KR102196156B1 - 황열 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 - Google Patents
황열 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102196156B1 KR102196156B1 KR1020190118151A KR20190118151A KR102196156B1 KR 102196156 B1 KR102196156 B1 KR 102196156B1 KR 1020190118151 A KR1020190118151 A KR 1020190118151A KR 20190118151 A KR20190118151 A KR 20190118151A KR 102196156 B1 KR102196156 B1 KR 102196156B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- yellow fever
- fever virus
- monoclonal antibody
- structural protein
- protein
- Prior art date
Links
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 title claims abstract description 140
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 title claims abstract description 139
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 title claims abstract description 101
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 101
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 48
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 claims abstract description 46
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 25
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- -1 AP) Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 6
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VKYZDCTWJGBFDW-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-2-methylaniline;hydron;chloride Chemical compound Cl.CC1=CC(Cl)=CC=C1N VKYZDCTWJGBFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 9-ethyl-3-carbazolamine Chemical compound NC1=CC=C2N(CC)C3=CC=CC=C3C2=C1 OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 4
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 4
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical group C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 4
- JORABGDXCIBAFL-UHFFFAOYSA-M iodonitrotetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C=CC=CC=2)=N1 JORABGDXCIBAFL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- IPSIPYMEZZPCPY-UHFFFAOYSA-N new fuchsin Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[NH2+])C(C)=CC1=C(C=1C=C(C)C(N)=CC=1)C1=CC=C(N)C(C)=C1 IPSIPYMEZZPCPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 claims description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000219198 Brassica Species 0.000 claims description 3
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 claims description 3
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical compound C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 claims description 3
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 claims description 3
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 claims description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 3
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 claims description 3
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 3
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 2
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 claims description 2
- ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N abts Chemical compound S/1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N\N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 claims 1
- RHCSKNNOAZULRK-APZFVMQVSA-N 2,2-dideuterio-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethanamine Chemical compound NCC([2H])([2H])C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 RHCSKNNOAZULRK-APZFVMQVSA-N 0.000 claims 1
- 241000220259 Raphanus Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 101900129545 Yellow fever virus Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 13
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 101710189818 Non-structural protein 2a Proteins 0.000 description 4
- 101710188652 Non-structural protein 4a Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 101710188653 Non-structural protein 4b Proteins 0.000 description 3
- 101800001141 Serine protease subunit NS2B Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000256111 Aedes <genus> Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 2
- JGAMUXDWYSXYLM-SRVKXCTJSA-N Lys-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JGAMUXDWYSXYLM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- AXFMEGAFCUULFV-BLFANLJRSA-N (2s)-2-[[(2s)-1-[(2s,3r)-2-amino-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC[C@@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AXFMEGAFCUULFV-BLFANLJRSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(carboxymethyl)amino]acetic acid;nickel Chemical compound [Ni].OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALZUKTXGUHPTJD-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3,3-dinitrocyclohexa-1,5-dien-1-yl)-2,6-dinitroaniline Chemical compound [O-][N+](=O)C1([N+]([O-])=O)C(N)C=CC(C=2C=C(C(N)=C(C=2)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)=C1 ALZUKTXGUHPTJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOTGCZBEERTTDQ-UHFFFAOYSA-N 4-Methoxy-1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(OC)=CC=C(O)C2=C1 BOTGCZBEERTTDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N Ala-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VIGKUFXFTPWYER-BIIVOSGPSA-N Ala-Cys-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N VIGKUFXFTPWYER-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- LBYMZCVBOKYZNS-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LBYMZCVBOKYZNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XSLGWYYNOSUMRM-ZKWXMUAHSA-N Ala-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XSLGWYYNOSUMRM-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101100272788 Arabidopsis thaliana BSL3 gene Proteins 0.000 description 1
- HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)CN=C(N)N HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NVUIWHJLPSZZQC-CYDGBPFRSA-N Arg-Ile-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NVUIWHJLPSZZQC-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UTSMXMABBPFVJP-SZMVWBNQSA-N Arg-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UTSMXMABBPFVJP-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- ANAHQDPQQBDOBM-UHFFFAOYSA-N Arg-Val-Tyr Natural products CC(C)C(NC(=O)C(N)CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O ANAHQDPQQBDOBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PPCORQFLAZWUNO-QWRGUYRKSA-N Asn-Phe-Gly Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PPCORQFLAZWUNO-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NCXTYSVDWLAQGZ-ZKWXMUAHSA-N Asn-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O NCXTYSVDWLAQGZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ala-Val Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- KGAJCJXBEWLQDZ-UBHSHLNASA-N Asp-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KGAJCJXBEWLQDZ-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- VHQOCWWKXIOAQI-WDSKDSINSA-N Asp-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VHQOCWWKXIOAQI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BIVYLQMZPHDUIH-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)O BIVYLQMZPHDUIH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- PSLSTUMPZILTAH-BYULHYEWSA-N Asp-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PSLSTUMPZILTAH-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- FMDCYTBSPZMPQE-JBDRJPRFSA-N Cys-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FMDCYTBSPZMPQE-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- LBOLGUYQEPZSKM-YUMQZZPRSA-N Cys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N LBOLGUYQEPZSKM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N Dioxetane Chemical compound C1COO1 BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000015220 Febrile disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- HXOLDXKNWKLDMM-YVNDNENWSA-N Gln-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N HXOLDXKNWKLDMM-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- UXXIVIQGOODKQC-NUMRIWBASA-N Gln-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O UXXIVIQGOODKQC-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- YYOBUPFZLKQUAX-FXQIFTODSA-N Glu-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YYOBUPFZLKQUAX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KRGZZKWSBGPLKL-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N KRGZZKWSBGPLKL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- YRMZCZIRHYCNHX-RYUDHWBXSA-N Glu-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O YRMZCZIRHYCNHX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- OLTHVCNYJAALPL-BHYGNILZSA-N Glu-Trp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OLTHVCNYJAALPL-BHYGNILZSA-N 0.000 description 1
- DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- NTBOEZICHOSJEE-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NTBOEZICHOSJEE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N Gly-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(O)=O OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- ISSDODCYBOWWIP-GJZGRUSLSA-N Gly-Pro-Trp Chemical compound [H]NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ISSDODCYBOWWIP-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 1
- ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(=O)O ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N Gly-Thr-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- WSWWTQYHFCBKBT-DVJZZOLTSA-N Gly-Thr-Trp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O WSWWTQYHFCBKBT-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 1
- BNMRSWQOHIQTFL-JSGCOSHPSA-N Gly-Val-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BNMRSWQOHIQTFL-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- ZYDYEPDFFVCUBI-SRVKXCTJSA-N His-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N ZYDYEPDFFVCUBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- STWGDDDFLUFCCA-GVXVVHGQSA-N His-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O STWGDDDFLUFCCA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- FYTCLUIYTYFGPT-YUMQZZPRSA-N His-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FYTCLUIYTYFGPT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QADCTXFNLZBZAB-GHCJXIJMSA-N Ile-Asn-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N QADCTXFNLZBZAB-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- XLDYDEDTGMHUCZ-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XLDYDEDTGMHUCZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N Ile-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N Ile-Leu-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N FZWVCYCYWCLQDH-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- SAVXZJYTTQQQDD-QEWYBTABSA-N Ile-Phe-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N SAVXZJYTTQQQDD-QEWYBTABSA-N 0.000 description 1
- KCTIFOCXAIUQQK-QXEWZRGKSA-N Ile-Pro-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O KCTIFOCXAIUQQK-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- NJGXXYLPDMMFJB-XUXIUFHCSA-N Ile-Val-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N NJGXXYLPDMMFJB-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- POJPZSMTTMLSTG-SRVKXCTJSA-N Leu-Asn-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N POJPZSMTTMLSTG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HVJVUYQWFYMGJS-GVXVVHGQSA-N Leu-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HVJVUYQWFYMGJS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- DCGXHWINSHEPIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N DCGXHWINSHEPIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FGZVGOAAROXFAB-IXOXFDKPSA-N Leu-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O FGZVGOAAROXFAB-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N Lys-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CRNNMTHBMRFQNG-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CRNNMTHBMRFQNG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WHBUXTUEHGNOOE-LLSUIQEISA-N Lys-Thr-Trp-Gly-Lys-Asn-Leu-Val-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)O)CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 WHBUXTUEHGNOOE-LLSUIQEISA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- PHWSCIFNNLLUFJ-NHCYSSNCSA-N Met-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCSC)N PHWSCIFNNLLUFJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- JQTOSAPHLXRNAH-BWJWTDLKSA-N Met-Glu-Ile-Arg Chemical compound N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JQTOSAPHLXRNAH-BWJWTDLKSA-N 0.000 description 1
- LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NLHSFJQUHGCWSD-PYJNHQTQSA-N Met-Ile-His Chemical compound N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(O)=O NLHSFJQUHGCWSD-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- ZACMJPCWVSLCNS-JYJNAYRXSA-N Met-Phe-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZACMJPCWVSLCNS-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- UAMFZRNCIFFMLE-FHWLQOOXSA-N Phe-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N UAMFZRNCIFFMLE-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- BWTKUQPNOMMKMA-FIRPJDEBSA-N Phe-Ile-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BWTKUQPNOMMKMA-FIRPJDEBSA-N 0.000 description 1
- YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- QSKCKTUQPICLSO-AVGNSLFASA-N Pro-Arg-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O QSKCKTUQPICLSO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SXMSEHDMNIUTSP-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SXMSEHDMNIUTSP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GFHXZNVJIKMAGO-IHRRRGAJSA-N Pro-Phe-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GFHXZNVJIKMAGO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IIRBTQHFVNGPMQ-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 IIRBTQHFVNGPMQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FIODMZKLZFLYQP-GUBZILKMSA-N Pro-Val-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FIODMZKLZFLYQP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- DWUIECHTAMYEFL-XVYDVKMFSA-N Ser-Ala-His Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 DWUIECHTAMYEFL-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- RJHJPZQOMKCSTP-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJHJPZQOMKCSTP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BUYHXYIUQUBEQP-AVGNSLFASA-N Ser-Phe-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BUYHXYIUQUBEQP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- KZPRPBLHYMZIMH-MXAVVETBSA-N Ser-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KZPRPBLHYMZIMH-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N Ser-Pro-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OSFZCEQJLWCIBG-BZSNNMDCSA-N Ser-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OSFZCEQJLWCIBG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- HSWXBJCBYSWBPT-GUBZILKMSA-N Ser-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)C(O)=O HSWXBJCBYSWBPT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- WPSDXXQRIVKBAY-NKIYYHGXSA-N Thr-His-Glu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N)O WPSDXXQRIVKBAY-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 1
- URPSJRMWHQTARR-MBLNEYKQSA-N Thr-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O URPSJRMWHQTARR-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N Thr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- SIEZEMFJLYRUMK-YTWAJWBKSA-N Thr-Met-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O SIEZEMFJLYRUMK-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- XIHGJKFSIDTDKV-LYARXQMPSA-N Thr-Phe-Trp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O XIHGJKFSIDTDKV-LYARXQMPSA-N 0.000 description 1
- IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N Thr-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N Thr-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N Thr-Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- TWJDQTTXXZDJKV-BPUTZDHNSA-N Trp-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O TWJDQTTXXZDJKV-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- PKZVWAGGKFAVKR-UBHSHLNASA-N Trp-Cys-Cys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N PKZVWAGGKFAVKR-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- ICPRIGUXAFULPH-ILWGZMRPSA-N Trp-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)N)C(=O)O ICPRIGUXAFULPH-ILWGZMRPSA-N 0.000 description 1
- RWTFCAMQLFNPTK-UMPQAUOISA-N Trp-Val-Thr Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)=CNC2=C1 RWTFCAMQLFNPTK-UMPQAUOISA-N 0.000 description 1
- ARPONUQDNWLXOZ-KKUMJFAQSA-N Tyr-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ARPONUQDNWLXOZ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ULHJJQYGMWONTD-HKUYNNGSSA-N Tyr-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ULHJJQYGMWONTD-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 1
- JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N Tyr-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JLKVWTICWVWGSK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- PMHLLBKTDHQMCY-ULQDDVLXSA-N Tyr-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PMHLLBKTDHQMCY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- VMRFIKXKOFNMHW-GUBZILKMSA-N Val-Arg-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N VMRFIKXKOFNMHW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XLDYBRXERHITNH-QSFUFRPTSA-N Val-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C XLDYBRXERHITNH-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- YCMXFKWYJFZFKS-LAEOZQHASA-N Val-Gln-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N YCMXFKWYJFZFKS-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- VHRLUTIMTDOVCG-PEDHHIEDSA-N Val-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHRLUTIMTDOVCG-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 1
- QZKVWWIUSQGWMY-IHRRRGAJSA-N Val-Ser-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QZKVWWIUSQGWMY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- PDASTHRLDFOZMG-JYJNAYRXSA-N Val-Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CC=C(O)C=C1 PDASTHRLDFOZMG-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 208000011312 Vector Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 101500010375 Zika virus Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000588 acetabulum Anatomy 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 239000000252 konjac Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 108010005652 splenotritin Proteins 0.000 description 1
- 241000114864 ssRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
- G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
- G01N2333/185—Flaviviruses or Group B arboviruses, e.g. yellow fever virus, japanese encephalitis, tick-borne encephalitis, dengue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 단일클론항체는 황열 바이러스의 비구조단백질 1에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지고, 동시에 다른 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 황열 바이러스의 검출 또는 황열 바이러스의 감염에 의해 발생하는 황열의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 황열의 예방, 치료, 예후 관찰, 역가측정 등 관련 연구 개발에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 황열 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다.
황열 바이러스는(Yellow fever virus)는 모기가 매개하는 열성 질환(Febrile disease)을 유발하는 바이러스(Mosquito-borne disease) 중의 하나로, 사람이 감염되면 심한 경우에 고열 뿐만 아니라 간(Liver) 기능 이상을 동반한 황달(Jaundice) 증세를 보이기 때문에 황열 바이러스라는 이름이 붙여졌다. 황열 바이러스에 의한 감염은 주로 아프리카와 남아메리카 대륙에서 발생해 왔으며, 특히 18세기와 19세기에는 가장 위험한 감염병 중의 하나로 여겨졌다. 황열 바이러스는 1927년 이 바이러스에 감염된 환자인 Mr. Asibi로부터 아프리카 가나(Ghana)에서 최초로 분리되었다 (Klitting R. et al., Genes (2018), Vol. 9, pp. E291., Monath T. P., Lancet Infect. Dis. (2001), Vol. 1, pp. 11-20., Monath T. P. & Vasconcelos P. F., J. Clin. Virol. (2015), Vol. 64, pp. 160-173., Pulendran B., Nat. Rev. Immunol. (2009), Vol. 9, pp. 741-747.).
황열 바이러스는 플라비비리대과(Flaviviridae family)의 하위 분류인 플라비바이러스속(Flavivirus genus)에 해당하는 바이러스이며, 비교적 잘 알려져 있는 지카 바이러스(Zika virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus) 및 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus) 등이 플라비바이러스에 속한다. 플라비바이러스(Flavivirus)는 모두 공통의 구조를 가지고 있다. 플라비바이러스의 외형은 구형(Spherical)으로 전자현미경을 통해 관찰이 가능하며 크기는 40~65 nm 이다. 플라비바이러스는 양성의 단일가닥 RNA 바이러스(Positive-sense single stranded RNA virus, (+)ssRNA virus)이며, 유전체는 약 11,000개 내외의 염기(Base)로 구성되어 있다. 이 유전체는 대칭 형태를 이루고 있는 정이십면체형의 캡시드단백질(Icosahedral-like nucleocapsid protein)로 둘러싸여 있으며, 캡시드 단백질을 외피단백질(Envelope protein)이 둘러싸고 있는 구조이다(Gardner C. L. & Ryman K. D., Clin. Lab. Med. (2010), Vol. 30, pp. 237-260., Lindenbach B. D. & Rice C. M., Adv. Virus Res. (2003), Vol. 59, pp. 23-61.).
플라비바이러스의 유전체는 3종의 구조단백질(Structural proteins)과 7종의 비구조단백질(Non-structural proteins), 총 10종의 단백질을 암호화하고 있다. 구조단백질에는 캡시드단백질(Capsid protein, C), 막단백질(Membrane protein, M) 및 외피단백질(Envelope protein, E)이 있으며, 비구조단백질에는 비구조단백질 1(Non-structural protein 1, NS1), 비구조단백질 2A(NS2A), 비구조단백질 2B(NS2B), 비구조단백질 3(NS3), 비구조단백질 4A(NS4A), 비구조단백질 4B(NS4B), 비구조단백질 5(NS5) 등이 있다. 아직까지 모든 단백질의 기능이 밝혀지지는 않았지만, 막단백질, 외피단백질, 비구조단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B 일부, 비구조단백질 4A 및 4B 일부가 바이러스의 표면에 노출되어 있는 것으로 파악되고 있다(Douam F. & Ploss A., Trends Microbiol. (2018), Vol. 26, pp. 913-928., Gardner C. L. & Ryman K. D., Clin. Lab. Med. (2010), Vol. 30, pp. 237-260., 스위스 생물정보학 연구소 ExPASy(ViralZone) 웹사이트 (https://viralzone.expasy.org/24?outline=all_by_species)). 따라서 항체를 이용한 면역분석법(Immunoassay)을 통해 황열 바이러스를 검출하거나 황열 바이러스의 감염증을 진단하고자 할 경우, 황열 바이러스의 표면에 위치하고 있어 항체와의 접근 및 결합(또는 반응)이 용이한 막단백질(M), 외피단백질(E), 비구조단백질 1(NS1), 비구조단백질 2A(NS2A) 및 2B(NS2B), 비구조단백질 4A(NS4A) 및 4B(NS4B) 등이 유용한 바이오마커(타겟, 목표물질)라고 할 수 있다.
황열 바이러스에 감염되면 2일에서 9일의 잠복기를 거쳐 발열, 두통, 오심, 구토, 복통, 근육통 등을 보인다고 알려져 있으며, 대개는 짧은 기간 내에 완전히 회복할 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 대유행(Outbreak) 시기에는 황달이나 출혈 등의 심한 증상을 유발하여 높은 사망률을 보일 수 있다. 황열 바이러스 감염에 대한 적절한 치료를 받았을 경우 사망률은 5% 정도로 알려져 있지만, 간(Liver) 기능이나 신장(Kidney) 기능의 저하를 동반한 중증의 황열 바이러스 감염증의 경우 사망률은 20~50% 정도로 매우 높아 조기 진단을 통한 치료가 중요하다고 할 수 있다(Douam F. & Ploss A., Trends Microbiol. (2018), Vol. 26, pp. 913-928., Gardner C. L. & Ryman K. D., Clin. Lab. Med. (2010), Vol. 30, pp. 237-260., Monath T. P. & Vasconcelos P. F., J. Clin. Virol. (2015), Vol. 64, pp. 160-173.). 황열 바이러스에 대한 예방접종은 존재하지만, 특화된 치료제는 없기 때문에 증상에 따른 수액 요법을 통해 치료하고 있다. 따라서 황열 바이러스에 감염되지 않도록, 황열 바이러스를 연구하는 연구자들이나 황열 바이러스 감염 위험 국가를 여행하기 전에는 황열 바이러스에 대한 백신을 맞도록 권장하고 있다(Barrett A. D. T., Vaccine (2017), Vol. 35, pp. 5951-5955., Monath T. P. & Vasconcelos P. F., J. Clin. Virol. (2015), Vol. 64, pp. 160-173.).
황열 바이러스에 감염되지 않는 것이 가장 이상적이겠지만, 황열 바이러스는 지난 17세기부터 현재까지 불규칙한 간격을 두고 지속적으로 아프리카와 아메리카 대륙에서 여러 차례의 대발생(Outbreaks)을 유발해왔다. 더욱이 최근 지구의 기후 변화로 인한 아열대지역이나 온대지역이 확대됨에 따라, 황열 바이러스의 주요 숙주인 숲모기(Aedes mosquito)의 서식지가 확대되고 있는 상황이다(Douam F. & Ploss A., Trends Microbiol. (2018), Vol. 26, pp. 913-928., Faria N. R. et al., Science (2018), Vol. 361, pp. 894-899.). 2016년 앙골라 대발생 사태 때 중국인 몇몇 환자의 황열 바이러스 감염 사례를 제외하고 아직까지 아시아에서의 황열 바이러스 감염증과 관련된 대유행(Outbreak) 사례는 발생하지 않았지만, 화물 운송 수단의 발달이나 여행객의 체류 및 기후의 변화 등과 같은 다양한 환경적인 요인에 의해 아시아도 더 이상 황열 바이러스 감염에 대해 안심할 수 없는 상황이다(Chen J. & Lu H., Biosci. Trends (2016), Vol. 10, pp. 158-162., Faria N. R. et al., Science (2018), Vol. 361, pp. 894-899., Klitting R. et al., Genes (2018), Vol. 9, pp. E291.). 이러한 세계적인 상황에 대비하기 위해 세계보건기구(World Health Organization, WHO), 유니세프(Unicef) 및 가비(Gavi, The Vaccine Alliance)는 2017년부터 10년 동안의 대비 방안에 대해 'A Global Strategy to Eliminate Yellow Fever Epidemics (EYE), (2017-2026)' 문헌을 통해 발표한 바 있다 (Domingo C. et al., Emerg. Microbes Infect. (2018), Vol. 7, pp. 129., Klitting R. et al., Genes (2018), Vol. 9, pp. E425.). 이렇듯 향후 황열 바이러스 감염으로 인한 대유행의 발생빈도와 규모가 더욱 늘어날 것으로 예상되고 있기 때문에, 황열 바이러스 감염증의 조기진단을 통한 신속한 치료 및 대응에 대한 중요성이 더욱 높아질 것으로 전망된다.
황열 바이러스의 검출기술 및 황열 바이러스 감염증의 진단기술은 크게 1) 항원-항체 반응을 이용하는 면역진단법(Immunodiagnostics), 2) 바이러스의 핵산(유전자)을 검출하는 분자진단법(Molecular diagnostics), 3) 직접적인 바이러스 배양법(Virus cultivation)과 같이 3가지로 분류할 수 있다. 이 중에서도 면역분석법은 '항체'를 보유하고 있다면, 분자진단법이나 바이러스 배양법에 비해 바이러스 분석방법이 비교적 간단하고 분석에 소요되는 시간이 매우 짧기 때문에 신속한 검출이 가능하다는 장점이 있다. 면역분석법은 검출하고자 하는 물질의 종류에 따라 혈청학적(또는 항체) 검출법(Serological (or antibody) detection) 및 항원 검출법(Antigen detection)으로 다시 세분화 할 수 있다(Domingo C. et al., Emerg. Microbes Infect. (2018), Vol. 7, pp. 129., Waggoner J. J. et al., J. Clin. Microbiol. (2018), Vol. 56, pp. e00827-18.).
황열 바이러스의 감염으로 인해 체내에 생성된 IgM나 IgG와 같은 이뮤노글로불린(Immunoglobulin)을 검출하는 혈청학적 검출법은 여러 국가들의 질병을 관리하고 통제하는 국가 기관에서 권장하고 있는 시험법이기 때문에 널리 이용되고는 있지만, 다른 바이러스와 구별하여 검출 또는 진단하거나 위양성(False-positive) 반응에 있어 궁극적으로 한계점을 가진다. IgM의 경우 황열 바이러스 감염 즉시 생성되는 것이 아니라 수 일에 걸쳐 생성되기 때문에 조기 진단이 어렵다는 단점이 있다. IgG의 경우에는 IgM보다 생성되는데 시간이 더 오래 걸리며 최초 감염이 아닌 경우 수 개월에서 수 년전의 감염으로 인해 체내에 생성된 항체일 수 있어 위양성(False-positive)의 결과를 초래할 수 있다. 또 다른 문제점은 황열 바이러스 감염으로 인해 체내에 생성된 IgM과 IgG 모두 단일클론항체(Monoclonal antibody)가 아닌 다클론항체(Polyclonal antibody)이기 때문에, 황열 바이러스와 구조가 유사한 다른 종류의 바이러스의 감염에 의해 위양성의 결과를 초래할 수 있다는 점이다. 따라서 황열 바이러스를 구성하는 특정 단백질을 바이오마커나 타겟(목표물질)로 정하여, 오직 황열 바이러스의 단백질과 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용한 항원 검출법이 황열 바이러스의 검출 및 황열 바이러스 감염증의 진단에 유리하다고 할 수 있다.
황열 바이러스의 검출 및 황열 바이러스 감염증의 진단도 중요하지만, 황열 바이러스와 같은 플라비바이러스속(Flavivirus genus)에 해당하는 지카 바이러스(Zika virus)나 뎅기 바이러스(Dengue virus)와 같은 다른 종류의 바이러스와 구별하여 검출하거나 이와 관련된 감염증을 구별하여 진단하는 것도 매우 중요한 상황이다. 이 바이러스들의 감염에 의한 초기증상이 매우 유사하고, 공통적으로 숲모기(Aedes mosquito)를 숙주로 이용하고 있기 때문에 각각의 바이러스를 혈청학적인 검출을 통해 구별하거나 진단하는 것은 어려운 상황이다. 또한 황열 바이러스는 4가지의 생물안전등급 중에서 고위험군이 속하는 3등급(Biosafety level 3, BSL3)으로, 2등급인 지카 바이러스나 뎅기 바이러스보다 위험도가 높기 때문에 각별한 주의가 요구된다(Douam F. & Ploss A., Trends Microbiol. (2018), Vol. 26, pp. 913-928., Waggoner J. J. et al., J. Clin. Microbiol. (2018), Vol. 56, pp. e00827-18., 병원체 생물안전정보집, 질병관리본부 국립보건연구원 (2017)). 따라서 신속하면서도 특이적으로 황열 바이러스만을 검출하거나 황열 바이러스 감염증을 진단할 수 있는 기술의 개발이 중요한 상황이다.
이에 본 발명자들은 신속하면서도 별도의 황열 바이러스의 배양과정 없이 황열 바이러스의 검출이나 황열 바이러스 감염증의 진단을 위해, '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하였으며, 본 발명의 단일클론항체는 황열 바이러스의 비구조단백질 1과 높은 결합친화도를 가지고, 특이도가 확인되어, '항원-항체 복합체'에 대한 반응분석으로부터 짧게는 수 분의 시간 이내에, 길게는 수 시간 이내에 손쉽게 황열 바이러스의 검출이나 황열 바이러스 감염증의 진단이 가능하다는 특징을 가진다.
본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주 JYN-2에 의해 생산되는 황열 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1, NS1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13938BP인 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 1) 황열 바이러스의 감염이 의심되는 대상으로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 생물학적 시료에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 및 3) 상기 단계 1)의 생물학적 시료 내의 황열 바이러스의 비구조단백질 1과 상기 단계 2)의 단일클론항체의 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, 황열 바이러스의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주 JYN-2에 의해 생산되는 황열 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1, NS1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13938BP인 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 황열 바이러스의 감염이 의심되는 대상으로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 생물학적 시료에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 및 3) 상기 단계 1)의 생물학적 시료 내의 황열 바이러스의 비구조단백질 1과 상기 단계 2)의 단일클론항체의 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, 황열 바이러스의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 단일클론항체는 황열 바이러스의 비구조단백질 1에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지고, 동시에 다른 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 황열 바이러스의 검출 또는 황열 바이러스의 감염에 의해 발생하는 황열의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 특성을 이용하여, 황열의 예방, 치료, 예후 관찰, 역가측정 등 관련 연구 개발에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 황열 바이러스의 비구조단백질 1을 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 것으로, 45 kDa(Kilodalton, 킬로달톤) 내지 60 kDa 부근에 밴드가 형성되어 황열 바이러스의 비구조단백질 1이 순수 분리 및 정제된 것을 확인한 도이다.(도면 내 'S.M.'은 단백질 사이즈 마커를 의미)
도 2는 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 것으로, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 단일클론항체의 중쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)가 관찰되어 단일클론항체가 분리 및 정제된 것을 확인한 도이다.(도면 내 'S.M.'은 단백질 사이즈 마커를 의미)
도 3은 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체의 아이소타입(Isotype)은 IgG2a임을 확인한 도이다.
도 4는 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체의 해리 상수(Dissociation constant, KD)를 나타낸 도이다.
도 5는 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 단일클론항체의 특이도를 측정하기 위해, 황열 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1, YFV NS1), 지카 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1 of Zika virus , ZIKV NS1), 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1 of Dengue virus , DENV NS1), 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH) 및 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)과 반응성을 확인한 도이다.
도 2는 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 것으로, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 단일클론항체의 중쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)가 관찰되어 단일클론항체가 분리 및 정제된 것을 확인한 도이다.(도면 내 'S.M.'은 단백질 사이즈 마커를 의미)
도 3은 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체의 아이소타입(Isotype)은 IgG2a임을 확인한 도이다.
도 4는 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체의 해리 상수(Dissociation constant, KD)를 나타낸 도이다.
도 5는 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 단일클론항체의 특이도를 측정하기 위해, 황열 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1, YFV NS1), 지카 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1 of Zika virus , ZIKV NS1), 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1 of Dengue virus , DENV NS1), 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH) 및 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)과 반응성을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주 JYN-2에 의해 생산되는 황열 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1, NS1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명에서 용어 '단일클론항체'란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 결합하는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 달리, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해 특이적으로 결합한다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 하이브리도마(Hybridoma)의 배양 또는 파지디스플레이(Phage display) 방법에 의해 생산될 수 있기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 장점을 갖는다. 본 발명의 목적상 본 발명의 단일클론항체는 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하므로, '황열 바이러스의 비구조단백질 1'을 인식하는 단백질 분자이다.
본 발명의 단일클론항체는 정제하지 않고 사용하거나, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 90% 이상의 순도)로 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 정제 방법의 예로는 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(Ascites)에서 분리할 수 있으나, 이에 의해 본 발명의 항체 정제 방법이 제한되는 것은 아니다.
한편, 항원을 검출하기 위해 단일클론항체를 사용하는 경우의 유용한 점은 단일 에피토프, 즉 항원결정부위를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(Mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용한 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해하여 생성된 단편을 면역블롯팅하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열 내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.
또한, 본 발명의 단일클론항체는 항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체의 결합특성을 갖는 한, 2개의 전체 길이의 경사슬 및 2개의 전체 길이의 중사슬을 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1)및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology 9th Edition, Abbas A. K. et al., 2017).
항체 분자의 '기능적인 단편'이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. F(ab')는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(Hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 F(ab')의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머(Dimer)와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 제한 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 아이소타입(Isotype)으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
상기 황열 바이러스의 비구조단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체뿐만 아니라 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함할 수 있다.
상기 단일클론항체는 IgG2a 아이소타입(Isotype)인 것을 특징으로 한다.
항체는 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE의 5개의 서로 다른 분류(Classification)로 나눌 수 있다. 각각의 분류와 아이소타입은 면역글로불린(Immunoglobulin) 사이에서 서로 다른 유형의 종류를 의미하며, 서로 다른 중쇄와 경쇄의 일정 부위 유전자를 사용하기 때문에 생긴 일정 부위의 차이를 지칭한다.
상기 단일클론항체는 3.307×10-11 내지 3.307×10-9 몰(M)의 해리 상수(Dissociation constant, KD)로 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 결합하는 것을 특징으로 한다.
상기 단일클론항체의 해리 상수는 항원과의 결합 친화도를 나타내며 해리 상수가 작을수록 단일클론항체와 항원과의 결합 친화도가 큰 것이다. 상기 결합 친화도는 통상의 방법에 따라 결정할 수 있으며, 이러한 방법으로는 특별히 제한하지는 않으나, 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment)을 통해 항원과의 결합을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13938BP인 하이브리도마 세포를 제공한다.
본 발명에서 용어 '하이브리도마 세포'란, 항체를 생산하는 B 림프구와 암세포의 일종인 골수종 세포를 융합하여 얻은 세포를 의미하는데, 골수종 세포는 형질전환된 세포로, 배양접시에서 오랜 기간 배양할 수 있는 장점이 있어, 한 가지 항체만을 만들어 내는 골수종 하이브리도마를 분리해 내면 손쉽게 단일클론항체를 대량으로 획득하는 것을 의미한다. B 림프구와 골수종 암세포를 융합하는 방법은 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 바람직하게는 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'로 면역화된 림프구와 골수종 세포가 융합된 세포일 수 있으며, '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 제한없이 포함할 수 있다.
상기의 하이브리도마 세포는 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 국제공인기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁을 진행하였으며 2019년 9월 5일자로 수탁번호 KCTC 13938BP를 부여받았다.
상기 하이브리도마 세포는 1) 황열 바이러스의 비구조단백질 1을 사용하여 마우스를 면역화시키는 단계; 2) 상기 면역화시킨 마우스의 비장 세포(Splenocytes)를 골수종 세포(Myeloma cells)와 융합하여 배양하는 단계; 및 3) 융합된 하이브리도마 세포주에서 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계; 를 통해 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 상기 황열의 감염 여부를 확인하는 것이다.
상기 검출용 조성물 또는 진단용 조성물은 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단일클론항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 상기 항원-항체반응의 분석법의 방법과 동일한 방법으로도 수행할 수 있다.
상기 검출용 조성물 또는 진단용 조성물은 검출 또는 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(Flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작하였으므로, 본 발명의 단일클론항체는 황열 바이러스의 검출 또는 황열 바이러스의 감염에 의한 황열의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트는 본 발명의 단일클론항체 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 포함할 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 또한 검출용(진단용) 키트는 본 발명의 단일클론항체와 여기에 적용될 시료 중의 항원(항원결정부위)과의 반응을 확인할 수 있는 표지체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 황열 진단용 키트는 표지체와 접합된 상기 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체에 결합이 가능한 2차항체, 발색기질 및 각 반응 단계에 사용하는 세척액을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 표지체의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 육안, 검출장비, 검출시약 등을 이용할 수 있다. 상기 검출시약은 검사하고자 하는 대상물질(Analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(Labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분을 포함할 수 있다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 알칼리성 포스파타제와 겨자무 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 3,3',5,5' -테트라메틸벤지딘, 4-메톡시-1-나프톨, 4-클로로-1-나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도체와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플루오레세인 (Fluorescein), 피코빌리프로틴(Phycobiliprotein), 로다민(Rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있다. 일예로, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP(Horseradish peroxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC (Fluorescein isothiocyanate)가, 발광물질로는 루미놀(Luminol), 아이소루미놀(Isoluminol) 및 루시게닌(Lucigenin)이, 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지 수단에 의한 표지 여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광 또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인 가능하다.
상기 표지체는 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(Colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nanotube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 발색기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 하나의 예로, TMB와 같은 발색기질은 2차항체접합체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인하거나 흡광도 측정을 통해 단백질 항원의 존재 유무를 검출할 수 있다.
상기 세척액은 단계에 따라 증류수, TBS (Tris buffered saline) 트윈 완충용액, PBS (Phosphate buffered saline) 트윈 완충용액, NaCl, 트윈-20 (Tween-20), 트리톤 X-100 (Triton X-100) 등을 사용할 수 있다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합 복합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척할 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 황열의 감염이 의심되는 대상으로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생물학적 시료에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 생물학적 시료 내의 황열 바이러스의 비구조단백질 1과 상기 단계 2)의 단일클론항체의 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, 황열 바이러스의 검출 방법을 제공한다.
상기 황열 바이러스의 감염이 의심되는 대상은 인간일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료(또는 액상화된 시료)를 의미하는 것으로, 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 조직 파쇄물, 세포, 세포 파쇄물, 체액, 타액, 활액, 뇌척수액, 림프액, 분변 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 생물학적 시료는 황열 바이러스의 검출에 사용하기 전에 전처리(Pre-treatment 또는 Pre-processing)할 수 있다. 전처리 방법의 예로, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있고, 상기 생물학적 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
상기 단계 3)의 항원-항체 복합체 형성은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay) 및 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
상기 웨스턴 블로팅은 생물학적 시료 중에 존재하는 해당 단백질을 확인하기 위한 유용한 방법이다. 예를 들어, 장기 조직 유래의 추출액 등의 생체 시료액을 v폴리아크릴아미드 겔(gel)에 전기영동 시킨 뒤, PVDF 멤브레인에 전이하고, 해당 단백질 또는 해당 펩타이드를 인식하는 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것이다.
상기 면역 화학 염색법은 조직 및 세포에 있어서 대상 폴리펩티드(polypeptide)의 발현 부위를 해석하기 위하여 유효한 방법으로, 예를 들어, 슬라이드글라스 상에 고정되는 조직 절편, 세포 등을 본 발명의 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 상기 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체와 결합할 수 있는 2차항체를 이용하여 검출하는 것에 따라 실시한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 생산된 하이브리도마 세포주 중 황열 바이러스의 비구조단백질 1과 높은 반응성을 보이는 세포주를 1차 선별하였으며, 계대배양을 거쳐 이들 중 생존능을 상실했거나 황열 바이러스의 비구조단백질 1과 반응하지 않는 하이브리도마 세포주를 제외하는 과정을 거쳐, 세포주를 2차 선별하였다. 이후, 선별한 세포주가 생산하는 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 IgG2a의 아이소타입을 가지고(도 3 참조), 1 나노몰 미만인 0.331±0.030 나노몰(nM)의 해리 상수값을 나타내어 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 높은 결합 친화도를 가지는 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 본 발명의 단일클론항체는 다른 단백질과는 반응하지 않고 황열 바이러스의 비구조단백질 1에만 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 5 참조). 이에, 본 발명의 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 황열 바이러스의 검출, 황열 바이러스의 감염에 의해 발생하는 황열의 진단, 황열의 예방, 치료, 예후 관찰, 역가측정 등 관련 연구 개발에서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 황열 바이러스의 비구조단백질 1의 준비
황열 바이러스의 비구조단백질 1을 암호화하는 352개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질(서열번호 1)을 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
구체적으로, 인간배아신장세포(Human embryonic kidney cell, HEK293 cell)에서 황열 바이러스의 비구조단백질 1을 발현시키고, C 말단(C-terminal)에 폴리히스티딘(Polyhistidine)을 연결(His-tagged)시켰다. 그 후 Ni-NTA 레진(Nickel-nitrilotriacetic acid resin)을 사용한 친화도 크로마토그래피(Affinity chromatography)로 황열 바이러스의 비구조단백질 1을 순수 분리 및 정제하였다.
분리 및 정제된 황열 바이러스의 비구조단백질 1은 단백질 전기영동 기술인 PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 확인하였다. 단일클론항체를 만들기 위한 항원(Antigen)으로 사용할 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'이 높은 순도(Purity)로 존재하는지, 알려진 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'의 분자량(Molecular weight)인 약 45 킬로달톤(Kilodalton, kDa) 부근에 위치하는지를 확인하기 위해 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 단백질 전기영동을 수행하였다. 이후 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 염색하고, 탈색용액을 이용하여 탈색반응을 진행하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, 단백질 사이즈 마커(Protein size marker, S.M.)와 비교했을 때 황열 바이러스의 비구조단백질 1은 알려진 황열 바이러스의 비구조단백질 1의 분자량인 45kDa과 유사한 45kDa 내지 60 kDa 부근에 밴드를 형성하여 황열 바이러스의 비구조단백질 1이 순수 분리 및 정제된 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 2> 하이브리도마 세포주 제작을 위한 마우스의 면역화 및 항체 역가(Antibody titer) 측정
<2-1> 마우스의 면역화 수행
황열 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작하기 위해 마우스의 면역화를 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1을 통해 확인된 '황열 바이러스의 비구조단백질 1' 30 ㎍을 PBS 용액을 이용하여 250 ㎕가 되도록 희석하고, 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant와 혼합하여 에멀젼(Emulsion) 형태로 만든 다음, 이를 생후 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 주사하여 1차 면역화를 수행하였다. 1차 면역화 수행으로부터 2주 후에 Complete Freund's Adjuvant 대신 Incomplete Freund's Adjuvant를 이용하여 동일한 방법 및 조건으로 2차 면역화를 수행하였다.
<2-2> 면역화된 마우스의 항체 역가 측정
2차 면역화로부터 2주 후에 마우스의 꼬리 정맥으로부터 10 ㎕의 혈액을 채취하여 마우스 체내에 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 항체가 충분히 생성되었는지 확인하기 위해 항체 역가(Antibody titer)를 Indirect ELISA를 통해 측정하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'을 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 다음 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4) (PBS/T) 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척하고, 1% 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척하여 블로킹 시켜 플레이트에 황열 바이러스의 비구조단백질 1을 코팅하였다.
상기 플레이트에 1/102, 1/103, 1/104의 비율로 희석된 마우스 혈액 100 ㎕를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후 HRP(Horseradish peroxidase)가 연결된 염소의 항-마우스 IgG(Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액을 100 ㎕씩 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다.
마우스 혈액 내에 존재하는 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 항체의 역가('황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 반응성)에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 10,000배 희석된 혈액에서도 흡광도가 부스터 주입의 별도 기준치인 0.3을 훨씬 상회하는 값인 2.023이 나왔기 때문에(표 1), 면역화가 잘 이루어진 것으로 판단되어 최종적으로 '황열 바이러스의 비구조단백질 1' 30 ㎍을 PBS 용액에 희석하여 별도의 아쥬반트(Adjuvant)없이 면역반응 극대화를 위한 부스터 주입(Booster injection)을 수행하였다.
| 시료의 종류 | 450nm에서 흡광도 |
| 100배 희석된 마우스 혈액 | 3.495 |
| 1000배 희석된 마우스 혈액 | 3.494 |
| 10000배 희석된 마우스 혈액 | 2.023 |
| 인산완충용액 대조군(control) | 0.021 |
<실시예 3> 하이브리도마 세포주의 제작
황열 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
구체적으로, 하이브리도마 세포주의 제작을 위한 세포융합은 공지된 하이브리도마 생산기술(Kohler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) Vol. 73, pp. 3-46.)을 통해 이루어졌다. 상기 실시예 2-1의 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'으로 면역화된 마우스로부터 비장(Spleen)을 적출한 다음, 조직분쇄기로 비장을 분쇄하고 RPMI 1640 배지에 현탁하여 비장세포(Splenocyte)를 계수하였다. 그 다음 37℃, 5% CO2의 세포배양기에서 배양한 T75 플라스크의 마우스 골수종세포(Myeloma, Sp2/0-Ag14)를 회수하고 RPMI 1640 배지에 현탁하여 동일한 방법으로 계수하였다. 계수한 마우스의 비장세포와 골수종세포를 세포수를 기준으로 5:1이 되도록 하나의 50 ㎖ 튜브에 옮겨 담은 뒤, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 50%의 PEG1500(Polyethylene glycol) 1 ㎖를 처리한 다음, 39 ㎖의 37℃ RPMI 1640 배지를 천천히 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시켜 세포융합이 일어나도록 하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수한 다음, HAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine)을 함유하고 있는 RPMI 1640 배지(HAT 배지)를 이용하여 적절한 수의 세포가 되도록 현탁한 다음 세포배양용 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 100 ㎕씩 분주했다. 이후 37℃, 5% CO2의 조건으로 세포배양기 내에서 배양하였다.
<실시예 4> 고반응성 하이브리도마 세포주의 선별
황열 바이러스의 비구조단백질 1과 높은 반응성을 보이는 하이브리도마 세포주를 선별하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3을 통해 융합된 세포를 7일 이상 배양하고, 육안이나 현미경을 통해 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것을 확인한 다음, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(Well)에 있던 기존 HAT 배지를 교체하여 상기 실시예 3과 동일한 조건에서 3일간 추가적으로 배양하였다. 이후 96-웰(96-well) 세포 배양 플레이트 내 각각의 웰에 존재하는 배지를 취하여 상기 실시예 2-2와 같은 방법으로 Indirect ELISA를 수행하였다.
'황열 바이러스의 비구조단백질 1'과 높은 반응성을 보이는 웰(Well)에 존재하는 하이브리도마를 선별하였으며, 추가적으로 24-웰 플레이트(24-well plate) 및 6-웰 플레이트(6-well plate)에서의 계대배양을 거쳐 생존능 및 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 반응성을 같은 방법으로 확인하였다. 생존능을 상실했거나 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 반응성이 없는 하이브리도마를 제외한 후, '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대해 높은 반응성을 보이는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다. 선별된 하이브리도마 세포주들은 단일클론의 하이브리도마 세포주를 얻기 위해 서브-클로닝(Sub-cloning) 및 클로닝(Cloning) 과정을 진행하였다. 1개의 96-well plate 당 50개~100개의 하이브리도마 세포가 들어가도록 하여 서브-클로닝 과정을 진행하였다. 보다 확실한(안정한) 단일클론의 하이브리도마 세포주가 얻어질 때 까지 같은 과정을 반복하여 클로닝을 수행하였다. 이들 중에서 황열 바이러스의 비구조단백질 1에만 특이적으로 결합하는 하이브리도마 세포주를 'Hybridoma JYN-2'로 명명하였으며 국제공인기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13938BP를 부여받았다.
<실시예 5> 단일클론항체의 생산, 분리, 정제 및 확인
선별된 하이브리도마 세포주로부터 다량의 단일클론항체를 얻기 위해 마우스의 복강 내로 하이브리도마 세포주를 주입하여 복수(Ascites)가 생성되도록 유도하였다. 이는 단일클론항체 획득을 위해 본 실시예에서 수행한 것일 뿐, 생체 외 세포배양(In vitro cell culture)을 통해서도 단일클론항체의 획득이 가능하다. 상기 마우스로부터 획득한 복수로부터 혈청(Serum)의 분리를 위해 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 수행하였다.
상기의 과정으로부터 준비된 혈청에 포함된 단일클론항체인 이뮤노글로불린 G (Immunoglobulin G, IgG)만을 선택적으로 분리/정제하기 위해 준비된 배지를 20 mM KH2PO4 (pH 7.4) 용액으로 평형화 해준 아가로즈(Agarose)-Protein G 레진(Resin)이 충진(Packing)되어 있는 컬럼(Column)에 흘려주었다. 혈청을 모두 흘려준 다음, 다시 20 mM KH2PO4 (pH 7.4)를 이용하여 비특이적으로 결합되어 있거나 끼어있는 단일클론항체 이외의 불순물들을 제거해 주었다. 이후 0.1 M Glycine (pH 2.8) 용액을 흘려주어 Protein G와 결합되어 있는 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 단일클론항체를 용출시켜주었으며, 용출되는 즉시 pH 중화(Neutralization)를 위해 1 M Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 용출액의 1/3에서 1/5 정도의 부피 비율(Volume ratio)이 되도록 섞어주었다. 이후 단일클론항체 용출액의 버퍼(용액)를 교환해주기 위해 PBS 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 이상 투석을 2회 반복하여 고농도의 염을 제거하였다. 투석이 완료된 단일클론항체는 주사기 필터를 통해 응집물(Aggregate)을 제거한 다음, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이후 상기 실시예 1과 동일한 방법 및 조건으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 쿠마시 블루 염색을 통해 고순도의 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 단일클론항체를 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 항체의 중쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)가 관찰되어, 단일클론항체의 분리 및 정제가 잘 이루어졌다고 판단하였다.
<실험예 1> 단일클론항체의 아이소타입(Isotype) 및 해리상수 확인
<1-1> 단일클론항체의 아이소타입(Isotype) 확인
상기 실시예 5로부터 순수 분리 및 정제된 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 단일클론항체의 아이소타입을 확인하였다.
구체적으로, 마우스 IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM에 각각 특이적으로 결합하는 염소(Goat)의 항체를 PBS (pH 7.4) 용액을 이용하여 1 ㎍/㎖의 농도로 희석시키고, 효소면역흡착검사용 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(Well)을 3회 세척하고, 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰(Well)에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 그 다음 상기 실시예 5의 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 단일클론항체를 100 ㎕ 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰으며, 반응이 끝난 후 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(Well)에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 아이소타입 반응성에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, 상기 실시예 5로부터 분리 및 정제된 단일클론항체의 아이소타입은 IgG2a임을 확인할 수 있었다.
<1-2> 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, K
D
) 확인
상기 실시예 5로부터 순수 분리 및 정제된 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, KD) 또는 결합친화도(Binding affinity)를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-2의 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'이 코팅되어 있는 효소면역흡착검사용 플레이트를 준비하였다. 상기 단일클론항체를 100 나노몰(nM)의 몰농도(Molar concentration)로 부터 PBS 용액을 이용하여 1/2씩 연속적으로 희석하여 0 nM을 포함한 총 16가지 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, 이들을 각각의 웰에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 농도의 단일클론항체에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 상기 실시예 5로부터 분리 및 정제된 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 단일클론항체의 해리상수는 0.331±0.030 나노몰(nM) 임을 확인하여, 일반적인 단일클론항체의 해리상수인 1 나노몰(nM)에서 100 나노몰(nM) 사이의 값보다 현저히 우수함을 확인할 수 있었다(Lai H. et al., Plant Biotechnol. J. (2014), Vol. 12, pp. 1098-1107., Qiu X. et al., Nat. Microbiol. (2018), Vol. 3, pp. 287-294., Rathore U. et al., J. Biol. Chem. (2018), Vol. 293, pp. 15002-15020.).
<실험예 2> 단일클론항체의 특이도 분석
상기 실시예 5를 통해 분리 및 정제된 단일클론항체가 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'과는 결합 또는 반응하면서, 다른 단백질과는 결합 또는 반응하지 않는지 확인하기 위해 단일클론항체의 특이도를 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5를 통해 분리 및 정제된 '황열 바이러스의 비구조단백질 1'에 대한 단일클론항체를 100 nM의 농도로 100 ㎕씩 '황열 바이러스의 비구조단백질 1(His-tagged form)', '지카 바이러스의 비구조단백질 1(His-tagged form)', '뎅기 바이러스의 비구조단백질 1(His-tagged form)', '젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH)' 및 '소혈청 알부민(BSA, Native form)'이 각각 코팅되어 있는 플레이트에 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(Well)을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 서로 다른 단백질에 대한 단일클론항체의 반응성 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 상기 실시예 5로부터 분리 및 정제된 단일클론항체가 같은 플라비바이러스 속에 속하는 지카 바이러스 및 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1과 다른 종류의 단백질인 젖산탈수소효소 및 소혈청알부민과는 결합 또는 반응하지 않으며, '황열 바이러스의 비구조단백질 1'과만 특이적으로 결합 또는 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Monoclonal antibody against non-structural protein 1 of yellow
fever virus, hybridoma cell line producing the same, and uses
thereof
<130> 2019P-08-026
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 352
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nonstructural protein 1 of Yellow fever virus
<400> 1
Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr
20 25 30
Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala
35 40 45
Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu
50 55 60
His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala Asp Glu Ile Asn Ala Ile Phe Glu
65 70 75 80
Glu Asn Glu Val Asp Ile Ser Val Val Val Gln Asp Pro Lys Asn Val
85 90 95
Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile Arg Asp Gly Leu Gln
100 105 110
Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys Asn Leu Val Phe Ser Pro Gly Arg
115 120 125
Lys Asn Gly Ser Phe Ile Ile Asp Gly Lys Ser Arg Lys Glu Cys Pro
130 135 140
Phe Ser Asn Arg Val Trp Asn Ser Phe Gln Ile Glu Glu Phe Gly Thr
145 150 155 160
Gly Val Phe Thr Thr Arg Val Tyr Met Asp Ala Val Phe Glu Tyr Thr
165 170 175
Ile Asp Cys Asp Gly Ser Ile Leu Gly Ala Ala Val Asn Gly Lys Lys
180 185 190
Ser Ala His Gly Ser Pro Thr Phe Trp Met Gly Ser His Glu Val Asn
195 200 205
Gly Thr Trp Met Ile His Thr Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Lys Glu Cys
210 215 220
Glu Trp Pro Leu Thr His Thr Ile Gly Thr Ser Val Glu Glu Ser Glu
225 230 235 240
Met Phe Met Pro Arg Ser Ile Gly Gly Pro Val Ser Ser His Asn His
245 250 255
Ile Pro Gly Tyr Lys Val Gln Thr Asn Gly Pro Trp Met Gln Val Pro
260 265 270
Leu Glu Val Lys Arg Glu Ala Cys Pro Gly Thr Ser Val Ile Ile Asp
275 280 285
Gly Asn Cys Asp Gly Arg Gly Lys Ser Thr Arg Ser Thr Thr Asp Ser
290 295 300
Gly Lys Val Ile Pro Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Met Pro Pro
305 310 315 320
Val Ser Phe His Gly Ser Asp Gly Cys Trp Tyr Pro Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Arg Lys Thr His Glu Ser His Leu Val Arg Ser Trp Val Thr Ala
340 345 350
Claims (15)
- 수탁번호 KCTC 13938BP의 하이브리도마 세포주 JYN-2에 의해 생산되는 황열 바이러스의 비구조단백질 1(Nonstructural protein 1, NS1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
- 제1항에 있어서, 상기 황열 바이러스의 비구조단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
- 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 IgG2a 아이소타입(Isotype)인 것을 특징으로 하는, 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
- 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 3.307×10-11 내지 3.307×10-9 몰(M)의 해리 상수(Dissociation constant, KD)로 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 결합하는 것을 특징으로 하는, 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13938BP인 하이브리도마 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 황열 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 황열 진단용 키트는 표지체와 접합된 상기 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체에 결합이 가능한 2차항체 및 발색기질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 키트.
- 제9항에 있어서, 상기 표지체는 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(Colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nanotube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 키트.
- 제9항에 있어서, 상기 발색기질은 DAB (Diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 황열 바이러스의 감염에 의한 황열 진단용 키트.
- 1) 황열 바이러스의 감염이 의심되는 대상으로부터 분리한 생물학적 시료에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 생물학적 시료 내의 황열 바이러스의 비구조단백질 1과 단일클론항체의 항원-항체 복합체 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는, 황열 바이러스의 검출 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 황열 바이러스의 감염이 의심되는 대상은 인간인 것인, 황열 바이러스의 검출 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 조직 파쇄물, 세포, 세포 파쇄물, 체액, 타액, 활액, 뇌척수액, 림프액, 분변 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 황열 바이러스의 검출 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 단계 2)의 항원-항체 복합체 형성은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay) 및 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 확인되는 것을 특징으로 하는, 황열 바이러스의 검출 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190118151A KR102196156B1 (ko) | 2019-09-25 | 2019-09-25 | 황열 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190118151A KR102196156B1 (ko) | 2019-09-25 | 2019-09-25 | 황열 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102196156B1 true KR102196156B1 (ko) | 2020-12-29 |
Family
ID=74089996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190118151A KR102196156B1 (ko) | 2019-09-25 | 2019-09-25 | 황열 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102196156B1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101970963B1 (ko) * | 2018-12-19 | 2019-04-23 | 주식회사 엠디헬스케어 | 황열 바이러스 ediii에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 |
| KR20190078039A (ko) | 2017-12-26 | 2019-07-04 | 주식회사 수젠텍 | 지카 바이러스 진단용 조성물 및 지카 바이러스 진단 방법 |
| KR20190091823A (ko) * | 2018-01-29 | 2019-08-07 | 충북대학교 산학협력단 | 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합 가능한 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도 |
| KR20190101685A (ko) * | 2018-02-23 | 2019-09-02 | 주식회사 젠바디 | 황열 바이러스 감염 진단용 신속진단키트 및 이를 이용한 황열 바이러스 검출방법 |
-
2019
- 2019-09-25 KR KR1020190118151A patent/KR102196156B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190078039A (ko) | 2017-12-26 | 2019-07-04 | 주식회사 수젠텍 | 지카 바이러스 진단용 조성물 및 지카 바이러스 진단 방법 |
| KR20190091823A (ko) * | 2018-01-29 | 2019-08-07 | 충북대학교 산학협력단 | 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합 가능한 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도 |
| KR20190101685A (ko) * | 2018-02-23 | 2019-09-02 | 주식회사 젠바디 | 황열 바이러스 감염 진단용 신속진단키트 및 이를 이용한 황열 바이러스 검출방법 |
| KR101970963B1 (ko) * | 2018-12-19 | 2019-04-23 | 주식회사 엠디헬스케어 | 황열 바이러스 ediii에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Korean J. Parasitol., Vol. 57, No. 3, pp. 283-290 (2019. 6.) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9470686B2 (en) | Combination hepatitis C virus antigen and antibody detection method | |
| US20240247037A1 (en) | Glypican epitopes and uses thereof | |
| KR102156165B1 (ko) | 인간 ｔｒｅｍ２ 세포막 단백질에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
| EP3027652A1 (en) | Anti-pla2r antibody and uses thereof | |
| KR20200020411A (ko) | 메르스 코로나바이러스 s 단백질에 대한 단클론 항체 및 그 용도 | |
| US20220091135A1 (en) | Test method for ulcerative colitis and primary sclerosing cholangitis | |
| WO2015196192A2 (en) | Methods and compositions relating to dengue virus | |
| KR102008609B1 (ko) | 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 특이 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도 | |
| KR102012123B1 (ko) | 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합 가능한 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도 | |
| KR20110040624A (ko) | 항-ｆａｓｎ 자가면역 항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물 | |
| JP5798679B2 (ja) | ヒト肝−カルボキシルエステラーゼ１を特異的に認識するモノクローナル抗体、前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞株及びその用途 | |
| KR102227251B1 (ko) | 지카 바이러스 외피 단백질 도메인 ⅲ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
| KR102196156B1 (ko) | 황열 바이러스 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
| KR102196159B1 (ko) | 조류 인플루엔자 바이러스 h7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
| KR102450481B1 (ko) | 돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도 | |
| CN113832132B (zh) | 一种烙铁头svmp蛋白特异性短肽、抗烙铁头svmp蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒 | |
| US20240210403A1 (en) | Lateral flow analysis and breast cancer | |
| CN113956355B (zh) | 抗人脑利钠肽(bnp)兔单克隆抗体及其应用 | |
| KR102227257B1 (ko) | 플라비바이러스 외피 단백질 도메인 ⅲ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
| KR102202082B1 (ko) | 치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 ⅱ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
| KR102218561B1 (ko) | 단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스의 검출 방법 | |
| KR102008608B1 (ko) | 뎅기 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 특이 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도 | |
| KR102218517B1 (ko) | 단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스의 검출 방법 | |
| EP2484694B1 (en) | Monoclonal antibody against human hig-1 polypeptide | |
| EP1765867B1 (en) | Monoclonal antibodies to hiv-1 vpr and methods of using same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |