CN104345151A - 提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法 - Google Patents

提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，包括：（1）用基础缓冲液配制含有非蛋白质封闭组分的第一种封闭液；（2）用与步骤（1）相同的基础缓冲液配制含有蛋白质和氨基酸的第二种封闭液；（3）用第一种封闭液在37℃条件下对包被有抗原的硝酸纤维素膜第一次封闭；（4）弃去第一种封闭液；（5）用第二种封闭液在37℃条件下对完成第一次封闭的硝酸纤维素膜第二次封闭；（6）弃去第二种封闭液，完成封闭；通过使用两种不同封闭液并两次封闭，充分发挥封闭液中有效成分，彻底封闭抗原抗体反应区域以外间隙，最大限度地降低交叉反应和非特异结合，有效提升酶联免疫斑点技术产品检测结果准确性。

Description

提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法
技术领域
本发明涉及生物体外诊断试剂的制备，尤其涉及一种提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法
背景技术
目前酶联免疫斑点技术产品在体外诊断试剂中已有广泛的应用，如风湿免疫科中各种自身免疫性疾病的检测。酶联免疫斑点技术是基于硝酸纤维素膜的酶联免疫技术，该种技术产品的优点是可实现多种实验室指标的同时检测，并且无需借助特殊仪器凭借肉眼即可进行结果判断。然而硝酸纤维素膜自身具有吸附性强这个特点使得基于其基础上建立起来的酶联免疫斑点法产品的特异性成为困扰该种技术产品的关键因素。本领域技术人员应了解该种技术产品特异性的好坏主要是由封闭过程来决定的。现有技术关于非特异反应的封闭是采用封闭液一次封闭的过程，封闭液主要是以蛋白质为基础的封闭液以及近年来出现的部分非蛋白质封闭液。然而现有技术封闭方法要么由于蛋白质组分导致出现部分的交叉反应，要么由于大分子非蛋白质封闭组分间的间隙出现部分的非特异结合，导致最终的封闭效果并不十分理想，仍然会出现较多的非特异显色，易于产生结果判读的错误。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有产品存在的上述缺点，而提供一种提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其通过使用两种不同的封闭液，并采用两次封闭的技术方案，充分发挥封闭液中的有效成分，彻底封闭抗原抗体反应区域以外的其余间隙，能够最大限度地降低交叉反应和非特异结合，有效提升酶联免疫斑点技术产品检测结果的准确性。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用基础缓冲液配制含有非蛋白质封闭组分的第一种封闭液；（2）用与步骤（1）相同的基础缓冲液配制含有蛋白质和氨基酸的第二种封闭液；（3）用前述第一种封闭液在温度37℃条件下对包被有抗原的硝酸纤维素膜进行第一次封闭；（4）弃去第一种封闭液；（5）用前述第二种封闭液在温度37℃条件下对前述完成第一次封闭的硝酸纤维素膜进行第二次封闭；（6）弃去第二种封闭液，完成封闭过程。
前述的提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其中配制第一种封闭液使用的基础缓冲液为磷酸盐缓冲液或者Tris-Hcl缓冲液；所述非蛋白质封闭组分为聚乙烯醇或聚乙二醇，该非蛋白质封闭组分的加入浓度为2±0.5%。
前述的提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其中配制第二种封闭液使用的基础缓冲液为磷酸盐缓冲液或者Tris-Hcl缓冲液；所述蛋白质为低分子量蛋白质，该低分子量蛋白质为酪蛋白或者牛血清白蛋白，且低分子量蛋白质的加入浓度为1±0.5%；所述氨基酸为酪氨酸，该氨基酸的加入浓度为1±0.5%。
前述的提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其中硝酸纤维素膜的包被抗原优选U1-nRNP或者SS-A。
前述的提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其中第一次封闭的时间为2至3小时；所述第二次封闭的时间为1至2小时。
本发明权利要求1所述提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法在酶联免疫斑点技术中的应用。
本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法的有益效果，通过使用两种不同的封闭液、采用两次封闭的技术方案，充分发挥封闭液中的有效成分，彻底地封闭抗原抗体反应区域以外的其余间隙，最大限度地降低交叉反应和非特异结合，克服现有技术封闭后仍会出现部分非特异显色现象，有效提升酶联免疫斑点技术产品检测结果的准确性。
附图说明：
图1为使用本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法和使用现有技术封闭后的非特异显色检测结果图。
图中主要标号说明：
1-5列是5份U1-nRNP阳性样本检测结果。
6-10列是5份U1-nRNP阴性样本检测结果。
A行是使用本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法封闭后的检测结果。
B行是使用现有技术封闭后的检测结果。
图2为使用本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法和使用现有技术封闭后的非特异显色检测结果图。
图中主要标号说明：
11-15列是5份SS-A阳性样本检测结果。
16-20列是5份SS-A阴性样本检测结果。
C行是使用本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法封闭后的检测结果。
D行是使用现有技术封闭后的检测结果。
具体实施方式
本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用基础缓冲液配制含有非蛋白质封闭组分的第一种封闭液；（2）用与步骤（1）相同的基础缓冲液配制含有蛋白质和氨基酸的第二种封闭液；（3）用前述第一种封闭液在温度37℃条件下对包被有抗原的硝酸纤维素膜进行第一次封闭；（4）弃去第一种封闭液；（5）用前述第二种封闭液在温度37℃条件下对前述完成第一次封闭的硝酸纤维素膜进行第二次封闭；（6）弃去第二种封闭液，完成封闭过程。
本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其中，所述配制第一种封闭液使用的基础缓冲液为磷酸盐缓冲液或者Tris-Hcl缓冲液；所述非蛋白质封闭组分为聚乙烯醇或聚乙二醇，该非蛋白质封闭组分的加入浓度为2±0.5%。所述配制第二种封闭液使用的基础缓冲液为磷酸盐缓冲液或者Tris-Hcl缓冲液；所述蛋白质为低分子量蛋白质，该低分子量蛋白质为酪蛋白或者牛血清白蛋白，且低分子量蛋白质的加入浓度为1±0.5%；所述氨基酸为酪氨酸，该氨基酸的加入浓度为1±0.5%。所述硝酸纤维素膜的包被抗原优选U1-nRNP或者SS-A。所述第一次封闭的时间为2至3小时；所述第二次封闭的时间为1至2小时。
本发明权利要求1所述提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法在酶联免疫斑点技术中的应用。
实施例1：
A配制第一种封闭液，具体配制方法为配制含有聚乙烯醇终浓度为2%的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2；
B配制第二种封闭液，具体配制方法为配制含有酪蛋白和酪氨酸终浓度各为1%的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2；
C用前述第一种封闭液对包被有U1-nRNP抗原的硝酸纤维素膜进行温度37℃持续时间2小时的第一次封闭；
D弃去前述第一种封闭液；
E用前述第二种封闭液对前述完成第一次封闭的硝酸纤维素膜进行温度37℃持续时间1小时的第二次封闭；
F弃去前述第二种封闭液，完成封闭过程。
如图1所示，1-5列是5份U1-nRNP阳性样本检测结果，6-10列是5份U1-nRNP阴性样本检测结果。A行是使用本发明实施例封闭后的检测结果，B行是使用现有技术封闭后的检测结果。阴性样本斑块中间应无显色条带，阳性样本斑块中间应有显色条带，并且条带颜色越深样本的阳性程度越强。另外，斑块背景颜色深，说明出现一定程度的非特异显色，封闭效果不理想。由附图可以清楚地看出，经过本发明实施例封闭后的检测结果斑块背景颜色浅，阴性样本没有出现非特异显色现象。而现有技术封闭后的检测结果斑块背景颜色深，5份阴性样本中有2份出现弱的非特异显色条带。结果说明，本发明实施例的封闭方法可有效地降低非特异显色现象，提升了酶联免疫斑点技术产品检测结果的准确性。
实施例2：
A配制第一种封闭液，具体配制方法为配制含有聚乙二醇终浓度为2%的0.02 mol/L Tris-Hcl缓冲液，pH7.2；
B配制第二种封闭液，具体配制方法为配制含有牛血清白蛋白和酪氨酸终浓度各为1%的0.02 mol/L Tris-Hcl缓冲液，pH7.2；
C用前述第一种封闭液对包被有SS-A抗原的硝酸纤维素膜进行温度37℃持续时间3小时的第一次封闭；
D弃去前述第一种封闭液；
E用前述第二种封闭液对前述完成第一次封闭的硝酸纤维素膜进行温度37℃持续时间2小时的第二次封闭；
F弃去前述第二种封闭液，完成封闭过程。
如图2所示，11-15列是5份SS-A阳性样本检测结果，16-20列是5份SS-A阴性样本检测结果。C行是使用本发明实施例方法封闭后的检测结果，D行是使用现有技术封闭后的检测结果。阴性样本斑块中间应无显色条带，阳性样本斑块中间应有显色条带，并且条带颜色越深样本的阳性程度越强。另外，斑块背景颜色深，说明出现一定程度的非特异显色，封闭效果不理想。由附图可以清楚地看出，经过本发明实施例封闭后的检测结果斑块背景颜色浅，阴性样本没有出现非特异显色现象。而现有技术封闭后的检测结果斑块背景颜色深，5份阴性样本中有2份出现弱的非特异显色条带。结果说明，本发明实施例封闭方法可有效地降低非特异显色现象，提升了酶联免疫斑点技术产品检测结果的准确性。
本发明实施例中未进行说明的内容为现有技术，故，不再进行赘述。
本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法的优点：主要是克服现有技术产品存在的部分非特异显色现象。该方法是采用两次封闭的技术方案，首先使用第一种非蛋白质封闭液进行第一次封闭，非蛋白质封闭液的优点是可以避免产生交叉反应，单独使用非蛋白质封闭液可以使其最高效率地吸附在硝酸纤维素膜表面，然而其较大的分子量会使封闭后的硝酸纤维素膜仍然残留有部分间隙，这些间隙可以导致非特异结合的发生，因此在第一次封闭后用含有较低分子量蛋白质和氨基酸的第二种封闭液进行第二次封闭，以彻底覆盖第一次封闭后残留的间隙。这样就形成了以第一次封闭为主，以第二次封闭为辅的两次封闭方法。本发明提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法与现有技术同时使用蛋白质封闭液和非蛋白质封闭液的一次封闭方法相比，避免了多种成分同时存在时与硝酸纤维素膜的竞争吸附现象，最大程度地保证了非蛋白质封闭液在硝酸纤维素膜上的吸附，充分地发挥了其避免产生交叉反应的优点，同时又通过第二次封闭的方法弥补了其残留间隙的缺点。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用基础缓冲液配制含有非蛋白质封闭组分的第一种封闭液；（2）用与步骤（1）相同的基础缓冲液配制含有蛋白质和氨基酸的第二种封闭液；（3）用前述第一种封闭液在温度37℃条件下对包被有抗原的硝酸纤维素膜进行第一次封闭；（4）弃去第一种封闭液；（5）用前述第二种封闭液在温度37℃条件下对前述完成第一次封闭的硝酸纤维素膜进行第二次封闭；（6）弃去第二种封闭液，完成封闭过程。
2.根据权利要求1所述的提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其特征在于，所述配制第一种封闭液使用的基础缓冲液为磷酸盐缓冲液或者Tris-Hcl缓冲液；所述非蛋白质封闭组分为聚乙烯醇或聚乙二醇，该非蛋白质封闭组分的加入浓度为2±0.5%。
3.根据权利要求1所述的提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其特征在于，所述配制第二种封闭液使用的基础缓冲液为磷酸盐缓冲液或者Tris-Hcl缓冲液；所述蛋白质为低分子量蛋白质，该低分子量蛋白质为酪蛋白或者牛血清白蛋白，且低分子量蛋白质的加入浓度为1±0.5%；所述氨基酸为酪氨酸，该氨基酸的加入浓度为1±0.5%。
4.根据权利要求1所述的提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的包被抗原优选U1-nRNP或者SS-A。
5.根据权利要求1所述的提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法，其特征在于，所述第一次封闭的时间为2至3小时；所述第二次封闭的时间为1至2小时。
6.权利要求1所述提高酶联免疫斑点技术的特异性膜封闭方法在酶联免疫斑点技术中的应用。
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