KR102218561B1

KR102218561B1 - 단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스의 검출 방법

Info

Publication number: KR102218561B1
Application number: KR1020190010382A
Authority: KR
Inventors: 김학용; 최재원; 조병관
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2021-02-19
Also published as: KR20200093198A

Abstract

본 발명은 단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명의 샌드위치 면역분석법(Sandwich Immunoassay)은 뎅기 바이러스(Dengue Virus)를 구성하는 단백질 바이오마커(Biomarker) 검출을 통해 뎅기 바이러스의 존재 유무를 확인하는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스의 검출 방법{Method of Detecting Dengue Virus Using Monoclonal Antibody Pair}

본 발명은 뎅기 바이러스(Dengue Virus)를 구성하는 단백질 바이오마커(Biomarker) 검출을 통해 감염증의 일종인 뎅기열(Dengue Fever), 뎅기 출혈열(Dengue Hemorrhagic Fever) 및 뎅기 쇼크 증후군(Dengue Shock Syndrome) 등과 같은 뎅기 바이러스 감염증을 진단하거나, 뎅기 바이러스의 존재 유무를 확인하는데 활용될 수 있는 기술이다. 또한 종래의 여러 종류의 면역분석법과 달리, 뎅기 바이러스를 구성하는 단백질 바이오마커에만 특이적으로 결합하는 1쌍의 단일클론항체를 이용하여 다른 플라비바이러스(Flavivirus)와 교차반응(Cross-Reactivity) 없이 오직 뎅기 바이러스만을 선택적으로 검출이 가능한 기술이다. 본 발명은 조직(Tissue), 혈액(Blood), 체액(Body Fluid), 소변(Urine), 타액(Saliva) 등과 같은 임상적 평가에 사용될 수 있는 검체(Clinical Specimen)는 물론, 연구용 시료나 식품 내에 존재하는 뎅기 바이러스의 존재 유무 판단 및 뎅기 바이러스를 구성하는 단백질 바이오마커의 양을 객관적으로 분석하는데 활용될 수 있는 기술이다.

뎅기 바이러스(Dengue Virus)는 대표적인 모기매개(Mosquito-Borne) 바이러스 중의 하나로, 뎅기열(Dengue Fever)을 유발하는 바이러스다. 뎅기 바이러스는 단일 (+)가닥 RNA 바이러스(Single Positive-Stranded RNA Virus)로, 플라비비리데과(Flaviviridae Family)의 하위 속인 플라비바이러스속(Flavivirus Genus)에 해당한다(Rodenhuis-Zybert et al., Cell. Mol . Life Sci . (2010) Vol. 67, pp. 2773-2786., Guzman et al. Nat. Rev. Dis . Primers (2016) Vol. 2, pp. 16055.). 플라비바이러스속에는 여러 종(Species)의 바이러스가 있으며, 진드기매개 바이러스(Tick-Borne Virus) 및 모기매개 바이러스(Mosquito-Borne Virus)로 나뉠 수 있다. 모기매개 바이러스에는 뎅기 바이러스 외에도 지카 바이러스(Zika Virus), 황열 바이러스(Yellow Fever Virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese Encephalitis Virus), 세인트루이스뇌염 바이러스(St. Louis Encephalitis virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus) 등이 있다.

플라비바이러스는 모두 공통의 구조를 가지고 있다. 구형(Spherical)의 구조로 크기는 40~65 nm이며, 약 10,000~11,000개의 염기(Base)로 구성되어 있다. 외피 단백질(Envelope Protein)과 정이십면체형의 캡시드 단백질(Icosahedral-Like Nucleocapsid Protein)은 대칭형태이며, 바이러스의 외형은 전자현미경으로 관찰이 가능하다. 플라비바이러스를 구성하는 단백질은 크게 구조단백질(Structural Protein)과 비구조단백질(Non-Structural Protein)로 분류할 수 있으며, 구조단백질에는 캡시드 단백질(Capsid Protein), 전구체 막 단백질(Precursor Membrane Protein), 막 단백질(Membrane Protein), 외피 단백질(Envelope Protein) 등이 있으며, 비구조단백질에는 비구조단백질 1(Non-Structural Protein 1, NS1), 비구조단백질 2A(NS2A), 비구조단백질 2B(NS2B), 비구조단백질 3(NS3), 비구조단백질 4A(NS4A), 비구조단백질 4B(NS4B), 비구조단백질 5(NS5) 등이 있다. 아직까지 모든 단백질의 기능이나 역할이 규명되지는 않았지만, 전구체 막 단백질, 외피 단백질, 비구조단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B의 일부, 비구조단백질 4A 및 4B의 일부가 바이러스 외부에 노출되어 있는 것으로 파악되고 있다(ViralZone, http://viralzone.expasy.org/24). 따라서 플라비바이러스에 해당하는 뎅기 바이러스를, 항체를 이용하여 검출하고자 할 경우 뎅기 바이러스의 외부에 노출되어 있어 항체와의 접근 및 결합(또는 반응)이 용이한 외피 단백질, 비구조단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B, 비구조단백질 4A 및 4B 등이 유용한 바이오마커(타겟, 목표물질)라고 할 수 있다.

뎅기 바이러스가 유발하는 뎅기열은 전 세계적으로 100여개 이상의 국가에서 발생하며, 대한민국에서 제4군 법정전염병으로 지정되어 있다. 전 세계 인구 중 약 40%(25억 명) 이상의 인구가 뎅기 바이러스 감염의 위험에 노출되어 있는 것으로 추정되고 있다. 뎅기 바이러스에 감염되면 일반적으로 근육통, 관절통을 동반한 고열이나 발진이 일어난다고 알려져 있으며, 심한 경우에는 뎅기 출혈열(Dengue Hemorrhagic Fever) 또는 뎅기 쇼크 증후군(Dengue Shock Syndrome)과 같은 증상이 나타나기도 한다. 뎅기 쇼크 증후군은 적절한 치료를 받지 못할 경우 사망률이 20%에 이를 수 있다고 알려져 있다(대한민국 질병관리본부(KCDC) 감염병관리 > 질병정보 > 뎅기열(Dengue fever) (2018)). 말라리아(Malaria)나 황열(Yellow Fever)에 비해 사망률은 훨씬 낮지만, 아직까지 특별한 예방주사나 치료제는 없다. 잠복기간은 4~7일 이며, 발병 시 오한을 동반한 고열이 3~4일정도 나타나는 경우가 많다. 뎅기열은 동남아시아 지역에서 주로 토착화 되었던 병으로 알려져 있지만, 최근 전 세계의 열대ㆍ아열대ㆍ온대 지역이 확대됨에 따라 말라리아와 함께 대표적인 전염병으로 널리 알려져 있다(대한민국 질병관리본부(KCDC) 감염병관리 > 질병정보 > 뎅기열(Dengue Fever) (2018)). 또한 지구온난화에 의한 열대ㆍ아열대ㆍ온대지역의 확대로 인해 뎅기 바이러스의 숙주인 이집트 숲모기(Aedes aegypti)와 흰줄 숲모기(Aedes albopictus)의 서식지가 확대되고 있다(Kraemer et al., eLife (2015) Vol. 4, pp. e08347). 따라서 뎅기 바이러스의 감염위험 지역이 점차 넓어지고 있는 상황이며, 이를 반영하듯 전 세계에서는 지난 50년 동안 뎅기 바이러스 감염 환자의 수가 약 30배 이상 증가한 것으로 보고되고 있으며, 발생 국가 또한 3개국에서 128개국으로 증가한 것으로 보고되고 있다(조승희 외, 주간 건강과 질병 (2016), Vol. 9, pp. 139-143.).

현재까지 뎅기열과 같은 감염증에 대한 명확한 치료 방법은 없지만, 수액 요법을 통해 고열 및 통증 등을 치료하고 있다. 뎅기열을 예방하기 위해 사노피 파스퇴르(Sanofi Pasteur) 사에서 뎅기 바이러스 백신인 뎅그박시아(Dengvaxia)를 세계 최초로 상업화 하는데 성공했지만, 2018년 필리핀에서 보고된 사망과 같은 부작용 사례로 인해 안정성 문제가 대두되고 있다(Aguiar et al., Clin . Infect. Dis . (2018) Vol. 66, pp. 641-462., Fatima et al., J. Glob. Heath (2018) Vol. 8, pp. 010312.). 치사율이 20%를 넘는 것으로 알려져 있는 뎅기 출혈열이나 뎅기 쇼크 증후군의 경우 바이러스 감염 조기 진단을 통해 적절한 치료를 수행한다면, 치사율을 1% 정도까지 낮출 수 있는 것으로 알려져 있다(염준섭, Korean Med . Assoc . (2017) Vol. 2017, pp. 468-474.). 따라서 조기에 고감도로 뎅기 바이러스를 검출하는 기술과 뎅기열을 진단할 수 있는 기술이 어느 때 보다도 중요한 상황이다.

뎅기 바이러스 검출 기술 및 뎅기 바이러스 감염증 진단 기술은 크게 1) 항원-항체 반응을 이용하는 면역분석법(Immunoassay), 2) 바이러스의 핵산(유전자)을 검출하는 분자진단법(Molecular Diagnostics), 3) 바이러스 배양법과 같이 크게 3가지로 분류할 수 있다. 이 중에서도 면역분석법은 분자진단법이나 바이러스 배양법에 비해 분석법이 비교적 간단하고 분석에 소요되는 시간이 짧기 때문에 신속한 검출이 가능하다는 장점이 있다. 면역분석법도 검출하고자하는 물질의 종류에 따라 혈청학적(또는 항체) 검출법(Serological (or Antibody) Detection) 및 항원 검출법(Antigen Detection)으로 다시 세분화 할 수 있다. 특히 미국 CDC (Centers for Disease Control and Prevention)에서는 혈청학적 검출법인 MAC-ELISA (IgM Antibody Capture ELISA)를 뎅기 바이러스 감염 여부 확인을 위한 표준 진단법 중의 하나로 권고하고 있지만(미국 CDC, https://www.cdc.gov/Dengue/clinicalLab/laboratory.html), 궁극적으로 뎅기 바이러스만을 구별하여 진단하는 것에는 한계가 있다.

특히, 뎅기 바이러스는 같은 생물학적 속에 해당하는 지카 바이러스와 마찬가지로 감염 초기에는 발열, 발진, 구토, 근육통 등의 공통적인 증상을 나타내 감염증을 구별하기 어렵지만, 일부 병증이 진행되거나 심각한 경우에는 뎅기 바이러스는 출혈열, 쇼크 등을 나타내는 반면 지카 바이러스의 경우 소두증(Microcephaly), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 신경계 손상 등을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에 두 바이러스의 정확한 구별이 필요하다(Honein et al., JAMA (2017) Vol. 317, pp. 59-68., Attar, Nat. Rev. Micro. (2016) Vol. 14, pp. 62., Cao-Lormeau et al., Lancet (2016) pp. 1531-1539.). 또한 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 최초 감염(Primary Infection), 2차 감염(Secondary Infection) 및 교차 감염(Cross Infection)에 따른 감염 증상 및 면역 반응이 일부 달라질 수 있는 것으로 보고되고 있기 때문에, 뎅기 바이러스와 지카 바이러스에 대한 구별이 더욱 중요한 상황이다(Bardina et al., Science (2017) Vol. 356, pp. 175-180., Tsai et al., Clin . Infect. Dis . (2017) Vol. 65, pp. 1829-1836., Herrera et al., mBIO (2018) Vol. 9, e00755-18.).

하지만 뎅기 바이러스와 지카 바이러스는 약 70% 이상이 동일하거나 특징이 유사한 아미노산으로 구성되어 있기 때문에, 바이러스 감염으로 인해 체내에 생성된 IgM나 IgG와 같은 이뮤노글로불린(Immunoglobulin)을 검출하는 혈청학적 검출법은 궁극적으로 뎅기 바이러스만을 특이적으로 검출하기 어렵다는 단점이 있다(최재원 외, 한국콘텐츠학회논문지 (2018), Vol. 18, pp. 99-113.). 또한 IgM의 경우 뎅기 바이러스 감염 즉시 생성되는 것이 아니라 수 일에 걸쳐서 체내의 면역반응을 통해 생성되기 때문에 조기 진단이 어렵고, IgG의 경우에는 IgM보다 생성되는데 시간이 더 오래 걸리며 최초 감염이 아닌 경우 이전의 감염으로 인해 체내에 생성된 항체일 수 있어 위양성(False-Positive)의 결과를 초래할 수 있다. 그렇기 때문에 뎅기 바이러스를 구성하는 특정 단백질을 바이오마커로 정하여, 오직 뎅기 바이러스의 단백질 바이오마커와 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용한 항원 검출법이 뎅기 바이러스의 조기 검출 및 특이 진단에 유리하다고 할 수 있다.

따라서 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하기 위해, 뎅기 바이러스의 단백질 바이오마커와는 결합하지만 다른 플라비바이러스들의 바이오마커와는 결합하지 않는 단일클론항체들을 이용한 단일클론항체 칩(Monoclonal Antibody Chip) 및 이를 이용한 샌드위치 면역분석법(Sandwich Immunoassay)을 개발하였으며, 이의 용도에 대해 기술하고자 한다.

대한민국 등록특허 제10-1520084호

본 발명의 목적은 뎅기 바이러스의 검출 방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

뎅기 바이러스(Dengue Virus)의 비구조단백질 1(Non-Structural Protein 1, NS1)에 특이적으로 결합하는 포획 항체(Capture Antibody)를 고정하는 단계;

개체로부터 분리된 생물학적 샘플을 접촉하는 단계;

뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 프로브 항체(Probe Antibody)를 접촉하는 단계; 및

뎅기 바이러스 비구조단백질 1과 포획 항체 및 뎅기 바이러스 비구조단백질 1과 프로브 항체 간의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 뎅기 바이러스 비구조단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 프로브 항체는 형광물질, 양자 점(Quantum dot), 금속 나노입자(Metal Nanoparticle), 겨자무 과산화효소(Horseradish Peroxidase), 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline Phosphatase), 라만 리포터(Raman Reporter), 란탄족 원소(Lanthanide), 전기화학발광 태그(Electrochemiluminescence Tag), 탄소 나노튜브(Carbon Nanotube) 또는 그래핀(Graphene)에 컨쥬게이션한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 포획 항체와 프로브 항체는 동종(Same Species)의 항체 쌍인 것이다.

상기 동종의 항체 쌍은 마우스 항체-마우스 항체 쌍(Mouse Antibody-Mouse Antibody Pair), 토끼 항체-토끼 항체 쌍(Rabbit Antibody-Rabbit Antibody Pair), 래트 항체- 래트 항체 쌍(Rat Antibody-Rat Antibody Pair) 또는 산양 항체-산양 항체 쌍(Goat Antibody-Goat Antibody Pair)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 단일클론항체 쌍은 뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 프로브 항체인 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 포획 항체의 농도는 0.1 μg/ml 내지 200 μg/ml인 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 생물학적 샘플은 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨인 것이다.

본 발명의 샌드위치 면역분석법 기반의 뎅기 바이러스의 검출방법은 뎅기 바이러스(Dengue Virus)를 구성하는 단백질 바이오마커(Biomarker) 검출을 통해 뎅기 바이러스의 존재 유무를 확인하는데 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과 사진이다.
도 2는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체 10종을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과 사진이다.
도 3은 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체의 해리상수(결합친화도)에 대한 결과 그래프이다.
도 4는 뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체 9종에 각각 Alexa Fluor 546 형광 염료(Fluorescent Dye)를 표지(Labeling)한 다음, 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동을 수행한 결과 사진이다.
도 5는 단일클론항체 칩을 이용한 최적의 포획 항체(Capture Antibody)-프로브 항체(Probe Antibody) 쌍 선별과정에 대한 모식도(도 5a) 및 결과 사진(도 5b)이다.
도 6은 단일클론항체 칩을 이용한 뎅기 바이러스 비구조단백질 1의 검출 결과에 대한 사진 및 그래프이다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하도록 한다.

본 발명은 뎅기 바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 뎅기 바이러스 또는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 다른 플라비바이러스(특히 지카 바이러스)와의 교차반응 없이 특이적으로 검출할 수 있는 검출(또는 진단)용 조성물, 키트, 검출방법 또는 뎅기열, 뎅기 출혈열, 뎅기 쇼크 증후군과 같은 뎅기 바이러스 감염증을 진단하는데 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명은,

개체로부터 분리된 생물학적 샘플을 접촉하는 단계;

본 발명은 종래의 여러 종류의 면역분석법과 달리, 뎅기 바이러스를 구성하는 단백질 바이오마커에만 특이적으로 결합하는 1쌍의 단일클론항체를 이용하여 다른 플라비바이러스(Flavivirus)와 교차반응(Cross-Reactivity) 없이 오직 뎅기 바이러스만을 선택적으로 검출하는데 활용될 수 있다. 또한 동종(Same Species)의 항체 쌍을 이용하기 때문에 항체 간의 교차반응(Cross-Reactivity)이 없어 종래에 샌드위치 면역분석법(Sandwich Immunoassay)에 주로 이용되는 이종(Different Species)의 항체시스템을 이용할 필요가 없다는 장점이 있다(ex) 토끼 항체-마우스 항체 쌍(Rabbit Antibody-Mouse Antibody Pair), 산양 항체-마우스 항체 쌍(Goat Antibody-Mouse Antibody Pair), 산양 항체-토끼 항체 쌍(Goat Antibody-Rabbit Antibody Pair) 등). 더 나아가 기존의 샌드위치 면역분석법에서 신호 검출에 필수적인 2종류의 항체(목표물질과 결합한 항체 및 그 항체에 결합가능한 프로브 항체(2차 항체)) 시스템과 달리 1종류를 직접적인 프로브(Probe)로 이용하기 때문에, 현재 이용되는 대부분의 방법인 2차 항체(Secondary Antibody) 시스템을 이용할 필요가 없어 간단하다는 장점이 있다.

본 발명은 조직(Tissue), 혈액(Blood), 체액(Body Fluid), 소변(Urine), 타액(Saliva) 등과 같은 임상적 평가에 사용될 수 있는 검체(Clinical Specimen)는 물론, 연구용 시료나 식품 내에 존재하는 뎅기 바이러스의 존재 유무 판단 및 뎅기 바이러스를 구성하는 단백질 바이오마커의 양을 객관적으로 분석하는데 활용될 수 있으며, 분석을 위한 시료 요구량이 1 ㎕ 내외 밖에 되지 않기 때문에 기존 방법들에 비해 경제적이다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 뎅기 바이러스 검출방법 및 뎅기 바이러스 감염증의 진단 방법은 '포획(Capture) 단일클론항체'-'뎅기 바이러스 비구조단백질 1'-'프로브(Probe) 단일클론항체'로 이어지는 즉, 항체-항원-항체 복합체(Complex) 형성을 확인하여 뎅기 바이러스 또는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 검출할 수 있다.

여기서, 상기 '항체-항원-항체 복합체' 형성은 비색법(Colorimetric Method), 전기화학법(Electrochemical Method), 형광법(Fluorometric Method), 발광법(Luminometry), 입자계수법(Particle Counting Method), 흡광법(Absorbance Measurement), 분광법(Spectrometric Method), 라만분광법(Raman Spectroscopic Method), 표면플라즈몬공명법(Surface Plasmon Resonance Method), 간섭계법(Interferometric Method), 육안측정법(Visual Assessment) 및 섬광계수법(Scintillation Counting Method)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일반적으로 항체, 항체의 절편(단편, 일부분), 유사 기능물과 같은 물질들의 경우 면역진단기술에서 핵심적인 역할을 하는 물질(원료)이다. 면역진단기술의 경우, 외부 생명체(또는 물질)로부터 기인하거나 생체 내의 변이로 인해 생성된 항원(Antigen)을 검출하거나, 상기 항원으로부터 생성된 항체(Antibody) 검출을 통한 방법이 일반적이다. 특히, 뎅기 바이러스 검출(또는 진단)을 위한 면역진단기술의 경우 뎅기 바이러스 감염으로부터 체내에 생성된 항체(이뮤노글로불린)의 일종인 IgA, IgM, IgG 중의 하나 혹은 그 이상, 또는 이들의 비율을 검출하는 것이 보편적으로 이용되고 있다(Zhang et al., Nat. Med . (2017) Vol. 23, pp. 548-550., Balmaseda et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . (2017) Vol. 114, pp. 8384-8389.). 하지만, 체내에 생성된 항체를 검출할 경우, 이들은 세포융합기술에 의해서만 만들어질 수 있는 단일클론항체가 아닌 '다클론항체(Polyclonal Antibody, pAb)'이기 때문에 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 뿐만 아니라 다른 진드기매개 바이러스, 모기매개 바이러스의 비구조단백질 1과 교차반응을 할 수 있다. 특히 뎅기 바이러스와 같은 속에 해당하는 지카 바이러스와 같은 플라비바이러스들의 비구조단백질 1과도 결합(또는 반응)할 수 있다. 따라서 체내에 생성된 IgA, IgM 또는 IgG와 같은 항체 검출을 통한 뎅기 바이러스의 구별 진단은 궁극적으로 불가능하다.

또한, 항체검출을 통한 진단기술의 경우(특히 IgG), 체내에서 검출 가능한 항체가 충분히 생성되기까지 1~2주 정도 혹은 그 이상의 시간이 소요되기 때문에, 조기진단이 불가능하다는 단점이 있다. 그러나 비구조단백질 1은 바이러스 감염 초기부터 바이러스 복제(또는 증식)과정에서 상대적으로 비율이 높아지는 단백질로 알려져 있기 때문에, 감염 후 7~10일 이내의 뎅기 바이러스 특이적인 조기진단에 매우 유용하다. 바이러스 검출(또는 진단)기술 외에도 뎅기 바이러스의 예방, 치료, 역가측정 등 관련 연구 및 개발에서 유용하게 사용될 수 있다.

따라서 본 발명자들은 항체검출이 아닌 항원검출을 통한 진단기술을 개발하고자, 뎅기 바이러스 특이적 검출을 위한 샌드위치 면역분석법 기반을 이용한 검출방법을 제공하고자 한다.

본 발명에서 '뎅기 바이러스의 비구조단백질 1'은 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체ㆍ돌연변이체뿐만 아니라 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함한다. 또한 '뎅기 바이러스의 비구조단백질 1'은 종(Species)이나 혈청형(Serotype), 균주(Strain), 데이터베이스(Database)에 따라 일부 차이가 있을 수 있기 때문에, 비구조단백질 1을 암호화하는 부위의 일부, 암호화 부위의 전ㆍ후 아미노산 서열 일부가 포함되거나 생략될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1은 뎅기 바이러스의 단백질을 암호화하는 약 3,400개 아미노산 중에서 비구조단백질 1을 암호화하는 352개의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 '항체'는 천연의 혹은 부분 또는 전부 합성된, 예컨대 재조합으로 제조된, 전장의 이뮤노글로불린(Full-Length IgG)의 특이성 및 결합력을 보유하는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역(Variable Domain)의 일부 이상을 포함하는 임의의 단편을 포함하는, 이뮤노글로불린 및 이뮤노글로불린 단편을 나타낸다. 따라서 항체는 이뮤노글로불린의 항원 결합 도메인과 상동이거나, 실질적으로 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질(또는 펩타이드)을 포함한다. 상기 항체는 합성 항체, 재조합적으로 제조된 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간유래 항체, 비-인간유래 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 항체는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, 이황화결합 Fv (dsFv), Fd 단편, Fd' 단편, 단일사슬 Fv (scFv), 단일사슬 Fab (scFab), 디아바디(Diabody), 나노바디(Nanobody), 미니바디(Minibody) 또는 상기 중 임의의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.

특히 본 발명의 항체는 '단일클론항체'로서, 본 발명의 용어 '단일클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로 단일 항원선 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 다클론항체는 일반적으로 교차반응이 있어 특이성이 낮고, 항혈청의 로트(Lot)마다 항체가 및 특이성이 변동하는 결점이 있기 때문에, 다클론항체를 이용한 진단시약의 제조는 본질적으로 품질관리가 어렵다는 문제점이 있는 반면, 단일클론항체는 항원-항체결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다. 또한, 본 발명의 단일클론항체는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합한다. 이에 제한되는 것은 아니나 본 발명의 일 실시예에서 측정된 본 발명의 단일클론항체의 뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 대한 해리상수(K_D)는 1.0×10^-10M 내지 2.0×10^-8M이며, 측정방법에 따라 해리상수의 차이가 날 수 있으므로 본 발명의 단일클론항체는 1×10^-11M 내지 2×10^-7M 범위의 해리 상수를 가질 수 있다.

본 발명의 단일클론항체는 종래 기술인 하이브리도마 생산방법에 따라 제작하였으며, 'Kohler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46.' 에 상세하게 기재되어 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 면역화된 마우스의 비장세포(항체 생산세포)를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서상의 '검출'은 항체-항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용한다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소, 금속 나노입자, 란탄족(Lanthanide) 원소, 라만 리포터(Raman Reporter), 전기화학적 태그, 자성입자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다. 바람직하게는, 항체-항원-항체 복합체를 형광(Fluorescence) 측정 기반을 이용하여 검출할 수 있다.

또한 본 명세서상의 '검출'은 표지체를 사용하지 않는 비표지(Label-Free) 방식으로도 가능하다. 구체적으로는 표면플라즈몬공명(Surface Plasmon Resonance), 등온 적정 칼로리메트리(Isothermal Titration Calorimetry), 바이오-층 간섭계법(Bio-Layer Interferometry) 중 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다.

본 발명의 뎅기 바이러스의 검출을 위한 단일클론항체 쌍은, 이용되는 항체가 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단일클론항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')₂, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 선별적으로 인지하는 단일클론항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구 및 시약이 포함될 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

또한 본 발명의 일 실시예로서 상기 단일클론항체 쌍을 생물학적 시료와 접촉시켜, 항체-항원-항체 복합체 형성을 형광을 통해 확인함으로써, 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 검출하는 뎅기 바이러스의 검출 방법에 대하여 개시된다.

본 발명에서 '생물학적 시료'란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 뇨 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체 또는 동일한 에피토프를 특이성을 가지는 항체와 반응시켜서 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1의 존재 여부 또는 발현 여부를 측정할 수 있다.

'항체-항원-항체 복합체'는 생물학적 시료중의 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1의 존재 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 단일클론항체 쌍과의 결합물을 의미한다. 또한 뎅기 바이러스 자체와 상기 단일클론항체의 결합물을 의미한다.

상기한 항체-항원-항체 복합체의 형성은 비색법(Colorimetric Method), 전기화학법(Electrochemical Method), 형광법(Fluorometric Method), 발광법(Luminometry), 입자계수법(Particle Counting Method), 흡광법(Absorbance Measurement), 분광법(Spectrometric Method), 라만분광법(Raman Spectroscopic Method), 표면플라즈몬공명법(Surface Plasmon Resonance Method), 간섭계법(Interferometric Method), 육안측정법(Visual Assessment) 및 섬광계수법(Scintillation Counting Method)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이하에서 설명되는 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 예시로서 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.

< 실시예 1: 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 준비 >

뎅기 바이러스 혈청형 2(Serological Type 2, Serotype 2) 단백질을 암호화하는 약 3,400개 아미노산 중에서 비구조단백질 1을 암호화하는 352개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였다.

본 발명의 뎅기 바이러스 비구조단백질 1의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시된다.

비구조단백질 1은 순수 분리ㆍ정제를 위해 N말단에 폴리히스티딘이 연결된 형태(His-Tagged)를 이용하였으며, 세포배양을 통해 인간유래 세포에서 발현되어 Ni-NTA 레진(Nickel-Nitrilotriacetic Acid Resin)을 사용하여 친화크로마토그래피(Affinity Chromatography) 방법으로 비구조단백질 1을 순수 분리ㆍ정제하였다. 분리ㆍ정제된 비구조단백질 1은 단백질 전기영동 기술인 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)를 통해 확인하였다.

도 1은 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과를 나타낸 것이다. 도 1에 나타낸 바와 같이 352개 아미노산의 분자량 부근인 약 45 킬로달톤(Kilodalton, kDa) 부근에서 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2: 하이브리도마 제작 및 단일클론항체 정제 >

세포융합은 기존에 잘 알려진 하이브리도마 생산기술(Kohler et al., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre et al., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46.)을 통해 이루어졌다. 상기 실시예 1의 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 면역화된 마우스로부터 비장(Spleen)을 적출한 다음, 조직분쇄기로 비장을 분쇄하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 비장세포(Splenocyte)를 계수하였다. 다음 37℃, 5% CO₂의 세포배양기에서 배양한 T75 플라스크에 있는 마우스 골수종세포(myeloma, Sp2/0-Ag14)를 회수하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 같은 방법으로 계수하였다. 계수한 마우스의 비장세포와 골수종세포가 세포수를 기준으로 5:1이 되도록 하나의 50 ㎖ 튜브에 옮겨 담은 뒤, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 50%의 PEG1500(Polyethylene Glycol) 1 ㎖를 처리하고, 20 ㎖의 37℃ RPMI 1640 배지, 19 ㎖의 37℃ RPMI 1640 배지를 순차적으로 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시켜 세포융합이 일어나도록 하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수한 다음, HAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine)을 함유하고 있는 RPMI 1640 배지(HAT 배지)를 첨가하여(10⁷개의 Splenocytes 당 10 ㎖ HAT 배지) 세포를 현탁한 다음 세포배양용 96-well plate의 각각의 well에 분주해주었다. 이후 37℃, 5% CO₂의 조건으로 세포배양기 내에서 배양하였다. 상기 하이브리도마를 10일 간 배양한 다음, 육안이나 현미경을 통해 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것이 확인되면, 96-well plate의 각각의 well의 기존 HAT 배지를 제거한 다음 새로운 HAT 배지 150 ㎕를 첨가하여 3일간 추가적으로 배양하였다. 이후 96-well plate 내 각각의 well로부터 배지 100 ㎕를 취하여 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하여 Indirect ELISA를 수행하여 반응성이 나타나는 하이브리도마들을 24-well plate에서의 배양을 거쳐 6-well plate로 옮겨 배양하였다. 추가적인 반응성 검사를 수행한 다음 하이브리도마 세포를 계수하여, 1개의 96-well plate 당 50개~100개의 하이브리도마 세포가 들어가도록 하여 서브-클로닝 과정을 진행하였다. 보다 확실한(안정한) 단일클론의 하이브리도마 세포주가 얻어질 때까지 같은 과정을 반복하여 클로닝을 수행하였다.

생후 12주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 Incomplete Freund's Adjuvant 500 ㎕와 상기 실시예 5로부터 얻어진 하이브리도마 세포주를 1 X 10⁶ ~ 5 X 10⁶ 개의 세포가 되도록 멸균된 PBS (pH 7.4) 용액으로 현탁한 세포현탁액 500 ㎕를 각각 주입하였다. 약 1~2주 사이에 복수(Ascites) 생성으로 인해 부푼 마우스의 복강 내에 존재하는 하이브리도마로부터 생성된 다량의 단일클론항체가 포함되어 있는 복수를 채취하였다. 이는 실시예 일 뿐, 대량의 마우스 생체 외 세포배양(In vitro cell culture)을 통해서도 단일클론항체 획득이 가능하다. 채취한 마우스 복수를 원심분리기를 이용하여 3,000 rpm, 4℃ 조건으로 30분간 원심분리를 수행한 후, 일부 섞여있을 수 있는 혈구층(Blood Layer)과 지질층(Lipid Layer)을 제거하여 단일클론항체가 다량 포함되어 있는 복수층(Ascites Layer)만을 분리한다.

상기의 과정을 통해 정제된 복수를 필터해준 다음, 20 mM KH₂PO₄ (pH 7.4) 용액으로 평형화 해 준 Protein G 레진이 충진(Packing)되어 있는 컬럼(Column)에 흘려주었다. 복수를 모두 흘려준 다음, 다시 20 mM KH₂PO₄ (pH 7.4)를 이용하여 비특이적으로 결합되어 있거나 끼어있는 단일클론항체 이외의 불순물들을 제거해 주었다. 이후 모든 불순물을 제거한 다음, 0.1 M Glycine (pH 2.8) 용액을 흘려주어 Protein G와 결합되어 있는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 용출시켜주었으며, 용출되는 즉시 pH 중화(Neutralization)를 위해 1 M Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 용출액의 1/3에서 1/5 정도의 양이 되도록 1 방울씩 떨어뜨려 주었다. 이후 단일클론항체 용출액의 버퍼(용액)를 교환해주기 위해 PBS 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 이상 투석을 2회 반복하여 고농도의 염을 제거해주었다. 투석이 완료된 단일클론항체는 필터를 통해 응집물(Aggregate)을 제거한 다음, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이후 도 2에 나타낸 바와 같이 단백질 전기영동을 수행하여 Coomassie Blue 염색을 통해 고순도의 단일클론항체를 확인하였다. 도 2에서 볼 수 있는 것처럼, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 항체의 중쇄(Heavy Chain)와 경쇄(Light Chain)만을 관찰할 수 있었기 때문에, 단일클론항체의 분리ㆍ정제가 잘 이루어졌다고 판단하였다.

< 실시예 3: 이소타입 확인 및 해리상수 측정 >

상기 실시예 2로부터 순수 분리ㆍ정제된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체의 이소타입을 확인하기 위해, 마우스 IgA, IgG₁, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃, IgM에 각각 특이적으로 결합하는 염소의 항체를 1 ㎍/㎖의 농도가 되도록 PBS (pH 7.4) 용액을 이용하여 희석시킨 다음 효소면역흡착검사용 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% PBS/T (0.1% Tween-20이 포함된 PBS) 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 다음은 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 well에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 그 다음 0.1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 상기 실시예 6으로부터 준비된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 100 ㎕ 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켜주었으며, 반응이 끝난 후 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-Mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 well에 분주하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop Solution)인 0.2 N H₂SO₄를 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 이소타입 반응성에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 이소타입을 확인하였다. 이로부터 상기 실시예 2로부터 분리ㆍ정제된 단일클론항체의 이소타입은 [표 1]에 나타낸 바와 같이 IgG₁ 또는 IgG_2a임을 확인할 수 있었다.

상기 실시예 2로부터 순수 분리ㆍ정제된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체와 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과의 해리상수(Dissociation Constant, K_D) 또는 결합친화도(Binding Affinity)를 측정하기 위해 상기 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1이 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트를 준비하였다. 상기 단일클론항체를 100 나노몰(nM)로 부터 PBS 용액을 이용하여 100 nM부터 1/2씩 연속적으로 희석하여 15개 서로 다른 농도 및 0 nM을 포함하여 총 16개의 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, 이들을 각각의 well에 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 well에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop Solution)인 0.2 N H₂SO₄를 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 농도의 단일클론항체에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그래프를 도 3에 나타내었다. 이로부터 상기 실시예 2로부터 분리ㆍ정제된 단일클론항체와 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1의 해리상수(Dissociation Constant (K_D) 또는 결합친화도)는 0.18±0.01 nM에서 16.00±2.50 나노몰 (nM) 범위임을 확인할 수 있었다.

	이소타입 (Isotype)	해리상수(K _D )
클론 1 (Clone 1)	IgG₁	0.38 ± 0.01 nM
클론 2 (Clone 2)	IgG₁	0.50 ± 0.03 nM
클론 3 (Clone 3)	IgG_2a	0.18 ± 0.01 nM
클론 4 (Clone 4)	IgG₁	0.61 ± 0.04 nM
클론 5 (Clone 5)	IgG₁	2.97 ± 0.35 nM
클론 6 (Clone 6)	IgG₁	0.36 ± 0.01 nM
클론 7 (Clone 7)	IgG₁	16.00 ± 2.50 nM
클론 8 (Clone 8)	IgG₁	3.56 ± 0.49 nM
클론 9 (Clone 9)	IgG₁	0.79 ± 0.05 nM
클론 10 (Clone 10)	IgG₁	0.58 ± 0.03 nM

< 실시예 4: 단일클론항체의 형광물질 표지( Fluorophore Labeling) >

단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스 비구조단백질 1의 고감도 분석을 위해 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 형광물질(Fluorophore 또는 Fluorescent Dye)로 표지하여 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트(Conjugate)를 준비하였다. 형광물질로는 Alexa Fluor 546 (AF546)을 이용하였으며, AF546 Protein Labeling Kit를 사용하여 제조사인 Thermo Fisher Scientific에서 제공된 실험방법을 바탕으로 컨쥬게이션을 진행하였다. 2 mg/mL 농도를 갖는 뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체 10종 중에서 다른 클론에 비해 낮은 해리상수를 갖는 클론 7을 제외한 9종의 단일클론항체를 각각 0.1 M NaHCO₃용액 및 AF546 용액과 섞어준 다음 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이후 용액 내에 남아있는 반응하지 않은 AF546 형광물질를 제거하기 위하여 정제용 레진(Resin)에 흘려주어 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트만을 선택적으로 분리하였다. 컨쥬게이트의 농도를 결정하기 위해 280 nm (단백질) 및 554 nm (AF546)에서의 흡광도를 동시에 측정하였다. 측정한 흡광도를 바탕으로 9종 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트의 농도 및 표지 효율(Labeling Efficiency)를 계산하였다. 9종의 단일클론항체와 형광물질의 컨쥬게이션(Conjugation)이 잘 이루어졌는지 확인하기 위해, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 9종의 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트를 2 μg씩 로딩한 후에 전기영동을 진행하였으며, 도 4에 나타난 바와 같이 겔 다큐멘테이션(Gel Documentation) 시스템을 이용하여 빛을 쪼여주어 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트를 확인하였다.

< 실시예 5: 단일클론항체 칩 제작 및 단일클론항체 쌍 선별 >

단일클론항체 칩에 사용할 글라스 슬라이드(Glass Slide)를 메탄올(CH₃OH)과 35%의 염산(HCl)이 1:1 비율로 배합된 용액에 실온에서 30분간 담가 두었다. 이후 황산(H₂SO₄)과 과산화수소수(H₂O₂) 3:1 비율로 배합된 용액에 실온에서 10분간 담가둔 다음, 증류수를 이용해 세척하여 건조시켰다. 3% APS (3-amino-propyl triethoxysilane)가 함유된 톨루엔(C₇H₈) 용액에 건조시킨 글라스 슬라이드를 상온에서 6시간 동안 담가 아민화(Amination) 시켰다. 톨루엔과 에탄올(C₂H₅OH)을 이용해 순차적으로 세척하고 100℃에서 1시간 동안 건조시켰다. 이후 단일클론항체의 균일한 고정을 위한 시약인 Calixarene 유도체 A를 10 mM이 되도록 클로로포름(CHCl₃) 용액에 녹여준 다음, 글라스 슬라이드를 상온에서 3시간 동안 담가 두었다. 마지막으로 클로로포름과 에탄올을 이용해 세척한 후 건조시켜 보관하였다.

우선 뎅기 바이러스 비구조단백질 1 검출을 위한 단일클론항체 칩의 성능 평가를 위해 단일클론항체 쌍(Pair)을 이용한 샌드위치 면역분석시험(Sandwich Immunoassay)을 수행하였다. 우선 동일한 양의 뎅기 바이러스 비구조단백질 1을 가장 높은 민감도로 검출이 가능한 최적의 단일클론항체 쌍을 찾기 위해 상기한 아민화 칩을 이용하였다. 10종의 단일클론항체를 각각 1 μM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅(Spotting)한 다음 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 단일클론항체를 고정한 후, 5%의 BSA 및 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹(Blocking)을 진행하였다. 다음에는 10종의 단일클론항체가 고정되어 있는 각각의 well에 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 50 nM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅하여 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 이후 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 10분씩 3번 세척하고, 9종의 단일클론항체-AF546 컨쥬게이트를 1 μM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 마찬가지로 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 10분간 3회의 세척을 해준 다음, 형광 스캐너로 형광 강도(Fluorescence Intensity)를 측정하여 최적의 포획 항체(Capture Antibody) 및 AF546이 표지된 프로브 항체(AF546 Labeled Antibody 또는 Probe Antibody) 쌍을 최종 선정하였다. 이 중에서도 포획 항체 Clone 3-프로브 항체 Clone 2, 포획 항체 Clone 5-프로브 항체 Clone 2, 포획 항체 Clone 5-프로브 항체 Clone 8, 포획 항체 Clone 6-프로브 항체 Clone 2, 포획 항체 Clone 8-프로브 항체 Clone 2, 포획 항체 Clone 9-프로브 항체 Clone 2, 포획 항체 Clone 10-프로브 항체 Clone 2로 구성된 항체 쌍이 다른 항체 쌍과 비교했을 때 비교적 우수한 것으로 나타났으며, 가장 우수한 항체 쌍인 포획 항체인 Clone 8-프로브 항체 Clone 2를 이용하여 추가적인 샌드위치 면역분석시험을 진행하였다.

< 실시예 6: 단일클론항체 쌍을 이용한 바이오마커 검출 >

실시예 5로부터 선정된 단일클론항체 쌍(포획 항체: Clone 8, 프로브 항체: Clone 2)을 이용하여 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1 검출을 위한 민감도 측정을 위해 마찬가지로 위의 실시예 5에서 제작한 단백질 칩을 이용하였다. 포획 항체를 1 μM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅한 다음 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 단일클론항체를 고정한 후, 5%의 BSA 및 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹(Blocking)을 진행하였다. 다음에는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 1 μM부터 1/2씩 연속 희석하여 0 nM을 포함해 서로 다른 15가지의 농도를 갖도록 희석하였다. 각각의 농도로 희석된 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 1 ㎕씩 스팟팅하여 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 이후 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 10분간 3회의 세척을 해준 다음, AF546 표지 항체를 1 μM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 마찬가지로 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 10분간 3회 세척해 해준 다음, 형광 스캐너로 뎅기 바이러스 비구조단백질 1의 농도별 형광 강도를 측정하여 민감도 및 검출한계(Limit of Detection, LOD)를 측정하였다.

그 결과, 단일클론항체 칩은 도 6에 나타낸 바와 같이 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1을 고감도 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method of Detecting Dengue Virus Using Monoclonal Antibody Pair <130> PN1812-542 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> non-structural protein 1 of dengue virus <400> 1 Asp Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr 20 25 30 Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys 35 40 45 Ala His Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu 50 55 60 Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile 85 90 95 Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys 100 105 110 Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser 115 120 125 His Asn Gln Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro 130 135 140 Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe 145 150 155 160 Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp 165 170 175 Val Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg 180 185 190 Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp 195 200 205 Thr Trp Lys Ile Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His 210 215 220 Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu 225 230 235 240 Met Ile Ile Pro Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr 245 250 255 Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys 260 265 270 Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr 275 280 285 Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser 290 295 300 Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro 305 310 315 320 Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala 340 345 350

Claims

뎅기 바이러스(Dengue Virus)의 비구조단백질 1(Non-Structural Protein 1, NS1)에 특이적으로 결합하는 포획 항체(Capture Antibody)를 고정하는 단계;
개체로부터 분리된 생물학적 샘플을 접촉하는 단계;
뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 프로브 항체(Probe Antibody)를 접촉하는 단계; 및
뎅기 바이러스 비구조단백질 1과 포획 항체 및 뎅기 바이러스 비구조단백질 1과 프로브 항체 간의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스의 검출 방법으로서,
상기 포획 항체는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체로 아민화된 슬라이드 글라스(aminated slide glass)에 칼릭스아렌(Calixarene) 유도체에 공유결합을 통해 고정한 후, 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA) 및 트윈-20(Tween-20)이 포함되어 있는 인산완충생리식염수(phosphate buffer saline, PBS)를 이용해 블로킹(blocking)된 것이고,
상기 프로브 항체는 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체로 1차 아민 그룹(primary amine group)에 공유결합을 통해 연결될 수 있는 형광물질을 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 용액과 섞어준 다음 반응시켜 제조된 것이고,
상기 포획 항체 및 프로브 항체의 사용량은 각각 0.15μg 인 것을 특징으로 하는, 단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스의 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뎅기 바이러스 비구조단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스의 검출 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 포획 항체와 프로브 항체는 동종(Same Species)의 항체 쌍인 것인 뎅기 바이러스의 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단일클론항체 쌍은 뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 뎅기 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 프로브 항체인 것인 뎅기 바이러스의 검출 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨인 것인 뎅기 바이러스의 검출 방법.