KR102189893B1

KR102189893B1 - bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102189893B1
Application number: KR1020180135344A
Authority: KR
Inventors: 김봉휘; 하영주; 김세영; 김지나
Original assignee: (주)에스엘에스바이오
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2020-12-11
Also published as: EP3712167A4; US20200326347A1; CN111587252B; WO2019098603A2; CA3082923C; AU2018370072B2; CN111587252A; US11953504B2; EP3712167A2; CA3082923A1; JP7013051B2; JP2021503014A; AU2018370072A1; WO2019098603A3; KR20190055741A

Abstract

본 발명은 bPAG1(bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포; 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 소의 임신 진단용 조성물; 소의 임신 진단 키트; 및 소의 임신 진단방법에 관한 것으로, 상기 항체는 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1에 특이적으로 결합하므로, 소와 같이 번식이 중요한 동물에 있어서 임신을 간단하게 진단할 수 있는바 번식 효율을 높여 축산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도{Antibody specifically binding a bPAG1 and use thereof}

본 발명은 소 임신-연관 글리코단백질1 (bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1, bPAG1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

산업동물인 소의 사육에서는 대부분이 새끼 생산을 통해 농가의 소득이 이루어지고 있는 실정이다. 한편, 소의 번식에서는 수태를 시키는 것도 중요하지만, 수정을 시킨 소의 임신여부를 조기에 진단하는 것 또한 비수태 동물을 조기에 별도 관리할 수 있어 공태 기간을 줄일 수 있으므로, 농가의 원가 절감이 가능하다. 현재, 소 임신진단의 대부분은 수의사 또는 인공 수정사에 의해 임신 30 내지 42일에 태막 촉진법에 의해 이루어지고 있다. 또한, 다른 방법으로는 우유 내의 프로게스테론을 방사성 면역법(radiommunoassay, RIA)을 이용하여 검사하는 방법이 있다. 이 방법에 의하면 프로게스테론은 임신의 정상적 진행과 유지에 필요한 스테로이드계 호르몬으로서, 프로게스테론의 혈청 역가가 임신 초기에 상승하므로, 상기 호르몬의 상승 정도를 우유 내에서 확인하는 방법이다. 그러나, 상기 방사성 면역분석법은 방사성 물질을 이용하여 위험성이 따를 뿐만 아니라, 복잡한 실험 장비를 사용해야 하며, 프로게스테론의 양은 소에 따라 다르기 때문에 기준이 불명확하여, 정확한 진단을 위해서는 최소한 2회 이상의 실험을 해야 하는 문제점이 있다. 따라서, 기존의 문제점을 해결함과 동시에, 보다 간편하고 신속하게 소의 임신을 초기에 정확하게 진단할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요하다.

일 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다.

다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포(수탁번호 KCLRF-BP-00416)를 제공하는 것이다.

다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 소의 임신 진단용 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검체 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 bPAG1 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 소에서 임신을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1에 특이적으로 결합하는 신규 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제작하고 상기 세포로부터 상기 항체를 다량으로 분리 정제하여 소의 임신 여부를 비교적 간단한 방법으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 내 용어, “소 임신-연관 글리코단백질1 (bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1, bPAG1) 단백질"은 소의 임신성 혈장 단백질로서, 임신에 따라 출현 또는 증량하는 혈류 단백질을 총칭한다. 상기 bPAG1는 단백질의 천연 형태, 그 변이체, 및 이의 기능적 등가물을 포함한다. 상기 bPAG1는 천연 세포 또는 재조합 세포로부터 분리되거나, 인공적으로 합성될 수 있다.

본 명세서 내 용어, “항체”는 단일 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 상기 항체는 달리 언급이 없으면 당업계에서 알려진 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드에 의하여 형성된 항원 결합 특이적 부위를 포함하는 분자 또는 그 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항체는 혈장 세포(plasma cell) 또는 하이브리도마 세포에 의해 생산될 수 있다. 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody)일 수 있다. 구체적으로, 수탁번호 KCLRF-BP-00416인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다. 본 명세서 내 용어, “항원-항체 복합체”는 bPAG1 단백질과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 복합체는 시료 중의 bPAG1 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 복합체는 예를 들어, 소의 뇨, 혈청 또는 혈장 등의 생물학적 시료 중 bPAG1을 검출하는데 사용될 수 있다.

일 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항체는 상기 항체가 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1 단백질을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 항원-결합 단편을 포함할 수 있으며, 상기 항원-결합 단편은 F(ab')2, Fab, Fab, Fv 단편 등을 포함할 수 있다.

일 실시예에서 bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체와 특이적으로 결합하는 에피토프(epitope)를 분석한 결과, 항원의 농도 의존적으로 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 상기 항체는 동일한 항원 농도에서 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 비해 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대하여 특이적으로 결합하는 양이 현저하게 높았다. 따라서, 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 에피토프 폴리펩티드에 결합하는 것일 수 있다. 또한, 상기 항체의 완전한 형태는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이술피드 결합으로 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 중쇄는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 단편 모두일 수 있다. 상기 경쇄는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체 길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미할 수 있다. 이때, 상기 중쇄는 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 입실론(ε)의 불변 영역을 포함하고, 경쇄는 카파(κ) 및 람다(λ) 타입의 불변 영역을 포함한다. 상기 항체는 예를 들면, 면역글로불린 M(IgM)일 수 있다.

다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포(수탁번호 KCLRF-BP-00416)를 제공한다. 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 마우스의 비장세포를 확보하고, 이를 마우스 골수종 세포와 융합하여 배양한 후, 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체가 확인된 하이브리도마 세포만을 선택하였다. 이후, 상기 하이브리도마 세포를 한국세포주은행(KCLB, Korean Cell Line Bank)에 기탁하여 2017년 12월 22일 수탁번호 KCLRF-BP-00416를 부여 받았다.

상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 이를 시험관 내 또는 생체 내에서 다량으로 배양하는데 사용될 수 있다. 상기 하이브리도마 세포가 생산하는 항체는 정제하지 않고 사용할 수 있으나, 최선의 결과를 얻기 위하여 공지된 방법에 따라 고순도 예컨대, 95% 이상으로 정제하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 투석, 염 친전, 크로마토그래피 등의 정제방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.

다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 소의 임신 진단용 조성물을 제공한다. 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 조성물은 상기 항체에 대한 희석제, 버퍼, 안정화제 등과 같은 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 검출 시약을 포함할 수 있다.

다른 양상은 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 소의 임신 진단용 키트를 제공한다. 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 구체적으로, 본 발명에 따른 소의 임신 진단용 키트에는 bPAG1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구 또는 시약이 포함될 수 있다. 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 에피토프 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 이때, 면역학적 분석에 사용되는 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다. 상기 표지 물질이 효소인 경우, 상기 키트는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지 시약 등을 포함할 수 있다.

상기 담체는 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카리드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

다른 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검체 시료에 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 bPAG1 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 소의 임신을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

일 구체예에 따른 소의 임신을 진단하는 방법은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검체 시료에 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 시료는 소로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 임신 여부를 확인하고자 하는 소의 유즙, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨일 수 있다. 상기 접촉시키는 단계는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 시료를 액체 매질 중에서 인큐베이션 하는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 시료 중 항원과 상기 항체가 항원-항체 결합을 하는데 적합한 온도, pH 및 교반 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 2 내지 37℃에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 pH 6 내지 8에서 수행되는 것일 수 있다.

일 구체예에 따른 소의 임신 진단 방법은 상기 항체 또는 항원-결합 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 검출하는 단계는 항원-항체 복합체를 직접 분리하여 그 존재를 확인하거나, 분리 또는 분리하지 않고 상기 복합체를 생화학, 면역화학 분석법 등의 방법을 수행하여 검출하는 것일 수 있다. 상기 분석 방법은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 항원-항체 복합체는 검출 가능한 표지(detectable lavel)로 표지되거나 검출 가능한 표지를 발생시킬 수 있는 물질로 표지될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지 또는 검출 가능한 표지를 발생시킬 수 있는 물질은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticla), 레독스 분자 및 방사선동위원소로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 효소는 예컨대, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제, 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 형광물질은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있다. 상기 발광물질은 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 상기 미세입자는 콜로이드금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄W(CN)⁸, [Os(bpy)3]²⁺, [RU(bpy)₃]²⁺ 또는 [MO(CN)₈]⁴ ^- 등일 수 있다. 상기 방사선동위원소는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I 또는 ¹⁸⁶Re 등일 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 소의 임신 여부에 따라 출현 또는 증량하는 혈장 단백질에 특이적으로 결합하여 항원-항체 복합체를 형성하며, 상기 항원-항체 복합체의 분석을 통하여 소의 임신 여부를 비교적 간단한 방법으로 진단할 수 있는 바, 소의 번식 효율을 높여 축산업에 유용하게 이용될 수 있다.

일 양상은 bPAG1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체는 소의 임신성 혈장 단백질인 bPAG1에 특이적으로 결합하므로, 소와 같이 번식이 중요한 동물에 있어서 임신을 간단하게 진단할 수 있는바, 번식 효율을 높여 축산업에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 bPAG1 단백질의 분자적 정보를 나타낸 것이다.
도 2는 아이소타입 스크리닝 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 면역글로불린 M을 분리한 후, Bradford assay를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 3에서, 도 3a는 분리한 3B1 클론의 정량 그래프를 나타낸 것이고, 도 3b는 분리한 3B3 클론의 정량 그래프를 나타낸 것이고, 도 3c는 분리 정제한 항체의 멤브레인 상에서의 활성 정도를 나타낸 사진이다.
도 4는 bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체의 에피토프 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 소의 임신 진단 방법을 나타낸 모식도이다.
도 6은 간이 제조한 키트를 이용하여 소의 임신을 진단한 결과를 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[준비예]

항체 제조용 항원 펩티드는 bPAG1 단백질의 150~200번째 및 350~400번째 아미노산 서열 중 40개를 선정하였으며, 키홀-림펫 헤모사이아닌(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)의 유무에 따라 4 종류로 진행하였다. bPAG1 단백질 단편의 아미노산 서열은 서열번호 5 (PAG1_100) 및 서열번호 6 (PAG1_300)의 서열을 갖는다.

[실시예]

실시예 1. 항원을 이용한 면역 반응 유도

1-1. bPAG1_100

준비예의 항원(bPAG1_100) 100㎕과 동량의 컴플리트 애쥬번트(Complete adjuvant)를 이용하여 항원 유화액을 만든 후, 8 주령의 암컷 마우스(BALB/C) 피하에 투여하여 면역반응을 유도하였다. 1차 투여 후, 2주 간격으로 동일한 항원 100㎕과 동량의 인컴플리트 애쥬번트(Incomplete adjuvant)를 이용하여 상기 마우스의 피하에 투여하였다. 항원 투여 일정 등에 관한 사항은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

1-2. bPAG1_100-KLH

항원 bPAG1_100-KLH을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

1-3. bPAG1_300

항원 bPAG1_300을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

1-4. bPAG1_300-KLH

항원 bPAG1_300-KLH을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

차수	항원	농도(㎎/㎖)	투여량(㎍)
1차	실시예 1-1	0.5	75	+ 컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
1차	실시예 1-2	0.3125	46.875	+ 컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
2차	실시예 1-1	0.5	75	+ 인컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
2차	실시예 1-2	0.3125	46.875	+ 인컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
1차	실시예 1-3	0.5	75	+ 컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
1차	실시예 1-4	0.3125	46.875	+ 컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
3차	실시예 1-1	0.5	75	+ 컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
3차	실시예 1-2	0.3125	46.875	+ 컴플리트 애쥬번트 (v/v 1:1 혼합)
2차	실시예 1-3	0.5	75	+incomplete adjuvant (v/v 1:1 혼합)
2차	실시예 1-4	0.3125	46.875	+incomplete adjuvant (v/v 1:1 혼합)
3차	실시예 1-3	0.5	75	+complete adjuvant (v/v 1:1 혼합)
3차	실시예 1-4	0.3125	46.875	+complete adjuvant (v/v 1:1 혼합)

실시예 2. 항체의 역가 확인

2-1. bPAG1_100

상기 실시예 1-1의 항원 투여를 3회 진행한 후, 상기 마우스의 꼬리 정맥에서 혈청(serum)을 소량 채혈하여 ELISA test를 통해 혈청 내 다클론 항체의 역가를 확인하였다. 구체적으로, bPAG1_100 항원 2 ㎍/㎖을 well당 100㎕씩 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, 코팅하였다. 다음날 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응(blocking)시켰다. 이후, 마우스 혈액에서 얻은 혈청을 사용하여 배율에 맞게 희석하여 웰에 100 ㎕를 분주한 후, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트는 PBST를 사용하여 세척한 후 HRP가 컨쥬게이션(conjugation)되어 있는 Goat anti-mouse IgG-HRP를 1:2000 비율로 희석하여 웰에 100 ㎕를 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PBST를 사용하여 세척하고, TMB 용액을 분주하여 15분간 반응 시킨 후 반응 정지액을 사용하여 반응을 종결하였다. 450/620 nm에서 흡광도 값을 측정하여 혈청 내 역가(titer)를 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 2 및 표 3에 나타냈다.

2-2. bPAG1_100-KLH

항원 bPAG1_100-KLH을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

2-3. bPAG1_300

항원 bPAG1_300을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

2-4. bPAG1_300-KLH

항원 bPAG1_300-KLH을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

PAG1-100 코팅
혈청 농도		대조군	NC1	NC2	NC3	실시예 2-1	실시예 2-2	실시예 2-3	실시예 2-4
x 100	A	0.203	0.087	0.145	0.111	2.393	2.483	0.195	0.151
x 200	B	0.084	0.037	0.062	0.045	2.176	2.265	0.087	0.069
x 400	C	0.03	0.014	0.025	0.018	2.018	1.916	0.035	0.029
x 800	D	0.013	0.009	0.011	0.01	1.547	1.518	0.015	0.013
x 1600	E	0.009	0.006	0.008	0.006	1.029	0.998	0.016	0.019
x 3200	F	0.006	0.006	0.006	0.007	0.562	0.554	0.014	0.002
x 6400	G	0.005	0.005	0.011	0.011	0.288	0.263	0.005	0.005
x 12800	H	0.005	0.005	0.005	0.005	0.134	0.127	0.005	0.005

PAG1-300 코팅
혈청 농도		대조군	NC1	NC2	NC3	실시예 2-1	실시예 2-2	실시예 2-3	실시예 2-4
x 100	A	0.15	0.075	0.125	0.082	0.159	0.012	2.558	2.583
x 200	B	0.059	0.027	0.048	0.033	0.073	0.048	2.317	2.34
x 400	C	0.021	0.012	0.018	0.015	0.03	0.019	2.114	2.164
x 800	D	0.01	0.007	0.009	0.008	0.013	0.01	1.828	1.921
x 1600	E	0.007	0.006	0.006	0.007	0.007	0.005	1.434	1.446
x 3200	F	0.005	0.005	0.006	0.005	0.006	0.006	0.869	0.887
x 6400	G	0.005	0.004	0.005	0.005	0.005	0.004	0.385	0.454
x 12800	H	0.005	0.004	0.005	0.005	0.005	0.005	0.224	0.246

그 결과, 표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, bPAG1의 항원성 분석을 통해 합성하여 얻어진 PAG1-100과 PAG1-300 펩타이드가 bPAG1 항체를 다량 생산하였음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조 및 단일클론 항체 분리

3-1. 하이브리도마 세포의 제조

상기 실시예 2의 항체 역가 확인 실험을 통해 확인된 마우스의 혈청 내 역가를 기준으로 높은 역가를 갖는 항체들이 생성되었음을 확인하고 상기 마우스의 림프구를 분리하여 세포 융합을 실시하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-1 내지 1-4에서 면역 반응이 유도된 마우스의 비장을 손상 없이 적출하여 DMEM (Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium) 배지로 세척하고, 림프구를 분리하여 60㎜ 디쉬(dish)에 DMEM 배지를 담아 단일 세포로 분리시켰다. 이후, RBC 용해 버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 림프구에 섞여있는 적혈구를 제거한 후, DMEM 배지로 세척하고, 준비된 골수종 세포(Myeloma cell, SP2/0 Ag 14 - ATCC #CRL-1581)과 림프구를 세포 수 대비 1:5로 혼합하였다. 이후, 상기 혼합된 세포들에 PEG1500 1.7 ㎖를 첨가해 세포 융합을 유도하고, 96 웰 플레이트에 웰 당 200 ㎕씩 세포를 분주 한 뒤 CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 세포 융합 2일 후, 각 웰 당 50%를 HAT 배지(hypoxanthine-aminopterinthymidine medium)로 교체하였고, 12일 후, 콜로니(colony)를 확인하여 bPAG1 단백질 펩티드(ELISA 확인용 항원)와의 반응 여부를 상기 실시예 2와 동일한 ELISA (Asb. 450 nm) 방식으로 진행하여 결정하였다. 상기 ELISA 결과 중, O.D 값을 기준으로 1.0 이상인 경우, 양성(positive)으로 선정하여 단일클론 항체를 생산하기 위한 모세포로 선정하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타냈다.

bPAG100						bPAG300
1A1	1B3	2A6	2C2	3A6	N	4A1
1.877	0.97	2.49	1.475	0.704	0.02	3.036
1A2	1B4	2B1	2C3	3B1		4A2
1.689	1.776	1.797	1.382	1.558		1.966
1A3	1B5	2B2	2C4	3B2		4A3
2.651	0.251	0.985	3.283	2.766		0.389
1A4	2A1	2B3	3A1	3B3		4A4
2.146	2.649	1.11	1.504	2.996		0.181
1A5	2A2	2B4	3A2	3B4		4A5
0.68	2.631	0.157	0.478	1.053		0.146
1A6	2A3	2B5	3A3	3B5		N
1.431	3.164	3.106	0.904	1.058		0.125
1B1	2A4	2B6	3A4	3B6
2.522	2.847	3.16	0.076	0.745
1B2	2A5	2C1	3A5	3C1
0.872	0.108	2.929	1.133	2.246

3-2. 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 선별

상기 실시예 3-1에서 제조한 융합세포군 중 bPAG1에만 특이적으로 반응하는 세포를 선별하고 항체의 생성여부를 확인하기 위하여, 효소 면역방법을 이용하여 스크리닝 하였다.

세포융합 후 12일째에 배지를 교환하고, 교환한 배지를 1차 항체로 사용하여 ELISA 시험을 수행하였다. ELISA 시험 후 해당 항원에 양성을 보이는 웰을 선택하여 24 웰로 옮겨 배양하였다. 24 웰에서 배양한 하이브리도마 세포주를 동일한 방법으로 다시 ELISA 시험을 수행하여 항체 역가를 확인함과 동시에 항체 생성 세포주를 2차 스크리닝 하였다. 24 웰에서 키운 융합세포의 흡광도(O.D값)를 ELISA로 확인하고, 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하여 6 웰 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA로 확인하여 3차 스크리닝을 수행하였다. 3차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 다시 75T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 ELISA로 흡광도를 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하였다. 상기 과정을 거쳐 선정된 세포주를 하기 표 5에 나타냈다.

bPAG1_100	1A6, 2A6, 2B6, 2C4
bPAG1_100-KLH	3A6, 3B1, 3B3, 3B5
bPAG1_300	4A1, 4A3

표 5에 나타난 바와 같이, bPAG1-100을 결합부위로 하는 항체는 1A6, 2A6, 2B6, 2C4, 3A6, 3B1, 3B3, 및 3B5 세포주가 최종 선별되었으며 bPAG-300을 결합부위로 하는 항체는 4A1 및 4A3 세포주가 선별되었다. 그 중, 융합세포 3B1을 한국세포주은행(KCLB)에 2017년 12월 5일자로 기탁하였다(수탁번호: KCLRF-BP-00416).

실시예 4. bPAG1 단백질에 대한 단일클론항체의 생산 및 정제

상기 실시예 3-2에서 최종 선택한 융합세포로부터 bPAG1에 단백질에 대한 단일클론 항체를 대량 생산하기 위하여 6 주령 마우스(BALB/C)의 복강에 0.5 ㎖ 인컴플리트 애쥬번트를 투여하였다. 3일 후, 상기 실시예 3-1에서 선정된 하이브리도마 세포 중 O.D 값이 높은 것으로 확인된 각각의 세포를 마우스 1 마리당 100 ㎕(1x10⁶ cell)씩 투여하였다. 6~10일 후, 상기 마우스의 복강에서 복수(ascite)를 채취하였다.

실시예 5. bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체의 분리

상기 실시예 3에서 선별한 융합세포들로부터 bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체를 분리하기 위하여 투석 팩(Dialysis pack)에 주사기를 사용하여 복수를 넣어주었다. 이후, 2 mM PB 2L를 비커에 넣고, 마그네틱 바와 시료가 들어있는 투석 색을 넣어준 후, 4℃에서 3~4일 동안 투석하였다. 이때, 버퍼는 하루에 한번씩 교체해 주었다. 투석이 완료된 후 투석액 내에 존재한 액체를 수거하여 원심분리 후 상층액을 수거하여 단백질 정량을 하였으며 또한 멤브레인 상에서 항원-항체 반응을 확인하였다.

그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 3B1 융합세포주의 경우, 복수 1 ㎖ 당 약 1.5 ㎎의 항체를 생산하였으며 3B3 융합세포주의 경우 복수 1 ㎖ 당 약 2 ㎎의 항체를 생산하였다. 상기 과정을 통해 분리된 항체의 멤브레인 상에서의 활성을 확인하기 위하여, 멤브레인에 임신한 소의 혈청을 소량 로딩하여 건조시킨 후 금 입자를 접합시킨 각 항체들을 전개 용액과 혼합하여 흘려 보냈다. 그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, 2C4, 3B1, 3B3 및 4A1 항체에서 항원(bPAG1)과의 결합을 의미하는 선명한 스팟을 확인할 수 있었다.

실시예 6. bPAG1 단백질에 대한 단일클론 항체의 에피토프(epitope) 분석

항체 생산에 사용한 펩티드를 사용하여 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 실시하였다. 맵핑에 사용된 펩티드는 기존 항원 생산에 사용되었던 PAG1 단백질의 100, 300 size의 일부만을 사용하였고, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 4종류로 진행하였다.

펩티드 1	ASSDLWVPSDFCTSPACSTH	서열번호 1
펩티드 2	CVRFRHLQSSTFRLTNKTFRI	서열번호 2
펩티드 3	GAIPRGSEHYVPCSEVNTLP	서열번호 3
펩티드 4	CSIVFTINGINYPVPGRAYIL	서열번호 4

구체적으로, 항원 bPAG1_100 및 bPAG1_300을 각각 100 ㎍/웰의 웰 당 25, 50, 100 및 200 ㎕씩 분주하여 코팅한 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 블로킹 버퍼를 이용하여 실온에서 1시간 동안 블로킹 한 후 정제된 샘플을 사용하여 웰에 100 ㎕ 분주하고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 반응이 완료된 플레이트를 PBST를 사용하여 세척하고, HRP가 컨쥬게이션 되어 있는 Goat anti-mouse IgM을 1:50000 비율로 희석하여 웰에 100㎕ 분주하고 1시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 PBST를 사용하여 세척하고 TMB 용액을 분주하여 15분간 반응시켰다. 이후, 반응 정지액을 사용하여 반응을 종결하고 450/620 nm에서 흡광도 값을 측정하여 샘플 내 역가를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 항원의 농도 의존적으로 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 펩티드 1의 경우, 동일한 항원 농도 대비 펩티드 2~4에 비해 항원과 특이적으로 결합하는 양이 현저한 것으로 보아, 본 발명에 따른 항체 에피토프의 아미노산 서열임을 알 수 있다.

실시예 7. 분리 정제한 항체를 이용한 소의 임신 진단

상기 실시예 3에서 선별한 항체를 이용하여 임신한 소의 혈액 내에 존재하는 것으로 알려져 있는 bPAG1을 검출하였다. 구체적으로, 상기 항체를 멤브레인에 분주하고 금 입자가 결합된 항원 결합 부위가 다른 항체를 이용하여 인공 수정 후 6주, 7주 및 8주된 소의 혈액을 채취하고 원심분리 하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청 0.05 ㎖을 간이 제조한 키트의 검체 적제부에 로딩하고 15분 경과한 후, 결과를 판정하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 수정 6주 후부터 검사선에 띠가 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 항체를 이용한 소의 혈액 내 bPAG1의 존재를 확인함으로써 소의 임신을 진단할 수 있다.

<110> Inc.SLS bio <120> A bPAG1 specific monoclonal antibody and use thereof <130> PN120010KR <150> KR 10-2017-0152257 <151> 2017-11-15 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope of bPAG1 <400> 1 Ala Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Ser Asp Phe Cys Thr Ser Pro Ala 1 5 10 15 Cys Ser Thr His 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope of bPAG1 <400> 2 Cys Val Arg Phe Arg His Leu Gln Ser Ser Thr Phe Arg Leu Thr Asn 1 5 10 15 Lys Thr Phe Arg Ile 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope of bPAG1 <400> 3 Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro Cys Ser Glu Val 1 5 10 15 Asn Thr Leu Pro 20 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope of bPAG1 <400> 4 Cys Ser Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly Ile Asn Tyr Pro Val Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ala Tyr Ile Leu 20 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bPAG1_100 <400> 5 Thr Ser Pro Ala Cys Ser Thr His Val Arg Phe Arg His Leu Gln Ser 1 5 10 15 Ser Thr Phe Arg Leu Thr Asn Lys Thr Phe Arg Ile Thr Tyr Gly Ser 20 25 30 Gly Arg Met Lys Gly Val Val Val 35 40 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bPAG1_300 <400> 6 Ser Glu Val Asn Thr Leu Pro Ser Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly Ile 1 5 10 15 Asn Tyr Pro Val Pro Gly Arg Ala Tyr Ile Leu Lys Asp Asp Arg Gly 20 25 30 Arg Cys Tyr Thr Thr Phe Gln Glu 35 40 <210> 7 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAG1_BOVIN Pregnancy-associated glycoprotein 1 <400> 7 Met Lys Trp Leu Val Leu Leu Gly Leu Val Ala Phe Ser Glu Cys Ile 1 5 10 15 Val Lys Ile Pro Leu Arg Arg Leu Lys Thr Met Arg Asn Val Val Ser 20 25 30 Gly Lys Asn Met Leu Asn Asn Phe Leu Lys Glu His Ala Tyr Ser Leu 35 40 45 Ser Gln Ile Ser Phe Arg Gly Ser Asn Leu Thr Thr His Pro Leu Arg 50 55 60 Asn Ile Lys Asp Leu Val Tyr Met Gly Asn Ile Thr Ile Gly Thr Pro 65 70 75 80 Pro Gln Glu Phe Gln Val Val Phe Asp Thr Ala Ser Ser Asp Leu Trp 85 90 95 Val Pro Ser Asp Phe Cys Thr Ser Pro Ala Cys Ser Thr His Val Arg 100 105 110 Phe Arg His Leu Gln Ser Ser Thr Phe Arg Leu Thr Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Arg Ile Thr Tyr Gly Ser Gly Arg Met Lys Gly Val Val Val His Asp 130 135 140 Thr Val Arg Ile Gly Asn Leu Val Ser Thr Asp Gln Pro Phe Gly Leu 145 150 155 160 Ser Ile Glu Glu Tyr Gly Phe Glu Gly Arg Ile Tyr Asp Gly Val Leu 165 170 175 Gly Leu Asn Tyr Pro Asn Ile Ser Phe Ser Gly Ala Ile Pro Ile Phe 180 185 190 Asp Lys Leu Lys Asn Gln Arg Ala Ile Ser Glu Pro Val Phe Ala Phe 195 200 205 Tyr Leu Ser Lys Asp Glu Arg Glu Gly Ser Val Val Met Phe Gly Gly 210 215 220 Val Asp His Arg Tyr Tyr Glu Gly Glu Leu Asn Trp Val Pro Leu Ile 225 230 235 240 Gln Ala Gly Asp Trp Ser Val His Met Asp Arg Ile Ser Ile Glu Arg 245 250 255 Lys Ile Ile Ala Cys Ser Asp Gly Cys Lys Ala Leu Val Asp Thr Gly 260 265 270 Thr Ser Asp Ile Val Gly Pro Arg Arg Leu Val Asn Asn Ile His Arg 275 280 285 Leu Ile Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro Cys Ser 290 295 300 Glu Val Asn Thr Leu Pro Ser Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly Ile Asn 305 310 315 320 Tyr Pro Val Pro Gly Arg Ala Tyr Ile Leu Lys Asp Asp Arg Gly Arg 325 330 335 Cys Tyr Thr Thr Phe Gln Glu Asn Arg Val Ser Ser Ser Thr Glu Thr 340 345 350 Trp Tyr Leu Gly Asp Val Phe Leu Arg Leu Tyr Phe Ser Val Phe Asp 355 360 365 Arg Gly Asn Asp Arg Ile Gly Leu Ala Arg Ala Val 370 375 380

Claims

소 임신-연관 글리코단백질 1 (bovine Pregnancy-associated glycoprotein 1, bPAG1)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 수탁번호 KCLRF-BP-00416인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 에피토프(epitope) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체의 중쇄는 면역글로불린 M(IgM)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
삭제
bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00416인 하이브리도마 세포.
제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 소의 임신을 진단하기 위한 조성물.
제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 소의 임신을 진단하기 위한 키트.
제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검체 시료에 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 bPAG1 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 소의 임신을 진단하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 검출 단계는 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 분석 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 소의 임신을 진단하는 방법.