KR102450481B1 - 돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도 - Google Patents

돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102450481B1
KR102450481B1 KR1020220046405A KR20220046405A KR102450481B1 KR 102450481 B1 KR102450481 B1 KR 102450481B1 KR 1020220046405 A KR1020220046405 A KR 1020220046405A KR 20220046405 A KR20220046405 A KR 20220046405A KR 102450481 B1 KR102450481 B1 KR 102450481B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
swine fever
fever virus
seq
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020220046405A
Other languages
English (en)
Inventor
김정호
사은영
이보람
김어진
류지은
배수민
이세정
곽중범
임화영
안동준
최세은
현방훈
Original Assignee
주식회사 바이오노트
대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오노트, 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) filed Critical 주식회사 바이오노트
Priority to KR1020220046405A priority Critical patent/KR102450481B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102450481B1 publication Critical patent/KR102450481B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 돼지열병 바이러스(Classical Swine Fever Virus: CSFV)와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 이를 포함하는 돼지열병 바이러스 검출용 조성물 및 키트; 상기 키트를 사용한 돼지열병 바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.
일 양상에 따른 돼지열병 바이러스 특이적 항체 및 이를 사용한 ELISA 진단법을 통해 종래 기술 대비 돼지열병 바이러스의 검출 시간을 현저히 단축시킬 수 있으며, 교차반응성 없이 높은 민감도 및 특이도를 나타내어 관련 질병의 진단에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도{Classical Swine Fever Virus specific monoclonal antibody and use thereof}
본 발명은 돼지열병 바이러스(Classical Swine Fever Virus: CSFV)와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 이를 포함하는 돼지열병 바이러스 검출용 조성물 및 키트; 상기 키트를 사용한 돼지열병 바이러스의 검출 방법 에 관한 것이다.
돼지열병(Classical Swine Fever: CSF) 또는 돼지 콜레라(hog cholera)는 은 돼지 아목의 포유동물들이 감염되는 매우 전염성이 높은 질병으로서, 세계동물보건기구(OIE) 관리 질병이자 국내 제1종 가축전염병으로 지정되어 있다. 병원체는 황열바이러스과(Flaviviridae family)에 속하는 페스티바이러스(pestivirus genus)로서, 돼지열병 바이러스(CSFV) 게놈은 positive single-stranded RNA이며 그 크기는 12.3 내지 12.5 kb로 알려져 있다. 돼지열병은 주로 경구 감염으로 발생하고, 고열, 식욕 감퇴 또는 후구 마비 등의 증상이 나타나며, 심한 경우 개체가 사지에 경련을 일으키고 폐사한다. 또한 급성의 경우 발병 이후 며칠 뒤 귀, 복부, 다리 안쪽 등이 보라색으로 변하고, 1-2주 내에 폐사하는 것으로 보고된다. 다만, 이러한 돼지열병의 임상 증상은 특이적이지 않기 때문에 정확한 진단을 위해서는 실험실적 진단이 필수적이다.
돼지열병은 높은 유병률과 치사율로 인해 농가에 경제적인 피해를 입힐 수 있으며, 독력(virulence)이 약한 바이러스도 임상 증상을 유발하지 않은 채로 약 3개월 간 장기적으로 배출되므로 예방과 방역이 중요한 질병이다. 국내의 경우 과거 돼지열병 근절 대책의 단계적 추진에 따라 2001년 12월 1일자로 돼지열병 청정국임을 선포한 적이 있으나, 이후 동북아 지역에서 새로운 유전형의 바이러스가 유입되거나 외래 돼지열병 바이러스가 감염된 종돈이 전국 양돈장에 분양, 전국적으로 확산되어 이후 백신접종 정책으로 전환되었다. 이에 돼지열병 백신 접종지역에서는 혈청학적 예찰 관리가 보다 더 중요한 상황이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 돼지열병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 이를 포함하는 돼지열병 바이러스 검출용 키트; 및 상기 키트를 사용한 돼지열병 바이러스의 검출 방법 등을 완성하였으며, 이는 돼지열병 바이러스의 감염 모니터링 및 백신 접종 평가 등에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
본 발명의 돼지열병 바이러스(Classical Swine Fever Virus: CSFV) 특이적 항체 및 이를 사용한 진단 키트는 기존에 알려진 진단 키트 또는 방법과 비교하여 돼지열병 바이러스의 검출 시간을 현저히 단축시킬 수 있는 바, 전파 속도가 빠른 돼지열병 바이러스의 감염 모니터링 등에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 및 진단 키트는 돼지열병 바이러스에 대해 높은 수준의 민감도 및 특이도를 나타내고, 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV) 및 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV) 등과 교차반응성을 나타내지 않으므로, 보다 정확한 검출 및 진단이 가능하다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2) 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역1 (Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 돼지열병 바이러스(Classical Swine Fever Virus: CSFV)와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
다른 양상은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역1(HCDR1), 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2) 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역1(LCDR1), 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 돼지열병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 명세서에서의 용어 "돼지열병 바이러스(Classical Swine Fever Virus: CSFV)"는 황열바이러스과(Flaviviridae family) 페스티바이러스(pestivirus genus)에 속하는 외피 단일가닥 RNA 바이러스인 CSF 바이러스를 의미하고, 그 게놈은 positive single-stranded RNA로 그 크기는 12.3 내지 12.5 kb로 알려져 있다. 돼지열병 바이러스를 구성하는 구조 단백질로는 뉴클레오캡시드, Erns(gp44), E1(gp33) 및 E2(gp55) 등이 있고, E2 단백질은 주요 구조 단백질로 바이러스 중화항체를 유발하는 당단백질(glycoprotein)로 알려져 있으며, 백신 개발에 활용된다.
본 명세서에서의 용어 "항체"는 돼지열병 바이러스에 대한 특이적인 항체로서, 구체적으로 이는 돼지열병 바이러스의 E2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 항체는 완전한 항체, 항체 분자의 항원 결합 단편, 합성 항체, 재조합 항체, 또는 항체 하이브리드(antibody hybrid)를 포함할 수 있다. 한편 상기 돼지열병 바이러스에 대한 서열 정보는 당업계에 이미 알려져 있다. 또한, 상기 항체는 단일클론 항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fv (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 단일클론 항체일 수 있다.
상기 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이고, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond, SS-bond)으로 연결된다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가질 수 있다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가질 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "단일클론 항체"는 상기 항체가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론 항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.
일 실시예에 따르면, 상기 돼지열병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 CSFV 5B(G)15-2은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2) 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역1 (Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 일 실시예에 따르면, 상기 돼지열병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 CSFV 5B(G)17-8은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역1(HCDR1), 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2) 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역1(LCDR1), 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또한, 상기 돼지열병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인될 수 있다.
상기 항체는 실시예에서 기술하고 있는 단일클론 하이브리도마 세포로부터 생산된 것일 수 있으며, 상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 하이브리도마 세포는 CSFV(strain LOM)를 접종한 CPK cell로부터 얻은 면역원을 동물에 면역화시키고, 면역화된 동물로부터 유래된 비장세포 및 골수종세포를 융합시켜 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 CSFV에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하는 방법으로 제조할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 제한없이 사용할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로서, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv: scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리도마 세포로부터 생산된 CSFV 후보항체를 각각 플레이트에 코팅하고 HRP conjugation을 진행한 후, CSFV와 Recombinant CSFV E2 항원(CSFV 양성 혈청) 및 CSFV 음성 혈청을 각각 반응시켜 CSFV 양성 혈청에는 반응하면서 CSFV 음성 혈청에 반응하지 않는, 변별력이 가장 높은 항체 pair로 mAb anti-CSFV 5B(G)17-8(Capture용 항체)와 mAb anti-CSFV 5B(G)15-2(Detector용 항체)를 선별하였다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지열병 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것으로, 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 키트에도 공히 적용된다. 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체(carrier) 또는 성분을 추가적으로 포함할 수 있고, 이는 사용 목적, 검체의 종류 및 상태 등에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 상기 조성물은 ELISA 진단법에 사용되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 Sandwich ELISA 진단법에 사용되는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 돼지열병 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다. 구체적으로, 이는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 코팅된 플레이트; 및 돼지열병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 돼지열병 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것으로, 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 키트에도 공히 적용된다.
상기 키트는 음성 대조혈청, 양성 대조혈청, 세척액, 효소 활성 측정용 기질액 및 효소 반응 정지액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 "표지체"는 효소, 발광체, 형광체, 발색체 등을 포함하며, HRP(horseradish peroxidase), Q dot(Quantum dot), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(glucose oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 콜로이드 금(colloidal gold), 형광물질, 방사성 물질 또는 색소(dye)일 수 있으나, 바람직하게는 HRP일 수 있다.
상기 "효소 활성 측정용 기질액" 및 "효소 반응 정지액"은 사용된 효소의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 당업계에 공지된 시약을 제한없이 사용할 수 있다. 일 실시예에 따르면, HRP에 대한 기질액으로서 테트라메칠벤지딘(TMB)을 가하여 15분간 실온에서 반응시키고 황산 용액으로 반응 정지하였다.
상기 키트는 항원-항체 반응을 검출할 수 있는 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있으며, 예를 들어 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포 분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip) 중 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로는 ELISA 진단법에 사용되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 Sandwich ELISA 진단법에 사용되는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, Capture용 항체를 코팅한 플레이트에 검체를 반응 시킨 후, 반응하지 않은 인자는 세척과정을 통해 제거하였다. 항체에 HRP를 컨쥬게이션(conjugation)한 Detector용 항체를 주입하여 반응 시켜서, 플레이트 표면의 capture용 항체와 결합한 항원과의 반응을 유도하였다. 반응하지 않은 잔여 Detector용 항체는 세척과정을 통해 제거한 후, TMB substrate를 넣어 표면에 결합되어 있는 HRP와의 반응을 유도하고, 발색된 정도를 통해 검체 내 항원의 존재 유무를 확인할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 키트 상에 검체를 반응시키는 단계; 및 효소 활성 측정용 기질액을 첨가하여 발색 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 돼지열병 바이러스의 검출 방법을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다. 일 실시예에 따르면, 상기 돼지열병 바이러스의 검출 방법은 기존 검출방법과 비교하였을 때 검사에 소요되는 시간이 현저히 단축되고, 기존 검출방법 대비 약 2 내지 3단계 더 높은 민감도 성능(102.8 TCID50) 및 높은 특이도 성능(100% (583/583))을 나타냄을 확인하였으며, pestivirus genus에 속하는 BVDV(Bovine viral diarrhea) 및 기타 PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus)에 대한 교차반응성 또한 없는 것으로 나타났다.
본 명세서에서의 용어 "검체"는 돼지열병이 감염된 것으로 의심되는 생물학적 시료를 의미하는 것으로, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 조직액, 소변, 눈물, 침, 젖, 구토물 또는 분변 등일 수 있으며, 구체적으로는 혈청일 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에 따르면, 상기 발색 정도를 확인하는 단계는 발색 기질과 효소 반응을 통해 항원-항체의 결합을 검출할 수 있는 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있으나, 구체적으로는 ELISA 진단법, 보다 구체적으로 Sandwich ELISA 진단법을 통해 실시될 수 있다.
일 양상에 따른 돼지열병 바이러스 특이적 항체 및 이를 사용한 ELISA 진단법을 통해 종래 기술 대비 돼지열병 바이러스의 검출 시간을 현저히 단축시킬 수 있으며, 교차반응성 없이 높은 민감도 및 특이도를 나타내어 관련 질병의 진단에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 CSFV Ag ELISA 키트(sandwich ELISA 키트)의 모식도를 나타낸 것이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: CSFV에 특이적인 항체를 생산하는 단일클론 하이브리도마의 제작 및 단일클론 항체의 생산
실시예 1-1: 면역원의 준비
농림축산검염본부에서 제공받은 CPK cell과 CSFV(strin LOM)를 이용하여 대량의 바이러스 배양액을 생산하였다. CSFV(strain LOM)를 접종한 CPK cell은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양배지로 37℃ 5% 이산화탄소 조건이 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양액은 회수하여 최종 농도가 10%가 되도록 PEG6000을 첨가하여 4℃에서 16시간 이상 교반 후 원심분리 하였으며, 침전물을 TNE buffer(50mM tris-HCl (pH7.4), 100mM NaCl, 0.1mM EDTA Acid))로 녹여 회수하였다. 침전물 회수액은 수크로오스(sucrose)를 이용한 gradient ultra centrifugation(sucrose 농도 20, 30, 40, 50%) 진행하였으며, 각 구간의 샘플을 회수하여 ELISA로 역가를 확인 후, 역가가 가장 높은 구간의 샘플을 면역원으로 준비하였다.
실시예 1-2: 마우스의 면역화
하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 상기 실시예 1-1에서 준비한 면역원과 동량의 완전 프로인드 어주번트(complete Freund's adjuvant)와 1:1로 혼합하여 자성의 6주령 Balb/c 마우스의 복강 내에 200ul/마리의 양으로 일주일 간격으로 4회 주사하였다. 마지막 4회차 주사 일주일 후 상동항원을 20% 농도(v/v)로 희석하여 2일 간격으로 2회 상기 마우스의 꼬리정맥에 20㎕/회 주사하여 부스팅(boosting)하였다. 세포융합을 하기 전 면역화된 마우스의 꼬리에서 채혈하여 얻어진 혈청을 PBS에 1/10씩 단계희석하여 ELISA로 CSFV에 대한 항체의 역가를 확인하였으며, 역가가 높은 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다.
실시예 1-3: 세포 융합 및 하이브리도마의 세포주 제조
면역화된 마우스에서 비장(spleen)을 적출하여 70um cell strainer를 이용하여 세포를 분리하였다. 비장세포를 원심분리하여 침전물을 획득하고 적혈구 용해 버퍼(Red blood cell lysis buffer, Sigma사)를 5ml 섞어준 뒤 1분간 방치하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 DMEM을 이용하여 3회 세척하고 세포 카운팅을 실시하였다. 상기 얻어진 비장세포 5개와 골수종세포(P3/NSI/1-Ag4-1 [NS-1] (ATCC® TIB-18??)) 1개의 비율로 혼합한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 천천히 분산시킨 후, PEG 1500을 처리하여 hybridoma cell을 제조하고 HAT와 소태아혈청(fetal bovine serum)이 20% 첨가된 IMDM 배양배지에 현탁하여 96well 조직배양 플레이트에 0.2 ㎖씩 분주한 후 37℃ 5% 이산화탄소 조건이 유지되는 배양기에서 배양하였으며 2일 간격으로 일주일 간 배지를 교체하였다.
실시예 1-4: CSFV에 대한 항체를 생산하는 단일클론 하이브리도마 세포의 선별
상기 실시예 1-3에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 CSFV에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 ELISA 분석 방법을 사용하였다. 먼저 실시예 1-1의 면역원을 마이크로 웰 바닥에 부착한 플레이트를 준비하여 하이브리도마 세포의 배양액을 각 100㎕/웰씩을 주입한 뒤 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이후 인산 완충용액-트윈 20(PBS-T) 용액으로 충분히 세척하여 플레이트에 부착된 항원과 반응하지 않은 배양액내 항체를 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 37℃에서 60분 동안 에서 반응시킨 다음, PBS-T 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 15분간 실온에서 반응시키고, 황산 용액으로 반응 정지 하였다. 항원-항체간 반응 정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과 CSFV에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 1차적으로 선별하였다. 선별된 잡종세포주는 제한 희석(limiting dilution)을 통해 단일클론 하이브리도마 세포주로 재선별 되었다.
실시예 1-5: 단일클론 항체의 생산 및 정제
상기 실시예 1-4에서 얻은 하이브리도마 세포를 HT가 포함된 소태아혈청 배지에서 배양하고 마우스 복강에 세포를 주입하여 복수를 제조한 뒤, 얻어진 복수를 가지고 단일클론 항체를 정제하였다. 먼저 20% 소태아혈청이 포함된 IMDM 배지에서 배양된 단일클론 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 얻은 뒤, 10㎖ DMEM로 2회 세척하여 소태아혈청을 제거하고 DMEM배지로 현탁하였다. DMEM 배지에 현탁한 세포들을 1×106 세포/ml 밀도로 마우스의 복강에 0.5ml 접종하고 7~9일 후 마우스에서 복수를 채취하였다. 상기 방법을 통하여 얻어낸 마우스 복수액은 원심분리(3000rpm, 10분, 4℃)를 통해 부유물을 침전시키고 상층액을 결합버퍼(Binding buffer, Thermo scientific사)와 1:1 비율로 섞어준 뒤 냉장(4℃)에서 12시간 이상 반응하였다. 반응 후 원심분리(3000rpm, 10분, 4℃)를 통해 다시 한번 부유물을 침전시키고, 1.2 um 실린지 필터를 사용하여 침전되지 않은 부유물을 재차 걸러내었다. 부유물이 완전히 제거된 복수액은 Protein G 레진(Cytiva사)이 들어있는 컬럼에 넣어, 항체와 Protein G 간의 결합을 유도하였다. 복수액이 컬럼을 모두 통과한 후 결합버퍼로 3회 세척한 뒤 용출버퍼(Elution buffer, Thermo scientific사)을 사용하여 용출하여 인산염완충용액(PBS)로 투석하여 사용하였다.
실시예 2: CSFV Ag ELISA 개발을 위한 항체 원료의 선발
Capture와 Detector로 적용 가능한 항체를 선발하기 위하여, 제작된 CSFV 후보항체를 각각 플레이트에 코팅하고, HRP conjugation을 진행하였다. 후보항체가 코팅된 플레이트에 CSFV와 Recombinant CSFV E2 항원, 그리고 CSFV 음성 혈청을 각각 반응시킨 후, Detector 후보 항체를 반응시키는 sandwich ELISA 검사를 수행하였다. 그 결과, 양성(CSFV 및 Recombinant CSFV E2 항원) 혈청에 반응을 하면서, CSFV 음성 혈청에 반응하지 않는 항체 pair를 선발하였다. 그 중, 음성과 양성에 대한 변별력이 가장 높은 항체 pair를 최종 원료로 선발하였다. 그 결과, mAb anti-CSFV 5B(G)17-8(Capture용 항체)와 mAb anti-CSFV 5B(G)15-2(Detector용 항체)가 최종 원료로 채택되었다.
실시예 3: CSFV Ag ELISA 진단법의 개발
실시예 3-1: CSFV Ag ELISA 진단법의 원리
상기 실시예 2에서 채택된 항체 원료를 사용하여, CSFV Ag ELISA 키트를 제작하였으며, 키트의 모식도는 도 1과 같다. Capture용 항체를 코팅한 플레이트에 검체를 반응 시킨 후, 반응하지 않은 인자는 세척과정을 통해 제거하였다. 항체에 HRP를 컨쥬게이션(conjugation)한 Detector용 항체를 주입하여 반응 시켜서, 플레이트 표면의 capture용 항체와 결합한 항원과의 반응을 유도하였다. 반응하지 않은 잔여 Detector용 항체는 세척과정을 통해 제거한 후, TMB substrate를 넣어 표면에 결합되어 있는 HRP와의 반응을 유도하고, 발색된 정도를 통해 검체 내 항원의 존재 유무를 확인할 수 있다.
실시예 3-2: CSFV Ag ELISA의 검사 시간 비교
기 상용화된 CSFV 항원진단 ELISA(비교예)와 본 진단법의 검사방법 상의 차이를 아래 표 1과 같이 정리하였다. 기 상용화된 키트의 검사방법은 모두 sandwich ELISA로 동일한 검사 원리로 확인되었으나, 총 검사에 소요되는 시간에서 큰 차이를 보였다. 구체적으로, 본 진단법의 검사 반응 시간은 총 105분이었으나, 기 상용화된 키트의 경우 최소 160분에서 최대 255분으로 확인되었다. 이로부터 본 발명의 돼지열병 바이러스의 검출 방법이 기존 방법 대비 검사 시간 면에서 현저히 단축되는 효과가 있음을 확인하였다.
제조사 본 진단법
(BIONOTE) 		비교예 1 비교예 2 비교예 3
원료
구성 		Plate mAb anti-CSFV Anti-CSFV E2 mAb anti-Erns mAb Anti-CSFV pAb
Detector mAb anti-CSFV-HRP conjugate Anti-CSFV-HRP conjugate anti-Erns pAb HRP conjugate Anti-CSFV-HRP conjugate
Assay format Sandwich ELISA Sandwich ELISA Sandwich ELISA Sandwich ELISA
검사
방법 		검체
반응 		검체 사용량 50uL,
37℃, 1 hr		 검체 사용량 50uL,
37℃, 90 min
or
RT, O/N		 검체 사용량 50uL,
37℃, 2 hr
or
2~8°C, O/N		 검체 사용량 50uL,
RT, 3 hr
Detector 반응 37℃, 30 min 37℃, 1 hr RT, 30 min RT, 1 hr
기질액
반응 		RT, 15 min RT, 10 min RT, 10 min RT, 15 min
검사시간 1 hrs 45 min 2 hrs 40 min
(17 hrs 10 min)		 2 hrs 40 min
(18 hrs 40 min)		 4 hrs 15 min
판정
기준 		계산
방법 		S/P ratio = (Sample - NC) / (PC - NC) S/P ratio = (Sample-NC) / (PC-NC) x 100 S-N = (Sample - NC) PP = ((Sample - NC) / (PC - NC)) x 100
음성판정 S/P ratio < 0.2 S/P ratio < 15 S-N ≤ 0.300 PP < 15%
양성판정 S/P ratio ≥ 0.2 S/P ratio ≥ 20 S-N > 0.300 PP ≥ 15%
* RT: room temperature, Sample: 검체 흡광도 NC: 음성 대조혈청 흡광도, PC: 양성 대조혈청 흡광도
실시예 3-3: CSFV Ag ELISA의 민감도 비교
CSFV(strain LOM)를 CSFV 음성혈청인 Normal porcine serum(이하 NPS, Gibco, Ref.No.26250-084)에 단계 희석하여 바이러스 역가별 검체를 제조하였다. 제조된 검체를 본 진단법 및 기 상용화된 키트(비교예)로 각각 검사하여 양성으로 판정되는 최소 검출한계를 비교하였다. 그 결과, 본 진단법(BIONOTE)은 102.8 TCID50까지를 양성으로 판정 가능하였다. 비교예 1의 경우는 103.7 TCID50에서도 음성으로 판정하였고, 비교예 2와 비교예 3은 각각 103.7 TCID50 와 103.4 TCID50의 검출한계를 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 돼지열병 바이러스의 검출 방법이 기존 방법 대비 약 2~3 단계 더 높은 민감도 성능을 지님을 확인하였다.
제조사 본 진단법
(BIONOTE) 		비교예 1 비교예 2 비교예 3
O.D S/P
ratio 		Result O.D S/P
ratio 		Result O.D S-N Result O.D PP Result
Control NC 0.066 0.00 - 0.021 0 - 0.005 0.000 - 0.062 0 % -
PC 2.004 1.00 Pos. 0.867 100 Pos. 1.043 1.037 Pos. 1.309 100 % Pos.
CSFV LOM strain, dil. with NPS 10 3.7 2.705 1.36 Pos. 0.106 10 - 0.411 0.406 Pos. 0.442 31 % Pos.
10 3.4 2.060 1.03 Pos. 0.046 3 - 0.174 0.169 - 0.343 23 % Pos.
10 3.1 1.008 0.49 Pos. 0.029 1 - 0.086 0.081 - 0.211 12 % -
10 2.8 0.500 0.22 Pos. 0.023 0 - 0.050 0.045 - 0.226 13 % -
10 2.5 0.261 0.10 - 0.019 0 - 0.026 0.021 - 0.219 13 % -
NPS 0.058 0.00 - 0.014 -1 - 0.001 -0.004 - 0.135 6 % -
실시예 3-4: CSFV Ag ELISA의 특이도 비교
가. 특이도 성능 평가
국내 CSFV 비발생 지역의 CSFV 백신접종 농가 및 도축장의 돼지혈청과, CSFV 청정화 지역인 제주도에서 입수한 돼지혈청을 검체 총 583개를 검사하여 본 진단법의 특이도 성능을 확인하였다. 그 결과 본 진단법(BIONOTE)의 경우 100% (583/583)의 특이도 성능이 확인되었고, 비교예의 경우 98.6% (575/583)의 성능을 확인하였다. 이로부터 본 발명의 돼지열병 바이러스의 검출 방법이 기존 방법 대비 더 높은 특이도 성능을 지님을 확인하였다.
검체 내역 입수년도 입수지역 검체 수 본 진단법
(BIONOTE) 		비교예
CSFV 백신접종 농가 돼지혈청 2019~2020 국내 440 100% (440/440) 98.2% (432/440)
CSFV 백신접종 지역 도축장 돼지혈청 2014 충북/전북 69 100% (69/69) 100% (69/69)
CSFV 청정화 지역 돼지혈청 2010 제주도 74 100% (74/74) 100% (74/74)
총 합계 583 100% (583/583) 98.6% (575/583)
나. 분석적 특이도(교차반응성) 평가
CSFV와 같은 pestivirus에 속하는 BVDV 및 국내 유행하였던 PEDV에 대한 교차반응성을 확인하고자 하였다. 그 결과, 본 진단법은 두 바이러스 배양액에 대해 모두 음성으로 판정하여, BVDV 및 PEDV에 대한 교차반응성이 없음을 확인하였다.
판정 기준 S/P ratio: 0.20 이상 양성 비고
O.D S/P ratio Result
Control NC 0.029 0.00 -
PC 2.075 1.00 Pos.
CSFV,
dil. with NPS 		10 3. 7 TCID 50 3.624 1.76 Pos.
10 3.4 TCID 50 2.549 1.23 Pos.
10 3.1 TCID 50 1.089 0.52 Pos.
10 2.8 TCID 50 0.474 0.22 Pos.
10 2.5 TCID 50 0.285 0.13 -
NPS 0.037 0.00 -
BVDV 원액 0.026 0.00 - IDEXXBVDVAg/Serumplustest
S-N3.897, 양성 확인
PBS - - -
PEDV 원액 0.022 0.00 - BIONOTEPEDAgRapid
color scale 80%, 양성 확인
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> BIONOTE, INC. National Veterinary Research and Quarantine Service <120> Classical Swine Fever Virus specific monoclonal antibody and use thereof <130> PN142615KR <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 1 Thr Glu Tyr Thr Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 2 His Ile Asp Pro Asn Asn Arg Asp Thr Thr Tyr Asn Arg Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 3 Gly Thr Tyr 1 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 4 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 5 Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 6 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Phe His Asn Asp Met 1 5 10 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 7 Ser Tyr Ser Thr Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 8 Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 9 Gln Ala His Tyr Tyr Gly Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 10 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Ser Leu His 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 11 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 12 Gln Gln Gly Ser Ser Met Pro 1 5

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2) 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역1 (Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 돼지열병 바이러스(Classical Swine Fever Virus: CSFV)와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2) 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역1 (Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 돼지열병 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 돼지열병 바이러스의 E2 단백질과 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 돼지열병 바이러스 검출용 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 돼지열병 바이러스 검출용 키트
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 제1항 또는 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 코팅된 플레이트; 및
    제1항 또는 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 돼지열병 바이러스 검출용 키트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 키트는 음성 대조혈청, 양성 대조혈청, 세척액, 효소 활성 측정용 기질액 및 효소 반응 정지액을 추가로 포함하는 것인, 돼지열병 바이러스 검출용 키트.
  9. 제6항에 있어서, 상기 항체는 돼지열병 바이러스의 E2 단백질과 특이적으로 결합하는 것인, 돼지열병 바이러스 검출용 키트.
  10. 제6항에 있어서, 상기 키트는 ELISA 진단법에 사용되는 것인, 돼지열병 바이러스 검출용 키트.
  11. 제6항의 키트 상에 검체를 반응시키는 단계; 및
    효소 활성 측정용 기질액을 첨가하여 발색 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 돼지열병 바이러스의 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 검체는 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 조직액, 소변, 눈물, 침, 젖, 구토물 및 분변 중 어느 하나인 것인, 돼지열병 바이러스의 검출 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 발색 정도를 확인하는 단계는 ELISA 진단법을 통해 실시되는 것인, 돼지열병 바이러스의 검출 방법.
KR1020220046405A 2022-04-14 2022-04-14 돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도 KR102450481B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220046405A KR102450481B1 (ko) 2022-04-14 2022-04-14 돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220046405A KR102450481B1 (ko) 2022-04-14 2022-04-14 돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102450481B1 true KR102450481B1 (ko) 2022-10-06

Family

ID=83597245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220046405A KR102450481B1 (ko) 2022-04-14 2022-04-14 돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102450481B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117447602A (zh) * 2023-12-22 2024-01-26 北京索莱宝科技有限公司 猪IgM的抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040062218A (ko) * 2002-12-31 2004-07-07 대한민국(관리부서 농림부 국립수의과학검역원) 돼지콜레라 바이러스에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는하이브리도마 세포주, 및 단일클론항체를 이용한돼지콜레라 바이러스 검출법
KR20140080860A (ko) * 2012-12-20 2014-07-01 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브 및 이를 이용한 돼지열병바이러스 진단 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040062218A (ko) * 2002-12-31 2004-07-07 대한민국(관리부서 농림부 국립수의과학검역원) 돼지콜레라 바이러스에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는하이브리도마 세포주, 및 단일클론항체를 이용한돼지콜레라 바이러스 검출법
KR20140080860A (ko) * 2012-12-20 2014-07-01 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 돼지열병바이러스 검출용 바이오 프로브 및 이를 이용한 돼지열병바이러스 진단 방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117447602A (zh) * 2023-12-22 2024-01-26 北京索莱宝科技有限公司 猪IgM的抗体及其应用
CN117447602B (zh) * 2023-12-22 2024-03-19 北京索莱宝科技有限公司 猪IgM的抗体及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016080701A1 (ko) 중동호흡기증후군 코로나바이러스 뉴클레오캡시드를 인식하는 항체 및 그의 용도
EP4174085A1 (en) Antibody against sars-cov-2, method for detecting sars-cov-2 using antibody and kit containing antibody
CN113493508A (zh) 一种用于检测新冠病毒n蛋白的双抗体夹心elisa试剂盒
KR102450481B1 (ko) 돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도
KR102189893B1 (ko) bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
US10526398B2 (en) Anti-dengue virus antibodies and applications thereof
KR100832870B1 (ko) 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론항체 및 이것의 용도
KR101263913B1 (ko) 우결핵 진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단 방법
KR102078879B1 (ko) 돼지파보바이러스에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도
CN116143909B (zh) 一种抗hiv-1 p24的抗体及其制备方法和用途
CN115806611A (zh) 抗新型冠状病毒n蛋白的抗体及其应用
KR20210116115A (ko) 돼지 유행성 설사병 바이러스와 결합하는 항체 및 이의 용도
EP1765867B1 (en) Monoclonal antibodies to hiv-1 vpr and methods of using same
JP3894381B2 (ja) 抗Ｇｌｕ▲１７▼−オステオカルシン抗体
KR101025595B1 (ko) 노로바이러스 검출용 항체, 및 이를 이용한 노로바이러스검출방법
KR102614002B1 (ko) 구제역 바이러스 a형에 면역반응성을 나타내는 항체, 이를 포함하는 구제역 바이러스 a형 항체 검출용 조성물, 및 이를 이용하는 구제역 바이러스 a형 항체를 검출하는 방법
KR20070103547A (ko) 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론항체 및 이것의 용도
CN116143931B (zh) 一种抗人IgM抗体及其制备方法和用途
KR102241521B1 (ko) 구제역 바이러스 o형에 면역 반응성을 나타내는 항체를 이용한 구제역 백신 접종으로 생성된 항체를 검출하는 방법
WO2023035988A1 (zh) 一种抗登革ns1蛋白的抗体及其应用
CN115873103B (zh) 一种抗新型冠状病毒n蛋白的抗体及其制备方法和用途
KR102168417B1 (ko) 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도
CN115850459B (zh) 靶向新型冠状病毒n蛋白的抗体及其应用
WO2023078452A1 (zh) 一种抗登革ns1蛋白的抗体及其应用
KR102227257B1 (ko) 플라비바이러스 외피 단백질 도메인 ⅲ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant