CN107365360A - 抗原肽‑微球及制备方法和在水貂阿留申病检测中的应用 - Google Patents

抗原肽‑微球及制备方法和在水貂阿留申病检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明为抗原肽‑微球制备方法和在水貂阿留申病检测中的应用，提供了一种SD抗原肽，同时进一步提供了SD抗原肽‑微球复合物，可以作为临床诊断试剂，用于检测水貂阿留申病。共价连接抗原肽的方式可使微球上结合的蛋白更加稳定，而且也使抗原肽吸附微球的过程时间减少，提高工作效率，方便易行，一般3‑5分钟即可完成。检测方法具有检测简单、快速且灵敏度高、准确性好及成本低等优点。本发明采用SD抗原肽与微球共价偶联的方法来检测水貂阿留申病，该方法使得检测更为经济、方便和快捷，适用于绝大多数散户饲养场及大型水貂场。

Description

抗原肽-微球及制备方法和在水貂阿留申病检测中的应用
技术领域
本发明提供一种抗原肽SD-微球复合物，同时还提供了其制备方法，进一步公开了该复合物在水貂阿留申病检测中的应用，可以制成一种免疫检测试剂，属于医学免疫领域。
背景技术
水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,MAD)由水貂阿留申病毒(Aleutianmink disease parvovirus, AMDV)引起，是一种慢性，消耗性传染病，普遍存在于世界各地的貂群中，发病率可高达 30%-90%。由于AD的致病机理比较特殊，目前尚未研制出可行的疫苗或药物来预防和治疗该病，只能通过定期检测来淘汰病貂净化貂群。然而目前检测 ADV的技术依然存在一些问题，如检测技术复杂，需要精密的仪器设备，需要大量的经费和劳动力，成本过高，检测精确度不够等，导致净化不完全。
对流免疫电泳(Counter Immune Electrophoresis, CIEP)是国际贸易中规定的检测方法。CIEP 检测结果主要由检测人员肉眼观察，结果常受到主观影响，全凭经验确定抗原和抗体之间沉淀线的特异与非特异性，故实现自动化检测困难重重。随着技术的发展，酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)技术发展越来越成熟，形成了各式各样的检测病毒的抗原抗体的商品试剂盒。我国使用的 ELISA检测AD的部分试剂盒全都依赖进口，且价格昂贵，从而检测成本相对提高，很难在国内推广，并且ELISA 检测所需时间较长。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种抗原肽SD，并将抗原肽SD与微球结合，形成抗原肽-微球复合物，可以作为临床诊断试剂，用于检测水貂阿留申病。
本发明进一步提供了抗原肽SD-微球的制备方法，这种共价连接抗原肽的方式可使微球上结合的抗原肽更加稳定，而且也使抗原肽吸附微球的过程时间减少，提高工作效率，方便易行，一般2-3分钟即可完成。
本发明还进一步公开了该微球在水貂阿留申病检测中的应用，可以制成一种免疫检测试剂。
本发明所述的一种抗原肽SD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的的一种抗原肽SD的制备方法，包括以下步骤：
1、根据Chou-Fasman法和Garnier-Robson 法预测结构蛋白VP2的二级结构，根据Karplus-Schulz法预测氨基酸的柔性；
2、 通过Kyke-Doolittle法和Emini法分别预测了结构蛋白VP2的亲水区域和表面可及性区域，选取其中亲水性及抗原指数高的表位肽段，作为ADV的B细胞优势表位；
3、通过将ADV的VP2序列与基准序列ADV-G的VP2比对，获得与猪细小病毒的同源性极高保守的VP2片段；
4、将保守的氨基酸片段与B细胞优势表位进行比较，选出相同的抗原性相对较高的片段，进行柔性linker-GSG串联连接，获得最佳优势B细胞表位组合氨基酸序列；
5、将人工设计抗原肽段在大肠杆菌BL21中诱导表达，经Ni2+亲和层析柱纯化后再超滤浓缩，得到抗原肽SD。
本发明所述的一种水貂阿留申病抗体检测微球的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
1、检测微球的活化：100uL微球溶液离心后弃上清液，在离心得到的沉淀中加入500μL50 mM pH 7.0的MES缓冲液，震荡混匀后离心，弃上清；在其沉淀中加入500uL MES缓冲液，漩涡混合30秒，超声震荡60秒，分别加入20μL 50 mg/mL的 NHS和EDC溶液震荡混匀，37℃温箱静置30min后离心弃上清；在离心得到的沉淀中加500uL洗涤液重悬，漩涡混合30秒，超声震荡60秒，活化完毕；
2、检测微球与抗原肽SD的偶联：每100uL活化后的微球加入400-600mg的抗原肽SD，充分混匀，4℃冰箱静置1-2小时；将此复合物离心弃上清；加入500μL 50 mM pH 7.0的MES缓冲液重悬微球，离心弃上清，重复3次；用500μL缓冲液清洗微球，离心弃上清；分别加入质量浓度为2%的甘氨酸溶液与1%的牛血清白蛋白各250uL进行封闭处理；再用500μL缓冲液清洗微球3次后离心，弃上清；加入500μL缓冲液即可得到抗原肽SD-微球复合物，4℃冰箱保存；
所述的甘氨酸（GLY）封闭液质量浓度为1%；牛血清白蛋白（BSA）封闭剂质量浓度为2%；封闭时间为两小时；
所述的储存液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液中至少一种，pH为6.0-9.0，浓度为50-500mmol/L。
本发明所述的一种抗原肽SD-微球复合物快速检测水貂阿留申病的检测试剂盒，其特征在于：包括抗原肽SD-微球复合物、微球稀释液；其中，抗原肽SD-微球复合物包括抗原肽SD、检测微球、活化剂、MES缓冲液；
抗原肽SD-微球复合物各组分的浓度为：
抗原肽SD 600mg/mL
检测微球 1g/mL
MES缓冲液 50mmol/L
所述的缓冲液选自PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液中至少一种，pH为6.0-9.0，浓度为50-500mmol/L；
所述的活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）至少一种，浓度为20-100mg/mL；
所述的微球稀释液选自PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液中至少一种，pH为6.0-9.0，浓度为50-500mmol/L。
本发明的积极效果在于：
提供了一种抗原肽SD，同时进一步提供了抗原肽SD-微球复合物，可以作为临床诊断试剂，用于检测水貂阿留申病。本发明共价连接抗原肽的方式可使微球上结合的蛋白更加稳定，而且也使抗原肽吸附微球的过程时间减少，提高工作效率，方便易行，一般3-5分钟即可完成。检测方法具有检测简单、快速且灵敏度高、准确性好及成本低等优点。本发明采用抗原肽SD与微球共价偶联的方法来检测水貂阿留申病，该方法使得检测更为经济、方便和快捷，适用于绝大多数散户饲养场及大型水貂场。
本发明的提出改善了在水貂阿留申病诊断中时间较长等问题，此外，通过利用微球作为载体，同时也提高了诊断的敏感性与特异性。因此，本发明为水貂阿留申病快速检测提出了新的思路，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为不同活化剂对抗原肽SD-微球复合物偶联率的影响；
图2为活化反应时间对抗原肽SD-微球复合物偶联率的影响；
图3-7为偶联时间和不同的抗原肽SD-微球复合物浓度对偶联率的影响；
图8为不同缓冲液的pH值对抗原肽SD-微球复合物偶联率的影响；
图9为MES缓冲体系的不同pH值对抗原肽SD-微球复合物偶联率的影响；
图10为本发明试剂盒检测效果。
具体实施方式
通过以下实施进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1：
抗原肽SD的制备：
（1）根据Chou-Fasman法和Garnier-Robson 法预测结构蛋白VP2的二级结构，根据Karplus-Schulz法预测氨基酸的柔性；
（2）通过Kyke-Doolittle法和Emini法分别预测了结构蛋白VP2的亲水区域和表面可及性区域，选取其中亲水性及抗原指数高的表位肽段，作为ADV的B细胞优势表位。
（3）通过将ADV的VP2序列与基准序列ADV-G的VP2比对，获得与猪细小病毒的同源性极高保守的VP2片段；
（4）将保守的氨基酸片段与B细胞优势表位进行比较，选出相同的抗原性相对较高的片段，进行柔性linker-GSG串联连接，获得最佳优势B细胞表位组合氨基酸序列。
（5）将人工设计抗原肽段在大肠杆菌BL21中诱导表达，经Ni2+亲和层析柱纯化后再超滤浓缩，得到抗原肽SD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：
水貂阿留申病抗体检测微球的制备：
（1）检测微球的活化：100uL微球溶液离心后弃上清液，在离心得到的沉淀中加入500μL50 mM pH 7.0的MES缓冲液，震荡混匀后离心，弃上清；在其沉淀中加入500uL MES缓冲液，漩涡混合30秒，超声震荡60秒，分别加入20μL 50 mg/mL的 NHS和EDC溶液震荡混匀，37℃温箱静置30min后离心弃上清；在离心得到的沉淀中加500uL洗涤液重悬，漩涡混合30秒，超声震荡60秒，活化完毕。
（2）检测微球与抗原肽SD的偶联：每100uL活化后的微球加入400-600mg的抗原肽SD，充分混匀，4℃冰箱静置1-2小时；将此复合物离心弃上清；加入500μL 50 mM pH 7.0的MES缓冲液重悬微球，离心弃上清，重复3次；用500μL缓冲液清洗微球，离心弃上清；分别加入质量浓度为2%的甘氨酸溶液与1%的牛血清白蛋白各250uL进行封闭处理；再用500μL缓冲液清洗微球3次后离心，弃上清；加入500μL缓冲液即可得到抗原肽SD-微球复合物，4℃冰箱保存；
实施例3
快速检测水貂阿留申病的检测试剂盒
1、抗原肽SD-微球复合物的制备：
（1）将抗原肽SD样品与活化好的微球混匀在1.5mL的EP管里，4℃冰箱静置若干小时。然后将此混合物14000rpm离心10分钟，弃上清；
（2）加入缓冲液重悬微球，14000rpm离心10分钟，弃上清，重复两次；
（3）用500uL储存液清洗微球，14000rpm离心5min，弃上清；
（4）加入甘氨酸（GLY）与牛血清白蛋白（BSA）进行封闭，过夜反应；
（5）次日，用500uL洗涤液清洗微球若干次，每次14000rpm，离心5min，清洗结后，加入500uL储存液于4℃保存，及得抗原肽SD-微球复合物，于4℃冰箱。
2、微球稀释液的制备：微球稀释液选自PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液中至少一种，pH为6.0-9.0，浓度为50-500mmol/L；
3、活化剂的制备：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）至少一种，浓度为20-100mg/mL；
实施例4：
抗原肽SD-微球复合物快速检测试剂盒能有效地检测出水貂阿留申病阳性血清
实验前，应分别将待检血清和抗原肽SD-微球复合物在室温放置5-10min，将玻板上标记被检血清号，然后在玻板上滴加相应被检血清0.02-0.04mL，抗原肽-微球复合物稀释后，取0.01-0.02mL滴加在相应被检血清上, 用小棒搅动待检血清和抗原肽-微球复合物，使之充分混合，结果如图10所示，在40-60s内，左侧玻璃平板内无絮状沉淀，说明水貂没有感染阿留申病毒，右侧玻璃平板内出现了絮状样沉淀，抗原肽SD-微球复合物与阳性血清发生了结合，说明水貂感染了阿留申病毒。
作为本发明的进一步优选，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液中至少一种，pH为6.0-9.0，浓度为50-500mmol/L；
作为本发明的进一步优选，所述抗原肽SD浓度为400-900ug/mL，活化后微球浓度为0.01-1g/mL；
作为本发明的进一步优选，所述储存液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液中至少一种，pH为6.0-9.0，浓度为50-500mmol/L；
作为本发明的进一步优选，封闭剂终浓度为分别为2-5%；
作为本发明的进一步优选，所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）至少一种，二者浓度为20-80mg/mL；
作为进一步优选，所述微球颗粒其平均粒径在100-500nm之间。
<110> 吉林大学
<120> 抗原肽-微球及制备方法和在水貂阿留申病检测中的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 水貂种（Neovison vison sp.）
<400> 1
Asn Gln Ala Asp Thr Asp Glu Tyr Leu Gly Ser Gly Gln Asp Asp Tyr
1 5 10 15
Leu Ser Val Asp Glu Gln Tyr Gly Ser Gly Trp Gly Glu Glu Arg Gly
20 25 30
Lys Lys Asn Ala Glu Met Gly Ser Gly Gly Gly Pro Arg Gln Trp Ser
35 40 45
Asp Thr Thr Lys Gly Ala Gly Thr His Ser Gly Ser Gly Pro Ile His
50 55 60 65
Glu Arg Ser Asn Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Lys Leu Thr Glu Asn Leu
70 75 80
Thr Asp Thr Phe Asn Tyr Asp Glu Asn Pro Asp Arg Ile Lys Thr Tyr
85 90 95
Gly Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Arg Ser Thr Ile Lys
100 105 108

Claims (6)

1. 一种抗原肽SD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种抗原肽SD的制备方法，包括以下步骤：
（1）根据Chou-Fasman法和Garnier-Robson 法预测结构蛋白VP2的二级结构，根据Karplus-Schulz法预测氨基酸的柔性；
（2）通过Kyke-Doolittle法和Emini法分别预测了结构蛋白VP2的亲水区域和表面可及性区域，选取其中亲水性及抗原指数高的表位肽段，作为ADV的B细胞优势表位；
（3）通过将ADV的VP2序列与基准序列ADV-G的VP2比对，获得与猪细小病毒的同源性极高保守的VP2片段；
（4）将保守的氨基酸片段与B细胞优势表位进行比较，选出相同的抗原性相对较高的片段，进行柔性linker-GSG串联连接，获得最佳优势B细胞表位组合氨基酸序列；
（5）将人工设计抗原肽段在大肠杆菌BL21中诱导表达，经Ni2+亲和层析柱纯化后再超滤浓缩，得到抗原肽SD。
3.如权利要求1所述的抗原肽SD在检测水貂阿留申病中的用途。
4.一种水貂阿留申病抗体检测微球的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：（1）检测微球的活化：100uL微球溶液离心后弃上清液，在离心得到的沉淀中加入500μL 50 mMpH 7.0的MES缓冲液，震荡混匀后离心，弃上清；在其沉淀中加入500uL MES缓冲液，漩涡混合30秒，超声震荡60秒，分别加入20μL 50 mg/mL的 NHS和EDC溶液震荡混匀，37℃温箱静置30min后离心弃上清；在离心得到的沉淀中加500uL洗涤液重悬，漩涡混合30秒，超声震荡60秒，活化完毕；
（2）检测微球与抗原肽SD的偶联：每100uL活化后的微球加入400-600mg的抗原肽SD，充分混匀，4℃冰箱静置1-2小时；将此复合物离心弃上清；加入500μL 50 mM pH 7.0的MES缓冲液重悬微球，离心弃上清，重复3次；用500μL缓冲液清洗微球，离心弃上清；分别加入质量浓度为2%的甘氨酸溶液与1%的牛血清白蛋白各250uL进行封闭处理；再用500μL缓冲液清洗微球3次后离心，弃上清；加入500μL缓冲液即可得到抗原肽SD-微球复合物，4℃冰箱保存；
所述的甘氨酸（GLY）封闭液质量浓度为1%；牛血清白蛋白（BSA）封闭剂质量浓度为2%；封闭时间为两小时；
所述的储存液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液中至少一种，pH为6.0-9.0，浓度为50-500mmol/L。
5.一种抗原肽SD-微球复合物快速检测水貂阿留申病的检测试剂盒，其特征在于：包括抗原肽SD-微球复合物、微球稀释液；其中，抗原肽SD-微球复合物包括抗原肽SD、检测微球、交联剂、MES缓冲液；
抗原肽SD-微球复合物各组分的浓度为：
抗原肽SD 600mg/mL
检测微球 1g/mL
MES缓冲液 50mmol/L
所述的缓冲液选自PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、硼酸缓冲液中至少一种，pH为6.0-9.0，浓度为50-500mmol/L；
所述的交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺至少一种，浓度为20-100mg/mL；
所述的微球稀释液选自PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、Tirs缓冲液中的一种，pH为7.0-9.0，浓度为50-500 mmol/L。
6.如权利要求5所述的一种抗原肽SD-微球复合物快速检测水貂阿留申病的检测试剂盒的制备，包括以下步骤：
（1）抗原肽SD-微球复合物的制备：
如权利要求4中所述抗原肽SD-微球复合物的制备方法；
（2）微球稀释液的制备：
微球稀释液选自PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、Tirs缓冲液中的一种或几种，其pH为6.0-9.0，浓度为50-500mmol/L。
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