JP6888207B2 - 糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法 - Google Patents
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Description
このような背景から、糖蛋白質の大量調製が求められるようになり、遺伝子工学的な方法により作製した細胞を培養する方法での調製が行われるようになった。しかし、このような手法で得られた糖蛋白質のN−結合型糖鎖は、一定した構造のものではなく、数種から数十種類以上の糖鎖が結合した糖蛋白質であり、均一の構造を有していない混合物である場合がほとんどであることから、近年、糖鎖部分を複合型糖鎖等に変換させることが課題の一つとなっている。
抗体は、高い結合活性、高い結合特異性及び血中での安定性から、ヒトの各種疾患に対する診断や予防のみならず、治療にも用いられてきた。特に、細胞工学技術の進歩により、抗体は培養細胞によって大量に調製が可能となり、抗体医薬品の主成分として用いられるようになった。
抗体医薬品に用いられる免疫グロブリン(IgG)の中でもIgG1は、高い抗体依存性細胞傷害性活性(以下、ADCC活性と称する)や補体依存性細胞傷害性活性(以下、CDC活性と称する)などのエフェクター機能を有していることが知られている。近年、治療用として用いられているリツキサンやハーセプチンなどの抗体は、このような活性による抗腫瘍効果を主要な効能とするものである。
しかし、上記の培養細胞等で得られるIgGは、フコースが付加されたものがほとんどであり、かつ非常に多種のN−結合型糖鎖を有する混合物である。
これに対し、フコースを欠いた構造のN−結合型糖鎖を有するIgG1に関しては、フコースをN−結合型糖鎖に付加させる酵素(フコシル転移酵素)を欠損させたチャイニーズハムスター由来の培養細胞によって生産できることが示されている(例えば特開2008−530243号公報参照)。
糖蛋白質の糖鎖を酵素によって変換する方法としては、糖質加水分解酵素(エンド−β−Nアセチルグルコサミニダーゼ、以下「エンド酵素」という)の糖鎖転移活性を利用する方法が古くから知られている(例えば特開平7−59587号公報参照)。エンド酵素の存在下、糖鎖供与体となる複合型のN−結合型糖鎖と、糖鎖受容体となる、Nアセチルグルコサミンのみをアスパラギン残基に有する糖蛋白質と、を反応させて、複合型糖鎖を有する糖ペプチドや糖蛋白質を得ることができる。
さらに、複合型糖鎖のIgGへの導入に関しては、Nアセチルグルコサミンをアスパラギン残基に有するIgG1ポリペプチド(以下、GlcNAc−IgG1という)に、化学合成した複合型糖鎖のオキサゾリン誘導体を糖供与体とし、上記とは別のエンド酵素の変異体の作用によって、複合型糖鎖を高い含有率で有するIgG1の調製方法が報告されている(例えば国際公開第2013120066号参照)。
このように、エンドM変異体による複合型糖蛋白質の容易な製造方法が望まれていた。
<1> 配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基がグルタミン、又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、あるいは配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼであって、かつ配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基以外の1個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び又は置換により、前記アミノ酸配列に対して80%以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼの存在下、下記一般式(1)で表される糖鎖供与体と、糖鎖受容体と、を反応させることにより糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する方法である。
本開示においてY1に結合するGlcNAcは、GlcNAcの1位の還元末端の炭素に結合する水素原子以外の置換基の原子を含まない。
<2> 前記糖鎖受容体が下記一般式(2)で表される<1>に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
(一般式(2)中、R2は一価の置換基を表す。GlcNAcはN−アセチルグルコサミニル基を表す。)
<3> 前記糖鎖受容体が、定常領域にN−アセチルグルコサミニル基が結合したIgGポリペプチドである<1>又は<2>に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
<4> 前記一般式(1)中、X1、X2、X3、X4、X5およびX6の少なくとも1つは糖質由来の基であり、前記糖質由来の基は、オリゴ糖残基と、アジド基、アルキニル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基及びイソシアネート基から選ばれるいずれか一つの基とが、リンカーを介して結合した構造を有する基である<1>〜<3>のいずれか1つに記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
<5> 前記一般式(1)中、Z1、X3、X4、X5およびX6が水素原子であり、X1がα1−6でManに結合したManにβ1−2でGlcNAcAが結合している糖質由来の基であり、X2がα1−3でManに結合したManにβ1−2でGlcNAcAが結合している糖質由来の基である<1>〜<4>のいずれか1つに記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
<6> 前記反応を、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率(糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数)5以上で行うことで免疫グロブリンGを製造する<1>〜<4>のいずれか1つに記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
<7> 前記モル比率は1〜4である<6>に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法である。
数値範囲を表す「〜」はその上限及び下限の数値を含む範囲を表す。更に、本明細書中において、糖鎖供与体、糖鎖受容体、IgG、変異型酵素等の各成分の量は、特に断らない限り、反応する溶液中に存在する複数の物質の合計量を意味する。
またアミノ酸残基は、3文字表記及び1文字表記のどちらかで表記される。
本開示においてY1に結合するGlcNAcは、GlcNAcの1位の還元末端の炭素に結合する水素原子以外の置換基の原子を含まない。
「糖鎖転移収量」とは、特に断らない限り、反応後に生ずる複合型糖鎖が転移された糖蛋白質の量をいい、「糖鎖転移収率」とは、糖鎖転移した生成物のモル数の、反応に用いた糖鎖受容体のモル数に対する割合を示す。
「定常領域」とは、IgGが有する重鎖のC末端領域を意味し、Fc領域と称することもある。本開示におけるFc領域は、天然の配列を有するFc領域であってもよいし、変異されたFc領域であってもよい。Fc領域とFc領域でない領域との境界は変化する場合もあるが、ヒトIgGにおいては226番目のシステイン(C226)又は230番目のプロリン(P230)の位置からC末端までの領域と定義される。
「グリコシド結合」とは、糖鎖中の糖もしくは単糖の1位の水酸基と他の糖の水酸基が脱水縮合することで、互いが酸素原子を介して結合する結合をいい、例えばα1−6グリコシド結合とは、糖の1位と他の糖の6位がα型で結合したグリコシド結合であることをいう。なお、糖の1位の水酸基はα型とβ型が存在する。
また、糖鎖を説明する表現として、単糖が3つ結合した糖鎖は3糖、5つ結合した場合は5糖、のように称することもある。
複数の単糖がグリコシド結合したもの、すなわち糖残基がグリコシド結合で連結したものをオリゴ糖残基と称することがある。また、「オリゴ糖残基」には、単糖が糖残基を形成するもの、例えば、GlcNAcβ1−2−、のような糖残基も含むことを意味する。
「コア糖鎖」とは、N−結合型糖鎖の中で、下記C−1で表される糖鎖部分をいい、「トリマンノシル」とは、コア糖鎖の中の3つのマンノース部分をいう。また、C−1の破線部分に示すように、トリマンノシル部位のうち、非還元末端側のα1−6で結合するManをMan2、非還元末端側のα1−3結合するManをMan3及び還元末端側のManをMan1と称する。
「1ユニット」とは、複合型のN−結合型糖鎖であるシアログライコペプチド(以下、SGPと称する)の非還元末端側の糖鎖部分を、パラニトロフェニルGlcNAc(GlcNAcβ1−O−pNP)に対し1分間で1μモル転移させる量である。
本開示で用いられるエンドM変異体は、加水分解活性が著しく低い一方、糖鎖転移活性は維持された変異体である。エンドM変異体はエンドMの反応過程を考慮して作製された変異体である。
特に、GlcNAc−IgGのような、GlcNAcがFc領域の内部に位置し、外部からエンド酵素が近づきにくいと考えられる糖鎖受容体に対しては、十分な糖鎖転移収量を得るために長時間の反応が必要になると考えられるので、この場合に、天然型基質のような、反応溶液中でも安定な糖鎖供与体の存在が有効であるものと考えられる。
本開示における糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する製造方法は、配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、あるいは配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基以外の1個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して80%以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼの存在下、一般式(1)で表される糖鎖供与体と、糖鎖受容体と、を反応させることにより糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する工程を含む。
以下に、詳細について説明する。
本開示において製造される糖ペプチド又は糖蛋白質としては、天然に見いだされているものも、合成によるものも含む。また、天然に存在する糖蛋白質におけるN−結合型糖鎖が結合するアスパラギンのC末端側には、該アスパラギンから2つ目のアミノ酸残基が必ずスレオニン残基かセリン残基であることが知られているが、本開示においても同様である。
この中でも、糖転移収率の観点から、抗菌性又は抗ウィルス性ペプチド及び生理活性ペプチド、ホルモン、サイトカイン又は抗体が好ましい。
本開示における免疫グロブリンG(IgG)は、少なくとも定常領域(以下Fc領域と称する)と可変領域(以下Fab領域と称する)を含む分子を意味する。IgGだけではなく、IgGの変異体、これらを含む融合蛋白質も含まれる。具体的には、例えばヒトIgG、マウスIgG等の非ヒトIgGなどの天然型IgG及びこれらの誘導体を含み、誘導体としてはキメラIgG、ヒト化IgGの抗原抗体反応を誘導可能な組換えIgG等が含まれる。これらは、モノクローナルIgG、ポリクローナルIgGのいずれであってもよく、単独又は2種以上の組合わせも含む。前記天然型IgGの誘導体は、天然型IgGのアミノ酸配列の一部に、欠失、付加、置換等の変異が導入されたIgGを含むことを意味しており、これらの変異は自然に生じたものだけでなく、人為的なものも含まれる。
CEによる測定は、キャピラリーカラム(30.2cm×50μm、ベックマンコールター社製、ペアーヒューズドシリカ)を備えたベックマンコールター社製のProteomeLab PA800を用い、下記分析条件にて行うことができる。
・分析条件:試料注入後、25℃、15kvの電圧で30分間測定
・検出波長:200nm
SDS−PAGEによる測定は、市販のスラブゲル用の装置(アトー社製、e−PAGEL)において、15%のポリアクリルアミドゲルを用い、20mAで70分間電気泳動後に、ゲルをクマシブリリアントブルーで染色し、得られたゲルを評価することができる。なおマーカーとしては、DynaMarker Muli ColorIII(Biodynamics Laboratory社製)を用いる。
すなわち、反応後の溶液に一定量のアセトンを加え、溶解した部分を乾燥後、一定量のDHBA溶液(20mg/mLの2,5−ジヒドロキシ安息香酸を50%メタノール水溶液に溶解させた溶液)に溶解させる。その後、溶解させた溶液の一部をMALDI−TOF MS分析用のplateにスポットし乾燥させ、ブルカー・ダルトニクス社製autoflex speed−tko1リフレクタシステムによって、下記の条件にて測定することで、反応後の生成物の質量を確認できる。
<条件>
・測定モード:positive ion mode,及びreflector mode
・測定電圧:1.5kv〜2.5kv
・測定分子量の範囲:0〜3000(m/z)及び45000〜60000(m/z)
・積算回数:1000〜8000
本開示においては、エンドMのアミノ酸に変異を導入した変異体を用いる。配列番号1で示されるエンド酵素は、ムコールヒエマリス由来のエンドβNアセチルグルコサミニダーゼ(GenBank Accesion No.BAB43869)である。
本開示の一実施形態では、配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ(エンドM変異体)、あるいは配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基がグルタミン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼであって、かつ配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基以外の1個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び又は置換により、前記アミノ酸配列に対して80%以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ(エンドM変異体ホモログ)の存在下で反応を行うことによって、糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する。
本開示では、エンドM変異体としては、N175QもしくはN175Aであることで、糖鎖転移反応後の生成物の加水分解を十分に抑えることができる。また、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量の観点からは、N175Q変異体であることが好ましい。
以上の観点から、本開示におけるエンド酵素変異体ホモログは、エンドMの触媒領域を含む500残基程度のアミノ酸配列の長さを有していれば、エンドMとしての糖鎖転移活性を有すると推定できる。
本開示におけるエンドM変異体ホモログは、N175Q変異体もしくはN175A変異体と80%以上の相同性を有し、かつ糖鎖転移活性を有するものであれば、175番目のアミノ酸残基以外のどのアミノ残基を他のアミノ酸に置換、欠失及び付加により調製されたものでもよい。
本開示における糖鎖供与体としては、下記一般式(1)で表される糖鎖供与体であれば、特に限定されない。GlcNAcとGlcNAcとのβ1−4結合を含む構造(キトビオシル構造)を有することで、基質として安定であり、溶液中でも長時間安定に存在できるため、長時間の反応時間を要する糖鎖受容体へも十分に対応できる。
X1およびX2としては、少なくとも1つのGlcNAcを有し、該GlcNAcが少なくともコア糖鎖部分のMan2もしくはMan3のどちらかにβ1−2でグリコシド結合する残基を有することを意味する。
X1〜X6が上記の場合には、Z1は水素原子でもGlcNAcβ1−4であってもよい。
この場合に、X1およびX2の両方もしくは片方が、GlcNAcβ1−2、Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2のいずれか一つであり、かつZ1が水素原子であること、又はX1およびX2の両方もしくは片方が、GlcNAcβ1−2、Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2のいずれか一つであり、かつZ1がGlcNAcであることが好ましい。また、さらに、X1およびX2の両方がGlcNAcβ1−2、Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2のいずれか一つであり、かつZ1が水素原子であること、又はX1およびX2の両方がGlcNAcβ1−2、Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2のいずれか一つであり、かつZ1がGlcNAcであることがより好ましい。
また、X1およびX2の両方が、Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2のいずれか一つであり、かつZ1が水素原子であること、又はX1およびX2の両方が、Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2のいずれか一つであり、かつZ1がGlcNAcであることがさらに好ましく、X1およびX2の両方が、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2もしくはGalβ1−4GlcNAcβ1−2のいずれか一つであり、かつZ1が水素原子であること、又はX1およびX2の両方が、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2もしくはGalβ1−4GlcNAcβ1−2のいずれか一つであり、かつZ1がGlcNAcであることが特に好ましく、X1およびX2の両方が、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2もしくはGalβ1−4GlcNAcβ1−2のいずれか一つであり、かつZ1がGlcNAcであることが最も好ましい。
ここで、アジド基、アルキニル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基及びイソシアネート基をクリック反応基と称することがある。すなわち、糖鎖供与体中の糖質由来の基は、前記糖質由来の基を構成するオリゴ糖残基とクリック反応基とが、リンカーを介して結合していてもよい。
上記一般式(1)で表され、前記リンカーが結合していない糖鎖供与体を、リンカー非含有糖鎖供与体と称し、上記一般式(1)で表され、X1〜X6の少なくとも一つが糖質由来の基であり、前記糖質由来の基は、オリゴ糖残基とクリック反応基とが前記リンカーを介して結合した構造を有する糖鎖供与体をクリック反応基含有糖鎖供与体と称することがある。また、クリック反応基、リンカー及びオリゴ糖残基を、各ブロックと称することがある。さらに、リンカーとは、後述するリンカーに用いる化合物と後述するクリック反応基を含む化合物とが結合することによって形成したもののうち、クリック反応基以外の部分をさす。
さらに、前記一般式(1)中のX3、X4、X5、X6及びZ1が水素原子であり、X1およびX2の両方もしくは片方がNeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuGcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuGcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2、GlcAβ1−2及びGlcNAcAβ1−2のいずれか一つであることがより好ましい。さらに、前記一般式(1)中のX3、X4、X5、X6及びZ1が水素原子であり、X1およびX2の両方もしくは片方が、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuGcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuGcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2、GlcAβ1−2及びGlcNAcAβ1−2のいずれか一つであることが特に好ましい。さらに、前記一般式(1)中のX3、X4、X5、X6及びZ1が水素原子であり、X1およびX2の両方が、GlcNAcAβ1−2であることが最も好ましい。
また、上記リンカーの形成には、上記の化合物(ポリマー)を用いることが好ましい。
また、上記リンカーの形成に用いるポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールの好ましい繰り返し単位数は、糖鎖供与体としての調製のし易さ及び糖鎖転移収率の観点から、1〜50が好ましく、1〜20がさらに好ましく、3〜10が特に好ましい。
Y1としては、糖鎖転移収量及び糖鎖転移収率を低下させるものでなければ、特に限定されない。例えば、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アルキルエステル基、アリールエステル基、アミノ基、アミド基、イミド基、アジド基、カルボキシル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基又はハロゲン基が挙げられ、これらの基の中で、アルコキシ基、アルキルエステル基、アリールエステル基、アミド基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基及びアリールスルホニルオキシ基は、さらに置換基を有していてもよい。
具体的には、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、パラメトキシフェノキシ基、パラニトロフェノキシ基などが挙げられる。
(N−1はGlcNAcに結合したアスパラギン、N−2はGlcNAcに結合したアスパラギンを含むヘキサペプチド(ペプチド部分の配列はLys−Val−Ala−Asn−Lys−Thr)を示す。*はGlcNAcの1位との結合位置を示す。)
天然から抽出する方法によって直接に得られる糖鎖供与体は、一般式(1)におけるY1がアスパラギンを含むペプチドであるが、アルコキシ基を含む糖鎖供与体においては、調製における容易さから、上記の天然から抽出する方法で得られた糖鎖供与体を、N175Q変異体の作用によって、糖鎖受容体となるアルコキシ基を有するGlcNAc誘導体に糖鎖転移することで得ることができる。このような糖鎖転移によって調製する方法は、例えば特開平10−45788号公報に記載されている。
さらに、前記クリック反応基がアジド基又はアルキニル基のいずれかであり、前記リンカーがポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールに由来する構造を有し、前記クリック反応基含有糖鎖供与体中の前記クリック反応基の数が1又は2であり、上記一般式(1)中のY1は、炭素数1〜8のアルコキシ基、炭素数2〜6のアルケニルオキシ基、炭素数6〜12の置換基を有していてもよいアリールオキシ基及び置換基を有していてもよいアミド基の群から選ばれるいずれか一つであることがより好ましい。
さらに、前記クリック反応基がアジド基又はアルキニル基のいずれかであり、前記リンカーがポリエチレングリコールに由来する構造を有し、前記クリック反応基含有糖鎖供与体中の前記クリック反応基の数が1又は2であり、前記一般式(1)中のX3、X4、X5、X6及びZ1が水素原子であり、X1およびX2の両方もしくは片方が、NeuAc、NeuGc、GlcA及びGlcNAcAから選ばれる酸性糖残基の少なくとも一つを含み、上記一般式(1)中のY1は、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、パラメトキシフェノキシ基、パラニトロフェノキシ基及びペプチドのアスパラギンの側鎖のアミノ基が結合したアミド基の群から選ばれるいずれか一つであることが特に好ましい。
さらに、前記クリック反応基がアジド基又はアルキニル基のいずれかであり、前記リンカーがポリエチレングリコールに由来する構造を有し、前記クリック反応基含有糖鎖供与体中の前記クリック反応基の数が1又は2であり、前記一般式(1)中のX3、X4、X5、X6及びZ1が水素原子であり、X1およびX2の両方もしくは片方がNeuAcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuAcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuGcα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−2、NeuGcα2−3Galβ1−4GlcNAcβ1−2、GlcAβ1−2及びGlcNAcAβ1−2のいずれか一つであり、Y1は、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、パラメトキシフェノキシ基、パラニトロフェノキシ基、アルキル基及びペプチドのアスパラギンの側鎖のアミノ基が結合したアミド基の群から選ばれるいずれか一つであることが最も好ましい。
本開示における糖鎖受容体としては、GlcNAcを含み、GlcNAcの1位がペプチド又は蛋白質に結合したものであれば、エンドM変異体の糖鎖転移活性を阻害するものでない限り、特に限定されない。
しかし、糖鎖受容体としての調製のしやすさ及び糖鎖転移収率の観点から、下記一般式(2)で表される糖鎖受容体であることが好ましい。
GlcNAc−R2 一般式(2)
(一般式(2)中、R2はアスパラギン残基を含むペプチド又は蛋白質を表す。GlcNAcはN−アセチルグルコサミニル基を表す。)
本開示の一実施形態においては、糖鎖受容体として、定常領域にGlcNAc基が結合したIgG(GlcNAc−IgG)を用いることができる。この中でもGlcNAc−IgG1であることが好ましい。
本開示におけるGlcNAc−IgGとは、免疫グロブリンG(IgG)を製造するために用いられる糖鎖受容体であり、1つの定常領域に1つのN−アセチルグルコサミニル基(GlcNAc)が結合した免疫グロブリンG(IgG)である。したがって、GlcNAc−IgGとしては、2つの定常領域に2つのGlcNAcが結合したものと、1つのGlcNAcが結合した1つの定常領域とGlcNAcが結合していない定常領域のものの2種が存在する。本開示においては、両方のIgGを含む。
また、糖鎖受容体の調製に用いられるIgGのフコースの含有率としては、ADCC活性の点から、50%以下であることが好ましく、30%以下であることがより好ましく、特に10%以下であることが好ましい。
上記のエンド酵素の中でも、IgGが有する様々な種類の糖鎖を加水分解することができる点において、エンドMが最も好ましい。
本開示の反応は、エンドM変異体又はエンドM変異体ホモログ、糖鎖供与体及び糖鎖受容体を溶解させた溶液中で行われる。反応に用いる溶液としては、エンドM変異体又はエンドM変異体ホモログの糖鎖転移活性を阻害しないものでれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液及び酒石酸緩衝液などが挙げられる。これらの緩衝液は、単独でも組み合わせて用いられてもよい。
上記の中でも、エンドM変異体又はエンドM変異体ホモログの糖転移活性の点から、リン酸緩衝液が好ましく、具体的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウムが好ましく、より好ましくはリン酸ナトリウム、リン酸カリウムである。
また、リン酸緩衝液の濃度としては、エンドM変異体又はエンドM変異体ホモログの糖転移活性の点から、10mM〜250mMが好ましく、20mM〜150mMがより好ましく、より好ましくは50mM〜100mMである。10mM以上とすることで緩衝能力を高め、250mM以下とすることで、エンドM変異体又はエンドM変異体ホモログの糖鎖転移活性を高め、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高めることができる。
また、不安定な糖鎖受容体への糖鎖転移反応を行う場合には、上記の温度範囲の中でもできるだけ低い温度での反応、すなわち4℃〜10℃での反応が好ましく、特に4℃での反応が好ましい。
本開示で製造される糖ペプチド又は糖蛋白質は、製造方法として固体、動物組織及び細胞等を使用しないので、外部からの夾雑物又はウィルスなどは混入する可能性は極めて低いので、安全かつ機能を維持した医薬用組成物や薬品の構成成分として提供できる。また、医薬用組成物は、本開示の一実施形態によって製造された糖ペプチド又は糖蛋白質の他、製薬上許容し得る安定化剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、嬌味剤、着色剤、香料等を適宜添加して、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の剤形にすることができる。
また、本開示の一実施形態で製造されるIgGは、特定の複合型糖鎖を高含有率で有するIgGであるため、医薬用組成物として極めて有用である。本開示による製造方法によって、所望される糖鎖構造のみを持ったIgGを調製できるため、ADCC活性やCDC活性、及び血中安定性の効果の程度をあらかじめ予想できるような抗体医薬の調製に貢献できる。
本実施例で用いられる、糖鎖受容体の調製に用いられる市販のモガムリズマブ製剤(協和発酵キリン社製)はIgG1であり、以下の性質を有する。
・分子量:149000
・糖鎖構造:Galが0〜2個付加したFucの含まない複合型糖鎖を主に含有し、Galが0〜2個付加したFucを含む複合型糖鎖及びその他のN−結合型糖鎖を含む
・構造:可変領域の一部がマウス型に置換されたヒト型IgG1
・機能:CCケモカイン受容体4を抗原とする
・調製:モガムリズマブをコードする遺伝子発現構成体をチャイニーズハムスター卵巣細胞に導入し、その後に発現誘導を行って調製
<エンドM変異体>
本実施例で用いられる、エンドM変異体は、N175Q変異体(東京化成工業社製、グライコシンターゼリコンビナント)を用いた。
糖鎖供与体の調製、糖鎖受容体の調製及び各種測定に用いた試薬は特に記載がない場合、東京化成工業社製のものをそのまま使用した。
IgG等の精製におけるクロマトグラフィーは、GEヘルスケア社製のProteinA−セファロースを用いたカラム操作により、流速0.5ml/minで行った。カラムは孔径10mmで長さが90mmの簡易カラム(バイオラッド社製)に単体を充填し、所定の緩衝液で平衡化した後に使用した。
・分析条件:試料注入後、25℃、15kvの電圧で30分間測定
・検出波長:200nm
なお、CE測定では、測定の前に、還元条件もしくは非還元条件にてあらかじめサンプルの前処理を行った。還元処理を行う理由は、図1に示すように、IgGのS−S結合が切断されて、分子量の大きい重鎖と分子量の小さい軽鎖を生じさせた後にCE測定することで、非還元処理の場合よりも、試料中の糖鎖転移した重鎖と糖鎖転移していない重鎖とのピーク分離がよく、反応の確認が容易になるためである。なお還元処理後の試料は、試料溶液に対し50mMのジチオトライトール(DTT)を加えて、100℃にて10分インキュベートして得られるものを用いた。
また、蛋白質の溶液中での濃度は、該溶液に280nmのUV透過光を照射して得られる吸光度を一般的なUV検出器により測定することで見積もられた。
ブロティング装置(アトー社製、Absorbent Paper CB−09A)を用い、泳動後のゲルを、1mA/cm2で60分ブロットすることで転写させ、得られた膜を、その後のレクチン染色に供した。なおマーカーは、上記と同じものを用いた。
<糖鎖受容体の調製>
上記の市販のモガムリズマブ製剤18mgを、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH6.25、15ml)に溶解させ、膜濃縮装置[分画分子量10000、アミコンウルトラ15(メルクミリポア社製)]にて4℃で、緩衝液の交換を行った。上記によって得られたモガムリズマブ(IgG1)18mgをリン酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH6.25、15ml)に溶解し、37℃でエンドMの1.5ユニット(U)(約0.600mg)を加え恒温槽中(EYELA社製、THERMISTOR TEMPPET T−80)で振盪しながらインキュベートした。反応溶液は経時的にCEで分析し、図1及び図2のように、IgGから、N−結合型糖鎖のエンドMによる加水分解が完全に行われることを確認するまでCEによる検出を続けた。
反応の経過は図1及び図2に示す。これらの結果から、還元処理後のCE測定による結果(図1)も、非還元処理後のCE測定による結果(図2)も、24時間後では、原料であるIgGのピークが完全に消滅し、保持時間の短い場所に、新たなピークが生成していることが示された。以上により、原料のIgGがエンドMにより加水分解されて、GlcNAc−IgGがほぼ定量的に生じていることが示された。
本実施例で用いられる、糖鎖供与体は、シアログライコペプチド(SGP、東京化成工業社製)であり、以下の構造を有する。なおペプチド部位のHはアミノ末端の水素、OHはカルボキシル末端の水酸基を示す。
上記にて得られたGlcNAc−IgG(糖鎖受容体)12.0mgを、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.0、1.2ml)に溶解させ、N175Q変異体(エンドM変異体)3.6U(3.6mg)及び、SGP(糖鎖供与体)69.7mgを加え(最終濃度24.6μM)、恒温槽にて30℃で振盪させながらインキュベートした。糖鎖転移反応の経過は、上記の所定時間のインキュベート後に、反応溶液から一部の溶液を採取し、直接CE測定を行うことで、確認した。インキュベートしはじめてから48時間後、再度、N175Q変異体3.6U(3.6mg)及び、SGP(東京化成工業社製)69.7mg(24μM)を加え、さらに22時間インキュベートした。
上記で行った各反応時間におけるCE測定の結果は図3及び図4に示す。また、各反応時間におけるSDS−PAGEの結果を図5に示す。また、CE測定における標準物質はベックマンコールター社製の10kdaリファレンスマーカーを用いた。図3及び図4中に「10kD」として示す。
また、図5の結果から、0時間におけるIgGの重鎖のバンド(分子量45kDa〜50kDa付近)が、24時間後のレーンではかなり消失し、代わりに2kDa程度高分子量側に新たなバンドが現れ、70時間後では、IgGの重鎖のバンドがほぼ消失した。
以上の結果から、糖鎖受容体であるGlcNAc−IgGに対し、エンドM変異体の作用によって、糖鎖供与体の糖鎖供与部分が効率よく転移し、複合型糖鎖を高含有で有するIgGが得られることが示された。また、比較的長時間において反応を行っても、徐々にGlcNAc−IgGが減少していることから、糖鎖供与体自体が安定に溶液中に存在し、エンドM変異体の基質としての役割を有していることが示された。
<糖鎖受容体>
糖鎖受容体としては、実施例1に用いた糖鎖受容体であるGlcNAc−IgG(市販のモガムリズマブ製剤のN結合型糖鎖を酵素処理したもの)をそのまま用いた。
下記構造を有するジシアロノナサッカライド−β−O-pNP(東京化成工業社製、製品番号N0913)の1.00g(0.426mmol)に、DMF50mlを加えて40℃に加熱して溶解させた。その後、11−アジド−3,6,9−トリオキサウンデカン−1−アミン(MW=218.24)2.54ml(12.8mmol)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン2.20ml(12.8mmol)、1−シアノ−2−エトキシ−2−(オキソエチリデンアミノキシ)ジメチルアミノ−モルホリノカルベニウムヘキサフルオロフォスフェート5.48g(12.8mmol)を加えて20時間撹拌した。−O-pNPはパラニトロフェノキシ基を表す。
・NMR測定
1H-NMR (400 MHz,D2O) δH: 8.12 (2H, d, Ph), 7.04 (2H, d, Ph), 5.18 (1H, d, H-1(GlcN)), 5.00 (1H, s, H-1(Man)), 4.81 (1H, s, H-1(Man)), 4.50 (1H, d, H-1(GlcN)), 4.46 (2H, d, H-1 x2(GlcN)), 4.31 (2H, d, H-1 x2(Gal)), 4.12 (1H, s, H-2(Man)), 4.06 (1H, s, H-2(Man)), 3.98 (1H, s, H-2(Man)), 3.93 (2H, t), 2.57 (2H, dd, H-3eq x2(Neu)), 1.97 (3H, s, CH3), 1.92 (6H, s, CH3 x2), 1.90 (6H, s, CH3 x2), 1.88 (3H, s).
・質量測定
MALDI−TOF MS:m/z calcd for C106H173N15NaO68 +:2767.04;found:2767.55
以上の測定結果から、糖鎖供与体である化合物A−1を、収率55%で得られたことを確認した。
糖鎖受容体GlcNAc−IgGの4.0mgを、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.0、0.4ml)に溶解させ、N175Q変異体(エンドM変異体)1.2U(1.2mg)及び、化合物A−1(糖鎖供与体)22mgを加え(最終濃度16μM)、恒温槽にて30℃で振盪させながらインキュベートした。所定時間後に、反応溶液から一部の溶液を採取し、直接CE測定を行うことで、糖鎖転移反応の経過を確認した。インキュベートしはじめてから22時間後に、再度、N175Q変異体1.2U(1.2mg)、及び化合物A−1(糖鎖供与体)22mg(24μM)を加え、さらに22時間インキュベートした。なお、化合物A−1中のアジド基を含むポリエチレングリコール(PEG)由来の構造を有するリンカーに相当する部分を、単にN3-PEGと称し、前記アジド基を含むリンカーが結合したジシアログリカン(SG)に相当する部分を、単にN3-PEG-SGと称することがある。また、SGとは、上記のジシアロノナサッカライド−β−pNP中におけるパラニトロフェノキシ基以外の部分を示す。
また、実施例中、糖鎖供与体中の糖鎖構造を有する部分、例えば、SGPの中のジシアログリカン(SG)に相当する部分を単に糖鎖部分と称することがある。
上記で行った糖鎖転移反応後の生成物を還元処理したものについて、CE測定を行った結果を図7に示す。図7中の(a)は、インキュベートを開始した直後(0時間後)の生成物のCE測定による結果を示し、図7中の(b)は、上記で行った糖鎖転移反応後(44時間後(糖鎖供与体及びN175Q変異体を追加後22時間後))の生成物のCE測定による結果を示す。また、CE測定における標準物質はベックマンコールター社製の10kdaリファレンスマーカーを用いた。図7中に「10kD」として示す。
また、上記で行った糖鎖転移反応後の生成物を還元処理したものについてMALDI−TOF MS測定を行った結果を図8に示す。さらに、糖鎖受容体及び糖鎖転移反応後の生成物についてのSDS−PAGEの結果を図9に示す。
また、図8の結果から、反応時間0時間(図7中の(a))ではGlcNAc−IgG(糖鎖受容体)の還元後の重鎖に相当する質量ピークが、糖鎖転移反応後(図7中の(b))にはほとんど消失した。代わりに、高質量側、すなわちN3−PEGが結合した複合型糖鎖(N3−PEG−SG)分の分子量が増加した位置に質量ピークが出現した。
また、図9の結果から、エンドM処理前の分子量45kDa〜50kDa付近のバンド(レーン1)が、エンドM処理後(レーン2)には低分子量側にシフトし、さらに、上記の糖鎖転移反応後(レーン3)には、高分子量側に新たな濃い濃度のバンドが現れた。
<糖鎖受容体>
GlcNAc1−β−O−pNP(東京化成工業社製)をそのまま用いた。
糖鎖供与体に用いるGlcNAcA−M3GN2−MP(化合物110)は、石田らの文献[SFG-JSCR, Joint Meeting November,16-19(2014)]に記載された合成方法を参考にして、図に示すような合成経路によって合成した。すなわち、公知の化合物102と、市販の化合物101を反応させ6糖を構築した後脱保護し、4−メトキシフェニル3,6−ジ−O−ベンジル−2−デオキシ−2−フタルイミド―β―D−グルコピラノシドとのグリコシル化反応によって7糖を構築した。続いて7糖を脱保護し、更にアセチル化してアセトアミド体へと誘導し、該アセトアミド体の非還元末端GlcNAcのベンジリデンアセタールを選択的脱保護した後、6位を選択的にカルボン酸へと変換した。その後、接触水素添加法によりベンジルエーテル基を脱保護することで、非還元末端にGlcNAcAを有する化合物110を得た。なお、MPとは、パラメトキシフェニル基を示す。
設楽らの文献[J. Biol. Chem. Vol.278,3466-3473(2003)]を参考にして合成できる公知の化合物102の500mg(0.28mmol)と、市販の化合物である4−メトキシフェニル−3−O−ベンジル−4,6−O−ベンジリデン−2−デオキシ−2−フタルイミド-β-D−グルコピラノシド(東京化成工業社製、製品番号M1609)700mg(1.1mmol)とを塩化メチレン12mLに溶解させ、さらにモレキュラーシーブを添加して溶液内を脱水乾燥させた。溶液を−20℃に冷却し、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸を10μL(0.056mmol)添加し、反応させた。薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル=1/1、v/v)にて生成物を確認した後に、トリエチルアミンを添加することで粗体を得た。得られた粗体を、カラムクロマトグラフィー[充填剤:PSQ100B(富士シリシア社製)、展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル=2/1]にて精製し、目的とする化合物103を収率46%(収量350mg)で得た。
化合物103の350mg(0.12mmol)をトルエン5.3mL、アセトニトリル7.0mL、イオン交換水3.5mLの混合溶液に溶解させ、系内を0℃に冷却した。これに硝酸アンモニウムセリウム(IV)を0.7g(1.28mmol)加えて反応させた。反応経過は薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル=1/1、v/v)にて確認を行った。反応の終結を確認した後に、分液処理を行うことで有機層を回収し、粗体を得た。得られた粗体を、カラムクロマトグラフィー(PSQ100B (富士シリシア社製)展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル=2/1)により精製し、目的とする化合物104を収率57%(収量192mg)で得た。
前記化合物104の192mg(0.073mmol)に塩化メチレン1.9mLを加えて溶解させた。これを0℃に冷却し、トリクロロアセトニトリル74μL(0.73mmol)、1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン1μL(0.007mmol)を加えて反応させた。反応経過は薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:トルエン/酢酸エチル=2/1、v/v)にて確認を行った。反応終結を確認した後に、シリカゲル(PSQ100B (富士シリシア社製))を用いて酢酸エチルで洗浄して濾過を行い、濾液を濃縮して粗体の化合物105を収率98%(収量200mg)で得た。
化合物(5)200mg(0.0719mmol)と4−メトキシフェニル3,6−ジ−O−ベンジル−2−デオキシ−2−フタルイミド―β―D−グルコピラノシド(東京化成工業社製、製品番号M1615)171mg(0.29mmol)を塩化メチレン3.7mLに溶解させ、さらにモレキュラーシーブを加えて溶液を脱水乾燥させた。その後、溶液を−20℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホンサントリメチルシリル0.7μL(0.0036mmol)を加えて撹拌することで反応させた。反応経過は薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:トルエン/酢酸エチル=3/1、v/v)にて確認を行った。反応終結を確認した後、トリエチルアミンを加えて中和を行った。反応後の混合液をセライト濾過した後、濾液を濃縮した後にカラムクロマトグラフィー(充填剤:PSQ100B(富士シリシア社製)、展開溶媒:トルエン/酢酸エチル=6/1)にて精製を行い、目的とする化合物106を収率65%(収量150mg)で得た。
化合物106の150mg(0.047mmol)を、n−ブタノール3mLに溶解させ、無水エチレンジアミン190μL(2.8mmol)を加えて還流撹拌することで反応させた。反応経過は薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:塩化メチレン/メタノール=20/1、v/v)にて確認を行った。生成物の確認を行い、反応が終結したことを確認した後に、無水酢酸0.9mL(9.3mmol)を添加し撹拌することでアセチル化を行った。アセチル化反応の経過は、薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:塩化メチレン/メタノール=20/1、v/v)にて確認した。反応終結を確認した後、トリエチルアミンを加えて中和を行い、さらに分液処理によって有機層を回収して粗体を得た。得られた粗体を、カラムクロマトグラフィー(充填剤:PSQ100B (富士シリシア社製)、展開溶媒:塩化メチレン/メタノール=50/1)により精製し、目的とする化合物107を収率80%(収量100mg)で得た。
化合物107の100mg(0.035mmol)に塩化メチレン2mLを加えて溶解させた。これに室温で80%トリフルオロメタンスルホン酸水溶液を、反応液が濁らない程度加えて室温で撹拌させることで反応を行った。反応経過は薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:塩化メチレン/メタノール=20/1、v/v)にて確認した。反応終結を確認した後、反応液を分液処理し、有機層を回収して粗体を得た。得られた粗体はカラムクロマトグラフィー[充填剤:PSQ100B (富士シリシア社製)、展開溶媒:塩化メチレン/メタノール=30/1]にて精製を行い、目的とする化合物108を収率52%(収量48mg)で得た。
化合物108の24mg(0.0089mmol)にアセトニトリル0.5mLを加えて溶解させ、続いて0.74Mに調製したリン酸バッファー0.12mLを加えた。これに過塩素酸ナトリウム1.6mg(0.018mmol)、2,2,6,6,−テトラメチルピペリジン 1−オキシ フリーラジカル0.2mg(0.0018mmol)、次亜塩素酸ナトリウム12%水溶液5μL(0.0018mmol)を順次添加し、室温にて撹拌することで反応を行った。反応経過は薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:塩化メチレン/メタノール=3/1、v/v)にて確認した。反応終結を確認した後、反応液は分液処理を行い、有機層を回収した。得られた粗体はカラムクロマトグラフィー[充填剤:PSQ100B(富士シリシア社製)、展開溶媒:塩化メチレン/メタノール=10/1]にて精製を行い、目的とする化合物109を収率55%(収量13mg)で得た。
化合物109の13mg(0.0047mmol)に酢酸エチル1.6mL、エタノール1.6mL及びイオン交換水0.8mLを加え溶解させた。これに水酸化パラジウム13mgを添加し、水素雰囲気下室温で一晩撹拌することで反応を行った。反応経過は薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:酢酸エチル/メタノール/水/酢酸=2/2/1/0.1、v/v)にて確認した。反応終結を確認した後、試薬を濾別し、得られた粗体はゲル濾過クロマトグラフィー(充填剤:GEヘルスケア社製セファデックスG−10、溶出液:イオン交換水)にて精製を行い、目的とする化合物110を収率93%(収量6.5mg)で得た。
・NMR測定
1H-NMR (D2O) δ: 7.03 (2H, dd, J = 8.9, 2.1 Hz, Ph), 6.95 (2H, dd, J = 9.2, 1.8 Hz, Ph), 5.11 (1H, s, H-1(Man)), 5.03 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-1(GlcN)), 4.90 (1H, s, H-1(Man)), 4.62 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-1(GlcN)), 4.57 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-1(GlcN x2)), 4.24 (1H, s, H-1(Man)), 4.17 (1H, s, H-2(Man)), 4.10 (1H, s, H-2(Man)), 2.07 (3H, s, CH3), 2.05 (6H, s, CH3 x2), 2.03 (3H, s, CH3).
・質量測定
MALDI−TOF MS:m/z calcd for C64H92N4O39:1450.53;found:1450.19
以上の測定結果から、目的とする化合物110を、収率55%で得られたことを確認した。
糖鎖受容体であるGlcNAc−β−エチルアジド(東京化成工業社製)の0.625μmolを、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH7.0、0.01ml)に溶解させ、N175Q変異体(エンドM変異体)10mU(1.0mg)及び、糖鎖供与体である化合物10の0.79μmolを加え(モル比率:糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数=1.264)、恒温槽にて30℃で振盪させながらインキュベートした。1時間後に、反応溶液から一部の溶液を採取し、HPLC測定を行うことで、糖鎖転移反応の経過を確認した。
上記で行った糖鎖転移反応後の生成物を還元処理したものについて、HPLC測定を行った結果を図10及び図11に示す。図10は、反応時間0時間後における結果を示し、図11は、反応時間1時間後における結果を示す。図10及び図11中の「糖鎖受容体」は、GlcNAc1−β−O−エチルアジドを示し、「糖鎖供与体」は化合物110ある。図11中の「GlcNAc1−β−O−MP」は、化合物110の1時間後での加水分解後生成物を示し、「転移物」は化合物110の還元末端が、糖鎖転移反応によって、1位がβ−O−エチルアジド化された生成物、すなわち化合物110のβ−O−MPがβ−O−エチルアジドとなった化合物を示す。
また、糖鎖供与体である化合物110の糖鎖部分は、一般式4−1−1で表される化合物の糖鎖部分(シアログライカン(SG))よりも構造が小さいためエンドM変異体の基質として反応阻害を起こしにくいと推測される。このことから、化合物110の糖鎖部分を有する上記一般式4−2−1で表される化合物も、一般式4−1−1で表される化合物と同様に、2つのN3-PEGを有するIgG(モガムリズマブ)を得るための有効な糖鎖供与体となり得ることが示唆された。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (3)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基がグルタミンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、あるいは配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基がグルタミンであるアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼであって、かつ配列番号1で示されるアミノ酸配列の175番目のアミノ酸残基以外の1個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して90%以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有する変異型エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼの存在下、
下記一般式(1)で表される糖鎖供与体と、
定常領域にN−アセチルグルコサミニル基が結合したIgG重鎖を含むポリペプチドである糖鎖受容体と、
を反応させることにより糖ペプチド又は糖蛋白質を製造する糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法であって、
前記一般式(1)で表される糖鎖供与体において、Y 1 は、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、パラメトキシフェノキシ基、パラニトロフェノキシ基又は下記式N−1若しくはN−2であり、オリゴ糖残基NeuAcα2−6Galβ1-4GlcNacと、アジド基、アルキニル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基又はイソシアネート基から選ばれるいずれか一つの基とが、重量平均分子量が100〜10000であり、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールに由来する構造を有するリンカーを介して結合した構造を有していてもよい、糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
(N−1はGlcNAcに結合したアスパラギン、N−2はGlcNAcに結合したアスパラギンを含むヘキサペプチド(ペプチド部分の配列はLys−Val−Ala−Asn−Lys−Thr)を示す。*はGlcNAcの1位との結合位置を示す。) - 前記反応を、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率(糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数)5以上で行うことで免疫グロブリンGを製造する請求項1に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
- 前記反応を、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率(糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数)1〜4で行うことで免疫グロブリンGを製造する請求項1又は請求項2に記載の糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法。
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