KR20120132227A - 다중 타입 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법 - Google Patents

다중 타입 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법 Download PDF

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KR20120132227A
KR20120132227A KR20110050925A KR20110050925A KR20120132227A KR 20120132227 A KR20120132227 A KR 20120132227A KR 20110050925 A KR20110050925 A KR 20110050925A KR 20110050925 A KR20110050925 A KR 20110050925A KR 20120132227 A KR20120132227 A KR 20120132227A
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박상규
조영준
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차의과학대학교 산학협력단
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본 발명은 다중 타입의 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되며, 구제역 바이러스의 고병원성 특정 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체 및 이를 이용한 검출 방법 등에 관한 것이다. 본 발명은 구제역 바이러스를 특이적으로 진단하는 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이를 이용한 진단방법/키트를 제공한다. 본 발명의 하이브리도마 세포주는 구제역 바이러스를 특이적으로 진단하는 항체를 생산할 수 있으며, 본 발명의 항체는 구제역 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있어 구제역 바이러스 진단 키트 제작에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 높다.

Description

다중 타입 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법{Monoclonal antibody for detecting multiple type Foot and Mouth Disease Virus and method for detecting Foot and Mouth Disease Virus using the same}
본 발명은 다중 타입의 구제역 바이러스 검출용 단일클론 항체 및 이를 이용한 구제역 바이러스 검출방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되며, 구제역 바이러스의 고병원성 특정 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체 및 이를 이용한 검출 방법 등에 관한 것이다.
구제역은 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 우제류에 감염되는 전염성이 매우 강한 질병으로 아프리카, 아시아, 중동아시아, 남미를 포함한 세계적으로 발병하고 있다. 최근 키칭(Kitching) 등에 의하면 현재 아시아에서 유행하고 있는 구제역 바이러스는 혈청형 O의 남 아시아(South Asia topotype)에 속하며 국내에서도 2000년, 2002년에 발병하여 축산 농가에 심각한 경제적 피해를 유발하였다. 감염 초기에는 입술, 혀, 잇몸, 코, 발굽 상이에 수포가 생기고 체온이 급격히 상승하여 식욕이 저하되다가 결국 급성폐사 한다. FMD는 치사율이 55%에 달하고 전파율이 90%로 우리나라에서는 제1종 법정 가축 전염병으로 국제수역사무국(OIE)은 목록 A(list A) 질병으로 분류하고 있다.
구제역 바이러스는 피코르나비르내 아흐토바이러스(Picornavirnae, Aphtovirus)에 속하는 단일가닥의 양성 센스 RNA 바이러스(Single Strand Positive Sense RNA virus)로 8,500염기쌍를 가지고 있으며, 게놈(genome)은 1개의 단백질을 발현하고 바이러스 단백질분해효소(viral proteinase)에 의해서 바이러스 단백질은 절단되어 성숙 단백질로 되는 특징이 있다. 바이러스 외피는 VP1, VP2, VP3, VP4 단백질로 구성되며, 바이러스 복제 및 단백질 성숙에 관여하는 비구조단백질은 L, 3A, 3B, 3C, 3D, 2A, 2B, 2C등이 있다.
외피 단백질(Capsid protein 또는 SP)은 중화항체를 유도하지만 바이러스 혈청형에 따라 생성되는 항체의 특성이 상이하여 다른 바이러스형에 대한 교차 방어력이 생성되지 않는 특징이 있고, 비구조단백질(NSP)은 바이러스 복제 및 감염에 가장 중요한 역할을 하는 단백질로써 중화항체를 유도하지는 않지만 7종의 혈청형 바이러스에 대해서는 교차 반응성이 있는 것으로 알려져 있다.
구제역을 통제하기 위해서 구제역 비 발생지역 및 청정국에서는 비 백신 정책을 실시하고 구제역 발병 시 ring vaccination 같은 긴급백신정책과 살처분 정책을 실시하며, 구제역 발생국은 구제역 백신을 접종하여 예방하고 있다. 구제역 백신은 7종의 혈청형 (O, A, Asia, C, SAT1, SAT2, SAT3 serotype)간에 각각 교차 방어력이 없어 국가별로 발병 가능성이 높은 바이러스 형을 선택한 후 세포배양을 통해 구조 단백질을 바이러스 배양 상층액에서 정제 후 농축한 사독백신을 사용한다. 하지만, 영국에서 발병한 것 같이 교통수단의 발단, 수출입 교역의 증가, 불법적인 밀수입 등으로 인해 예측하지 못한 바이러스형에 의해서 발병의 가능성이 높아지고 있고 또한, 소각 및 매몰에 의한 환경문제가 크게 대두되고 있다.
이에 구제역 바이러스를 빠르게 검출하여 이에 대한 대책 수립을 위한 정보를 제공하기 위한 신속하고, 정확한 방법의 개발이 요구되어 왔다.
이에 본 발명자들은 구제역 진단용 항체를 효과적으로 생산 할 수 있는 방법에 관하여 연구하던 중 고항원성 도메인을 분석하여 서열번호 1의 펩티드가 고항워성 펩티드인 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되며, 서열번호 1로 표시되는 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이를 이용한 검출 방법 등을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되며, 서열번호 1로 표시되는 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 본 발명의 항체를 생산하는, 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 항체를 검사시료에 접촉시키는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 구제역 바이러스 검출 키트를 제공한다.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2nd ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered.,1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되며, 서열번호 1로 표시되는 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체에 관한 것이다.
‘항체’란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하며, 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되며, 서열번호 1 (TDMCLADFHAGIFLKGQEHAVFAC)와 특이적으로 결합한다.
한편, 본 발명은 상기 항체를 생산하는, 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
상기 하이브리도마는 통상의 배양방법에 의해 계대배양 가능하고, 필요에 따라 동결보존할 수 있다. 하이브리도마를 통상의 방법에 의해 배양하여 그 배양액을 회수하거나 또는 그 배양액을 포유동물의 복강 내로 이식하여 복수를 회수할 수 있다. 상기 배양액 또는 복수중의 항체는 염석법, 이온교환 및 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피 등 통상 사용되는 방법에 의해 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 본 발명의 항체를 검사시료에 접촉시키는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서 검사시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포등의 생물학적 시료를 비롯하여 공기, 물, 토양 등의 비생물학적 시료도 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 소, 돼지, 양, 염소 등의 우제류로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 일부 성분을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
본 발명에서 검출은 표적 구제역 바이러스, 보다 구체적으로 VP1 단백질의 A형, O형, Asia형 (혈청형), 보다 더 구체적으로는 서열번호 1의 에피토프의 존재 또는 부재를 분석, 영상화, 확인, 확립하는 것을 말한다.
본 발명에서 검출하는 방법으로는 당 업계에 공지된 다양한 분석방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 시료를 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정한다. 본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 생물학적 시료 중의 본 발명의 에피토프 또는 VP1 단백질의 A형, O형, Asia형 또는 구제역 바이러스와 이를 특이적으로 인지하는 본 발명의 항체의 결합물을 의미한다.
본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 구제역 바이러스 검출 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 본 발명의 항체이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법 (radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯 (immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 항체는 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow & Lane; Cold SpringHarbor, 1988), 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 구제역 바이러스의 고병원성 부위를 탐색하여 이를 항원으로 하여 마우스를 면역화하고, 상기 마우스의 비장세포를 적출하여 이를 골수종 세포와 융합시킴으로써 하이브리도마를 제조하였다. 상기에서 실제로 기능하는 항체에 대한 것이며, 세포 자체의 생명력이 우수하고, 항원-항체 반응성이 가장 우수한 세포주를 이를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국세포주 은행에 2011년 5월 23일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00266로 기탁하였다.
참고로, 본 명세서에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
따라서, 본 발명은 구제역 바이러스를 특이적으로 진단하는 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이를 이용한 진단방법/키트를 제공한다. 본 발명의 하이브리도마 세포주는 구제역 바이러스를 특이적으로 진단하는 항체를 생산할 수 있으며, 본 발명의 항체는 구제역 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있어 구제역 바이러스 진단 키트 제작에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 높다.
도 1은 본 발명의 항체의 구제역 바이러스 검출 특이성을 확인한 것이다. (BSA - 음성 대조군, BSA-A24 : 본 발명의 항체)
도 2는 구제역 바이러스 A형, O형, Asia형의 VP1 아미노산 서열의 일부를 정렬한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
항체 제작을 위한 고항원성 구제역 바이러스 펩티드 제작
<1-1> 고항원성 펩티드 탐색
구제역 바이러스에 대한 항체를 제작하기 위하여 구제역 바이러스 type A형(ACX54405.1, 서열번호 3), O형 (ADM36038, 서열번호 4), Asia 1(ABF74751, 서열번호 5)의 VP1 단백질을 이용하여 http://liv.bmc.uu.se/cgi-bin/emboss/antigenic 에서 고항원성 도메인을 분석하였다.
그 결과 “TDMCLADFHAGIFLKGQEHAVFAC” 아미노산 서열(A24, 서열번호 1)을 가진 펩티드 및 “ILTTRNGHTTSTTQSSVGVTYGY” 아미노산 서열(서열번호 2, 300~322부위)을 가진 펩티드가 고항원성인 것으로 판명되었다.
<1-2> 고항원성 항원 펩티드 제조
상기 실시예 1-1에서 탐색된 펩티드를 (주)셀앤바이오에 의뢰하여 제작하였다. 이 때, KLH conjugation를 위해 C-terminal 말단에 시스테인 (cystein)을 상용의 키트 (KLH conjugation kit, Pierce, Tavano R. et al. 2011. J. Bacteriol. 193,107-115)를 사용하여 추가하였다.
< 실시예 2>
구제역 바이러스 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 제작
<2-1> 항원면역
KLH가 컨쥬게이션된 서열번호 1 및 서열번호 2의 펩티드를 각각 20μg/마우스의 농도로 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant (Sigma, USA)가 섞인 에멀젼을 제조하였다. 상기 에멀젼을 생후 7 주령 암컷 Balb/c 마우스 (오리엔트) 3 마리에 발바닥에 주사하였다. 1 마리당 20μg의 항원을 주사하되 총 부피는 400μl로 하였다. 2주 뒤에 Incomplete Freund's Adjuvant (Sigma, USA)와 항원을 혼합한 에멀전을 상기 마우스의 복강에 주입한 후, 2주일 후 PBS (phosphate buffered saline)에 녹인 항원을 20μg/마우스의 용량으로 복강 내에 주사하여 항체 생성을 유도하였다. 항체 생성을 효소면역법 및 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 항체를 확인한 후, 세포 융합에 들어가기 3일 전에 쥐의 꼬리 정맥에 PBS에 녹인 항원으로 추가접종 하였다.
그 결과 서열번호 1의 아미노산서열을 가지는 펩티드를 주입한 군에서는 항체생성이 잘 이루어졌으나, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 주입한 군에서는 항체생성이 전혀 이루어지지 않는 것을 확인하였다 (결과미도시).
이로서 상기 고항원성 펩티드 선별 시스템에 의하여 도출된 펩티드가 모두 항체 형성이 가능한 펩티드는 아닌 것을 확인하였으며, 이후 실험은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드 만을 대상으로 실시되었다.
<2-2> 항체 생성 세포의 확인 및 선별
상기 방법에 따라 면역화된 쥐의 안와 정맥 총 (eye ball)으로부터 혈액을 취득하여 1.5ml 원심분리 튜브에 담아 13,000 rpm, 10분 원심분리로 혈청을 분리하여 항체의 생성 여부를 실험하기까지 -20℃에서 보관하였다. 항원 단백질로 효소면역법 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 항체의 생성을 확인한 후 항체 생성 쥐의 비장 세포에 대한 융합(fusion)에 착수하였다.
<2-3> 융합세포 제조
항체 생성이 확인된 후 쥐를 희생시켜 항체생산 세포 (splenocyte)를 분리하고, 이와 골수종 세포 (myeloma cell) P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580, USA)를 융합하였다. 즉, 쥐의 P3X63Ag8.653 세포를 배양 접시에 10% 우 태아 혈청 (Biowhittaker, USA)이 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 최적 성장기에 이르도록 유지시켰다. 세포 융합을 위하여 P3X63Ag8.653 세포를 무 혈청 RPMI 1640 배지 (Biowhittaker, USA)로 2번을 세척한 후 1 x 107 세포 되게 농도를 맞추었다. 쥐를 경추이탈 (cervical dislocation)에 의해 희생시켜 비장을 취득하고 이것을 메쉬 (Sigma, USA) 용기에 넣고 세포를 하나씩 분리시켰다. 비장세포 부유액을 만든 후 원심 세척한 다음 비장세포액을 Tris-NH4Cl 용액 (Tris 20.6 g/L, NH4Cl 8.3 g/L)에 노출시켜 적혈구를 용해시킨 후, 완전히 분리된 항체 생산 세포를 5분간 400 g에서 원심분리한 후 무 혈청 배지로 2번 세척하고 10 ㎖의 배지에 현탁시켰다. 림프세포를 혈구계수판 (haemocytometer)으로 계수하여 1 x 108의 림프구를 1 x 107 P3X63Ag8.653 세포 (10:1)와 무 혈청 배지에 섞어 5분간 400g로 원심분리하였다. 37℃에서 전 처리된 50% (M/V) 폴리에틸렌 글리콜 1500 (Sigma, USA)을 이용하여 1 ㎖ 용액을 1분에 걸쳐 서서히 떨어뜨리면서 섞었다. 위에서 생성된 융합 혼합액을 무 혈청 RPMI 1640 배지로 희석하고 3분 동안 400 g에서 원심분리한 후 20% 우 태아 혈청과 HAT (100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16 μM thymidine)가 포함된 RPMI 1640 선택 배지 35ml에 세포를 현탁시켰다. 100 ul의 현탁액을 하루 전에 feeder cells (쥐의 복강에서 RPMI 1640 배지로 분리한 macrophage)를 코팅한 96 웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO2 에서 배양하였으며, 5일 후부터는 2-3일 간격으로 HAT 선택 배지를 번갈아 주면서 14 일간 배양하였다. 14일 이후부터는 20% 우 태아 혈청과 HT (HAT 선택 배지에서 0.4 μM aminopterin을 제거한 배지)가 포함된 RPMI 1640 배지로 교환하면서 계대 배양을 진행하였다.
<2-4> 융합세포 선별 및 분리
상기 실시예 2-3의 방법에서 융합이 된 배양 상층액을 취득하여 제공된 항원에 대한 특이 항체 생성 여부를 조사하기 위하여 BSA에 conjugation된 각 peptide를 이용하여 효소면역 측정법으로 검색하였으며, 융합 세포의 배양액을 음성대조군에 비해 4배 이상의 역가를 나타내는 웰의 세포만 선택하여 24 웰 배양 플레이트 및 25cm2 배양 플라스크로 옮겨 증식시켰다.
< 실시예 3>
구제역 바이러스 특이적 진단
제작된 항체가 구제역 펩티드에 대해 특이적인지 확인하기 위하여 BSA (bovine serum album)에 conjugation된 각각의 펩티드를 웰당 5ng 씩 로딩 (loading)하여 웨스턴 블럿을 실시하였다.
그 결과, 도 1에서 보듯이, 제작된 단일클론 항체가 구제역 펩티드에 특이적인 것을 확인하였고, 구제역 바이러스에 대해서도 마찬가지였다. 이와 같이 본 발명의 항체는 구제역 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있었으며, 이를 이용하여 구제역 바이러스의 검출, 구제역 진단 등에 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 구제역 바이러스를 특이적으로 진단하는 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이를 이용한 진단방법/키트를 제공한다. 본 발명의 하이브리도마 세포주는 구제역 바이러스를 특이적으로 진단하는 항체를 생산할 수 있으며, 본 발명의 항체는 구제역 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있어 구제역 바이러스 진단 키트 제작에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 높다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00266 20110523
<110> Cha <120> Monoclonal antibody for detecting multiple type Foot and Mouth Disease Virus and method for detecting Foot and Mouth Disease Virus using the same <130> NP11-0025 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A24 <400> 1 Thr Asp Met Cys Leu Ala Asp Phe His Ala Gly Ile Phe Leu Lys Gly 1 5 10 15 Gln Glu His Ala Val Phe Ala Cys 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control <400> 2 Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr 20 <210> 3 <211> 2332 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus - type A <400> 3 Met Asn Thr Thr Asp Cys Phe Ile Ala Leu Leu His Ala Ile Arg Glu 1 5 10 15 Ile Lys Ala Arg Leu Phe Ser Arg Thr Gln Glu Lys Met Glu Phe Thr 20 25 30 Leu Tyr Asn Gly Glu Lys Lys Thr Phe Phe Ser Arg Pro Asn Asn His 35 40 45 Asp Asn Cys Trp Leu Asn Thr Ile Leu Gln Leu Phe Arg Tyr Val Asp 50 55 60 Glu Pro Phe Phe Asp Trp Val Tyr Glu Ser Pro Glu 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1805 Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp Thr 1810 1815 1820 Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys 1825 1830 1835 1840 Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Leu Lys Met Lys Ala His Ile Asp 1845 1850 1855 Pro Glu Pro His His Glu Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu 1860 1865 1870 Glu Arg Val His Val Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala 1875 1880 1885 His Gly Val Phe Asn Pro Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys 1890 1895 1900 Asp Pro Arg Leu Asn Glu Gly Val Val Leu Asp Glu Val Ile Phe Ser 1905 1910 1915 1920 Lys His Lys Gly Asp Thr Lys Met Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Phe 1925 1930 1935 Arg Arg Cys Ala Ala Asp Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Glu Leu Gly 1940 1945 1950 Thr Ala Asn Ala Pro Leu Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly Val Asp 1955 1960 1965 Gly Leu Asp Ala Met Glu Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu Pro Trp Ala 1970 1975 1980 Leu Gln Gly Lys Arg Arg Gly Ala Leu Ile Asp Phe Glu Asn Gly Thr 1985 1990 1995 2000 Val Gly Pro Glu Val Thr Ala Ala 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2205 Asp Leu Asp Phe Glu Ala Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu Gly Gln 2210 2215 2220 Thr Ile Thr Pro Ala Asp Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val Leu Gly Gln 2225 2230 2235 2240 Ser Lys <210> 5 <211> 2329 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus - type Asia 1 <400> 5 Met Asp Thr Thr Asp Cys Phe Ile Ala Leu Leu His Ala Leu Arg Glu 1 5 10 15 Ile Lys Ala Leu Phe Leu Pro Arg Thr Gln Arg Lys Met Glu Leu Thr 20 25 30 Leu Tyr Asn Gly Glu Lys Lys Ile Phe Tyr Ser Arg Pro Asn Asn His 35 40 45 Asp Asn Cys Trp Leu Asn Thr Ile Leu Gln Leu Phe Arg Tyr Val Asp 50 55 60 Glu Pro Phe Phe Asp Trp Val Tyr Glu Ser Pro Glu Asn Leu Thr Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ile Arg His Leu Glu Gly Ile Thr Gly Leu Glu Leu His Glu 85 90 95 Gly Gly Pro Pro Ala Leu Val Val Trp Asn Ile Lys His Leu Leu His 100 105 110 Thr Gly Ile Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Glu Val Cys Ile Ala Asp 115 120 125 Gly Thr Asp Met Cys Leu Ala Asp Phe His Ala Gly Ile Phe Leu Lys 130 135 140 Gly Gln Gly His Ala Val Phe Ala Cys Val Thr Ser Asp Gly Trp Tyr 145 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990 Leu Ala Thr Gly Val Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys 995 1000 1005 Pro Trp Tyr Lys Leu Ile Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Thr 1010 1015 1020 Ala Val Ala Ala Arg Ser Lys Asp Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu 1025 1030 1035 1040 Ala Asp Thr Gly Leu Glu Ile Leu Asp Ser Thr Phe Val Val Lys Lys 1045 1050 1055 Ile Ser Asp Ser Leu Ser Ser Leu Phe His Val Pro Ala Pro Val Phe 1060 1065 1070 Ser Phe Gly Ala Pro Ile Leu Leu Ala Gly Leu Val Lys Ile Ala Ser 1075 1080 1085 Ser Phe Phe Arg Ser Thr Pro Glu Asp Leu Glu Arg Ala Glu Lys Gln 1090 1095 1100 Leu Lys Ala Arg Asp Ile Asn Asp Ile Phe Ala Ile Leu Lys Asn Gly 1105 1110 1115 1120 Glu Trp Leu Val Lys Leu Ile Leu Ala Ile Arg Asp Trp Ile Lys Ala 1125 1130 1135 Trp Ile Ala Ser Glu Glu Lys Phe Val Thr Met Thr Asp Leu Val Pro 1140 1145 1150 Gly Ile Leu Glu Lys Gln Arg Asp Leu Asn Asp Pro Ser Lys Tyr Glu 1155 1160 1165 Glu Ala Lys Glu Trp Leu Asp Asn Ala Arg Gln Ala Cys Leu Lys Ser 1170 1175 1180 Gly Asn Val His Ile Ala Asn Leu Cys Lys Val Val Ala Pro Ala Pro 1185 1190 1195 1200 Ser Lys Ser Arg Pro Glu Pro Val Val Val Cys Leu Arg Gly Lys Ser 1205 1210 1215 Gly Gln Gly Lys Ser Phe Leu Ala Asn Val Leu Ala Gln Ala Ile Ser 1220 1225 1230 Ser His Phe Thr Gly Arg Ile Asp Ser Val Trp Tyr Cys Pro Pro Asp 1235 1240 1245 Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Asn Gln Gln Thr Val Val Val Met Asp 1250 1255 1260 Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Phe Lys Tyr Phe Ala Gln 1265 1270 1275 1280 Met Val Ser Thr Thr Gly Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Asp 1285 1290 1295 Lys Gly Lys Pro Phe Asn Ser Lys Val Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu 1300 1305 1310 Tyr Ser Gly Phe Thr Pro Arg Thr Met Val Cys Pro Asp Ala Leu Asn 1315 1320 1325 Arg Arg Phe His Phe Asp Leu Asp Val Ser Ala Lys Asp Gly Tyr Lys 1330 1335 1340 Ile Asn Asn Lys Leu Asp Ile Thr Lys Ala Leu Glu Asp Thr His Thr 1345 1350 1355 1360 Asn Pro Val Ala Met Phe Gln Tyr Asp Cys Ala Leu Leu Asn Gly Met 1365 1370 1375 Ala Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Gln Asp Met Phe Lys Pro Gln Pro 1380 1385 1390 Pro Leu Gln Asn Val Tyr Gln Leu Val Gln Glu Val Ile Glu Arg Val 1395 1400 1405 Glu Leu His Glu Lys Val Ser Ser His Pro Ile Phe Lys Gln Ile Ser 1410 1415 1420 Ile Pro Ser Gln Lys Ser Val Leu Tyr Phe Leu Ile Glu Lys Gly Gln 1425 1430 1435 1440 His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile 1445 1450 1455 Lys Glu Glu Leu Arg Pro Leu Ile Gln Gln Thr Ser Phe Val Lys Arg 1460 1465 1470 Gly Phe Lys Arg Leu Lys Glu Asn Phe Glu Ile Val Ala Leu Cys Leu 1475 1480 1485 Thr Leu Leu Ala Asn Ile Val Ile Met Ile Arg Gly Thr Cys Lys Arg 1490 1495 1500 Gln Asn Met Val Asp Asp Ala Val Asn Glu Tyr Ile Glu Lys Pro Asn 1505 1510 1515 1520 Ile Thr Thr Asp Asp Lys Thr Leu Asn Glu Ala Glu Lys Asn Pro Leu 1525 1530 1535 Glu Thr Ser Gly Ala Ser Thr Val Gly Phe Arg Glu Ile Thr Leu Pro 1540 1545 1550 Gly His Asp Ala Ser Asp Asp Val Asn Ser Glu Pro Ala Lys Pro Val 1555 1560 1565 Glu Lys Gln Pro Gln Ala Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg 1570 1575 1580 Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro 1585 1590 1595 1600 Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Arg Val Lys Ala Arg 1605 1610 1615 Thr Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Asp Gly Pro Val Lys Lys Pro 1620 1625 1630 Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly 1635 1640 1645 Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro 1650 1655 1660 Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys Ala Thr 1665 1670 1675 1680 Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu 1685 1690 1695 Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr Asp Ser Asp 1700 1705 1710 Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln Asp Met Leu 1715 1720 1725 Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg Val Arg Asp 1730 1735 1740 Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala Arg Met Lys Lys Gly Thr Pro 1745 1750 1755 1760 Val Val Gly Val Ile Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser 1765 1770 1775 Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp 1780 1785 1790 Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Arg Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr 1795 1800 1805 Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val 1810 1815 1820 Gly Thr His Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val 1825 1830 1835 1840 Ser Arg Ser Met Leu Leu Lys Met Lys Ala His Ile Asp Pro Glu Pro 1845 1850 1855 His His Glu Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val 1860 1865 1870 His Val Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val 1875 1880 1885 Phe Asn Pro Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys Asp Pro Arg 1890 1895 1900 Leu Asn Glu Gly Val Val Leu Asp Glu Val Ile Phe Ser Lys His Lys 1905 1910 1915 1920 Gly Asp Thr Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Ala Leu Phe Arg Arg Cys 1925 1930 1935 Ala Ala Asp Tyr Ala Ser His Leu His Ser Val Leu Gly Thr Ala Asn 1940 1945 1950 Ala Pro Leu Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly Val Asp Gly Leu Asp 1955 1960 1965 Ala Met Glu Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu Pro Trp Ala Leu Gln Gly 1970 1975 1980 Lys Arg Arg Gly Ala Leu Ile Asp Phe Glu Asn Gly Thr Val Gly Pro 1985 1990 1995 2000 Glu Val Ala Ala Ala Leu Glu Leu Met Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe 2005 2010 2015 Ala Cys Gln Thr Phe Leu Lys Asp Glu Ile Arg Pro Met Glu Lys Val 2020 2025 2030 Arg Ala Gly Lys Thr Arg Ile Val Asp Val Leu Pro Val Glu His Ile 2035 2040 2045 Leu Tyr Thr Arg Met Met Ile Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ser 2050 2055 2060 Asn Asn Gly Pro Gln Ile Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val 2065 2070 2075 2080 Asp Trp Gln Arg Phe Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp 2085 2090 2095 Asp Val Asp Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met 2100 2105 2110 Asn Ile Met Phe Glu Glu Val Phe Arg Thr Glu Phe Gly Phe His Pro 2115 2120 2125 Asn Ala Glu Trp Ile Leu Lys Thr Leu Val Asn Thr Glu His Ala Tyr 2130 2135 2140 Glu Asn Lys Arg Ile Thr Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser 2145 2150 2155 2160 Ala Thr Ser Ile Ile Asn Thr Ile Leu Asn Asn Ile Tyr Val Leu Tyr 2165 2170 2175 Ala Leu Arg Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr Tyr Thr Met 2180 2185 2190 Ile Ser Tyr Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser Asp Tyr Asp Leu Asp 2195 2200 2205 Phe Glu Ala Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu Gly Gln Thr Ile Thr 2210 2215 2220 Pro Ala Asp Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val Leu Gly His Ser Ile Thr 2225 2230 2235 2240 Asp Val Thr Phe Leu Lys Arg His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly 2245 2250 2255 Phe Tyr Lys Pro Val Met Ala Ser Lys Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser 2260 2265 2270 Phe Ala Arg Arg Gly Thr Ile Gln Glu Lys Leu Ile Ser Val Ala Gly 2275 2280 2285 Leu Ala Val His Ser Gly Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro 2290 2295 2300 Phe Gln Gly Leu Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg 2305 2310 2315 2320 Trp Val Asn Ala Val Cys Gly Asp Ala 2325

Claims (5)

  1. 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되며, 서열번호 1로 표시되는 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체.
  2. 제1항의 항체를 생산하는, 기탁번호 KCLRF-BP-00266인 하이브리도마 세포주.
  3. 제1항의 항체를 검사시료에 접촉시키는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 검출 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 구제역 바이러스는 type O, type A 및 type Asia로 이루어진 군에서 선택된 혈청형인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항의 항체를 포함하는 구제역 바이러스 검출 키트.
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