JP6693134B2 - リンカー配列を有する抗体及びそれを用いた測定法 - Google Patents

Description

本発明は、リンカー配列を有する抗体に関するものである。

抗体は、その特異性と親和性の高さから、実験用試薬としてだけでなく、免疫診断などの分野でも幅広く利用されている。抗体はＨ鎖、Ｌ鎖の２種類のタンパク質の複合体であるので、組換え抗体を作製する際には、特許文献１に記載のようにそれぞれの遺伝子を形質導入により細胞へ導入する必要がある。

特許文献２に記載のように、導入するＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子の割合は、抗体の発現量に大きく影響する。そのため、非特許文献１のように、同一ベクター内にＨ鎖遺伝子及び、Ｌ鎖遺伝子を直列にならべて、導入遺伝子の割合を一定にする方法や、非特許文献２に記載のように、Ｈ鎖タンパクとＬ鎖タンパクを、ペプチドリンカーを介して結合させることで、１つのタンパク質として発現させる方法が行われている。

このペプチドリンカーは抗原抗体反応には無関係だと考えられるが、リンカーの配列によっては抗原抗体反応に影響を及ぼし、抗体の親和性、特異性に影響を与えることがあった。

特開２００９−２４０３００号公報 特開２０１２−１４３２４６号公報

Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．、１６７．２７１．１９９４ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、３６．６１．１９９９

本発明の目的は、抗原抗体反応にできるだけ影響を及ぼさないリンカー配列を有する抗体を提供することである。

上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する
（１）ウサギ抗体のＨ鎖とＬ鎖が配列番号１に記載のペプチドリンカーを介して結合していることを特徴とする抗体。
（２）抗体がハプテンに対する抗体である、（１）に記載の抗体。
（３）ハプテンが甲状腺ホルモン又はステロイドホルモンである、（２）に記載の抗体。
（４）ハプテンがトリヨードサイロニン又はエストラジオールである、（２）又は（３）に記載の抗体。
（５）抗体が一本鎖抗体である、（１）〜（４）いずれかに記載の抗体。
（６）試料中の抗原と、標識化した抗原とを、（１）〜（５）いずれかに記載の抗体と競合的に反応させ、抗体に結合した又はしなかった標識化抗原を検出することを特徴とする、抗原の競合的測定法。

以下、本発明を詳細に説明する。

（１）抗体
本発明の抗体は、ウサギ抗体のＨ鎖とＬ鎖が配列番号１に記載のペプチドリンカーを介して結合しているものである。ここで、ウサギ抗体のＨ鎖とＬ鎖は、Ｈ鎖Ｃ末端からペプチドリンカーを介してＬ鎖Ｎ末端に結合していてもよく、またＬ鎖Ｃ末端からペプチドリンカーを介してＨ鎖Ｎ末端に結合していてもよい。

競合法における測定感度は、用いる抗体の親和定数に依存する（ぶんせき、５５１−５５２；２００４）。一般的に、ウサギ抗体は、マウス又はラットなど抗体よりも高い親和性を有するため、低濃度域の測定対象を検出することが可能である。このように親和性の高いウサギ抗体を用いて測定を行うと、後述の実施例にも示すように、低濃度領域で、測定値が乖離して偽高値を示すことがあることを本発明者は見出した。そしてこのような現象は、ウサギ抗体において、特定のリンカー配列を用いることで解決できることをも本発明者は見出した。

本発明において、抗体は特に限定されるものではないが、特に低分子物質であるハプテンに対する抗体であることが好ましい。ハプテンとしては特に限定されるものではないが、例えば甲状腺ホルモン等があげられ、その中でもトリヨードサイロニンが特に好ましい。また、ハプテンとして例えばステロイドホルモンがあげられ、その中でもエストラジオール（Ｅ２）が好ましい。

本発明の抗体は、特にハプテンを競合法により測定する際に大きな効果を発揮する。ハプテンは低分子物質であるためサンドイッチ法で測定することが難しく、競合法等で測定される。競合法では、その測定原理から見て、抗体を過剰に用いることができず、限られた量の抗体を用いて行う。そのため、前述の文献（ぶんせき、５５１−５５２；２００４）に記載のように抗体の親和性が測定系の感度に直結する。換言すれば、測定系の感度向上のために、抗原への親和性が高い抗体を用いることが必要である。その際、親和性の高い抗体としてウサギ抗体を用いた場合であっても、本発明による抗体であれば、前述のように低濃度域における測定値の乖離を最小限に抑えることができる。

（２）組換え抗体の作製
本発明の抗体の作製は、ウサギ抗体のＨ鎖とＬ鎖とを配列番号１に記載のペプチドリンカーを介して化学的に結合させてもよく、また遺伝子工学的な手法を用いて結合させてもよく、特に限定されない。遺伝子工学的には、例えば、抗体生産細胞から目的とする抗体の遺伝子を抽出し、配列番号１に記載のペプチドリンカーを発現しうる遺伝子と共に、抗体のＬ鎖とＨ鎖とがペプチドリンカーを介して発現するように、発現ベクターへ組み込んだ後、発現細胞へ遺伝子導入を行うことで、目的の組換え抗体を作製することができる。

抗体発現方法は、大腸菌発現系、動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、無細胞タンパク発現系などがあげられる。特に本発明では、動物細胞発現系を用いることが好ましい。

発現に用いる動物細胞は、ＳＰ２／０細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞などがあ
げられる。特に本発明ではＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いることが好ましい。

（３）抗体評価方法
本発明の抗体評価方法は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光偏光法等の検出方法を適宜採用することができる。例えば、本発明の抗体を固相に固定化して、抗原とアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等で標識した抗原を同時に反応させる、競合型の測定方法を用いて、抗体性能を評価することができる。また実施例で使用したＡＩＡ６００ＩＩ（東ソー社製）などのエンザイムイムノアッセイ装置を用いて抗体評価を行うこともできる。

抗体作製の際のペプチドリンカー配列が抗原抗体反応に影響を及ぼすことがあり、免疫診断用抗体としての使用が困難になることがある。本発明のペプチドリンカーを有するウサギ抗体は、抗原抗体反応にほとんど影響を及ぼさず、免疫診断用抗体としても問題なく使用することができる。

各リンカーを有する抗体を用いて作成した検量線を示す図である。 比較例３でリンカー無しの抗体とリンカー配列２の抗体でＴ３濃度を測定した際の相関を示す図である。 実施例３でリンカー無しの抗体とリンカー配列１の抗体でＴ３濃度を測定した際の相関を示す図である。 実施例４と比較例３の抗Ｅ２抗体を用いて作成した検量線を示す図である。 実施例５でリンカー無しの抗体とリンカー配列１の抗体でＥ２濃度を測定した際の相関を示す図である。

実施例１
（１） 組換え抗体の作製
組換え抗体の作製はトリヨードサイロニン結合牛血清アルブミン（Ｔ３−ＢＳＡ）を免
疫したウサギ脾臓細胞を用いて、特許文献１に記載の方法で行った。

（２） 一本鎖抗体の作製
（１）で得たＨ鎖、Ｌ鎖のウサギモノクローナル抗体遺伝子を鋳型にして非特許文献２
に記載の遺伝子組み換え手法を用いて、配列番号１のリンカー配列を持つ抗Ｔ３ウサギ一
本鎖抗体を得た。

（３） 一本鎖抗体の精製
一本鎖抗体の精製はＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−６５０（東ソ
ー製）及び、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー製）を用いて行った。

（４） 一本鎖抗体のＦａｂ’化及びフルオレセイン標識
（３）の方法で精製した一本鎖抗体は、ペプシン消化による抗体断片化を行った後、２
−メルカプトエチルアミンにより還元し、一本鎖Ｆａｂ’化抗体を得た。この一本鎖Ｆａ
ｂ’化抗体とフルオレセイン−５−マレイミド（東京化成工業）を反応させることで、フ
ルオレセイン標識一本鎖Ｆａｂ’化抗体を得た。標識抗体の精製はＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０
００ＳＷ（東ソー製）を用いて行った。

（５） ＡＩＡ試薬形態での抗体性能の評価
（１）〜（４）の方法で得た、リンカー配列が配列番号１のフルオレセイン標識抗Ｔ３
一本鎖Ｆａｂ’化抗体を、ＡＩＡ６００ＩＩを用いて以下の方法で検量線を作成し評価し
た。
（５−１）水不溶性担体に抗フルオレセイン抗体を物理的に吸着させ固定化した。
（５−２）濃度既知のＴ３溶液とＡＬＰ標識したＴ３溶液を抗フルオレセイン抗体固定化
担体と共に、容器中に分注した。
（５−３）（４）で得た、フルオレセイン標識抗Ｔ３一本鎖Ｆａｂ’化抗体溶液を上述の
容器中に加え反応させた。
（５−４）未反応のＡＬＰ標識Ｔ３をＢ／Ｆ分離後、４−ＭＵＰを分注し、継時的に蛍光
強度を測定することで、４−ＭＵの生成速度を検出した。

比較例１ リンカーを持たない抗体のＦａｂ’化及び性能評価
実施例１の（１）、（４）、（５）の方法に従い、リンカー無しのフルオレッセイン標識抗Ｔ３一本鎖Ｆａｂ’化抗体を作製し、ＡＩＡ６００ＩＩを用いて、検量線を作成した。

比較例２ リンカー配列が配列番号２の一本鎖抗体のＦａｂ’化及び性能評価
実施例１の（１）〜（５）の方法に従い、リンカー配列が配列番号２のフルオレッセイン標識抗Ｔ３一本鎖Ｆａｂ’化抗体を作製し、ＡＩＡ６００ＩＩを用いて、検量線を作成した。

実施例１、比較例１，２の結果を図１に示す。縦軸には濃度既知サンプル測定時に得られた値（Ｂ）をゼロ濃度サンプル測定時に得られた値（Ｂ０）で割ることで、競合特性（Ｂ／Ｂ０）を算出し、プロットした。結果からリンカーの有無又は配列に関わらず、同等の検量線を描くことが分かり、３種の抗体の競合特性は同等であることが分かった。

比較例３ 検体測定時の相関性
比較例１及び比較例２で得た、リンカー無しのＦａｂ’及びリンカー配列２のＦａｂ’の実検体測定時の相関性を図２に示す。

グラフ横軸には、リンカー無しのＦａｂ’化抗体で検体中のＴ３濃度を測定したときの値を、縦軸にはリンカー配列２のＦａｂ’化抗体で同一検体中のＴ３濃度を測定したときの値をプロットした。約６０サンプルの検体測定を行ったところ、１検体のみ相関を外れる検体があった（リンカー無しＦａｂ’での測定値；２．７ｐｇ／ｍＬ、リンカー配列２Ｆａｂ’での測定値；５．３ｐｇ／ｍＬ）。以後、この相関を外れた検体を検体Ａと呼ぶ。リンカー配列２を有するＦａｂ’抗体を用いて検体Ａを測定すると偽高値が示され、リンカー配列２が抗原抗体反応の特異性に影響を与えていることが示唆された。

実施例２ リンカー無しＦａｂ’、配列番号１のＦａｂ’、配列番号２のＦａｂ’を用
いた検体濃度測定
検体Ａ及び、検体Ａと同程度のＴ３濃度の検体（検体Ｂ）を、ＡＩＡ６００ＩＩを用い
てリンカー無しＦａｂ’、リンカー配列１のＦａｂ’、リンカー配列２のＦａｂ’でそれ
ぞれ測定した。またその時の４−ＭＵの生成速度の測定値（ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））の比
をとった結果を表１に示す。

検体Ａと検体Ｂは同程度の濃度であるので、それぞれの抗体での測定値の比をとった結果
は１に近くなると考えられる。リンカー無しＦａｂ’、リンカー配列１のＦａｂ’では、１に近い値を示したが、リンカー配列２のＦａｂ’では０．７６と小さな値を示した。以上の結果から、検体Ａ測定時に、リンカー配列２は抗原抗体反応の特異性に影響を与えるが、リンカー配列１は特異性にほとんど影響を与えないことが示唆された。

実施例３ 検体測定時の相関性
リンカー無しのＦａｂ’及びリンカー配列１のＦａｂ’の実検体測定時の相関性を図３に示す。グラフ横軸には、リンカー無しのＦａｂ’化抗体で検体中のＴ３濃度を測定したときの値を、縦軸にはリンカー配列１のＦａｂ’化抗体で同一検体中のＴ３濃度を測定したときの値をプロットした。結果から、リンカー配列１のＦａｂ’抗体を用いて検体中Ｔ３濃度を測定した値は、リンカー無しのＦａｂ’抗体を用いて濃度測定を行なった値と、いずれの検体においても、同等であり、リンカー配列１が抗原抗体反応の特異性にほとんど影響を与えていないことが示された。

実施例４ 抗Ｅ２ウサギ抗体
（１） 組換え抗体の作製
組換え抗体の作製はエストラジオール結合牛血清アルブミン（Ｅ２−ＢＳＡ）を免
疫したウサギ脾臓細胞を用いて、特許文献１に記載の方法で行った。
（２） 一本鎖抗体の作製
（１）で得たＨ鎖、Ｌ鎖のウサギモノクローナル抗体遺伝子を鋳型にして非特許文献２
に記載の遺伝子組み換え手法を用いて、配列番号１のリンカー配列を持つ抗Ｅ２ウサギ一
本鎖抗体を得た。
（３） 一本鎖抗体の精製
一本鎖抗体の精製はＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−６５０（東ソ
ー製）及び、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー製）を用いて行った。
（４） ＡＩＡ試薬形態での抗体性能の評価
（１）〜（３）の方法で得た、リンカー配列が配列番号１の抗Ｅ２抗体を、ＡＩＡ６００ＩＩを用いて以下の方法で検量線を作成し評価した。
（４−１）水不溶性担体に抗ウサギ抗体を物理的に吸着させ固定化した。
（４−２）濃度既知のＥ２溶液とＡＬＰ標識したＥ２溶液を抗ウサギ抗体固定化担体と共に、容器中に分注した。
（４−３）（３）で得た、抗Ｅ２抗体溶液を上述の容器中に加え反応させた。
（４−４）未反応のＡＬＰ標識Ｅ２をＢ／Ｆ分離後、４−ＭＵＰを分注し、継時的に蛍光
強度を測定することで、４−ＭＵの生成速度を検出した。

比較例３ リンカーを持たない抗Ｅ２抗体及び性能評価
実施例４の（１）、（４）の方法に従い、リンカー無しの抗Ｅ２抗体を作製し、ＡＩＡ６００ＩＩを用いて、検量線を作成した。

実施例４、比較例３の結果を図４に示す。縦軸には濃度既知サンプル測定時に得られた値（Ｂ）をゼロ濃度サンプル測定時に得られた値（Ｂ０）で割ることで、競合特性（Ｂ／Ｂ０）を算出し、プロットした。結果からリンカーの有無に関わらず、同等の検量線を描くことが分かり、２種の抗体の競合特性は同等であることが分かった。
実施例５ 検体測定時の相関性（抗Ｅ２抗体）
リンカー無しの抗Ｅ２抗体及びリンカー配列１の抗Ｅ２抗体の実検体測定時の相関性を図５に示す。グラフ横軸には、リンカー無しの抗Ｅ２抗体で検体中のＥ２濃度を測定したときの値を、縦軸にはリンカー配列１の抗Ｅ２抗体で同一検体中のＥ２濃度を測定したときの値をプロットした。結果から、リンカー配列１の抗Ｅ２抗体を用いて検体中Ｅ２濃度を測定した値は、リンカー無しの抗Ｅ２抗体を用いて濃度測定を行なった値と、いずれの検体においても、同等であり、リンカー配列１が抗原抗体反応の特異性にほとんど影響を与えていないことが示された。

Claims (6)

1. ウサギ抗体のＨ鎖とＬ鎖が配列番号１に記載のペプチドリンカーを介して結合していることを特徴とする抗体。
2. 抗体がハプテンに対する抗体である、請求項１に記載の抗体。
3. ハプテンが甲状腺ホルモン又はステロイドホルモンである、請求項２に記載の抗体。
4. ハプテンがトリヨードサイロニン又はエストラジオールである、請求項２又は３に記載の抗体。
5. 抗体が一本鎖抗体である、請求項１〜４いずれかに記載の抗体。
6. 試料中の抗原と、標識化した抗原とを、請求項１〜５いずれかに記載の抗体と競合的に反応させ、抗体に結合した又はしなかった標識化抗原を検出することを特徴とする、抗原の競合的測定法。

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