CN102914654A

CN102914654A - 一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液及其封闭方法

Info

Publication number: CN102914654A
Application number: CN2011102229952A
Authority: CN
Inventors: 董方; 项安波
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-08-04
Filing date: 2011-08-04
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明公开了一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液，所述封闭液为聚偏氟乙烯封闭液。所述封闭液是经磷酸盐缓冲液稀释后得到的重量百分含量为50％-100％的溶液。本发明提供的一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭方法，包括以下步骤：(1)加一抗，感作后再加封闭液；(2)-40℃冷冻保存2小时；(3)真空-80℃冻干。本发明通过采用聚偏氟乙烯封闭液作为检测多种蛋白质的生物芯片中封闭液，在用本发明的生物芯片检测多种蛋白质时，消除非特异性游离结合和交叉反应，避免产生假阳性。

Description

一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液及其封闭方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液及其封闭方法。

背景技术

自1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(ELISA，Enzyme LinkedImmunosorbent Assay)用于免疫球蛋白G(IgG)定量测定的文章以来，使得这项开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。抗原定位的酶标抗体技术的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。包括后期衍生发展的各种免疫检测技术中(如FLEIA(荧光酶免测定法)，CLEIA(化学发光酶免测定法))等都以此模式建立定量化体系。

在基本原理①中，根据检测目的需要预先制备生物芯片。为防止固相物质与检测系统中的蛋白成分(如抗体IgG等)发生非特异性吸附，造成假阳性报告，在进行一抗孵育前，需预先对生物芯片的固相膜上的非特异结合位点进行封闭。常用的封闭液有脱脂奶粉封闭液和单组分BSA(牛血清白蛋白)封闭液。脱脂奶粉封闭液中含有微量的生物素和碱性磷酸酶，因而不适合生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶检测系统，主要用于非生物素的HRP(辣根过氧化物酶)系统Western Blot(蛋白质印迹)的封闭。BSA单一组分封闭液适用于包括生物素-亲和素和碱性磷酸酶在内的各种检测系统的封闭，也可用于ELISA实验的封闭。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：BSA单一组分封闭液作为用于检测多种蛋白质的生物芯片时，这种源于牛的BSA会与待检蛋白发生游离结合或交叉反应而导致结果产生假阳性。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种在检测多种蛋白质时，能够消除非特异性游离结合和交叉反应，避免产生假阳性的用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液及其封闭方法。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液，所述封闭液为聚偏氟乙烯封闭液。

所述封闭液是将聚偏氟乙烯封闭液经磷酸盐缓冲液稀释后得到的重量百分含量为50％-100％的溶液。

本发明提供的另一个技术方案是：一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭方法，包括以下步骤：

(1)加一抗，感作后再加封闭液；

(2)-40℃冷冻保存2小时；

(3)真空-80℃冻干。

所述步骤(1)中所加封闭液是将聚偏氟乙烯封闭液经磷酸盐缓冲液稀释后得到的重量百分含量为50％-100％的溶液。

所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.4，浓度0.01mol/L。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：通过采用聚偏氟乙烯封闭液作为检测多种蛋白质的生物芯片中封闭液，在用本发明的生物芯片检测多种蛋白质时，消除非特异性游离结合和交叉反应，避免产生假阳性。本发明原材料聚偏氟乙烯封闭液取材容易，成本低廉，PVDF(Polyvinylidene Fluoride，聚偏氟乙烯)化学稳定性好，几乎不与任何物质产生化学反应，而且几乎无批间差。本发明的封闭方法与现有方法相比有显著的抑制非特异性吸附、安定固相上生理活性物质的效果。

附图说明

图1是本发明实施例提供的不同封闭液的封闭效果对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液，所述封闭液为聚偏氟乙烯封闭液。即聚偏氟乙烯封闭液在检测多种蛋白质的生物芯片中作为封闭液的用途。

本发明的聚偏氟乙烯封闭液购置于日油株式会社，其产品目录上的名称为“封闭试剂N101”，其中主要成分为PVDF。采用本发明的封闭液，消除非特异性游离结合和交叉反应，避免产生假阳性。

一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭方法，包括以下步骤：

用pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液(Public Broadcasting Service，PBS)，浓度0.01mol/L稀释聚偏氟乙烯封闭液，得到重量百分含量为50％-100％的溶液，也可以不用磷酸盐缓冲液稀释，采用直接购买得到的聚偏氟乙烯封闭液，即重量百分含量为100％的聚偏氟乙烯封闭液原液；

(2)在生物芯片中加一抗，感作后再加(1)所述稀释的聚偏氟乙烯封闭液；“加一抗，感作后”是指加第一抗体并待其感作后；

(3)将上述生物芯片置于-40℃冷冻保存2小时；

(4)再将该生物芯片在真空-80℃冻干。

参见图1，图1显示了由不同的封闭液制得的生物芯片测得的同一检测物中非特异性蛋白含量的数值。检测物为血清(非特异IgE＝5000IU/ml)。其中，纵坐标为ΔK/s(膜表面漫反射光单位时间增量)，纵坐标数值与检测物中非特异性蛋白含量成正比。膜表面漫反射光单位时间增量越小，检测物中非特异性蛋白含量越低，检测物中非特异性蛋白含量低，说明被检测物含有的容易被非特异性吸附的蛋白未与封闭液发生非特异性吸附，未被检测出，封闭液起到了很好的封闭作用，其背景也很低。横坐标为封闭液种类。其中，聚偏氟乙烯封闭液通过pH7.2～7.4，浓度0.01mol/L的PBS稀释后，得到1％和50％的溶液，将聚偏氟乙烯(PVDF)封闭液浓度分三档对比筛选。横坐标中为封闭液种类依次为艾斯封闭液(BlockAce)、磷酸盐缓冲液、1％聚偏氟乙烯封闭液、50％聚偏氟乙烯封闭液、100％聚偏氟乙烯封闭液和50％易泽封闭液(EZBlock)。

从图1可以看出当采用浓度大于50％的PVDF封闭液进行封闭时，其背景可以降低到常规使用的艾斯封闭液的31％，100％的PVDF封闭液可使背景降到最低。本发明的制备的生物芯片，显著降低背景，保证了检测灵敏度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液，其特征在于，所述封闭液为聚偏氟乙烯封闭液。

2.根据权利要求1所述的用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液，其特征在于，所述封闭液是将聚偏氟乙烯封闭液经磷酸盐缓冲液稀释后得到的重量百分含量为50％-100％的溶液。

3.一种使用权利要求1所述封闭液用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)加一抗，感作后再加封闭液；

(2)-40℃冷冻保存2小时；

(3)真空-80℃冻干。

4.根据权利要求3所述的的封闭方法，其特征在于，所述步骤(1)中所加封闭液是将聚偏氟乙烯封闭液经磷酸盐缓冲液稀释后得到的重量百分含量为50％-100％的溶液。

5.根据权利要求4所述的的封闭方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.4。