KR102196159B1 - 조류 인플루엔자 바이러스 h7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 - Google Patents

조류 인플루엔자 바이러스 h7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 Download PDF

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최재원
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 단일클론항체는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지고, 동시에 다른 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 고병원성인 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 또는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의해 발생하는 조류 인플루엔자의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 고병원성인 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염이 의심되는 동물 또는 인간에서 조류 인플루엔자를 신속하게 진단할 수 있으며, 조류 인플루엔자의 예방, 치료, 예후 관찰, 역가측정 등 관련 연구 개발에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도{Monoclonal antibody against hemagglutinin of avian influenza virus subtype H7, hybridoma cell line producing the same, and uses thereof}
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자(Influenza)는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)에 의해 발병되는 급성 호흡기 질환을 의미하며, 흔히 독감이나 플루(Flu)로 잘 알려져 있다. 인플루엔자 바이러스는 Orthomyxovidridae 과(Family)의 하위 분류인 7개의 속(Genus) 중에서도 4개의 속(Genus)에 해당하는 바이러스들을 지칭한다. 이들 인플루엔자 바이러스는 바이러스를 구성하는 여러 종류의 단백질 중에서 핵단백질(Nucleoprotein, NP)과 막단백질(Matrix protein 또는 Membrane protein, M)에 의한 항원성의 차이(Antigenic differences)에 따라 인플루엔자 바이러스 A(Influenzavirus A), 인플루엔자 바이러스 B(Influenzavirus B), 인플루엔자 바이러스 C(Influenzavirus C) 및 인플루엔자 바이러스 D(Influenzavirus D)로 구분된다. 각각의 속(Genus)에는 단일 종(Species)이 있는 것으로 현재까지 보고되고 있으며, 그 각각은 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus), 인플루엔자 B 바이러스(Influenza B virus), 인플루엔자 C 바이러스(Influenza C virus) 및 인플루엔자 D 바이러스(Influenza D virus)이다(McDonald S. M. et al., Nat. Rev. Microbiol. (2016), Vol. 14, pp. 448-460., Yamayoshi S. and Kawaoka Y., Nat. Med. (2019), Vol. 25, pp. 212-220., To J. and Torres J., Cells (2019), Vol. 8, pp. E654.).
인플루엔자 A 바이러스는 사람(Humans)을 포함한 여러 포유류(Mammals)에게 감염될 수 있으며, 다른 종들과 달리 특히 조류(Bird)에게 감염될 수 있는 것으로 알려져 있다. 인플루엔자 B 바이러스는 주로 사람(Humans)에게 감염되며 물개(Seals)에게도 일부 감염될 수 있는 것으로 알려져 있으며, 인플루엔자 A 바이러스의 감염보다는 흔하지 않다(Osterhaus A. D. et al., Science (2000), Vol. 288, pp. 1051-1053.). 인플루엔자 C 바이러스(Influenza C virus)는 사람(Humans), 돼지(Pigs) 및 개(Dogs)에게 감염될 수 있는 것으로 알려져 있으며, 간혹 일부 심각한 증상을 나타내지만 일반적으로 경미한 증상을 보이거나 인플루엔자 A 바이러스에 비해 비교적 전염성이 낮은 것으로 생각되고 있다(Matsuzaki Y. et al., J. Clin. Microbiol. (2002), Vol. 40, pp. 422-429.). 인플루엔자 D 바이러스의 감염은 A형, B형 및 C형에 비해 드물지만, 주로 소(Cattle)나 돼지(Pigs)에게 감염될 수 있는 것으로 알려져 있으며 아직까지 사람에게 감염되어 질병을 일으킨 사례는 없는 것으로 알려져 있다(Hause B. M. et al., PLoS Pathogens (2013), Vol. 9, pp. e1003176.).
인플루엔자 바이러스는 직경(Diameter)이 80-120 nm 정도이며, 일반적으로 타원형(Ellipsoidal)이거나 필라멘트 형태(Filamentous)의 입자이다. 이 바이러스는 음성의 단일가닥 RNA 바이러스(Negative-sense single-stranded RNA virus, (-)ssRNA virus)이며, 전체 유전체는 12,000-15,000개 뉴클레오티드(Nucleotide)의 길이의 염기(Base)로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. 특징적인 것은 다른 종류의 RNA 바이러스들과는 달리 분절된 RNA(Segmented RNA)를 가지고 있으며, 6개에서 8개의 분절(Segment)을 갖는 것으로 알려져 있다(Bouvier N. M. and Palese P., Vaccine (2008), Vol. 26, pp. D49-53., McDonald S. M. et al., Nat. Rev. Microbiol. (2016), Vol. 14, pp. 448-460.).
이 중에서도 특히 인플루엔자 A 바이러스는 8개의 RNA 분절을 가지며, 분절 1(Segment 1)은 RNA 중합효소 서브유닛(Subunit)인 PB2 단백질, 분절 2(Segment 2)는 RNA 중합효소 서브유닛인 PB1, 분절 3(Segment 3)은 RNA 중합효소 서브유닛인 PA, 분절 4(Segment 4)는 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA), 분절 5는 핵단백질(Nucleoprotein, NP), 분절 6은 뉴라미니다제(Neuraminidase, NA), 분절 7은 막단백질(Matrix proteins 또는 Membrane proteins, M), 분절 8은 비구조단백질(Nonstructural proteins, NS)을 암호화하고 있는 것으로 알려져 있다. 이 중에서도 분절 4와 분절 6으로부터 각각 생성되는 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA)를 암호화하는 2가지의 분절을 표면 항원 유전자(Surface antigen gene)로 분류하며, 나머지 6개의 RNA 분절을 내부 유전자(Internal gene)로 분류한다. 병원성(Pathogenicity)은 주로 헤마글루티닌(HA) 유전자와 관련이 있으며, 헤마글루티닌(HA) 유전자의 특정 부위의 배열에 따라 고병원성(High pathogenicity)으로 분류될 수 있다. 숙주(Host)에 대한 감염 특이성과 관련도가 가장 높은 유전자는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)이나, 다른 내부 유전자들도 복합적으로 관련되어 있다(Zheng W. and Tao Y. J., FEBS Lett. (2013), Vol. 587, pp. 1206-1214., Chenavas S. et al., Future Microbiol. (2013), Vol. 8, pp. 1537-1545., Lo C. Y. et al., Subcell. Biochem. (2018), Vol. 88, pp. 95-128., Te Velthuis A. J. and Fodor E., Nat. Rev. Microbiol. (2016), Vol. 14, pp. 479-493.).
인플루엔자 A 바이러스는 매우 다양한 아형(Subtype)이 존재하며, 바이러스의 표면에 존재하는 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA)에 따라 분류될 수 있다. 헤마글루티닌(HA)는 적혈구가 응집(Agglutination)되도록 하는 단백질이며, 뉴라미니다제(NA)는 단당류 시알산(Monosaccharide sialic acid)의 글리코시드 결합(Glycosidic bond)를 제거하는 효소로 알려져 있다. 현재까지 헤마글루티닌은(HA)는 18종이 있는 것으로 파악되고 있으며, 뉴라미니다제(NA)는 11종이 있는 것으로 파악되고 있다. 따라서 이들의 조합에 의해 최대 198종의 인플루엔자 A 바이러스 아형(Subtype)이 존재할 수 있으며, H1N1, H5N9 및 H18N11 등과 같이 HXNX의 형태로 표기하고 있다(Yamayoshi S. and Kawaoka Y., Nat. Med. (2019), Vol. 25, pp. 212-220., Jagadesh A. et al., Arch. Virol. (2016), Vol. 161, pp. 2087-2094., Gamblin S. J. and Skehel J. J., J. Biol. Chem. (2010), Vol. 285, pp. 28403-28409.).
조류 인플루엔자(Avian influenza, AI)는 조류(Bird)를 감염시킬 수 있는 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus)에 감염되어 나타나는 조류의 급성 전염병을 의미한다. 닭이나 오리, 칠면조 등의 가금류 뿐만 아니라 야생의 조류 등을 감염시키며 심각한 피해를 야기시키는 것으로 알려져 있다. 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 가금류 및 야생 조류와의 접촉이나 감염된 조류의 배설물이나 분비물에 오염된 사물과의 접촉을 통해서도 조류 인플루엔자가 발생할 수 있다. 감염된 조류의 분변 1 g에는 닭 10만 마리 ~ 100만 마리를 감염시킬 수 있는 바이러스가 존재하고, 조류 인플루엔자 바이러스는 분변 내에서 7일에서 35일 정도까지도 생존할 수 있으며, 낮은 온도와 높은 습도에서는 100일 넘게 까지도 생존할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 우리나라에서는 「가축전염병 예방법」에 따라 제1종 가축전염병으로 지정되어 있으며, 드물지만 인체 감염 가능성도 일부 존재하기 때문에 「감염병 예방 및 관리에 관한 법률」에 따라 제4군 감염병(동물 인플루엔자)으로 지정하여 관리하고 있는 상황이다(조류 인플루엔자 긴급행동지침전문 (2017), 농림수산식품부).
조류 인플루엔자는 병원성(Pathogenicity)의 정도에 따라 저병원성 조류 인플루엔자(Low pathogenic AI)와 고병원성 조류 인플루엔자(High pathogenic AI)로 나눌 수 있다. 특히 고병원성 조류 인플루엔자는 닭이나 칠면조의 경우 치사율이 100%에 가까울 정도로 위험도가 매우 높기 때문에 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE (舊 국제 수역 사무국))에서 관리대상 질병으로 지정하고 있으며, 조류 인플루엔자 발생 시 세계동물보건기구(OIE)에 의무적으로 보고해야 한다(조류 인플루엔자 긴급행동지침전문 (2017), 농림수산식품부., Machalaba C. C. et al., Emerg. Infect. Dis. (2015), Vol. 21, pp. e1-7.).
고병원성 조류 인플루엔자는 조류(Bird) 뿐만 아니라 사람도 감염될 수 있다는 사례가 전 세계적으로 보고되고 있고 천문학적인 금액의 경제적인 피해를 유발할 수 있기 때문에 주의가 요구된다. 여러 종류의 조류 인플루엔자 바이러스 중에서도 H5N1, H5N6, H7N9, H9N2, H10N8 등의 아형에 대한 인체 감염 사례가 보고되었으며, 인체에 감염될 경우 50%에 가까운 사망률을 보이기 때문에 매우 큰 주의가 요구된다(고기오, KISTEP 기술동향브리프: 가축전염병 (2018-17호), 한국과학기술기획평가원., 조류 인플루엔자 인체감염 예방 및 관리지침 (2017), 보건복지부 & 질병관리본부). 과거에는 인플루엔자 바이러스에 A형, B형 및 C형만 존재하는 것으로 알려져 있었으나, 2016년 D형이 새롭게 확인되어 인플루엔자 바이러스의 신규 속(Genus)과 종(Species)이 추가된 바 있다(Hause B. M. et al., PLoS Pathog. (2013), Vol. 9, pp. e1003176.). 또한 가장 많은 인플루엔자 바이러스의 아형(Subtypes)이 존재하는 인플루엔자 A 바이러스의 경우에도 기존에 알려지지 않았던 새로운 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)의 종류가 확인됨에 따라 신 ·변종 조류 인플루엔자에 대한 경계가 높아지고 있는 상황이다 (미국 Centers for Disease Control and Prevention (https://www.cdc.gov/flu/avianflu/influenza-a-virus-subtypes.htm), Tong S. et al., PLoS Pathog. (2013), Vol. 9, pp. e1003657.).
그 중에서도 2016년 이후 조류 뿐만 아니라 인체에 감염될 수 있고, 감염될 경우 50%를 넘는 높은 사망률을 보이는 H7N4 및 H7N9와 같은 H7 아형의 고병원성 조류 인플루엔자에 대한 경계가 높아지고 있다 (Goneau L. W. et al., Curr. Infect. Dis. Rep. (2018), Vol. 20, pp. 37., Mehta K. et al., Curr. Infect. Dis. Rep. (2018), Vol. 20, pp. 38., 국내ㆍ외 조류 인플루엔자 발생 현황 (2017년 제7호), 질병관리본부). 따라서 조류 인플루엔자로 인한 사회적, 경제적 손실을 줄이기 위한 조기대응기술이 요구되고 있으며, 조류 인플루엔자를 조기에 신속하게 진단할 수 있는 기술에 대한 개발이 요구되고 있다.
현재 조류 인플루엔자를 진단하기 위한 실험실 표준 방법으로는 1) 인플루엔자 특이 유전자를 검출하는 방법, 2) 검체로부터 바이러스를 직접 분리하여 확인하는 방법, 3) 검체의 혈청으로부터 인플루엔자 바이러스에 대한 특이항체를 검사하는 방법 등이 있다(이창섭, J. Korean Med. Assoc. (2010), Vol. 53, pp. 43-51., 감염병실험실진단 (2005), 질병관리본부). 첫 번째 방법인 인플루엔자 특이 유전자를 검출하는 방법은 미국 CDC(Centers for Disease Control and Prevention)에서 권고하고 있는 방법으로, 조류 인플루엔자 바이러스에 특이적인 유전자를 역전사 실시간 중합효소연쇄반응(Reverse transcription real-time polymerase chain reaction, rRT-PCR)을 통해 검출하는 방법이다(미국 Centers for Disease Control and Prevention (Avian Influenza: Information for Health Professionals and Laboratorians, https://www.cdc.gov/flu/avianflu/healthprofessionals.htm)). 진단까지 수 시간 이내로 비교적 빠르지만, 변이(Variation)가 빈번하게 일어나는 조류 인플루엔자 바이러스이기 때문에 위양성(False-positive)의 결과가 나타날 수 있는 단점이 있다. 두 번째 방법인 검체로부터 바이러스를 직접 분리하여 확인하는 방법은 검사자가 감염에 노출될 가능성이 크며, 무엇보다도 실제 조류 인플루엔자 바이러스를 확인하기 까지 7일 내외의 시간이 소요된다는 특징이 있다. 결론적으로 병원성과 전염성이 매우 높은 조류 인플루엔자의 진단은 가능하지만, 진단에 필요한 시간이 길기 때문에 조류 인플루엔자로 인한 사회적, 경제적 손실을 최소화하기에는 무리가 있다. 세 번째 방법은 검체의 혈청 내에 존재하는 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 생성된 특이항체를 검사하는 방법이다. 이 방법은 비교적 빠르지만 과거 인플루엔자에 걸린적이 있거나 백신주사를 맞은 경우에 위양성(False-positive)의 결과가 나타날 수 있다.
이에 본 발명자들은 신속하면서도 별도의 조류 인플루엔자 바이러스의 배양과정 없이 조류 인플루엔자 바이러스의 검출이나 조류 인플루엔자 진단을 위해, '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하였으며, 본 발명의 단일클론항체는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌과 높은 결합친화도를 가지고, 특이도가 확인되어, 짧게는 수 분의 시간 이내에, 길게는 수 시간 이내에 손쉽게 조류 인플루엔자 바이러스의 검출이나 조류 인플루엔자의 진단이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2007951 B1 KR 10-2012-0024313 A KR 10-2007-0072945 A
본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC 13937BP의 하이브리도마 세포주 AIH7-6에 의해 생산되는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13937BP인 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 1) 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염이 의심되는 대상으로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 생물학적 시료에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 및 3) 상기 단계 1)의 생물학적 시료 내의 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌과 상기 단계 2)의 단일클론항체의 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13937BP의 하이브리도마 세포주 AIH7-6에 의해 생산되는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13937BP인 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염이 의심되는 대상으로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 생물학적 시료에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 및 3) 상기 단계 1)의 생물학적 시료 내의 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌과 상기 단계 2)의 단일클론항체의 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 단일클론항체는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지고, 동시에 다른 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 고병원성인 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 또는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의해 발생하는 조류 인플루엔자의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 고병원성인 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염이 의심되는 동물 또는 인간에서 조류 인플루엔자를 신속하게 진단할 수 있으며, 조류 인플루엔자의 예방, 치료, 예후 관찰, 역가측정 등 관련 연구 개발에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌을 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 것으로, 72 kDa(Kilodalton, 킬로달톤) 부근에 밴드가 형성되어 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌이 순수 분리 및 정제된 것을 확인한 도이다.(도면 내 'S.M.'은 단백질 사이즈 마커를 의미)
도 2는 수탁번호 KCTC 13937BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 것으로, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 단일클론항체의 중쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)가 관찰되어 단일클론항체가 분리 및 정제된 것을 확인한 도이다.(도면 내 'S.M.'은 단백질 사이즈 마커를 의미)
도 3은 수탁번호 KCTC 13937BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체의 아이소타입(Isotype)은 IgG2a임을 확인한 도이다.
도 4는 수탁번호 KCTC 13937BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체의 해리 상수(Dissociation constant, KD)를 나타낸 도이다.
도 5는 수탁번호 KCTC 13937BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 단일클론항체의 특이도를 측정하기 위해, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌(Hemagglutinin of avian influenza virus H7 subtype , AIV H7 HA), 지카 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1 of Zika virus , ZIKV NS1) 및 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)과 반응성을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC 13937BP의 하이브리도마 세포주 AIH7-6에 의해 생산되는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명에서 용어 '단일클론항체'란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 결합하는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 달리, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해 특이적으로 결합한다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 하이브리도마(Hybridoma)의 배양 또는 파지디스플레이(Phage display) 방법에 의해 생산될 수 있기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 장점을 갖는다. 본 발명의 목적상 본 발명의 단일클론항체는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하므로, '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'을 인식하는 단백질 분자이다.
본 발명의 단일클론항체는 정제하지 않고 사용하거나, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 90% 이상의 순도)로 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 정제 방법의 예로는 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(Ascites)에서 분리할 수 있으나, 이에 의해 본 발명의 항체 정제 방법이 제한되는 것은 아니다.
한편, 항원을 검출하기 위해 단일클론항체를 사용하는 경우의 유용한 점은 단일 에피토프, 즉 항원결정부위를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(Mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용한 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해하여 생성된 단편을 면역블롯팅하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열 내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.
또한, 본 발명의 단일클론항체는 항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체의 결합특성을 갖는 한, 2개의 전체 길이의 경사슬 및 2개의 전체 길이의 중사슬을 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1)및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology 9th Edition, Abbas A. K. et al., 2017).
항체 분자의 '기능적인 단편'이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. F(ab')는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(Hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 F(ab')의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머(Dimer)와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 제한 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 아이소타입(Isotype)으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
상기 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체뿐만 아니라 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함할 수 있다.
상기 단일클론항체는 IgG2a 아이소타입(isotype)인 것을 특징으로 한다.
항체는 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE의 5개의 서로 다른 분류(Classification)으로 나눌 수 있다. 각각의 분류와 아이소타입은 면역글로불린(Immunoglobulin) 사이에서 서로 다른 유형의 종류를 의미하며, 서로 다른 중쇄와 경쇄의 일정 부위 유전자를 사용하기 때문에 생긴 일정 부위의 차이를 지칭한다.
상기 단일클론항체는 1.49×10-11 내지 1.49×10-9 몰(M)의 해리 상수(Dissociation constant, KD)로 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 결합하는 것을 특징으로 한다.
상기 단일클론항체의 해리 상수는 항원과의 결합 친화도를 나타내며 해리 상수가 작을수록 단일클론항체와 항원과의 결합 친화도가 큰 것이다. 상기 결합 친화도는 통상의 방법에 따라 결정할 수 있으며, 이러한 방법으로는 특별히 제한하지는 않으나, 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment)을 통해 항원과의 결합을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13937BP인 하이브리도마 세포를 제공한다.
본 발명에서 용어 '하이브리도마 세포'란, 항체를 생산하는 B 림프구와 암세포의 일종인 골수종 세포를 융합하여 얻은 세포를 의미하는데, 골수종 세포는 형질전환된 세포로, 배양접시에서 오랜 기간 배양할 수 있는 장점이 있어, 한 가지 항체만을 만들어 내는 골수종 하이브리도마를 분리해 내면 손쉽게 단일클론항체를 대량으로 획득하는 것을 의미한다. B 림프구와 골수종 암세포를 융합하는 방법은 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 바람직하게는 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'으로 면역화된 림프구와 골수종 세포가 융합된 세포일 수 있으며, '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 제한없이 포함할 수 있다.
상기의 하이브리도마 세포는 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 국제공인기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁을 진행하였으며 2019년 9월 5일자로 수탁번호 KCTC 13937BP를 부여받았다.
상기 하이브리도마 세포는 1) 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌을 사용하여 마우스를 면역화시키는 단계; 2) 상기 면역화시킨 마우스의 비장 세포(Splenocytes)를 골수종 세포(Myeloma cells)와 융합하여 배양하는 단계; 및 3) 융합된 하이브리도마 세포주에서 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계; 를 통해 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 상기 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염 여부를 확인하는 것이다.
상기 검출용 조성물 또는 진단용 조성물은 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단일클론항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 상기 항원-항체반응의 분석법의 방법과 동일한 방법으로도 수행할 수 있다.
상기 검출용 조성물 또는 진단용 조성물은 검출 또는 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(Flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작하였으므로, 본 발명의 단일클론항체는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 또는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트는 본 발명의 단일클론항체 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 포함할 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 또한 검출용(진단용) 키트는 본 발명의 단일클론항체와 여기에 적용될 시료 중의 항원(항원결정부위)과의 반응을 확인할 수 있는 표지체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조류 인플루엔자 진단용 키트는 표지체와 접합된 상기 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체에 결합이 가능한 2차 항체, 발색기질 및 각 반응 단계에 사용하는 세척액을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 표지체의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 육안, 검출장비, 검출시약 등을 이용할 수 있다. 상기 검출시약은 검사하고자 하는 대상물질(Analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(Labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분을 포함할 수 있다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 알칼리성 포스파타제와 겨자무 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 3,3',5,5' -테트라메틸벤지딘, 4-메톡시-1-나프톨, 4-클로로-1-나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도체와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로오레세인 (Fluorescein), 피코빌리프로틴(Phycobiliprotein), 로다민(Rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있다. 일예로, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP (Horseradish peroxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC (Fluorescein isothiocyanate)가, 발광물질로는 루미놀(Luminol), 아이소루미놀(Isoluminol) 및 루시게닌(Lucigenin)이, 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지 수단에 의한 표지 여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광 또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인 가능하다.
상기 표지체는 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(Colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nanotube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 발색기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-Phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 하나의 예로, TMB와 같은 발색기질은 2차항체접합체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인하거나 흡광도 측정을 통해 단백질 항원의 존재 유무를 검출할 수 있다.
상기 세척액은 단계에 따라 증류수, TBS (Tris buffered saline) 트윈 완충용액, PBS (Phosphate buffered saline) 트윈 완충용액, NaCl, 트윈-20 (Tween-20), 트리톤 X-100 (Triton X-100) 등을 사용할 수 있다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합 복합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척할 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염이 의심되는 대상으로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생물학적 시료에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 생물학적 시료 내의 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌과 상기 단계 2)의 단일클론항체의 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 방법을 제공한다.
상기 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염이 의심되는 대상은 동물 또는 인간일 수 있다.
상기 동물은 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형이 감염될 수 있는 가능성이 있는 모든 동물을 포함하며, 인간을 제외한 포유류 및 조류를 포함한다.
상기 조류는 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추리, 꿩과 같은 가금류 및 두루미, 백로, 까치, 까마귀, 참새, 산비둘기, 찌르레기, 직바구리, 기러기, 황새, 홍학, 독수리, 매, 뻐꾸기, 올빼미, 딱다구리와 같은 야생 조류를 포함한다.
상기 동물은 동물의 생체(生體) 또는 사체(死體)를 포함한다.
상기 생물학적 시료는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염이 의심되는 동물의 생체 또는 사체로부터 분리할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료(또는 액상화된 시료)를 의미하는 것으로, 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 조직 파쇄물, 세포, 세포 파쇄물, 체액, 타액, 활액, 뇌척수액, 림프액, 분변 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 생물학적 시료는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출에 사용하기 전에 전처리(Pre-treatment 또는 Pre-processing)할 수 있다. 전처리 방법의 예로, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있고, 상기 생물학적 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
상기 단계 3)의 항원-항체 복합체 형성은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay) 및 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
상기 웨스턴 블로팅은 생물학적 시료 중에 존재하는 해당 단백질을 확인하기 위한 유용한 방법이다. 예를 들어, 장기 조직 유래의 추출액 등의 생체 시료액을 v폴리아크릴아미드 겔(Gel)에 전기영동 시킨 뒤, PVDF 멤브레인에 전이하고, 해당 단백질 또는 해당 펩타이드를 인식하는 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것이다.
상기 면역 화학 염색법은 조직 및 세포에 있어서 대상 폴리펩티드(polypeptide)의 발현 부위를 해석하기 위하여 유효한 방법으로, 예를 들어, 슬라이드글라스 상에 고정되는 조직 절편, 세포 등을 본 발명의 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 상기 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체와 결합할 수 있는 2차 항체를 이용하여 검출하는 것에 따라 실시한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 생산된 하이브리도마 세포주 중 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌과 높은 반응성을 보이는 세포주를 1차 선별하였으며, 계대배양을 거쳐 이들 중 생존능을 상실했거나 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌과 반응하지 않는 하이브리도마 세포주를 제외하는 과정을 거쳐, 세포주를 2차 선별하였다. 이후, 선별한 세포주가 생산하는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 IgG2a의 아이소타입을 가지고(도 3 참조), 0.149±0.018 나노몰(nM)의 해리 상수값을 나타내어 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 높은 결합 친화도를 가지는 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 본 발명의 단일클론항체는 다른 단백질과는 반응하지 않고 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형에만 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 5 참조). 이에, 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 고병원성인 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의해 발생하는 조류 인플루엔자의 진단, 조류 인플루엔자의 예방, 치료, 예후 관찰, 역가측정 등 관련 연구 개발에서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌(Hemagglutinin)의 준비
조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌을 암호화하는 524개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질(서열번호 1)을 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
구체적으로, 인간배아신장세포(Human embryonic kidney cell, HEK293 cell)에서 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌을 발현시키고, C 말단(C-terminal)에 폴리히스티딘(Polyhistidine)을 연결(His-tagged)시켰다. 그 후 Ni-NTA 레진(Nickel-nitrilotriacetic acid resin)을 사용한 친화도 크로마토그래피(Affinity chromatography)로 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌을 순수 분리 및 정제하였다.
분리 및 정제된 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌은 단백질 전기영동 기술인 PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 확인하였다. 단일클론항체를 만들기 위한 항원(Antigen)으로 사용할 '조류 인플루엔자 바이러스의 H7 아형의 헤마글루티닌'이 높은 순도(Purity)로 존재하는지, 알려진 '조류 인플루엔자 바이러스의 H7 아형의 헤마글루티닌'의 분자량(Molecular weight)인 약 64 킬로달톤(Kilodalton, kDa) 부근에 위치하는지를 확인하기 위해 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 단백질 전기영동을 수행하였다. 이후 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 염색하고, 탈색용액을 이용하여 탈색반응을 진행하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, 단백질 사이즈 마커(Protein size marker, S.M.)와 비교했을 때 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌은 알려진 헤마글루티닌의 분자량인 64kDa과 유사한 72kDa 부근에 밴드를 형성하여 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌이 순수 분리 및 정제된 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 2> 하이브리도마 세포주 제작을 위한 마우스의 면역화 및 항체 역가(Antibody titer) 측정
<2-1> 마우스의 면역화 수행
조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작하기 위해 마우스의 면역화를 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1을 통해 확인된 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌' 30 ㎍을 PBS 용액을 이용하여 250 ㎕가 되도록 희석하고, 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant와 혼합하여 에멀젼(Emulsion) 형태로 만든 다음, 이를 생후 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 주사하여 1차 면역화를 수행하였다. 1차 면역화 수행으로부터 2주 후에 Complete Freund's Adjuvant 대신 Incomplete Freund's Adjuvant를 이용하여 동일한 방법 및 조건으로 2차 면역화를 수행하였다.
<2-2> 면역화된 마우스의 항체 역가 측정
2차 면역화로부터 2주 후에 마우스의 꼬리 정맥으로부터 10 ㎕의 혈액을 채취하여 마우스 체내에 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 항체가 충분히 생성되었는지 확인하기 위해 항체 역가(Antibody titer)를 Indirect ELISA를 통해 측정하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'을 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 다음 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4) (PBS/T) 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척하고, 1% 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척하여 블로킹 시켜 플레이트에 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌을 코팅하였다.
상기 플레이트에 1/102, 1/103, 1/104의 비율로 희석된 마우스 혈액 100 ㎕를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후 HRP(Horseradish peroxidase)가 연결된 염소의 항-마우스 IgG(Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액을 100 ㎕씩 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다.
마우스 혈액 내에 존재하는 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 항체의 역가('조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 반응성)에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 10,000배 희석된 혈액에서도 흡광도가 부스터 주입의 별도 기준치인 0.3을 훨씬 상회하는 값인 1.847이 나왔기 때문에(표 1), 면역화가 잘 이루어진 것으로 판단되어 최종적으로 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌' 30 ㎍을 PBS 용액에 희석하여 별도의 아쥬반트(Adjuvant)없이 면역반응 극대화를 위한 부스터 주입(Booster injection)을 수행하였다.
<면역화된 마우스의 혈액 희석배율에 따른 흡광도 측정>
시료의 종류 450nm에서 흡광도
100배 희석된 마우스 혈액 3.372
1000배 희석된 마우스 혈액 3.293
10000배 희석된 마우스 혈액 1.847
인산완충용액 대조군(control) 0.013
<실시예 3> 하이브리도마 세포주의 제작
조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
구체적으로, 하이브리도마 세포주의 제작을 위한 세포융합은 공지된 하이브리도마 생산기술(Kohler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) Vol. 73, pp. 3-46.)을 통해 이루어졌다. 상기 실시예 2-1의 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'으로 면역화된 마우스로부터 비장(Spleen)을 적출한 다음, 조직분쇄기로 비장을 분쇄하고 RPMI 1640 배지에 현탁하여 비장세포(Splenocyte)를 계수하였다. 그 다음 37℃, 5% CO2의 세포배양기에서 배양한 T75 플라스크의 마우스 골수종세포(Myeloma, Sp2/0-Ag14)를 회수하고 RPMI 1640 배지에 현탁하여 동일한 방법으로 계수하였다. 계수한 마우스의 비장세포와 골수종세포를 세포수를 기준으로 5:1이 되도록 하나의 50 ㎖ 튜브에 옮겨 담은 뒤, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 50%의 PEG1500(Polyethylene glycol) 1 ㎖를 처리한 다음, 39 ㎖의 37℃ RPMI 1640 배지를 천천히 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시켜 세포융합이 일어나도록 하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수한 다음, HAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine)을 함유하고 있는 RPMI 1640 배지(HAT 배지)를 이용하여 적절한 수의 세포가 되도록 현탁한 다음 세포배양용 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 100 ㎕씩 분주했다. 이후 37℃, 5% CO2의 조건으로 세포배양기 내에서 배양하였다.
<실시예 4> 고반응성 하이브리도마 세포주의 선별
조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌과 높은 반응성을 보이는 하이브리도마 세포주를 선별하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3을 통해 융합된 세포를 7일 이상 배양하고, 육안이나 현미경을 통해 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것을 확인한 다음, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(Well)에 있던 기존 HAT 배지를 교체하여 상기 실시예 3과 동일한 조건에서 3일간 추가적으로 배양하였다. 이후 96-웰(96-well) 세포 배양 플레이트 내 각각의 웰에 존재하는 배지를 취하여 상기 실시예 2-2와 같은 방법으로 Indirect ELISA를 수행하였다.
'조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'과 높은 반응성을 보이는 웰(Well)에 존재하는 하이브리도마를 선별하였으며, 추가적으로 24-웰 플레이트(24-well plate) 및 6-웰 플레이트(6-well plate)에서의 계대배양을 거쳐 생존능 및 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 반응성을 같은 방법으로 확인하였다. 생존능을 상실했거나 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 반응성이 없는 하이브리도마를 제외한 후, '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대해 높은 반응성을 보이는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다. 선별된 하이브리도마 세포주들은 단일클론의 하이브리도마 세포주를 얻기 위해 서브-클로닝(Sub-cloning) 및 클로닝(Cloning) 과정을 진행하였다. 1개의 96-well plate 당 50개~100개의 하이브리도마 세포가 들어가도록 하여 서브-클로닝 과정을 진행하였다. 보다 확실한(안정한) 단일클론의 하이브리도마 세포주가 얻어질 때 까지 같은 과정을 반복하여 클로닝을 수행하였다. 이들 중에서 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에만 특이적으로 결합하는 하이브리도마 세포주를 국제공인기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13937BP를 부여받았다.
<실시예 5> 단일클론항체의 생산, 분리, 정제 및 확인
선별된 하이브리도마 세포주로부터 다량의 단일클론항체를 얻기 위해 마우스의 복강 내로 하이브리도마 세포주를 주입하여 복수(Ascites)가 생성되도록 유도하였다. 이는 단일클론항체 획득을 위해 본 실시예에서 수행한 것일 뿐, 생체 외 세포배양(In vitro cell culture)을 통해서도 단일클론항체의 획득이 가능하다. 상기 마우스로부터 획득한 복수로부터 혈청(Serum)의 분리를 위해 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 수행하였다.
상기의 과정으로부터 준비된 혈청에 포함된 단일클론항체인 이뮤노글로불린 G (Immunoglobulin G, IgG)만을 선택적으로 분리/정제하기 위해 준비된 배지를 20 mM KH2PO4 (pH 7.4) 용액으로 평형화 해준 아가로즈(Agarose)-Protein G 레진(Resin)이 충진(Packing)되어 있는 컬럼(Column)에 흘려주었다. 혈청을 모두 흘려준 다음, 다시 20 mM KH2PO4 (pH 7.4)를 이용하여 비특이적으로 결합되어 있거나 끼어있는 단일클론항체 이외의 불순물들을 제거해 주었다. 이후 0.1 M Glycine (pH 2.8) 용액을 흘려주어 Protein G와 결합되어 있는 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 단일클론항체를 용출시켜주었으며, 용출되는 즉시 pH 중화(Neutralization)를 위해 1 M Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 용출액의 1/3에서 1/5 정도의 부피 비율(Volume ratio)이 되도록 섞어주었다. 이후 단일클론항체 용출액의 버퍼(용액)를 교환해주기 위해 PBS 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 이상 투석을 2회 반복하여 고농도의 염을 제거하였다. 투석이 완료된 단일클론항체는 주사기 필터를 통해 응집물(Aggregate)을 제거한 다음, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이후 상기 실시예 1과 동일한 방법 및 조건으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 쿠마시 블루 염색을 통해 고순도의 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 단일클론항체를 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 항체의 중쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)가 관찰되어, 단일클론항체의 분리 및 정제가 잘 이루어졌다고 판단하였다.
<실험예 1> 단일클론항체의 아이소타입(Isotype) 및 해리상수 확인
<1-1> 단일클론항체의 아이소타입(Isotype) 확인
상기 실시예 5로부터 순수 분리 및 정제된 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 단일클론항체의 아이소타입을 확인하였다.
구체적으로, 마우스 IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM에 각각 특이적으로 결합하는 염소(Goat)의 항체를 PBS (pH 7.4) 용액을 이용하여 1 ㎍/㎖의 농도로 희석시키고, 효소면역흡착검사용 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(Well)을 3회 세척하고, 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰(Well)에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 그 다음 상기 실시예 5의 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 단일클론항체를 100 ㎕ 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰으며, 반응이 끝난 후 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(Well)에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 아이소타입 반응성에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, 상기 실시예 5로부터 분리 및 정제된 단일클론항체의 아이소타입은 IgG2a임을 확인할 수 있었다.
<1-2> 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, K D ) 확인
상기 실시예 5로부터 순수 분리 및 정제된 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, KD) 또는 결합친화도(Binding affinity)를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-2의 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'이 코팅되어 있는 효소면역흡착검사용 플레이트를 준비하였다. 상기 단일클론항체를 100 나노몰(nM)의 몰농도(Molar concentration)로 부터 PBS 용액을 이용하여 1/2씩 연속적으로 희석하여 0 nM을 포함한 총 16가지 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, 이들을 각각의 웰에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 농도의 단일클론항체에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 상기 실시예 5로부터 분리 및 정제된 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 단일클론항체의 해리상수는 0.149±0.018 나노몰(nM) 임을 확인하여, 일반적인 단일클론항체의 해리상수인 1 나노몰(nM)에서 100 나노몰(nM) 사이의 값보다 현저히 우수함을 확인할 수 있었다(Lai H. et al., Plant Biotechnol. J. (2014), Vol. 12, pp. 1098-1107., Qiu X. et al., Nat. Microbiol. (2018), Vol. 3, pp. 287-294., Rathore U. et al., J. Biol. Chem. (2018), Vol. 293, pp. 15002-15020.).
<실험예 2> 단일클론항체의 특이도 분석
상기 실시예 5를 통해 분리 및 정제된 단일클론항체가 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'과는 결합 또는 반응하면서, 다른 단백질과는 결합 또는 반응하지 않는지 확인하기 위해 단일클론항체의 특이도를 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5를 통해 분리 및 정제된 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'에 대한 단일클론항체를 100 nM의 농도로 100 ㎕씩 '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌(His-tagged form)', '지카 바이러스의 비구조단백질 1(His-tagged form)' 및 '소혈청 알부민(BSA, Naitve form)'이 각각 코팅되어 있는 플레이트에 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(Well)을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 서로 다른 단백질에 대한 단일클론항체의 반응성 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 상기 실시예 5로부터 분리 및 정제된 단일클론항체가 다른 종류의 단백질과는 결합 또는 반응하지 않으며, '조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌'과만 특이적으로 결합 또는 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Monoclonal antibody against hemagglutinin of avian influenza virus subtype H7, hybridoma cell line producing the same, and uses thereof <130> 2019P-08-005 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hemagglutinin of Avian Influenza virus Subtype H7 <400> 1 Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Ile Ala Ile Ile Pro Thr Asn Ala 1 5 10 15 Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Lys Val 20 25 30 Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr Glu Thr 35 40 45 Val Glu Arg Thr Asn Ile Pro Arg Ile Cys Ser Lys Gly Lys Arg Thr 50 55 60 Val Asp Leu Gly Gln Cys Gly Leu Leu Gly Thr Ile Thr Gly Pro Pro 65 70 75 80 Gln Cys Asp Gln Phe Leu Glu Phe Ser Ala Asp Leu Ile Ile Glu Arg 85 90 95 Arg Glu Gly Ser Asp Val Cys Tyr Pro Gly Lys Phe Val Asn Glu Glu 100 105 110 Ala Leu Arg Gln Ile Leu Arg Glu Ser Gly Gly Ile Asp Lys Glu Ala 115 120 125 Met Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Ile Arg Thr Asn Gly Ala Thr Ser Ala 130 135 140 Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp Leu Leu 145 150 155 160 Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ala Phe Pro Gln Met Thr Lys Ser Tyr Lys 165 170 175 Asn Thr Arg Lys Ser Pro Ala Leu Ile Val Trp Gly Ile His His Ser 180 185 190 Val Ser Thr Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Lys Leu 195 200 205 Val Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr Gln Gln Ser Phe Val Pro Ser Pro 210 215 220 Gly Ala Arg Pro Pro Val Asn Gly Leu Ser Gly Arg Ile Asp Phe His 225 230 235 240 Trp Leu Met Leu Asn Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe Asn Gly 245 250 255 Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys Ser Met 260 265 270 Gly Ile Gln Ser Gly Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly Asp Cys 275 280 285 Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln Asn Ile 290 295 300 Asp Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Arg Ser 305 310 315 320 Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro Lys Gly 325 330 335 Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu 340 345 350 Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly 355 360 365 Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp Gln 370 375 380 Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe 385 390 395 400 Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val Glu Lys Gln Ile Gly Asn 405 410 415 Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn 420 425 430 Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala 435 440 445 Asp Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg 450 455 460 Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys 465 470 475 480 Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His 485 490 495 Ser Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Pro 500 505 510 Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val Ile Leu 515 520

Claims (16)

  1. 수탁번호 KCTC 13937BP의 하이브리도마 세포주 AIH7-6에 의해 생산되는 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 IgG2a 아이소타입(Isotype)인 것을 특징으로 하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 1.49×10-11 내지 1.49×10-9 의 해리 상수(Dissociation constant, KD)로 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 결합하는 것을 특징으로 하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13937BP인 하이브리도마 세포.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형 검출용 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조류 인플루엔자 진단용 키트는 표지체와 접합된 상기 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체에 결합이 가능한 2차항체 및 발색기질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표지체는 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(Colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nanotube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 키트.
  11. 제9항에 있어서, 상기 발색기질은 DAB (Diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염에 의한 조류 인플루엔자 진단용 키트.
  12. 1) 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염이 의심되는 대상으로부터 분리한 생물학적 시료에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 생물학적 시료 내의 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 헤마글루티닌과 단일클론항체의 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 감염이 의심되는 대상은 동물 또는 인간인 것인, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 동물은 동물의 생체(生體) 또는 사체(死體)를 포함하는 것인, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 조직 파쇄물, 세포, 세포 파쇄물, 체액, 타액, 활액, 뇌척수액, 림프액, 분변 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 단계 2)의 항원-항체 복합체 형성은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay) 및 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 확인되는 것을 특징으로 하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7 아형의 검출 방법.
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