CN115201183A - 一种单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒及其测定方法 - Google Patents

一种单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒及其测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，包括单人份包装的检测试剂，所述检测试剂包括第一试剂、第二试剂、洗液、底物液，第一试剂为羧基磁微球包被的S100β抗体溶液；第二试剂为由标记物标记的S100β抗体；还公开了一种单人份S100β蛋白化学发光测定方法。本发明采用羧基磁微球包被S100β抗体，标记物标记S100β抗体的酶促化学发光法对S100β进行定量检测，其灵敏度、重复性等均优于免疫层析法；且试剂单人份包装，可随到随检，无开瓶有效期限制及污染等，是提升基层检验水平的重要装备。

Description

一种单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒及其测定方法
技术领域
本发明涉及S100β蛋白检测技术领域，特别是涉及一种单人份S100蛋白化学发光测定试剂盒及其测定方法。
背景技术
S100蛋白是1965年由Moore BW在牛脑中发现的，因该蛋白能溶解于100％硫酸铵中而得名。其由两个亚单位α、β结合形成S100αα、S100αβ、S100ββ。其中S100β蛋白由两个β亚基通过半胱氨酸残基形成二硫键组成，分子量为21KD的酸性钙结合蛋白，是S100家族中在脑内主要的和最具活性的成员。约96％的S100β蛋白以二聚体活性形式存在于脑内星形胶质细胞中，故被称为中枢神经特异蛋白，也被称为脑的“C反应蛋白”。
S100-β蛋白具有广泛的生物学活性，生理浓度时是一种神经营养因子，在神经胶质细胞的生长、繁殖、分化、基因表达、细胞凋亡中发挥重要作用，促进脑的发育。脑中S100-β蛋白在胚胎期第14d即有微弱表达，后与神经系统生长发育呈正相关。成年后相对稳定，正常成人血清中含量＜0.2ng/mL。当脑外伤、脑梗塞等造成神经胶质细胞膜受损时，S100-β蛋白释放至细胞外间隙，并通过受损的血脑屏障进入脑脊液和血液，从而导致血液中S100-β蛋白的浓度升高。过高浓度的S100-β蛋白具有神经毒性作用，可加重神经系统炎症，从而导致功能紊乱，影响钙动态平衡而导致细胞死亡。因此，对于S100-β蛋白准确、灵敏、快速的检测，对临床诊断脑损伤具有重要意义。
目前，市场用于检测S100β蛋白的试剂盒主要基于电化学发光法、化学发光法、免疫层析法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、胶乳增强免疫比浊法等。其中免疫层析法操作简便快捷，但灵敏度较低，易受杂散光干扰；ELISA试剂盒具有操作流程繁琐，检测时间长，产生较多具有样本污染的废液等缺点；市面上的胶乳增强免疫比浊法、电化学发光法成本较高、检测时间长，且需要价格昂贵的配套全自动分析系统进行检测。另外，目前市场上的检测S100β蛋白的试剂盒均为多人份检测使用，需要额外配备洗液、底物液、反应杯等耗材，还有开瓶有效期及污染等问题。
因此亟需提供一种新型的S100β蛋白检测试剂盒来解决上述问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒及其测定方法，能够对S100β蛋白进行定量检测且实现单人份包装检测。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，包括单人份包装的检测试剂，所述检测试剂包括：
第一试剂，为羧基磁微球包被的S100β抗体溶液；和
第二试剂，为由标记物标记的S100β抗体；和/或
洗液；和/或
底物液。
在本发明一个较佳实施例中，所述第一试剂的浓度为300-1000ug/ml。
在本发明一个较佳实施例中，所述第二试剂的浓度为0.050-0.300ug/ml。
其中，所述标记物采用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶的一种或两种。
在本发明一个较佳实施例中，所述洗液按质量份数包括：
0.5-0.9％金属离子溶液、0.02-0.1％表面活性剂、0.02-0.1％防腐剂、10-100mM/L缓冲溶液。
其中，所述金属离子溶液可采用NaCl溶液。
进一步的，所述洗液的pH为7.2-7.8。
在本发明一个较佳实施例中，所述底物液按质量份数包括：
2.0-10.0mM镁离子溶液、0.5-2mM锌离子溶液、0.02-0.1％表面活性剂、0.02-0.1％防腐剂、50-100mg/L底物、10-100mM/L缓冲溶液。
其中，所述底物为3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1，2-二氧杂环丁烷(即AMPPD)、(4-氯苯巯基)(10-甲基-9，10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐(即APS-5)、鲁米诺及其衍生物(如异鲁米诺、4-氨基已基-N-乙基异鲁诺及AHEI和ABEI)中的至少一种。
所述镁离子和锌离子可采用MgCl2和ZnCl2，MgCl2和ZnCl2作为酶的辅助因子，在酶促反应中主要起着递氢、传递电子和传递某些化学基团的作用。
进一步的，所述底物液的pH为8.8-10.0。
上述洗液和底物液中，所述表面活性剂采用脂肪酸甘油酯，脂肪酸山梨坦，聚山梨酯(吐温)中的至少一种；
所述防腐剂采用Proclin300、硫柳汞、叠氮化钠、庆大霉素中的至少一种；
所述缓冲溶液采用Tris、MES、HEPES、PBS、CBS、SSC中的至少一种。
在本发明一个较佳实施例中，所述单人份检测试剂包括试剂条、检测卡的形式。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种单人份S100β蛋白化学发光测定方法，采用如上所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，包括以下步骤：
S1：将待测样本、第二试剂与第一试剂混匀反应；
S2：吸取200ul洗液，重复洗涤若干次；
S3：之后加入底物液反应，检测底物液的发光值；
S4：利用已知浓度的校准曲线，将所得的发光值代入标准曲线方程中，计算得出所测样本中S100β蛋白的浓度。
本发明采用表面修饰有羧基官能团且具有超顺磁性的磁微粒，利用碳化二亚胺(EDC)活化，并添加N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，形成稳定的中间体Sulfo-NHS酯，与抗体上的氨基共价结合形成稳定的酰胺键，达到抗体偶联到磁微球的目的。与甲苯磺酰基磁微球相比，其优点/不同点在于：第一，甲苯磺酰基磁微球反应18-24h，羧基磁微球反应时间1-3h；第二，反应过程中，甲苯磺酰基磁微球为疏水性，需添加硫酸铵进行反应，而硫酸铵会造成抗体的变性，对抗体活性有影响，而羧基磁微球为亲水性，无需添加；第三，甲苯磺酰基磁微球包被抗体需在37℃高温条件下长时间反应，对温度比较敏感的抗体不适用，羧基磁微球为常温反应；第四，甲苯磺酰基磁微球为疏水性，需要严格的封闭，如封闭不充分，可产生非特异吸附，造成假阳性问题。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用羧基磁微球包被S100β抗体，标记物标记S100β单克隆抗体的酶促化学发光法对S100β进行定量检测，其灵敏度、重复性等均优于免疫层析法；
(2)本发明将试剂各组分分装入特定试剂条中，实现单人份包装检测，与传统POCT(point-of-care testing，即时检验)相比，单人份化学发光检测试剂自动化程度高、检测灵敏度高、结果稳定、可质控等显著优点；同时，单人份化学发光不需额外配备洗液、底物液、反应杯等耗材，无隐性成本。试剂单人份包装，可随到随检，无开瓶有效期限制及污染等，是提升基层检验水平的重要装备。
附图说明
图1是本发明所述试剂盒进行临床样本检测实验的相关性结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明提供一种单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，用于血液中S100β蛋白的测定。
在一较佳实施例中，所述单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，包括：检测试剂条，试剂条包括5个以上的试剂孔位，其中一个孔位装载有由磁微球包被的S100β抗体，为第一试剂；一个孔位装载有由标记物标记的S100β抗体，为第二试剂；两个孔位装载有洗液，一个孔位装载有底物液。
所述第一试剂为浓度为500ug/ml的磁微球包被的S100β抗体溶液；第二试剂为浓度为0.200ug/ml的酶标记物标记的S100β抗体溶液，其中酶可选为碱性磷酸酶；洗液主要含0.9％NaCl、0.05％Tween-20、0.05％Proclin300、25mM/L的Tris-HCl溶液等成分，pH7.8；底物液主要含5.0mM MgCl、1.0mM ZnCl、0.05％Tween-20、0.05％Proclin300、100mg/LAMPPD的Tris-HCl溶液等成分，pH9.5。
需要说明的是，S100β抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，在此不作限定。
本发明所述单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒的制备方法包括以下步骤：
(一)第一试剂的制备
1.抗体的预处理：将0.1mg S100β包被抗体加入超滤离心管(50KD)中，8000r/min离心5-6min。将离心浓缩后的抗体加入200uL 0.1M MES(pH 5.0)溶液，8000-9000r/min离心5-6min，弃滤液，再加入200uL 0.1M MES(pH 5.0)溶液，按上述方法离心，此步骤重复5-6次。将离心后的离心管取出，弃滤液，离心柱反转，2000-3000r/min离心1min，收集滤液，整个过程收集浓缩抗体约100μL。
2.羧基磁微球的处理及包被：取5.0mg悬浮磁微球液到离心管中，置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清；加入1mL 0.1M MES(pH 5.0)，混匀悬浮磁微球；置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清。加入10μL 1％浓度的EDC溶液和15μL 1％浓度的Sulfo-NHS溶液，用漩涡混合器充分混匀活化磁微球30min。置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清；加入0.1MMES(pH 5.0)溶液，用漩涡混合器充分混匀悬浮磁微球，置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清。加入预处理后的0.1mg抗体，用0.1M MES(pH 5.0)调整磁微球浓度为5mg/mL并用漩涡混合器充分混匀悬浮磁微球2小时；将离心管置于磁分离架上约1分钟，小心移去上清；用1mL TBST溶液对磁微球进行清洗，重复清洗3次。将包被抗体的磁微球用TBST溶液稀释至500ug/mL，存放于2～8℃待用。
(二)第二试剂的制备
1.ALP的马来酰胺化
将配制好的0.9mg/ml GMBS工作液(pH7.45)加入5mg/ml ALP中，室温避光反应60min，标记比例为10∶1-50∶1(GMBS∶ALP的摩尔比)。将反应液用10kD超滤离心管，10000r/min，10min/次，浓缩纯化3次；倒置超滤管，2000r/min，离心1min，收集浓缩液，获得马来酰胺化的ALP约100μL。
2.抗体的巯基化
将10mM DTT工作液(pH7.10)加入2mg/ml S100β标记抗体中，室温避光反应60min，标记比例为100∶1～600∶1(DTT∶S100β抗体的摩尔比)将反应液用50kD超滤离心管，8000r/min，5min/次，浓缩纯化3次；倒置超滤管，2000r/min，离心1min，收集浓缩液，获得巯基化的S100β抗体约100μL。
3.交联和封闭
将100μL马来酰胺化的ALP与100μL巯基化的S100β抗体混合，室温避光反应2-4h；反应结束后，按照每毫克蛋白加入1mg甘氨酸，放置于室温，避光反应30min，进行封闭。
4.纯化
将步骤3)中制备的交联产物用50kD超滤离心管，8000r/min，5min/次，浓缩纯化3次；倒置超滤管，2000r/min，离心1min，收集纯化液；将纯化后的产物用酶标抗体稀释液按1∶10比例稀释储存体积，再加入等体积甘油，-20℃冷冻保存。
本发明还提供一种单人份S100β蛋白化学发光测定方法，采用如上所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，包括以下步骤：
S1：将10-30ul待测样本、第二试剂孔中碱性磷酸酶标记的S100β抗体溶液10-40ul加入到第一试剂孔中，37℃混匀反应10min；
S2：吸取200ul洗液，重复洗涤3次；
S3：向洗涤后的试剂1孔中加入200ul底物液，反应5min后仪器自动测定发光值；
S4：利用已知浓度的校准曲线，将所得的发光值代入标准曲线(四参数拟合)方程中，计算得出所测样本中S100β蛋白的浓度。
具体的，该测定方法的原理为双抗体夹心法。
下面对本发明实施例提供的试剂盒选取三个批次进行性能测试。
1.最低检测限
将10ul待测样本(S0-S5)、第二试剂孔中碱性磷酸酶标记的S100β抗体溶液20ul加入到第一试剂孔中，37℃混匀反应10min；吸取200ul洗液，重复洗涤3次；向洗涤后的试剂1孔中加入200ul底物液，反应5min后仪器测定发光值；
空白标准品S0溶液设置20个复孔，其他5个浓度标准品S1-S5设置双孔，检测结果见表1。计算得到S0的平均值(Mean)和标准差(SD)，根据各校准品发光值与相对应浓度值进行线性拟合，根据拟合方程计算出Mean+2SD的浓度值，即为试剂盒最低检测限。三批次试剂盒最低检测限均在：0.015ng/ml以下。
表1试剂盒最低检测限检测数据
Figure BDA0003782102170000061
Figure BDA0003782102170000071
2.重复性
取质控品QC1(0.150ng/ml)、QC2(10.000ng/ml)，分别用三批试剂盒进行批内差和批间差测试。结果显示(表2-1、表2-2)试剂盒批内差、批间差均＜3.00％。
表2-1试剂盒重复性检测数据(批内差)
Figure BDA0003782102170000072
表2-2试剂盒重复性检测数据(批间差)
QC1 QC2
批次1试剂 0.172 11.560
批次2试剂 0.171 11.455
批次3试剂 0.174 11.499
平均值 0.172 11.505
SD 0.0032 0.1229
CV 1.86％ 1.07％
3.抗干扰性
将不同浓度的甘油三酯、胆红素、血红蛋白分别加入高低质控品中，按检测要求将样本(质控品及配制好的含有不同浓度甘油三酯、胆红素、血红蛋白的高低质控品)进行检测，结果显示(表3-1、表3-2、表3-3)试剂盒在检测含有高浓度甘油三酯、胆红素、血红蛋白的质控品时，结果偏差均＜10％。试剂盒不受甘油三酯(5％)、胆红素(0.32mg/m1)、血红蛋白(18mg/m1)的干扰。
表3-1试剂盒抗干扰试验-甘油三酯
Figure BDA0003782102170000081
表3-2试剂盒抗干扰试验-胆红素
Figure BDA0003782102170000082
Figure BDA0003782102170000091
表3-3试剂盒抗干扰试验-血红蛋白
Figure BDA0003782102170000092
4.临床样本检测
共收集临床样本35份，用本发明研制试剂和对比试剂分别进行检测比较，参阅图1，结果显示，本发明研制试剂的相关性R2＝0.9914，相关性良好。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，包括单人份包装的检测试剂，所述检测试剂包括：
第一试剂，为羧基磁微球包被的S100β抗体溶液；和
第二试剂，为由标记物标记的S100β抗体；和/或
洗液；和/或
底物液。
2.根据权利要求1所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述第一试剂的浓度为200-1000ug/ml。
3.根据权利要求1所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述第二试剂的浓度为0.050-0.300ug/ml。
4.根据权利要求1所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述洗液按质量份数包括：
0.5-0.9％金属离子溶液、0.02-0.1％表面活性剂、0.02-0.1％防腐剂、10-100mM/L缓冲溶液。
5.根据权利要求1或4所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述洗液的pH为7.2-7.8。
6.根据权利要求1所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述底物液按质量份数包括：
2.0-10.0mM镁离子溶液、0.5-2mM锌离子溶液、0.02-0.1％表面活性剂、0.02-0.1％防腐剂、50-100mg/L底物、10-100mM/L缓冲溶液。
7.根据权利要求6所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述底物为3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷、(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐、鲁米诺及其衍生物中的至少一种。
8.根据权利要求1或6所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述底物液的pH为8.8-10.0。
9.根据权利要求1所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述单人份检测试剂包括试剂条、检测卡的形式。
10.一种单人份S100β蛋白化学发光测定方法，采用如权利要求1至9任一项所述的单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将待测样本、第二试剂与第一试剂混匀反应；
S2：吸取200ul洗液，重复洗涤若干次；
S3：之后加入底物液反应，检测底物液的发光值；
S4：利用已知浓度的校准曲线，将所得的发光值代入标准曲线方程中，计算得出所测样本中S100β蛋白的浓度。
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