JP5663834B2 - 遺伝子組換え抗体の製造方法 - Google Patents
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Description
ウサギに免疫する抗原は、特に限定されず、ハプテン、ペプチド、タンパク質、核酸、細胞、脂質、糖鎖、細菌、蛍光物質、ビタミン類の中から任意に選択することができるが、特に、親和性および特異性などにおいて高い抗体性能が要求される抗原に対して本発明を適用するのが好ましい。具体的には、測定原理上高感度測定系を構築するために高い親和性が要求される競合法用の抗原、例えば、エストロン(E1)、エストラジオール(E2)、エストリオール(E3)、プロゲステロン、コルチゾールなどのステロイドホルモン類、サイロニン、サイロキシン、トリヨードサイロニンなどの甲状腺ホルモン類といったハプテンがあげられる。また、競合法用の抗原以外でも、例えば、Cペプチド、および脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)といった、高感度が要求されるペプチドへの適用も好ましい一例である。
抗原を免疫するウサギは、抗原の種類によって免疫応答は異なるため、できるだけ多くの系統と匹数に免疫するのが好ましい。ウサギの系統としては、一般に入手可能な日本白色種、およびニュージーランドホワイトが例示されるが、当該系統に限定されるものではない。また、同じ系統のウサギを用いても個体差があるため数匹から10匹程度の個体に免疫することで、免疫応答の高いウサギ由来の抗体産生細胞を入手するのが好ましい。
単離の対象となる抗体産生細胞は、抗体を産生する細胞であれば特に限定はされないが、脾臓由来の細胞、リンパ節由来の細胞、末梢血由来の細胞のいずれかを使うのが好ましい。また、抗体産生細胞の単離は通常実施されている方法で実施すればよい。単離した細胞はすぐに使用するのが好ましいが、一般的に入手できる細胞保存溶液中に分散させた状態で、液体窒素あるいはディープフリーザー中で保存することが可能であり、必要に応じて使用することが出来る。
上記(3)で単離した抗体産生細胞から目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別する必要がある。選別方法としては、非特許文献9にあるように、抗体を産生している細胞から一個の細胞を選別し、選別した細胞から抗体遺伝子を単離、増幅させる方法があるが、当該選別方法では抗原結合能しか評価ができないため、目的の性能を有した抗体を取得するのは困難である。そのため、本発明では、(3)で単離した抗体産生細胞を増殖させ、培養上清中に発現した抗体の有する競合特性、特異性、反応性といった性能を評価し、当該性能が高い抗体を発現している細胞を選別後、抗体遺伝子を単離することを特徴としている。
性能が評価できるまで培養する方法。
うな細胞と融合させることで、培養上清中の抗体性能を評価する方法。
死化し培養することで、抗体遺伝子を単離する細胞を選別する方法。
このうち、a)またはb)の方法を用いて増殖させる方法が好ましい。
抗体遺伝子を保有する細胞を選別するための抗体性能の評価方法は、対象抗体の評価内容に応じて適宜選択すればよい。例えば、評価内容としては、抗原結合能、競合特性、特異性、抗体生産性があげられ、評価方法としてはELISA法、RIA法、蛍光偏光法をあげることができる。
上記(4)で選別した細胞から重鎖(H鎖)および軽鎖(L鎖)の抗体遺伝子を単離する時期としては、抗原およびウサギの系統によって最適時期が異なるため、培養上清中に評価するための十分な抗体量が確保でき、かつ、抗体遺伝子の脱落が起きない期間であれば特に限定されないが、実施例12にあるように抗体産生細胞増殖開始後16日後で抗体遺伝子を単離すると、抗体遺伝子の増幅効率、および抗原結合活性を持った発現ベクターの取得率が低下していることから、抗体遺伝子の単離は抗体産生細胞増殖開始後14日以内に実施するのが好ましい。
抗体遺伝子の増幅方法としては通常用いられるRT−PCR法が使用できる。また、RT−PCR反応の際に用いる逆転写酵素およびDNAポリメラーゼは通常市販の酵素が使用できるが、特にDNAポリメラーゼはDNA増幅の際、変異が導入されるのを避けるため、Phusion High−Fidelity DNA polymerase(商品名)(第一化学薬品社製)やPrimeSTAR HS DNA polymerase(商品名)(タカラバイオ社製)といったフィデリティーの高い酵素を使用するのが好ましい。
発現用ベクターについては、一般的に報告されているベクターであれば限定されないが、特にpECEdhfr(非特許文献16、図4)を発現ベクターとして使用するのが好ましい。また、発現させる抗体の領域も、抗体の可変領域を含むように発現させればよく、発現の形としてはIgG、F(ab’)2、Fab、FV、scFVが例示できる。また、単離した抗体遺伝子を出発材料として、種々のアミノ酸変異を加えることで抗体の性能を変化させることは、当業者であれば容易に想到可能である。
発現ベクターは適切なホスト細胞に導入することにより、遺伝子組換え抗体を産生させることができる。一過的に遺伝子組換え抗体を高発現させるためには、SV40 large T抗原タンパク質発現細胞をホスト細胞として用いるのが好ましく、その一例として、実施例7、13、14で使用のCOS1細胞(非特許文献17、18)や、293T細胞、COS7細胞をあげることができる。
免疫抗原としてはE2−BSA(商品名)(Sigma社製)を使用した。またELISAでのスクリーニング用抗原は、下記の方法で作製した。
(1)BCP(Blue Carrier Protein:Pierce社製)100mgを10mg/mLになるようにPBSを加え、6位をN−ヒドロキシスクシイミドで活性化したエストラジオール(E2) 1.25mgをDMF 1mLに溶解したものと混合した。
(2)室温で2時間撹拌後、PBSで透析(1L×3回)することでE2−BCPを得た。
免疫動物はウサギ(日本白色種)の12週齢メスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、2次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用い、抗原溶液(500μg/mL)と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に2週間間隔で免疫した。免疫抗抗原量は、初回500μgで2次免疫以降は250μgである。
(1)E2−BCP(0.5μg/mL)をELISAプレートに固定化後、1%スキムミルクでブロッキングした。
(2)ウサギから採血した血清と反応させた。E2に結合した抗E2ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をB/F分離後、酵素基質である4―メチルウンベリフェリルリン酸(4−MUP)を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、定法に従い脾臓細胞を単離した。脾臓細胞を10%FCSを含むGIT培地(日水製薬社製)に懸濁し、マイクロプレートにまいて培養した。一週間後に培養上清を実施例2に記載の方法で、192クローンの培養上清中の抗体を評価した結果を図1に示した。このように、マイクロウエルプレートの上清中に抗体の産生を確認することができた。
以下に示す方法で、末梢血細胞由来のリンパ球と不死化能を与える細胞とを融合させた。
(1)十分に抗体価が上昇したウサギ末梢血から採取したリンパ球と、マウスミエローマ細胞の遺伝子にウサギの染色体が一部組み込まれている細胞(2−3A、特許文献1)を融合した。なお、本細胞(2−3A)は、栄研化学株式会社により樹立されたもので、栄研化学株式会社の好意により譲渡して頂いたものである。
(2)定法(PEG法)に従い、2−3A細胞と末梢血細胞由来のリンパ球とを融合させた。
(3)融合後の細胞浮遊液を10%FCS、1×HATを含むGIT培地(日水製薬社製)で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。
以下に示す方法で、脾臓細胞と不死化能を与える細胞とを融合させた。
(1)十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、定法に従って脾臓細胞を調製した。なお、ウサギ脾臓細胞と細胞融合する細胞は、実施例4で使用した細胞(2−3A、特許文献1)を使用した。
(2)定法(PEG法)に従い、2−3A細胞とウサギ脾臓細胞を融合させた。
(3)融合後の細胞浮遊液を10%FCS、1×HATを含むGIT培地(日水製薬社製)で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。
(4)培養上清中の抗E2抗体の性能を下記の3つのELISAにより評価した。
(4−1)反応性:E2−BCP(0.5μg/mL)をELISAプレートに固定化した後、1%スキムミルクでブロッキングした。その後、細胞融合後の培養上清を反応させた。E2に結合した抗E2ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をB/F分離後、酵素基質である4−メチルウンベリフェリルリン酸(4−MUP)を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
(4−2)競合特性:反応性を評価する実験系に、E2(500pg/mL)を共存させる実験を行なった。ここで得られた値(B)を、反応性で得られた値(B0)で割ることで、競合特性(B/B0値)を算出した。
(4−3)特異性:反応性を評価する実験系に、各種ステロイド(エストロン:E1、エストリオール:E3、エチニルエストラジオール:EtE2、テストステロン:TS、各500 pg/mL)を共存させる実験をおこなった。ここで得られた値(B)を、反応性で得られた値(B0)で割ることで、特異性(B/B0値)を算出した。
実施例5の結果、図3で黒丸で塗りつぶしたクローンを選別後、当該クローンから以下の方法で抗体遺伝子を単離、増幅後、発現ベクターを作製した。
(1)MagMaxTM−96 Total RNA Isolation kit(商品名)(Ambion社製)を用い、添付されているプロトコルに従って細胞からのRNAの単離を行なった。
(2)単離したRNAを鋳型とし、Ready−To−Go You−Prime First−Strand Beads(商品名)(GE Healthcare社製)を用いて、逆転写反応を行ないcDNAを合成した。
(3)ウサギ抗体遺伝子に特異的なプライマー(重鎖(H鎖)および軽鎖(L鎖)に特異的なプライマー、配列番号1から4、なお配列1と2はH鎖、配列3と4はL鎖にそれぞれ特異的なプライマーである)を用いPhusion High−Fidelity DNA polymerase(商品名)(第一化学薬品社製)で、抗体遺伝子をPCR反応で増幅させた。条件を以下に示す。
キットに添付の緩衝液で、dNTP 0.2μM、プライマーはそれぞれ0.5
μMで行なった。
98℃で30秒保持後、98℃で10秒、72℃で50秒のサイクルを35サイ
クル繰り返し、その後72℃で10分間保持した。
(4)電気泳動で遺伝子の増幅を確認した。
(5)得られたH鎖及びL鎖のPCRフラグメントを、BglIIとXbaIで制限酵素処理した後、動物細胞用発現ベクター(pECEdhfr:図4)のBglII/XbaIサイトに導入し、H鎖、L鎖用の発現ベクターを調製した。
実施例6で得られたH鎖、L鎖用の発現ベクターからCOS1細胞(非特許文献17、18)での遺伝子組換え抗体の生産を行なった。なお、実施例6における抗体遺伝子の単離操作は細胞融合後8日目に実施した。
(1)96ウエルプレート上で対数増殖期にあるCOS細胞に、H鎖発現ベクターとL鎖発現ベクター各200ngを、リポフェクトアミン2000(商品名)(インビトロジェン社製)で導入した。遺伝子導入時の培地は、Opti−MEM(商品名)(インビトロジェン社製)を使用した。
(2)遺伝子導入から3日後に培養上清を回収し、ELISAで抗体の存在を確認した。
(3)抗原結合能が確認された抗体遺伝子ペアを有するCOS細胞を、培養スケールを上昇させて培養し、抗体の一過性発現を行なった。
(4)定法に従い培養上清からProtein Gカラム(GE Healthcare社製)で抗E2抗体を精製した。抗体の性能を評価し、競合特性、特異性、生産性などの点から性能が高かった抗体を選定した。
実施例7で選定した抗体の発現ベクターをCHO細胞に導入することで、抗体安定産生株を作製した。
BIAcore T−100(商品名)(ビアコア社製)を用いて、以下に示す3種類のモノクローナル抗体の親和性を測定した。
(b)東ソー株式会社で単離したラットモノクローナル抗体Ra−1
(c)本発明で製造したウサギモノクローナル抗体U−1
親和性は以下に示す方法で測定した。
(1)E2誘導体(6位にアミノ基が導入されたもの)をアミンカップリング法で、センサーチップ(CM5)上に結合させたものを使用した。
(2)緩衝液:HBS−EP、温度:25℃、流速30μL/min、結合時間:1分、解離時間:10分、の条件で解析を行なった。
(3)得られたデータを、解析ソフト(Biacore T100 Evaluation Software、version 1.1)を用い、bivalentモデルで解析し、Kd(M)の値を算出した。
単離した抗体を蛍光偏光解消法で結合性を評価した(図6)。テトラメチルローダミンで標識したE2を使用し、横軸に抗体濃度を、縦軸に蛍光偏光度(mP)をプロットしたものである。テトラメチルローダミン標識E2のmP値を20としたとき、抗体濃度を増加させた場合の偏光度の変化を示している。抗体濃度が高くなるにつれ、テトラメチルローダミンで標識されたE2が抗体と結合するため、大きい偏光度を得るようになる。本発明で製造したウサギモノクローナル抗体U−1は、マウスモノクローナル抗体Ma−1、ラットモノクローナル抗体Ra−1と比較して100倍以上低い濃度で偏光度が増加している。このことは、U−1が、Ma−1およびRa−1より親和性が極めて高いことを示している。
本発明で製造したウサギモノクローナル抗体U−1を使用した免疫反応試薬を、ポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬(Eテスト「TOSOH」II E2、東ソー社製)と性能を比較した。両免疫反応試薬の検量線を図7に示す。E2の検出限界はポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬が25.2pg/mLであるのに対し、U−1を使用した免疫反応試薬は22.4pg/mLと、ポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬より高感度な測定系が構築できることが明らかとなった。
ヘテロハイブリドーマは遺伝子が脱落しやすいとの情報はあるが、それがどの程度の時間で消失してしまうかなどの詳細な解析は報告されていなかった。本発明者らも、細胞融合後の培養上清をELISAで評価し、抗体が培養上清に発現していることを確認した後、その細胞から抗体遺伝子の増幅を試みても、抗体遺伝子が増幅できないという問題に直面した。PCRの条件、プライマーの配列などの種々の観点から遺伝子が増幅できない理由を検討した結果、細胞融合後に得られたヘテロハイブリドーマを経代培養する際、通常のマウスモノクローナル抗体を取り扱うのと同じ感覚で取り扱うと、抗体を発現しなくなる時期の特定が難しいことを見出した。通常、細胞を継代培養する際は、細胞懸濁液を約10倍量程度の新しい培地に移して培養を継続するため、はじめの培養上清中は、新しい培地に移すことで希釈されてゆく。つまり、細胞が安定に抗体を発現していない場合は、培養上清が希釈されるため、継代培養後の培養上清のシグナルは激減する。しかし、ウサギモノクローナル抗体の場合はこの理論は当てはまらなかった。ウサギモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体と比較して、極端に親和性が高く、継代培養により培養上清が10倍あるいは100倍程度希釈されてもELISAでは十分なシグナルが得られるため、すでにヘテロハイブリドーマから抗体遺伝子は脱落し、抗体は発現していないにもかかわらず、ELISAでは陽性判定となってしまう。このことは、実施例10において、本特許で単離したウサギモノクローナル抗体とマウスモノクローナル抗体の結合性の比較を行なった結果、ウサギモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体より100倍以上低い濃度でも抗原結合能が観察されていることからも裏づけできる。
抗トリヨードサイロニン(T3)ウサギモノクローナル抗体を以下の方法で単離した。
BSA(Sigma社製)25mgを10mg/mLになるように、ホウ酸バッファー(0.05M、pH8.5)を加え、カルボン酸をメチルエステルとして保護した後、アミノ基からリンカーを伸ばした。次に、前記溶液と、N−ヒドロキシスクシイミドで活性化したT3 7mgをDMSO 100μLに溶解した液とを混合した。室温で30分撹拌後、PBSで透析(500mL×3回)することで、免疫抗原であるT3−BSAを得た。
BCP(Blue Carrier Protein:Pierce社製)を用いて(1)と同様の方法で作製した。BCP 25mgを10mg/mLになるように、ホウ酸バッファー(0.05M、pH8.5)を加えた。前記溶液に、N−ヒドロキシスクシイミドで活性化したT3 7mgをDMSO 100μLに溶解した液とを混合した。室温で30分撹拌後、PBSで透析(500mL×3回)することで、ELISAでのスクリーニング抗原であるT3−BCPを得た。
免疫動物はウサギ(日本白色種)の12週齢メスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、2次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用い、抗原溶液(500μg/mL)と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に2週間間隔で免疫した。免疫抗抗原量は、初回1mgで2次免疫以降は500μgである。
(3−1)T3−BCP(0.5μg/mL)をELISAプレートに固定化後、1%スキムミルクでブロッキングした。
(3−2)ウサギから採血した血清と反応させた。T3に結合した抗T3ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をB/F分離後、酵素基質である4―メチルウンベリフェリルリン酸(4−MUP)を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、細胞凍結保存液(セルバンカー1(商品名)、日本全薬工業社製)中に分散させた状態で、ディープフリーザー中(−80℃)で保存した。保存細胞は定法に従って解凍し、GIT培地(日水製薬社製)で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。5日間培養後の培養上清中にある抗T3抗体の性能は下記の3つのELISAにより評価した。
(4−1)反応性:Anti−Rabbit IgG(0.5μg/mL)をELISAプレートに固定化した後、1%スキムミルクでブロッキングした。その後、培養上清とアルカリホスファターゼ標識T3を同時に反応させた。ウサギモノクローナル抗体に未反応の酵素標識T3をB/F分離後、酵素基質である4−メチルウンベリフェリルリン酸(4−MUP)を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
(4−2)競合特性:反応性を評価する実験系に、T3(2nM)を共存させる実験を行なった。ここで得られた値(B)を、反応性で得られた値(B0)で割ることで、競合特性(B/B0値)を算出した。
(4−3)競合特性:反応性を評価する実験系に、T4(20nM)を共存させる実験を行なった。ここで得られた値(B)を、反応性で得られた値(B0)で割ることで、特異性(B/B0値)を算出した。
(4)の結果、図9で黒丸で塗りつぶしたクローンを選別後、選別した次の日に以下の方法で抗体遺伝子の単離を行なった。
(5−1)RNeasy Plus Micro kit(商品名)(QIAGEN社製)を用い、添付されているプロトコルに従って、細胞からのRNAの抽出を行なった。
(5−2)(5−1)で得られたRNAを鋳型とし、Sensiscript RT Kit(商品名)(QIAGEN社製)を用いて逆転写反応を行ない、cDNAを合成した。
(5−3)ウサギ抗体遺伝子に特異的なプライマー(H鎖およびL鎖に特異的なプライマー。配列番号1から3、5から7)を用いPhusion High−Fidelity DNA polymerase(商品名)(第一化学薬品社製)で、抗体遺伝子を増幅させた。条件は以下に示す。なお、H鎖を増幅させる際の二回目のPCRは、一回目のPCR産物(2μL)を鋳型とした他は、一回目のPCRと同じ試薬組成/反応条件で行なっている。
キットに添付の緩衝液で、dNTP 0.2μM、プライマーはそれぞれ0.5
μMで行なった。
98℃で30秒保持後、98℃で10秒、72℃で50秒のサイクルを35サイ
クル繰り返し、その後72℃で10分間保持した。
H鎖:一回目のPCRでは配列2及び5、二回目のPCRでは配列1及び6
L鎖:配列番号3及び7
(5−4)電気泳動で遺伝子の増幅を確認した。
(5−5)得られたH鎖及びL鎖のPCRフラグメントを、BglIIとXbaIで制限酵素処理した後、動物細胞用発現ベクター(pECEdhfr:図4)のBglII/XbaIサイトに導入し、H鎖、L鎖用の発現ベクターを調製した。
(5)で得られたH鎖、L鎖用発現ベクターからCOS1細胞(非特許文献17、18)での遺伝子組み換え抗体の生産を行なった。
(6−1)96ウエルプレート上で対数増殖期にあるCOS細胞に、H鎖発現ベクターを16.6ng、及びL鎖発現ベクターを8.3ngを、リポフェクトアミン2000(商品名)(インビトロジェン社)で導入した。遺伝子導入時の培地は、Opti−MEM(商品名)(インビトロジェン社)を使用した。
(6−2)遺伝子導入から3日後に培養上清を回収し、ELISAで抗体の存在を確認した。
(6−3)抗原結合能が確認された抗体遺伝子ペアを有するCOS細胞を、培養スケールを上昇させて培養し、抗体の一過性発現を行なった。
(6)で作製した、ウサギ由来抗T3モノクローナル抗体(UT1D−5)を用いて、AIA用テストカップを作製した。AIAは東ソー株式会社で販売している全自動免疫診断システムであり、今回作製した抗体を使用してAIA用の免疫反応試薬を作製し評価を行なった。
抗脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)ウサギモノクローナル抗体を以下の方法で単離した。
BNPのC末端側7アミノ酸に相当するペプチド(CKVLRRH、配列番号12)を合成した。合成したペプチドのN末端にあるシステインを利用して、マレイミド−KLH(PIERCE社製)と反応させ、これを免疫抗原として使用した。反応方法は添付されたプロトコルに従い、ペプチド1mgに対して、マレイミド−KLHを1mg反応させた。
BNPのC末端の7アミノ酸に相当するペプチド(CKVLRRH、配列番号12)のN末端に、リンカー配列(GGGSGGGS、配列番号13)を付加し、さらにN末端をビオチン化したペプチド(biotin−GGGSGGGSCKVLRRH、配列番号14、以降Bio−BNCと表記)を作成し、これをELISAでのスクリーニング抗原として使用した。
免疫動物はウサギ(日本白色種)の12週齢メスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、2次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用い、抗原溶液(500μg/mL)と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に2週間間隔で免疫した。免疫抗抗原量は、初回500μgで2次免疫以降は250μgである。
(3−1)ストレプトアビジン(0.5μg/mL)をELISAプレートに固定化後、1%スキムミルクでブロッキングした。
(3−2)Bio−BNC(0.5μg/mL)を反応させたELISAプレートを作製した。その後、抗原を免疫したウサギの血清を反応させた。Bio−BNCに結合した抗BNPウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をB/F分離後、酵素基質である4―メチルウンベリフェリルリン酸(4−MUP)を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、細胞凍結保存液(セルバンカー1(商品名)、日本全薬工業社製)中に分散させた状態で、ディープフリーザー中(−80℃)で保存した。保存細胞は定法に従って解凍し、GIT培地(日水製薬社製)で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。5日間培養後の培養上清中にある抗BNP抗体の性能は下記のELISAにより評価した。
(4−1)ストレプトアビジン(0.5μg/mL)をELISAプレートに固定化後、1%スキムミルクでブロッキングし、その後、Bio−BNC(0.5μg/mL)を反応させたELISAプレートを作製した。
(4−2)培養上清と反応させた。Bio−BNCに結合した抗BNPウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をB/F分離後、酵素基質である4―メチルウンベリフェリルリン酸(4−MUP)を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
(4)で選別したクローンから以下の方法で抗体遺伝子の単離を行なった。
(5−1)RNeasy Plus Micro kit(商品名)(QIAGEN社製)を用い、添付されているプロトコルに従い、細胞からのRNAの抽出を行なった。
(5−2)得られたRNAを鋳型とし、Sensiscript RT Kit(商品名)(QIAGEN社製)を用い、逆転写反応を行ないcDNAを合成した。
(5−3)ウサギ抗体遺伝子に特異的なプライマー(H鎖およびL鎖に特異的なプライマー。配列番号2、3、6から11参照)を用いPhusion High−Fidelity DNA polymerase(第一化学薬品社製)で、抗体遺伝子を増幅させた。条件は以下に示す。なお、二回目のPCR(反応液量50μL)を行なう際、H鎖を増幅させる場合は、一回目のPCR産物(2μL)を鋳型とした他は、一回目のPCRと同じ試薬組成/反応条件で行なっており、L鎖を増幅させる場合は、一回目のPCR産物をTEで1000倍希釈した液(2μL)を鋳型とした他は、一回目のPCRと同じ試薬組成/反応条件で行なっている。
キットに添付の緩衝液で、dNTP 0.2μM、プライマーはそれぞれ0.5
μLで行なった。
98℃で30秒保持後、98℃で10秒、72℃で50秒のサイクルを35サイ
クル繰り返し、その後72℃で10分間保持した。
H鎖:一回目のPCRでは配列2及び6、二回目のPCRでは配列8及び9
L鎖:一回目のPCRでは配列3及び7、二回目のPCRでは配列10及び11
(5−4)電気泳動で遺伝子の増幅を確認した。
(5−5)得られたH鎖及びL鎖のPCRフラグメントは、BglII/XbaIで制限酵素処理した後、動物細胞用発現ベクター(pECEdhfr:図4)のBglII/XbaIサイトにInfusion Cloning kit(商品名)(Clontech社製)を用いて導入し、H鎖、L鎖用の発現ベクターを調製した。
(5)で得られたH鎖、L鎖用発現ベクターからCOS1細胞(非特許文献17、18)での遺伝子組み換え抗体の生産を行なった。
(6−1)96ウエルプレート上で対数増殖期にあるCOS細胞に、H鎖発現ベクターを20ng、及びL鎖発現ベクターを20ngを、リポフェクトアミン2000(商品名)(インビトロジェン社製)で導入した。遺伝子導入時の培地は、Opti−MEM(商品名)(インビトロジェン社製)を使用した。
(6−2)遺伝子導入から3日後に培養上清を回収し、ELISAで抗体の存在を確認した。抗原結合能が確認された2つのクローン(27、45)を取得した。
(6)で取得したクローンより得られたウサギ由来抗BNPモノクローナル抗体(27、45)を、以下の方法でELISAにより評価した。
(7−1)抗ウサギ抗体(10μg/mL)を固定化したELISAプレートに、(6)で取得したクローンから抗体を一過性発現させた後の培養上清を反応させ、その後BNP(0.1μg/mL)を反応させた。
(7−2)さらに、アルカリフォスファターゼで標識されたBNPの環状部位を認識する抗体(タンパク質濃度として、A280nm=0.003)を反応させた。
(7−3)未反応の酵素標識抗体をB/F分離後、酵素基質である4―メチルウンベリフェリルリン酸(4−MUP)を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
E2−BSAを免疫したウサギ凍結脾臓細胞を使用して以下に示す実験を行なった。
(1)実施例5に示す方法に従い、細胞融合を行ない、マイクロタイタープレートに融合細胞をまいた。
(2)培養1、2、3、4、7、11日目に培養上清を同量とった。なお、培養上清をとる際に、同量の同じ組成の培地を加えることで培地の量を維持している。
(3)得られた培養上清を、実施例2に示すELISAで評価した。
Claims (5)
- 抗原を免疫したウサギから抗体産生細胞を単離し、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別し、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離、増幅し、発現ベクターに導入後、ホスト細胞に導入することで遺伝子組換えウサギモノクローナル抗体を発現させる遺伝子組換え抗体の製造方法において、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別するにあたり、抗体産生細胞を増殖させてから選別し、その抗体産生細胞を増殖させる方法が、マウスミエローマ細胞又はマウスミエローマ細胞株を出発とした細胞株を融合させて培養する方法であり、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、抗体産生細胞増殖開始後14日以内に実施することを特徴とする、遺伝子組換え抗体の製造方法。
- 選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、選別した細胞から抗体遺伝子の脱落が起きない期間内で実施することを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
- 抗体産生細胞が、抗原を免疫したウサギの脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞のいずれかであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
- ウサギに免疫する抗原が、ハプテンまたはペプチドであることを特徴とする、請求項1から3いずれかに記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
- ホスト細胞が動物細胞であることを特徴とする、請求項1から4いずれかに記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
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