'— SLN— α PGAを得た。得られ た 6'—SLN— aPGAについて、 H— NMR分析を行い、下記式に基づき、糖残基 置換度を求めた結果、 66%と算出された (図 13参照)。
糖残基置換度 (%) = (AX100)/(C- (3A/4) -4B)
[0133] (得られた 6， 一 SLN— aPGAの） NMR)
— NMR(D O, 60°C)： δ 7. 28 (brs) , 6. 97(brs), 5. 06 (brs) , 4. 47(d, J =
2
7. 7Hz), 4. 00-3. 55 (m), 2. 71 (dd, J=4. 2, 12, 2Hz), 2.41 (brs), 2. 2
9-1. 90 (m), 1. 71(t, J=12. 0Hz)
[0134] 実施例2:3， —SLN— γPGA(Poly(Neu5AcQ；2— 3LacNAcJ8—p— aminoph enyl/ y - PGA) )および 6 ' - SLN - y PGA (Poly (Neu5Ac a 2— 6LacNAc β
— p— aminophenyl/ y― PGA) )の調製
[0135] (l)LN-pNP (p- nitrophenyl - LacNAc)の合成
lOOmM Tris— HCl(pH8. 0), 20mM MgCl , 20mM GlcNAc— pNP, 30
2
mM UDP-Gal, 5. 0% (v/v) Acetonitrile, 0. lU/ml β 1, 4— GalTを含 む溶液 75mlを 37°Cで 6時間インキュベーションした後、 5分間煮沸し、遠心分離 (8, OOOrpm, 20分）して上清を回収した。これを ODSカラム（60mL, 50mM炭酸水素 トリェチルァミンで平衡化）に吸着させ、 5— 10%MeOH— 50mM炭酸水素トリェチ ルァミンで目的物を溶出した。 LN— pNP溶出フラクションを回収し、濃縮後、水で 5 回共沸し、炭酸水素トリエチルァミンを除去した。これを真空乾燥し (50°C、 3h)、 LN — pNPを 307mg得た。
[0136] (得られた LN— pNPの NMR)
— NMR (D O) : δ 8. 25 (2H, d, J = 9. 3Hz) , 7. 20 (2H, d, J = 9. 3Hz) , 5
2
. 36 (1H, d, J = 8. 4Hz) , 4. 53 (1H, d, J = 7. 8Hz) , 4. 12— 3. 57 (12H, m)
, 2. 03 (3H, s)
[0137] ( 2) LN— pAP (p - aminophenyl - LacNAc)の合成
LacNAc— pNP (550mg, 1. 09mmol)を水一メタノール（10 : 1, 44ml)に溶解し
、 10%パラジウム炭素触媒（55mg)、ギ酸アンモ-ゥム（550mg, 8. 7mmol)をカロえ
、室温で 1. 5時間攪拌した。反応懸濁液をろ過し、ろ液を濃縮した。残渣を ODSカラ ム（80mL)に吸着し、 5%メタノールで目的物を溶出した。溶媒を留去し、 LN-pAP を 513mg (99%)得た。
[0138] (得られた LN—pAPの NMR)
— NMR (D O)： δ 6. 94 (2Η, d, J = 8. 8Hz) , 6. 81 (2H, d, J = 8. 8Hz) , 5
2
. 02 (1H, d, J = 8. 5Hz) , 4. 51 (1H, d, J = 7. 8Hz) , 4. 02— 3. 54 (12H, m) , 2. 05 (3H, s)
[0139] ( 3) LN - γ PGA (Poly (LacNAc j8 -p- aminophenyl/ γ PGA) )の合成 y PGA(6. 5mg, 0. 043mmol as glu unit)を lOOmMの Na CO /NaHC
2 3
Oノ ッファ， pH10. 0 (0. 5ml)【こ溶解し、 LN— pAP (60. Omg, 0. 126mmol)の
3
lOOmM Na CO /NaHCOバッファ溶液（0. 4ml)および HOBt (6. 5mg, 0. 0
2 3 3
42mmol) , BOP試薬（50. 7mg, 0. 115mmol)の DMSO溶液（1. 4ml)をそれぞ れ加え、室温で 24時間攪拌し反応させた。得られた反応液に 2. 3mlの PBS (10m M リン酸バッファ（pH7. 5)および 120mM NaCl, 2. 7mM KC1)をカ卩えて、氷 上で 2時間攪拌した。生じた沈殿を遠心分離（15, OOOrpm, 5min)で除いた。上清 4. 6mlに PBS1. 5mlを添カ卩して沈殿が生じないのを確認した後、エバポレーター濃 縮（バス温 40°C)で 0. 8mlとし、ゲル濾過（Sephadex G— 50F, 8ml)に力けた。サ ンプルをアプライした後超純水 10mlで溶出し、アプライ力も全量を回収した。回収サ ンプルを透析チューブに入れ、 1000mlの蒸留水および超純水で透析した。透析サ ンプルを回収してエバポレーター濃縮で (バス温 40°C)で 0. 8mlとし、凍結乾燥 (棚 温 20°C、ー晚）して 19. Omgの LN— y PGAを得た。得られた LN— y PGAについ て、 — NMR分析を行い、下記式に基づき、糖残基置換度を求めた結果、 50%と 算出された（図 14参照)。
糖残基置換度 (%) = (A X 100) / (B- (3A/4) )
[0140] (得られた LN— y PGAの NMR)
— NMR (D O, 60°C)： δ 7. 30 (brs) , 6. 97 (brs) , 5. 05 (brs) , 4. 50— 3. 6
2
4 (m) , 2. 84 (br) , 2. 43— 1. 92 (m)
[0141] (4) 3 ' - SLN - y PGA (Poly (Neu5Ac a 2 - 3LacNAc β— p— aminophenyl Ζ Ύ—PGA) )の合成
50mM 力コジル酸バッファ（pH6. 0) , 2. 5m MnCl , 8mg LacNAc- y PG
2
A, 30mM CMP-NeuAc, 0. l% (w/v) BSA, 20U/ml AP, 0. 02U/ml
« 2, 3-SiaT(Rat, Recombinant, Spodoptera frugiperda, CALBICHEM 社)を含む溶液 1. 05mlを 37°Cで 44時間インキュベーションした後、 3分間煮沸し、 遠心分離（15, OOOrpm, 5分）して上清を回収した。上清をゲル濾過（Sephadex G- 50F, 8ml)にかけた。サンプルをアプライした後超純水 8mlで溶出し、アプライ から全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、 1000mlの蒸留水およ び超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム（Dowex AG 50 W-8X, 3ml)にかけた。吸着後 30mlの超純水で溶出し、吸着液力 全量を回収し た (45ml)。回収液をエバポレーター濃縮で (バス温 40°C)で 0. 8mlとし、凍結乾燥（ 棚温 20°C、ー晚）して 9. Omgの 3，— SLN— γ PGAを得た。得られた 3，— SLN— y PGAについて、 — NMR分析を行い、下記式に基づき、シァリル化率を求めた 結果、 99%と算出された (図 15参照)。
シァリル化率 (％) = (B X 100) Z (A/4) )
[0142] (得られた 3， -SLN- γ PGAの NMR)
— NMR (D O, 60°C)： δ 7. 35 (brs) , 7. 03 (brs) , 5. 12 (brs) , 4. 58 (d, J = 7. 6Hz), 4. 13-3. 54 (m), 2. 77(d, J=12, 0Hz), 2. 53— 1. 91 (m), 1. 80 (t, J=12. 1Hz)
[0143] (5)6' -SLN - yPGA(Poly(Neu5Aca2-6LacNAcj8 - 5 - aminophenyl ΖΎ—PGA))の合成
50mM 力コジル酸バッファ（pH6. 0), 2. 5m MnCl , 8mg LacNAc- yPG
2
A, 30mM CMP-NeuAc, 0. l%(w/v)BSA, 20U/ml AP, 0. 02U/ml 2, 6— SiaT (Rat, Recombinant, Spodoptera frugiperda, CALBICHEM 社)を含む溶液 1. 05mlを 37°Cで 44時間インキュベーションした後、 3分間煮沸し、 遠心分離（15, OOOrpm, 5分）して上清を回収した。上清をゲル濾過（Sephadex G-50F, 8ml)にかけた。サンプルをアプライした後超純水 8mlで溶出し、アプライ から全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、 1000mlの蒸留水およ び超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム（Dowex AG 50 W-8X, 3ml)にかけた。吸着後 30mlの超純水で溶出し、吸着液力 全量を回収し た (45ml)。回収液をエバポレーター濃縮で (バス温 40°C)で 0. 8mlとし、凍結乾燥（ 棚温 20°C、ー晚）して 7.4mgの 6，— SLN— γ PGAを得た。得られた 6，— SLN— yPGAについて1 H— NMR分析を行い、下記式に基づき、シァリル化率を求めた結 果、 99%と算出された (図 16参照)。
シァリル化率 (％) = (B X 100) Z (A/4) )
[0144] (得られた 6， -SLN- γ PGAの NMR)
— NMR(D O, 60°C)： δ 7. 36 (brs) , 7. 05 (brs) , 5. 14(brs), 4. 49—4. 3
2
9(m), 4. 16 (brs), 4. 01— 3. 55 (m), 2. 71(d, J = 9. 9Hz), 2. 59— 1. 81 (m ), 1. 71(t, J=12. 1Hz)
[0145] 実施例 3
(1)酵素
Trichoderma reesei由来セノレラーゼ (cellulase XL— 522)は、ナガセケムテツ タスより購入した。 α 2, 3- (Ν)—シァリルトランスフェラーゼ（Rat, Recombinant , Spodoptera frugiperda)、 α 2, 6— (N)—シァリルトランスフェラーゼ（Rat, Recombinant, Spodoptera frugiperda)は、 CALBIOCHEM社より購入した 。アルカリフォスファターゼは、 Boehringer Mannheim社より購入した。
[0146] (2)基質
Lactose Monohydrate、 5— amino— 1— pentanolは、禾ロ光! ¾薬 (衝より購入 した。 γ -PGA, CMP— Neu5Ac、 LacNAcは市販品を必要より精製して使用した
[0147] (3)試薬
Trifluoroacetic Anhvdride、 MnCl ·4Η Οは、和光純薬（株）より購入した。 Β
2 2
OP、 HOBt、および BSAは、 Sigma— Aldrich社より購入した。
[0148] (4)酵素活性測定法
<LaC j8— pNP加水分解活性 >
T. reesei由来セルラーゼの酵素活性測定法は Lac jS— pNPからの pNPの遊離 量を定量して行った。 10mM Lac jS— pNP (25 /z l)と 50mM酢酸ナトリウム緩衝液 pH5. 0 (70 μ 1)とを混合し、適当量の酵素を加えて全量を 100 μ 1とし、 40°Cで 20 分間反応を行った。経時的に反応液から 10 1とり、予め 96穴マイクロプレートに分 注しておいた 1. 0M炭酸ナトリウム溶液（190 1)と混合し、反応停止後、直ちにプレ 一トリーダーを用い 405nmにおける吸光度を測定し、遊離した pNPを定量した。酵 素活性 1Uは、 1分間に 1 μ molの pNPを遊離させる酵素量と定義した。
[0149] < Gal j8— pNP加水分解活性 >
T. reese油来セルラーゼ中に夾雑する |8— D—ガラクトシダーゼ活性測定法は G al β—pNPからの pNPの遊離量を定量して行った。 10mM Gal β—pNP (25 μ 1) と 50mM 酢酸ナトリウム緩衝液 ρΗ5. 0 (25 μ 1)とを混合し、適当量の酵素を加えて 全量を 100 1とし、 40°Cで 20分間反応を行った。経時的に反応液から 10 1とり、 予め 96穴マイクロプレートに分注しておいた 1. 0M炭酸ナトリウム溶液（190 1)と混 合し、反応停止後、直ちにプレートリーダーを用い 405nmにおける吸光度を測定し、 遊離した pNPを定量した。酵素活性 1Uは、 1分間に 1 molの pNPを遊離させる酵 素量と定義した。
[0150] (5)酵素の調製
<T. reesei 由来セルラーゼの部分精製 > T. reesei由来セルラーゼの粗酵素溶液（1000ml, 875kU)を 25%飽和硫安で処 理後、高速微量遠心機（KUBOTA 1720 ;RA- 200J ローター使用、 KUBOTA 製）を用いて 4°Cで遠心分離を行い（6010g X 20min)上清を回収した。これを、 75% 飽和硫安で処理し、同様の条件で遠心分離後、生じた沈殿を 10mMリン酸ナトリウム 緩衝液 (PH6. 0)に溶解した。分画分子量 30000の限外ろ過膜 (PM— 30, Millipo re Corp. )を用いて脱塩後、凍結乾燥を行い、 7. 8gの酵素粉末を得た。そのうち 1 . 0gを 10mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH6. 0)に溶解し、予め同緩衝液で平衡化し た DEAE— Sepharose Fast Flowカラムクロマトグラフィー（ φ 2. 6 X 18cm)に供 した。カラムを 1000mlの同緩衝液で洗浄後、 600mlの 500mM NaClを含む同緩 衝液でステップワイズ溶出を行った。カラム吸着部を限外ろ過により脱塩、濃縮後、 凍結乾燥を行い、部分精製酵素 (0. 7g, 0. 70UZmg)を得た。
[0151] < Gal- amidine gelを用いた j8—D—ガラクトシダーゼの除去 >
部分精製酵素（50mg, Lac jS— pNP加水分解活性 35U, Gal jS pNP加水分 解活性 19U)を 50mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH6. 0 ( 1. Oml)に溶解し、予め同 溶媒で平衡化しておいた Gal— amidineァフィユティーカラムクロマトグラフィー（ φ 1 . 2 X 1. 7cm)〖こ供した。流速 lOmlZhにおいて各エツペンドルフチューブに lmlず つ分取して、非吸着部を 50mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH6. 0 (30ml)で洗浄した 。吸着部を 1. OM NaClを含む 50mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH6. 0 (20ml)で 溶出し、さらに 0. 5M methyl β— Galを含む 50mM酢酸ナトリウム緩衝液 ρΗ4. 0 ( 10ml)で溶出した。タンパク質の検出は 280nmの吸光度を測定することで行い、 Lac jS— pNPおよび Gal jS— pNPの加水分解活性を測定した。それぞれの画分を 分画分子量 30000の限外ろ過膜 (PM— 30, Millipore Corp. )を用いて濃縮後 、凍結乾燥を行い、非吸着部より β D ガラクトシダーゼを除去した部分精製酵素 (Lac jS— pNP加水分解活性 32U, Gal jS pNP加水分解活性 0. 3U)を得た (Ta ble. l) oなお、以後の反応には全て j8— D ガラクトシダーゼを除去した部分精製 酵素を用いた。
[0152] これらの酵素等を用い、下記式 (X)に示す合成経路で下記に記載する手順で Pol v (Neu5Aca 2— 3LacNAc β— 5— aminopentyl/ γ—PGA)および Poly (N eu5Aca a 2— 6LacNAc β — 5— aminopentyl/ y― PGA)を調製した。 —, HO ^^NHCOCF3 + M, 0_S (Χ Η
Figure imgf000048_0001
COO" a* O ,
— i— C C—
H H2 H2
Figure imgf000048_0002
(x)
(6) 5— Trifluoroacetamido— 1— pentanolのィ匕学合成
はじめに、 5 - amino - 1 - pentanol ( 1 Og, 97mmol)にピリジン（20ml)をカ卩えて 溶解した。これを氷冷、攪拌し、そこへ無水トリフルォロ酢酸（25ml, 180mmol)を滴 下しながら添加し反応を開始させた。反応開始から 5分おきに TLC (展開溶媒 クロ 口ホルム:アセトン = 8 : 2)で、リンモリブデン酸発色を用い反応を確認した。 1時間後 、 TLCで原料が消失したのを確認した後、クラッシュアイスを反応液と同量程度加え て反応を停止させ、続、て飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 200mlをカ卩えて反応液を 中和した。反応液を濃縮後、アセトンを適量加え再び濃縮を行った。この操作を 3回 程度繰り返したのち、反応液をアセトンで溶解し、多量に存在する炭酸水素ナトリウム を析出させた。これをろ過後、濃縮し、クロ口ホルム:アセトン =8:2で平衡化（10ml /min)したシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ φ 4. 5 X 35cm)に供した。約 25ml ごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は TLC (展開溶媒 クロ口ホルム：アセトン =8 :2)で、リンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。 目 的物を含む画分を濃縮し、 目的物である 5—Trifluoroacetamido— 1 pentanol を収量 18g、収率 94%で得た。これを1 H— NMRに供した。
(5— Trifluoroacetamido— 1— pentanolの NMR)
'H-NMRCD O, 270 MHz)： δ 3. 59 (t, 2Η, Hi), 3. 33 (t, 2H,
2
H-e), 1.65-1.48(2HX2, H—b, d), 1. 36 (2H, H— c) [0154] (7) 5— Trifluoroacetamidopentyl j8— lactosideの合成
基質として lactose (54. 3g, 151mmol)と 5— Trifluoroacetamido— 1—penta nol(30. Og, 151mmol)とを 50mM酢酸ナトリウム緩衝液 pH5.0(151ml)に溶解 し、そこへガラクトシダーゼを除去した T. reesei由来セルラーゼ（4500U)を加えて 反応を開始させた。反応を追跡するために反応液 10 1を経時的に採取し、 190^1 の脱塩水をカ卩えた後、 100°Cで 10分間煮沸して反応を停止させ、 0.45 mフィルタ 一でろ過した後、ろ液を HPLCにより分析した。反応液を激しく振とう（200rpm)し、 4 0°Cで 120時間反応を行った。その後、 100°C、 10分間の煮沸により反応を停止させ た。反応液を濃縮後、クロ口ホルム:メタノール：水 =7: 3:0.5で平衡化（lOmlZmi n)した Silica Gel 60N カラムクロマトグラフィー（ φ 4. 5 X 50cm)に供し同溶媒 で溶出し、 2311117 1½ずっ分取して11^ (クロロホルム：メタノール：水=7:3:0. 5 )で分析した。 目的画分を含む画分を濃縮し、重水に溶解して1 H— NMRにより構造 解析した結果、 5 - Trifluoroacetamidopentyl β—lactosideを収量 849mg、収 率 1.0%で得た。
(5—Trifluoroacetamidopentyl β—lactosideの NMR)
— NMR(D O, 270 MHz)： 64.48 (d, 1H, H— 1), 4.45 (d, 1H,
2
H-l'), 3. 34 (t, 2H, H-e), 3. 32(1H, H— 2), 1. 71— 1. 57(2 HX2, H—b, d), 1.42(2H, H c)
[0155] (8) 5— Trifluoroacetamidopentyl j8— N— acetyllactosaminideの合成 基質として N— acetyllactosamine (20. Og, 52. 2mmol)と 5— Trifluoroaceta mido - 1 - pentanol (15. 6g, 78. 4mmol)とを lOOmM酢酸ナトリウム緩衝液 pH 4. 0 (52. 2ml)に溶解し、そこへガラクトシダーゼを除去した T. reesei由来セルラ ーゼ（6200U)をカ卩えて反応を開始させた。反応を追跡するために反応液 10 μ 1を 経時的に採取し、 190 1の脱塩水を加えた後、 100°Cで 10分間煮沸して反応を停 止させ、 0. 45 mフィルターでろ過した後、 HPLCにより分析した。反応液を激しく 振とう（200rpm)し、 40°Cで 144時間反応を行った。その後、 100°C、 10分間の煮 沸により反応を停止した。反応液を濃縮後、水で平衡化（5. OmlZmin)した活性炭 —セライトクロマトグラフィー（ φ 4. 5 X 100cm)に供した。まず、 0% (5. 0L)— 25% (5 . 0L)のエタノール直線濃度勾配法により、基質として用いた LacNAcを溶出した。 6 OmlZtubeずつ分取後、各フラクションを N -ァセチル基に由来する 21 Onmの吸光 度で測定した。 LacNAcを含む画分を濃縮することで、 LacNAcを回収量 17. 2g、 回収率 86%で得た。次に 80%エタノール（5. 0L)に切り換え吸着部を溶出した。 60m lZtubeずつ分取後、各フラクションを 210nmの吸光度で測定した。続いて、 目的画 分を含む画分を濃縮し、クロ口ホルム:メタノール：水 = 7 : 3 : 0. 5で平衡化（lOmlZ min)した Silica Gel 60N カラムクロマトグラフィー（ φ 4. 5 X 50cm)に供し同溶 媒で溶出し、 28mlZtubeずつ分取して TLC (クロ口ホルム：メタノール：水 = 7： 3： 0 . 5)で分析した。 目的画分を含む画分を濃縮し、重水に溶解して1 H—NMRにより 構造解析し 7こ結果、 5— Trifluoroacetamidopentyl β— Ν— acetyllactosamini deを収量 322mg、収率 1. 1%で得た。
(5—Trifluoroacetamidopentyl β— N— acetyllactosaminideの NMR) — NMR (D O, 270 MHz)： 6 4. 51 (d, 1H, H— 1) , 4. 46 (d, 1H,
2
H- l ' ) , 3. 31 (t, 2H, H-e) , 2. 02 (s, 3H, -NHAc) , 1. 57 (2 H X 2, H-b, d) , 1. 34 (2H, H— c)
(9) 5— aminopentyl j8— lactosideの合成
5—Trifluoroacetamidopentyl β—lactoside (104mg, 0. 19mmol)に 1. 0 M NaOH (l. 2ml)をカ卩えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から 30分 おきに TLC (展開溶媒 クロ口ホルム：メタノール：水 = 7 : 3 : 0. 5)で、オルシノール 硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。 1時間後、 TLCで原料が 消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（1. OmlZmin)した Sephadex G— 25カラムクロマトグラフィー（ φ 2.5 X 48cm)に供した。約 2. Omlごとにカラムを 通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は、 TLC (展開溶媒 クロ口ホルム ：メタノール:水 = 7:3:0.5)でリンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。 目的 物を含む画分を濃縮し、 目的物である 5— aminopentyl |8—1& 051(16を収量82 mg、収率 96%で得た。これを1 H— NMRに供した。
(5— aminopentyl β— lactosideの NMR)
— NMR(DO, 500 MHz)： 64.49 (d, 1H, H— 1), 4.45 (d, 1H,
2
H-l'), 3.30 (t, 1H, H-2), 2.97 (t, 2H, H— e), 1.67(2HX 2, H-b, d), 1.47(2H, H— c)
[0157] ( 10) 5— aminopentyl j8— N— acetyllactosaminideの合成
5— Trifluoroacetamidopentyl β—N— acetyllactosaminide (lOOmg, 0.1 8mmol)に 1.0M NaOH(l.2ml)をカ卩えて溶解し、室温で反応を開始した。反応 開始から 30分おきに TLC (展開溶媒 クロ口ホルム:メタノール:水 =6 :4:1)で、ォ ルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。 1時間後、 TL Cで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（1. OmlZmin)した Se phadex G— 25カラムクロマトグラフィー（ φ 2.5 X 55cm)に供した。約 2.0mlごと にカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は N—ァセチル基に由 来する 210nmの吸光度と、 TLC (展開溶媒 クロ口ホルム：メタノール：水 = 6： 4： 1) でリンモリブデン酸発色とを用い生成物を確認した。 目的物を含む画分を濃縮し、 目 的物である 5— aminopentyl β—N— acetyllactosaminideを収量 82mg、収率 9 9%で得た。これを1 H— NMRに供した。
(5— aminopentyl β—N— acetyllactosaminideの NMR)
— NMR(DO, 270 MHz)： 64.52 (d, 1H, H-l), 4.47 (d, 1H,
2
H-l'), 2.77 (t, 2H, H— e), 2.03 (s, 3H, -NHAc), 1.54(2 HX2, H-b, d), 1.35 (2H, H— c)
[0158] (11) Poly ( 5 - aminopentyl β -lactoside / γ— PGA)の合成 y— PGA(M. W. :77000, 16. 5mg)^100mM Na CO /NaHCO pHIO
2 3 3
. 0(1. 3ml)に溶解後、予め DMSO(3. 5ml)に溶解しておいた BOP(130mg)、 H OBt(16mg)を加えスターラーで攪拌した。最後に 5— aminopentyl β— lactosid e(140mg)を lOOmM Na CO /NaHCO pHIO. 0(0. 9ml)に溶解後、添カロし
2 3 3
、攪拌しながら室温で 24時間反応を行った。反応終了後、反応液が 7. 5mlになるよ うに PBSを添加した。その後、 PD— 10カラム 1本あたり 2. 5mlの反応液を PBSで平 衡ィ匕した PD— 10 (φ 1. 7X5. 0cm, Sephadex G— 25)カラムに供し、 3. 5ml の PBSで Poly (5— aminopentyl β -lactoside / γ—PGA)を溶出した。次 にこの画分を 2. 5Lの超純水に対して 3日間透析した。その間、超純水の交換を 6回 行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを1 H— NMRによる構造解析に 供した。また、糖残基置換度 (％)の計算は1 H— NMRより、 γ—PGAの βおよび γ 位プロトンの積分比（Α)と 5— aminopentyl β—lactosideのァグリコン部位のプロ トン 6個分の積分比 (B)を以下に示す式にあてはめ算出した（図 17)。その結果、糖 残基置換度 69%の Poly (5— aminopentyl β -lactoside / γ— PGA)を収量 29. 6mgで得た。
[0159] 糖残基置換度 (%) = (4 X 100) / (A- (B/6) )
(Poly (5 - aminopentyl β -lactoside Z γ— PGA)の NMR)
— NMR(D O, 500 MHz)： 64.47 (d, 1H, H— 1), 4.45 (d, 1H,
2
H-l'), 4. 34-4. 22(1H, H- a), 3. 31 (t, 1H, H— 2), 3. 20 ( 2H, H-e), 2. 42 (2H, Η— γ), 2. 20— 1. 98(2H, H~ β), 1. 63( 2H, H-d), 1. 52 (2H, H— b), 1. 35 (2H, H— c)
[0160] ( 12) Poly (5 - aminopentyl β -N-acetyllactosaminide Z γ— PGA)の 合成
y— PGA(M. W. :77000, 15. lmg)を lOOmM Na CO /NaHCO pHIO
2 3 3
. 0(1. 3ml)に溶解後、予め DMSO(3. 5ml)に溶解しておいた BOP(119mg)、 H OBt(15mg)を加えスターラーで攪拌した。最後に 5— aminopentyl β— N— ace tyllactosaminide(140mg)を lOOmM Na CO /NaHCO pHIO. 0(0. 9ml)
2 3 3
に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で 24時間反応を行った。反応終了後、反応液 が 7. 5mlになるように PBSを添カ卩した。その後、 PD— 10カラム 1本あたり 2. 5mlの 反応液を PBSで平衡化した PD— 10(φ 1. 7X5. Ocm, Sephadex G— 25)カラ ムに供し、 3. 5mlの PBSで Poly(5— aminopentyl β - Ν - acetyllactosaminid e / γ— PGA)を溶出した。次にこの画分を 2. 5Lの超純水に対して 3日間透析し た。その間、超純水の交換を 6回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これ を1 H— NMRによる構造解析に供した。また、糖残基置換度 (％)の計算は1 H— NM 尺より、 γ—PGAの 13および γ位プロトンの積分比（Α)と 5— aminopentyl β— Ν
— acetyllactosaminideのァグリコン部位のプロトン 6個分の積分比（B)をに示す式 にあてはめ算出した（図 18)。その結果、糖残基置換度 61%の Poly(5— aminopent yl β -N- acetyllactosaminide / γ—PGA)を収量 17. Omgで得た。
[0161] また、より高分子量のァシァ口型二糖含有糖鎖ポリペプチドを合成するため、上記と 同様の組成で γ— PGA(M. W. :990000, 15. Omg)を用いて行った結果、糖残 ¾i換度 58%の Poly (5— aminopentyl β— Ν— acetyllactosaminide / y
— PGA)を収量 24. Omgで得た。糖残基置換度は、次の式により求めた。
[0162] 糖残基置換度 (%) = (4X100)/ (A- (B/6 X 3) )
(Poly (5— aminopentyl β—N— acetyllactosaminide / γ— PGA)の NM R)
— NMR(D O, 270 MHz)： 64. 51 (d, 1H, H— 1), 4.47 (d, 1H,
2
H— 1，）, 4. 30-4. 21 (1H, Hi), 3. 18 (2H, H— e), 2.40 (2H, H- γ), 2. 18-1. 98(2H, H—j8), 2.02(s, 3H, -NHAc), 1. 5 2(2HX2, H-b, d), 1. 35 (2H, H— c)
[0163] (13) Poly (Neu5Ac a 2 - 3Lac j8 -5 -aminopentyl / γ— PGA)の合成 受容体基質として Poly (5— aminopentyl β—lactoside / y—PGA)
[69%, 2
5. 5mgを Lac—単位当たり 8. OmM、供与体基質として CMP— Neu5Ac 16
10kDa]
.0mM、 MnCl 2. 5mM、 BSAO. 1%、 MOPS buffer (pH7.4)50mMとなるよう
2
調整した。次に、反応液に対し lOUZmlのアルカリフォスファターゼおよび 40mUZ mlの α 2, 3—（Ν)—シァリルトランスフェラーゼを添カ卩し、 37°Cで 48時間反応を行 つた。シァリルイ匕率は1 H— NMRより、糖鎖由来の Glc(H— 2)プロトンの積分比と 5 -aminopentyl β— lactosideのァグリコン部位のプロトン 2個分の積分比の和（A )と、 Neu5Acに特徴的な 3位エタアトリアルプロトンの積分比（B)を以下に示す式に あてはめ算出した。その結果、シァリル化率 69%の Poly(Neu5Ac a 2— 3Lac β - 5 -aminopentyl / γ—PGA)を収量 6. 7mgで得た（図 19)。シァリル化率は、 次の式により求めた。
[0164] シァリル化率（％) = (B X 100) / (A/3)
(Poly (Neu5Ac α 2 - 3Lac j8 -5 -aminopentyl / γ— PGA)の NMR) — NMR(D O, 270 MHz)： 64. 53 (d, 1H, H— 1), 4.47 (d, 1H,
2
H-l'), 4. 35-4. 19(1H, H- a), 3. 30 (t, 1H, H— 2), 3. 20 ( 2H, H-e), 2. 76 (dd, 1H, H— 3，，eq), 2. 41 (2H, Η— γ), 2. 20 -1. 98 (2H, H- j8), 2. 03 (s, 3H, -NHAc"), 1. 82(t, 1H, H -3"ax), 1. 63 (2H, H— d), 1. 53(2H, H—b), 1. 36 (2H, H— c) [0165] (14) Poly (Neu5Ac a 2 - 6Lac j8—5— aminopentyl Z Ύ—PGA)の合成 受容体基質として Poly (5— aminopentyl β -lactoside / y—PGA)
[69%, 2
5. 5mgを Lac—単位当たり 8. OmM、供与体基質として CMP— Neu5Ac 16
10kDaJ
. 0mM、 MnCl 2. 5mM、 BSA0. 1%、 MOPS buffer (pH7.4)50mMとなるよう
2
調整した。次に、反応液に対し lOUZmlのアルカリフォスファターゼおよび 40mUZ mlの α 2, 6—（Ν)—シァリルトランスフェラーゼを添カ卩し、 37°Cで 48時間反応を行 つた。シァリルイ匕率は1 H— NMRより、糖鎖由来の Glc(H— 2)プロトンの積分比と 5 -aminopentyl β—lactosideのァグリコン部位のプロトン 2個分の積分比の和（A )と、 Neu5Acに特徴的な 3位エタアトリアルプロトンの積分比（B)を以下に示す式に あてはめ算出した。その結果、シァリル化率 57%の Poly (Neu5Ac a 2— 6Lac β - 5— aminopentyl / y - PGA)を収量 6. 8mgで得た（図 20)。
[0166] シァリル化率（％) = (B X 100) / (A/3)
(Poly (Neu5Ac α 2— 6Lac β— 5— aminopentyl / — PGA)の NMR) — NMR(D O, 270 MHz)： 64.47 (d, 1H, H-l), 4.43 (d, 1H,
2
H-l'), 4. 32-4. 20(1H, H- a), 3. 32 (t, 1H, H— 2), 3. 20 ( 2H, H-e), 2. 71 (dd, 1H, H— 3，，eq), 2. 41 (2H, Η— γ), 2. 20 -1. 98 (2H, H— β)， 2. 03 (s, 3H, -NHAc"), 1. 75 (t, 1H, H -3"ax), 1. 63 (2H, H— d), 1. 52(2H, H—b), 1. 35(2H, H— c) [0167] (15) Poly (Neu5Ac a 2 - 3LacNAc j8— 5— aminopentyl Z γ— PGA)の 合成
受容体基質として Poly (5— aminopentyl — Ν— acetyllactosaminide / γ -PGA) 5. Omgを LacNAc—単位当たり 8. OmM、供与体基質として
[61%, 210kDa]
CMP-Neu5Ac 16. OmM、 MnCl 2. 5mM、 BSAO. 1%、 MOPS buffer (pH
2
7. 4) 50mMとなるよう調整した。次に、反応液に対し lOUZmlのアルカリフォスファ ターゼおよび 40mU/mlの α 2, 3—（Ν)—シァリルトランスフェラーゼを添カ卩し、 37 °Cで 48時間反応を行った。シァリル化率は1 H— NMRより、 5 -aminopentyl β - N— acetyllactosaminideのァグリコン部位のプロトン 2個分の積分比（A)と、 Neu5 Acに特徴的な 3位エタアトリアルプロトンの積分比（B)を以下に示す式にあてはめ算 出した。その結果、シァリル化率 96%の Poly (Neu5Ac a 2— 3LacNAc j8— 5— a minopentyl / y - PGA)を収量 6.4mgで得た（図 21 )。
[0168] また、受容体基質として Poly (5— aminopentyl β -N- acetyllactosaminide
Ζ Ύ -PGA) 5. Omgを用いて上記と同様の方法でシァリル化を行つ
[58%, 2600kDa]
たところ、シァリル化率 100%の Poly(Neu5Ac a 2— 3LacNAc β— 5— aminope ntyl Z γ— PGA)を収量 6. Omgで得た。シァリル化率は、次の式で求めた。
[0169] シァリル化率（％) = (B X 100) / (A/2)
(Poly (Neu5Ac α 2— 3LacNAc β— 5— aminopentyl / — PGA)の NM R)
— NMR(D O, 270 MHz)： 64. 53 (d, 1H, H— 1), 4.47 (d, 1H,
2
H-l'), 4. 35-4. 20(1H, H- a), 3. 18 (2H, H— e), 2. 73 (dd, 1H, H-3"eq), 2. 40 (2H, Η— γ), 2. 20— 1. 98(2H, H— j8), 2. 03 (s, 3HX2, -NHAc, -NHAc"), 1. 82(t, 1H, H— 3，，ax), 1. 52(2HX2, H—b, d), 1. 30 (2H, H— c)
[0170] (16) Poly (Neu5Ac a 2 - 6LacNAc j8 -5 -aminopentyl / γ— PGA)の 合成 受容体基質として Poly(5— aminopentyl β— Ν— acetyllactosaminide Z y -PGA) 5. Omgを LacNAc—単位当たり 8. OmM、供与体基質として
[61%, 210kDa]
CMP-Neu5Ac 16. OmM、 MnCl 2. 5mM、 BSAO. 1%、 MOPS buffer (pH
2
7. 4) 50mMとなるよう調整した。次に、反応液に対し lOUZmlのアルカリフォスファ ターゼおよび 40mU/mlの α 2, 6—（Ν)—シァリルトランスフェラーゼを添カ卩し、 37 °Cで 48時間反応を行った。シァリル化率は1 H— NMRより、 5-aminopentyl β - N— acetyllactosaminideのァグリコン部位のプロトン 2個分の積分比（A)と、 Neu5 Acに特徴的な 3位エタアトリアルプロトンの積分比（B)、 3位アキシャルプロトンの積 分比（C)を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シァリルイ匕率 97%の Poly ( Neu5Ac 2— 6LacNAc β— 5— aminopentyl / γ— PGA)を収量 6. lmg で得た（図 22)。
[0171] また、受容体基質として Poly (5— aminopentyl β -N- acetyllactosaminide
Ζ Ύ -PGA) 5. Omgを用いて上記と同様の方法でシァリル化を行つ
[58%, 2600kDa]
たところ、シァリル化率 100%の Poly(Neu5Ac a 2— 6LacNAc β— 5— aminope ntyl Z γ— PGA)を収量 6. Omgで得た。シァリル化率は次の式で求めた。
[0172] シァリル化率（％) = ( (B+C) /2 X 100) / (A/2)
(Poly (Neu5Ac α 2— 6LacNAc j8— 5— aminopentyl / y - PGA)の NM R)
'H-NMRCD O, 500 MHz)： 64. 55 (d, 1H, H—l), 4.45 (d, 1H
2
, H-l'), 4. 33-4. 21(1H, H- a), 3. 19 (2H, H— e), 2. 67(d d, 1H, H-3"eq), 2. 40 (2H, H— γ), 2. 18— 1. 98(2H, H- β ), 2. 06 (s, 3H, -NHAc"), 2. 03 (s, 3H, -NHAc), 1. 74 (t , 1H, H-3"ax), 1. 56— 1. 51 (2HX2, H—b, d), 1. 31 (2H, H-c)
[0173] 実施例 4
参考例の方法で調製した下記の 2種類のシアル糖鎖含有ポリマー（sialyl— glyco polymer)をミクロタイタープレートに下記の方法により吸着させた。まず、 96穴ミクロ タイタープレート (Corning— Costar, Labcoat2503, Cambridge, MA)に、前記 シアル糖鎖含有ポリマーの PBS溶液を 100 μ 1づっ加えた（倍々希釈： 200 μ g/ml 、 PBSを最大濃度として倍々希釈する)。つぎに、前記プレートを、室温に 1時間放置 後、紫外線照射装置 (VILBER LOURMAT, France)のガラス面上に前記プレ ートを置き、紫外線 (254nm)を 1分間照射した。照射後、ゥエル内のシアル糖鎖含 有ポリマー溶液を、前記プレートを斜めにして捨てた。そして、前記プレートに 2%BS A (Sigma, Grade96%)を 100 /z l加え、室温で 1時間ブロッキング処理した。
[0174] その後、各ゥエルを 100 μ 1の PBSで 5回洗浄し、 3種類の不活性化したインフルェ ンザウィルス（トリ A型ウィルス： AZduckZHonk Kong/24/76 (H3N2) , 32Η AU (赤血球凝集価）；ヒト A型ウィルス： AZMemphisZlZ71 (H3N2) , 32HAU ；ヒト B型ウィルス： B/Lee/40)を含有する PBS液を 100 μ 1加え、 4°Cで 12時間ゆ つくり振盪しながら放置した。 PBSで 3回洗浄後、各ゥエルに 50 1の抗インフルェン ザウィルスゥサギ抗血清（1000倍希釈）を加え、 4°Cで 2時間、ゆっくり振盪した。各ゥ エルに 50 1の horseradish peroxidase—結合ブロアイン A (Organon Teknika N. V. Cappel Products, Turnout, Belgium, PBSで 1000倍希釈）をカロえ、 4°Cで 2時間ゆっくり振盪した。各ゥエルを PBSで 3回洗浄後、 50 1の基質試薬(0. 01%H2O2含有オルソフヱ-レンジァミン（Wako Pure Chemicals, Japan)溶液 )を加え、室温で 10分間放置し、次いで、 50 1の ^ HC1をカ卩えて反応を停止させ た。そして、各ゥエルの発色を 492nm (対照： 630nmを対照）で比色定量した。
[0175] その結果、トリ A型インフルエンザウイルス（AZduckZHong Kong/24/76) ( H3N2)については図 1のグラフに示し、ヒト A型インフルエンザウイルス（A/Memp his/1/71) (H3N2)については図 2のグラフに示し、ヒト B型インフルエンザウィル ス（BZLeeZ40))については、図 3のグラフに示す。図 1〜図 3において、グラフ縦 軸は、波長 492nmの吸光度（Absorbance at 492nm)を示し、グラフ横軸は、シ アル糖鎖含有ポリマー濃度 (mgZL)を示す。また、図 1〜図 3において、「SA a 2, 3 — glycopolymer」は、下記の 2— 3型のシァロ糖鎖含有ポリマーを示し、「SA a 2, 6 -glycopolymerjは、下記の 2— 6型のシァロ糖鎖含有ポリマーを示す。
[0176] シァロ糖鎖含有ポリマー
(2— 3型） Poly (Neu5 Ac a 2— 3Gal j8 1— 4GlcNAc β - pAP/ a - PGA) (2— 6型）
Poly (Neu5 Ac α 2— 6Gal j8 1— 4GlcNAc β - pAP/ a - PGA
[0177] 図 1のグラフに示すように、前記トリ A型インフルエンザウイルスは、 2— 3型のシァロ 糖鎖含有ポリマーを強く認識したが、 2— 6型のシァロ糖鎖含有ポリマーに対しての 認識性は低力つた。また、図 2のグラフに示すように、前記ヒト A型インフルエンザウイ ルスは、 2— 6型のシァロ糖鎖含有ポリマーを強く認識した力 2— 3型のシァロ糖鎖 含有ポリマーに対しての認識性は低力つた。そして、図 3グラフに示すように、前記ヒト B型インフルエンザウイルスは、 2— 6型のシァロ糖鎖含有ポリマーを強く認識したが 、 2— 3型のシァロ糖鎖含有ポリマーに対しての認識性は低力つた。
[0178] 実施例 5
各種シァロ糖鎖結合ポリグルタミン酸ポリマー（2 μ g/ml)を PBS液で倍々希釈後 、マイクロプレート（Corning— Costar ; Labcoat 2503, Cambrige, MA)の 各ゥエルに 100 /z lずつ加えた。つぎに、前記プレートを 4°Cに 2時間静置後、紫外線 照射装置のガラス面上に前記プレートを置き、紫外線 (254nm)を 10分間照射した。 照射後、ゥエル内のシァロ糖鎖含有ポリマー溶液を捨て、各ゥエルに 2%BSA (Alb umin bovine Fraction V, Sigma, St. Louis, MO)もしくは 0. 1 %ブロ ックエース（大日本製薬） 250 μ 1を加え、 4°Cにー晚ブロッキング処理した。その後、 各ゥエルを 250 μ 1の PBS液で 5回洗浄し、エーテル処理で不活性化したインフルェ ンザウィルス（トリ A型ウィルス： AZduckZHong Kong/313/4/78 (H5N3) ,
128HAU ;ヒト Α型ウィルス： AZMemphisZlZ71 (H3N2) , 128 HAU)の P BS懸濁液を 50 /z l各ゥエルに加え、 4°Cに 5時間放置した。各ゥエルを 0. 01 % Tw een20含有 PBS液 250 /z lで 5回洗浄後、 0. 1 %BSAもしくは 0. 01 %ブロックエー スで 1000倍に希釈した抗インフルエンザウイルスゥサギ抗血清を各ゥエルに 50 μ 1 ずつカロ免、 4。Cに 2時間静置した。各ウエノレを 0. 01 %Tween20含有 PBS液 250 1 で 5回洗浄後、 0. 1 %BSAもしくは 0. 01 %ブロックエースで 1000倍に希釈した HR P標識プロテイン Aを各ゥエルに 50 1ずつ加え、 4°Cに 2時間静置した。各ゥエルを 0. 01 %Tween20含有 PBS液 250 1で 5回洗浄後、 100 /z 1の基質溶液（O— phe nylenediamine 4mg, 0. 01%H2O2含有 lOOmMクェン酸リン酸緩衝液 pH5. 0 )を加え、室温で 15— 20分間放置後、 1N硫酸水溶液を各ゥエルに 50 1カ卩ぇ反応 を停止した。各ゥエルの発色を 492nm (対照波長 630nm)にて測定した。
[0179] その結果を、図 4〜図 11〖こ示すよう〖こ、トリインフルエンザウイルスは、 2— 3型のシ ァロ糖鎖含有ポリマーを強く認識した力 2— 6型のシァロ糖鎖含有ポリマーに対して の認識性は低かった。一方、ヒトインフルエンザウイルスは、 2— 6型のシァロ糖鎖含 有ポリマーを強く認識したが、 2— 3型のシァロ糖鎖含有ポリマーに対しての認識性 は低力つた。そして、それぞれのシァロ糖鎖含有ポリマーに対する結合曲線の傾きを 求めることで、ウィルスの変異による感染宿主の変化が起きて 、る力否かの判定をす ることがでさる。
[0180] 参考例
(1)パラー-トロフエ-ルトル N ァセチルー 13—ラタトサミニド [Gal jS 1— 4GlcNAc β ρΝΡ]の調製
2. 4gの乳糖および 2. 3gのパラー-トロフエ-ルトル N ァセチルダルコビラノシド (シグマ社）を、 20%ァセトニトリルを含む 20mMのリン酸ナトリウムバッファー（pH7. 0)に溶解し（12mL)、 20単位のバチルスサーキュランス由来 j8—ガラクトシダーゼ（ 大和化成社)を加え 40°Cで 6時間反応させる。その後、反応液を 95°C、 10分間加熱 して反応を停止させた後に遠心し、上清を回収する。上清液をトヨパール HW—40S カラム（商品名、 5 X 100cm,東ソ一社）に供し、溶出液を分画採取し（20mLZ本）、 その一部を 300nmの吸光度を測定してパラ—ニトロフエ-ル残基を定量し、さらにフ エノールー硫酸法による 485nmの吸光度を測定し、炭化水素を定量する。パラー二 トロフエ-ルトル N—ァセチルー 13—ラタトサミニド含む画分（120mL) めて採取 し、濃縮後、メタノールを徐々に添加する。析出した沈殿を濾取し、減圧乾燥して 29 2mgのパラー-トロフエ-ルトル N ァセチルー 13—ラタトサミ -ドの結晶を得る。
[0181] (2)パラ一ァミノフエ-ルトル N ァセチル一 13—ラタトサミニド [Gal j8 1— 4GlcNAc
β ρΑΡ]の調製
前記（1)で得られたパラー-トロフエ-ルトル Ν ァセチルー 13—ラタトサミニド 100 mgを 20mLのメタノールに溶解し、その溶液にギ酸アンモ-ゥム 300mgおよび 10% ノ《ラジウム Z活性炭末 20mgを加えて、 40°Cで反応を行う。その際、反応を高速液 体クロマトグラフィーで経時的に追跡する。 40分後に、パラー-トロフエ-ルトル N— ァセチルー β—ラタトサミニドのピークが消滅したことを確認後、反応液を室温に戻し て反応を停止する。反応液を順次、セライト、濾紙により濾過し、濾液は濃縮後、予め 12%メタノールで平衡化したクロマトレタス一 ODS DM1020Tカラムクロマトグラフ ィ一に供する。溶出液を分画採取し（30mLZ本）、 210nm、 300nmの両吸収の一 致したァミノ還元二糖誘導体と予想されるピーク画分を濃縮、凍結乾燥し、 70. 7mg のパラ一ァミノフエ-ルトル N ァセチル一 β—ラタトサミニドの結晶を得る。
[0182] (3)ポリ（パラ一ァミノフエ-ルトル Ν—ァセチル一 13—ラタトサミニド一 L グルタミン — co グルタミン酸） [Poly (Gal j8 1— 4GlcNAC j8— ρΑΡΖ α— PGA) ]の調製 a—ポリ— L グルタミン酸ナトリウム（シグマ社） 20mgを 0. 4mLのジメチルスルホ キシドに溶解し、予め 0. 2mLのジメチルスルホキシドに溶解したへキサフルォロリン 酸べンゾトリァゾール一 1—ィルォキシトリス（ジメチルァミノ）ホスホ-ゥム 160mgと 1 —ヒドロキシベンゾトリァゾールー水和物 18mgを添カ卩し、室温下 20分間攪拌する。 さらに前記（2)で得られたパラ一ァミノフエ-ル一 N ァセチル一 β—ラタトサミニド 6 Omgをジメチルスルホキシド 0. 4mLに溶解して添カロし、室温下 24時間攪拌する。そ の反応液をセフアデックス G— 25カラム（商品名、 2. 0 X 26cm、アマシャムフアルマ シァバイオテク社）に供し、 0. 1M塩ィ匕ナトリウムを含む 0. 02Mリン酸ナトリウムバッ ファー (pH7. 4)で溶出する（流速 1. OmLZ分)。溶出液を分画採取し (2. OmL/ 本）、その一部をフ ノール 硫酸法による 485nmの吸光度を測定し、炭化水素を 含む画分を集めて採取する（13mL)。その溶液を、 YM— 3メンブランを装着した限 外ろ過器 (アミコン社)で濃縮し（2kgZcm2)、さらに凍結乾燥し、 46mgの標品を得 る。
[0183] (4)ポリ [パラ一ァミノフエ-ル（N ァセチルノイラミニルー（2— 3)—N ァセチルー
β—ラタトサミ -ド） L グルタミン一 co グルタミン酸] [Poly (Neu5Ac a 2— 3Ga Ι β ΐ - 4GlcNAc β - pAP/ a - PGA) ]の調製
前記（3)で得られたポリ（パラ一ァミノフエ-ルトル一 N—ァセチル一 /3—ラタトサミ -ド— L グルタミン— co グルタミン酸） [Poly (Gal j8 1 ~4GlcNAc β -pAP/ a - PGA) ] 1 Omgとシチジン 5， -モノホスフォ N ァセチルノイラミン酸ナトリゥム 15 mg、さらに 250mM塩化マンガン 10 μ Lと 10%牛血清アルブミン 10 μ Lおよびアル カリホスファターゼ 2 Lを、 50mM力コジル酸バッファー（ρΗ6. 0) 950 に溶解し 、 30ミリ単位の a 2, 3 - (N)—シァリルトランスフェラーゼ（ラットリコンビナント、 Spod optera frugiperda由来、カルビオケム社）を添カ卩して 37°Cで 48時間反応を行なう 。この反応液をセフアデックス G— 25カラム（2. 0x26cm、アマシャムフアルマシアバ ィォテク社）に供し、 10. 9mgの最終生成物を得る。
[0184] (5)ポリ [パラ一ァミノフエ-ル（N ァセチルノイラミニル一（2— 6)— N ァセチル一 β—ラタトサミ -ド） L グルタミン一 co グルタミン酸] [Poly (Neu5Ac a 2— 6Ga 1 j8 1— 4GlcNAc β - pAP/ a - PGA) ]の調製
前記（3)で得られたポリ（パラ一ァミノフエ-ルトル一 N—ァセチル一 /3—ラタトサミ -ド— L グルタミン— co グルタミン酸） [Poly (Gal j8 1 ~4GlcNAc β -pAP/ a — PGA) ] 5mgとシチジン 5，一モノホスフォ一 N ァセチルノイラミン酸ナトリウム 7. 5 mg、さらに 250mM塩化マンガン 5 μ Lと 10%牛血清アルブミン 5 μ Lおよびアルカリ ホスファターゼ 1 Lを、 50mM力コジル酸バッファー（ρΗ6. 0) 474 Lに溶解し、 1 5ミリ単位の a 2, 6— (N)—シァリルトランスフェラーゼ（ラット肝由来、カルビオケム社 )を添加して 37°Cで 48時間反応を行なう。この反応液をセフアデックス G— 25カラム（ 商品名、 2. 0 X 26cm、アマシャムフアルマシアバイオテク社）に供し、 6. 3mgの最 終生成物を得る。
[0185] 以上のように、本発明によれば、簡単な装置若しくは器具で容易にウィルスのレセ プター糖鎖認識特異性を判別できる。したがって、本発明によれば、例えば、検査施 設ゃ病院等の臨床現場においても、的確にウィルスのレセプター糖鎖認識特異性を 判別でき、その用途は広い。

Claims

請求の範囲
[1] ウィルスのレセプター糖鎖認識特異性の判別方法であって、シァロ糖鎖含有ポリマ 一を表面に固定した担体に、前記ウィルスサンプルを接触させ、その結合度合いを 測定することにより前記ウィルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別する方法。
[2] ウィルス変異による感染宿主の変化を判別する方法であって、 2種類以上のシァロ糖 鎖含有ポリマーを 1つの担体の表面に固定した担体もしくは異なるシァロ糖鎖含有ポ リマーをそれぞれの担体の表面に固定した 2種類以上の担体を用い、前記 2種類以 上のシァロ糖鎖含有ポリマー毎に前記ウィルスサンプルを接触させ、それぞれの結 合度合いを測定し、それらの結果を比較してウィルス変異による感染宿主の変化を 判別することを特徴とする、ウィルス変異による感染宿主の変化を判別する方法。
[3] 前記シァロ糖鎖含有ポリマーにおける前記シァロ糖鎖力 シァリルラクト系 I型糖鎖（S A a 2— 6 (3) Gal j8 1— 3G1CNAC j8 1—）、シァリルラクト系 II型糖鎖（SA a 2— 6 (3 ) Gal j8 1— 4GlcNAC j8 1— )、シァリルガンダリオ系糖鎖（SA a 2— 6 (3) Gal j8 1— 3GalNAc β 1—)およびシァリルラタトース糖鎖（SA « 2-6 (3) Gall— 4Glc— )力 らなる群力 選択される少なくとも一つの糖鎖である請求項 1又は 2記載の判別方法
[4] 前記シァロ糖鎖含有ポリマーにおける前記ポリマー力 ポリグルタミン酸である請求 項 1又は 2記載の判別方法。
[5] 前記結合度合！ヽの測定が、前記ウィルスに対する抗ウィルス抗体を用いた免疫学的 測定法による測定である請求項 1又は 2記載の判別方法。
[6] 前記ウィルスサンプル力 インフルエンザウイルスのサンプルである請求項 1又は 2記 載の判別方法。
[7] 下記式 (I)で表され、 γ —ポリグルタミン酸にシァロ糖鎖を結合させたシァロ糖鎖含 有ポリマー。
[化 1] COOH
Figure imgf000063_0001
OH Η2
ΝΗ 一 CO-
CH
ΝΗ C
OCCHI Η Η
Figure imgf000063_0002
CHCIII
Figure imgf000063_0003
Figure imgf000063_0004
(式 (I)中、 Zは水酸基又は式 (Π)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以上 の整数を示す。式 (Π)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 Rは 炭化水素を示す。 )
下記式 (ΠΙ)で表され、 γ —ポリグルタミン酸にシァロ糖鎖を結合させたシァロ糖鎖含 有ポリマー。 2 COOH
N CI CH2
一
H
Figure imgf000064_0001
CO-Z
(III)
Figure imgf000064_0002
(IV)
(式 (m)中、 Zは水酸基又は式 (IV)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以 上の整数を示す。式 (IV)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 Rは炭化水素を示す。 )
下記式 (V)で表され、 a ポリグルタミン酸にシァロ糖鎖を結合させたシァロ糖鎖含 有ポリマー。
[化 3]
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000065_0002
(VI)
(式 (V)中、 Zは水酸基又は式 (VI)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 10以 上の整数を示す。式 (VI)中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチルァミノ基、 R'はフエ-レンを除く炭化水素を示す。 )
[10] 下記式 (VII)で表され、 α—ポリグルタミン酸にシァロ糖鎖を結合させたシァロ糖鎖 含有ポリマー。
[化 4]
Figure imgf000066_0001
(VII)
Figure imgf000066_0002
(VIII)
(式 (vn)中、 zは水酸基又は式 (vm)で表されるシァロ糖鎖結合部位であり、 nは 1
0以上の整数を示す。式 (VIII)中、中、 Acはァセチル基、 Xは水酸基又はァセチル アミノ基、 R'はフエ-レンを除く炭化水素を示す。 )
[11] 以下の工程からなる、シァロ糖鎖含有ポリマーの製造法。
(工程 1)
糖転移酵素を用いて目的とするシァロ糖鎖を合成する工程
(工程 2)
工程 1で合成したシァロ糖鎖とポリグルタミン酸とをィ匕学的に結合させる工程 (工程 3)
工程 2で合成したシァロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシァロ糖鎖含 有ポリマーを取得する工程
[12] シァロ糖鎖が、シァリルラクト系 I型糖鎖（SA a 2— 6 (3) Gal j8 l— 3GlcNAc j8 1—） 、シァリルラクト系 II型糖鎖（SA « 2-6 (3) Gal β 1— 4GlcNAc β ΐ—）、シァリルガ ングリオ系糖鎖（SA a 2— 6 (3) Gal j8 1— 3GalNAC j8 1— )およびシァリルラタトー ス糖鎖（SA α 2— 6 (3) Gall 4Glc )力 なる群力 選択される少なくとも一つの 糖鎖である請求項 11記載の製造法。
[13] 請求項 1記載又は 2記載の判別方法に用いる担体であって、シァロ糖鎖含有ポリマ 一を表面に固定した担体。
[14] シァリルラクト系 I型糖鎖（SA a 2— 6 (3) Gal j8 1— 3GlcNAC j8 1— )、シァリルラクト 系 II型糖鎖（SA 0: 2— 6 (3) Gal j8 l—4GlcNAc j8 1—）、シァリルガンダリオ系糖鎖 (SA α 2— 6 (3) Gal j8 1— 3GalNAc β 1—)およびシァリルラタトース糖鎖（SA a 2 - 6 (3) Gall— 4Glc)力もなる群力も選択される少なくとも一つのシァロ糖鎖をポリグ ルタミン酸に結合させたシァロ糖鎖含有ポリマーを紫外線照射することで表面に固定 した担体。
[15] 前記担体が複数のゥエルを有し、異なる種類のシァロ糖鎖含有ポリマーが複数固定 されている請求項 13又は 14記載の担体。
[16] 請求項 1又は 2記載のウィルスのレセプター糖鎖認識特異性又はその変異を判別す る方法に用いるキットであって、請求項 14記載の担体を含むキット。
[17] 担体が複数のゥエルを有し、 1つの担体に異なる種類のシァロ糖鎖含有ポリマーが 複数固定されたものである、請求項 16記載のキット。
[18] 2つ以上の担体を含有し、異なる種類のシァロ糖鎖含有ポリマーがそれぞれの担体 に固定されたものである、請求項 16記載のキット。
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