EA026336B1 - Клетка позвоночного или насекомого для продукции белка или липида, не содержащего фукозу или содержащего сниженное количество фукозы, и ее применения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к клеткам для продуцирования белка или липида с отсутствием фукозы или со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах и к способу получения такой клетки. Изобретение также относится к способам продуцирования белков и липидов с отсутствием фукозы или со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах с использованием упомянутых клеток.

Description

Настоящее изобретение относится к клеткам, продуцирующим молекулы с отсутствием фукозы, со сниженным количеством фукозы или имеющей другие атипичные сахара в гликановых фрагментах. Оно также относится к способам продуцирования молекулы с отсутствием фукозы, со сниженным количеством фукозы или имеющей другие атипичные сахара в гликановых фрагментах с использованием упомянутых клеток и к молекулам, получаемым упомянутыми способами. Настоящее изобретение дополнительно относится к молекулам с искусственным характером гликозилирования.

Уровень техники изобретения

Терапевтические гликозилированные молекулы, предназначенные для применения у человека, должны иметь сложный характер гликозилирования, аналогичный найденному в организме человека. Поэтому, как правило, для продуцирования терапевтических гликозилированных молекул, таких как белки или липиды, применяют клетки животных, если предпочтительно, чтобы гликозилированные молекулы имели сложный характер гликозилирования, подобно тому, как у человека. Структура и сложность гликанов серьезно влияет на функцию биомолекулы ίη νίνο путем модуляции периода полураспада, связывания с рецепторами, индукции или подавления иммунных реакций.

Углеводные цепи гликолипидов являются сложными и могут содержать значительное количество фукозы (ΡΝΑ8 1985; 82: 3045-3049). На основании формы связывания с белковой группой углеводные цепи гликопротеинов грубо подразделяют на два типа, а именно углеводные цепи, которые связываются с аспарагином (углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи), и углеводные цепи, которые связываются с другими аминокислотами, такими как серин, треонин (углеводные цепи, присоединенные через О-гликозидные связи).

Углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи, имеют различное строение (Βίοсйстюа1 ЕхрсптспШОоп МсФоб 23 - МсФоб ίοτ Фибушд О1усорго1ст 8идаг Сйат (СакищСш 8киррап Ссйст), сб|1сб Ьу Кс1ко ТакайакЫ (1989)), но известно, что они имеют обычную основную коровую структуру. Конец углеводной цепи, который сзязывается с аспарагином, называют редуцирующим концом, а противоположный - нередуцирующим концом. Углеводная цепь, присоединяемая через Νгликозидную связь, относится к высокоманнозному типу, в котором только манноза связывается с нередуцирующим концом коровой структуры; комплексный тип, в котором со стороны нередуцирующего конца коровой структуры с тремя остатками маннозы имеется по меньшей мере одна боковая цепь галактозо-Л-ацетилглюкозамина (называемого далее Οа1-Ο1сNΑс), присоединенная к каждому из двух (1—3 и 1 —>6) маннозному плечу. Сторона нередуцирующего конца Οа1-Ο1сNΑс может содержать галактозу и сиаловую кислоту, срединный Ν-ацетилглюкозамин или подобную структуру. В гибридном типе со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеются ветвления как высокоманнозного типа, так и комплексного типа. В гликанах из клеток позвоночных фукоза может быть присоединена к антенному Ο1сNΑс через связь α(1—3) (терминальная фукоза) или к ΟΚΝΑ^ связанному с аспарагином, через связь α(1—6) (фукоза кора). Клетки насекомых вырабатывают гликаны, которые могут содержать фукозу кора, присоединенную в положении (1—3).

Олигосахаридный фрагмент Ν-гликозилированных белков первоначально синтезируется из олигосахаридов, связанных с липидом, с образованием Ο1сзМаη₉Ο1сNΑс₂-пирофосфорил-долихола, который затем переносится к аспарагину белка в эндоплазматическом ретикулуме (ЕК), появляясь в трипептидной последовательности аспарагин-Х-серин (А8п-Х-8сг) или аспарагин-Х-треонин (Αδη-Χ-Тйг), где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина. После этого белок транспортируется к комплексу Гольджи, где олигосахаридный участок подвергается дальнейшей обработке в следующей последовательности: во-первых, все три остатка глюкозы (О1с) удаляются глюкозидазами I и II с образованием Μаη₉Ο1сNΑс₂, присоединенного к белку. Структура Μаη₉Ο1сNΑс₂ может быть дополнительно обработана удалением нескольких остатков маннозы (Мап). Первоначально удаляются четыре остатка маннозы, присоединенные в положении α(1—2) с образованием Маη₅Ο1сNΑс₂, присоединенного к белку, который затем удлиняется за счет добавления остатка Ν-ацетилглюкозамина (ΟΚΝΑφ. Данная новая структура, Ο1сNΑсМаη₅Ο1сNΑс₂-белок, является субстратом для α-маннозидазы II, которая удаляет маннозы, присоединенные в положениях α(1— 3)- и α(1—6). После этого добавляются последовательно другие сахара, ΟΚΝΑ^ галактоза, фукоза и сиаловая кислота, образуя комплексные типы структур, которые часто встречаются на Ν-гликозилированных белках.

Молекула фО. например, содержит олигосахарид, присоединенный через Ν-гликозидную связь, который ковалентно связан с консервативным остатком аспарагина 297 каждого домена СН2 в Рс-области. Олигосахариды, найденные в Рс-области сывороточных фО, представляют собой, в основном, биантенные гликаны комплексного типа. Изменения характеров гликозилирования фО включают в себя присоединение к коровой структуре, состоящей из двух Ν-ацетилглюкозаминов (ΟΚΝΑφ и трех манноз (Мап) (Ο1сNΑс₂Маηз), терминальной сиаловой кислоты (ΝαιΑΟ, третьего плеча Ο1сNΑс (срединного ΟΚΝΑφ, терминальное галактозилирование (О) и фукозилирование в положении α(1—6) (Р). Точная схема гликозилирования зависит от структурных свойств подкомпонент фО, в частности доменов СН2 и СН3 (Ьипа с! а1. (2000) Еиг 1. ВюсЬст, 267: 7246-7257).

В клетках животных и человека присутствуют фукозилтрансферазы, которые добавляют остаток

- 1 026336 фукозы к остатку ΟΙοΝΛο на редуцирующем конце Ν-гликанов на белке или к другим образующимся гликановым структурам на гликолипидах. Присоединение фукозы к гликановым фрагментам, связанным с белком или липидом, требует в качестве донора нуклеотидный сахар, ΟΌΡ-Ь-фукозу, а также наличие определенных фукозилтрансфераз, которые передают остаток фукозила от донора к молекуле акцептора (Вескег апй Бо\ус. 1999). В эукариотических клетках ΟΌΡ-Ь-фукоза может быть синтезирована двумя различными путями, более известным путем синтеза йе ηονο фукозы или второстепенным реутилизационным путем (Вескег и Бо\ус. 1999). Реутилизационный путь или путь мусорщика является незначительным источником СЭР-Б-фукозы (около 10%), который может быть легко заблокирован пропуском свободной фукозы и фукозилированных гликопротеинов из культуральной среды. Реутилизационный путь начинается с внеклеточной фукозы, которая может быть транспортирована в цитозольный компартмент посредством специфичных к фукозе транспортеров плазматической мембраны. Альтернативно, в цитозоль может пройти фукоза, отщепленная от эндоцитированных гликопротеинов. Цитозольная Ьфукоза фосфорилируется фукокиназой до фукозо-1-фосфата и затем преобразуется СИР-фукозопирофосфорилазой в СИР-Ь-фукозу (фиг. 1, правая панель). Эксперименты на клеточных культурах показывают, что реутилизационный путь вносит относительно небольшой вклад в цитозольные пулы СЭРЬ-фукозы (Вескег и Бо\ус. 1999).

Более известный путь синтеза йе ηονο фукозы начинается с СИР-Э-маннозы и состоит из СЭРманнозо-дегидратазы (СМИ) и СПР-кето-дезокси-маннозо-эпимеразы/СПР-кето-дезокси-галактозоредуктазы (СМЕК, также известной как Рх у людей), локализованных в цитоплазме, которые совместно превращают СИР-маннозу в СИР-Ь-фукозу (фиг. 1, левая панель). Позже СИР-Ь-фукоза транспортируется в комплекс Гольджи с помощью транспортера СИР-фукозы, локализованного в мембране комплекса Гольджи. Как только СИР-Ь-фукоза попадает в люминальный компартмент комплекса Гольджи, фукозилтрансферазы могут ковалентно связать СИР-Ь-фукозу с образующимися гликановыми фрагментами в комплексе Гольджи. В частности, фукозилтрансфераза (Ри18) переносит остаток фукозы с помощью (1^6)-связи к позиции 6 остатка С1сNΑс на редуцирующем конце Ν-гликана.

Было показано, что отсутствие фукозы на гликопротеинах имеет определенные преимущества. Например, для моноклональных антител, иммуноглобулинов и родственных им молекул было показано, что в отсутствие коровой фукозы углевод из Ν-гликана, присоединенный к аспарагину 297 Рс-участка (домена СН2) иммуноглобулинов, увеличивает или изменяет их связывание с рецепторами Рс. Различные типы консервативных областей связывают различные Рс-рецепторы. Примеры включают в себя связывание Рс-доменов 1дС1 с родственными Рс-рецепторами СЭ16 (РсуКШ), СИ32 (РсуК11-В1-В2) и/или С.П64 (РсуК1), связывание Рс-доменов 1дА с родственными Рс-рецепторами С.П89 (РсаК1) и связывание доменов 1дЕ с родственными Рс-рецепторами РсеРК1 или СЭ23. Связывание с РсуКШ, который находится на поверхности ΝΚ-клеток, сильно увеличивается. (§Ые1Й8 е1 а1. ДВС 277 (30): 26 733 (2002)).

Доминирующим механизмом действия терапевтических антител является антителозависимая клеточная цитотоксичность (именуемая в дальнейшем АОСС-активность). Антитело, связывающееся с клеткой-мишенью (опухолевая клетка или клетка, инфицированная патогеном) своим участком РаЬ, узнается в Рс-участке Рс-рецептором эффекторной клетки, как правило, ΝΚ-клетки. После связывания эффекторная клетка выделяет цитокины, такие как ΙΕΝ-у, и цитотоксические гранулы. содержащие перфорин и гранзимы, которые попадают в клетку-мишень, вызывая гибель клетки. Сродство к РсуКШ имеет решающее значение для антител, действующих по механизму АТСС. Носители аллели низкого сродства рецептора плохо отвечают на терапевтические антитела, такие как КПихипаЬ (Сайтоп е1 а1. В1оой 99: 754758).

Следовательно, более высокое сродство к РсуКШ, опосредованное отсутствием коровой фукозы в гликановом фрагменте участка Рс, может увеличить потенцию или уменьшить эффективную дозу биотерапевтического продукта с серьезными последствиями для клинических преимуществ и стоимости.

Для того чтобы модифицировать структуру углеводной цепи полученного гликопротеина, были предприняты попытки использовать различные методы, такие как 1) применение ингибитора против фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, 2) гомозиготный нокаут гена, участвующего в углеводном синтезе или переносе, 3) отбор мутанта, 4) введение гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, и подобные способы. Конкретные примеры приводятся ниже.

Примерами ингибиторов против ферментов, имеющих отношение к модификации углеводной цепи, являются кастаноспермин и Ν-метил-Пдезоксинойиримицин, представляющие собой ингибиторы гликозидазы Ι, бромокондулит, являющийся ингибитором гликозидазы ΙΙ, 1-дезоксинойиримицин и 1,4диокси-1,4-имино-Э-маннит, являющиеся ингибиторами маннозидазы I, свайнсонин, являющийся ингибитором маннозидазы ΙΙ и подобные соединения. Примерами ингибиторов, специфических для гликозилтрансферазы, являются дезоксипроизводные субстратов против Ν-ацетилглюкозаминтрансферазы V (СпТУ) и подобные соединения.

Мутанты ферментов, имеющих отношение к модификации углеводной цепи, главным образом, отбирают и получают в виде лектинневосприимчивой клеточной линии. Например, мутанты клеток СНО

- 2 026336 получают как лектинневосприимчивую клеточную линию с использованием такого лектина, как \УСА (агглютинин зерна пшеницы, полученный из Т. уиЦапЦ, СопА (конканавалин А, полученный из С. еп81Γοπηίδ). К1С (токсин, полученный из К. сошшцшк), Ь-РНА (лейкоагглютинин, полученный из Р. уиЦапЦ, ЬСА (лентилагглютинин, полученный из Ь. сиПпапЦ, Р8А (лектин гороха, полученный из Р. кайуит) или подобного.

Более того, описаны несколько способов получения рекомбинантных антител с отсутствием фукозы. Одним из наиболее важных ферментов, которые обеспечивают присоединение фукозы к Νгликановым фрагментам кора, является а-1,6-фукозилтрансфераза 8 (Ри18). Упомянутый фермент катализирует присоединение фукозы к положению 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце через αсвязь в пентасахариде углеводной цепи Ν-гликана комплексного типа, присоединенном через Νгликозидную связь (\νϋ 00/61739). Антитела с пониженным количеством фукозы также получают с помощью клетки, в которой экспрессия генов транспортера фукозы искусственно подавлена (патент США 20090061485). Было описано, что внедрение РНК, способной подавлять функцию α-1,6фукозилтрансферазы, также приводит к производству молекул антител, не имеющих фукозы (ЕР 1792987 А1).

Многие из предлагаемых клеток или способов получения молекул, имеющих измененный характер гликозилирования, которые могут быть использованы для терапевтических показаний, имеют существенные недостатки. Например, обработка антител ферментами, которые удаляют гликозилирование, например фукозидазами для удаления остатков фукозы, включает в себя дополнительные производственные шаги, которые являются дорогими, отнимают много времени и являются потенциально весьма рискованными как экономически, так и с точки зрения сохранения постоянства исходной композиции лекарственных средств. Кроме того, молекулярная инженерия клеточных линий для нокаута ключевых ферментов, участвующих в синтезе гликопротеинов, является утомительной, дорогой и не всегда увенчивается успехом. В дополнение упомянутые клеточные линии имеют тот недостаток, что они не допускают перестраиваемую продукцию молекул с различными АЭСС-эффективностью или СНСэффективностью для оптимизации эффективности и безопасности для терапевтического использования. Обработка клеточных линий РНК-интерференцией или антисмысловыми молекулами для нокдауна уровня ключевых ферментов, участвующих в синтезе гликопротеинов, может привести к непредсказуемым внецелевым эффектам, является дорогостоящей и представляется нецелесообразной для реализации в производственном масштабе.

Таким образом, существует потребность в новых выгодных клетках и способах продуцирования молекул с измененным характером гликозилирования, имеющих улучшенные свойства для применения в терапевтических целях.

Настоящее изобретение относится к клеткам, продуцирующим молекулы, имеющие измененный характер гликозилирования, то есть молекулы, у которых нет фукозы, которые имеют сниженное количество фукозы или имеют другие атипичные сахара на своих гликановых структурах. Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования молекул, имеющих измененный характер гликозилирования, то есть молекул, у которых нет фукозы, которые имеют сниженное количество фукозы или имеют другие искусственные сахара на гликановых структурах, применяя упомянутые клетки. Упомянутые молекулы имеют улучшенные свойства для применения в терапевтических целях, например увеличенную АЭСС-активность или СНС-активность, повышенную способность ингибировать сигнальные события, увеличенную способность индуцировать апоптоз и/или увеличенную способность для иммунотерапии. Кроме того, клетки и способы, относящиеся к настоящему изобретению, позволяют иметь перестраиваемую, надежную, недорогую и прямую продукцию молекул, имеющих измененный характер гликозилирования, то есть молекул, у которых нет фукозы, которые имеют сниженное количество фукозы или имеют другие искусственные сахара на гликановых структурах. Дополнительно, настоящее изобретение относится к способам, которые пригодны для производственных масштабов.

Во многих случаях, было затрачено значительное время и были предприняты огромные усилия для создания и развития эффективных клеточных линий-продуцентов, которые экспрессируют интересующий трансген на желательных уровнях. В случаях, когда интересующий трансген представляет собой терапевтическое антитело, которое может выиграть от увеличения АЭСС-эффекторной функции, было бы предпочтительно дополнительно воздействовать на клеточную линию-продуцент таким образом, чтобы клетка-продуцент с высокой продуктивностью была бы не в состоянии присоединять коровую фукозу к Ν-гликановым фрагментам или могла бы присоединять искусственные сахара к Ν-гликановым фрагментам.

Настоящее изобретение относится к единице экспрессии, которая может быть легко применена к уже существующим генетически модифицированным клеткам таким образом, что она делает их неспособными присоединять фукозу к образующимся гликоструктурам гликопротеинов или делает их способными присоединять к образующимся гликоструктурам гликопротеинов другие искусственные сахара, отличные от фукозы, например, для того, чтобы производить антитела, имеющие улучшенную АЭССактивность.

- 3 026336

Сущность изобретения

Первый аспект настоящего изобретения касается клетки позвоночных, содержащей по меньшей мере, один фермент, выбранный из группы, состоящей из ОПР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозоредуктазы (ΚΜΌ), ΟΌΡ перозаминсинтетазы (Рег), ОПР-6-дезокси-Э-талозосинтетазы (СТ8), мутанта Су§1098ег ΟΌΡ-фукозосинтетазы (СР8-Су51098ег) и ΟΌΡ-4-кето-б-дезоксиманнозо-З-дегидратазы (СоГО). где указанный фермент использует в качестве субстрата СПР-6-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу (ΟΌΡ-4-кето-бдеокси-Э-маннозу), которая является ключевым промежуточным продуктом в пути синтеза фукозы бе ηονο и не катализирует реакцию, которая преобразует СПР-6-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу в СПР-Ьфукозу, и где указанная клетка может быть использована для продукции белка или липида, не содержащих фукозу или содержащих сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах по сравнению с количеством фукозы в его гликановых фрагментах, когда белок или липид продуцируется в клетке позвоночных, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам.

Второй аспект настоящего изобретения касается способа получения белка или липида, не содержащих фукозу или содержащих сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах по сравнению с количеством фукозы в его гликановых фрагментах, когда белок или липид продуцируется в клетке позвоночных, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам. Данный способ содержит следующие стадии: I) предоставление клетки позвоночных в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения; II) культивирование указанной клетки позвоночных в условиях, обеспечивающих продукцию белка или липида; и III) выделение белка или липида, не содержащих фукозу или содержащих сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах из культивированной клетки.

Третий аспект настоящего изобретения касается терапевтической композиции антител, содержащих Ν-гликаны типа С0-С1сМАс и не содержащих фукозу и/или содержащих сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах по сравнению с количеством фукозы в гликановых фрагментах антител, которые продуцируются в клетке позвоночных, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам, где указанную композицию получают способом согласно второму аспекту изобретения.

Четвертый аспект настоящего изобретения касается единицы экспрессии, содержащей одну или более последовательностей, управляющих экспрессией позвоночных, функционально связанных с полинуклеотидом, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, где указанный фермент использует СПР-6-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу (СПР-4-кето-6-деокси-Э-маннозу), которая является ключевым промежуточным продуктом в пути синтеза фукозы бе ηονο в качестве субстрата и не катализирует реакцию, которая преобразует СПР-6-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу в СЭР-Ь-фукозу и где указанный фермент выбирают из группы, состоящей из СПР-6-дезокси-Э-ликсо-4гексулозоредуктазы (ΡΜΌ), СЭР-перозаминсинтетазы (Рег), СПР-6-дезокси-Э-талозосинтетазы (СТ8), мутанта Су§1098ег СЭР-фукозосинтетазы (СР8-Су51098ег) и СОР-4-кето-6-дезоксиманнозо-3дегидратазы (СоЮ).

Пятый аспект настоящего изобретения касается способа получения эукариотической клетки согласно первому аспекту настоящего изобретения, включающий стадию введения единицы экспрессии согласно четвертому аспекту в клетку позвоночных.

Шестой аспект настоящего изобретения касается клетки насекомых, содержащей: (I) первый полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, выбранный из группы, состоящей из СПР-6-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозоредуктазы (ΚΜΟ), СЭР-перозаминсинтетазы (Рег), СПР-6-дезокси-Э-талозосинтетазы (СТ8), мутанта Су§1098ег СЭР-фукозосинтетазы (СР8-Су§1098ег) и СОР-4-кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратазы (СоЮ), где указанный фермент использует в качестве субстрата СПР-6-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу (СПР-4-кето-6-деокси-О-маннозу), которая является ключевым промежуточным продуктом в пути синтеза фукозы бе ηονο и не катализирует реакцию, которая преобразует СПР-6-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу в СОР-Ь-фукозу, и (II) второй полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок.

Седьмой аспект настоящего изобретения касается способа получения белка, не содержащего фукозу или содержащего сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах по сравнению с количеством фукозы в его гликановых фрагментах, когда белок продуцируется в клетке насекомых, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам, который включает стадии: (I) предоставление клетки насекомых согласно шестому аспекту; (II) культивирование указанной клетки, при котором происходит экспрессия первого полинуклеотида, кодирующего фермент, и второго полинуклеотида, кодирующего белок; (III) выделение белка из упомянутой клетки.

Подробное описание изобретения

Перед подробным описанием настоящего изобретения следует понять, что данное изобретение не ограничено конкретной методикой, протоколами и реактивами, описанными здесь, так как они могут варьировать. Также следует понимать, что применяемая здесь терминология предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, которое будет ограничено только прилагаемой формулой изобретения. Если не оговорено особо, научные и технические термины, используемые в связи с данным изобретением, будут иметь значения, которые обычно подразумеваются специалистами в данной области.

- 4 026336

Предпочтительно термины, используемые в настоящем документе, определяют как описано в А тиШ1шдиа1 д1о88ату оГ Ью1есЬио1одюа1 1етт§: (ГОРАС Кесоттеибайоик), ЬеиеиЬегдег, Н.С.Ж. Ыаде1, В. аибоЫЫ, Н. еЙ8. (1995), НеКебса СЫтюа Ас1а, СН-4010 Ва§е1, 5>\уЦ/егкшб).

Во всем описании и в формуле изобретения, которые следуют, если не подразумевается иное, исходя из контекста, будет понятно, что под словом содержать и вариантами, такими как содержит и содержащий, подразумевается включение заявленного целого или шага или группы целых или шагов, но не исключение любого другого целого или шага или группы целого или шагов.

Несколько документов приводятся в тексте данного описания. Каждый из документов, указанных здесь (в том числе все патенты, заявки на патенты, научные публикации, описания производителя, инструкции, номера доступа последовательностей в СеиВаик и т.д.), будь то выше или ниже, включен здесь посредством ссылки в полном объеме. Ничто в настоящем документе не следует расценивать как признание того, что изобретение не имеет права на такое раскрытие информации, предвосхищавшей изобретение.

В последующем будут описаны элементы настоящего изобретения. Данные элементы перечислены с конкретными вариантами осуществления, однако следует понимать, что они могут быть объединены в любом виде и в любом количестве, чтобы создать дополнительные варианты осуществления. По-разному описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления не должны быть истолкованы так, чтобы ограничить настоящее изобретение только эксплицитно описанными вариантами осуществления. Данное описание следует понимать таким образом, чтобы поддерживать и охватывать варианты осуществления, которые сочетают в себе эксплицитно описанные варианты осуществления с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Дополнительно любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в данной заявке следует считать раскрытыми описанием настоящей заявки, если не подразумевается иное, исходя из контекста.

Термин содержать или варианты, такие как содержит и содержащий, согласно настоящему изобретению означает включение заявленного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Термин состоящий в основном из в соответствии с настоящим изобретением означает включение заявленного целого или группы целых, при этом исключая модификации или другие целые, которые могли бы существенно повлиять или изменить указанное целое. Термин состоящий из или варианты, такие как состоит из в соответствии с настоящим изобретением означает включение заявленного целого или группы целых и исключение любого другого целого или группы целых.

В контексте настоящего изобретения термин олигопептид относится к короткой цепи аминокислот, соединенных пептидной связью, например цепи, которая обычно составляет в длину менее чем около 50 аминокислот и более типично менее чем около 30 аминокислот.

Термины полипептид и белок используют взаимозаменяемо в контексте настоящего изобретения, и они обозначают длинную цепь аминокислот, соединенных пептидной связью, например цепь, которая обычно составляет в длину 50 аминокислот и более чем 50 аминокислот.

Термин полипептидный фрагмент при использовании в контексте настоящего изобретения обозначает полипептид, который имеет делецию, например делецию по аминоконцу и/или по карбоксильному концу и/или внутреннюю делецию по сравнению с полипептидом полной длины.

В контексте настоящего изобретения термин гибридный белок относится к полипептиду, содержащему полипептид или полипептидный фрагмент, связанный с гетерологичными аминокислотными последовательностями. Гибридные белки полезны, поскольку они могут быть сконструированы таким образом, чтобы содержать два или более желаемых функциональных элемента из двух или более различных белков.

Термины антитело, иммуноглобулин, Ι§ и молекула 1д используют взаимозаменяемо в контексте настоящего изобретения. Домен СН2 каждой тяжелой цепи содержит один сайт для Ν-связанного гликозилирования остатка аспарагина, как правило, остатка аспарагина 297, который связывает Ν-гликан с молекулой антитела (КаЬа! е! а1., Зециеисе оГ рто1еш8 оГ 1ттиио1одюа1 иНегеЖ ΡίΓιΗ ЕД, И.8. Оерайтеи! оГ НеаИЪ аиб Нитаи §егуюе8, ΝΙΗ РиЬйсайои №. 91-3242). В рамки понятия включены классы иммуноглобулинов, а именно 1дС, 1дА, 1дЕ, 1дМ и Ι§Ό. В рамки понятия включены также субтипы 1§С, а именно 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. Данные термины используют в их самом широком смысле, и они включают в себя моноклональные антитела (в том числе моноклональные антитела полной длины), поликлональные антитела, одноцепочечные антитела и мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела).

Термин фрагмент антитела при использовании в контексте настоящего изобретения относится к фрагменту антитела, который содержит, по меньшей мере, участок домена СН2 тяжелой цепи иммуноглобулина константной области, который содержит Ν-связанный сайт гликозилирования домена СН2 и способен специфически связываться с антигеном, то есть содержит цепи по меньшей мере одной У_ъ и/или У_Н-цепи или их связывающей части.

Термины Рс-домен и Рс-область относятся к С-концевой части тяжелой цепи антитела, которая взаимодействует с рецепторами на поверхности клеток, называемыми Рс-рецепторами, и некоторыми белками системы комплемента. Данное свойство позволяет антителам активировать иммунную систему.

- 5 026336

В контексте настоящего изобретения термин гликопротеин относится к белкам, которые содержат олигосахаридные цепи (гликаны), ковалентно связанные с их полипептидными боковыми цепями. Углевод присоединяется к белку в котрансляционной или посттрансляционной модификации. Этот процесс известен как гликозилирование, такое как Ν-гликозилирование или О-гликозилирование.

Ν-гликозилирование означает добавление углеводных цепей, которые присоединяются к азоту амидной группы боковой цепи аспарагина. О-гликозилирование означает добавление углеводных цепей к кислороду гидроксильной группы боковой цепи гидроксилизина, оксипролина, серина или треонина.

Термин гликолипид при использовании в контексте настоящего изобретения относится к липидам, связанным с углеводом. Они встречаются, если углеводная цепь связана с фосфолипидами на экзоплазматической поверхности клеточной мембраны. Углеводы находят на наружной поверхности мембраны всех эукариотических клеток. Углеводная структура гликолипида контролируется гликозилтрансферазами, которые добавляют липиды, и глюкозилгидролазами, которые модифицируют гликан после добавления. Гликолипиды также встречаются на поверхности оболочечных вирусов, включая те, которые используют в качестве ослабленных живых вакцин.

Термины гликан или гликановый фрагмент используют взаимозаменяемо в контексте настоящего изобретения, обозначая полисахарид или олигосахарид. Термин олигосахарид означает сахаридный полимер, содержащий небольшое количество (обычно от трех до десяти) сахаров-компонентов, также известных как простые сахара или моносахариды. Термин полисахарид означает полимерную углеводную структуру, образующуюся из повторяющихся единиц (или моно- или дисахариды, как правило, больше 10), соединенных гликозидными связями. Можно найти гликаны, прикрепленные к белкам как в гликопротеинах или прикрепленные к липидам, как в гликолипидах. Термины охватывают Ν-гликаны, такие как Ν-гликаны высокоманнозного типа, Ν-гликаны комплексного типа или Ν-гликаны гибридного типа или О-гликаны.

В контексте настоящего изобретения для следующих моносахаридов использовали следующие сокращения: глюкоза соответствует О1с, галактоза соответствует Оа1, манноза соответствует Мап, фукоза соответствует Рис или Р, Ν-ацетилгалактозамин соответствует Са1ЫАс или Ν-ацетилглюкозамин соответствует С1сЫАс.

Ν-гликан означает Ν-связанный олигосахарид или полисахарид. Ν-связанным олигосахаридом является, например, тот, который присоединен или был присоединен к остатку Ν-ацетилглюкозамина, связанного с азотом амидной группы остатка аспарагина в белке. Преобладающими сахарами, найденные в Ν-гликопротеинах, являются глюкоза, галактоза, манноза, фукоза, Ν-ацетилгалактозамин (ОаШАс), Νацетилглюкозамин (О1сКАс) и сиаловая кислота (например, Ν-ацетил-нейраминовая кислота (ΝΑΝΑ)). Процессинг углеводных групп происходит котрансляционно в просвете ЕК и продолжается в комплексе Гольджи в случае Ν-связанных гликопротеинов. Ν-гликаны имеют общий пентасахаридный кор МаηзΟ1сNΑс2 (Мап относится к маннозе, 01с относится к глюкозе и ΝΑ^¹ относится к Νацетильному остатку; 01сNΑс относится к Ν-ацетилглюкозамину). Ν-гликаны отличаются по количеству ответвлений (антенны), содержащих периферические сахара (например, 01сКАс, галактозу, фукозу и сиаловую кислоту), которые добавляются к Маηз01сNΑс2 коровой структуры, которую также называют триманнозный кор, пентасахаридный кор или олигоманнозный кор. Ν-гликаны классифицируют в соответствии с их разветвленными компонентами (например, высокоманнозные, комплексные или гибридные).

Ν-гликан высокоманнозного типа означает Ν-связанный полисахарид или олигосахарид, который имеет пять остатков маннозы (Мап₅) или более остатков маннозы (например, Мап₆, Мап₇ или Мап₈).

Ν-гликан комплексного типа означает Ν-связанный олигосахарид или полисахарид, который обычно имеет по меньшей мере один 01сКАс, прикрепленный к 1,3-маннозной руке, и хотя бы один 01сКАс, прикрепленный к 1,6-маннозной руке триманнозного кора. Комплексные Ν-гликаны также могут иметь остатки галактозы (0а1) или Ν-ацетилгалактозамина (ОаШАс), которые необязательно модифицировали, сиаловой кислоты или производных (например, ΝΑΝΑ или №иАс, где №и относится к нейраминовой кислоте и Ас относится к ацетильному остатку). Комплексные Ν-гликаны также могут иметь внутрицепочечные замены, содержащие срединный 01сNΑс и фукозу кора (Рис). Νгликаны комплексного типа в контексте настоящего изобретения могут содержать ноль (00), одну (01), или две (02) галактозы, а также одну фукозу, прикрепленные к первому 01сNΑс на редуцирующем конце (обозначается как 00Р, 01Р, 02Р соответственно).

Ν-гликан гибридного типа означает Ν-присоединенный олигосахарид или полисахарид, который имеет по меньшей мере один 01сNΑс на конце 1,3-маннозной руки триманнозного кора и ноль или более манноз на 1,6-маннозной руке триманнозного кора.

Сокращения, используемые в контексте настоящего изобретения для описания гликоструктур, определяются следующим образом:

кор соответствует Мап₃ 0ΚΝΑ^.

соответствует 0ΚΝΑ^ Мап₃ 0ΚΝΑ^,

00-01сNΑс соответствует 00-структура, в которой отсутствует один 01сNΑс (то есть 01сNΑс Мап₃ 0ΚΝΑ^),

- 6 026336 соответствует О0-структура, содержащая один дополнительный остаток галактозы (то есть 0а1 01с\Ас; Мап₃ 01сХЛсА соответствует 00-структура, содержащая два дополнительных остатка галактозы (то есть 0а12 01с\Ас_; Мап₃ 01сЫЛс₂),

00Р соответствует 00-структура, содержащая дополнительный остаток фукозы, который соединен с первым остатком 01сЫЛс пентасахаридного кора (то есть 01сЫЛс₂ Мап₃ 01сЫЛс₂ Рис),

00Р-01сЫЛс соответствует 00-01сЫЛс-структура, содержащая дополнительный остаток фукозы, который соединен с первым остатком 01сЫЛс пентасахаридного кора (то есть 01сЫЛс Мап₃ 01сЫЛс₂ Рис),

01Р соответствует 01-структура, содержащая дополнительный остаток фукозы, который соединен с первым остатком 01сЫЛс пентасахаридного кора (то есть 0а1 01сЫЛс₂ Мап₃ 01сЫЛс₂ Рис),

02Р соответствует 02-структура, содержащая дополнительный остаток фукозы, который соединен с первым остатком 01сЫЛс пентасахаридного кора (то есть 0а1₂ 01сЫЛс₂ Мап₃ 01сЫЛс₂ Рис),

Мащ соответствует коровая структура, содержащая один дополнительный остаток маннозы (то есть Мап Мап₃ 01сЫЛс₂),

Мап₅ соответствует коровая структура, содержащая два дополнительных остатка маннозы (то есть Мап₂ Мап₃ 01сЫЛс₂),

Мап<5 соответствует коровая структура, содержащая три дополнительных остатка маннозы (то есть Мап₃ Мап₃ 01сЫЛс₂),

Мап₇ соответствует коровая структура, содержащая четыре дополнительных остатка маннозы (то есть Мащ Мап₃ 01сЫЛс₂),

Мащ соответствует коровая структура, содержащая пять дополнительных остатков маннозы (то есть Мап₅ Мап₃ 01сЫЛс₂).

О-гликан означает О-связанный полисахарид или олигосахарид. О-связанные гликаны обычно прикрепляются к пептидной цепи по серину или треонину. О-связанное гликозилирование является истинно посттрансляционным событием, которое происходит в комплексе Гольджи и которое не требует консенсусной последовательности, и для переноса белка не требуется олигосахаридный предшественник. Наиболее распространенный тип О-связанных гликанов содержит начальный остаток ОаШЛс (или эпитоп Тп), они обычно относятся к гликанам муцинового типа. Другие О-связанные гликаны включает в себя глюкозамин, ксилозу, галактозу, фукозы или маннозу в качестве начального сахара, связанного с остатками серина/треонина. О-связанные гликопротеины являются, как правило, крупными белками (больше 200 кДа), которые бывают обычно биантенными со сравнительно меньшим ветвлением, чем Νгликаны.

Термин молекула, природно содержащая фукозу в гликановых фрагментах при использовании в контексте настоящего изобретения относится к любому соединению, которое при продуцировании в эукариотической клетке, предпочтительно клетке позвоночных, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам, то есть с неизмененной способностью добавлять фукозу к гликановым фрагментам, содержит гликановые фрагменты, содержащие по меньшей мере один остаток фукозы. Такие молекулы содержат по меньшей мере один или более мотивов последовательностей, узнаваемых ферментом переноса гликана, например содержит остаток аспарагина (Лкр), серина (8ег) или треонина (ТЬг), предпочтительно трипептидную последовательность Лкп-Х-Зег/ТЬг, в которой X является любой аминокислотой, кроме пролина. Предпочтительными примерами эукариотических клеток (например, клеток позвоночных), которые производят молекулы, содержащие гликановые фрагменты с фукозой, являются СНО, Л0Е1.Н^ Л0Е1.СК, Л0Е1.СКР1Х или Л0Е1.С8. Предпочтительно такими соединениями являются белки, гибридные белки или липиды. Предпочтительно белки являются эукариотическими, предпочтительно позвоночных, наиболее предпочтительно млекопитающих или производными от них.

Термин молекула с отсутствием фукозы в гликановых фрагментах в контексте настоящего изобретения означает, что в молекуле, природно содержащей фукозу в гликановых фрагментах, не присутствует обнаруживаемое количество фукозы. Выраженное в терминах чистоты понятие молекула с отсутствием фукозы в гликановых фрагментах означает, что молекула, которая природно содержит фукозу в гликановых фрагментах, является до 100% свободной от сахарного остатка фукозы в гликановых фрагментах.

Термин молекула со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах относится к молекуле, в которой количество фукозы в гликановых фрагментах снижается от числа (п), если она экспрессируется в клетке, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам, то есть с неизмененной возможностью добавлять фукозу к гликановым фрагментам. Таким образом, сниженное состояние соответствует п-х, где п имеет смысл, указанный выше, и х равняется числу от 1 до (п-1). Предпочтительно если п равняется 2 в природном состоянии, оно снижается до 1. Аналогичным образом, если п равняется 3 в природном состоянии, оно предпочтительно снижается до 2 или до 1, если п равняется 4 в природном состоянии, оно предпочтительно снижается до 3, 2 или 1, если п равняется 5 в природном состоянии, оно предпочтительно снижается до 4, 3, 2 или 1, или, если п равняется 6 в природном состоянии, оно предпочтительно снижается до 5, 4, 3, 2 или 1.

- 7 026336

Термин композиция молекул со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах используется в контексте настоящего изобретения, чтобы показать, что молекулы композиции, природно содержащие фукозу в гликановых фрагментах, имеют сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах. Такое сравнение предпочтительно осуществляется с помощью молекул, продуцируемых клеточными линиями, указанными выше. Выраженное в терминах уменьшения это означает, что у данного количества молекул композиции, предпочтительно от 1, 10, 100 или 1000 пмоль молекул композиции, количество остатков фукозы снижается от 10 до 95%, предпочтительно около 15%, около 20, около 25, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93 или около 94%. Общее снижение может быть связано с увеличением в композиции числа молекул с отсутствием фукозы в гликановых фрагментах и/или со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах.

Термин композиция молекул, которые практически не содержат фукозу в гликановых фрагментах используется в контексте настоящего изобретения, чтобы показать, что молекулы композиции, которые природно содержат фукозу в гликановых фрагментах, по существу, лишены остатка сахара фукозы в гликановых фрагментах. Выраженный в терминах чистоты термин композиция молекул, которые практически не содержат фукозу в гликановых фрагментах означает, что у данного количества молекул композиции, предпочтительно от 1, 10, 100 или 1000 пмоль молекул композиции, по меньшей мере около 95%, около 96, около 97, около 98, около 99, около 99,1, около 99,2, около 99,3, около 99,4, около 99,5, около 99,6, около 99,7, около 99,8 или по меньшей мере около 99,9% упомянутых молекул не содержат остаток сахара фукозы в гликановых фрагментах.

Специалист в данной области может легко экспериментально определить сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах конкретной молекулы, например молекулы антитела, (I) культивированием клеток по настоящему изобретению в условиях, в которых интересующие молекулы продуцируются, (II) выделением упомянутой молекулы из упомянутых клеток и (III) анализом структуры углеводной цепи упомянутой молекулы по отношению к остаткам фукозы, прикрепленным к гликановым фрагментам и вычислением среднего значения остатков фукозы, находящихся в структуре углеводной цепи упомянутой молекулы. (IV) сравнением результата с результатом для той же молекулы, например молекулы антитела, продуцируемой в клетках, в которых молекула продуцируется с характером гликозилирования с неуменьшенным количеством фукозы. Предпочтительно клетки, используемые в двух экспериментах, являются идентичными, но с той разницей, что одна клетка содержит по меньшей мере один фермент, который применяет в качестве субстрата СОР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу, причем фермент не катализирует реакцию, которая преобразует СОР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в СОР-Ь-фукозу. Предпочтительно обе клетки выращивают в одинаковых условиях культивирования, чтобы исключить вариации в фукозилировании, что может быть связано с различиями в условиях культивирования.

Структура углеводной цепи в молекуле, например молекуле антитела, может быть просто проанализирована способом двумерного картирования углеводной цепи (Апа1. ВюсЬет., 171, 73 (1988), ΒίοсЬетюа1 Ехрейтейайоп МеШоШ 23 - МеШоШ ίοτ §1ибушд С1усорто1еш §идат СЬа1п5 Парам §с1епййс 8ос1ейе8 Рте88) еййей Ьу Кшко ТакаЬакЫ (1989)). Структура, выводимая способом двумерного картирования углеводной цепи, может быть определена проведением масс-спектрометрии, такой как МАЬО! (МаЬтх А^Шеб Ьакег ОеюгрОопЛоппаРогр-ТОР-МЕ) каждой углеводной цепи.

Фукозилирование молекул, например белков или липидов, содержащих гликановые фрагменты в эукариотических клетках (например, клетках позвоночных), требует нуклеотидный сахар, СОР-Ь-фукозу в качестве донора, а также наличие определенных фукозилтрансфераз, которые переносят фукозильный остаток от молекулы донора на молекулу акцептора. В эукариотических клетках (например, клетках позвоночных) СОР-Ь-фукоза может быть синтезирована двумя различными путями, более известным путем синтеза бе поуо фукозы или второстепенным реутилизационным путем.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что наличие фермента (отклоняющий фермент) в эукариотической клетке (например, клетки позвоночных), который эффективно использует СОР-6-дезоксиО-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, но не катализирует реакцию, которая преобразует СЭР-6дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в СОР-Ь-фукозу, приводит к продуцированию молекулы, например белка или липида, с отсутствием фукозы или со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах. Термин СОР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулоза является синонимом термина СОР-4-кето-6-дезокси-Оманноза. Оба термина являются взаимозаменяемыми в настоящем документе.

Таким образом, первый объект настоящего изобретения относится к (модифицированной) клетке позвоночных для продуцирования молекулы, природно содержащей фукозу в гликановых фрагментах, которая не содержит фукозу или содержит сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах, содержащей по меньшей мере один фермент, который применяет СОР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, причем фермент не катализирует реакцию, которая преобразует СОР-6-дезокси-Оликсо-4-гексулозу в СОР-Ь-фукозу.

Ферментом, который присутствует в клетке позвоночных по первому объекту изобретения, может быть любой фермент, который применяет СОР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата при

- 8 026336 условии, что упомянутый фермент не катализирует реакцию, которая преобразует ΟΌΡ-6-дезоксиЮликсо-4-гексулозу в ΟΌΡ-Ь-фукозу. Скорее упомянутый фермент преобразует ООР-6-дезокси-0-ликсо-4гексулозу в продукт, который не может быть больше использован для синтеза ΟΌΡ-Ь-фукозы в клетке позвоночных.

Фермент, который присутствует в клетке позвоночных по первому объекту изобретения, представляет собой фермент, который обычно не присутствует в клетке позвоночных, то есть является гетерологичным или искусственным ферментом, например ферментом из организма другого царства, таким как прокариоты, предпочтительно бактерии. Альтернативно, упомянутый фермент может также быть ферментом, который обычно присутствует в клетке позвоночных, но не преобразует субстрат ΟΌΡ-6дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу в ΟΌΡ-Ь-фукозу, а, скорее в другой продукт, например, в связи с наличием мутаций.

Фермент, который присутствует в клетке позвоночных по первому объекту настоящего изобретения, вводят в клетку позвоночных, например, с помощью микроинъекции белка, электропорации белка или липофекции белка. Также возможно ввести в клетку позвоночных последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, предпочтительно интегрированную в вектор экспрессии, например, через микроинъекцию ДНК, электропорацию ДНК или липофекцию ДНК, которая последовательно транскрибируется и транслируется в соответствующий белок в клетке позвоночных. Специалист в данной области хорошо информирован о молекулярно-биологических методиках, таких как микроинъекция, электропорация или липофекция, для введения белков или последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки, в клетки позвоночных и знает, как выполнять данные методики.

Предпочтительно, что два или более фермента, то есть 2, 3, 4, 5, 6 или 7, которые используют ΟΌΡ6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата и которые не катализируют превращение ΟΌΡ-6дезоксиЮ-ликсо-4-гексулозы в ΟΌΡ-Ь-фукозу, присутствуют в клетке позвоночных, чтобы эффективно блокировать путь синтеза йе ηονο фукозы в упомянутой клетке.

Предпочтительно фермент, который применяет Ο^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, выбирают из группы, состоящей из Ο^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозоредуктазы (синоним Ο^Ρ-4-кето-6-дезокси-^-маннозоредуктаза, сокращенно ΡΜΟ), ΟΌΡ-Ό-перозаминсинтетазы (Ρογ). ΟΌΡ6-дезоксиЮ-талозосинтетазы (ΟΤ8), мутанта Су§1098ег (СР8-Су51098ег) ΟΌΡ-фукозосинтетазы, ΟΌΡ-4кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратазы (СоЮ), предпочтительно Ο^Ρ-4-кето-6-дезоксиманнозо-3дегидратазы (СоЮ) в сочетании с ΟΌΡ-Ь-колитозосинтазой (Со1С) и их вариантов, предпочтительно фермент происходит из бактерии или является производным от такого бактериального фермента. Более предпочтительно фермент, который применяет Ο^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, представляет собой Ο^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозоредуктазу (ΚΜΌ), мутант ΟΌΡфукозосинтетазы Су§1098ег (СР8-Су51098ег) и/или ΟΌΡ-Ό-перозаминсинтетазу Шег).

Ο^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозоредуктаза (ΡΜΌ) редуцирует субстрат ΟΌΡ-6-дезокси-О-ликсо4-гексулозу до ΟΌΡ-Ό-рамнозы. ΟΌΡ-Ό-рамноза является донором нуклеотидного сахара для Όрамнозилирования у бактерий и не встречается у позвоночных. В клетках позвоночных также отсутствуют специфические рамнозилтрансферазы, так что ΟΌΡ-Ό-рамноза не может быть включена в образующиеся гликоструктуры гликопротеинов или гликолипидов в клетках позвоночных.

Фермент ΟΌΡ-6-дезокси-О-талозосинтетаза (ОТ8) редуцирует субстрат Ο^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4гексулозу до ΟΌΡ-дезокси-О-талозы. ΟΌΡ-дезокси-О-талоза является донором нуклеотидного сахара для 6-дезокси-О-талозилирования у бактерий и не встречается у позвоночных. В клетках позвоночных также отсутствуют специфические дезокситалозилтрансферазы, так что ΟΌΡ-дезокси-О-талоза не может быть включена в образующиеся гликоструктуры в клетках позвоночных.

Дополнительно фермент ΟΌΡ-Ό-перозаминсинтетаза Шег) редуцирует и трансаминирует субстрат Ο^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозу до ΟΌΡ-Ό-перозамина. ΟΌΡ-Ό-перозамин является донором нуклеотидного сахара для перозаминилирования у бактерий, например Е.еоП. ΟΌΡ-Ό-перозамин, как правило, не присутствует в клетках позвоночных. В клетках позвоночных также отсутствуют специфические перозаминилтрансферазы, так что ΟΌΡ-Ό-перозамин не может быть присоединен к образующимся гликоструктурам в клетках позвоночных.

Таким образом, гетерологичные ферменты ΟΤ8 и/или Ρе^ (I) истощают субстрат ΟΌΡ-6-дезокси-Оликсо-4-гексулозу в клетке позвоночных и (II) приводят к синтезу искусственных продуктов (например, ΟΌΡ-дезокси-О-талозы в случае ΟΤ8 и ΟΌΡ-Ό-перозамина в случае Ρе^), которые не могут быть больше использованы для синтеза ΟΌΡ-Ь-фукозы. Таким образом, молекулы, которые обычно содержат фукозу в гликановых фрагментах, продуцируемую в клетке позвоночных, содержащей ΟΤ8 и/или Ρе^, не имеют фукозы или имеют сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах.

Фермент Ο^Ρ-4-кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратаза (СоЮ) использует субстрат ΟΌΡ-6-дезоксиО-ликсо-4-гексулозу и преобразует его в Ο^Ρ-4-кето-3,6-дидезокси-^-маннозу. Так как промежуточный продукт Ο^Ρ-4-кето-3,6-дидезокси-^-манноза может быть нестабильной в клетке позвоночных, СоЮ предпочтительно применяют в сочетании с ферментом ΟΌΡ-Ь-колитозосинтазой (Со1С). Фермент Со1С относится к классу Ο^Ρ-4-дегидро-6-дезокси-^-маннозо-эпимераз/редуктаз. Фермент Со1С преобразует далее промежуточный продукт Ο^Ρ-4-кето-3,6-дидезокси-^-маннозу в стабильный конечный продукт

- 9 026336

ΟΌΡ-Ь-колитозу. Оба продукта не могут быть включены в образующиеся гликоструктуры в клетках позвоночных, так как упомянутые клетки не имеют соответствующей гликозилтрансферазы, чтобы переносить СПР-4-кето-3,6-дидезокси-О-маннозу и/или ΟΌΡ-Ь-колитозу на гликановые фрагменты молекул, присутствующих в упомянутых клетках. Таким образом, предпочтительно, что СоГО присутствует в клетке позвоночных в сочетании с Со1С.

Фермент ΟΌΡ-фукозосинтетаза (СР8) (также известный как ΟΌΡ-4-кето-б-дезокси-О-маннозоэпимераза/редуктаза, СМЕК) преобразует ΟΌΡ-4-кето-б-дезокси-О-маннозу в ΟΌΡ-Ь-фукозу в клетках позвоночных. Реакция СР8 включает в себя эпимеризации как по С-3, так и по С-5, а затем НАДФНзависимое восстановление карбонильной группы по С-4. В настоящем изобретении используют мутант по активному сайту, предпочтительно СР8-Су51098ет, который преобразует С^Ρ-4-кето-6-дезокси-^маннозу в продукт, отличающийся от ΟΟΡ-Ρ-фукозы, а именно ΟΟΡ-6-дезокси-О-альтрозу (см. Ьаи 8.Т.В., Таппег, М.Е. 2008. МееЬашкт апй асйуе 8Йе гемйиех о£ С^Ρ-Ρисо8е ЗуйЪазе, 1оитиа1 о£ 1Не Атепсап СЬет1еа1 5>ос1е1у. Уо1. 130, Ыо. 51, рр. 17593-17602).

Предпочтительно два или более фермента, то есть 2, 3, 4, 5, 6 или 7, выбранных из группы, состоящей из С^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозоредуктазы (синоним С^Ρ-4-кето-6-дезокси-^-маннозоредуктаза, сокращенно ΚΜΌ), С^Ρ-^-перозаминсинтетазы (Тег). С^Ρ-6-дезокси-^-талозосинтетазы (СГ8), мутанта Суз1098ег (СР8-Су51098ет) С^Ρ-фукозосинтетазы, С^Ρ-4-кето-6-дезоксиманнозо-3дегидратазы (СоГО), предпочтительно С^Ρ-4-кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратазы (СоГО) в сочетании с ΟΟΡ-Ρ-колитозосинтазой (Со1С) и их вариантов, присутствуют в клетке позвоночных.

Вариант фермента ΚΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С, который является предпочтительным в настоящем изобретении, отличается от фермента ΡΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С, из которого он получен, до 150 (то есть до 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 или 150) аминокислотными изменениями в аминокислотной последовательности (то есть замены, инсерции, делеции, усечения на Ν-конце и/или усечения на С-конце). Аминокислотные замены могут быть консервативными или неконсервативными. Вариант фермента ΡΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С, который является предпочтительным в настоящем изобретении, может альтернативно или дополнительно характеризоваться определенной степенью идентичности последовательности с ферментом ΚΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С, из которого он произведен. Таким образом, варианты ферментов ΚΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С, которые являются предпочтительными в настоящем изобретении, имеют идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с референсным ферментом ΡΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С. Предпочтительно идентичность последовательности продолжается на непрерывном протяжении 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300 или более аминокислот, предпочтительно по всей длине соответствующего референсного фермента ΡΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С. Особенно предпочтительно, чтобы идентичность последовательности по всей длине составляла по меньшей мере 80%, составляла по всей длине по меньшей мере 85%, составляла по всей длине по меньшей мере 90%, составляла по всей длине по меньшей мере 95%, составляла по всей длине по меньшей мере 98% или составляла по всей длине по меньшей мере 99,5% соответствующего референсного фермента ΚΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8Суз1098ег, СоГО или Со1С. Также особенно предпочтительно, чтобы идентичность последовательности составляла по меньшей мере 80% на протяжении по меньшей мере 200 или 250 аминокислот, составляла по меньшей мере 85% на протяжении по меньшей мере 200 или 250 аминокислот, составляла по меньшей мере 90% на протяжении по меньшей мере 200 или 250 аминокислот, составляла по меньшей мере 95% на протяжении по меньшей мере 200 или 250 аминокислот, составляла по меньшей мере 98% на протяжении по меньшей мере 200 или 250 аминокислот или составляла по меньшей мере 99,5% на протяжении по меньшей мере 200 или 250 аминокислот соответствующего референсного фермента ΚΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су§1098ег, СоГО или Со1С.

Фрагмент (или делеционный вариант) фермента ΚΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С имеет предпочтительно делецию до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 аминокислот на Ν-конце и/или на С-конце и/или внутренне.

Дополнительно фермент ΚΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С, имеющий указанную выше степень родства с референсным ферментом, рассматривают только как вариант, если он проявляет соответствующую биологическую активность до уровня по меньшей мере 30% активности соответствующего референсного фермента. Соответствующая биологическая активность в контексте настоящего изобретения представляет собой ферментативную активность, то есть активность варианта фермента ΚΜΌ, Ρе^, СТ8, СР8-Су51098ет, СоГО или Со1С для утилизации субстрата С^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4гексулозы и преобразования его в С^Ρ-^-рамнозу, С^Ρ-^-перозамин, С^Ρ-дезокси-^-талозу, С^Ρ-6дезоксиГО-альтрозу, С^Ρ-4-кето-3,6-дидезокси-^-маннозу или ΟΟΡ-Ρ-колитозу соответственно. Спе- 10 026336 циалист в данной области может легко оценить, имеет ли вариант фермента ΚΜΌ, Рег, СТ§, СР8Су8109§ет, СоГО или Со1С ферментативную активность, составляющую по меньшей мере 30% от активности соответствующего референсного фермента ΚΜΌ, Рег, СТ§, СР8-Су8109§ет, СоШ или Со1С. Подходящие тесты, например тесты ферментативной активности для определения ферментативной активности варианта фермента по сравнению с ферментативной активностью соответствующего референсного фермента известны специалистам в этой области.

Предпочтительно фермент СПР-б-дезокси-О-ликсо-4-гексулозоредуктаза (ΚΜΌ) происходит из Ркеиботоиак аетидшока (8ЕЦ ГО N0: 1). Фермент ΟΌΡ-б-дезоксиГО-талозосинтетаза (СТ§) происходит предпочтительно из АсйиоЬасШик асйиотусе1етсотЬаи8 (8ЕЦ ГО N0: 2). Предпочтительно, чтобы фермент СЭР-перозаминсинтетаза (Рег) происходила из УФпо Сйо1етае (§ЕЦ ГО N0: 3). Предпочтительно СОР-4-кето-б-дезоксиманнозо-3-дегидратаза (СоГО) происходит из Е.сой (§ЕЦ ГО N0: 4). Применение СОР-Ь-колитозосинтазы (Со1С) из Е.сой также является предпочтительным (8ЕЦ ГО N0: 7). СОР фукозосинтетаза (СР8) дикого типа происходит из Сг1се1и1и8 дпкеик (китайский хомячок) (8ЕЦ ГО N0: 5). Мутант СОР-фукозосинтетазы Су8109§ет (СР8-Су8109§ет) из Спсе1и1и5 дгйеш (китайский хомячок) имеет аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: б.

Как упоминалось выше, изобретение охватывает варианты ферментов, применяющих СЭР-бдезокси-Э-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает варианты выше упомянутых номеров идентификатора последовательностей, то есть варианты §ЕЦ ГО N0: 1, варианты §ЕЦ ГО N0: 2, варианты §ЕЦ ГО N0: 3, варианты §ЕЦ ГО N0: 3, варианты §ЕЦ ГО N0: 4, варианты §ЕЦ ГО N0: 5, варианты §ЕЦ ГО N0: б и варианты §ЕЦ ГО N0: 7. Что касается структурного и/или функционального определения упомянутых вариантов, это относится к вышеупомянутым пунктам.

Предпочтительно последовательности нуклеиновых кислот ΚΜΌ, Рег, СТ§, СоГО, Со1С или СР8Су8109§ет являются кодон-оптимизированными. Термин кодон-оптимизированный при использовании в контексте настоящего изобретения означает, например, удаление ТАТА-бокса, сП сайтов, участков посадки рибосомы, мотивов нестабильности РНК, повторяющихся последовательностей, выраженной вторичной структуры РНК и критических сайтов сплайсинга, а также применение часто используемых кодонов в эукариотических (например, позвоночных) клетках или генов с высоким уровнем экспрессии в эукариотических (например, позвоночных) клетках.

Кроме того, предпочтительно, что дополнительно реутилизационный путь синтеза фукозы заблокирован в клетке позвоночных. Таким образом, при культивировании клеток по настоящему изобретению предпочтительно применять питательные среды, свободные от фукозы и от фукозилированных гликопротеинов.

Клетка позвоночных дополнительно или альтернативно с ферментом содержит СОРГО-рамнозу, СЭРГО-перозамин, СОР-дезокси-Э-талозу, СОР-б-дезокси-Э-альтрозу, СПР-4-кето-3,б-дидезокси-Оманнозу и/или СПР-Ь-колитозу для ингибирования или предотвращения синтеза СОР-Ь-фукозы, так как авторы настоящего изобретения неожиданно заметили, что добавление, в особенности цитозольное добавление, например, внутрицитоплазматической инъекцией, искусственных сахаров СОРГО-рамнозы, СЭРГО-перозамина, СОР-дезокси-Э-талозы, СПР-б-дезокси-Э-альтрозы, СЭР-4-кето-3,б-дидезокси-Эманнозы и/или СЭР-Ь-колитозы положительно влияет на ингибирование переноса фукозы в клетки позвоночных. Добавление искусственного сахара(ов) СЭР-б-дезокси-Э-альтрозы, СЭР-Э-рамнозы и/или СЭР-Э-перозамина является особенно предпочтительным.

Предпочтительно, чтобы фермент, который применяет СЭР-б-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата и который не катализирует реакцию, которая преобразует СЭР-б-дезокси-Э-ликсо-4гексулозу в СЭР-Ь-фукозу, экспрессировался из последовательности нуклеиновых кислот, временно присутствующей или стабильно поддерживаемой в клетке позвоночных, эписомально или хромосомно.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент, предпочтительно СЭР-бдезокси-Э-ликсо-4-гексулозоредуктазу (КМЭ), СЭР-Э-перозаминсинтетазу (Рег), СЭР-б-дезокси-Эталозосинтетазу (СТ§), мутант СЭР-фукозосинтетазы Су8109§ет (СР8-Су8109§ет), СЭР-4-кето-бдезоксиманнозо-3-дегидратазу (СоГО) или СПР-Ь-колитозосинтазу (Со1С), интегрирован в вектор экспрессии, который применяется, чтобы трансформировать клетки.

Подходящие векторы экспрессии содержат плазмидные космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) и вирусные векторы. Предпочтительно применяют невирусные векторы экспрессии.

Экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, контролируют последовательностями, контролирующими экспрессию.

Термины последовательности, контролирующие экспрессию относятся к нуклеотидным последовательностям, которые влияют на экспрессию в эукариотических клетках (например, клетках позвоночных) кодирующих последовательностей, с которыми они функционально связаны. Последовательности, контролирующие экспрессию, представляют собой последовательности, которые контролируют транскрипцию, например промоторы, ТАТА-бокс, энхансеры; посттранскрипционные события, например полиаденилирование; и трансляцию последовательностей нуклеиновых кислот.

Предпочтительные промоторы представляют собой конститутивные промоторы, включающие в се- 11 026336 бя прямой промотор немедленно ранних генов цитомегаловируса НСМУ, ранние или поздние промоторы 8У40 или регулируемые промоторы, включающие в себя промотор СИР-1, Тет-репрессор, который работает, например, в системах включения или отключения Тет, промотор 3-фосфоглицераткиназы (ФГК), промоторы кислой фосфатазы и промоторы дрожжевых факторов спаривания α или а, например, прямой промотор ранних генов СМУ, ранний или поздний промотор 8У 40, промотор гена полиэдрина, ретровирусные ЬТИ, промотор ФГК, фактор элонгации 1-α (ΕΡ1-α), ЕР2 и фосфоенолпируваткарбоксикиназы (РЕРСК). Особенно предпочтительными промоторами являются промоторы, которые поддерживают только промежуточную или слабую экспрессию фермента, чтобы избежать возможных проблем токсичности. Сила экспрессии данного промотора может быть нормирована сравнением экспрессии с силой экспрессии сильного конститутивного промотора, направляющего экспрессию эндогенной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ОЛРИН). Промотор, направляющий экспрессию фермента с силой, равной от 10 до 1% ОЛРИН, считается промотором, направляющим промежуточную экспрессию, и промотор с направляющей экспрессией фермента с силой, равной менее чем 1%, считается слабым промотором. Силу экспрессии можно оценить способами, известными в данной области техники, в том числе, например, ПЦР в реальном времени.

Маркерные метки могут быть также метками, применяемыми в вариантах осуществления настоящего изобретения. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты маркерной метки является функционально связанной с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок (например, фермент, антитело), который будет помечен. Предпочтительно маркерная метка представляет собой флуоресцентный белок, выбранный из группы, состоящей из ОРР и его вариантов, включая в себя, но не ограничиваясь, ОРР. Применяемый здесь термин функционально связанный означает, что одна нуклеиновая кислота связана со второй нуклеиновой кислотой таким образом, что экспрессия в рамке соответствующего гибридного белка может быть осуществлена с избеганием сдвигов рамки считывания или стоп-кодонов. Данные термины также означают связывание последовательностей, контролирующих экспрессию, с последовательностью, кодирующей интересующую нуклеиновую кислоту (например, фермент, антитело), чтобы эффективно контролировать экспрессию упомянутой последовательности. Данные термины также относятся к связыванию последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих аффинную метку или маркерную метку, с последовательностью, кодирующей интересующую нуклеиновую кислоту (например, фермент, антитело).

Предпочтительно, чтобы последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент КМЭ, Рег, ОТ8, ОР8-Су51098ет, СоЮ или Со1С в векторе экспрессии, была функционально связана со специфическими последовательностями позвоночных, контролирующими экспрессию, которые позволяют экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент КМЭ, Рег, ОТ8, ОР8Су81098ет, СоЮ или Со1С в клетке позвоночных.

В результате фермент(ы) ИМИ, Рег, ОТ8, ОР8-Су§1098ет и/или СоЮ, СоЮ предпочтительно в сочетании с Со1С, экспрессируются в клетке позвоночных по настоящему изобретению с выходом, оптимальным для желаемого эффекта. В зависимости от природы фермента и клетки, применяемых для экспрессии, данные выходы могут быть высокими, умеренными или низкими. Специалисты в данной области легко выберут соответствующие специфические последовательности позвоночных, контролирующие экспрессию, чтобы достичь высокого, умеренного или низкого уровня экспрессии.

Экспрессия фермента(ов) ИМИ, Рег, ОТ8, ОР8-Су§1098ет и/или СоЮ, СоЮ предпочтительно в сочетании с Со1С, в клетке позвоночных имеет такой эффект, что она эффективно блокирует синтез ОИРЬ-фукозы и, таким образом, приводит к продуцированию молекул, которые природно содержат фукозу в гликановых фрагментах, но в которых, в связи с их экспрессией, отсутствует фукоза, или они имеют сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах.

Для долгосрочного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом является предпочтигельной стабильная экспрессия. Например, могут быть созданы эукариотические клетки (например, клетки позвоночных), которые стабильно экспрессируют нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент, который применяет ОИР-б-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, причем фермент не катализирует реакцию, которая преобразует ОИР-б-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в ОИР-Ь-фукозу, и белок, например антитело. Вместо применения векторов экспрессии, которые содержат вирусные ориджины репликации, эукариотические клетки (например, клетки позвоночных) могут быть трансформированы векторами, контролируемыми соответствующими последовательностями, контролирующими экспрессию (например, промотор, энхансер, последовательности, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т.д.) и, необязательно, селектируемыми маркерами. После введения чужеродной ДНК трансформированные клетки могут быть обнаружены анализом нуклеиновых кислот из таких клеток, выявлением эффекта экспрессии (например, отсутствие фукозы, применяя способ связывания лектинов) или могут быть выбраны применением селективного давления. Подходящие системы селекции хорошо известны в данной области техники.

Предпочтительно клетка позвоночных дополнительно содержит по меньшей мере одну молекулу (акцептора), которая способна служить субстратом для фукозилтрансферазы. Термин молекула (акцеп- 12 026336 тора), способная служить субстратом для фукозилтрансферазы при использовании в контексте настоящего изобретения относится к любому интересующему соединению, например белок, полипептид, олигопептид, липид, липидный фрагмент или гибридный белок, которое имеет или содержит гликановые фрагменты, к которым прикреплен по меньшей мере один остаток фукозы, если оно продуцируется в клетке с неизмененной активностью фукозилирования. Такое соединение является подходящим субстратом для фукозилтрансферазы. Предпочтительная молекула акцептора представляет собой соответственно гликопротеин, гликополипептид, гликоолигопептид, гликолипид, гликолипидный фрагмент или гликозилированный гибридный белок. Термин молекула (акцептора), способная служить субстратом для фукозилтрансферазы при использовании в контексте настоящего изобретения также относится к любому белку или липиду, пока он представляет собой перспективный гликопротеин или гликолипид, к которому может быть прикреплен по меньшей мере один остаток фукозы, то есть белок или липид, с которым связаны олигосахаридные структуры, содержащие моносахарид, к которому фукоза может быть присоединена фукозилтрансферазой после ее продуцирования клеткой позвоночных. Предпочтительно белки не являются прокариотического происхождения. Особенно предпочтительно белок представляет собой белок млекопитающих или производное от него.

Присутствие в клетке позвоночных по изобретению молекулы, способной служить субстратом для фукозилтрансферазы, например белка или липида, содержащего гликановые фрагменты, к которым может быть прикреплен по меньшей мере один остаток фукозы, приводит к продуцированию данной молекулы, которая не содержит фукозы в гликановых фрагментах или которая имеет сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах, несмотря на то, что остатки фукозы могут быть присоединены.

Предпочтительно молекула, способная служить субстратом для фукозилтрансферазы, представляет собой белок, предпочтительно эндогенный или экзогенный белок. Термин экзогенный белок означает любой белок, который либо поступает с наружной стороны соответствующей клетки или экспрессируется в клетке из нуклеиновой кислоты, введенной в соответствующую клетку. Термин эндогенный белок означает любой белок, кодируемый геномом клетки. Предпочтительно интересующий белок, а именно перспективный гликопротеин, рекомбинантно экспрессируется в клетке позвоночных. Предпочтительно, чтобы упомянутый белок экспрессировался из последовательности нуклеиновой кислоты, временно присутствующей или стабильно поддерживаемой в клетке позвоночных. Подходящие векторы экспрессии и последовательности контроля экспрессии были описаны выше в отношении фермента. Они могут в равной степени быть использованы в контексте экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий белок.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка позвоночных содержит (I) по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент ОПР-б-дезокси-О-ликсо-4-гексулозоредуктазу (КМЭ), ΟΌΡ-Όперозаминсинтетазу (Рег), ΟΌΡ-б-дезокси-Э-талозосинтетазу (СТ§), мутант ΟΌΡ-фукозосинтетазы Су8109§ег (СР8-Су8109§ег), ΟΌΡ-4-кето-б-дезоксиманнозо-З-дегидратазу (СоГО) или ΟΌΡ-Ьколитозосинтазу (Со1С), функционально связанную со специфическими последовательностями позвоночных, контролирующими экспрессию, которые позволяют экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей соответствующий фермент, и (II) по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий белок, а именно перспективный гликопротеин, например антитело, такое как 1дО1, функционально связанную со специфическими последовательностями позвоночных, контролирующими экспрессию, которые приводят к экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий белок, например антитело, такое как 1дО1, в упомянутой клетке.

В результате, (I) фермент(ы) КМЭ, Ρе^, ОТ§, СР8-Су8109§ег и/или СоГО. СоГО предпочтительно в сочетании с Со1С, и (II) интересующий белок(и), а именно перспективный гликопротеин(ы), например антитело, такое как Σ§01, экспрессируются в клетке позвоночных по настоящему изобретению.

Предпочтительно первый объект настоящего изобретения касается белка, который представляет собой антитело, фрагмент антитела, гибридный белок, вирусный белок, фрагмент вирусного белка, антиген или гормон. Наиболее предпочтительно антитело или фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из фС, предпочтительно Σ§01, ^02, ^СЗ, [804, I§М, фА, и I§Ε. Наиболее предпочтительно гибридный белок содержит Рс-область антитела, например Рс-область фС, такую как Рс-область фСЕ ^02, фСЗ, ^04, I§М, фА, или !дЕ. Наиболее предпочтительно гормон представляет собой фолликул-стимулирующий гормон (ФСГ), гонадотропный гормон, тиреотропный гормон, интерлейкин-2, ИЛб, интерлейкин-10, интерлейкин-11, растворимый интерлейкин-4, эритропоэтин или тромбопоэтин. Предпочтительно вирусный белок или фрагмент вирусного белка содержится в мембране оболочки оболочечного вируса. Особенно предпочтительно, чтобы вирусный белок являлся белком С или Р респираторно-синцитиального вируса и фрагмент вирусного белка был внеклеточным фрагментом упомянутого белка.

Дополнительный объект настоящего изобретения касается вируса, содержащего упомянутые вирусный белок или фрагмент вирусного белка.

Предпочтительно молекула, способная служить субстратом для фукозилтрансферазы, является ли- 1З 026336 пидом. Предпочтительно липид представляет собой глицерогликолипид, наиболее предпочтительно галактолипид, сульфолипид (8ЦЭО) или гликосфинголипиды, наиболее предпочтительно цереброзид (например, галактоцереброзид или гликоцереброзид), ганглиозид, глобозид, сульфатид или гликофосфосфинголипид. Особенно предпочтительно липид содержится в мембране оболочки оболочечного вируса.

Гликосфинголипид (О8Ь) является особенно предпочтительным. Гликосфинголипиды содержат гидрофобный церамидный якорь Ν-ацилсфингозин и гидрофильные головные группы, состоящие из сахаридов. Они обычно находятся на внешней поверхности клеточной мембраны. Композиция сахаридных фрагментов специфична в зависимости от типа клеток и зависит от стадии развития организма или может измениться с онкогенным состоянием клетки.

Наиболее предпочтительно вирусный белок и/или липид содержится в мембране оболочки оболочечного вируса.

Как уже упоминалось выше, белок может быть вирусным белком, который содержится в мембране оболочки оболочечного вируса. Липид также может быть липидом, содержащимся в мембране оболочки оболочечного вируса.

Дополнительный объект настоящего изобретения касается вируса, содержащего упомянутый липид.

Вышеупомянутый вирус может быть введен в клетку позвоночных путем вирусной инфекции. Вирус также может быть введен в клетку позвоночных введением нуклеиновых кислот, кодирующих весь вирус или часть вируса, который нужно продуцировать. В данном случае будет необходимо обеспечить белки, необходимые для репликации, сборки и т.д., это обычно достигается применением вирусных клеточных линий-продуцентов, способных экспрессировать один или несколько вирусных белков. Например, клетки НЕК293, Рег.С6 и АΟΕ1.НN экспрессируют белки аденовируса Е1А и являются, таким образом, способными дополнять ДНК, в которой отсутствуют кодирующие области Е1.

Предпочтительно клетка позвоночных представляет собой клетку млекопитающих, рыб, амфибий, рептилий или клетку птиц.

Особенно предпочтительно

I) клетка млекопитающих представляет собой клетку человека, хомячка, собаки или обезьяны, предпочтительно клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку почки африканских зеленых обезьян (Уего-76) (АТСС СКЬ-1587), человеческую клетку рака шейки матки (НеЬа) (АТСС ССЬ 2), собачью клетку почки линии Мабш ЭагЫп (МЭСК) (АТСС ССЬ 34), человеческую клетку РЕК.С6 (коммерческая клетка Сгисе11, ЬеМеп, ТНе №1Нег1апбк) или человеческую клетку (Ното кар1епк) ΛΟΕ1.ΗΝ (коммерческая клетка РгоВюОеп, ВегНп, Оегтапу);

II) клетка рыбы представляет собой клетку яичников (ССО) 1с1а1иги8 рипсйШк (канальный сом) (АТСС СКЬ-2772);

III) клетка амфибии представляет собой клетку почек Хепорик 1ае\ак (АТСС ССЬ-102);

IV) клетка рептилии представляет собой клетку сердца (ЦН-2) Циапа Циапа (АТСС ССЬ-108), или

V) птичья клетка представляет собой клетку сетчатки птиц АОЕ1.СК или АОЕТСКЫХ или птичьей сомитной клетки АОЕ1.С8 (все клетки получены из мускусной утки, Сатпа токсНа1а). Эти клеточные линии являются коммерчески доступными от РгоВюОеп АО.

Клеточная линия АОЕТСК.РкХ (17а11Ь) была депонирована в РгоВюОеп АО, Оое1Нек1г. 54, 13086 ВегНп, Оегтапу с Э8М2-Эеи1ксНе 8атт1ип§ уоп Мйгоогдатктеп ипб 2е11киНигеп ОтЬН, МаксНегобег Vед 1Ь, 38124 ВгаипксНгеЦ, Оегтапу 24 ноября 2005 г. под номером доступа Э8М АСС2749. Клеточная линия АОЕ1.НN ^С5Т11#34) была депонирована в РгоВюОеп АО, Оое1Нек1г. 54, 13086 ВегНп, Оегтапу с Э8М2-Эеи1ксНе 8атт1ип§ уоп М1кгоогдатктеп ипб 2е11киНигеп ОтЬН, МаксНегобег Vед 1Ь, 38124 ВгаипксНгеЦ, Оегтапу 4 ноября 2005 г. под номером доступа Э8М АСС2744. Клеточная линия АОЕТСК.РкХ (17а11Ь) происходит из эмбриональных клеток сетчатки мускусной утки (Сатпа токсНа1а). Клеточная линия АОЕ1.НN ^С5Т11#34) происходит из перивентрикулярной области нервной системы человеческого плода (Ното кар1епк). Обе клеточные линии поддерживаются стабильной интеграцией и экспрессией аденовирусных белков Е1А и Е1В.

Другая предпочтительная клетка позвоночных представляет собой птичью клетку ЕВ14, которая является коммерческой клеткой VIVΛ^I8 (Штек, Ргапсе). Другие предпочтительные клетки позвоночных приведены в следующей таблице.

- 14 026336

Таблица 1

КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ	НОМЕР ДЕПОНИРОВАНИЯ	ПРОИСХОЖДЕНИЕ
N80	ЕСАСС Νο. 85110503	Мышиная миелома
8р2/0-А§14	АТСС СКП-1581	Мышиная миелома
ВНК21	АТСС ССЬ-10	Почка детеныша хомячка
ВНК ТК -	ЕСАСС Νο. 85011423	Почка детеныша хомячка
НаК	АТСС ССЬ-15
2254-62.2 (производное ВНК-21)	АТСС СКЬ-8544	Почка детеныша хомячка
Дикий тип СНО	ЕСАСС 00102307	Яичник китайского хомячка; Сг1се1и1и$ §гкеи$
СНО-К1	АТСС ССЬ-61	Яичник китайского хомячка; СпсеЦЛиз §П5еиз
сно-оикх (соответствует СНО 4ик', (Ί !Ο·'4Ιιίτ’’’	АТСС СЕЬ-9096	Яичник китайского хомячка; Спсе(и1и$ £п$еи$
сно-оикхвп	АТСС СКГ-9010	Яичник китайского хомячка; Сг1се(и1из ^ΐ'ίιειιχ
СНО-ОО44	не депонировано в АТСС (№1аиЬ е1 а1., 1983)	Яичник китайского хомячка; Сг1се{и!и$
СНО Рго-5	АТСС СЕЛ-1781	Яичник китайского хомячка; Сггсе1и1из £гйеи5
У79	АТСС ССС-93
В14АР28-ОЗ	АТСС СС 1,-14
НЕК 293	АТСС СКЬ-1573	Почка человеческого эмбриона
СО8-7	АТСС СКВ-1651
игбб	АТСС ΤΙΒ-196
ΗιιΝδΙ	АТСС СКЕ-8644
снь	ЕСАСС Νο. 87111906

Клетки позвоночных природно не содержат гликозилтрансферазу для 0ПР-Э-рамнозы, 0ΌΡ-Όперозамина, 0ПР-дезокси-0-талозы, 0ПР-6-дезокси-0-альтрозы, 0ПР-4-кето-3,6-дидезокси-Э-маннозы или 0ОР-Ь-колитозы, так как упомянутые сахара обычно не синтезируются или не присутствуют в клетках позвоночных. Таким образом, даже если искусственные сахара 0ПР-Э-рамноза, 0ПР-Э-перозамин, 0ПР-дезокси-Э-талоза, 0ПР-6-дезокси-Э-альтроза, 0ОР-4-кето-3,6-дидезокси-П-манноза или 0ОР-Ьколитоза производятся неприродно в клетках позвоночных в соответствии с первым объектом настоящего изобретения, они не могут быть включены в образующиеся гликоструктуры белков и липидов.

Авторы настоящего изобретения, однако, неожиданно обнаружили, что искусственные сахара 0ЭРΌ-рамноза, 0ПР-Э-перозамин, 0ПР-дезокси-Э-талоза, 0ПР-6-дезокси-Э-альтроза, 0ОР-4-кето-3,6дидезокси-О-манноза или 0ОР-Ь-колитоза могут быть интегрированы в гликановые структуры белков и липидов при условии, что соответствующая гетерологичная гликозилтрансфераза и необязательно соответствующий гетерологичный транспортер нуклеотидного сахара 0ОР-дезоксигексозы также присутствует(ют) в клетке позвоночных.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления клетка позвоночных в соответствии с первым объектом настоящего изобретения дополнительно содержит по меньшей мере одну гликозилтрансферазу для 0ОР-П-рамнозы, 0ОР-П-перозамина, 0ВР-дезокси-Э-талозы, 0ЭР-6-дезокси-Эальтрозы, 0ПР-4-кето-3,6-дидезокси-Э-маннозы или 0ПР-Ь-колитозы, предпочтительно кодируемую нуклеиновой кислотой, содержащейся в клетке позвоночных и функционально связанной со специфическими последовательностями контроля экспрессии из позвоночных, которые позволяют экспрессию упомянутой последовательности нуклеиновой кислоты, и необязательно, по меньшей мере, один транспортер нуклеотидного сахара 0ОР-дезоксигексозы для 0ОР-П-рамнозы, 0ПР-Э-перозамина, 0ЭРдезокси-О-талозы, 0ПР-6-дезокси-0-альтрозы, 0ПР-4-кето-3,6-дидезокси-Э-маннозы или 0ОР-Ь- 15 026336 колитозы, предпочтительно кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащейся в клетке позвоночных и функционально связанной со специфическими последовательностями контроля экспрессии из позвоночных, которые позволяют экспрессию упомянутой последовательности нуклеиновой кислоты. В более предпочтительном варианте осуществления клетка позвоночных в соответствии с первым объектом настоящего изобретения дополнительно содержат гликозилтрансферазу для СЭР-О-рамнозы, СЭР-Эперозамина и/или СЭР-б-дезокси-О-альтрозы.

Особенно предпочтительно, что две или более, например 2, 3, 4, 5, б или 7, вышеупомянутых гликозилтрансфераз и необязательно два или более, например 2, 3, 4, 5, б или 7, вышеупомянутого транспортера нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы присутствуют в клетке позвоночных, например в эукариотической клетке.

Подходящие системы для временной или стабильной экспрессии таких нуклеиновых кислот известны специалисту в данной области, и предпочтительные системы описаны выше и могут аналогичным образом применяться в контексте экспрессии гликозилтрансферазы и необязательно транспортера нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы.

Предпочтительно гликозилтрансфераза для СЭР-Э-рамнозы, СОР-Э-перозамина, СЭР-дезокси-Эталозы, СЭР-б-дезокси-О-альтрозы, СПР-4-кето-3,б-дидезокси-О-маннозы или СЭР-Ь-колитозы рекомбинантно экспрессируется в клетке позвоночных. Гликозилтрансфераза для СЭР-О-рамнозы, СЭР-Эперозамина, СЭР-дезокси-О-талозы, СЭР-б-дезокси-О-альтрозы, СПР-4-кето-3,б-дидезокси-О-маннозы или СЭР-Ь-колитозы может быть экспрессирована из последовательности нуклеиновой кислоты, временно присутствующей или стабильно поддерживаемой в клетке позвоночных. Предпочтительно также, что вышеупомянутый транспортер нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы рекомбинантно экспрессируется в клетке позвоночных. Упомянутый транспортер нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы может быть экспрессирован из последовательности нуклеиновой кислоты, временно присутствующей или стабильно поддерживаемой в клетке позвоночных.

Таким образом, в другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка позвоночных содержит:

(Ι) по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент СПР-б-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозоредуктазу (ΡΜΌ), СЭР-Эперозаминсинтетазу (Рег), СЭР-б-дезокси-Э-талозосинтетазу (СТ§), мутант СЭР-фукозосинтетазы Су8109§ег (СР8-Су8109§ег), СЭР-4-кето-б-дезоксиманнозо-3-дегидратазу (СоГО) или СЭР-Ьколитозосинтазу (Со1С), функционально связанную со специфическими последовательностями позвоночных, контролирующими экспрессию, (ΙΙ) по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, а именно перспективный гликопротеин, например антитело, такое как 1дС1, функционально связанную со специфическими последовательностями позвоночных, контролирующими экспрессию, которые позволяют экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый белок в упомянутой клетке, (ΙΙΙ) по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гликозилтрансферазу для СЭР-Э-рамнозы, СЭРГО-перозамина, СОР-дезоксиГО-талозы, СЭР-б-дезоксиГО-альтрозы, СОР-4-кето-3,б-дидезокси-0-маннозы или СЭР-Ь-колитозы, функционально связанную со специфическими последовательностями позвоночных, контролирующими экспрессию, которые позволяют экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый белок в упомянутой клетке, и необязательно (IV) по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспортер нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы для СЭРГО-рамнозы, СЭР-Эперозамина, СЭР-дезоксиГО-талозы, СЭР-б-дезоксиГО-альтрозы СОР-4-кето-3,б-дидезокси-0-маннозы или СЭР-Ь-колитозы, функционально связанную со специфическими последовательностями позвоночных, контролирующими экспрессию, которые позволяют экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый белок в упомянутой клетке.

В результате (Ι) фермент(ы), (ΙΙ), интересующий белок(и), (ΙΙΙ) гликозилтрансфераза(ы) и необязательно (IV) транспортер нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы гиперэкспрессируются в клетке позвоночных по настоящему изобретению.

Упомянутый белок(и) дополнительно модифицируется коэкспрессированной гликозилтрансферазой(ами), которая использует(ют) конечный(е) продукт(ы) фермента(ов), а именно СЭР-Э-рамнозу, СЭРΌ-перозамин, СЭР-дезокси-Э-талозу, СЭР-б-дезокси-О-альтрозу, СЭР-4-кето-3,б-дидезокси-О-маннозу и/или СЭР-Ь-колитозу, и интегрирует их в гликоструктуры белка(ов), которые не содержат фукозу или содержат сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах. Это приводит к образованию нового искусственного белка(ов), который содержит(ат) Ό-рамнозу, Ό-перозамин, дезокси-О-талозу, б-дезоксиΌ-альтрозу, 4-кето-3,б-дидезокси-О-маннозу и/или Ь-колитозу в гликановых фрагментах.

Предпочтительно вышеупомянутые транспортеры нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы представляют собой транспортеры нуклеотидного сахара СПР-дезоксигексозы комплекса Гольджи, а именно транспортеры, которые позволяют перенос вышеупомянутых нуклеотидных сахаров через мем- 1б 026336 брану комплекса Гольджи клетки позвоночных, например эукариотической клетки.

(Модифицированная) клетка позвоночных в соответствии с настоящим изобретением может быть использована для продуцирования оболочечных вирусов, содержащих гликопротеины и гликолипиды на поверхности оболочки, не имеющие фукозы в гликановых фрагментах или со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах.

Предпочтительно оболочечный вирус используют полностью или частично в качестве активного компонента вирусной вакцины. Термин вирусная вакцина означает подготовку ослабленного или убитого вируса, который при введении стимулирует выработку антител или клеточный иммунитет против вируса, но не в состоянии вызывать тяжелые инфекции.

(Модифицированная) клетка позвоночных в соответствии с настоящим изобретением может быть использована для продуцирования оболочечных вирусов, содержащих гликопротеины и гликолипиды на поверхности оболочки, которые содержат Ό-рамнозу. Ό-перозамин, дезокси-О-талозу, 6-дезокси-Эальтрозу, 4-кето-3,6-дидезокси-О-маннозу и/или Ь-колитозу в гликановых фрагментах.

Второй объект настоящего изобретения касается способа продуцирования молекулы, природно содержащей фукозу в гликановых фрагментах, которая не содержит фукозу или содержит сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах, содержащий следующие стадии:

I) предоставление клетки позвоночных в соответствии с первым объектом,

II) выделение молекулы, которая способна служить субстратом для фукозилтрансферазы, предпочтительно белок или липид, из клетки в I).

Предпочтительно во время стадии I) молекула, которая способна служить субстратом для фукозилтрансферазы, например белок, экспрессируется в клетке I).

Упомянутые молекулы, например белки или липиды, не содержащие фукозу или со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах, можно легко выделить на стадии II) из клетки позвоночных.

Различные процедуры изоляции известны в данной области для молекул, заключенных в эукариотических клетках (например, клетках позвоночных) или секретируемых из таких клеток, содержащих модифицированные молекулы, например белки, не содержащие фукозу или со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах. Такие способы обычно включают в себя сбор клеток, разрушение и фракционирование/очистку в случае внутриклеточных молекул и получение бесклеточного супернатанта культуры с последующей очисткой секретируемых молекул.

Процедура экстракции, которая будет полезна в соответствии с изобретением, не мешает модифицированным молекулам, которые нужно выделить. Например, экстракцию предпочтительно проводят в отсутствие сильных детергентов и восстановителей или любого агента, который может вызвать денатурацию белка.

Третий объект настоящего изобретения относится к молекуле, не содержащей фукозу или со сниженным количеством фукозы в гликановых фрагментах, получаемой способом второго объекта. Предпочтительно данная молекула является липидом или белком.

Особенно предпочтительно, что белок представляет собой антитело, гормон, антиген или вирусный белок, как указано выше в отношении первого объекта.

Особенно предпочтительно, что липид представляет собой глицерогликолипид, наиболее предпочтительно галактолипид, сульфолипид (5>ΟΌ0) или гликосфинголипиды, наиболее предпочтительно цереброзид (например, галактоцереброзид или гликоцереброзид), ганглиозид, глобозид, сульфатид или гликофосфосфинголипид. Предпочтительно липид, например ганглиозид, содержится в мембране оболочечного вируса.

Наиболее предпочтительно вирусный белок и/или липид содержатся в оболочке оболочечного вируса.

Дополнительный объект настоящего изобретения относится к композиции молекул в соответствии с третьим объектом.

Четвертый объект настоящего изобретения относится к молекуле, содержащей гликановые фрагменты, содержащие Ό-рамнозу, Ό-перозамин, дезокси-О-талозу, 6-дезокси-Э-альтрозу, 4-кето-3,6дидезокси-О-маннозу и/или Ь-колитозу, получаемые способом по второму объекту.

Предпочтительно данная молекула не содержит Ь-фукозу или содержит сниженное количество Ьфукозы в гликановых фрагментах. Предпочтительно данная молекула является липидом или белком. Дополнительно предоставлены клетки позвоночных, преимущественно опухолевые клетки, которые экспрессируют такие модифицированные молекулы, предпочтительно липиды и/или белки. Наиболее предпочтительными являются опухолевые клетки, содержащие гликаны, содержащие Ό-рамнозу. Ό-рамноза является строительным блоком полисахаридов Оапобегта 1исМит. Данные полисахариды, которые используют в традиционной китайской медицине для повышения активности иммунологических эффекторных клеток: ΝΚ-клетки и лимфокин-активированные клетки-киллеры активируются, и фагоцитоз и цитотоксичность макрофагов увеличиваются (Ζΐη.ι е! а1., 2007, 1оигпа1 о£ Е1ЬпорЬагтасо1оду 111 (2). 219226). Такие клетки могут быть применены для повышения иммунного ответа против данной опухолевой клетки, например, как в способе активной иммунизации.

- 17 026336

Дополнительный объект настоящего изобретения относится к композиции молекул в соответствии с четвертым объектом.

Пятый объект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей гликопротеины, которые содержат:

I) от 70 до 95%, то есть 70, 71, 72, 73, 74, 75, 7б, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8б, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 и 95%, предпочтительно 80% 00-01οΝΑο, О0, О1 и/или О2 Ν-гликанов комплексного типа, и

II) от 5 до 30%, то есть 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1б, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 2б, 27, 28, 29 и 30%, предпочтительно 20% Ν-гликанов высокоманнозного типа, причем Ν-гликаны комплексного типа гликопротеинов не содержат фукозу или в значительной степени не содержат фукозы. Предпочтительно гликопротеины композиции являются указанными выше предпочтительными гликопротеинами, в частности антителами.

Особенно предпочтительно, что в композиции Ν-гликаны комплексного типа составляют от 70 до 80%, предпочтительно около 75% О0 и от 20 до 30%, предпочтительно около 25% 00-01οΝΑο, О1 и/или О2 Ν-гликанов комплексного типа, и/или что Ν-гликаны высокоманнозного типа составляют от 45 до 55%, предпочтительно около 50% гликанов тап5 и от 45 до 55%, предпочтительно около 50% Νгликанов тап_б, тап₇ и/или тап₈. Понятно, что в каждом случае цифры суммируют до 100%.

Также особенно предпочтительно, что в композиции Ν-гликаны комплексного типа составляют от 70 до 90%, предпочтительно около 80% О0 и от 10 до 30%, предпочтительно около 20% 00-01οΝΑο, О1 и/или О2 Ν-гликанов комплексного типа, и/или что Ν-гликаны высокоманнозного типа составляют от б0 до 85%, предпочтительно около 70% гликанов тап₅ и от 15 до 40%, предпочтительно около 30% Ν- гликанов тапб, тап₇ и/или тап₈. Понятно, что цифры в каждом случае суммируют до 100%.

Гликопротеины предпочтительно являются гликопротеинами, которые указаны в качестве предпочтигельных в связи с первым объектом изобретения, в частности, антитела, например 1дО1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4, причем данные антитела предпочтительно имеют более высокую АОСС-активность, чем композиция антител, продуцируемых в родительской, немодифицированной клетке (например, эукариотическая клетка, такие как клетка позвоночных).

АОСС является доминирующим механизмом, посредством которого антитела, направленные против опухолевых (раковых) клеток, проявляют свое действие. АОСС также может быть применен для устранения специфических иммунных клеток, чтобы прервать патогенез аутоиммунных заболеваний.

Различные заболевания, в том числе вирусные и бактериальные инфекции можно предотвратить и лечить, подавляя пролиферацию клеток, инфицированных вирусом или бактерией, с помощью антител с высокой АОСС-активностью согласно настоящему изобретению.

Шестой объект настоящего изобретения относится к белку, предпочтительно непрокариотическому белку, предпочтительно вирусному белку или белку млекопитающих, или к липиду, предпочтительно непрокариотическому липиду, например гликосфинголипиду, который содержит гликановые фрагменты, содержащие Ό-рамнозу, Ό-перозамин, дезокси-О-талозу, б-дезокси-О-альтрозу, 4-кето-3,б-дидезокси-Оманнозу и/или Ь-колитозу. Предпочтительно вирусный белок и/или липид содержатся в оболочке оболочечного вируса. Альтернативно, предоставляют эукариотические, предпочтительно позвоночных, более предпочтительно млекопитающих и наиболее предпочтительно человеческие клетки (аллогенные или аутологичные опухолевые клетки), содержащие такие белки и/или липиды.

Предпочтительно белок или липид содержит в гликановых фрагментах Ό-рамнозу, Ό-перозамин, дезокси-О-талозу, б-дезокси-О-альтрозу, 4-кето-3,б-дидезокси-О-маннозу и/или Ь-колитозу, более предпочтительно Ό-рамнозу и/или Ό-перозамин, не содержит фукозу или содержит сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах. Ясно, что белки шестого объекта также могут обладать всеми свойствами, которые являются следствием применения предпочтительных и особенно предпочтительных объектов способов по настоящему изобретению.

Известно, что искусственные сахара, такие как Ό-рамноза, Ό-перозамин, дезокси-О-талоза, бдезокси-О-альтроза, 4-кето-3,б-дидезокси-О-манноза и/или Ь-колитоза, оказывают сопротивление катионным пептидам, например полимиксину В, дефензинам и т.д., например, нейтрализацией заряда на бактериальной поверхности (см. Вгеа/еа1е е1 а1., 2003, ТНе 1оигпа1 оГ Вю1одюа1 СНетЮгу, 278, 24731-24739).

Дефензины представляют собой небольшие цистеин-богатые катионные белки, найденный, например, у эукариот (например, позвоночных). Они активны в отношении бактерий, грибков и многих оболочечных и необолочечных вирусов. Они состоят из 18-45 аминокислот, включая в себя от б (у позвоночных) до 8 консервативных остатков цистеина. Эукариотические (например, позвоночных) клетки иммунной системы содержат данные пептиды, например, в нейтрофильных гранулоцитах и почти всех эпителиальных клетках, чтобы помочь в уничтожении фагоцитированных бактерий.

Таким образом, создание оболочечных вирусов, содержащих вирусные белки, содержащие Όрамнозу, Ό-перозамин, дезокси-О-талозу, б-дезокси-О-альтрозу, 4-кето-3,б-дидезокси-О-маннозу и/или Ь-колитозу, предпочтительно катионный аминосахар Ό-перозамин, на гликановых фрагментах является очень полезным, например, в генной терапии в качестве векторов, так как данные вирусы были бы устойчивы к атакам дефензинов и других катионных пептидов врожденной иммунной защиты. Производство вирусов или гликопротеинов, содержащих один или более сахарных остатков Ό-рамнозы, Ό- 18 026336 перозамина, дезоксиЮ-талозы, 6-дезоксиЮ-альтрозы, 4-кето-3,6-дидезоксиЮ-маннозы и/или Ьколитозы в гликановых фрагментах, было бы очень полезно, чтобы вызвать первичный иммунный ответ. Данные углеводные остатки природно не присутствуют на гликопротеинах млекопитающих. Однако они часто встречаются на гликопротеинах и липополисахаридах бактерий. Например, последовательность ΚΜΟ происходит из бактерии Ркеиботопак аегидшока, которая является одним из наиболее важных бактериальных патогенов, с которыми сталкиваются хозяева с ослабленным иммунитетом и пациенты с муковисцидозом (ΜΒ).

Особенно желательным является создание белков, содержащих сахарный остаток Ό-перозамин или оболочечных вирусов, содержащих вирусные белки, содержащие сахарный остаток Ό-перозамин, в связи с катионностью Ό-перозамина. Вирус, который содержит в оболочке гликопротеины, содержащие сахарный остаток Ό-перозамин, имеет катионный поверхностный заряд, который может защитить упомянутый вируса от врожденной иммунной защиты.

Седьмой объект настоящего изобретения относится к единице экспрессии, которая содержит одну или более последовательностей позвоночных, контролирующих экспрессию, функционально связанных с (первым) полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, который применяет ООР-6-дезокси-0-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, причем фермент не катализирует реакцию, которая преобразует СОР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в СОР-Ь-фукозу.

Единицей экспрессии может быть любая система экспрессии, известная специалисту в данной области, в которой одна или более последовательностей позвоночных, контролирующих экспрессию, и (первый) полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, который применяет СОР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, могут быть объединены, например, в плазмиде, космиде, вирусе и т.д.

Предпочтительно одна или более последовательностей позвоночных, контролирующих экспрессию, которые содержатся в единице экспрессии, функционально связаны с (первым) полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, который применяет СОР6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, чтобы позволить экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, который применяет СОР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, в клетке позвоночных, например клетке СНО или НеЬа.

Предпочтительно вектор экспрессии, например плазмидный вектор, позволяет временную экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, который применяет СОР-6дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, в цитоплазме клетки позвоночных или позволяет стабильную экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, который применяет СОР-6-дезокси-0-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, в клетке позвоночных после интеграции упомянутой последовательности в геном упомянутой клетки.

Особенно предпочтительно фермент, который применяет СОР-6-дезокси-0-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, выбирают из группы, состоящей из ООР-6-дезоксиЮ-ликсо-4-гексулозоредуктазы (ΚΜΌ), СОРЮ-перозаминсинтетазы (Рег), СОР-6-дезокси-0-талозосинтетазы (СТ8), мутанта Су§1098ег (СР8-Су51098ег) СОР-фукозосинтетазы, СОР-4-кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратазы (СоЮ), предпочтительно СОР-4-кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратазы (СоЮ) в сочетании с СОР-Ь-колитозосинтазой (Со1С) и их вариантов.

Предпочтительно единица экспрессии дополнительно содержит (второй) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гликозилтрансферазу для СОРЮ-рамнозы, СОРЮ-перозамина, СОР-дезоксиЮ-талозы, СОР-6-дезоксиЮ-альтрозы, СОР-4-кето-3,6-дидезоксиЮманнозы или СОР-Ь-колитозы, предпочтительно функционально связанную с одним или несколькими элементами, контролирующими экспрессию позвоночных, например, с промотором, и предпочтительно содержащийся в векторе экспрессии, например плазмидном векторе, чтобы позволить экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутую гликозилтрансферазу в клетке позвоночных, например в клетке СНО, клетке НеЬа или опухолевой клетке, предпочтительно аутологичной опухолевой клетке, и необязательно (третий) полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспортер нуклеотидного сахара СОР-дезоксигексозы для СОРЮ-рамнозы, СОРЮ-перозамина, СОР-6-дезоксиЮ-талозы, СОР-6-дезоксиЮ-алырозы, СОР-4-кето-3,6-дидезоксиЮманнозы или СОР-Ь-колитозы, предпочтительно функционально связанную с одним или несколькими элементами, контролирующими экспрессию позвоночных, например, с промотором, и предпочтительно содержащийся в векторе экспрессии, например плазмидном векторе, чтобы позволить экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый транспортер нуклеотидного сахара СОРдезоксигексозы в клетке позвоночных, например в клетке СНО, клетке НеЬа или опухолевой клетке, предпочтительно аутологичной опухолевой клетке.

Упомянутые первый, второй и необязательно третий полинуклеотиды могут быть интегрированы отдельно в векторы экспрессии, например векторы временной экспрессии или векторы, которые интегрируются в геном клетки. Альтернативно, упомянутые первый, второй и необязательно третий полинуклеотиды могут находиться в одном векторе экспрессии. Экспрессия может управляться одним промотором, двумя промоторами или тремя промоторами. В первом случае предпочтительно, что белки, коди- 19 026336 руемые первым, вторым и необязательно третьим полинуклеотидом, транскрибируются как единый транскрипт и разделяются только последовательностью 1КЕ8.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения единица экспрессии содержит одну или несколько последовательностей позвоночных, контролирующих экспрессию, функционально связанных с первым полинуклеотидом, содержащем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент КМЭ, одну или несколько последовательностей позвоночных, контролирующих экспрессию, функционально связанных с вторым полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гликозилтрансферазу для СОР-Э-рамнозы, и необязательно одну или несколько последовательностей позвоночных, контролирующих экспрессию, функционально связанных с третьим полинуклеотидом, содержащем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспортер нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы для СОР-О-рамнозы, которая предпочтительно содержится в одном векторе экспрессии, в двух векторах экспрессии, или в трех векторах экспрессии соответственно.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения единица экспрессии содержит одну или несколько последовательностей позвоночных, контролирующих экспрессию, которые контролируют экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент КМЭ, содержащейся в первом полинуклеотиде, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу для СОР-Э-рамнозы, содержащейся во втором полинуклеотиде, и необязательно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транспортер нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы для СОР-Э-рамнозы в третьем полинуклеотиде, причем первый, второй и необязательно третий полинуклеотиды отделены друг от друга последовательностью 1КЕ8, предпочтительно содержащейся в векторе экспрессии.

Единица экспрессии в соответствии с седьмым объектом данного изобретения также может быть использована в медицине, в частности в подготовке вакцины для лечения или профилактики заболеваний, получающих пользу от иммунной стимуляции, в частности опухолей.

Дополнительно в контексте седьмого объекта все дополнительно предпочтительные и особенно предпочтительные варианты осуществления первого объекта изобретения, в частности, связанные с полинуклеотидами, содержащими различные нуклеиновые кислоты, которые будут экспрессированы, элементы контроля экспрессии, например, управление умеренной или низкой экспрессией фермента, который использует СОР-6-дезокси-0-ликсо-4-гексулозу, одинаково предпочтительны в контексте седьмого объекта.

Во многих случаях биофармацевтическими компаниями было затрачено значительное время и были направлены огромные усилия на создание и развитие эффективных фармацевтических клеточных линийпродуцентов, которые экспрессируют интересующий трансген на желательных уровнях. В случаях, когда интересующий трансген представляет собой терапевтическое антитело, которое может выиграть от расширения эффекторной функции АЭЭС, очень желательно дополнительно управлять клеточной линиейпродуцентом таким образом, чтобы клетка-продуцент с высокой продукцией была не в состоянии присоединить фукозу кора к Ν-гликановым фрагментам или была в состоянии присоединить искусственные сахара к Ν-гликановым фрагментам.

Предпочтительно, как уже говорилось выше, единица экспрессии дополнительно содержит второй полинуклеотида, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гликозилтрансферазу для СОР-Э-рамнозы, СОРГО-перозамина, СОР-дезокси-Э-талозы, СЭР-6-дезокси-6-Эальтрозы, СПР-4-кето-3,6-дидезокси-О-маннозы или СЭР-Б-колитозы и необязательно третий полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспортер нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы для СОР-О-рамнозы, СОР-Э-перозамина, СОР-дезокси-О-талозы, СОР-6-дезокси-6-0-альтрозы, СПР-4-кето-3,6-дидезокси-О-маннозы или СОР-Б-колитозы. Предпочтительно, что второй полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гликозилтрансферазу для СОР-Э-рамнозы, СОР-Э-перозамина, СЭР-дезокси-Э-талозы. СЭР-6дезокси-6-Э-альтрозы, СПР-4-кето-3,6-дидезокси-О-маннозы или СОР-Б-колитозы, функционально связан с одной или несколькими последовательностями позвоночных, контролирующими экспрессию, чтобы позволить экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутую гликозилтрансферазу, в клетке позвоночных, например клетке СНО или НеБа. Предпочтительно также, что третий полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транспортер нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы для СОР-Э-рамнозы, СОРГО-перозамина, СЭРдезокси-О-талозы, СОР-6-дезокси-6-0-альтрозы, СПР-4-кето-3,6-дидезокси-О-маннозы или СЭР-Бколитозы, функционально связан с одной или несколькими последовательностями позвоночных, контролирующими экспрессию, чтобы позволить экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый транспортер нуклеотидного сахара СЭР-дезоксигексозы в клетке позвоночных, например клетке СНО или НеБа.

Отношение экспрессии различных последовательностей нуклеиновой кислоты друг к другу зависит как от количества копий, так и от сайта интеграции в геноме клетки позвоночных. С помощью стандартных процессов скрининга возможно выделить клеточные клоны, которые экспрессируют индивидуальные продукты гена в нужном соотношении.

- 20 026336

Упомянутую предпочтительную единицу экспрессии можно легко применить к уже существующим клеточным линиям (например, СНО, НсЬа) таким образом, чтобы сделать их способными присоединять вместо фукозы другие искусственные сахара (например, Ό-рамнозу, Ό-перозамин, дезокси-О-талозу или 6-дезокси-Э-альтрозу) к образующимся гликоструктурам гликопротеинов и гликолипидов. Данную единицу экспрессии также можно легко применить к уже генетически модифицированным клеточным линиям (например, !дО1 СНО) таким образом, чтобы сделать их способными присоединять вместо фукозы другие искусственные сахара (например, Ό-рамнозу) к образующимся гликоструктурам гликопротеинов, например, для того, чтобы продуцировать антитела, имеющие искусственную структуру гликозилирования, такие как !дО1/+ Ό-рамноза.

Предпочтительно единица экспрессии содержит дополнительный полинуклеотид (второй, третий или четвертый полинуклеотид), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую интересующий белок, например !дО1. Предпочтительно, что дополнительный полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую интересующий белок, например фОЕ функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию, позволяя экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый белок в клетке позвоночных, например клетке СНО или НсЬа.

Применительно к единице экспрессии седьмого объекта настоящего изобретения все элементы, предпочтительно нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент, элементы контроля экспрессии, нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент, который применяет ООР-6-дезокси-0-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, и при этом фермент не катализирует реакцию, которая преобразует ООР-6-дезокси-Оликсо-4-гексулозу в ООР-Ь-фукозу, изложенные в первом и втором объекте изобретения, являются аналогично предпочтительными.

Восьмой объект настоящего изобретения относится к (модифицированной) эукариотической клетке для производства белка, обычно содержащего фукозу в гликановых фрагментах, который не содержит фукозу или содержит сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах, содержащей:

I) первый полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, который применяет ООР-6-дезокси-0-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, и

II) второй полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, причем фермент не катализирует реакцию, которая преобразует ООР-6-дезокси-0-ликсо-4гексулозу в ООР-Ь-фукозу.

Применительно к эукариотической клетке все предпочтительные и особенно предпочтительные варианты осуществления, описанные ранее применительно к клетке позвоночных первого объекта изобретения, являются аналогично предпочтительными.

Предпочтительно эукариотическая клетка является клеткой позвоночных, например млекопитающих, рыб, амфибий, клеткой рептилий или птичьей клеткой, предпочтительно, как указано выше в отношении первого объекта изобретения, или клеткой насекомых. Клетки насекомых, например клетки 8Г9 или Ш5, применяемые в сочетании с системой экспрессии бакуловируса, являются предпочтительными для продуцирования гликопротеинов из-за высокой урожайности и скорости. Однако гликопротеины из клеток насекомых могут содержать коровую а-1,3-фукозу. Основной вклад в действие антител против гликопротеинов, происходящих из насекомых, в частности антител !дЕ, распространяется на данный остаток сахара. Они лежат в основе аллергических реакций на гликопротеины насекомых.

Клетки насекомых, содержащие по меньшей мере один фермент, который применяет ОЭР-6дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, причем фермент не катализирует реакцию, которая преобразует ООР-6-дезокси-0-ликсо-4-гексулозу в ООР-Ь-фукозу, не будут содержать фукозу или содержат сниженное количество фукозы в гликанах. Это позволит уменьшить или устранить аллергические реакции на такие гликопротеины.

Вышеупомянутая (модифицированная) эукариотическая клетка также может содержать более чем один полинуклеотид, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, который применяет ОЭР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата, например, полинуклеотиды, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих различные ферменты, которые используют ОЭР-6-дезокси-О-ликсо-4-гексулозу в качестве субстрата (см. первый объект настоящего изобретения).

Девятый объект настоящего изобретения относится к способу получения белка, обычно содержащего фукозу в гликановых фрагментах, который не содержит фукозу или содержит сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах, содержащему следующие стадии:

I) предоставление эукариотической клетки в соответствии с восьмым объектом,

II) экспрессия фермента, кодируемого первым полинуклеотидом, и белка, кодируемого вторым полинуклеотидом, в упомянутой клетке,

III) выделение белка из упомянутой клетки.

В рамках способа с использованием эукариотической клетки по настоящему изобретению все предпочтительные и особенно предпочтительные варианты осуществления, описанные ранее применительно

- 21 026336 к клетке позвоночных первого объекта изобретения, и способ второго объекта настоящего изобретения являются аналогично предпочтительными в связи с девятым объектом изобретения.

Десятый объект настоящего изобретения относится к белкам, которые не содержат фукозу или содержат сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах, получаемых способом девятого объекта.

Различные модификации и изменения настоящего изобретения будут очевидны для специалиста в данной области, не выходя из сферы действия изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных режимов для выполнения изобретения, которые очевидны специалистам в данной области техники в соответствующих областях, предполагается охватить настоящим изобретением.

Следующие фигуры и примеры являются лишь иллюстрацией настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие объем изобретения, как это указано прилагаемой формулой изобретения в любом случае.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан общий вид реутилизационного и бе поуо путей синтеза фукозы в эукариотических клетках (например, клетках позвоночных). В отсутствие фукозы клетки не могут синтезировать СЭР-фукозу через реутилизационный путь (см. правую панель). Путь синтеза бе поуо может быть заблокирован ферментативным превращением промежуточного продукта СОР-4-кето-6-дезоксиманнозы в тупиковый продукт, который обычно не встречается в клетках позвоночных (левая панель). Если отклоняющим ферментом является, например, КМЭ, то тупиковым продуктом является СОР-Э-рамноза. СЭРдезоксигексозы, такие как СОР-Э-рамноза, могут вызывать ингибирование обратной связи фермента СМЭ, тем самым в дальнейшем блокируя путь синтеза бе поуо фукозы, а также альтернативный синтез СОР-рамнозы.

На фиг. 2 показана СРР-флуоресценция клеток КМО-СНОЛдС, которые стабильно гиперэкспрессируют трансген КМО.

На фиг. 3 показан ОТ ПЦР-анализ клонов, экспрессирующих КМЭ-трансген. Линия М соответствует ВР-ДНК-маркеру, линия 1: клон 1 РМО-СНОЛдС, линия 2: клон 2 РМО-СНОЛдС, линия 3: клон 3 РМО-СНОЛдС, линия 4: клон 4 РМО-СНОЛдС; линия 5: клон 5 РМО-СНОЛдС; линия 6: клон 6 РМОСНОЛдС; линия 7: родительский клон СНОЛдС, линия 8: отрицательный контроль ПЦР. Полоса РМО видна во всех РМО-трансфицированных клонах.

На фиг. 4 показано синоптическое сравнение профилей МАЬО! М§ перметилированных Νгликанов, высвобожденных из ЦС1 клеток СНОЛдС (В) и РМО-СНОЛдС (А). Рс-области антител олигосахаридов, высвобожденные перевариванием РNСа8е Р, были проанализировали с помощью массспектрометра иИтаИех III ТОР/ТОР, оснащенного лазером §тат1Веат-П™. Пики значения т/ζ соответствуют натрий-связанному иону олигосахарида. Все меченые молекулярные ионные сигналы |Μ+Ν;·ι|+, могут быть переданы как аннотированные. Равный 164 Да сдвиг основных ιη/ζ-пиков в МАЬООспектре, показанный на панели А, указывает на потерю фукозы. Схематическая структура олигосахаридов каждого пика показана над каждым аннотированным пиком. Ν-гликоструктуры, полученные из терапевтического антитела ШСЕ экспрессированного в клетках РМО-СНОЛдС, которые стабильно гиперэкспрессируют трансген РМО, полностью лишены присоединенных остатков фукозы и содержат сравнительно большое количество высокоманнозных структур, базируясь на относительных интенсивностях МАЬОО пика (панель А, известные высокоманнозные структуры обведены в кружок), тогда как Νгликоструктуры, полученные из терапевтического антитела ЦСЕ экспрессированного в неизмененных родительских клетках СНОЛдС, имеют фукозилированный кор и содержат значительно меньшее количество высокоманнозных структур. (Остатки фукозы соответствуют обведенным в кружок черным треугольникам, панель В).

На фиг. 5 показаны спектры МАЬОНТОР десиалированных ЦС Ν-гликанов, полученные с использованием (А) \УТ клеток дикого типа СНО, (В) клона Н1 клеток РМО-СНО (С) клона Н2 клеток РМОСНО, (Ό) клона Н3 клеток РМО-СНО. Все молекулярные ионы присутствуют либо в натриевой [М + Ν;·ι'| или калиевой [М + К+] форме (черный крест). Темный серый круг соответствует Мап; светлый серый круг соответствует Са1; черный квадрат соответствует С1сNАс; черный треугольник соответствует Рис; белый крест, не содержит углеводного материала.

На фиг. 6 показаны в (А) кривые связывания РсдРШа-Н18 (РНе158) с \УТ ЦС клеток дикого типа и афукозилированным ЦС в отсутствие плазмы. РсуРШа-связывание было детектировано ИФА с использованием РсуРШа в качестве реагента для захвата, конъюгированное с пероксидазой античеловеческого антитела ЦС в качестве реагента обнаружения и тетраметилбензидин (ТМБ) в качестве хромогенного субстрата. Числа показывают среднее поглощение пероксидазы, прореагировавшей с ТМБ при 450 нм, п равно 2. Полосы показывают 8Ό. Светлые кружки соответствуют фукозилированному ЦС клеток дикого типа (^Т), черные кружки соответствуют афукозилированному ЦС, полученному из клона Н1 (Н1); черные квадраты соответствуют афукозилированному ЦС, полученному из клона Н2 (Н2), направленные

- 22 026336 вверх черные треугольники соответствуют афукозилированному фС, полученному из клона НЗ (НЗ). На панели В показано относительное кратное увеличение РсуКШ-связывания афукозилированного фС по сравнению с фС ХТ. Относительное кратное увеличение РсуКШ-связывания рассчитывают из значений ЕС₅₀. ХТ, фукозилированный фС дикого типа, Н1, афукозилированный ^С, полученный из клона Н1, Н2, афукозилированный фС, полученный из клона Н2, НЗ, афукозилированный фС, полученный из клона НЗ.

На фиг. 7 показаны приготовление и анализ ΝΚ-клеток для анализов АЭСС-активности. (А) Точечный график, показывающий уровень чистоты выделенных первичных ΝΚ-клеток, применяемых в анализах АЭСС. Первичные ΝΚ-клетки выделяли из цельной крови от здорового человека-донора разделением магнитными шариками. Изолированные ΝΚ-клетки затем анализировали на чистоту проточной цитометрией, применяя антитела против ΝΚ-клеточных маркеров СПб и СП5б. (В) Производительность изолированных ΝΚ-клеток. Для того чтобы определить цитолитическую активность изолированных ΝΚклеток, окрашенные кальцеином-АМ клетки-мишени Κ562 инкубировали в одиночку, с ΝΚ-клетками или с сапонином, агентом, лизирующим клетки, в течение 4 ч. Средняя интенсивность флуоресценции (МИ), высвобождаемой из инкубированных клеток-мишеней, косвенно указывает на степень лизиса клеток. Величина МИ, наблюдаемая для ΝΚ-опосредованного лизиса клеток, вычитаемая из значения МИ, полученного для спонтанного лизиса клеток, указывает на максимально возможную специфическую МИ, которая наблюдается в анализе АЭСС. Обратите внимание, что №С-опосредованный лизис не в полной мере достигает уровня МИ, получаемого при полном лизисе.

На фиг. 8 показана АЭСС-активность ίη уйго афукозилированного и фукозилированного фС, полученных из СНО и КМЭ-СНО. Числа показывают среднее значение специфического лизиса клеток (%) в данной концентрации фС (%), η равняется 4; полоски указывают на ±§Ό, !§С клеток дикого типа (светлые квадраты), афукозилированный фС, полученный из клона Н1 (черные кружки), афукозилированный фС, полученный из клона Н2 (направленный вниз черный треугольник), и афукозилированный ^С, полученный из клона НЗ (направленный вверх черный треугольник). Сопоставимые данные были получены, когда клетки δΚ-ΒΚ-З применяли в качестве клеток-мишеней (данные не представлены).

На фиг. 9 показан профиль ΚΡΑΕ^ΡΑΌ моносахаридов, гидролизованных из цитозольной фракции (А) немодифицированных клеток СНО и (С) клона Н2 клеток КМЭ-СНО. (В), (А) с добавкой 10 пмоль/мкл Ь-рамнозы и (Ό), (С) с добавкой 10 пмоль/мкл Ь-рамнозы. Так как после гидролиза ТРА моносахариды не Ν-ацетилировали повторно, С1сЫАс измеряли как С1сЫН2. При выбранных условиях пик Ь-рамнозы элюируется при времени удерживания, равном около 15,5 мин. Отмечается отсутствие пика фукозы на НΡΑЕС-ΡΑ^ хроматограммах клеточного лизата из модифицированного клона Н2.

На фиг. 10 показан профиль ^АЕС^А^О моносахаридов, высвобождаемых из Ν-гликанов фС из (А), клеток дикого типа ХТ СНО и (С), модифицированного клона Н2 клеток КМО-СНО, (В), (А) с добавкой 10 пмоль/мкл Ь-рамнозы и (Ό), (С) с добавкой 10 пмоль/мкл Ь-рамнозы. Так как после гидролиза ТРА моносахариды не Ν-ацетилировали повторно, С1сNΑс измеряли как С1сNН2. При выбранных условиях пик Ь-рамнозы элюируется при времени удерживания, равном около 15,5 мин. Отмечается отсутствие пика фукозы на НΡΑЕС-ΡΑ^ хроматограммах образцы Ν-гликанов фС, полученных из клона Н2 клеток КМЭ-СНО.

Примеры

1.Экспериментальная часть

1.1 Материалы и методы.

1.1.1. Клеточные линии.

Рекомбинантный СНОЧдС клеточной линии СНО/ЭС44 был создан ранее в нашей лаборатории стабильной трансфекцией клеточной линии СНО с дефицитом дигидрофолатредуктазы (Иг1аиЬ е1 а1., 198б, Ροκ Νηΐΐ Асаб δα И8А. 8З (2): ЗЗ7-З41) вектором экспрессии, содержащим кассету экспрессии антител, которая содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепи терапевтического моноклонального антитела (трастузумаб (Негсер11п®)). Создание клеточной линии КМЭСНОЧдС началось из существующей клеточной линии СНОЧдС. Обе клеточные линии поддерживали в бессывороточной среде.

1.1.2. Оптимизация генов и синтез.

Аминокислотную последовательность для оксидоредуктазы Ктб ^е^ото^к аегидшока ΡΑО1; З04 аминокислот) (номер доступа в СепВапк: ААС088З9.1) обратно транслировали и получившуюся нуклеотидную последовательность, оптимизированную нокаутом криптических сайтов сплайсинга и дестабилизирующих РНК элементов последовательности, оптимизировали для повышения устойчивости РНК и адаптации частоты использования кодонов в соответствии с требованиями клеток СНО (СпсеИйю дг18еи8).

1.1.3. Конструирование плазмиды экспрессии КМЭ.

Синтезированную КМО-конструкцию вырезали ЕсоМ и Вд1 II и дефосфорилировали телячьей кишечной фосфатазой. Переваренную и дефосфорилированную вставку лигировали в предварительно переваренный бисистронный вектор экспрессии, который позволяет координированную коэкспрессию

- 2З 026336

ΚΜΌ и зеленого флуоресцентного белка (ΟΡΡ) из бисистронной мРНК. Плазмиду экспрессии оснащали геном устойчивости к неомицину, позволяющим прямую селекцию клеток, у которых есть стабильно интегрированная кассета бисистронной экспрессии. Общие процедуры для конструирования плазмиды экспрессии описаны в 8атЬгоок, 1., РпШск Е.Р. и Μ;πιί;·ιΙί8 Т.: С1отп§ Ι/ΙΙ/ΙΙΙ, А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 №\у Уогк/Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу ΡΐΌ88, 1989, 8есопй ЕйШоп.

1.1.4. Преобразование продуцирующих антитела клеток Ι§Ο СНО в клетки, секретирующие нефукозилированные антитела.

Клетки СНО-ΙβΟ. стабильно экспрессирующие терапевтическое антитело трастузумаб типа Ι§Ο1, стабильно трансфицировали трансгеном ΚΜΌ-ΟΡΡ электропорацией в соответствии с инструкцией изготовителя (Μ^с^οΡο^аΐο^, ΡΕΟΕΑΒ В|о1еск, Οе^таηу). Через 24 ч после электропорации трансфектанты отбирали на среде α-ΜΕΜ, содержащей антибиотик Ο418. Ο418-устойчивые клоны затем выделяли клонированием способом предельного разведения, то есть их ресуспендировали в селективной среде и сеяли в 96-луночные планшеты в разведении, при котором вероятность получения колонии из одной клетки составляет больше 95% на основании статистики Пуассона. Для обеспечения моноклональности клетки, выращенные в 96-луночных планшетах, выделяли и снова сеяли в 96-луночные планшеты при предельном разведении. После данных двух раундов клонирования одиночной клетки несколько изолированных одиночных клонов наращивали в больших объемах. После этого их адаптировали к росту в суспензии. Применяя описанный протокол электропорации, достигали эффективность трансформации, равную около 2000 на 2х10⁶ электропорированных клеток по оценке распределения ΟΡΡ-флуоресценции в чашках с культурой (фиг. 2).

1.1.5. Скрининг клонов флуоресцентной микроскопией.

Одиночные клеточные клоны сеяли в 96-луночные планшеты и проводили скрининг для успешной интеграции ΚΜΌ мониторингом ΟΡΡ-флуоресценции с микроскопом О1утри8 ΙΧ-50 (О1утри8 ОрРса1 Со, Еигоре), оснащенным количественным адаптером. Для ΟΡΡ-сканирования применяли флуоресцентный фильтр при 200-кратном увеличении против фазового контраста. Изображения редактировали с применением видоискателя У1е\уПпйег Ше. Кроме того, экспрессию мРНК трансгена ΚΜΌ подтвердили ПЦР-анализом. Успешную экспрессию трансгена ΚΜΌ подтвердили ПЦР-анализом с использованием ΚΜΌ-специфического набора праймеров (фиг. 3).

1.1.6. Продуцирование немодифицированного и гликолизированного ΙβΟ1 бессывороточной периодической культурой в пробирках в шейкере.

Чтобы сравнить гликоструктуры антител, вырабатываемых ΚΜΌ-модифицированными клонамипродуцентами СНО (ΚΜ^-СНО-IдΟ) с гликоструктурой антител типа Ι§Ο1, секретируемых из немодифицированных СНО-клеток-продуцентов антител (СНОЧ^), обе клеточные линии применяли для продуцирования антител ΙβΟ1 в супернатанте культуры. Клоны-продуценты антител ΚΜΌ-ΟΒΌ-Ι^Ο и СНОΙ§Ο инокулировали при плотности 2х 10⁵ клеток/мл в фукозо-дефицитную среду роста.

Пробирки в шейкере инкубировали при 180 об/мин, 37°С, 7,5% рСО₂. Культуру останавливали через 7 дней, когда клетки еще показывали жизнеспособность, равную больше 80%. Плотность жизнеспособных клеток измеряли автоматическим счетчиком клеток, νί-СЕРЬ™ ΧΚ (Весктап СоиЛег, РнПеПоп, СА), применяя способ исключения красителя трипанового синего. Характер снижения жизнеспособности в течение срока периодического культивирования с подпиткой, а также средняя удельная продуктивность (цр) между 3 и 10 днями периодического культивирования с подпиткой в шейкере оставались сопоставимыми между двумя различными клонами. Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин на 5000 об/мин и супернатант переносили в отдельную пробирку. Клетки ΚΜ^-СНО-IдΟ и немодифицированные СНО-ΙβΟ культивировали сходным образом. Концентрацию антител в культуральной жидкости измеряли сэндвич-иммуноанализом, специфичным для человеческого Ι§Ο1, на Οу^ο1аЬ \Уогк81аРоп (Οу^ο8 АВ, 8\уейеп). Оба клона росли логарифмически, давая сравнительные ΙβΟ-титры при соответствующих датах отбора проб, и имели сравнительное начальное время удвоения. Оба клона сохраняли морфологию, типичную для клеток яичника китайского хомячка.

1.1.7. Очистка Ι§Ο1 аффинной хроматографией с протеином А.

После стерильной фильтрации фильтром с порами 0,2 мкм супернатант загружали в миниколонку с протеин А-сефарозой. Применяли 0,5 мл колоночного носителя с общей емкостью, равной 10 мг. Колонку уравновешивали пятью объемами колонки в 20 мМ фосфата натрия, рН 7,0 самотеком. После связывания белков с низкой скоростью потока колонку дважды промывали уравновешивающим буфером. Затем антитело элюировали в четырех объемах колонки в 0,1М глицин-буфере, рН 3,0, самотеком. Фракции по 1 мл собирали и немедленно нейтрализовали 1М Трис-НС1, рН 9. Целостность и чистоту каждого очищенного ΙβΟ1 подтверждали анализом 8Ό8-ΡΛΟΞ в восстанавливающих условиях. Чистота составляла больше 90%, и целостность элюированных антител подтвердили анализом 8Ό8-ΡΛΟΞ в восстанавливающих условиях.

1.1.8. Приготовление Ν-связанных олигосахаридов, происходящих из антител.

100 мкг каждого антитела применяли для масс-спектрометрической характеристики Ν-связанных олигосахаридов. Белки переваривали трипсином (0:2 мг/мл, 16 ч, 37°С) до того, как Ν-гликаны высвобо- 24 026336 ждали в ходе инкубации с 1 единицей пептид-Ы-гликозидазы Р (ΡNСа5еР, КосНе Озадпозйсз) в течение 18 ч при 37°С. Высвобожденные Ν-гликаны обнаруживали двухстадийной хроматографией на колонках ΚΡ-(Зер-Ρак Ρак С18) с последующими колонками сатЬодтарЬ ех!гас1-с1еап (АиНгег е! а1., 2006, С1усоЫо1оду 16 (2006), рр. 991-1006). 50% каждого пула Ν-гликанов переваривали 10 мЕд нейраминидазы в течение 18 ч при 37°С, и 50% перметилировали метилйодидом, как описано у Сшсапи апй Кегек (Сшсапи апй Кегек, 1984, СагЬоЬуйг Кее. 1984: 131:209).

1.1.9. Анализ Ν-связанных олигосахаридов способом ΜΑ^^I-ТΟР-ΜЗ.

Ν-гликаны, высвобожденные из каждого очищенного 1дС1, анализировали масс-спектрометром И1!гаР1ех III ТОР/ТОР (Вгикег ОаИотк СтЬН, Вгетеп, Сегтапу), оснащенным лазером 8таг1Веат-П™. Измерения проводили в режиме положительных ионов. Положительные ионы подвергали ускоряющему напряжению 25 кВ и задержке экстракции 10 нс и анализировали в рефлектронном режиме. Для анализа десиалированные гликаны растворяли в Н₂О и перметилированные гликаны растворяли в 70% (об/об) ацетонитрила. 0,5 мкл образцы смешивали в отношении 1: 1 (об/об) с арабинозазоном (АгаЬиюзахопе) (2 мг/мл), растворенным в 80% этанола, на мишени и оставляли сушиться при комнатной температуре. Применяли внешнюю калибровку со ступеньками декстрана. Спектры анализировали с помощью С1усореаИтйег ^ааз е! а1., 2007, Ρ^оΐеот^С5 7, 4435-4444). Выявленные гликановые структуры строили с программным обеспечением С1усоАогкЬепсЬ (Сегош е! а1., 2008, I. Ρ^оΐеоте Кее. 7 (4) 1650-1659). Анализ олигосахаридного профиля продуктов, очищенных от окончательной среды культивирования, подтвердил, что Ν-связанные олигосахариды Рс-области продуктов были высокоманнозного, а также биантенного комплексного типа, и что в продукте 1дС1, секретируемом из клона ΚΜΌ-ΟΗΟ-^^ полностью отсутствует фукозилирование кора. Анализ гликоструктуры показал, что отношение нефукозилированных олигосахаридов антител, вырабатываемых коэкспрессирующими клонами ΚΜΌ, значительно увеличивалось в каждом случае (то есть составляло до 99, 95, 97 и 98%), по сравнению с антителами из родительских клонов СНО-1дС (фиг. 4). Ν-гликоструктуры, полученные из продукта антитела 1дС1, экспрессированного в клетках ΚΜΌ-ΟΗΟ-^^ почти полностью лишены присоединенных остатков фукозы и содержат сравнительно большое количество высокоманнозных структур, базируясь на относительных интенсивностях ΜΑΡΌΙ-пика (фиг. 4, панель А, известные высокоманнозные структуры обведены в кружок), тогда как Ν-гликоструктуры, полученные из терапевтического антитела 1дС1, экспрессированнные в немодифицированных клетках СНО-1дС, имеют фукозилированный кор и содержат значительно меньшее количество высокоманнозных структур (остатки фукозы соответствуют треугольникам в кружке; фиг. 4, панель В).

2. Экспериментальная часть

2.2. Материалы и методы.

2.2.1. Клеточные линии, оптимизация генов и синтеза, конструирование плазмиды экспрессии ΚΜΌ, преобразование продуцирующих антитела клеток 1дС-СНО в клетки, секретирующие нефукозилированные антитела, скрининг клонов флуоресцентной микроскопией и ПЦР-анализом.

Что касается клеточной линии СНО-1дС, применяемой для того, чтобы продуцировать клеточную линию ΚΜ^-СНΟ-IдС, оптимизации генов и синтеза ΚΜΌ, конструирования плазмиды экспрессии ΚΜΌ, преобразования продуцирующих антитела клеток 1дС-СНО в клетки, секретирующие нефукозилированные антитела, скрининга клонов флуоресцентной микроскопией для успешной ΚΜΌ-интеграции и ПЦР-анализа для успешной экспрессии мРНК трансгена ΚΜΌ, это относится к пунктам от 1.1.1 к 1.1.5, как указано выше (1. Экспериментальная часть).

2.2.2. Периодическое культивирование с подпиткой.

1дС продуцировали, применяя клетки как СНО, так и ΚΜΌ-СНО (клоны Н1, Н2 и Н3), чтобы сравнить их Ν-гликановые структуры. Клетки высевали при плотности 4х10⁵ клеток/мл в 500 мл колбы при перемешивании в 100 мл бессывороточной среды (пользовательские разработки для Ρ^оВ^оСеη; ЗАГС Вюзаепсе, Ьепеха, К.А.) с добавлением 4 мМ глютамина, но без антибиотиков или метотрексата. Культуры встряхивали со скоростью 180 об/мин при 37°С и 7,5% СО₂. Клетки подкармливали 1,75 мл ΡВСРеей Μίχ на 100 мл объема культуры на 4-й день культивирования. Плотность клеток и жизнеспособность определяли способом исключения красителя трипанового синего, применяя автоматизированную систему определения количества клеток У1Се11 (Весктап СоиЬет, Вгеа, СА). Аликвоты супернатанта клеточной культуры собирали на 3, 5 и 7 день, чтобы определить концентрации 1дС, которые измеряли сэндвич-иммуноанализом на Суго1аЬ. Культуры останавливали через 7 дней, когда клетки еще показывали жизнеспособность, равную больше 80%. Супернатант культуры клеток собирали и стерильно фильтровали.

2.2.3. Сэндвич-иммуноанализ Суго1аЬ, специфичный по отношению к 1дС1.

Концентрацию 1дС1 определяли сэндвич-иммуноанализом, выполняемым на Суго1аЬ Аогк51а1юп (Сугоз АВ, Ирр5а1а, З^ейеп). Анализ включал в себя последовательное добавление биотинилированного антитела захвата, которое узнает эпитопы на Рс-участке 1дС, образцов супернатанта культуры клеток или поликлонального человеческого 1дС референсного стандарта и антитела обнаружения, меченного А1еха Р1иог 647, которое связывает эпитопы в РаЬ-области 1дС. Образцы и стандарты измеряли в трех экземп- 25 026336 лярах. Среднее 0Ό, стандартное отклонение (ЗЭ) и % коэффициент вариации (% СУ) рассчитывали автоматически программным обеспечением Суго1аЬ еуа1иа1от после каждого запуска. Описанный сэндвичиммуноанализ 1дС1 Суго1аЬ предварительно проверяли, основываясь на предпосылке, что остаточные значения для каждого калибровочного стандарта отвечают пределу, равному 20% допустимой относительной погрешности (КЕ).

2.2.4. Очистка 1дС1 аффинной хроматографией с протеином А.

Супернатант культуры клеток загружали на колонку с протеин А-сефарозой объемом 0,5 мл, предварительно уравновешенную 20 мМ фосфатом натрия, рН 7,0. После промывания колонки двумя объемами колонки уравновешивающего буфера, антитело элюировали в четырех объемах колонки 0,1М глицина, рН 3,0. Фракции собирали и немедленно нейтрализовали 1М Трис-НС1, рН 9. Целостность и чистоту каждого очищенного 1дС1 подтверждали анализом ЗЭЗ-РАСЕ в восстанавливающих условиях. Концентрацию белка очищенного 1дС определяли сэндвич-иммуноанализом Суго1аЬ.

2.2.5. Обработка 1дС Шгликанов.

1дС (100 мкг) переваривали трипсином в течение 1б ч при 37°С. Реакцию прекращали нагреванием образца в течение 5 мин при 95°С. Антитела дополнительно переваривали с 1 и ΡNСа8е Р в течение 18 ч при 37°С. Высвобождаемые Шгликаны выделяли и обессоливали на картриджах Зер-Рак С18 с обращенной фазой с последующими колонками сагЬодгарЬ ех!тас1-с1еаи. Каждый пул Шгликанов переваривали с 10 мЕд нейраминидазы в течение 18 ч при 37°С.

2.2.6. Масс-спектрометрия.

Шгликаны анализировали на масс-спектрометре иЬтаИех III Т0Р/Т0Р (Вгикег ЭаЬотк СтЬН, Вгетеп, Сегтапу), оснащенном лазером ЗтайВеат-ΙΙ™ и установкой ЫРТ-МЗ/МЗ. Спектры регистрировали в рефлектронном режиме при ускоряющем напряжении 25 кВ и задержке экстракция 10 нс. Измерения проводили в режиме положительных ионов. Внешнюю калибровку выполняли со ступеньками декстрана. Десиалированные Шгликаны растворяли в Н₂О. 0,5 мкл проб смешивали в отношении 1:1 (об/об) с Э-арабинозазоном (5 мг/мл), растворенным в 70% этанола, на стальной мишени (СЬеп е1 а1. 1997). Спектры анализировались с помощью С1усо-реакйпбет [Маа8 е1 а1., 2007]. Выявленные гликана структуры строили с программным обеспечением С1усо\УогкЬепсЬ [Сегот е1 а1., 2008].

2.2.7. Анализ специфического связывания Рс-у-рецептора ША (РсуКША) РсуКША-связывающую активность образцов 1дС анализировали тестом специфического связывания РсуКША, как описано у №\уа е1 а1., 2004, с небольшими изменениями. Гистидин (Н18)-меченный РсуКША (Р158) (22 кДа, 158Р, К & Ό Зу81ет8, М1пиеаро118, МЛ) применяли в сочетании с моноклональным антителом антийейаШЗ (Οίадеп, Нббеп, Германии) для связывания с рецептором. Иммунопланшеты (Мах18отр, ТЬегто, ХУаЬЬат, МА) покрывали антителом антийейаШЗ и блокировали с блокирующим реагентом (КосЬе Э1адпо8Ьс8, Реп/Ьегд, Сегтапу). В дальнейшем, рекомбинантный гистидин (Н1З)-меченный РсуКША добавляли в иммунопланшеты. Покрытые планшеты инкубировали с серийными разведениями образца и контролями так, чтобы они могли связаться с иммобилизованным рецептором РсуКША. После стадии промывки связанные 1дС детектировали моноклональным антителом против 1дС человека, конъюгированным с пероксидазой (Шапоуа, НатЬигд, Сегтапу), и количество связанного 1дС определяли количественно по активности пероксидазы. После каждого шага инкубации иммунопланшет промывали 3 раза РВЗ, содержащим 0,2% твин-20. Тетраметилбензидин (ТМБ; Зегатип, НеИекее, Сегтапу) применяли в качестве хромогенного субстрата, реакцию прекращали с помощью 1М серной кислоты и, наконец, поглощение детектировали при 450 нм (1пйпЬе Р200 Кеабег, Тесап, СгаПкЬепп, Сегтапу). На основании данных поглощения, зависящих от концентрации, подбор единой кривой проводили с применением 4-параметровой логистической модели кривой (Маде11ап ЗоГЬетате б.1, Тесап). Внутрисерийную точность для данного анализа связывания РсуКША определили в пределах 15% СУ.

2.2.8. Анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС).

Первичные человеческие ЛК-клетки выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК). МНПК отделяли от цельной крови здоровых человеческих доноров центрифугированием в градиенте плотности, и клетки ПК в дальнейшем изолировали разделением отрицательными магнитными бусинками (МШеиуц Вегд18сЬ С1абЬасЬ, Сегтапу). Чистоту изолированных ПК-клеток подтвердили способом проточной цитометрии (РЕ-конъюгированные СЭ1б и А1еха488-конъюгированные антитела СЭ5б, ВЭ, Зап 1оке, СА). Клеточные линии ВТ-474 (ЬакГагднек е1 а1., 1978, инвазивная протоковая карциномы молочной железы, человек, СЬЗ, Ерре1Ьеш, Сегтапу) и ЗК-ВК-3 (2аЬтеску е1 а1., 1991, аденокарцинома молочной железы, человек, АТСС, Манассас, УА) применяли в качестве клеток-мишеней. Обе клеточные линии подтвердили положительными для маркера Нег2/пеи способом проточной цитометрии (данные не представлены). Линии клеток-мишеней обновили из исследовательского банка клеточных культур за 3 дня до инокуляции. Лизис клетки-мишени, индуцированный антителозависимой ПК-клеткой, определяли количественно высвобождением витального красителя (Са1сеш А.М., ПГе ТесЬпо1од1е8, СатПЬаб, СА). Клетки-мишени окрашивали в соответствии с протоколом производителей и сеяли при плотности 2х10⁴ жизнеспособных клеток/лунка в 50 мкл КРМ11б40 (ПГе ТесЬпо1од1е8) + 10% РСЗ (ВюсЬтот, ВегЬп, Сегтапу) в 9б-луночных планшетах для микротитрования. Готовили последовательные разведения антител

- 2б 026336

1:3 в КРМП640 + 10% ФТС. 50 мкл каждого разведения пипетировали в лунку с п равным 3 и предварительно инкубировали с клетками-мишенями в течение 30 мин при 37°С до инокуляции ΝΚ-клеток. В конце предварительной инкубации антител сеяли клетки-эффекторы при соотношении эффекторная клетка к клетке-мишени (Е:Т), равном 5:1. Планшеты затем центрифугировали при 200 д в течение 3 мин и инкубировали в течение 4 ч при 37°С и 5% СО₂. Для каждой клеточной линии индуцировали контроль спонтанного лизиса клетки-мишени (ν/о ΝΚ-клетки), контроль независимого от антитела лизиса клеткимишени (ν/ΝΚ-клетки) и контроль тотального лизиса клетки-мишени (индуцированного сапонином). Тотальный лизис в контрольных лунках индуцировали добавлением 15 мкл/лунку 0,1 мг/мл сапонина в КРМП640 + 10% ФТС за 15 мин до окончания инкубационного периода. Во все остальные лунки добавляли 15 мкл КРМП640 + 10% ФТС. Высвобождение кальцеина-АМ определяли количественно детектированием флуоресценции в супернатанте культуры. Планшеты центрифугировали (150 д, 3 мин) и 100 мкл супернатанта из каждой лунки переносили в 96-луночный черный планшет для определения флуоресценции (ТЬегто). Среднюю интенсивность флуоресценции (МР!) детектировали, применяя !пПп11е Р200 КеаДег (Тесап, фильтр возбуждение/излучение 485/535 нм). Подбор кривой проводили с применением 4-параметровой логистической модели кривой доза-реакция (Маде11ап версии 6.1). Специфический лизис клеток рассчитывали следующим образом: специфический лизис клеток [%] соответствует [МИ (образец) - МРI (спонтанный)]/[МРI (тотальный) - МРI (спонтанный)] х 100. В то время как МРI (образец) представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции, высвобождаемой специфическим лизисом клетки-мишени, МИ (спонтанный) представляет собой постепенное высвобождение флуоресцентного красителя клеткой-мишенью, и МИ (тотальный) представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции, получаемой после тотального лизиса клетки-мишени, индуцированного детергентом.

2.2.9. Анализ моносахаридов и определение рамнозы.

Клетки (3х10⁷) отделяли от супернатанта центрифугированием при 100 д в течение 5 мин. Впоследствии их лизировали тремя циклами замораживания-оттаивания. Клеточные мембраны затем отделяли от цитозольной фракции при 21000 д в течение 30 мин при 4°С. Супернатанты клеточной культуры, клеточные мембраны, цитозольные фракции, а также Ν-гликаны !д0 гидролизовали в 2 N ТРЛ в течение 4 ч при 100°С. После выпаривания при пониженном атмосферном давлении образцы анализировали способом НРАЕС-РА^ на колонке РА-1, применяя Эюпех Ю8-3000, и 2-дезоксирибозу применяли в качестве внутреннего стандарта. Нейтральные моносахариды разделяли изократным элюированием в 2,25 мМ №ЮН. Послеколоночное добавление 200 мМ №ЮН позволяло амперометрическое детектирование. Так как НРАЕС-РА^ не позволяет присвоить энантиомерную идентичность (Нойоп, Ό. 2004), Ь-рамнозу применяли в качестве стандарта для определения времени удерживания, ожидаемого для Ό-рамнозы. Ό0Ό для рамнозы определяли, как описано в главе 6.3 ЮН Нагтош/еД 1г1раг1Пе дшбеНпе £ог уаМаБоп о£ апа1уйса1 ргосебигек ОСНО2 (К1)).

2.3. Результаты.

2.3.1. Гетерологичная экспрессии трансгена КМЭ.

Для оценки влияния экспрессии трансгена КМО на уровне фукозилирования секретируемого !д0. вектор, оснащенный кассетой бисистронной экспрессии, содержащей гены для ΟΌΡ-6-дезокси-О-ликсо4-гексулозоредуктазы (КМО) и зеленого флуоресцентного белка (0РР), создали и ввели в клон СН0/ОО44, который ранее разработали для гиперэкспрессии и секреции биоподобной версии терапевтических антител трастузумаб типа ^01 (НегсерБп®, КосЬе). 0418-устойчивые клоны, экспрессирующие трансген, идентифицировали их 0РР-опосредованной зеленой флуоресценцией, и они появились в течение 2 недель после трансфекции. Эффективность трансформации, составляющую около 80%, достигали за счет электропорации по оценке распределения 0РР-флуоресценции (данные не приводятся, но сопоставимы с данными, приведенными на фиг. 2). Успешную экспрессию трансгена КМО подтвердили ПЦРанализом с применением КМО-специфического набора праймеров (данные не приводятся, но сопоставимы с данными, приведенными на фиг. 3). Модифицированные клетки СНО, экспрессирующие трансген КМЭ, назвали КМО-СН0.

2.3.2. Бессывороточная подпитываемая периодическая культура клеток СНО и КМО-СН0, продуцирующих антитела.

Бессывороточную подпитываемую периодическую культуру немодифицированных родительских клеток СНО и трансфицированных клеток КМО-СН0, продуцирующих !д0, культивировали в трубках биореактора объемом 50 мл, содержащих среду роста с дефицитом фукозы, дополненную Ь-глютамином. Трубки биореактора инокулировали при начальной плотности клеток, равной 4х10⁵ клеток/мл, и инкубировали при 180 об/мин, 37°С, 7,5% рСО₂. За продуктивностью периодических культур с подпиткой следили в течение 14 дней и сравнивали бок о бок. Сравнительный анализ параллельных подпитываемых периодических культур клеток СНО и КМО-СН0 не показал значительных отклонений на протяжении 14 дней. Начальные скорости удвоения, скорости пролиферации и [дО-титры при соответствующих сроках отбора проб совпадали для обеих клеточных линий. Оба клона сохраняли морфологию, типичную для клеток СНО. Характер снижения жизнеспособности на протяжении теста периодического культивирования с подпиткой, а также средняя удельная продуктивность (д_р) между 3 и 10 днями теста периоди- 27 026336 ческого культивирования с подпиткой в шейкере оставались сопоставимыми для двух различных клонов (данные не представлены).

2.3.3. Ν-гликановый анализ ЦО, продуцируемого клетками СНО и КМЭ-СНО.

Клетки СНО и КМЭ-СНО выращивали в накопительной культуре. Применяли три различных клона КМЭ-СНО, продуцирующих ЦО, а именно Н1, Н2 и Н3. Клетки инокулировали при начальной плотности клеток 4х10⁵ клеток/мл и выращивали в течение 7 дней в биореакторных трубках при 180 об/мин, 37°С, 7,5% рСО₂. Супернатанты собирали на 7 день и образцы ЦО очищали аффинной хроматографией с протеином А. Чистоту и целостность элюированных антител подтвердили анализом 8П8-РАОЕ в восстанавливающих условиях. Ν-гликаны, высвобожденные с помощью РNОаке Р, десиалировали и впоследствии анализировали МΛ^^I-ТОР-М8. Относительное количественное определение интенсивностей сигнала Ν-гликанов проводили, как было показано ранее, чтобы дать надежные результаты при сравнении с хроматографическими методами (\ν;·ι6;·ι е1 а1., 2007). Структуры диантенных Ν-гликанов высокоманнознного, а также комплексного типа были обнаружены во всех пробах (фиг. 5). Монофукозилированные агалактозилированные/моногалактозилированные/дигалактозилированные диантенные Ν-гликаны являлись тремя самыми распространенными структурами Ν-гликанов, найденными в ЦО дикого типа (VI) (фиг. 5А). Наличие кора фукозы в данных пиках, а именно при т/ζ 1485,4, 1647,4 и 1809,4, было подтверждено МАРШ-ТОР/ТОР. Диагностический фрагментами ион бНех1НехЫАс₂ наблюдали в каждом спектре при т/ζ 592,8. В пробах ЦО, которые были продуцированы клетками КМО-СНО, наблюдали только следовые количества фукозы (фиг. 5В, С, Ό), которые составляли не более 2% от общего пула Νгликанов (пример Н2). Одновременно пример Н2 содержал большее количество высокоманнозных структур, чем ЦО дикого типа νΓ.

2.3.4. ЦОРРс-связывающая активность ЦО, продуцируемого клетками СНО и КМО-СНО.

Поскольку сравнительно слабое взаимодействие (К_б ~1 мкм) между !ёО1 и родственным ему Рсрецептором РсуКШа является одним из основных факторов, влияющих на АЭСС-эффекторную функцию (8опбегтапп е1 а1., 2000), анализ связывания РсуКШа является косвенным показателем для прогнозирования АЭСС-активности образцов моноклонального антитела !дО1. Связывание РсуКШа афукозилированным ЦО, секретируемым из клеток КМЭ-СНО, значительно увеличивалось с эквивалентным связыванием с РсуКШа-158Р при количестве белка около 16 раз меньше, по сравнению с фукозилированным ЦО, секретируемым из клеток дикого типа СНО (фиг. 6А, В). На фиг. 6В приведены данные как относительное увеличение в разы связывания афукозилированного ЦО с использованием фукозилированного ЦО в качестве эталона сравнения.

2.3.5. АЭСС-активностъ афукозилированного ЦО, продуцируемого клетками КМЭ-СНО.

Для анализа АЭСС-активности выделенные ΝΚ-клетки и клетки-мишени, экспрессирующие НЕК2, инкубировали совместно с серийными разведениями афукозилированного и фукозилированного ЦО. В качестве предварительного условия для анализа ΝΚ-клетки выделяли из образцов цельной крови при уровне чистоты, равном 73% (фиг. 7). Технический контроль цитотоксичности ΝΚ-клеток показал удельную активность лизиса, равную 77%, для донорского материала, применяемого для АЭСС-анализа (фиг. 7). Клеточную линию-мишень ВТ-474, экспрессирующую НЕК2 (полученная из человека, инвазивная протоковая карцинома молочной железы) применяли в АЭСС-анализе. Клеточная линия-мишень ВТ474 также атакуется ΝΚ-клетками с помощью механизмов, отличных от АЭСС. Клетки ВТ-474 показывают среднее значение независимого от антител лизиса клеток, равное 16% (данные не представлены). Данные по специфическому лизису клеток, индуцированному пробами ЦО, показаны на фиг. 8. Все три образца афукозилированных ЦО (Н1-Н3) вызывали повышенный АЭСС-ответ по сравнению с антителами дикого типа ^^Т (фиг. 8). Образец Н2 афукозилированного ЦО индуцировал самый высокий АЭССответ (фиг. 8). Аналогичные результаты были получены, когда клетки 8К-ВК-3 (НЕК2-позитивная аденокарцинома молочной железы) применяли в качестве клеточных линий-мишеней в анализе. Расчетные значения ЕС₅₀ для образцов афукозилированного и фукозилированного ЦО, инкубированных с клетками ВТ-474 и 8К-ВК-3, приведены в табл. 2 (см. ниже). Наблюдаемые изменения в ЕС₅₀ между диким типом ЦО и вариантами Н1 до Н3 оставались сопоставимыми, независимо от клеточных линий-мишеней, применяемых в анализе АЭСС (фиг. 8). В присутствии НЕК2-позитивной клеточной линии-мишени ВТ474 и клеточной линии-мишени 8К-ВК-3 и очищенных ИК-клеток, афукозилированный ЦО показал в среднем в 16 раз больше антитело-опосредованную активность, истощающую клетку-мишень, со средними значениями ЕС50, равными 0,443 мкг/мл и 0,00817 мкг/мл, что указывает на гораздо более высокую эффективность по сравнению с фукозилированным ЦО. Следует отметить, что образцы афукозилированного ЦО, которые показали повышенную РсуКШа-связывающую активность, также вызывали выше АЭССответ, по сравнению с ЦО дикого типа ^Т.

- 28 026336

Таблица 2

Подведенные итоги АОСС-эффекторной функции афукозилированного (Н1-3) и фукозилированного (^Т) 1дО, инкубированного с различными антигенпредставляющими клетками-мишенями (ВТ-474, 8К-ВК-3). Расчетное соотношение ЕС₅₀ (фукозилированный)/ЕС₅₀ (афукозилированный) указывает на увеличенную АОСС-эффекторную функцию

Название образца	ВТ-474 ЕС51) [нг/мл]	ВТ-474 Соотношение (\УТ/Н)	8К-ВК-3 ЕС50 [нг/мл]	8К-ВК-3 Соотношение 0УТ/Н)
дут	6.03	...	1.31	...
Н1	0.454	13	0.0932	14
Н2	0.227	27	0.0602	22
нз	0.647	9	0.0917	14

2.3.б. Анализ моносахаридов - отсутствие обнаруживаемых количеств Ό-рамнозы в клеточных лизатах, а также в Ν-гликанах 1дО.

Клеточные мембраны, культуральные жидкости и цитозольные фракции изолировали из клеток КМО-СНО. Моносахариды в дальнейшем высвобождали и анализировали НРАЕС-РАО. Как и ожидалось, фукоза присутствовала в клетках СНО, а не в клетках КМО-СНО. Уровень рамнозы, превышающий предел обнаружения (ЬОО), не наблюдали в цитозольных фракциях (фиг. 9). На основе стандартного отклонения γ-перехвата и наклона калибровочной кривой значения ЬОО составили 1,2 и 1,1 пмоль на 10 мкл объема впрыскиваемого образца рамнозы и фукозы соответственно. Точно так же Ν-гликаны, высвобождаемые из очищенных антител, продуцируемые с применением клеток КМО-СНО, гидролизовали ТРА и образовавшиеся моносахариды анализировали НРАЕС-РАО. ТРА-гидролизованные Ν-гликаны не дали пик рамнозы, который превышал ЬОО (фиг. 10). В заключение, ни клетки КМО-СНО, ни секретируемые антитела не содержали обнаруживаемые количества рамнозы.

2.4. Заключительные замечания.

Авторы оценили подход конструирования гликофрагментов, чтобы достичь секреции МКА с дефицитом фукозы из клеточных линий, которые были модифицированы для непрерывного удаления ключевого промежуточного продукта из цитозольного пути синтеза бе поуо фукозы (фиг. 1). Данные авторов ясно показывают, что трансгенная экспрессия гетерологичного бактериального фермента приводит к желаемому блоку в синтезе фукозы на образующихся Ν-гликанах гликопротеинов. Степень истощения фукозы данным методом также указывает на то, что удаление фукозы из культуральной среды было достаточно, чтобы полностью блокировать реутилизационный путь, который в противном случае может служить альтернативным источником цитозольной ООР-фукозы.

Ключевой метаболической целью в подходе авторов являлась ООР-4-кето-б-дезокси-0-манноза, которая является общим промежуточным продуктом для синтеза нескольких различных ООРмонодезоксигексоз, в том числе ООР-Ь-фукозы, ООР-4-дезокси-0-талозы, ООР-колитозы и ООР-Оперозамина, например, у бактерий. Более того, мутант ООР-фукозосинтазы с активным сайтом Су§1098ег продуцирует ООР-б-дезокси-О-альтрозу вместо ООР-фукозы (Баи и Таннер., 2008).

Специфический прокариотический фермент, который авторы выбрали в качестве образца для своего подхода, представлял собой ООР-б-дезокси-О-ликсо-4-гексулозоредуктазу (синоним ООР-4-кето-бдезокси-О-маннозоредуктазы, сокращенно КМО) (КпеМшдег е! а1., 2001; Май е! а1., 2002). Авторы показали здесь, что гетерологичная экспрессия прокариотического фермента ООР-б-дезокси-О-ликсо-4гексулозоредуктазы (КМО) в цитоплазме может эффективно отклонять путь синтеза фукозы бе поуо. Упомянутый фермент использует ИАОН и ИАОРН в качестве доноров водорода и катализирует целевое восстановление 4-кетогруппы промежуточного продукта пути синтеза фукозы ООР-4-кето-б-дезокси-Оманнозы, чтобы вырабатывать ООР-О-рамнозу. Представляется, что преобразование ООР-4-кето-бдезокси-О-маннозы в ООР-О-рамнозу с помощью КМО происходит количественно, потому что обратная реакция не была обнаружена (Кпе1бшдег е! а1., 2001).

Данные авторов также показывают, что ООР-рамноза, б-дезоксигексоза, которую находят только в гликоконъюгатах определенных бактерий, но не в животных (^МеЬЬ е! а1., 2004), представляет собой тупиковый продукт в рамках цитозоля позвоночных.

Немодифицированные клетки позвоночных не имеют рамнозилтрансфераз (^МеЬЬ е! а1., 2004) и мембранных транспортеров, так что включение ООР-О-рамнозы в образующиеся гликаны очень маловероятно внутри клеток позвоночных. Наши данные могут подтвердить это. Они ясно показывают, что искусственная Ό-рамноза не входила в состав секретируемого 1дО или чего-либо еще в клетке (фиг. 9 и 10).

В дополнение к отсутствию фукозы на гликановых структурах, 1дО, секретируемые из генетически модифицированных клонов, показали высокий уровень высокоманнозных структур. Это может возникнуть в результате торможения по механизму обратной связи ОМО ООР-О-рамнозой. Отсутствие ОМО- 29 026336 активности в качестве альтернативного метаболического стока для ООР-маннозы может способствовать увеличению пула цитозольной ООР-О-маннозы, который в свою очередь, может вызвать возрастание высокоманнозных структур, наблюдаемых в продуктах, секретируемых из КМЭ модифицированных клеток-хозяев (фиг. 4 и 5).

Результаты анализа РсуКШ-связывания, а также Α^СС-анализа ш νίίτο также показывает, что афукозилированные фО имеют значительно более высокую связывающую активность для РсуКШа и расширенный Α^СС-ответ. Наблюдаемый сдвиг ЕС₅₀ и увеличение в разы активности по истощению клеткимишени (табл. 2, фиг. 8) были бы еще выше, если бы тест был проведен в присутствии цельной крови, сыворотки или плазмы. Интересно, авторы обнаружили, что образец Н2 афукозилированного фО с самым высоким уровнем высокоманнозных структур также показал самую высокую Α^СС-активность, независимо от клетки-мишени, применяемой в анализе (ВТ474 или 8К-ВК-3) (табл. 2).

Взятое вместе данное исследование показывает, что гиперэкспрессия КМЭ в клетках позвоночного хозяина приводит к истощению важного ключевого промежуточного продукта для синтеза цитозольной ОЭР-фукозы, ООР-4-кето-6-дезокси-0-маннозы. Такой подход позволяет получать метаболически сконструированные клеточные линии, а также предлагает многообещающую новую стратегию для преобразования существующих клонов клеток, экспрессирующих антитела в клетки-продуценты для терапии с истощенной фукозой. Способность надежно конструировать недостаток фукозы в уже существующих клеточных линиях может помочь ускорить разработку лекарственных средств для следующего поколения моноклональных антител.

3. Сокращения.

ΑСN, ацетонитрил, СНО, яичник китайского хомячка, СУ, коэффициент вариации; бНсх, дезоксигексоза, ЕС₅₀, половина максимальной эффективной концентрации (то есть концентрации агониста, который провоцирует ответ на полпути между базовым и максимальным ответом), Рис, фукоза, Оа1, галактоза; Οа1NΑс, Ν-ацетилгалактозамин; Ο1сNΑс, Ν-ацетилглюкозамин, ОМЕК, ООР-4-кето-6-дезокси-Эманнозо-3,5-эпимераза/4-редуктаза, НРЬС, высокоэффективная жидкостная хроматография,; ^ΑΕ^ ΡΑ^. анионообменная хроматография высокого рН с импульсным амперометрическим обнаружением; ЬОО, предел обнаружения, МКА, моноклональное антитело, МΑ^^I-ΤΟР-М8 масс-спектрометрия время-пролетной матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации, МЕМ, модифицированная среда Игла; РВМС, мононуклеарные клетки периферической крови, РВ8, фосфатно-солевой буфер; РЫОа8с Р, пептид-Н4-(Ы-ацетил-в-глюкозаминил)аспарагинамидаза Р; Кйа, рамноза, КМЭ, ООР-6-дезокси-Эликсо-4-гексулозоредуктаза, 8Ό8, додецилсульфат натрия, ТФК, трифторуксусная кислота.

Ссылки

Ссгот, Α., Маа88, К., Осусг, Н., Осусг, К., ЭсН, Α., Нак1ат, 8.М. 2008. Ο1усο\Vο^кЬсηс11: Α Τοοί ίοτ 1йс Сοтриίс^-Α88^8ίсб Αηηοίаί^οη οί Ма88 8рсс1га οί О1усап8, Фиппб οί Рю^тс Ксксагсй, 7(4), 1650-1659.

СНсп, Р., Ваксг ΑΌ., ΝονοΙπγ М.У. 1997. ТНс икс οί Ο8аζοηс8 а8 тайтсс8 ίοτ 1йс та1г!х-а88181сб 1а8сг бс8ο^рί^οη/^οη^ζаί^οη та88 8рссί^οтсί^у οί са^ЬοНуб^аίС8. Απη1 ВюсНст. 244(1): 144-51.

ΚοΠοί! Ό. 2004 Αбνаηсс8 ш Са^ЬοНуб^аίс СНст181гу апб ВюсНст18йу. Ό. ΚοΠοί! Εάίίοτ, Ейсуют Αсабстю Ргс88, Αт8ίс^бат апб 8ап ΌΚβο, νοί. 59, р.11.

ЮН О2(К 1): ЮН На^тοη^ζсб ТпрагШс ОшбсНпс: УаПба1юп οί Α^^ΐ^Ι Ргоссбитс8: Тсх1 апб Мс1Нο6ο1οβ\· ф2(К1) Ситтсй 81ср 4 усг8юп , Рагой ОшбсНпс ба1сб 27 ОсЮЬсг 1994.

Кпшбшдст В., Отайпдст М., Αбат О., РисНЬсгдсг М., Кο8та Р., 2аут 8., Мс88псг Р. 2001. Испййсаίίοπ οί ίνο Ο^Ρ-6-бсοxу-^-1уxο-4-Нсxи1ο8С гсбис1а8с8 8уп1Нс81/и18 Ο^Ρ-^-^Натηο8С ш Αηси^^η^Ьас^11и8 ίНс^тοасгорН^1и8 Й420-91Т. 1. Вю1. СНст. РсЬ 23; 276(8):5577-83.

^а8ίа^дис8 Ε.Υ., ^иИп^ Ю.О. апб Ксбйс1б Е.8. 1978. ΗοΗιΙίοπ οί ίνο Нитап ίитο^ ср11НсПа1 сс11 1шс8 Ггош 8ο1ι6 Ьгса81 сагсиюта8. ί. Νηΐ1. Сапссг Й181; 61(4):967-78.

Ьаи 8.Т.В., Таппсг, М.Е. 2008. МссНат8т апб Α4ί\Ό 8Пс Кс81бис8 οί Ο^Ρ-Рисο8С 8упФа8с, Фитй οί 1Нс Αιικ^-ηι СНстюа1 8οс^сίу, νο1. 130, п. 51, рр. 17593-17602.

Мак1 М., 1агу1псп Ν., КаЫпа ί., Κοο8 С., МааНстю Н., Ксп^псп К.; РФШ^; Маййа. 2002. Рипйюпа1 схргс88юп οί Ρ8сибοтοηа8 ас^ид^ηο8а Ο^Ρ-4-ксίο-6-бсοxу-^-таηηο8С гсбис1а8с \у1исН 8уп1Нс81/с8 ОЭР^Натηο8С. Еиг. 1. ВюсНст. Нт; 269(2):593-601.

Νί\νη К., 8Нο^^-Нο8ака Е., 8акигаба М., 8Нтка\уа Т., ИсЫба К., Иакатига К., МаШШита К., Исба К., Напа1 Ν., 8Нйага К. 2004. ^сГисο8у1аίсб апй-СС сНсп-юктс гсссрЮг 4 !дО1 \\ЙН спНапссб ай^бубсрспбсй сс11и1аг суЮЮхюПу 81ю\У8 рοίсηί Шсгарсйю асГОйу ίο Т сс11 1сикст1а апб ^тр^та. Сапссг Кс8, 64:2127-2133.

Νί\γη К., На!апака 8., 8Нο^^-Нο8ака Е., 8акигаба М., КοЬауа8Н^ Υ., ИсНата Α., Υο1<οί Н., Иакатига К., 8Й11ага К. 2004. ЕпНапсстсп! οί 1Нс аηί^Ьοбу-бсрсηбсηί ссйи1аг суЮЮхюНу οί 1ον-ίисο8с !дС1 18 шбсрспбсй οί РсдаттаКШа ίиηсί^οηа1 рο1утο^рН^8т. СНп Сапссг Кс8, 10:6248-6255.

8Ню1б8 К.Ь., Ьа1 1., Ксск К., О^птаИ ЬУ., №п§ К., Мспд ΥΌ., ЮаксП 8.Н., Ргс81а Ь.О. 2002. Ьаск οί ίисο8с οη Нитап !дО1 Ν-Ппксб ο1^дο8ассНа^^бс 1шргоус8 Ьшбшд ίο Нитап РсдаттаКШ апб ай^бубсрспбсп! ссйи1аг Юхкйу. 1. Вю1. СНст, 277:26733-26740.

8οηбс^таηη. Р., НиЬсг, К., Οο8Φυίζ^ V., апб ΗκοΚ и. 2000. ТНс 3.2-Α сгу81а1 81гис1игс οί !Нс Нитап

- 30 026336 !дС1 Рс Ггадтепк-Рс даттаКШ сотр1ех. №1иге 406, 267-273.

Иг1аиЬ С., Как Е., СагокЬегк Α.Μ., СЬакш Ь.А. Ое1еЬоп оГ 1Не б1р1о1б б1НубгоГо1а1е гебискаке 1осик Ггот сиНигеб таттаНап се11к, Се11. 1983 Лт; 33(2):405-12.

Иг1аиЬ С., ΜΐίοΗοΠ Р.Р, Как Е., СЬакш Ь.А., Рипападе У.Ь., Μуοба Т.Т., Нат1ш I. 1986. ЕГГеск оГ датта гаук а! 1Не б1НубгоГо1а1е гебискаке 1осик: ЭекЬопк апб шуегкюпк. 8отаЬс Се11 Μο1 Сепе!, 12:555556.

\Уаба, Υ.; А/абк Р.; Сокке11о, С.Е.; Эей А.; Отек, К.А.; Сеуег, Н.; Сеуег, К.; КакеЬк К.; Каг1ккоп, КС.; Како, К.; Ка\уакакк Ν.; КЬоо, К.Н.; К1т, 8.; Копбо, А.; Ь/Шоуа, Е.; ΜесЬ^еГ. Υ.; Μ^уοкЬ^, Е.; Nакатига, К.; №птакки, Н.; №уо1пу Μ.ν.; Раскег, КН.; РеггеаиИ, Н.; Ре1ег-Ка1аНп1с, I.; РоЫеШ/, С.; Кет1ю1б, ν.Ν.; Кибб, РМ.; 8и/икк А.; ТашдисЬк N. 2007. Сотрапкоп оГ Не текЬобк Гог ргоГШпд д1усоргокеш д1усапк-НИРО Нитап Эйеаке С1усот1ск/Ргокеоте [пНаНуе ти1Ь-ткШиЬопа1 ккибу. С1усоЫо1оду; 17(4):41122.

\УеЬЬ КА., Μιι1Κ1κ·ι1< АМ, Ьат 18., КоссЬеПа Н.Ь., Сагауйо Κ.Μ. 2004. Сгукка1 ккгискиге оГ а кекгатепс СЭР-Э-таппоке 4,6-беЬубгакаке Ггот а Ьас1ег1а1 СЭР-Э-гНатпоке ЫокупкЬейс ракЬтеу. Ргокеш 8ск РеЬ;13(2):529-39.

ИаЬгеску ДК., Ьат Т., ΜсКеηζ^е 8.1. апб Сагпеу 1991. ТЬе ехкгасе11и1аг ботат оГ р185/пеи 1к ге1еакеб Ггот кЬе кигГасе оГ Нитап Ьгеакк сагсшота се11к, 8К-ВК-3. I. Вю1. СЬет.; 266(3):1716-20.

Список последовательностей <110> 3ΑΝΏΙΟ, Уо1кег, νΟΝ ΗΟΒ5ΤΕΝ, Напз Ηθηηίης, ОСОВЕК,

СНггзЫапе <120> СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ МОЛЕКУЛ, СОДЕРЖАЩИХ

СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ ГЛИКАНОВЫЕ СТРУКТУРЫ <130> 513-17 РСТ <150> из 61/244,624 <151> 2009-09-22 <160> 7 .

<170> Патентная версия 3.5<210> 1 <211> 304 <212> РРТ <213> Рзеискотопаз аегидтпоза <220>

<221> Пептид <222> (1)..(304) <223> СВР-б-дезокси-О-ликсо-4-гексулозоредуктаза (ΒΜϋ), <400> 1

Мер ТИг С1.п Агд Деи РПе Уа1 ТПг С1у Деи Зег С1у РИе Уа1 61у Дуз

10 15

ΗΪ5 Деи С1.п А1а Туг Деи А1а А1а А1а Ηΐδ ТЬг Рго Тгр А1а Деи Деи

- 31 026336

25

Рго Уа1 Рго ΗΪ5 Агд Туг Азр Ьеи Ьеи С1и Рго

40

Ьеи Тгр Рго С1и Ьеи Рго Азр А1а Уа1 Не Ηίε

55

Туг Уа1 Рго С1и А1а РЬе Агд Аэр Рго А1а Агд

70 75

Ьеи Ьеи С1у ТЬг Ьеи Азп Ьеи Ьеи С1п А1а Ьеи

90

Зег С1у ТЬг РЬе Ьеи Туг 11е Зег Зег С1у Азр

100 105

А1а 31и А1а А1а Ьеи Рго 11е ΗΪ3 С1и С1и Ьеи

115 120

Азп Рго Туг А1а Уа1 Зег Ьуз Ьеи А1а А1а С1и

130 135

Тгр С1у Не ТЬг С1и С1у Тгр Агд Уа1 Ьеи Уа1

145 150 155

Нхз Не С1у Рго С1у С1п Ьуз Азр Зег РЬе Уа1

165 170

Агд С1п 11е А1а Агд МеЬ Ьуз С1п С1у Ьеи С1п

Азр Зег Ьеи С1у Азр

Ьеи А1а С1у С1п ТЬг

ТЬг Ьеи С1п Не Азп

Ьуз А1а Агд С1у РЬе

Уа1 Туг С1у С1п Уа1

110

Не Рго ΗΪ3 Рго Агд

125

Зег Ьеи Суз Ьеи С1п

140

А1а Агд Рго РЬе Азп

160

Не А1а Зег А1а А1а

175

А1а Азп Агд Ьеи 61и

190

Азр Уа1 С1п Азр \7а1

205

51и А1а С1у А1а Уа1

220

Агд С1и Ьеи Не С1и

240

11е Уа1 61п Азр Рго

255

Агд С1у Зег Нпз А1а

270

11е ТЬг 11е Ьуз С1п

285

Агд Уа1 Агд 61и С1и

300

			180					185
Уа1	С1у	Азр	Не	Азр	Уа1	Зег	Агд	Азр	РЬе	Ьеи
		195					200
Ьеи	Зег	А1а	Туг	Ьеи	А.гд	Ьеи	Ьеи	Зег	ΗΪ3	61у
	210					215
Туг	Азп	Уа1	Суз	Зег	С1у	С1п	С1и	С1п	Ьуз	Не
225					230					235
Ьеи	Ьеи	А1а	Азр	Пе	А1а	31п	Уа1	01и	Ьеи	С1и
				245					250
А1а	Агд	Ме£	Агд	Агд	А1а	С1и	31п	Агд	Агд	Уа1
			260					265
Агд	Ьеи	ΗΪ3	Азр	ТЬг	ТЬг	С1у	Тгр	Ьуз	Рго	С1и
		275					280
Зег	Ьеи	Агд	А1а	Не	Ьеи	Зег	Азр	Тгр	С1и	Зег
	290					295

<210> 2 <211> 294 <212> РКТ <213> АсЫпоЬасШиз асМпотусеЬетсотзЛапз <220>

- 32 026336 <221> ПЕПТИД <222> (1)..(294) <223> С0Р~6-дезокси-0-талозосинтетаза (СТ5) <400> 2

Меб Ьуз Не Ьеи Уа1 ТЬг С1у С1у Зег С1у РЬе Не С1у Ьуз Азп Ьеи

10 15

Не Туг Ьеи Ьеи Агд С1и Ьуз Агд С1и РЬе С1и Уа1 РЬе С1у А1а ТЬг

25 30

Уа1 С1и С1и ТЬг Мер Азр Ьеи ТЬг Азп Рго Суз Зег Уа1 С1п Зег Уа1

40 45

Ьеи С1и Ьуз ТЬг Ьуз Рго Азр РЬе 11е Уа1 Ηίδ Ьеи А1а А1а Ьеи ТЬг

55 60

РЬе \7а1 Рго Азп Азп Азп Рго Не ТЬг РЬе Туг Ьеи Уа1 Азп ТЬг Не

70 75 80

С1у ТЬг С1и Азп Ьеи Ьеи Агд Зег Не Уа1 Азр Ьеи Азп Уа1 А1а Ьуз

90 95

Ьеи <31у \7а1 Ьеи Суз РЬе Зег ТЬг А1а С1у Не Туг С1у Не С1п С1и

100 105 110

ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Зег С1и Зег Ьеи ТЬг Рго Ьуз Рго Уа1 Азп Ηίδ Туг

115 120 125

Зег Мер Зег Ьуз Шз Суз Мер С1и Шз Не νβΐ Азп Ьуз Туг Агд Суз

130 135 140

РЬе Агд С1у Не ТЬг Уа1 Уа1 Агд Рго РЬе Азп Уа1 Ьеи С1у Ьеи С1у

145 150 155 160

С1п Азп Не Азп РЬе Ьеи Уа1 Рго Ьуз Мер Уа1 Зег А1а РЬе \7а1 Ьуз

165 170 175

Ьуз Азр Ьуз ТЬг Не С1и Ьеи С1у Азп Ьеи Азр Зег Уа1 Агд Азр РЬе

180 185 190

Не Зег Уа1. Азп Азр Суз Суз Азр Не Х1е Туг Агд Ьеи Не Зег Ьуз

195 200 205

Ьеи Не С1и Азп С1и ТЬг Не Азп Не Суз ТЬг С1у Не С1у Туг Зег

210 215 220

Уа1 Туг С1п Не РЬе С.1п Ьеи Ьеи Суз 51и Не Зег Мер Ηίδ С1п Мер

225 230 235 240

С1и Не Ьуз С1п Азп С1и Ьеи РЬе Уа1 Агд Ηίδ Азр Азр Не Рго С1п

245 250 255

Мер Не С1у Азр Рго Зег Ьуз Ьеи Ьеи Азп Уа1 Ьеи С1у Азп Азр Туг

260 265 270

Агд РЬе ТЬг Зег Уа1 Агд А1а Не Ьеи С1и С1и Мер Туг Ьуз Азп Агд

275 280 285

Ьеи Ьеи С1и Ьеи Зег Не

290 <210> 3 <211> 367 <212> РРТ <213> УЬЪНо сЬоЬегае <2 2 0>

<221> ПЕПТИД <222> (1) . . (367) <223> СГОР-Ь-перозаминсинтетаза <4С0> 3

МеТ Не Рго Уа1 Туг С1и Рго Зег

5

Ьеи Азп Азр Суз Не Азр Зег С1у

Не Азр Агд РЬе С1и ТЬг С1и РЬе

40

А1а ТЬг ТЬг Уа1 Зег Азп С1у ТЬг

55

А1а Ьеи С1у Не ТЬг С1п С1у Азр

70

Туг Уа1 А1а Зег Уа1 Азп ТЬг Не

РЬе А1а С1и Не С1и С1у С1и Зег

100

Ьуз Агд Ьуз 11е Азп Ьуз Ьуз ТЬг

115 ' 120

Туг С1у С1п А1а Суз Азр Не С1п

130 135

Низ С1у Ьеи Туг Ьеи Не С1и Азр

145 150

Уа1 Азп С1у Ьуз Ьуз Уа1 С1у ТЬг

165

РЬе РЬе С1у Азп Ьуз ТЬг Не ТЬг

180

Зег Азп Зег Азр Не Не Не Азр

195 200

С1у Уа1 Уа1 А1а С1у Ьуз Агд Туг

210 215

Туг Агд Меи ТЬг Азп Ьеи Суз А1а (Рег)

Ьеи Азр

Тгр Уа1

А1а С1и

Уа1 А1а

С1и Уа1

Уа1 С1п

Ьеи С1п

105

Ьуз А1а

Зег Ьеи

Суз А1а

РЬе С1у

170

Зег С1у

185

Ьуз Суз

Тгр Низ

А1а Не

61у Азп 61и Агд Ьуз Туг

Зег Зег Агд С1у Ьуз Туг ' 30

РЬе Ьеи Ьуз Уа1 Ьуз НЬз

Ьеи НЬз Ьеи А1а Меи Зег

Не Уа1 Рго ТЬг РЬе ТЬг

80

Суз С1у А1а Ьеи Рго Уа1

Уа1 Зег Уа1 С1и Азр Уа1 но

Уа1 Меи А1а Уа1 НЬз 11е

125

Агд Азр Ьеи Суз Азр С1и

140

С1и А1а Не С1у ТЬг А1а

155 160

Азр Уа1 Зег ТЬг РЬе Зег

175

С1и С1у С1у Мер Уа1 Уа1

190

Ьеи Агд Ьеи Ьуз Азп С1п

205

Азр Ьеи Уа1 А1а Туг Азп

220

С1у Уа1 А1а С1п Ьеи С1и

- 34 026336

225

230

235

240

Агд

Уа1

Азр

Ъуз

Пе

Не

Ъуз

Агд

Ъуз

Агд

Азр

Не

А1а

С1и

Не

Туг

245

250

255

Агд

Зег

С1и

Ъеи

А1а

31у

Ъеи

Рго

Мер

С1п

Уа1

ΗΪ5

Ъуз

С1и

Зег

Азп

260

265

270

С1у

ТЬг

РЬе

ΗΪ3

Зег

Туг

Тгр

Ъеи

ТЬг

5ег

Не

Не

Ъеи

Азр

С1п

С1и

275

280

285

РЬе

С1и

Уа1

Ηίδ

Агд

Азр

С1у

Ъеи

Мер

ТЬг

РЬе

Ъеи

С1и

Азп

Азп

Азр

290

295

300

Не

С1и

Зег

Агд

Рго

РЬе

РЬе

Туг

Рго

А1а

НЪз

ТЬг

Ъеи

Рго

Мер

Туг

305

310

315

320

С1и

ΗΪ5

Ъеи

А1а

С1и

Туз

ТЬг

А1а

РЬе

Рго

Ъеи

Зег

Азп

Зег

Туг

Зег

325

330

335

ΗΪ5

Агд

С1у

Не

Азп

Ъеи

Рго

Зег

Тгр

Рго

С1у

Ъеи

Суз

Азр

Азр

С1п

340

345

350

Уа1

Ъуз

С1и

Не

Суз

Азп

Суз

Не

Ъуз

Азп

Туг

РЬе

Азп

Суз

Не

355

360

365

<210> 4 <211> 388 <212> РРТ <213> ЕзсЬегЪсЫа соН <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1)..(388)

6ϋΡ-4-кето-б-дезоксиманнозо-З-дегидратаза (СоЮ) <400> 4

Мер 1

Не Азп Туг Рго Ъеи 5

А1а

Зег Зег ТЬг Тгр Азр Азр Ъеи С1и Туг

10

15

Ъуз

А1а

Не

С1п

Зег

Уа1

Ъеи

Азр

Зег

Ъуз

Мер

РЬе

ТЬг

Мер

С1у

С1и

20

25

30

Туг

Уа1

Ъуз

С1п

Туг

С1и

ТЬг

С1п

РЬе

А1а

Ъуз

ТЬг

РЬе

С1у

Зег

Ъуз

35

40

45

Туг

А1а

Уа1

Мер

Уа1

Зег

Зег

С1у

Зег

ТЬг

А1а

Азп

Ъеи

Ъеи

Мер

Не

50

55

60

А1а

А1а

Ъеи

РЬе

РЬе

ТЬг

Ъуз

Ъуз

Рго

Агд

Ъеи

Ъуз

Ъуз

С1у

Азр

31и

65

7 0

75

80

Не

Не

Уа1

Рго

А1а

Уа1

Зег

Тгр

Зег

ТЬг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Ъеи

С1п

85

90

95

С1п

Туг

С1у

Ъеи

Агд

Уа1

Ъуз

РЬе

Уа1

Азр

Не

Азр

Не

Азп

ТЬг

Ъеи

- З5

- 37 026336

Зег

Азп

С1у

Зег

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

Тгр

СПу

ТЬг

С1у

Ьуз

Рго

Агд

Агд

195

200

205

С1п

РЬе

Не

Туг

Зег

Ьеи

Азр

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

РЬе

Не

Тгр

Уа1

Ьеи

210

215

220

Агд

С1и

Туг

Азп

С1и

Уа1

С1и

Рго

Не

Не

Ьеи

Зег

Уа1

С1у

С1и

С1и

225

230

235

240

Азр

С1и

Уа1

Зег

Не

Ьуз

С1и

А1а

А1а

С1и

А1а

νεί

Уа1

С1и

А1а

Мер

245

250

255

Азр

РЬе

Суз

С1у

С1и

Уа1

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

ТЬг

Ьуз

Зег

Азр

С1у

С1п

260

265

270

Туг

Ьуз

Ьуз

ТЬг

А1а

Зег

Азп

Пу

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

Туг

Ьеи

Рго

Азр

275

280

285

РЬе

Агд

РЬе

ТЬг

Рго

РЬе

Ьуз

С1п

А1а

Уа1

Ьуз

С1и

ТЬг

Суз

А1а

Тгр

290

295

300

РЬе

ТЬг

Азр

Азп

Туг

С1и

СЬп

А1а

Агд

Ьуз

305

310

<210> 7 <211> 307 <212> ΡΗΤ <213> ЕзсЬегЬсЫа соН <220>

<221> ПЕПТИД <222> (1) .. (307) <223> СЬР-Ь-колитозосинтаза (Со1С) <400> 7

Мер

Ьуз

Не

Ьеи

Ьеи

ТЬг

С1у

Зег

ТЬг

С1у

Мер

Уа1

С1у

Агд

Азп

Не

1

5

10

15

Уа1

Азр

Азп

Азп

Азп

Зег

Азп

Ьуз

Туг

С1и

Ьеи

Ьеи

Суз

Рго

ТЬг

Зег

20

25

30

Зег

С1и

Ьеи

Азп

Ьеи

Ьеи

Азр

Азп

Ьуз

А1а

Уа1

НЬз

Азр

Туг

11е

ТЬг

35

40

45

Суз

НЬз

Зег

Рго

Азр

Ьеи

Не

Не

ΗΪ5

А1а

А1а

С1у

Ьеи

Уа1

С1у

С1у

50

55

60

Не

С1п

А1а

Азп

Не

Ьуз

Агд

Рго

Уа1

Азр

РЬе

Ьеи

Уа1

Зег

Азп

Ьеи

65

70

75

80

Ьуз

Мер

С1у

Уа1

Азп

Не

Уа1

Азп

С1и

А1а

Ьуз

Азп

Суз

С1у

Уа1

Ьуз

85

90

95

Азп

РЬе

Не

Азп

Ьеи

С1у

Зег

Зег

Суз

Мер

Туг

Рго

Ьуз

С1у

Не

Азр

100

105

110

ТЬг

А1а

Не

Зег

С1и

Азр

А1а

Ьеи

Ьеи

ТЬг

С1у

Ьуз

Ьеи

С1и

НЬз

ТЬг

- 39 026336

115 120 125

Азп С1и С1у Туг А1а Теи А1а Туз Не ТЬг Уа1 А1а Туз Теи Суз С1и

130 135 140

Туг Не ТЬг Туз С1и Зег С1и С1у Туг Н±з Туг Туз ТЬг Не Не Рго

145 150 155 160

Суз Азп Теи Туг С1у Туз Туг Азр Туз РЬе Азр О1и ΗΪ3 Зег Зег Ηί$

165 170 175

МеО 11е Рго А1а Уа1 Не Азп Агд Не ΗΪ3 Азп А1а Туз Уа1 Азп Азп

180 185 190

Не Туз Теи Не (31и Не Тгр С1у Азр С1у С1и Зег Агд Агд С1и РЬе

195 200 205

МеЬ Туг А1а С1и Азр РЬе А1а Азп РЬе Не Туг С1п А1а Не Рго Азп

210 215 220

Не С1п Агд Теи Рго Суз МеТ Теи Азп Уа1 С1у Теи С1у Ηίε Азр РЬе

225 230 235 240

Зег Не Азп Азр Туг Туг Туз Уа1 Не А1а С1и С1и Не 31у Туг Туз

245 250 255

С1у Зег РЬе ТЬг Ηίε Азр Ьеи ТЬг Туз Рго Уа1 С1у МеС Агд Агд Туз

260 265 270

Теи \7а1 Азр Не ТЬг Теи Ьеи Зег С1и РЬе С1у Тгр Туз Туг С1п РЬе

275 280 285

С1и Теи Агд Азр С1у 11е Туз О1и ТЬг Туг Ьуз Туг Туг Ьеи С1и Азп

290 295 300

Уа1 Туг Ьуз

305

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Клетка позвоночных, содержащая по меньшей мере один фермент, выбранный из группы, состоящей из ΟΌΡ-6 -дезоксиШ-ликсо-4-гексулозоредуктазы (ΚΜΌ), ΟΌΡ перозаминсинтетазы (Ρογ), ΟΌΡ6-дезоксиШ-талозосинтетазы (ΟΤ8), мутанта Су81098ег ΟΌΡ-фукозосинтетазы (ΟΡ8-Су81098е^) и ΟΌΡ4-кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратазы (СоШ), где указанный фермент использует в качестве субстрата Ο^Ρ-б-дезокси-^-ликсо-4-гексулозу (ΟΌΡ4-кето-б-деоксиШ-маннозу), которая является ключевым промежуточным продуктом в пути синтеза фукозы йе ηονο, и не катализирует реакцию, которая преобразует Ο^Ρ-б-дезокси-^-ликсо-4-гексулозу в ΟΌΡ-Ε-фукозу, и где указанная клетка может быть использована для продукции белка или липида, не содержащего фукозу или содержащего сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах по сравнению с количеством фукозы в его гликановых фрагментах, когда белок или липид продуцируется в клетке позвоночных, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам.
2. 2. Клетка позвоночных по п.1, в которой по меньшей мере один фермент содержит маркерную метку, которая предпочтительно является флуоресцентным белком или аффинной меткой.
3. 3. Клетка позвоночных по п.1 или 2, в которой Ο^Ρ-б-дезокси-^-ликсо-4-гексулозоредуктаза (ΚΜΌ) происходит из Ρ8еийοтοηа8 аеш§то8а и имеет аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ ΝΟ 1.
4. 4. Клетка позвоночных по любому из пп.1-3, содержащая ΟΌΡ-Ό-рамнозу, ΟΌΡ-Ό-перозамин, ΟΌΡдезокси-О-талозу, ΟΌΡ-6-дезокси-О-альтрозу, Ο^Ρ-4-кето-3,б-дидезокси-^-маннозу и/или ΟΌΡ-Όколитозу.
5. 5. Клетка позвоночных по любому из пп.1-4, в которой фермент экспрессируется с последовательности нуклеиновой кислоты, которая присутствует временно или поддерживается стабильно в указанной клетке.

   - 40 026336
6. 6. Клетка позвоночных по любому из пп.1-5, в которой фермент экспрессируется с единицы экспрессии, содержащей одну или несколько последовательностей позвоночных, контролирующих экспрессию, функционально связанных с полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный фермент.
7. 7. Клетка позвоночных по любому из пп.1-6, в которой белок является эндогенным или экзогенным белком.
8. 8. Клетка позвоночных по п.7, в которой белок является антителом, предпочтительно антителом 1дС1, фрагментом антитела, предпочтительно фрагментом антитела, содержащим Рс-область антитела, гибридным белком, предпочтительно гибридным белком, содержащим Рс-область антитела, вирусным белком, фрагментом вирусного белка, антигеном или гормоном.
9. 9. Клетка позвоночных по любому из пп.1-8, представляющая собой клетку млекопитающего, рыбы, амфибии, рептилии или птицы.
10. 10. Клетка позвоночных по п.9, где:

    I) клетка млекопитающего представляет собой клетку человека, хомячка, собаки или обезьяны, предпочтительно клетку яичника китайского хомячка, клетку почки африканских зеленых обезьян (АТСС СКЬ-1587), человеческую клетку рака шейки матки (АТСС ССЬ 2), клетку почки собаки линии Μ;·ιώπ ОагЬш (АТСС ССЬ 34), человеческую клетку ΡΕΚΌ6 или человеческую клетку АСЕ1.НИ;

    II) клетка рыбы представляет собой клетку яичников каналового сома Κΐ;·ι1ιιπΐ5 рипс1а1и5 (АТСС СКЬ-2772);

    III) клетка амфибии представляет собой клетку почек Хепориз 1аеу15 (АТСС ССЬ-102);

    IV) клетка рептилий представляет собой клетки сердца !диапа 1диапа (АТСС ССЬ-108) или

    V) клетка птицы представляет собой клетку сетчатки птицы, предпочтительно клетку АСЕ1.СКЫХ или сомитную клетку птицы.
11. 11. Клетка позвоночных по любому из пп.1-10, которая дополнительно содержит по меньшей мере одну гликозилтрансферазу для С^Ρ-^-рамнозы, С^Ρ-^-перозамина, С^Ρ-6-дезокси-^-талозы, С^Ρ-6дезоксиГО-альтрозы, С^Ρ-4-кето-3,6-дидезокси-^-маннозы или С^Ρ-^-колитозы.
12. 12. Способ продуцирования белка или липида, не содержащего фукозу или содержащего сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах по сравнению с количеством фукозы в его гликановых фрагментах, когда белок или липид продуцируется в клетке позвоночных, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам, включающий стадии:

    I) предоставление клетки позвоночных по любому из пп.1-11;

    II) культивирование указанной клетки позвоночных в условиях, обеспечивающих продукцию белка или липида; и

    III) выделение белка или липида, не содержащего фукозу или содержащего сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах из культивированной клетки.
13. 13. Терапевтическая композиция антител, содержащих Ν-гликаны типа С0-С1сNΑс и не содержащих фукозу и/или содержащих сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах по сравнению с количеством фукозы в гликановых фрагментах антител, которые продуцируются в клетке позвоночных, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам, где указанную композицию получают способом по п.12.
14. 14. Единица экспрессии, содержащая одну или несколько последовательностей позвоночных, контролирующих экспрессию, функционально связанных с полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, где указанный фермент использует С^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозу (С^Ρ-4-кето-6-деокси-^маннозу), которая является ключевым промежуточным продуктом в пути синтеза фукозы йе поуо, в качестве субстрата и не катализирует реакцию, которая преобразует С^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозу в С^Ρ-^-фукозу, и где указанный фермент выбирают из группы, состоящей из С^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4гексулозоредуктазы (ΚΜΌ), С^Ρ-перозаминсинтетазы Тег), С^Ρ-6-дезокси-^-талозосинтетазы (СТЗ), мутанта Су5109Зег С^Ρ-фукозосинтетазы (СРЗ-Су5109Зег) и С^Ρ-4-кето-6-дезоксиманнозо-3дегидратазы (СоГО).
15. 15. Единица экспрессии по п.14, где фермент содержит маркерную метку, которая предпочтительно является флуоресцентным белком или аффинной меткой.
16. 16. Способ получения эукариотической клетки по п.6, включающий стадию введения единицы экспрессии по п.14 или 15 в клетку позвоночных.
17. 17. Клетка насекомых, содержащая:

    I) первый полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, выбранный из группы, состоящей из С^Ρ-6-дезокси-^-ликсо-4-гексулозоредуктазы (ΚΜΌ), С^Ρ-перозаминсинтетазы Тег), С^Ρ-6-дезокси-^-талозосинтетазы (СТЗ), мутанта Су5109Зег С^Ρфукозосинтетазы (СРЗ-Су5109Зег) и С^Ρ-4-кето-6-дезоксиманнозо-3-дегидратазы (СоГО), и

    II) второй полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок,

    - 41 026336 где указанный фермент использует в качестве субстрата 0ВР-6-дезокси-Э-ликсо-4-гексулозу (СЭР4-кето-6-деокси-О-маннозу), которая является ключевым промежуточным продуктом в пути синтеза фукозы Фе поуо, и не катализирует реакцию, которая преобразует 0ВР-6-дезокси-В-ликсо-4-гексулозу в 0ПР-Ь-фукозу, и где указанная клетка может быть использована для продукции белка, не содержащего фукозу или содержащего сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах по сравнению с количеством фукозы в его гликановых фрагментах, когда белок продуцируется в клетке насекомых, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам.
18. 18. Клетка по п.17, где белок содержит маркерную метку, которая предпочтительно является флуоресцентным белком или аффинной меткой.
19. 19. Клетка по одному из пп.17 или 18, в которой белок является антителом, предпочтительно антителом 1§01, фрагментом антитела, предпочтительно фрагментом антитела, содержащим Рс-область антитела, гибридным белком, предпочтительно гибридным белком, содержащим Рс-область антитела, вирусным белком, фрагментом вирусного белка, антигеном или гормоном.
20. 20. Способ продуцирования белка, не содержащего фукозу или содержащего сниженное количество фукозы в гликановых фрагментах по сравнению с количеством фукозы в его гликановых фрагментах, когда белок продуцируется в клетке насекомых, способной добавлять фукозу к гликановым фрагментам, включающий стадии:

    I) предоставление клетки насекомых по любому из пп. 17-19,

    II) культивирование указанной клетки, при котором происходит экспрессия первого полинуклеотида, кодирующего фермент, и второго полинуклеотида, кодирующего белок, и

    III) выделение белка из упомянутой клетки.