KR101990858B1

KR101990858B1 - 흰반점 증후군바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101990858B1
Application number: KR1020170175255A
Authority: KR
Inventors: 오명주; 김위식; 방지형
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2019-09-30

Abstract

본 발명은 흰반점증후군바이러스 (White spot syndrome virus, WSSV)에 특이적인 단클론항체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 흰반점 증후군바이러스 감염의 진단, 예방 및 치료 등에 유용하게 이용될 수 있는 흰반점 증후군바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

흰반점 증후군바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도{MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST WHITE SPOT SYNDROME VIRUS AND USE THEREOF}

흰 반점 증후군 (White spot syndrome)은 1992년대 초 대만에서 양식중인 넙치 (Paralichthys olivaceus)가 대량으로 폐사하면서 원인 바이러스가 처음으로 분리되었다. 이후 일본의 조피볼락 (Sebastes schlegelii) 및 은어 (Plecoglossus altivelis), 중국의 돌가자미 (Kareius bicoloratus) 등 아시아 지역에서만 분리되는 바이러스가 2012년도 유럽의 회색숭어(Thymallus thymallus)에서도 검출되었다. 국내의 경우 1998년도에 넙치로부터 바이러스가 분리되었으며, 참돔과 감성돔에 대하여 병원성을 지니는 것을 확인하였다.

흰 반점 증후군의 원인바이러스는 흰반점증후군바이러스 (White spot syndrome virus, WSSV)로 이중가닥의 DNA 바이러스이며 Nimaviridae과, Whispovirus속의 외막이 있는 바이러스이다. 길이 400 nm, 넓이 150nm의 막대모양 바이러스 입자를 보인다.

WSSV는 DNA virus로 VP35 (nucleocapsid protein), VP28, VP19 (envelope protein), VP26, VP24 (tegument protein)의 5개의 주요 단백질로 구성되어 있는 것이 특징이다.

최근, 소비자들의 안전한 먹거리에 대한 수요 증가로 인해 전 세계적으로 수산생물의 방역 (Aquatic animal Disease Control), 예찰 (Surveillance) 및 모니터링 (Monitoring)의 중요성이 더욱 커지고 있다. 또한, 국가적인 예찰 및 방역활동 뿐만 아니라 지역적 (regional) 이고 구역화 (zoining)된 수산생물의 질병 예찰 및 모니터링 연구결과의 분석은 향후 수산생물질병의 역학조사 및 질병 관리에 필요한 유용한 자료를 제공 할 뿐만 아니라 자국 내 특정 질병에 대한 무병(청정)지역을 증명할 수 있는 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 WSSV의 국내 분리주의 서열변이에 대한 지속적인 연구 및 다른 국가 분리주와의 서열비교와 지속적인 모니터링도 중요하게 되었다.

국립수산과학원에 의해 실시된 우리나라 양식장의 병원체 감염률 조사에서 2006년 이후 바이러스성 신경괴사 바이러스의 검출률이 가장 높게 나타났으며(60% 이상), 이어 바이러스성 출혈성 패혈증바이러스에 의한 감염이 뒤를 따랐다(28%). 이와 같이 바이러스성 출혈성 패혈증은 높은 감염률을 나타내고 있으며, 밀집양식에서 전염성이 높아지고, 한번 감염으로 대량폐사를 일으켜 수산어가에 큰 피해를 입히고 있으나, 감염 시 초기 진단이 어려운 점이 있어 이의 용이한 진단방법 및 치료와 예방에 대한 연구가 시급하다.

따라서, 본 발명의 목적은 종묘 생산시기에 대량 발생하여 높은 폐사율을 보이는 새우의 원인바이러스인 흰반점증후군바이러스 (White spot syndrome virus, WSSV)에 감수성 및 특이성이 있는 단클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 흰반점증후군바이러스에 특이성이 있는 단클론항체를 생산하는 융합세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 새우의 흰반점증후군의 진단, 치료 및 예방에 용이하게 이용할 수 있는 흰반점증후군 진단용 조성물 및 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 흰반점증후군바이러스(White spot syndrome virus, WSSV)의 항원단백질 VP28과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 35C9를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 35C9는 하이브리도마 세포(KCLRF-BP-00413)에 의해 생산된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 35C9는 WSSV에 감염된 새우에서만 나타나는 VP28유사물질에 특이적으로 결합한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 V28유사물질은 25 kDa의 분자량을 나타낸다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 단일클론 항체 35C9를 생산하는 하이브리도마 세포주( KCLRF-BP-00413)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 단일클론항체 35C9를 포함하고 새우의 흰반점증후군을 진단하는 진단 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술된 진단 조성물을 포함하는 새우의 흰반점증후군 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상술된 진단 조성물을 포함하는 새우의 흰반점증후군 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

먼저, 본 발명에 의하면 흰반점증후군바이러스에 감수성 및 특이성이 높은 단클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주를 제공할 수 있다.

또한 본 발명에 의하면 새우의 흰반점증후군의 진단, 치료 및 예방에 용이하게 이용할 수 있는 진단용 조성물 및 진단키트를 제공함으로써 양식장에서 대량폐사를 일으켜 막대한 손해를 입히고 있는 흰반점증후군의 진단과 치료 및 예방에 이용할 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 WSSV에 감염된 흰다리 새우의 간췌장을 대상으로 한 PCR 결과를 나타낸 것이다 (M: marker (bp), 1,2,3: 흰다리 새우).
도 2는 SDS-PAGE에서 관찰되는 정제된 재조합 WSSV VP28의 구조 단백질을 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 제작된 단클론 항체가 WSSV VP28 재조합 단백질을 인식하는 것을 나타낸 웨스턴 블로팅 결과이다 (line 1: marker (kDa), line 2: 음성대조구: 1차 항체 대신 2% skim milk 사용, line 3: 제작된 항체로 반응).
도 4는 WSSV 인위감염 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 제작된 단클론항체의 정상새우 및 WSSV 감염 새우의 hemolyph에 대한 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다 (1: 정상 hemolyph 1, 2: 정상 hemolyph 2, 3: 감염 hemolyph 1, 4: 감염 hemolyph 2, 5: WSSV VP28 재조합 단백질).
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제작된 단클론 항체의 정상새우 및 WSSV 감염 새우의 아가미 마쇄액에 대한 특이성을 나타내는 웨스턴 블로팅 사진이다 (M: marker (kDa), 1: 정상 새우 아가미 마쇄액 1, 2: 정상 새우 아가미 마쇄액 2, 3: WSSV 감염 새우 아가미 마쇄액 1, 4: WSSV 감염 새우 아가미 마쇄액 2, 5: WSSV VP28 재조합 단백질).

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 흰반점증후군바이러스 구조단백질을 에피토프로 하여 흰반점증후군바이러스 (White spot syndrome virus, WSSV)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 융합세포주를 개발한 것에 있다.

따라서, 본 발명은 흰반점증후군바이러스(White spot syndrome virus, WSSV)의 항원단백질 VP28과 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, WSSV에 감염된 새우에서만 나타나는 VP28유사물질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 35C9를 제공한다.

본 발명에서 "35C9 항체"또는 "단클론항체 35C9"는 하이브리도마 세포주( KCLRF-BP-00413)에 의해 생산되는 단클론 항체를 의미한다.

단일클론항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술 (Koeher and Milstein, Nature, 256:495 (1975))에 의하여 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 약 20 ㎍을 얻어서 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화시킨다. 그 후 쥐에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성한다. 이어, ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay)로 하이브리도마 세포의 단일클론항체의 생성여부를 알아보고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리 정제하거나 쥐의 복강에 주입한 후 복수를 채취한다.

먼저 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조에 필요한 마우스를 면역화시켰다. 구체적으로는, 정제된 WSSV VP28 재조합 단백질을 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS)에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 마우스의 발바닥에 1차 주사하였다. 1차 면역화 후 2주 후에 마우스로부터 채혈한 후 ELISA를 실시하여 항체가를 측정하였으며, 마우스의 면역성을 높이기 위하여 정제된 바이러스 구조단백질만을 사용하여 2차 면역하였다. 2차 면역화 후 1주 후에 3차 면역화하고, 마지막 면역화한 후 3일 후에 면역화된 마우스로부터 비장조직을 적출하였다. 적출된 비장조직과 골수종 세포인 Sp2/0Ag14 세포를 세포수를 기준으로 10:1의 비율로 혼합하고 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 넣어 세포 융합시키고 배양하였다.

상기 융합세포군 중에서 WSSV에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고, 선별된 융합세포가 단일클론이 되도록 제한 희석법(limiting dilution)을 사용하여 융합세포를 희석한 후, 하나의 세포로부터 증식한 융합세포의 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하여 흡광도가 가장 우수한 융합세포를 선택하였다. 최종적으로 선택한 융합세포 즉 하이브리도마 세포를 "WSSV 35C9"로 명명하였으며, 한국세포주연구재단에 2017년 10월 18일자로 기탁하였다(수탁번호: KCLRF-BP-00413 ).

상기 얻어진 하이브리도마 세포(KCLRF-BP-00413)를 마우스에 주사하고, 마우스의 혈청으로부터 WSSV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 35C9를 분리하였다.

또한, 본 발명의 하이브리도마 세포 및 이로부터 생산된 단일클론항체 35C9는 WSSV 특히 IPNV의 항원단백질 VP28에 대한 결합 특이성이 높았고, 더 나아가 WSSV에 감염된 새우에서만 나타나는 VP28유사물질 즉 25 kDa의 분자량을 갖는 단백질에 대한 결합 특이성도 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 상기 단클론항체 35C9를 포함하는 진단 조성물 및 진단키트를 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 흰반점증후군 바이러스의 감염 여부를 확인하는 것이다.

본 발명의 항체를 이용하여 시료, 예를 들면 새우조직에 포함된 WSSV를 분석하는 방법으로는 통상의 항원-항체반응의 분석법을 사용할 수 있다. 예컨대, 면역 검정(측정)법으로는 효소 면역 측정법(ELISA), 형광면역 측정법(FIA), 방사선 면역 측정법(RIA), 발광 면역 측정법, 면역블롯(immunoblot)법, 웨스턴 블롯(western blot)법, 면역 염색법 등이 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 WSSV에 특이적인 단일클론항체 35C9이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약 등을 추가로 포함할 수 있다.

면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 비제한적인 예로서, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법, ELISA, 면역블롯, 파아르 분석법, 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법 등이 있다.

면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함되며, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는데, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등이 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글루코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 다이이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다. 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 통상 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorptionpad)로 이루어진다.

마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다.

본 발명에서 WSSV를 인식하는 35C9 항체를 이용하는 면역 검정의 바람직한 예로서, ELISA 법을 들 수 있다. ELISA 법은 일반적인 경합법, 샌드위치법 등의 수법에 따라 실시할 수 있고, 액상계 또는 고체상태계에서 도 실시할 수 있다.

본 발명의 흰반점증후군 진단용 키트(kit)는 본 발명의 단일클론항체 35C9를 포함하는 것으로, 상기 진단용 키트는 필요에 따라 면역 반응을 이용하고, 웰, 염색제, 검출용의 효소 표지 항체, 세척액, 항체 희석액, 검체 희석액, 효소 기질, 효소 기질액 희석액, 그밖의 시약을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 진단키트는 일 구현예로서 WSSV에 특이적인 단일클론항체 35C9; 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차항체 접합체 (Conjugate); 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 진단키트는 WSSV 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 진단키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량분석 또는 정성분석함으로써 새우의 흰반점증후군을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 ELISA, RIA (Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯, 면역 블롯 분석 또는 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 검체 및 대조군을 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 재조합 모노클로날 항체 단백질과 반응하는 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.

항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 (Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다. 2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP (Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (Coloid gold), FITC (Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (Fluorescein) 및 색소 (Dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이 때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.

TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써폐암 특이적 마커 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다. 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 MNaCl, 및 0.05% 트윈 20 (Tween 20)으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응정지용액은 황산용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.

한편, WSSV에 특이적인 항체인 35C9를 생물학적 마이크로칩 (Biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상어류로부터 분리된 검체 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩(Biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템 (Microarray system)을 이용하면, 대량으로 시료를 분석할 수 있다.

실시예

1. WSSV의 genomic DNA 추출

새우양식장에서 WSSV에 감염된 흰다리 새우를 채집한 후, 해부하여 간췌장을 취하였다. 간췌장을 사용하여 genomic DNA extraction kit (Bioneer, Korea)로 매뉴얼에 따라 DNA를 추출하였다.

2.Polymerase chain reaction (PCR)

WSSV VP28 증폭용 primer는 GenBank에 보고된 유전자서열 (GenBank No.: AF173993)을 참고로 제작하였으며, pET vector에 서브클로닝하기 위해 primer 내에 Nde1와 Xho1의 제한효소 서열을 추가하였다. 제작된 primer의 염기서열은 다음과 같다: Forward: 5'-AAACATATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC-3', reverse: 5'-GCTCTCGAGTTCCTCGGTCTCAGTGCC-3'. PCR은 PCR premix (Bioneer, Korea)를 사용하여 다음의 반응조건으로 실시하였다: denaturation 95℃ 1분, annealing 58℃ 1분, extension 72℃ 1분, 35 cycle. PCR 산물은 1% agarose gel을 사용하여 전기영동하였다.

3. pET 벡터 클로닝

WSSV VP28의 재조합 단백질을 생산하기 위해 발현 벡터로서 pET-23(a)을 사용하였다. WSSV VP28 유전자가 들어 있는 T-Blunt 벡터에 Nde1과 Xho1을 사용하여 잘라낸 다음, 1% agarose gel을 사용하여 전기영동한 후 약 600 bp의 밴드를 QIAquick gel extraction kit (Qiagen, USA)로 정제하였다. pET-23(a)에 Nde1과 Xho1을 사용하여 잘라낸 다음, 600 bp의 산물을 삽입한 후 competent cell에 주입하였다. 세포를 암피실린 (50 mg/ml)을 함유한 LB 한천배지 위에 분주한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배지 위에 자란 콜로니를 사용하여 LB broth에 배양한 후 Accuprep plasmid mini extraction kit (Bioneer, Korea)로 플라스미드를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA는 ABI 3730 XI DNA 시퀀서를 사용하여 sequencing 하였다.

4.무 세포 단백질 합성 (Cell-free protein expression) 및 정제

재조합 VP28 단백질 합성은 세포가 없는 단백질 발현 방법으로서 ExiProgen 단백질 합성 시스템 (Bioneer, Korea)을 사용하였다. VP28 단백질 유전자를 포함하는 pET vector를 T7 RNA 중합효소, ribosomes, 단백질 발현에 필요한 tRNA를 포함하는 E. coli 추출물과 혼합한 후 30℃에서 배양하였다. 발현된 표적 단백질은 Ni-affinity column chromatography를 사용하여 정제한 후, storage buffer (50 mM Tris-Cl (pH 7.6), 100mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.05% NaN₃, 50% glycerol)로 용해시켰다.

5.바이러스 면역 및 hybridoma 제작

면역은 정제 재조합 단백질 (약 100 ㎍)와 complete freunds adjuvant를 1:1 비율로 혼합하여 BALB/c 마우스의 발바닥에 1차 면역하였다. 2주 후 마우스로부터 채혈한 후 ELISA를 실시하여 항체가를 측정하였으며, 재조합 단백질만을 사용하여 2차 면역하였다. 1주후 3차 면역시켰고, 면역 3일 후 마우스의 흉선 조직을 분리한 후 PEG 1500 (Roche, USA)를 이용하여 myeloma cell (Sp2/0Ag14)과 융합시킨 후 hypoxanthine, thymidine (HT) (gibco, USA) 배지를 사용하여 96 well plate (TPP, Switzerland)에 분주하여 CO₂배양기에서 37℃로 배양하여 hybridoma를 제작하였다.

6. Hybridoma의 screening

WSSV VP28 재조합 단백질에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는 hybridoma를 screening하기 위하여 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 실시하였다. 항원은 정제된 WSSV VP28 재조합 단백질을 96 well plate (corning, USA)에 well 당 50 ㎕ (250 ng/well)씩 분주하여 4℃에서 overnight 또는 37℃에서 2시간 coating하였다. 2% skim milk/TBST (Tris-buffered saline-Tween 20) 200 ㎕를 분주하여 blocking 한 후, TBST로 1회 세정하고 1차 항체로서 hybridoma 배양 상등액을 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 반응하였다. TBST로 3회 세정한 후 2차 항체로는 horseradish peroxidase (HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG (Pierce, USA)를 2% skim milk/TBST로 5,000배 희석하여 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응하였다. TBST로 5회 세정한 후 tetramethylbenzidine base (TMB, color reagents) (surmodics, TMBC)를 well 당 50 ㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H₂SO₄를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, microplate photometer (Multiskan, USA)로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

상술된 바와 같이 제작된 Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA와 western blot으로 스크린 한 결과, 10개 시료에서 양성 반응을 나타내었다. 10개의 시료를 대상으로 ELISA로 3회 클로닝을 실시한 결과, 최종적으로 1개의 clone (35C9)을 선별하였다. 최종적으로 선별한 융합세포 즉 하이브리도마 세포를 "WSSV 35C9"로 명명하였으며, 한국세포주연구재단에 2017년 10월 18일자로 기탁하였다(수탁번호: KCLRF-BP-00413 ).

기탁된 clone으로부터 생산된 항체를 사용하여 (항체의 이름 : clone의 이름과 동일하게 사용) 특이성 조사를 실시하였다.

실험예 1.

다음과 같이 TA 클로닝 및 염기서열을 분석하고 그 결과 사진을 도 1에 나타내었다.

WSSV에 감염된 흰다리 새우의 간췌장으로부터 DNA를 분리한 후 WSSV VP28을 타겟으로 하는 primer를 사용하여 얻어진 PCR 산물 (VP28 유전자)을 QIAquick gel extraction kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였고, 정제 후 T-Blunt PCR cloning kit (Solgent, Korea)를 사용하여 T-Blunt 벡터에 클로닝하였다. 클로닝 후 벡터를 competent cell에 주입하였다. 세포를 암피실린 (50 mg/ml)을 함유한 LB 한천배지 위에 분주한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배지위에 자란 콜로니를 사용하여 LB broth 배양한 후 Accuprep plasmid mini extraction kit (Bionner, Korea)로 플라스미드를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA는 ABI 3730 XI DNA 시퀀서를 사용하여 sequencing 하였다.

3개의 시료 모두에서 약 610 bp의 PCR 산물이 관찰되었는데, PCR 산물을 정제한 후 염기서열을 분석한 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 기존에 보고된 WSSV VP28의 염기서열과 100% 일치하였다.

실험예 2

정제된 WSSV VP28 재조합 단백질을 분석하기 위해 sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 실시하였다. 정제된 재조합 단백질에 동량의 SDS-sample buffer (1.59％ SDS, 0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 14% glycerol (w/v), 0.01% bromophenol blue (w/v), 4% 2-mecaptoethanol (v/v))를 첨가하여 100℃에서 3분간 열처리한 후 SDS-PAGE (12％ acrylamide separating gel, 4％ acrylamide stacking gel, 30 mA, 2 hours)를 실시하였다. 전기영동 후, 겔은 0.2％ coomassie brilliant blue R-250 (Wako, Japan)로 염색하여 결과를 확인하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2는 무 세포 단백질 합성으로 제작한 WSSV VP28 재조합 단백질 (rVP28)을 Ni-affinity column chromatography로 정제한 후 SDS-PAGE를 실시하여 관찰되는 WSSV VP28 재조합단백질을 나타낸 사진이다. 약 28 kDa의 단백질이 관찰되는 것을 도 2로부터 알 수 있었다.

실험예 3

항원에 대한 항체의 인식 능력을 확인하기 위하여 western immunoblot 분석을 실시하고 그 결과를 도 3에 나타내었다. SDS-PAGE는 위와 동일한 방법으로 실시하였다. WSSV VP28 재조합 단백질을 사용하여 전기영동 한 후, gel에 있는 단백질을 transblot 장치 (ATTO, Japan)를 이용하여 144 ㎃에서 1시간 동안 nitrocellurose membrane (advantec, Japan)에 blotting하였다. Blotting 후 2% skim milk로 blocking하여 1시간 반응시킨 후, buffer 1 (0.1M maleic acid, 0.15M NaCl, pH 7.5)으로 15분간 세정하였다. 1차 항체로는 본 연구에서 제작한 hybridoma 배양 상등액을 2% skim milk로 2배 희석하여 1시간 반응시킨 후 위와 동일한 방법으로 세정하였다. 2차 항체로는 alkaline phosphatase (AP)가 표식되어 있는 goat polyclonal anti-mouse IgG antibody (novus, USA)를 2% skim milk로 5,000배 희석하여 1시간 반응시킨 후 5회 세정하고 발색제 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂용액 (pH 9.5) 20㎖, NBT (75 ㎎/㎖ 4-nitrotetrazolium blue chloride) 90 ㎕, BCIP (50 ㎎/㎖ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt/dimethyl-formamide) 70㎕)로 발색하여 육안으로 확인하였다. 발색이 완료된 후 발색 정지액 (1mM EDTA, 10mM Tris-HCl)을 첨가하였다.

도 3은 단클론 항체의 WSSV VP28 재조합 단백질 인식 부위를 나타낸 웨스턴 블로팅 결과이다(line 1: marker (kDa), line 2: 1차 항체 대신 2% skim milk, line 3: 35C9).

단클론 항체의 WSSV VP28 인식 부위를 조사하기 위해, 정제된 WSSV VP28 재조합 단백질을 사용하여 western blot을 실시한 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 WSSV의 VP28 protein (28 kDa)을 인식하는 것이 확인되었다.

실험예 4

제작된 단클론 항체의 heavy 및 light chain의 subtype을 확인하기 위하여 Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit (Pierce, USA)를 사용하여 ELISA를 매뉴얼에 따라 실시하였고, 단클론 항체에 대한 isotyping 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

Target	Clone	IgG1	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgA	IgM	κ	λ	H-chain	L-chin
WSSV	35C9	0.781	0.053	0.046	0.047	0.049	0.049	0.125	0.053	IgG1	κ

표 1에 나타난 바와 같이 35C9 항체를 대상으로 rapid ELISA mouse mAb isotyping kit를 사용하여 IgG의 heavy 및 light chain의 subtype을 조사한 결과, H-chain은 IgG1로 나타났으며, L-chain은 κ로 확인되었다.

실험예 5

WSSV 인위감염 실험을 다음과 같이 수행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 흰다리 새우 (5.2ㅁ4.2 g) 62마리를 새우 연구소로부터 분양 받아 전남대학교 사육실 (여과순환식수조)에서 30일간 사육하였다 (사육 수온: 24.5℃). 감염실험을 실시하기 전에 건강한 새우 10마리를 무작위로 수집하여 음성 시료로 사용하였다. 감염실험은 WSSV로 인해 폐사된 새우의 간췌장 조직을 사용하여 1일에 2번씩 급이한 후 11일간 관찰하였다. 감염실험 전의 새우와 폐사 직전의 새우로부터 20% sodium citrate가 들어 있는 주사기를 사용하여 hemolymph를 취한 후 원심분리하여 (3,000 g, 15 min, 4℃) 상층액을 분리하였다. 정상 새우와 WSSV 감염 새우로부터 분리한 hemolymph 상층액에 WSSV가 존재하는지를 확인하기 위해, hemolymph 상층액을 10배 희석한 후 WSSV rapid diagnostic test kit (Shrimple, Japan)에 반응시켜 양성 유무를 확인하였다. 진단 키트상에서 WSSV 음성 (감염실험 전 새우)과 양성 (WSSV 감염 새우)을 보이는 새우의 아가미 조직을 취해 MEM으로 1:10으로 마쇄한 후 원심분리하여 (3,000 g, 15 min, 4℃) 상층액을 분리하였다.

도 4는 WSSV 인위감염 실험 결과를 나타내는 사진이다. 11일간 누적 폐사율을 관찰한 결과, 6일째부터 폐사되는 개체가 관찰되었고 (2마리 폐사), 11일 째 100% 폐사되었다. 폐사된 새우는 WSSV rapid diagnostic test kit상에서 양성 반응을 나타내었고, 대조구 새우에서는 음성반응을 나타내었다. 이후의 실험은 본 연구 결과를 토대로 WSSV 감염 여부를 확인한 시료를 사용하여 실시하였다.

실험예 6

WSSV VP28 재조합 단백질에 대한 단클론 항체가 WSSV에 감염된 새우에 대해 반응하는지를 조사하기 위해, hemolymph를 사용하여 ELISA를 다음과 같이 실시하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

ELISA는 정상 새우와 WSSV에 감염된 새우의 hemolymph 상층액을 사용하여 실시하였다. hemolymph 상층액을 증류수로 50배 희석하여 96 well ELISA microplates (Greiner-bio-one, Germany)에 각각 50 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 overnight하여 항원을 코팅하였다. T-PBS (0.05% Tween-20/PBS (v/v))로 3회 세정하였고 5% skim milk를 380 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 동안 blocking하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 1차 항체로는 본 연구에서 제작한 단클론 항체를 시료당 2개의 well에 50 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 반응하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 horseradish peroxidase (HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG (Youngin, Korea)를 5% skim milk로 1,000배 희석하여 well 당 50 ㎕씩 분주하였으며, 25℃에서 1시간 반응하였다. T-PBS로 5회 세정한 후 TMB conductivity one component HRP Microwell substrate (Surmodics, USA)을 well 당 50 ㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H₂SO₄를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

도 5는 정상 및 WSSV 감염 새우의 hemolyph에 대한 단클론 항체의 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다 (1: 정상 hemolyph 1, 2: 정상 hemolyph 2, 3: 감염 hemolyph 1, 4: 감염 hemolyph 39, 5: WSSV VP28 재조합 단백질). 단클론 항체는 감염 hemolyph 시료들과 WSSV VP28 재조합 단백질에는 높은 OD값을 보였고 (시료: 3, 4, 5번), 정상 hemolyph에는 낮은 OD값을 보였다 (시료: 1, 2).

실험예 6

WSSV VP28 재조합 단백질에 대한 단클론 항체가 WSSV에 감염된 새우에 대해 반응하는지를 조사하기 위해, 아가미를 사용하여 western blot을 실시하였고 그 결과를 도 6에 나타내었다. Western blot에 사용된 바이러스 항원은 정상 새우와 WSSV에 감염된 새우의 아가미 조직 마쇄액에 SDS-sample buffer를 첨가한 후 100℃에서 3분간 열처리하여 제작하였다. western blot은 위와 동일한 방법으로 실시하였다.

도 6은 정상 및 WSSV 감염 새우의 아가미 마쇄액에 대한 단클론 항체의 특이성을 나타내는 웨스턴 블로팅 사진이다 (M: marker (kDa), 1: 정상 새우 아가미 마쇄액 1, 2: 정상 새우 아가미 마쇄액 2, 3:　WSSV 감염 새우 아가미 마쇄액　１, ４:　WSSV 감염 새우 아가미 마쇄액　2，５：WSSV VP28 재조합 단백질).

정상 새우 아가미 마쇄액과 WSSV 감염 새우의 아가미 마쇄액, WSSV VP28 재조합 단백질을 사용하여 western blot을 실시한 결과, 도 6에 도시된 바와 같이 단클론항체는 WSSV 감염 새우 아가미 마쇄액에서 25 kDa에 반응하였고, 정상 새우와는 반응하지 않았다. 양성 대조구로 사용한 WSSV VP28 재조합 단백질에 대해서는 28 kDa에서 반응이 확인되었다.

상술된 실험결과에서 알 수 있듯이 VP28 재조합 단백질을 사용하여 제작한 단클론 항체 35C9는 WSSV에 감염된 새우와 정상 새우를 ELISA와 western blot을 통해 뚜렷히 구분할 수 있었으나, 특이하게도 western blot에서 VP28 재조합 단백질에 대해서는 28kDa에 반응하였으나 WSSV에 감염된 새우에서는 25 kDa에 반응하였다. 이러한 반응을 보이는 이유는 정확히 설명할 수 없으나 제작된 단클론 항체는 WSSV에 감염된 새우에서만 나타나는 물질 (VP 28 유사물질)을 인식하는 것으로 추정된다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00413

20171018

Claims

수탁번호 KCLRF-BP-00413으로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되어 흰반점증후군바이러스(White spot syndrome virus, WSSV)의 항원단백질 VP28과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 단일클론항체는 WSSV에 감염된 새우에서만 나타나는 VP28유사물질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 3 항에 있어서,
상기 VP28유사물질은 25 kDa의 분자량을 나타내는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제 1 항, 제 3 항, 및 제 4 항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00413으로 기탁된 하이브리도마 세포주.
제 1 항, 제 3 항, 및 제 4 항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 포함하고 새우의 흰반점증후군을 진단하는 진단 조성물.
제 6 항의 진단 조성물을 포함하는 새우의 흰반점증후군 진단 키트.
제 6 항의 진단 조성물을 포함하는 새우의 흰반점증후군 진단용 마이크로어레이.