CN104530459A - 一种偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法，该方法包括以下步骤：步骤1，活化荧光微球表面的羧基；步骤2，偶联单克隆抗体的氨基与荧光微球表面的羧基；步骤3，封闭荧光微球表面没有完全反应的活化基团；步骤4，保存偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球。本发明制备方法简单，易行，成本低，适合产业化。

Description

一种偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法

技术领域

本发明涉及荧光标记抗体领域，尤其是涉及一种偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法。

背景技术

聚苯乙烯荧光微球是用荧光试剂染色的均一微球。荧光微球是指直径在纳米级至微米级范围内，负载有荧光物质，受外界能量刺激能激发出荧光的固体微粒。其外形可为任意形状，典型的外形为球形。荧光微球的载体多为有机或无机聚合物材料。它具有相对稳定的形态结构和发光行为，受外界条件如溶剂、热、电、磁等的影响比纯粹的荧光化合物要小，其作为一种新型的载体材料已广泛应用于生物医学领域。

一般采用种子聚合法和分散聚合法制备荧光微球，对制备荧光微球的实验工艺，微球形貌和实验后期处理进行了对比，选择分散聚合法制备荧光微球。通过光学显微镜和场发射扫描电镜对荧光微球进行了形貌表征，用激光粒度分析仪对荧光微球的粒径进行了表征，用紫外可见分光光度计，荧光分光光度计和荧光显微镜对微球的荧光性质进行了分析，用红外光谱分析和电导滴定，对微球表面的官能团进行了测定。光学显微镜和场发射扫描电镜的照片表明了高分子荧光微球呈现很好的球形，表面光滑，且分散均匀。激光粒度分析图表明离心过的高分子荧光微球的粒径比较均匀，大致呈正态分布。紫外吸收光谱图和荧光光谱图表明荧光素已经被包覆到球内，我们可以通过改变两种荧光素的比例制备不同强度的荧光微球，荧光显微镜照片表明我们制备的荧光微球具有很好的荧光性质。红外光谱分析和电导滴定的测定表明，我们制备高分子荧光微球表面带有-COOH官能团。容易和生物分子相连，适合做免疫检测的载体。

随着对功能高分子研究的深入，荧光微球(Fluorescent microspheres)以其稳定的形态结构及稳定而高效的发光效率，在许多领域有很重要的应用，尤其在生物免疫检测上有着很广泛的应用。微球免疫检测技术最早可以追溯到1956年Singer和Plotz发明的乳液凝集测试(latex agglutination tests, LAT)用于类风湿因子的检测，从此之后，LAT应用于超过100种传染病毒的检测，出现了一系列从简单到比较复杂的测试方法。

微球的定量或定性检测一般都是建立在抗原(Ag)和抗体(Ab)的特异性反应的基础上的，抗原或抗体被吸附到微球载体上，然后把它与含有对应反应物的样品（血清，尿样等）混合，这些“敏感”的微球就起着放大抗原抗体之间特异性反应的作用。

微球免疫检测发展情况，主要有乳液凝集检测、粒子捕获酶联免疫检测、超顺磁性微球测试、微球用作标记物和染色剂、流式荧光免疫微球分析技术。对载体微球提出如下要求：

（1）微球上固载有荧光，且荧光稳定，对免疫反应不产生毒性；

（2）微球表面共聚有羧基功能团，以作为和免疫生物物质反应的位点；

（3）微球的粒径是单分散的；

（4）微球的大小是微米级的。

聚苯乙烯荧光微球标记抗体主要用于荧光免疫层析。免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一项新兴免疫检测技术。免疫层析技术已固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物子层析条上移动。待测物在T线处发生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。常用荧光免疫层析法包括夹心法和竞争法，其中双抗体夹心法较为常见。利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测物的定性或定量检测。

目前常用于荧光标记抗体的荧光物质是荧光素，例如异硫氰酸荧光黄(FITC)和四乙基罗丹明(RB200)。但影响标记效率的因素有温度、时间、pH、荧光素和蛋白的量等，需注意控制；荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适当以避免气泡产生。荧光素标记过程复杂，实验条件严格。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法，工艺简单，成本低廉，适合大规模生产。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，活化荧光微球表面的羧基；

步骤2，偶联单克隆抗体的氨基与荧光微球表面的羧基；

步骤3，封闭荧光微球表面没有完全反应的活化基团；

步骤4，保存偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球。

作为优选的是，步骤1，所述活化荧光微球表面的羧基是-COOH，取表面带羧基的荧光微球与离心管中，用MES buffer洗涤3-5遍后离心并弃去上清液，再向离心管中加入MES buffer ，按体积比1:2加入新鲜配制的0.5g/mL EDC溶液和0.25g/mL sulfo-NHS溶液，用旋涡混合器振荡混匀，室温下旋转活化荧光微球表面的羧基5-10分钟，用MES buffer洗涤荧光微球2-5遍。

作为优选的是，步骤2，所述偶联单克隆抗体的氨基与荧光微球表面的羧基是-NH₂和-COOH反应脱水形成肽键-NH-OC-，洗涤完成后，加入单克隆抗体，再加入BST buffer，保持荧光微球的浓度为3-6mg/ml，旋涡混合器振荡混匀，在室温下旋转反应1-3小时，再用冷冻离心机分离收集上清液，并检测偶联效率。

作为优选的是，荧光微球的浓度为4mg/ml。

作为优选的是，步骤3所述封闭荧光微球表面没有完全反应的活化基团是羧基-COOH，向步骤2分离后的沉淀中加入BST 缓冲液和甘氨酸，旋转封闭30-60分钟，再用冷冻离心机分离弃上清后，加入含BSA封闭液，室温下旋转反应30-60分钟。

作为优选的是，步骤4，用BST buffer洗涤封闭完成的荧光微球2-5次，保存于含BSA和NaN₃叠氮钠的BST缓冲液的免疫微球保存液中备用。

本发明是将聚苯乙烯荧光微球作为荧光标记物质，标记单克隆抗体，因此两者的结合物被称作偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球。

本发明聚苯乙烯荧光微球标记抗体的测试原理：本发明制备的荧光微球标记的抗体与样品溶液（抗原）按照一定比例进行混匀，在样品区加入样品混合液，通过硝酸纤维素膜的毛细作用，混合液沿着测试通道流动直至到达沉积有抗体的检测区，在检测区发生抗原抗体的特异性结合，形成双抗夹心结构。通过使用荧光显微镜捕捉检测区的荧光信号。

有益效果

本发明聚苯乙烯荧光微球与抗体的偶联率高达80%；荧光微球分散性好；在与样品溶液混合后，混合液中荧光微球的团聚现象明显减弱；流经检测通道的荧光信号较弱；检测区非特异性结合减弱，特异性结合增强。

附图说明

图1为本发明制备的偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球制备示意图，其中，1. 单克隆抗体，2. 聚苯乙烯荧光微球，3. 偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球；

图2为本发明制备的偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的应用实例，其中，a为实施例1的荧光信号，b为实施例2的荧光信号，c为实施例3的荧光信号。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

    步骤1，以0.01M MES buffer作为活化缓冲液，取100μL表面有羧基的荧光微球加入1.5mL离心管中，用MSE buffer洗涤3次后，用冷冻离心机离心弃上清液，再在离心管中加入MES buffer，按体积比1:2加入新鲜配制的0.5g/mL EDC溶液和0.25g/mL sulfo-NHS溶液，用旋涡混合器振荡混匀，室温下旋转活化微球表面的羧基10分钟，再用MSE buffer洗涤荧光微球2遍。

步骤2，以0.02M BST buffer 作为偶联过程的缓冲液，洗涤完成后，加入10μg单克隆抗体，再加入BST buffer，保持荧光微球的浓度为3mg/ml，室温下旋转反应1小时，再用冷冻离心机分离收集上清液，并检测偶联率为82%。

步骤3，向分离后的沉淀中加入BST 缓冲液和2.5μL甘氨酸，旋转封闭30分钟，再用冷冻离心机分离弃上清后，加入BSA封闭液（BST缓冲液稀释），室温下旋转反应30分钟。

步骤4，用BST buffer洗涤封闭完成的荧光微球4次，保存于含BSA和NaN₃叠氮钠的BST缓冲液的免疫微球保存液中备用。

实施例2

    步骤1，以0.01M MES buffer作为活化缓冲液，取100μL表面有羧基的荧光微球加入1.5mL离心管中，用MSE buffer洗涤3次后，用冷冻离心机，离心弃上清液。洗涤3遍后，在离心管中加入MES buffer，按体积比1:2加入新鲜配制的0.5g/mL EDC溶液和0.25g/mL sulfo-NHS溶液，用旋涡混合器振荡混匀，室温下旋转活化微球表面的羧基10分钟，再用MSE buffer洗涤微球2遍。

步骤2，以0.02M BST buffer 作为偶联过程的缓冲液。洗涤完成后，加入10μg单克隆抗体，再加入BST buffer，室温下旋转反应2小时，再用冷冻离心机分离收集上清液，并检测偶联率为85%。

步骤3，向分离后的沉淀中加入BST 缓冲液和5.0μL甘氨酸，旋转封闭30分钟，再用冷冻离心机分离弃上清后，加入BSA封闭液（BST缓冲液稀释），室温下旋转反应30分钟。

步骤4，用BST buffer洗涤封闭完成的荧光微球4次，保存于含BSA和NaN₃叠氮钠的BST缓冲液的免疫微球保存液中备用。

实施例3

    步骤1，以0.01M MES buffer作为活化缓冲液，取100μL表面有羧基的荧光微球加入1.5mL离心管中，用MSE buffer洗涤3次后，用冷冻离心机，离心弃上清液。洗涤3遍后，在离心管中加入MES buffer，按体积比1:2加入新鲜配制的0.5g/mL EDC溶液和0.25g/mL sulfo-NHS溶液，用旋涡混合器振荡混匀，室温下旋转活化微球表面的羧基10分钟，再用MSE buffer洗涤微球2遍。

步骤2，以0.02M BST buffer 作为偶联过程的缓冲液。洗涤完成后，加入10μg单克隆抗体，再加入BST buffer，室温下旋转反应2小时，再用冷冻离心机分离收集上清液，并检测偶联率为93%。

步骤3，向分离后的沉淀中加入BST 缓冲液和7.5μL甘氨酸，旋转封闭30分钟，再用冷冻离心机分离弃上清后，加入BSA封闭液（BST缓冲液稀释），室温下旋转反应30分钟。

步骤4，用BST buffer洗涤封闭完成的荧光微球4次，保存于含BSA和NaN₃叠氮钠的BST缓冲液的免疫微球保存液中备用。

对比例

 步骤1，以0.01M MES buffer作为活化缓冲液，取100μL表面有羧基的荧光微球加入1.5mL离心管中，用MSE buffer洗涤3次后，用冷冻离心机离心弃上清液，再在离心管中加入MES buffer，按体积比1:2加入新鲜配制的0.5g/mL EDC溶液和0.25g/mL sulfo-NHS溶液，用旋涡混合器振荡混匀，室温下旋转活化微球表面的羧基10分钟，再用MSE buffer洗涤荧光微球2遍。

步骤2，以0.02M BST buffer 作为偶联过程的缓冲液，洗涤完成后，加入10μg单克隆抗体，再加入BST buffer，保持荧光微球的浓度为3mg/ml，室温下旋转反应1小时，再用冷冻离心机分离收集上清液，并检测偶联率为75%。

步骤3，向分离后的沉淀中加入BST 缓冲液，旋转封闭30分钟，再用冷冻离心机分离弃上清后，加入BSA封闭液（BST缓冲液稀释），室温下旋转反应30分钟。

步骤4，用BST buffer洗涤封闭完成的荧光微球4次，保存于含BSA和NaN₃叠氮钠的BST缓冲液的免疫微球保存液中备用。

通过对实施例的偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的检测可知，聚苯乙烯荧光微球与抗体的偶联效率（如图1所示），与室温下旋转时间和甘氨酸的用量有关，（如图2所示）。随着室温旋转时间从1小时增加到3小时，聚苯乙烯微球与抗体的偶联效率越高；随着甘氨酸的用量从2.5μL增加到7.5μL，对荧光微球表面未完全反应的活化基团进行封闭效果越好，团聚现象明显减弱（如图2所示），应用于检测中所需实验步骤少，试剂用量小，实验效率高等优点。通过实施例1-3可以看出，本发明聚苯乙烯荧光微球标记抗体的分散性好，团聚现象明显减弱，荧光微球与抗体偶联效率高，适用于进一步实验检测。

Claims (6)

1.一种偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，活化荧光微球表面的羧基；

 步骤2，偶联单克隆抗体的氨基与荧光微球表面的羧基；

步骤3，封闭荧光微球表面没有完全反应的活化基团；

步骤4，保存偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球。

2.根据权利要求1所述的偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于：步骤1，所述活化荧光微球表面的羧基是-COOH，取表面带羧基的荧光微球与离心管中，用MES buffer洗涤3-5遍后离心并弃去上清液，再向离心管中加入MES buffer ，按体积比1:2加入新鲜配制的0.5g/mL EDC溶液和0.25g/mL sulfo-NHS溶液，用旋涡混合器振荡混匀，室温下旋转活化荧光微球表面的羧基5-10分钟，用MES buffer洗涤荧光微球2-5遍。

3.根据权利要求1所述的偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于：步骤2，所述偶联单克隆抗体的氨基与荧光微球表面的羧基是-NH₂和-COOH反应脱水形成肽键-NH-OC-，洗涤完成后，加入单克隆抗体，再加入BST buffer，保持荧光微球的浓度为3-6mg/ml，旋涡混合器振荡混匀，在室温下旋转反应1-3小时，再用冷冻离心机分离收集上清液，并检测偶联效率。

4.根据权利要求3所述的偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于：荧光微球的浓度为4mg/ml。

5.根据权利要求1所述的偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于：步骤3所述封闭荧光微球表面没有完全反应的活化基团是羧基-COOH，向步骤2分离后的沉淀中加入BST 缓冲液和甘氨酸，旋转封闭30-60分钟，再用冷冻离心机分离弃上清后，加入含BSA封闭液，室温下旋转反应30-60分钟。

6.根据权利要求1所述的偶联抗体的聚苯乙烯荧光微球的制备方法，其特征在于：步骤4，用BST buffer洗涤封闭完成的荧光微球2-5次，保存于含BSA和NaN₃叠氮钠的BST缓冲液的免疫微球保存液中备用。