CN111077316A - 一种荧光微球与抗体的偶联方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种荧光微球与抗体的偶联方法，包括如下步骤：(a)将荧光微球进行活化处理、重悬，得到微球悬浮液；(b)将抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应、超声处理、继续反应；(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物；本发明上述偶联方法，通过对荧光微球进行活化处理，以及通过超声处理保障各反应物的充分接触，能够显著提高荧光微球与抗体的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与抗体蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的稳定性，并避免凝集现象的发生；此外，还能够提高荧光检测的灵敏度。

Description

一种荧光微球与抗体的偶联方法
技术领域
本发明实施例涉及生物分析技术领域，具体涉及一种荧光微球与抗体的偶联方法。
背景技术
对某些抗原或特异性蛋白进行检测时,通常会应用到免疫标记技术。免疫标记技术是将既容易测定又具有高敏感性的物质标记到特异性抗原或者抗体蛋白上,通过这些标记物的增强放大作用来显示反应体系中抗原或抗体的性质和含量的技术。
目前常用的标记物包括胶体金、乳胶、荧光素、荧光微球、酶和放射性核素等。然而，现有的荧光微球标记抗体过程中，由于标记方法不合适，导致荧光微球与抗体偶联效率和偶联强度较低，从而导致荧光强度交底的问题。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种荧光微球与抗体的偶联方法，以解决现有技术中由于标记方法不合适，导致荧光微球与抗体偶联效率和偶联强度较低的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面提供一种荧光微球与抗体的偶联方法，所述偶联方法包括如下步骤：
(a)将荧光微球进行活化处理、重悬，得到微球悬浮液；
(b)将抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应、超声处理、继续反应；
(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；
(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。
本发明上述偶联方法，通过对荧光微球进行活化处理，以及通过超声处理保障各反应物的充分接触，能够显著提高荧光微球与抗体的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与抗体蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的稳定性，并避免凝集现象的发生；此外，还能够提高荧光检测的灵敏度。
进一步地，所述荧光微球表面含有羧基，可以是红色荧光微球、绿色荧光微球、量子点荧光微球或时间分辨荧光微球；优选地，所述荧光微球粒径80-500nm。
进一步地，所述抗体蛋白为肌酸激酶同工酶单克隆抗体。
本发明通过对荧光微球和抗体蛋白种类的限定，能够更好地提高荧光微球与抗体蛋白的偶联效率和偶联强度，提高免疫荧光的检测效果。
进一步地，所述步骤(a)中，活化处理具体为：
将荧光微球清洗后进行超声分散、稀释，随后依次向稀释后的荧光微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应、超声处理、离心，收集活化后的荧光微球。
进一步地，所述稀释采用的稀释剂为含聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液，聚乙烯吡咯烷酮浓度为0.05-2％，稀释后的荧光微球固含量为0.8-1.2‰。
进一步地，所述含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光微球溶液的体积比均为1∶(22-28)；所述含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8-12mg/ml；所述含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为8-12mg/ml。
进一步地，所述常温反应时间为25-35min。
本发明通过上述特定的活化方法，能够充分提高荧光微球的活性，提高与抗体的偶联强度和偶联效率。
进一步地，所述步骤(a)中，重悬为向活化处理后的荧光微球中添加含0.2％聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液、超声处理即可。
进一步地，所述步骤(a)中，微球悬浮液中荧光微球的固含量为0.08-0.12％。
进一步地，所述步骤(b)中，抗体溶液与微球悬浮液的体积比1∶(180-220)；抗体溶液中抗体浓度为2.8-3.0mg/ml。
本发明通过控制抗体与荧光微球的添加量，能够使得抗体与荧光微球充分结合，并具有较佳的空间构象，避免抗体蛋白活性的降低，影响荧光检测的灵敏度。
进一步地，所述步骤(b)中，反应时间为50-70min；超声处理时间为55-65s，超声波频率为40KHZ；继续反应时间为55-65min。
进一步地，所述步骤(c)中，封闭液为20％的BSA，且添加后的反应液中BSA浓度为0.4-0.6％；封闭时间为55-65min。
进一步地，所述步骤(d)中，甘氨酸溶液中甘氨酸浓度为4.5-5.5％。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明上述偶联方法，通过对荧光微球进行活化处理，以及通过超声处理保障各反应物的充分接触，能够显著提高荧光微球与抗体的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与抗体蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的稳定性，并避免凝集现象的发生。
(2)本发明通过对荧光微球和抗体蛋白种类的限定，能够更好地提高荧光微球与抗体蛋白的偶联效率和偶联强度，提高免疫荧光的检测效果。
(3)本发明通过控制抗体与荧光微球的添加量，能够使得抗体与荧光微球充分结合，并具有较佳的空间构象，避免抗体蛋白活性的降低，影响荧光检测的灵敏度。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例为一种荧光微球与肌酸激酶同工酶单克隆抗体的偶联方法，该偶联方法包括如下步骤：
(a)将荧光微球清洗后进行超声分散3min、采用聚乙烯吡咯烷酮浓度为2％的MES缓冲液进行稀释至荧光微球固含量为0.8‰，随后依次向稀释后的荧光微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应25min、超声处理、以10000r/min离心10min，收集活化后的荧光微球，向活化处理后的荧光微球中添加含0.2％聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液、超声处理，得到荧光微球的固含量为0.08％的微球悬浮液，其中，含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光微球溶液的体积比均为1∶28含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8mg/ml；含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为12mg/ml；
(b)将浓度为3.0mg/ml的抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应50min、采用40KHZ的超声波超声处理65s、继续反应65min，其中，抗体溶液与微球悬浮液的体积比1∶180；
(c)待反应结束后，向反应液中添加20％的BSA至反应液中BSA浓度为0.4％进行封闭反应65min、以10000r/min离心10min，收集沉淀物；
(d)将沉淀物置于浓度为4.5％的甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。
实施例2
本实施例为一种荧光微球与肌酸激酶同工酶单克隆抗体的偶联方法，该偶联方法包括如下步骤：
(a)将荧光微球清洗后进行超声分散2min、采用聚乙烯吡咯烷酮浓度为0.05％的MES缓冲液进行稀释至荧光微球固含量为1.2‰，随后依次向稀释后的荧光微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应35min、超声处理、以10000r/min离心10min，收集活化后的荧光微球，向活化处理后的荧光微球中添加含0.2％聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液、超声处理，得到荧光微球的固含量为0.12％的微球悬浮液，其中，含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光微球溶液的体积比均为1∶22含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为12mg/ml；含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为8mg/ml；
(b)将浓度为2.8mg/ml的抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应70min、采用40KHZ的超声波超声处理55s、继续反应55min，其中，抗体溶液与微球悬浮液的体积比1∶220；
(c)待反应结束后，向反应液中添加20％的BSA至反应液中BSA浓度为0.6％进行封闭反应55min、以10000r/min离心10min，收集沉淀物；
(d)将沉淀物置于浓度为5.5％的甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。
实施例3
本实施例为一种荧光微球与肌酸激酶同工酶单克隆抗体的偶联方法，该偶联方法包括如下步骤：
(a)将荧光微球清洗后进行超声分散2.5min、采用聚乙烯吡咯烷酮浓度为1％的MES缓冲液进行稀释至荧光微球固含量为1‰，随后依次向稀释后的荧光微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应30min、超声处理、以10000r/min离心10min，收集活化后的荧光微球，向活化处理后的荧光微球中添加含0.2％聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液、超声处理，得到荧光微球的固含量为0.1％的微球悬浮液，其中，含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光微球溶液的体积比均为1∶25含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为10mg/ml；含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为10mg/ml；
(b)将浓度为2.91mg/ml的抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应60min、采用40KHZ的超声波超声处理60s、继续反应60min，其中，抗体溶液与微球悬浮液的体积比1∶200；
(c)待反应结束后，向反应液中添加20％的BSA至反应液中BSA浓度为0.5％进行封闭反应60min、以10000r/min离心10min，收集沉淀物；
(d)将沉淀物置于浓度为5％的甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。
对照例1
本对照例为荧光微球与抗体的常规偶联方法，该偶联方法与实施例1中的偶联方法基本相同，区别仅在于步骤(a)中稀释采用的稀释剂为MES缓冲液。
实验例1
采用下述方法制备一种检测肌酸激酶同工酶的免疫荧光检测卡：
(a)标记垫的制备：按照实施例1制备的荧光微球偶联抗体，用含1％BSA、0.1％曲拉通、10％蔗糖、0.2％PVP40的PBS溶液(pH)稀释至5％，用三维划膜喷金仪喷到用同样溶液处理过的标记垫上，喷量为4μL/cm；然后将喷好的垫子置于37℃烘箱，干燥4h后置于<20％湿度条件下密闭保存；
(b)包被膜的制备：分别将抗肌酸激酶同工酶单抗和Protein A用划膜稀释液稀释至0.5mg/mL和0.2mg/mL,分别喷到硝酸纤维素膜上作为检测线(T)和质控线(C)，包被量均为1μL/cm，检测线和质控线间隔4mm；然后置于37℃烘箱，干燥12h后置于<20％湿度条件下密闭保存。所述划膜稀释液为含2％蔗糖的PBS溶液(pH7.4)；
(c)检测卡组装：将吸水垫、包被膜、标记垫、样品垫、标识条依次粘于PVC底板上，裁成4mm宽度的试纸条，装进卡壳，即成一种检测肌酸激酶同工酶的免疫荧光检测卡。
按照上述方法，将对照例1中制备得到的荧光微球偶联抗体制备成一种检测肌酸激酶同工酶的免疫荧光检测卡。
将实施例1和对照例1的两种不同偶联方法制备的荧光微球抗体偶联物制备的检测卡分别进行检测，对比两者的显色荧光强度。
检测方法如下：
将肌酸激酶同工酶抗原用PBS配制成0ng/mL、5ng/mL、25ng/mL，分别用两种检测卡，每个浓度点测试10次，对比检测线(T)、质控线(C)的荧光强度值；实验结果如下：
表1采用实施例1中偶联抗体制备的检测卡检测结果
Figure BDA0002334648200000071
表2采用对照例1中偶联抗体制备的检测卡检测结果
Figure BDA0002334648200000081
由表1、表2可知：
本申请实施例的偶联方法与对照例1中的偶联方法相比，偶联得到的复合物具有更高的活性，能够更好地提高荧光微球与抗体蛋白的偶联效率和偶联强度，提高免疫荧光的检测效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种荧光微球与抗体的偶联方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将荧光微球进行活化处理、重悬，得到微球悬浮液；
(b)将抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应、超声处理、继续反应；
(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；
(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。
2.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤(a)中，活化处理具体为：
将荧光微球清洗后进行超声分散、稀释，随后依次向稀释后的荧光微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应、超声处理、离心，收集活化后的荧光微球。
3.根据权利要求2所述的偶联方法，其特征在于，所述稀释采用的稀释剂为含聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液，聚乙烯吡咯烷酮浓度为0.05-2％，稀释后的荧光微球固含量为0.8-1.2‰。
4.根据权利要求2所述的偶联方法，其特征在于，所述含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光微球溶液的体积比均为1∶(22-28)；所述含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8-12mg/ml；所述含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为8-12mg/ml。
5.根据权利要求2所述的偶联方法，其特征在于，所述常温反应时间为25-35min。
6.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤(a)中，微球悬浮液中荧光微球的固含量为0.08-0.12％。
7.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤(b)中，抗体溶液与微球悬浮液的体积比1∶(180-220)；抗体溶液中抗体浓度为2.8-3.0mg/ml。
8.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤(b)中，反应时间为50-70min；超声处理时间为55-65s，超声波频率40KHZ；继续反应时间为55-65min。
9.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤(c)中，封闭液为20％的BSA，且添加后的反应液中BSA浓度为0.4-0.6％；封闭时间为55-65min。
10.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤(d)中，甘氨酸溶液中甘氨酸浓度为4.5-5.5％。
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