JP6718561B2

JP6718561B2 - 活性型ＧｃＭＡＦの製造方法

Info

Publication number: JP6718561B2
Application number: JP2019559230A
Authority: JP
Inventors: 陽一鍋島; 曜子鍋島; 千秋安部
Original assignee: Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Current assignee: Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-07-08
Anticipated expiration: 2038-12-14
Also published as: CN111527210A; JPWO2019117295A1; EP3725883A4; WO2019117295A1; US20210198307A1; EP3725883B1; EP3725883A1

Description

本発明は、活性型ＧｃＭＡＦの製造方法に関する。

ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ；ＶｉｔａｍｉｎＤＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ）は、肝臓で合成され血中に分泌される糖タンパク質の１つである。ＶＤＢＰは、ビタミンＤに結合し、血中の移送担体としての機能を担っている。また、破壊された細胞から漏れ出るＧ−アクチンに結合し、アクチン重合体が血管腔を狭めて塞ぐことを抑える機能を有することも知られている。上記ＶＤＢＰは、Ｇｃグロブリンともよばれ、一部のアミノ酸が異なり、糖鎖構造の異なる３種類のサブタイプ（ＶＤＢＰ１ｆ、ＶＤＢＰ１ｓ、ＶＤＢＰ２）が存在する。このうち、ＶＤＢＰ１ｆ（Ｇｃ１ｆ）は、４１８（４２０）番目のスレオニンに、ＧａｌＮＡｃにシアル酸とガラクトースが結合した３糖からなるＯ型糖鎖が結合している。この３糖からなるＯ型糖鎖が結合しているＶＤＢＰはマクロファージを活性化する機能はない不活性型であるが、Ｔ細胞及びＢ細胞それぞれの細胞表面に発現しているシアリダーゼ及びβガラクトシダーゼの作用によりシアル酸とガラクトースが取り除かれ、ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−Ｔ４１８（４２０）だけが残ると、活性型であるＧｃｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ＧｃＭＡＦ、以下、「活性型ＧｃＭＡＦ」とも表記することがある。）となり、マクロファージを活性化することができる（非特許文献１及び２参照）。この活性型であるＧｃＭＡＦは、マクロファージを活性化するだけでなく、血管新生阻害作用を介した抗腫瘍活性を示すことも知られている（特許文献１参照）。

一方、図１に模式的に示すように、不活性型のＶＤＢＰから活性型であるＧｃＭＡＦへの変換工程は複雑であり、その製造方法においては、血清や血漿から不活性型であるＶＤＢＰを精製し、シアリダーゼ、βガラクトシダーゼで処理してシアル酸とガラクトースを取り除き、ＧａｌＮＡｃだけが残った活性型であるＧｃＭＡＦとする方法が一般的である。しかし、このような従来の方法は、血清や血漿から不活性型のＶＤＢＰを精製する工程、得られたＶＤＢＰを酵素処理する工程等の複雑な複数の工程を必要とするため、より簡便で容易な製造方法が求められていた。

特表２００３−５３２６８２号公報

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 8539-8543 Anticancer Research, 2005. 25, 3689-3696

このような状況の中、本発明は、より簡便、かつ収率の高い活性型ＧｃＭＡＦの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、不活性型ＶＤＢＰの発現ベクターを導入した宿主細胞を、無血清培地中で培養することで、糖鎖切断のための酵素処理工程を経なくとも、４１８（４２０）番目のスレオニンにＧａｌＮＡｃのみが結合した活性型ＧｃＭＡＦを効率的に製造できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。

［１］ＶｉｔａｍｉｎＤＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ発現ベクターを導入した宿主細胞を、無血清培地中で培養する工程
を含む、活性型のＧｃｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ＧｃＭＡＦ）の製造方法。
［２］上記培養が、浮遊培養である、［１］に記載の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法。
［３］糖鎖切断のための酵素処理工程を含まない、［１］又は［２］に記載の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法。
［４］ビタミンＤアフィニティカラムによる精製工程を含む、［１］から［３］のいずれかに記載の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法。

本発明の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法によると、培養細胞にＶＤＢＰを発現させる方法を採用していることで、血清、血漿等を収集する必要がなく、大量製造も容易である。また血清、血漿等からＶＤＢＰを精製する工程も不要であり、さらに糖鎖切断のための酵素処理工程も不要であるため、少ないステップで効率よく簡便に活性型ＧｃＭＡＦを製造することができる。本発明により、これまで、大量生産が難しかった活性型ＧｃＭＡＦを容易に大量生産できるようになるため、活性型ＧｃＭＡＦを有効成分とする医薬品、健康食品等の分野において好適に用いられ得る。

図１は、不活性型のＶＤＢＰから活性型ＧｃＭＡＦへの変換工程を模式的に示す図である。図２は、本発明の方法（ＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システム）を用いて得られた活性型ＧｃＭＡＦのウェスタンブロットの結果を示す図である。図３は、本発明の方法（ＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システム）を用いて得られた活性型ＧｃＭＡＦ（ビタミンＤアフィニティカラム精製後）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）とウェスタンブロットの結果を示す図である。図４は、活性型ＧｃＭＡＦ合成におけるＧＡＬＡＮＴ３（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ３）発現の影響について検討した結果を示す図である。図５は、本発明の方法（ＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システム）を用いて得られた活性型ＧｃＭＡＦのマクロファージ活性化能を示す図である。図６は、本発明の方法（ＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システム）を用いて得られた活性型ＧｃＭＡＦのウェスタンブロットの結果を示す図である。図７は、本発明の方法（ＨＥＫ２９３細胞／無血清培地／浮遊系培養システム）を用いて得られた活性型ＧｃＭＡＦのウェスタンブロットの結果を示す図である。図８は、本発明の方法（ＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システム）を用いて得られた活性型ＧｃＭＡＦ（ビタミンＤアフィニティカラム精製後）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果を示す図である。

以下、本発明の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法について詳細に説明する。なお、本明細書において、ＤＮＡやベクターの調製等の分子生物学的手法は、特に明記しない限り、当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。

＜活性型ＧｃＭＡＦの製造方法＞
本発明の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法は、ＶＤＢＰ発現ベクターを導入した細胞を、無血清培地中で培養する工程を含み、不活性型ＶＤＢＰの糖鎖切断のための酵素処理工程を必要としないことを特徴とする。

本発明の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法は、血漿や血清からＧｃグロブリンを精製して活性型ＧｃＭＡＦを製造するのではなく、ＶＤＢＰ発現ベクターを導入した細胞を無血清培地中で培養することにより、複数の工程を要することなく簡便に活性型ＧｃＭＡＦを製造できるという方法である。

本発明においてＶＤＢＰは、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ；ＶｉｔａｍｉｎＤＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ）のことであり、Ｇｃグロブリン、Ｇｃタンパク質ともよばれ、糖鎖構造の異なる３種類のサブタイプ（１ｆ、１ｓ、２）を含む。ＶＤＢＰにおけるいずれのサブタイプにおいても、糖鎖の中心であるＮ−アセチルガラクトサミンにガラクトースがＯ−グリコシド結合している共通の構造を有する。１ｆ型サブタイプでは、ＧａｌＮＡｃにＧａｌａｃｔｏｓｅとＳｉａｌｉｃａｃｉｄが結合した３糖がＯ型ｌｉｎｋで結合しており（図１参照）、１ｓ型サブタイプでは、ＧａｌＮＡｃにＧａｌａｃｔｏｓｅとα−Ｍａｎｎｏｓｅが結合した３糖がＯ型ｌｉｎｋで結合しており、２型サブタイプでは、ＧａｌＮＡｃにＧａｌａｃｔｏｓｅが結合した２糖がＯ型ｌｉｎｋで結合しているＶＤＢＰが本発明に含まれる。また、本発明におけるＶＤＢＰは、動物由来であり、好ましくは哺乳類由来であり、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラット等由来のものが挙げられ、中でもヒト由来のものがより好ましい。

本発明におけるＶＤＢＰ発現ベクターは、遺伝子組換え技術を用いて人工的にＶＤＢＰをコードする核酸を、適切な発現ベクターに組込んだものである。本発明の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法によると、上記発現ベクターを、適切な宿主細胞に発現させ、適切な培養条件で培養することにより、不活性型であるＶＤＢＰの糖鎖切断のための酵素処理をすることなく、活性型ＧｃＭＡＦを効率よく製造することができる。なお、ＶＤＢＰのアミノ酸配列、核酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている配列情報を利用することができる。

本発明におけるＶＤＢＰ発現ベクターとしては、ＶＤＢＰ１ｆ、ＶＤＢＰ１ｓ、ＶＤＢＰ２のいずれのサブタイプをコードする核酸を組み込んだ発現ベクターであってもよいが、中でもＶＤＢＰ１ｆをコードする核酸を組み込んだＶＤＢＰ１ｆ発現ベクター及びＶＤＢＰ１ｓをコードする核酸を組み込んだＶＤＢＰ１ｓ発現ベクターが好ましく、ＶＤＢＰ１ｆ発現ベクターがより好ましい。ＶＤＢＰ１ｆ、ＶＤＢＰ１ｓ、ＶＤＢＰ２をコードする核酸の配列を、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３として配列表に記載した。また、ＶＤＢＰ１ｆ、ＶＤＢＰ１ｓ、ＶＤＢＰ２のそれぞれのアミノ酸配列を、配列番号４、配列番号５、配列番号６として記載した。さらに、ＶＤＢＰ発現ベクターに組込む核酸配列としては、翻訳活性を最適化した配列が好ましく、ＶＤＢＰ１ｆの最適化核酸配列を配列番号７、この配列に対応するアミノ酸配列を配列番号８として記載した。ＶＤＢＰ１ｓの最適化核酸配列を配列番号１０、この配列に対応するアミノ酸配列を配列番号１１として記載した。ＶＤＢＰ２の最適化核酸配列を配列番号１２、この配列に対応するアミノ酸配列を配列番号１３として記載した。また、Ｈｉｓタグを付与したＶＤＢＰ１ｆの最適化核酸配列を配列番号９、Ｈｉｓタグを付与したＶＤＢＰ１ｓの最適化核酸配列を配列番号１４、Ｈｉｓタグを付与したＶＤＢＰ２の最適化核酸配列を配列番号１５として記載した。として記載した。

本発明におけるＶＤＢＰ発現ベクターは、発現させた細胞の培養液からのＶＤＢＰの回収を容易にするため、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＦタグ等のタグ配列をさらに含んでいてもよい。例えば、ヒトＧｃＭＡＦのサブタイプＧｃ１ｆ又はＧｃ１ｓの配列にＨｉｓ−Ｔａｇを連結した、ＨｓＧｃＭＡＦ−Ｇｃ１ｆ−Ｈｉｓｔａｇの配列（配列番号９）又はＨｓＧｃＭＡＦ−Ｇｃ１ｓ−Ｈｉｓｔａｇの配列（配列番号１４）等が好ましいものとして挙げられる。

ＶＤＢＰ発現ベクターは、当業者に従来公知の方法により構築し、適切な宿主細胞に発現させることができ、具体的な方法は特に限定されない。また、ＶＤＢＰ発現ベクターを組込む宿主細胞は、ＶＤＢＰを効率よく発現できる細胞であれば、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられ、中でもＣＨＯ細胞が好ましい。特に、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））細胞が好ましい。

本発明においては、ＶＤＢＰ発現ベクターを導入した細胞を、無血清培地中で培養する。上記無血清培地としては、血清を含んでいない培地であれば特に限定されないが、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ２０１培地、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ（商標））及びこれらの混合培地等が挙げられる。中でも、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ（商標））が好ましい。

上記無血清培地には、必要に応じて、血清代替物として、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を添加してもよい。これらの培地には、また必要に応じて、さらに脂質、アミノ酸、タンパク質、多糖、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の物質を添加してもよい。

本発明において、ＶＤＢＰ発現ベクターを導入した細胞を培養する方法としては、ＶＤＢＰ発現ベクターを導入した細胞を、上記無血清培地中で、３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍ条件下で浮遊培養することが好ましい。その際の細胞濃度は、１×１０^３細胞／ｍＬ〜１×１０^７細胞／ｍＬであり、１×１０^４細胞／ｍＬ〜１×１０^６細胞／ｍＬが好ましく、１×１０^５細胞／ｍＬ〜１×１０^６細胞／ｍＬがより好ましい。培養日数は、２日間〜１４日間であり、３日間〜１０日間であることが好ましく、５日間〜８日間であることがより好ましい。この培養日数は、細胞の生存率を見ながら適宜調節することができる。このような条件でＶＤＢＰ発現ベクターを導入した細胞を培養することで、培養液中には、酵素処理をしていないにも関わらず、脱糖が必要な糖鎖が切断された活性型ＧｃＭＡＦが得られる。本発明の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法は、糖鎖切断のための酵素処理工程を必要としないことが大きな特徴のひとつである。

上記で得られた培養液から、活性型ＧｃＭＡＦを回収する方法としては、上記Ｈｉｓタグ等のタグを有するタンパク質を特異的に回収可能な樹脂を利用したアフィニティカラムによる方法を採用できる。例えばＨｉｓタグタンパク質を回収する場合には、ニッケルイオンを配位結合した金属キレートアフィニティカラムを利用して高純度に精製することができる。カラムに結合させた後、イミダゾール等を添加することで、Ｈｉｓタグがニッケルカラムから解離し、Ｈｉｓタグを有する活性型ＧｃＭＡＦを溶出することができる。

上記で得られた培養液から、活性型ＧｃＭＡＦを回収する別の方法としては、ビタミンＤアフィニティカラム（「Ｖｉｔ．Ｄアフィ二ティーカラム」とも称する。）、例えば、２５（ＯＨ）Ｄ３ｓｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラムを使用する方法が挙げられる。すなわち、上記で得られた培養液を、ＨｉＰｒｅｐＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ｃｏｌｕｍｎにかけ、得られたサンプルをＶｉｔ．Ｄアフィ二ティーカラム（２５（ＯＨ）Ｄ３ｓｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ）にかけてＶＤＢＰを精製する。結合バッファーとして５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（ｐＨ７．４）、溶出バッファーとして、６ＭＧｕａｎｉｄｉｎｅＨＣｌを用いることができる。得られたサンプルを１０ｍＭＳｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅで透析後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色を行うと、ＶＤＢＰが単一バンドとして精製されることが確認できる。この方法によると、６０ｋＤａ付近の夾雑タンパクとも分離可能である。

本発明の方法によって得られた活性型ＧｃＭＡＦは、マクロファージを活性化する機能を有する。ここで、マクロファージを活性化する機能とは、マクロファージの貪食能、特にＦｃレセプターを介する貪食能や、活性酸素産生能、抗原提示能等を促進させる機能をいう。本発明の方法によって得られた活性型ＧｃＭＡＦを評価するためには、例えば、マウス等のマクロファージを活性型ＧｃＭＡＦで処理することで、Ｆｃレセプターを介したＳＲＢＣ（羊赤血球）を貪食する能力がどの程度向上するかを確認することにより行うことができる。具体的には、実施例の項目４に詳細に説明されている実験方法を使用することができる。

以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

１．ＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システムを用いた活性型ＧｃＭＡＦのＯｎｅ−ｓｔｅｐ合成方法
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））細胞にＨｕｍａｎＶＤＢＰ１ｆ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４−ＴＯＰＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＣＭＶプロモーターの下流にＨｓＧｃＭＡＦ−Ｇｃ１ｆ−Ｈｉｓｔａｇを結合させたもの；以下、ＨｓＧｃＭＡＦ−Ｇｃ１ｆ−Ｈｉｓｔａｇベクターともいう）とＧＡＬＡＮＴ３遺伝子発現ベクター（１６ＡＣＪＯＭＰ＿ＧＡＬＮＴ３＿ｐｃＤＮＡ３．４−ＴＯＰＯ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を導入し、無血清培地（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ（商標））を用いて浮遊系で培養した。培養方法はＧｉｂｃｏ（商標）ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍのＰｒｏｃｏｔｏｌに従い、ＨｓＧｃＭＡＦ−Ｇｃ１ｆ−Ｈｉｓｔａｇベクター量（μｇ）、ＧＡＬＡＮＴ３遺伝子発現ベクター量（μｇ）、Ｃｕｌｔｕｒｅｖｏｌｕｍｅ（ｍＬ）は下記表１の通りとした。

８日間の培養後、細胞上清をＨｉｓ−Ｔｒａｐｃｏｌｕｍｎ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にかけ、トラップされたタンパク質を分離し、５０ｍＭＳｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて透析した。透析後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質をメンブレンにトランスファーし、抗Ｈｉｓ抗体又は抗ＤＶＢＰ抗体を用いてウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）を行った（図２Ａ）。さらに、条件１、条件２から得られた５μｇのＶＤＢＰに、１ｍＵシアリダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）及び１ｍＵガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）処理（３７℃，３ｈ）を行った。上記酵素処理サンプルと酵素未処理サンプルに分け、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＧａｌＮＡｃに反応するレクチンブロット（ビオチン標識ＨＰＡレクチン；ＢｉｏｔｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＨＰＡｌｅｃｔｉｎ）で糖鎖構造を解析した。その結果、上記酵素処理していないサンプルもＨＰＡレクチンに反応することから、本発明の無血清培地／浮遊系培養システムを用いると、上記酵素処理をしなくても、活性型ＧｃＭＡＦが得られることが示された。さらに、酵素処理してもＨＰＡレクチンに反応するＶＤＢＰ量が増加しないことから、本発明の無血清培地／浮遊系培養システムを用いると、ほぼ全てのＶＤＢＰが活性型ＧｃＭＡＦとして得られることが示された（図２Ｂ）。

上記のＶＤＢＰサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離、ＣＢＢで染色すると、５３ｋＤａ付近の明瞭なＶＤＢＰバンドと６０ｋＤａ付近にバンドを認めた。そこで、５３ｋＤａ付近のＶＤＢＰと６０ｋＤａ付近のバンドを分離するために、ＨｉＰｒｅｐＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ｃｏｌｕｍｎにかけ、得られたサンプルをＶｉｔ．Ｄアフィ二ティーカラム（２５（ＯＨ）Ｄ３ｓｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ）にかけてＶＤＢＰを精製した。結合バッファーとして５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ｐＨ７．４）、溶出バッファーとして、６ＭＧｕａｎｉｄｉｎｅＨＣｌを用いた。得られたサンプルを１０ｍＭＳｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅで透析後にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いＣＢＢ染色した。Ｖｉｔ．Ｄアフィ二ティーカラム精製により、ＶＤＢＰが単一バンドとして精製されること、すなわち、６０ｋＤａ付近のバンドと分離できることが示された（図３Ａ）。また、ウエスタンブロッティングにより、抗ＶＤＢＰ抗体によって認識された（図３Ｂ）。

以上のとおり、ＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システムを用いてＶＤＢＰを合成すると活性型ＧｃＭＡＦがＯｎｅ−ｓｔｅｐで合成されるが、同時に６０ｋＤａ程度の夾雑タンパクが存在することが明らかになった。そしてＧｃＭＡＦと６０ｋＤａの夾雑タンパクはＶｉｔ．Ｄアフィ二ティーカラムにより分離精製できることが確認された。

この結果は、本発明のＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システムを用いてＶＤＢＰを合成するとＧａｌＮＡｃのみが結合した活性型ＧｃＭＡＦを、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐで合成できることを示している。また、Ｖｉｔ．Ｄアフィ二ティーカラムにより６０ｋＤａ程度の夾雑タンパクと効率的に分離することができる。さらに本発明の方法によると、ＧｃＭＡＦの発現レベルも高く（３−５ｍｇ／２０ｍＬｃｕｌｔｕｒｅ）、本発明の方法は現在知られている限り最適な活性型ＧｃＭＡＦのｏｎｅ−ｓｔｅｐ合成法であると言える。

２．ＧｃＭＡＦ合成に与えるＧＡＬＡＮＴ３発現誘導の検討
ＶＤＢＰの４１８／４２０番目のスレオニンにＧａｌＮＡｃが結合する効率がＧＡＬＡＮＴ３などの糖鎖付加酵素の共発現により影響されるか否かを解析した。

ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））細胞にＨｕｍａｎＶＤＢＰ１ｆ発現ベクターとＧＡＬＡＮＴ３遺伝子発現ベクターを導入し、無血清培地（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ（商標））を用いて浮遊系で培養した。培養方法はＧｉｂｃｏ（商標）ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍのＰｒｏｃｏｔｏｌに従い、ＨｓＧｃＭＡＦ−Ｇｃ１ｆ−Ｈｉｓｔａｇベクター（μｇ）量、ＧＡＬＡＮＴ３遺伝子発現ベクター量（μｇ）、Ｃｕｌｔｕｒｅｖｏｌｕｍｅ（ｍＬ）は下記表２の通りとした。

７日間の培養後（３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍ）、細胞上清をＨｉｓ−Ｔｒａｐｃｏｌｕｍｎ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にかけ、トラップされたタンパク質を分離し、５０ｍＭＳｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて透析した。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質をメンブレンにトランスファーし、抗ＶＤＢＰ抗体を用いてウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）を行った（図４Ａ）。さらに、ＧａｌＮＡｃに反応するビオチン標識ＨＰＡレクチン（ＢｉｏｔｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＨＰＡｌｅｃｔｉｎ）で糖鎖構造を解析した（図４Ｂ）。ＧＡＬＡＮＴ３が無しの条件（条件３）においても、ＨＰＡレクチンに反応することから、ＧＡＬＡＮＴ３の共発現はＶＤＢＰの発現量、ＧａｌＮＡｃ付加効率に影響しないことが示された。

この結果は、糖鎖付加酵素ＧＡＬＡＮＴ３の共発現はＶＤＢＰの発現量、ＧａｌＮＡｃ付加効率に影響しないことを示している。ＣＨＯ細胞では糖鎖付加酵素が元々十分量発現している可能性が考えられた。すなわち、本発明のＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システムを用いた活性型ＧｃＭＡＦのｏｎｅ−ｓｔｅｐ合成法においても、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））細胞におけるＧＡＬＡＮＴ３の共発現は必須ではないといえる。

３．本発明の活性型ＧｃＭＡＦのｏｎｅ−ｓｔｅｐ合成法により得られた活性型ＧｃＭＡＦのマクロファージ貪食能活性の測定
７週齢のＩＣＲマウス（雌）は日本ＳＬＣから購入した。頸椎脱臼後に外皮を剥ぎ、ＩＣＲマウスの腹腔に冷ＤＰＢＳ５ｍｌを注入し、腹部を揉み、腹腔細胞を含む腹腔液を取り出した。腹腔液を４℃、１，０００ｒｐｍで１５分間遠心後に、上清を除去し適当量のＲＰＭＩ１６４０培地（ＴＨＥＲＭＯＦＩＣＨＥＲＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を加え、トリパンブルー染色し、細胞数をカウントした。ＲＰＭＩ１６４０培地で１．０×１０^６細胞／ｍＬに調整し、あらかじめカバーグラスを沈めたプレートに５．０×１０^５細胞／ｗｅｌｌになるように５００μＬずつ播種した。さらにＲＰＭＩ１６４０培地を５００μＬ加えて、３７．５℃で１時間予備培養し、マクロファージをカバーグラスに定着させた。上清を除き、付着したマクロファージ層を洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて３７℃で一晩培養した。上清を除き、９９０μＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加え、上記精製して得られた活性型ＧｃＭＡＦ１ｎｇ（１０μＬ、終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を添加、ポジティブコントロールとして１μｇのリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社）（１０μＬ、終濃度１μｇ／ｍＬ）を加え、３７℃、５％ＣＯ_２条件下、３時間培養した。上清を除き、Ａｎｔｉ−ＳｈｅｅｐＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌＳｔｒｏｍａ抗体（Ａｂｃａｍ社、ａｂ５０６７４）を反応させ、ＩｇＧでオプソニン化した０．５％ＳＲＢＣ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社、ＣＬＤ６８）を加えて、マクロファージに９０分間貪食させた。カバーグラスをｗｅｌｌから取り出し、室温で乾燥させ、メタノールでマクロファージを固定させた。乾燥機で乾燥後、ＤＰＢＳで２０倍希釈したギムザ染色液で１時間染色した。カバーグラスを水道水で洗浄後、一晩室温で乾燥させた。カバーグラスをスライドガラスに貼り付け、顕鏡（４００倍）した。貪食されたＳＲＢＣをカウントし、下記式にて貪食指数（ｉｎｇｅｓｔｉｏｎｉｎｄｅｘ）を算出してマクロファージの貪食活性を評価した。結果を図５に示す。

図５に示すとおり、本発明のＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システムで得られたＧｃＭＡＦはマクロファージの貪食能を促進する効果（マクロファージ活性化効果）を有していることがわかった。また、本発明のＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システムで得られたＧｃＭＡＦは、１ｎｇ／ｍＬという低用量で、ポジティブコントロールとして使用したＬＰＳの１μｇ／ｍＬに相当するマクロファージ活性化効果を奏した。したがって、本発明の方法によると比活性が高い活性型ＧｃＭＡＦを効率的に取得することができるといえる。

４．ＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システムを用いた活性型ＧｃＭＡＦサブタイプ（１ｆ、１ｓ、２型）のＯｎｅ−ｓｔｅｐ合成方法
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））細胞にＨｕｍａｎＶＤＢＰ１ｆ、ＶＤＢＰ１ｓまたはＶＤＢＰ２発現ベクターを導入し、無血清培地（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ（商標））を用いて浮遊系で培養した。培養方法はＧｉｂｃｏ（商標）ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍのＰｒｏｃｏｔｏｌに従い、ＨｓＧｃＭＡＦ−Ｇｃ１ｓまたはＨｓＧｃＭＡＦ−Ｇｃ２−Ｈｉｓｔａｇは１５μｇ用いた。

８日間の培養後、細胞上清をＨｉｓ−Ｔｒａｐｃｏｌｕｍｎ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にかけ、トラップされたタンパク質を分離し、５０ｍＭＳｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて透析した。透析後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。５μｇのＶＤＢＰに、１ｍＵシアリダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）及び１ｍＵガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）処理（３７℃，３ｈ）を行った。上記酵素処理サンプルと酵素未処理サンプルに分け、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＶＤＢＰ抗体、ＧａｌＮＡｃに反応するレクチンブロット（ビオチン標識ＨＰＡレクチン；ＢｉｏｔｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＨＰＡｌｅｃｔｉｎ）で糖鎖構造を解析した。なお、１ｆ型は「２．ＣＨＯ細胞／無血清培地／浮遊系培養システムを用いた活性型ＧｃＭＡＦのＯｎｅ−ｓｔｅｐ合成方法」に記載の方法で合成し、Ｖｉｔ．Ｄアフィ二ティーカラム（２５（ＯＨ）Ｄ３ｓｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ）処理したサンプルを用いた。その結果、１ｓ型、１ｆ型では酵素処理していないサンプルもＨＰＡレクチンに反応することから、本発明の無血清培地／浮遊系培養システムを用いると、上記酵素処理をしなくても、活性型ＧｃＭＡＦが得られることが示された。さらに、酵素処理してもＨＰＡレクチンに反応するＶＤＢＰ量が増加しないことから、本発明の無血清培地／浮遊系培養システムを用いると、ほぼ全てのＶＤＢＰが活性型ＧｃＭＡＦとして得られることが示された（図６）。

また、上記透析後のＶＤＢＰサンプルをＨｉＰｒｅｐＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ｃｏｌｕｍｎにかけ、得られたサンプルをＶｉｔ．Ｄアフィ二ティーカラム（２５（ＯＨ）Ｄ３ｓｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ）にかけてＶＤＢＰを精製した。結合バッファーとして５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ｐＨ７．４）、溶出バッファーとして、６ＭＧｕａｎｉｄｉｎｅＨＣｌを用いた。得られたサンプルを１０ｍＭＳｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅで透析後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色を行った。Ｖｉｔ．Ｄアフィ二ティーカラム精製により、ＶＤＢＰが単一バンドとして精製されること、すなわち、６０ｋＤａ付近のバンドと分離できることが示された（図８）。

５．ＨＥＫ２９３／無血清培地／浮遊系培養システムを用いた活性型ＧｃＭＡＦのＯｎｅ−ｓｔｅｐ合成方法
Ｅｘｐｉ２９３（Ｇｉｂｃｏ（商標））細胞にＨｕｍａｎＶＤＢＰ１ｆ発現ベクターを導入し、無血清培地（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ（商標））を用いて浮遊系で培養した。培養方法はＧｉｂｃｏ（商標）Ｅｘｐｉ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍのＰｒｏｃｏｔｏｌに従い、ＶＤＢＰ１ｆ発現ベクター（ＨｓＧｃＭＡＦ−Ｇｃ１ｆ−Ｈｉｓｔａｇベクター）は２０μｇ用いた。

８日間の培養後、細胞上清をＨｉｓ−Ｔｒａｐｃｏｌｕｍｎ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にかけ、トラップされたタンパク質を分離し、５０ｍＭＳｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて透析した。５μｇのＶＤＢＰに、１ｍＵシアリダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）及び１ｍＵガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）処理（３７℃，３ｈ）を行った。上記酵素処理サンプルと酵素未処理サンプルに分け、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＧａｌＮＡｃに反応するレクチンブロット（ビオチン標識ＨＰＡレクチン；ＢｉｏｔｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＨＰＡｌｅｃｔｉｎ）で糖鎖構造を解析した。その結果、酵素処理していないサンプルもＨＰＡレクチンに反応することから、ＨＥＫ２９３細胞を宿主細胞とした場合もＣＨＯ細胞の場合と同様に、上記酵素処理をしなくても、活性型ＧｃＭＡＦが得られることが示された（図７）。

以上のとおり、本発明の宿主細胞／無血清培地／浮遊系培養システムを用いた活性型ＧｃＭＡＦの製造方法によると、糖鎖切断のための酵素処理工程を要することなくＯｎｅ−ｓｔｅｐで活性型ＧｃＭＡＦを効率よく合成できることが明らかとなった。

本発明の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法によると、培養細胞にＶＤＢＰを発現させる方法を採用していることで、血清、血漿等を収集する必要がなく、大量製造も容易である。また血清、血漿等からＶＤＢＰを精製する工程も不要であり、さらに糖鎖切断のための酵素処理工程も不要であるため、少ないステップで効率よく簡便に活性型ＧｃＭＡＦを製造することができる。本発明により、これまで、大量生産が難しかった活性型ＧｃＭＡＦを容易に大量生産できるようになるため、活性型ＧｃＭＡＦを有効成分とする医薬品、健康食品等に好適に用いられ得る。

Claims

ＶｉｔａｍｉｎＤＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞を、無血清培地中で浮遊培養する工程
を含む、活性型のＧｃｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ＧｃＭＡＦ）の製造方法。
糖鎖切断のための酵素処理工程を含まない、請求項１に記載の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法。
ビタミンＤアフィニティカラムによる精製工程を含む、請求項１又は２に記載の活性型ＧｃＭＡＦの製造方法。