ES2609846T3

ES2609846T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer pancreático

Info

Publication number: ES2609846T3
Application number: ES12819899.1T
Authority: ES
Inventors: Yoshitaka Minamida; Fumiyoshi Okano; Takanori Saito
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2011-08-04
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2017-04-24
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: US9409993B2; JPWO2013018886A1; EP2740489B1; EP2740489A1; WO2013018886A1; CA2844037C; KR102041832B1; RU2630638C2; RU2014108047A; BR112014002619A2; MX2014001372A; MX351414B; US20140308283A1; KR20140064835A; AU2012290949B2; JP6003650B2; HUE030130T2; EP2740489A4; AU2012290949A1; PT2740489T

Abstract

Una composicion farmaceutica para su uso en un metodo de tratamiento del cancer pancreatico, que comprende, como principio activo, un anticuerpo o un fragmento del mismo que tienen reactividad inmunologica especifica con una proteina CAPRIN-1 o un fragmento de la misma que comprende de 7 a 12 o mas restos de aminoacidos consecutivos.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

Después de confirmar un aumento en el nivel del anticuerpo deseado en el suero del mamífero inmunizado de este modo, se recogen inmunocitos del mamífero y se someten a fusión celular. Los ejemplos preferidos de los inmunocitos incluyen particularmente células de bazo.

5 Se usan células de mieloma de mamífero como células progenitoras compañeras para su fusión con los inmunocitos. Se conocen en la técnica varias líneas celulares, por ejemplo, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies.

D.H.: et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), y R210 (Galfre,

G.: et al., Nature (1979) 277, 131-133), se usan preferentemente como células de mieloma.

La fusión celular entre los inmunocitos y las células de mieloma puede efectuarse básicamente de acuerdo con un método conocido en la técnica, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C. Methods

15 Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Más específicamente, la fusión celular se lleva a cabo, por ejemplo, en presencia de un promotor de la fusión celular en un medio nutriente convencional. Por ejemplo, como promotor de fusión se usa polietilenglicol (PEG) o virus de Sendai (virus hemaglutinante de Japón (VHJ)). Si se desea, puede añadirse además un adyuvante, tal como dimetilsulfóxido, para potenciar la eficacia de la fusión.

La proporción entre los inmunocitos y las células de mieloma puede ajustarse de manera arbitraria. Por ejemplo, la cantidad de los inmunocitos se ajusta a de 1 a 10 veces la cantidad de las células de mieloma. Los ejemplos del medio que puede usarse en la fusión celular incluyen los medios RPMI1640 y MEM, adecuados para el crecimiento

25 de células de mieloma, así como medios convencionales para su uso en este tipo de cultivo celular. Además, puede usarse un complemento de suero, tal como suero de ternero fetal (FCS) en combinación con estas células.

Para la fusión celular, se mezclan exhaustivamente los inmunocitos y las células de mieloma en una cantidad predeterminada del medio. Normalmente se añade una solución de PEG (meso molecular medio: por ejemplo, de aproximadamente 1000 a 6000) precalentada a aproximadamente 37°C a la mezcla a una concentración del 30 al 60 % (p/v) y se mezcla con la misma para formar los hibridomas de interés. Posteriormente, se repiten los procedimientos de añadir secuencialmente un medio adecuado y retirar el sobrenadante por centrifugación para eliminar los agentes de fusión celular o similares no favorables para el crecimiento de los hibridomas.

35 Los hibridomas obtenidos de este modo se cultivan en un medio selectivo convencional, por ejemplo, un medio HAT (un medio que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina) para la selección. Se continúa el cultivo en el medio HAT durante un periodo (normalmente, de varios días a varias semanas) suficiente para la muerte de las células (células no fusionadas) distintas de los hibridomas de interés. Posteriormente, se exploran los hibridomas que producen el anticuerpo de interés y se clonan como clones individuales mediante un método convencional de dilución limitante.

Además de dicha obtención de los hibridomas mediante la inmunización de animales no humanos con antígenos, pueden obtenerse hibridomas que producen anticuerpos humanos que tienen la actividad deseada (por ejemplo, actividad inhibidora del crecimiento celular) sensibilizando a linfocitos humanos, por ejemplo, linfocitos humanos

45 infectados con el virus EB, con proteínas, células que expresan proteínas, o lisados de las mismas in vitro y fusionando los linfocitos sensibilizados con células de mieloma de origen humano capaces de dividirse permanentemente, por ejemplo, U266 (n.º de referencia TIB 196).

Los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal preparado de este modo pueden subcultivarse en un medio convencional y también pueden almacenarse durante un largo periodo en nitrógeno líquido.

Específicamente, los antígenos deseados o las células que expresan los antígenos deseados se usan como antígenos sensibilizantes en la inmunización de acuerdo con un método de inmunización convencional. Los inmunocitos obtenidos se fusionan con células progenitoras conocidas en la técnica de acuerdo con un método de

55 fusión celular convencional. Las células productoras de anticuerpo monoclonal (hibridomas) pueden explorarse mediante un método de exploración convencional para preparar el anticuerpo de interés.

Otro ejemplo de anticuerpo que puede usarse en la presente invención es un anticuerpo policlonal. El anticuerpo policlonal puede obtenerse, por ejemplo, del modo siguiente:

Se obtiene suero de animales pequeños, tales como ratones, ratones productores de anticuerpos humanos, o conejos inmunizados con proteínas CAPRIN-1 naturales o proteínas CAPRIN-1 recombinantes expresadas como proteínas de fusión con GST o similares en microorganismos, tales como E. coli, o péptidos parciales de la misma. Este suero se purifica usando, por ejemplo, precipitación por sulfato de amonio, columnas de proteína A o de 65 proteína G, cromatografía de intercambio iónico de DEAE, o columnas de afinidad acopladas con proteínas CAPRIN1 o péptidos sintéticos para preparar el anticuerpo policlonal de interés. En los ejemplos descritos más adelante, se

9

imagen8

imagen9

polipeptídico que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamíferos, preferentemente seres humanos. Su unidad más pequeña consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, preferentemente de 8 a 11 aminoácidos.

El anticuerpo usado en la presente invención tiene una constante de afinidad Ka (kon/koff) de preferentemente al 5 menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 × 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 × 109 M-1, al menos 1010 M-1 , al menos 5 ×1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 × 1011 M-1, al menos 1012 M-1, o al menos 1013 M-1 .

El anticuerpo usado en la presente invención puede conjugarse con un agente antitumoral. La conjugación del anticuerpo con el agente antitumoral puede efectuarse mediante un espaciador que tiene un grupo (por ejemplo, un grupo succinimidilo, un grupo formilo, un grupo 2-piridiltio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo, o un grupo hidroxi) reactivo con un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo tiol, o similares.

Los ejemplos del agente antitumoral incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos públicamente en las bibliografías, por ejemplo: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, 15 tiotepa, busulfán, improsulfán, piposulfán, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, butalacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de mecloretamina clorhidrato, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliceamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-Lnorleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, 25 estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (por ejemplo, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, y testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidracida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, ácido tenuazonico, triazicuona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatino,

35 oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecán, inhibidores de topoisomerasa, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina, y sales farmacéuticamente aceptables (conocidas en la técnica) y derivados (conocidos en la técnica) de los mismos.

Como alternativa, el anticuerpo usado en la presente invención puede administrarse en combinación con un agente antitumoral para producir un mayor efecto terapéutico. Esta técnica puede adaptarse a un paciente con cáncer que expresa CAPRIN-1 antes o después de una intervención quirúrgica. Esta estrategia puede aplicarse, particularmente después de la cirugía, a un cáncer que expresa CAPRIN-1, que se ha tratado convencionalmente solo con un agente antitumoral, para producir una mayor prevención de la recidiva del cáncer o para la prolongación del tiempo de

45 supervivencia.

Los ejemplos del agente antitumoral usado en la administración combinada incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos públicamente en las bibliografías, por ejemplo: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfán, improsulfán, piposulfán, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, butalacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de mecloretamina clorhidrato, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, 55 caliceamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinano, lonidamina, maitansina, 65 ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidracida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, ácido

12

imagen10

codifica una región variable A de cadena pesada, un ADN que codifica una región variable B de cadena ligera, un ADN que codifica una región variable B de cadena pesada, y un ADN que codifica una región variable A de cadena ligera en este orden (siempre que el ADN que codifica una región variable B de cadena ligera y el ADN que codifica una región variable B de cadena pesada estén ligados mediante un ADN que codifica un enlazador como se ha

5 descrito anteriormente). En este contexto, las regiones variables de cadena pesada y ligera proceden todas de un anticuerpo humano o proceden de un anticuerpo humano que tiene las CDR sustituidas por CDR de un anticuerpo procedente de un animal no humano (por ejemplo, de ratón, rata, o pollo).

Los ADN recombinantes preparados de este modo pueden incorporarse en uno o más vectores adecuados, que después se introducen en células hospedadoras (por ejemplo, células de mamífero, células de levadura, y células de insecto) de tal forma que los ADN se (co)expresan para producir anticuerpos recombinantes (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, Shepherd y C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; y J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

15 Los ejemplos del anticuerpo de la presente invención preparados mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente incluyen los siguientes anticuerpos (a) a (y):

(a): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las SEQ ID NO: 37, 38, y 39 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 41, 42, y 43 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 40 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44);

(b): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 47, 48, y 49 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 51, 52, y

25 53 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 50 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 54);

(c): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 57, 58, y 59 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 61, 62, y 63 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 60 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 64);

(d): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 67, 68, y 69 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 71, 72, y 73 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 70 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 74);

35 (e) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 77, 78, y 79 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 81, 82, y 83 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 80 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 84);

(f): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 87, 88, y 89 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 91, 92, y 93 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 90 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 94);

(g): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 97, 98, y 99 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 101, 102,

45 y 103 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 100 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 104);

(h): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 107, 108, y 109 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 111, 112, y 113 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 110 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 114);

(i): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 117, 118, y 119 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 121, 122, y 123 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 120 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 124);

55 (j) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 127, 128, y 129 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 121, 122, y 123 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 130 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 124);

(k): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 132, 133, y 134 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 136, 137, y 138 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 135 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 139);

(l): un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 142, 143, y 144 y una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de las SEQ ID NO: 146,

65 147, y 148 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 145 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 149);

14

imagen11

imagen12

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención se une a proteínas CAPRIN-1 en las células de cáncer pancreático y muestra un efecto antitumoral mediante la actividad anterior. Por lo tanto, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invención es potencialmente útil en el tratamiento del cáncer pancreático. Específicamente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer pancreático, que

5 comprende el anticuerpo anti-CAPRIN-1 como principio activo. El anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado con el fin de administración a cuerpos humanos (terapia de anticuerpos) es preferentemente un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 con mayor afinidad de unión por una proteína CAPRIN-1 en la superficie de células de cáncer pancreático ejerce una actividad antitumoral más fuerte. Por lo tanto, puede esperarse un efecto antitumoral más fuerte en caso de que pueda obtenerse un anticuerpo anti-CAPRIN-1 que tenga una elevada afinidad de unión por la proteína CAPRIN-1. Dicho anticuerpo puede adaptarse a una composición farmacéutica pensada para el tratamiento del cáncer pancreático. De manera deseable, dicha elevada afinidad de unión es preferentemente de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 × 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 × 109 M-1, al menos 1010 M-1 ,

15 almenos5×1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 × 1011 M-1, al menos 1012 M-1, o al menos 1013 M-1, en términos de una constante de asociación (constante de afinidad) Ka (kon/koff), como se ha descrito anteriormente.

<Unión a células que expresan antígenos>

Puede determinarse la capacidad del anticuerpo para unirse a CAPRIN-1 mediante el uso de un ensayo de unión usando, por ejemplo, ELISA, transferencia de Western, inmunofluorescencia, y análisis por citometría de flujo, tal como se describe en los ejemplos.

<Tinción inmunohistoquímica>

25 Puede ensayarse la reactividad del anticuerpo que reconoce a CAPRIN-1 con CAPRIN-1 mediante un método inmunohistoquímico de sobra conocido para los expertos en la materia usando una sección congelada fijada en paraformaldehído o acetona o una sección incluida en parafina fijada con paraformaldehído de un tejido obtenido de un paciente durante una intervención quirúrgica o de un animal que porta un xenoinjerto de tejido inoculado con una línea celular que expresa CAPRIN-1 ya sea de manera espontánea o después de su transfección.

Para la tinción inmunohistoquímica, puede teñirse el anticuerpo reactivo con CAPRIN-1 mediante diversos métodos. Por ejemplo, puede visualizarse el anticuerpo por reacción con un anticuerpo de cabra anti-ratón o un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado a peroxidasa de rábano picante.

35 <Composición farmacéutica>

Una diana de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer pancreático de la presente invención no está particularmente limitada en tanto que la diana sea (una célula) de cáncer pancreático que expresa un gen de CAPRIN-1.

Los términos "tumor" y "cáncer" usados en el presente documento significan neoplasia maligna y se usan de manera intercambiable entre sí.

45 El cáncer pancreático diana en la presente invención es cáncer pancreático que expresa un gen que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 30 con número par

o una secuencia parcial de las mismas que consiste en 7 a 12 o más aminoácidos consecutivos.

Los ejemplos del cáncer pancreático incluyen, pero sin limitación, carcinoma pancreático ductal, carcinoma pancreático ductal invasivo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasia papilar-mucinosa intraductal (IPMN), neoplasia quística mucinosa (MCN), pancreoblastoma, cistadenocarcinoma seroso, tumor sólido seudopapilar (SPT), gastrinomas (síndrome de Zollinger-Ellison), glucagonomas, insulinoma, neoplasia endocrina múltiple de tipo-1 (MEN1) (síndrome de Wermer), tumor de células de islote no funcionales, somatostatinomas, y VIPomas.

55 Los animales receptores son mamíferos, por ejemplo, mamíferos incluyendo primates, animales de compañía, ganado, y animales de deporte y de manera particularmente preferente son seres humanos, perros, y gatos.

En caso de usar el anticuerpo de la presente invención en forma de una composición farmacéutica, la composición farmacéutica puede formularse mediante un método conocido generalmente para los expertos en la materia. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede usarse en forma de una inyección parenteral de una solución o suspensión aséptica con agua o cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede formularse con el anticuerpo mezclado en una forma de dosis unitaria requerida para la práctica farmacéutica generalmente aceptada, en combinación adecuada con vehículos o medios farmacológicamente

65 aceptables, específicamente, agua esterilizada, suero salino fisiológico, aceite vegetal, un emulsionante, un agente suspensor, un tensioactivo, un estabilizante, un agente aromatizante, un excipiente, un vehículo, un conservante, un

17

imagen13

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se describirá específicamente en referencia a los ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no pretende estar limitado por estos ejemplos específicos. 5 [Ejemplo 1] Identificación de proteínas antigénicas del cáncer pancreático mediante el método SEREX

(1) Preparación de la biblioteca de ADNc

Se extrajeron los ARN totales del tejido testicular de un perro sano mediante el método de guanidinio ácido-fenolcloroformo. Los ARN de poli-A se purificaron usando el kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) de acuerdo con el protocolo adjunto con el kit.

Los ARNm (5 µg) obtenidos de este modo se usaron para sintetizar una biblioteca de fago de ADNc testicular

15 canino. La biblioteca de fago de ADNc se preparó usando el kit de síntesis de ADNc, el kit de síntesis de ZAP-ADNc, y el kit de clonación de ZAP-ADNc Gigapack II Gold (fabricado por Stratagene Corp.) según los protocolos adjuntos con los kits. La biblioteca de fago de ADNc preparada tenía un tamaño de 7,73 × 105 ufp/ml.

(2) Exploración de la biblioteca de ADNc usando suero

La biblioteca de fago de ADNc testicular canino preparada de este modo se usó en inmunoexploración. Específicamente, se infectó a E. coli hospedadoras (XL1-Blue MRF’) con los fagos en una placa de agarosa NZY (Φ90 × 15 mm) para dar 2210 clones. El hospedador se cultivó a 42°C durante 3 a 4 horas para formar placas. La placa se cubrió a 37°C durante 4 horas con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricada por GE

25 Healthcare Bio-Sciences Ltd.) infiltrada con IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) para la inducción y expresión de proteínas para transferir las proteínas a la membrana. Después, se recuperó la membrana, se empapó en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) que contenía leche desnatada al 0,5 %, y se agitó durante una noche a 4°C para suprimir la reacción no específica. Se hizo reaccionar este filtro con suero diluido 500 veces de un perro afectado a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.

El suero anterior de un perro afectado usado era suero recogido de un perro afectado por cáncer de mama. El suero se almacenó a -80°C y se pretrató inmediatamente antes de su uso. El pretratamiento del suero se llevó a cabo mediante el método siguiente: se infectaron E. coli hospedadoras (XL1-Blue MRF’) mediante fagos de expresión λ ZAP que no tenían inserto de gen exógeno y después se cultivaron durante una noche en una placa de medio NZY a

35 37°C. Después, se añadió a la placa tampón de NaHCO3 0,2 M (pH 8,3) que contenía NaCl 0,5 M. Se dejó reposar la placa a 4°C durante 15 horas. Después, se recuperó el sobrenadante en forma de un extracto de E. coli/fago. A continuación, el extracto de E. coli/fago recuperado se aplicó a una columna de NHS (fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) para inmovilizar a las proteínas procedentes de E. coli/fago sobre la misma. Se aplicó el suero de un perro afectado a esta columna con proteína inmovilizada y se hizo reaccionar con la misma. Los anticuerpos adsorbidos en las E. coli y los fagos se retiraron del suero. Se diluyó una fracción del suero que había pasado a través de la columna 500 veces con TBS que contenía leche desnatada al 0,5 %. Esta dilución se usó como material de inmunoexploración.

La membrana embotellada con el suero tratado de este modo y las proteínas de fusión se lavó cuatro veces con

45 TBS-T (Tween 20 al 0,05 %/TBS) y después se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora con anticuerpos de cabra anti-IgG de perro (anticuerpo de cabra anti-IgG-h+l de perro conjugado a HRP; fabricado por BETHYL Laboratories, Inc.) diluido 5000 veces con TBS que contenía leche desnatada al 0,5 %, después de la detección mediante reacción enzimática de color usando solución madre de NBT/BCIP (fabricada por Roche Diagnostics K.K.). Se recogieron las colonias que se encontraban en los sitios positivos a la reacción de color de la placa de agarosa NZY (Φ 90 × 15 mm) y se lisaron en 500 µl de una solución de tampón SM (NaCl 100 mM, MgClSO4 10 mM, Tris-HCl 50 mM, gelatina al 0,01 %, pH 7.5). Posteriormente se efectuaron la exploración secundaria y la exploración terciaria del mismo modo que antes hasta que se obtuvieron colonias positivas a una sola reacción de color. De este modo, se exploraron 30940 clones de fagos reactivos con IgG en el suero. Después, se aislaron 5 clones positivos.

55

(3) Búsqueda de homología para el gen de antígeno aislado

Para someter a estos cinco clones positivos aislados de este modo a análisis de secuencia de nucleótidos, se llevaron a cabo procedimientos para convertir los vectores de fagos a vectores de plásmidos. Específicamente, se mezclaron 200 µl de una solución de E. coli hospedadoras (XL1-Blue MRF’) preparada de tal forma que la absorbancia DO600 era de 1,0 con 250 µl de una solución de fago purificado y adicionalmente con 1 µl de fago auxiliar ExAssist (fabricado por Stratagene Corp.), seguido de reacción a 37°C durante 15 minutos. Después, se añadieron 3 ml de medio LB a la mezcla de reacción. El hospedador se cultivó a 37°C durante 2,5 a 3 horas, inmediatamente después se incubó durante 20 minutos en un balo de agua a 70°C, y después se centrifugó a 1000 65 × g a 4°C durante 15 minutos para recuperar el sobrenadante en forma de una solución de fagémido. Posteriormente, se mezclaron 200 µl de una solución de E. coli hospedadoras de fagémido (SOLR) preparada de tal

19

forma que la absorbancia DO600 era de 1,0 con 10 µl de una solución de fago purificada, seguido de reacción a 37°C durante 15 minutos. Se inocularon 50 µl de la mezcla de reacción a un medio de agar LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 µg/ml) y se cultivó durante una noche a 37°C. Se recogió una sola colonia de SOLR transformadas y se cultivó a 37°C en un medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 µg/ml).

5 Después, se purificaron los ADN de plásmido que tenían los insertos de interés usando el kit QIAGEN plasmid Miniprep (fabricado por Qiagen N.V.).

Se analizaron las secuencias de longitud completa de los insertos en los plásmidos purificados mediante el método del cebador caminante usando un cebador de T3 representado por la SEQ ID NO: 31 y un cebador de T7 representado por la SEQ ID NO: 32. Este análisis de secuenciación proporcionó secuencias génicas representadas por las SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, y 13. A consecuencia de llevar a cabo la búsqueda de homología con genes conocidos usando las secuencias de nucleótidos de estos genes y secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, y 14) codificadas de este modo y el programa de búsqueda de homología BLAST Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), se observó que los cinco genes obtenidos eran genes que codificaban 15 CAPRIN-1. La identidad de secuencia entre estos cinco genes fue del 100 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en las regiones que se traducirían en proteínas y del 99 % en cuanto a sus secuencias de aminoácidos. La identidad de secuencia de estos genes con genes que codifican factores homólogos humanos fue del 94 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en regiones que se iban a traducir en proteínas y del 98 % respecto de sus secuencias de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos de los factores homólogos humanos se representan por las SEQ ID NO: 1 y 3, y sus secuencias de aminoácidos se representan por las SEQ ID NO: 2 y 4. Asimismo, la identidad de secuencia de los genes caninos obtenidos respecto de un gen que codifica un factor homólogo bovino fue del 94 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en regiones que se iban a transformar en proteínas y del 97 % respecto de sus secuencias de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del factor homólogo bovino está representada por la SEQ ID NO: 15, y su secuencia de aminoácidos está representada por la SEQ ID NO: 16. En 25 este contexto, la identidad de secuencia entre los genes que codifican los factores homólogos humanos y el gen que codifica el factor homólogo bovino fue del 94 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en las regiones que se iban a transformar en proteínas y del 93 al 97 % respecto de sus secuencias de aminoácidos. La identidad de secuencia de los genes caninos obtenidos respecto de un gen que codifica un factor homólogo de caballo fue del 93 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en regiones que se iban a transformar en proteínas y del 97 % respecto de sus secuencias de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del factor homólogo de caballo está representada por la SEQ ID NO: 17, y su secuencia de aminoácidos está representada por la SEQ ID NO: 18. En este contexto, la identidad de secuencia entre los genes que codifican los factores homólogos humanos y el gen que codifica el factor homólogo de caballo fue del 93 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en las regiones que se iban a transformar en proteínas y del 96 % respecto de sus secuencias de aminoácidos. La identidad de 35 secuencia de los genes caninos obtenidos con genes que codifican factores homólogos de ratón fue del 87 al 89 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en regiones que se iban a traducir en proteínas y del 95 al 97 % respecto de sus secuencias de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos de los factores homólogos de ratón se representan por las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, y 27, y sus secuencias de aminoácidos se representan por las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, y 28. En este contexto, la identidad de secuencia entre los genes que codifican los factores homólogos humanos y los genes que codifican los factores homólogos de ratón fue del 89 al 91 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en las regiones que se iban a transformar en proteínas y del 95 al 96 % respecto de sus secuencias de aminoácidos. La identidad de secuencia de los genes caninos obtenidos respecto de un gen que codifica un factor homólogo de pollo fue del 82 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en regiones que se iban a transformar en proteínas y del 87 % respecto de sus secuencias de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos

45 del factor homólogo de pollo está representada por la SEQ ID NO: 29, y su secuencia de aminoácidos está representada por la SEQ ID NO: 30. En este contexto, la identidad de secuencia entre los genes que codifican los factores homólogos humanos y el gen que codifica el factor homólogo de polo fue del 81 al 82 % respecto de sus secuencias de nucleótidos en las regiones que se iban a transformar en proteínas y del 86 % respecto de sus secuencias de aminoácidos.

(4) Análisis de la expresión génica de CAPRIN-1 en células de cáncer pancreático humano

Los genes obtenidos de este modo se examinaron respecto de su expresión en cuatro líneas celulares de cáncer pancreático humano (Capan-2, MIAPaCa-2, PANC-1, y BxPC-3) mediante RT-PCR. La reacción de 55 retrotranscripción se llevó a cabo del modo siguiente: se extrajeron los ARN totales de 50 a 100 mg de cada tejido y de 5 a 10 × 106 células de cada línea celular usando el reactivo TRIZOL (fabricado por Invitrogen Corp.) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. A partir de los ARN totales, se sintetizaron los ADNc usando el sistema de síntesis SuperScript First-Strand para RT-PCR (fabricado por Invitrogen Corp.) de acuerdo con el protocolo adjunto al mismo. La reacción PCR se llevó a cabo del modo siguiente usando cebadores (SEQ ID NO: 33 y 34) específicos para los genes obtenidos: La PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos repetitivos que implicaban cada uno 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos usando un ciclador térmico (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) y una solución de reacción con el volumen total ajustado a 25 µl mediante la adición de 0,25 µl de la muestra preparada mediante la reacción de retrotranscripción y cada reactivo y tampón adjunto (2 µM de cada uno de los cebadores, 0,2 mM de cada uno de dNTP, y 0,65 U de polimerasa ExTaq 65 (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.)). Los cebadores específicos de genes anteriores se diseñaron para amplificar la región de los nucleótidos con número 698 a 1124 en la secuencia de nucleótidos (gen de CAPRIN-1 humana) de

20

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

Claims

imagen1

imagen2