WO2015046444A1 - 抗アルドステロン抗体 - Google Patents

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WO2015046444A1
WO2015046444A1 PCT/JP2014/075667 JP2014075667W WO2015046444A1 WO 2015046444 A1 WO2015046444 A1 WO 2015046444A1 JP 2014075667 W JP2014075667 W JP 2014075667W WO 2015046444 A1 WO2015046444 A1 WO 2015046444A1
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antibody
seq
amino acid
monoclonal antibody
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英樹 太田
晃 山内
健一 瀬月内
博之 岡本
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塩野義製薬株式会社
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody recognizing aldosterone (ALD) or a fragment thereof, an assay method or a diagnostic method using these, and a kit containing them.
  • ALD aldosterone
  • Hypertension is a typical lifestyle-related disease in Japan, and the total number of patients is reported to be about 44 million. About 90% of all hypertension is essential hypertension, and about 10% is secondary hypertension. Most of this secondary hypertension is a disease called primary aldosteronism (PA), and the estimated number of Japanese patients is 2.2 to 4.4 million.
  • PA primary aldosteronism
  • the disease is due to autonomous aldosterone hypersecretion from the adrenal cortex. This excessive secretion enhances sodium reabsorption and potassium excretion in the kidney, resulting in an increase in circulating plasma volume, and hypertension, hypokalemia, and suppression of plasma renin activity (PRA).
  • PRA plasma renin activity
  • the probability of a patient having a stroke or myocardial infarction is 4-6 times that of essential hypertension.
  • plasma aldosterone concentration PAC
  • plasma aldosterone concentration / plasma renin activity plasma Aldosterone-ReninRatioRAR
  • Non-Patent Documents 1 to 5 There have been many reports regarding methods for measuring aldosterone using monoclonal antibodies (for example, Non-Patent Documents 1 to 5). On the other hand, since aldosterone has many analogs in vivo, attempts have been made to obtain highly specific monoclonal antibodies that can avoid cross-reactions with these analogs (Patent Document 1, Non-Patent Documents). 6-7).
  • Aldosterone's in-vitro diagnostic agents are only RIA (Radioimmunoassay) products, and there is a problem that measurement and diagnosis cannot be easily performed in a medical institution having no facilities.
  • Non-RIA type aldosterone measurement kits are on the market, but there are problems such as insufficient accuracy guarantees and low specificity for aldosterone. Such facts suggest that aldosterone-related diseases may be overlooked and ineffective therapeutics may be being administered.
  • An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody capable of specifically binding to aldosterone.
  • the present invention (1) (A) a heavy chain variable region comprising the following amino acid sequence; TSDYAWN (SEQ ID NO: 3), YINYSGRTGYNPSLKS (SEQ ID NO: 4), and RPYSYGPTYGFTY (SEQ ID NO: 5), or one or several amino acids in one or more of these CDRs are deleted, substituted or Three CDRs consisting of added amino acid sequences, and (B) a light chain variable region comprising the following amino acid sequences; RSSTGPVTTSNYAN (SEQ ID NO: 6), GLIGINKRAP (SEQ ID NO: 7), and ALWYSNHWL (SEQ ID NO: 8), or one or several amino acids in one or more of these CDRs are deleted, substituted or 3 CDRs consisting of an added amino acid sequence, A monoclo
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes aldosterone and binds with high affinity, it is useful for specific detection of the aldosterone.
  • a part thereof or a label thereof (or an aldosterone detection reagent containing any of these) and a specific detection method of aldosterone using the same, aldosterone expression (expression enhancement, expression) It becomes possible to diagnose various diseases and pathological conditions associated with (failure / decrease) immunochemically or immunohistologically.
  • FIG. 1 shows a method for preparing an antigen for immunization and an antigen for antibody screening.
  • FIG. 2 shows an antibody screening method (A) and an aldosterone measurement method (B).
  • FIG. 3A shows changes in antibody titer when KLH conjugate, A / J mouse and peritoneal administration are combined.
  • FIG. 3B shows changes in antibody titer when a BSA conjugate, A / J mouse and subcutaneous administration are combined.
  • FIG. 3C shows changes in antibody titer when BSA conjugate, BALB / c mouse and subcutaneous administration are combined.
  • FIG. 4 shows a standard curve for aldosterone measurement. The standard curve of the external diagnostic agent (SPAC-S-aldosterone kit) to be compared is also shown.
  • SPAC-S-aldosterone kit The standard curve of the external diagnostic agent to be compared is also shown.
  • FIG. 5 examines cross-reactivity to aldosterone and its analogs.
  • FIG. 6 shows the cross-reactivity of this antibody (concentration range is 0.1 nM to 100 ⁇ M).
  • the cross-reactivity of the monoclonal antibody of the present invention was examined.
  • the cross-reactivity of a commercially available aldosterone kit (Company A: Alpco) was examined.
  • the cross-reactivity of a commercially available aldosterone kit (Company C: Cayman Chemical Company) was examined.
  • aldosterone is represented by the following chemical formula.
  • Aldosterone is a mineral corticoid produced and secreted by the adrenal cortex globular layer and plays an important role in maintaining electrolyte homeostasis, circulating blood volume and blood pressure.
  • the plasma concentration in healthy individuals is estimated to be 35-240 pg / ml.
  • High-level diseases involving aldosterone include primary aldosteronism and Barter syndrome, and low-level diseases include Addison's disease, congenital adrenal cortex enzyme deficiency, and hyporeninic hypoaldosteronism.
  • the “monoclonal antibody” of the present invention is a monoclonal antibody that specifically binds to this aldosterone. Being able to specifically bind means that there is little cross-reactivity with similar substances.
  • Cross-reactivity refers to immune cross-reactivity.
  • an antibody obtained by immunization with a certain antigen exhibits a binding reaction with another antigen (related antigen)
  • this reaction is called a cross-reaction.
  • the reaction amount between the target antigen and the antibody is used as a reference, the degree of reaction amount between the related antigen and the antibody can be shown as cross-reactivity. It shows that it has specificity with respect to the target antigen, so that the value of cross-reactivity is small.
  • the monoclonal antibody according to the present invention is a monoclonal antibody that specifically binds to aldosterone, and its cross-reactivity to 18-hydroxycorticosterone was 0.01% or less when the reactivity to aldosterone was 100%.
  • Another feature of the monoclonal antibody of the present invention is that it has a high affinity for aldosterone.
  • affinity refers to the binding force between antigen and antibody. In the present specification, affinity was shown using as an index the concentration (IC50 value) of aldosterone that inhibits the amount of labeled aldosterone bound to the antibody by 50%. The IC50 value was calculated by a regression model using a logistic curve (Rodbard et al., Synposium on RIA and related procedures in medicine, P165, Int. Atomic Energy Agency, 1974).
  • aldosterone concentration and aldosterone / renin activity are used.
  • normal values of aldosterone are as needed: 36-240 pg / mL, supine position: 30-159 pg / mL, standing position: 39-307 pg / mL, and sensitivity is required to accurately measure normal values.
  • the aldosterone antibody requires a minimum detection sensitivity of 25 pg / mL or less and an affinity of 5 nM (IC 50%).
  • This antibody has an affinity of 1 nM (IC 50%) and a minimum detection limit of 5 pg / mL and satisfies the above requirements, and is useful for directly measuring aldosterone in a blood sample.
  • a preferred form includes CDR1, CDR2 and CDR3 which are complementarity determining regions in the sequence, a) CDR1 has the amino acid sequence TSDYAWN (SEQ ID NO: 3), and CDR2 is an amino acid sequence.
  • CDR3 has the amino acid sequence RPYSYGPTYGFTY (SEQ ID NO: 5), immunoglobulin heavy chain variable region (V H ) and b)
  • CDR1 has the amino acid sequence RSSSTGPVTTSNYAN (SEQ ID NO: 6)
  • CDR2 has the amino acid sequence GLIGINKRAP (SEQ ID NO: 7)
  • CDR3 has the amino acid sequence ALWYSNHWL (SEQ ID NO: 8), which includes an immunoglobulin light chain variable region (V L ).
  • the immunoglobulin class of this antibody belongs to IgG 1 ( ⁇ ).
  • the monoclonal antibody of the present invention it is possible to use a recombinant antibody produced by cloning a gene of an antibody, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique (for example, Carl Et al., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, 1990).
  • a gene recombination technique for example, Carl Et al., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, 1990.
  • DNA encoding the variable region (V region) of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the constant region (C region) of the desired antibody, and this is expressed into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer / promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • the expression of the antibody gene may be carried out by co-transforming the host by separately incorporating the heavy chain (H chain) or light chain (L chain) of the antibody into an expression vector, or DNA encoding the H chain and L chain. May be incorporated into a single expression vector to transform the host (see, for example, Japanese Patent No. 3559795).
  • the monoclonal antibody of the present invention can be produced according to a conventional method (see Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497. (1975)).
  • a clone that produces a fusion antibody (hybridoma) of a mammalian plasma cell (immune cell) immunized with an immunogen and a mammalian plasmacytoma cell (myeloma cell), and produces a monoclonal antibody that recognizes aldosterone. are screened and the selected clones are cultured.
  • the immunogen can be prepared using aldosterone.
  • Aldosterone may be obtained by synthesis or purified from a biological sample. The synthesis method is, for example, Journal of the Chemical Society. Perkin transactions 1 (1975), Volume 22, pages 2243-51. Since aldosterone is a low molecular weight compound, it is considered difficult to produce an antibody alone as an immunogen, so it is desirable to prepare a complex with a carrier protein.
  • any of various proteins known to enhance antigenicity can be used as the carrier protein.
  • examples thereof include synthetic polypeptides in addition to high-molecular substances such as bovine serum albumin (BSA), bovine thioglobulin (BTG), and limpet hemocyanin (KLH).
  • BSA bovine serum albumin
  • BSG bovine thioglobulin
  • KLH limpet hemocyanin
  • binding of aldosterone and carrier protein can be achieved by using, for example, an active ester method.
  • a carbodiimide method, a glutaraldehyde method, a diazo method, and the like can also be used for preparing an immunogen.
  • Antibodies A Laboratory Manual, (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • rabbits, goats, sheep, mice, rats and the like are used as mammals to be immunized with an immunogen.
  • the immunization method can be performed by a general method, for example, by administering an immunogen to a mammal by intravenous, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal injection or the like. More specifically, for example, the immunogen is diluted to an appropriate concentration with a physiological saline-containing phosphate buffer (PBS), physiological saline, or the like, and is used in combination with a normal adjuvant as required. Give several doses at weekly intervals. When mice are used, a single dose is about 50 to 100 ⁇ g per mouse.
  • the adjuvant refers to a substance that nonspecifically enhances the immune response to the antigen when administered together with the antigen. Examples of commonly used adjuvants include pertussis vaccine and Freund's adjuvant. Plasma cells (immune cells) can be collected from mammals 3 to 10 days after the final immunization.
  • a hybridoma In order to obtain a hybridoma from the obtained immune cells, for example, it is intended to obtain cells that can be passaged by the method described in “Basic method for molecular cell biology” (Takeichi Minamiedo et al., 1994) and the like.
  • a hybridoma can be obtained by fusing a plasmacytoma cell and an immune cell producing an antibody in the presence of Sendai virus or polyethylene glycol.
  • the plasmacytoma cells used here are preferably plasmacytoma cells derived from the same isothermal animal even in the same isothermal animal.
  • a mouse myeloma cell is used. It is preferable to use it.
  • Plasmacytoma cells are p3x63-Ag8. A known item such as a UI can be used.
  • Hybridomas are selected by HAT medium (medium supplemented with hypoxanthine, aminopterin, and thymidine), and when colonies are confirmed, the binding between the antibody secreted in the culture supernatant and the antigen is examined (screened). A hybridoma producing the target antibody can be obtained.
  • Examples of the screening method include various methods generally used for antibody detection such as spot method, agglutination reaction method, Western blot method, ELISA method, etc., but preferably the reactivity with aldosterone is used as an indicator. It is carried out according to the ELISA method. By this screening, an antibody-producing strain that specifically reacts with aldosterone can be screened.
  • Cloning of the antibody-producing strain obtained as a result of the screening can be performed by the usual limiting dilution method, soft agar method or the like.
  • the cloned hybridoma can be cultured in a large amount in a serum medium or a serum-free medium as necessary. According to this culture, a relatively high-purity antibody can be obtained as a culture supernatant. It is also possible to inoculate the abdominal cavity of a mammal that is compatible with the hybridoma, such as a mouse, and inoculate the hybridoma to collect a large amount of antibody as mouse ascites.
  • the antibody-containing culture supernatant and mouse ascites can be purified by conventional methods, such as ammonium sulfate fractionation, salting out, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.
  • the “monoclonal antibody fragment” is a part of the monoclonal antibody of the present invention described above, and means a region that retains specific binding properties to aldosterone, as in the case of the monoclonal antibody (hereinafter referred to as this). Are also simply referred to as “antibody fragments”).
  • Such antibody fragments include Fab (fragment of antigen binding), F (ab ′) 2 , Fab ′, single chain antibody (hereinafter referred to as “scFv”), dimerized V region fragment ( (Hereinafter referred to as Diabody), disulfide stabilized antibody (hereinafter referred to as “dsFv”), dAd (single domain antibody), CDR-containing peptides, etc. (expert opinion onion) ⁇ Therapeutic Patents, Vol. 6, No. 5, pp. 441-456, 1996).
  • the antibody of the present invention When performing an assay using an antibody as described above, the antibody itself can usually be labeled with various substances so that the behavior of the antibody can be detected.
  • the antibody can be labeled by using a conventional method described in, for example, “Molecular Cell Biology Basic Experimental Method” (Takeichi Horie et al., 1994).
  • various substances include chemiluminescent substances, enzymes, fluorescent substances, colored beads, radioisotopes, elements, metals, and biotin. Specific examples are shown below, but are not limited thereto.
  • the chemiluminescent substance refers to, for example, luminol and acridinium ester.
  • Examples of enzymes include ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase and peroxidase.
  • Examples of the fluorescent substance include europium cryptate, FITC (fluorescein isothiocyanate), RITC (tetramethylrhodocyanate isothiocyanate), and the like.
  • Examples of the colored beads include protein A beads, wheat germ agglutinin (WGA) beads, and streptavidin beads.
  • Radioisotope refers to, for example, 14 C, 125 I, 3 H, and the like.
  • the element refers to a lanthanide element such as europium.
  • Examples of metals include ferritin and gold colloid.
  • the present invention includes assays using aldosterone antibodies, whether or not labeled as described above.
  • An assay using an antibody may be competitive or non-competitive.
  • a homogeneous assay method (measurement by a homogeneous system) or a heterogeneous assay method (measurement by a heterogeneous system) may be used.
  • enzyme immunoassay EIA
  • solid phase enzyme immunoassay ELISA
  • fluorescence immunoassay FIA
  • RIA radioimmunoassay
  • TR-FIA time-resolved fluorescence immunoassay
  • Chemiluminescence immunoassay immunoblotting, Western blotting, immunostaining, and other conventional methods.
  • the assay includes drug screening for the purpose of developing therapeutic and preventive agents. It also includes those related to disease diagnosis.
  • a preferred specific method of the assay using the antibody of the present invention is an ELISA method.
  • the ELISA method is a method in which an antibody or antigen labeled with an enzyme is used and the amount of the antibody or antigen is quantified based on the activity of the labeled enzyme.
  • An antigen-antibody conjugate labeled with an enzyme and a free-form labeled antigen, or an immobilized antibody or antigen is used to separate the antibody.
  • As the solid phase agarose, the inner surface of a microtiter plate, latex particles, and the like can be used.
  • Specific examples of the ELISA method include a competitive immunoassay and a two-antibody sandwich immunoassay.
  • the labeling enzyme include horseradish-derived peroxidase (hereinafter also referred to as HRP), alkaline phosphatase, and the like, preferably horseradish-derived peroxidase.
  • a preferred kit for detecting aldosterone provided by the present invention is a kit for sandwich ELISA using two monoclonal antibodies that specifically bind to aldosterone.
  • the kit reacts with at least the monoclonal antibody of the present invention or fragment thereof immobilized on a solid support, the monoclonal antibody of the present invention or fragment thereof labeled with the labeling agent, and the labeling agent.
  • the labeling agent is preferably the above-mentioned enzyme, particularly alkaline phosphatase (ALP), and the substrate is preferably APS-5. According to such sandwich ELISA, aldosterone can be detected with higher sensitivity.
  • an appropriate reaction solution, dilution solution, washing solution, depending on the use such as immunoelectrophoresis or immunoassay, Aldosterone standard solution, transfer solution, electrophoresis solution, reaction stop solution, antibody detection reagent, labeling activity measurement reagent, staining solution, reaction plate, nitrocellulose filter, polyacrylamide gel and the like may be contained.
  • the antibody detection reagent include a secondary antibody that binds to the monoclonal antibody of the present invention, such as an anti-IgG antibody or protein A labeled with a radioactive substance or an enzyme.
  • aldosterone By using the above-described reagent kit containing the monoclonal antibody, antibody fragment or labeled product of the present invention as a binding or detection reagent, aldosterone can be conveniently, specifically and in accordance with general immunoelectrophoresis and immunoassay methods. It can be detected and measured with high sensitivity.
  • the method for measuring aldosterone using the above kit containing the antibody is the test sample ( (For example, specific detection and quantification of aldosterone in blood, urine, etc.) and various tissues, measurement of distribution of aldosterone-expressing tissue, and purification of aldosterone using affinity, accompanied by increased expression of aldosterone (or It is useful for immunochemical and immunohistological diagnosis of various diseases (due to increased aldosterone expression).
  • Aldosterone-6-hemisuccinate NHS ester was prepared according to the previously reported patent document (published patent No. 63-60996). This was conjugated to the amino group of BSA [Bovine Serum Albumin] or KLH [Keyhole Limeto Hemocyanin] to prepare a hapten antigen (FIG. 1).
  • Emulsions Preparation of monoclonal antibody
  • An aldosterone hapten antigen is added to an equal amount of TiterMax Gold [TiterMax USA, Inc. ]
  • TiterMax Gold TiterMax USA, Inc.
  • Emulsions can also be prepared by mixing equal amounts of complete adjuvant for the first immunization and incomplete adjuvant for the second and subsequent immunizations.
  • Monoclonal antibodies are described in K. Watanabe et al. , Vasohibin as an endotherium-derived negative feedback regulator of angiogenesis, J. Clin. Invest. 114 (2004), 898-907. That is, to a 5-week-old female BALB / c mouse or A / J mouse, 50 ⁇ g of hapten antigen per mouse was administered in an equal volume divided subcutaneously or intraperitoneally for each administration. Thereafter, after the fifth immunization, the spleen was removed from the mouse that had undergone the final booster (4 days before cell fusion) to prepare spleen cells. Cell fusion between spleen cells and myeloma cells (P3U1) Watanabe et al. , Vasohibin as an endothelium-derIVED negative feedback regulator of engineering, J. Clin. Invest. 114 (2004), 898-907.
  • P3U1 myeloma cells
  • the antibody titer of the antiserum and the hybridoma supernatant was evaluated by the DELFIA method (FIG. 2A) described below. That is, antiserum or hybridoma supernatant was added to a 96-well microplate on which a goat anti-mouse IgG antibody was solid-phased, and biotinylated aldosterone and Eu-labeled streptavidin were mixed and stirred, then at room temperature for 2 hours or overnight at 4 ° C. Reacted.
  • immunization was performed so as to lower the antigenicity and immune response contrary to normal. Specifically, (1) aldosterone-BSA conjugate was used as an antigen, (2) BALB / c mice with low immune response were used, and (3) immunization was performed by subcutaneous immunization. As a result, an increase in antibody titer was observed each time the number of immunizations was repeated, and mice with very high affinity (6 nM) and high antibody titer could be obtained (FIG. 3).
  • a mouse having an antiserum with high antibody titer and affinity could be obtained, and a hybridoma producing a monoclonal antibody with high affinity by cell fusion with myeloma cells could be obtained.
  • the monoclonal antibody was purified from the ascites obtained by administering the antibody-producing hybridoma serum-free medium or hybridoma to mice using a protein A column (MAPS II kit, Bio-Rad Laboratories Inc.).
  • Table 1 below shows the characteristics of the obtained monoclonal antibodies.
  • the obtained antibody had a 50% inhibition rate (IC 50%) in the competitive assay of 0.5 nM, and had a very high affinity as an antibody of a low molecular compound.
  • IC 50% 50% inhibition rate
  • Such an antibody was obtained as a result of the reverse of the above-mentioned method, that is, the result of creative ingenuity such as lowering the antigenicity. It cannot be obtained by law.
  • Aldosterone-6-hemisuccinate NHSester was reacted with alkaline phosphatase (ALP) at a ratio of 5: 1 to prepare ALP-labeled aldosterone (FIG. 4).
  • ALP-labeled aldosterone FIG. 4
  • An aldosterone measurement system was constructed using this ALP-labeled aldosterone.
  • the steroid compounds examined are as follows. Cortisol, cortisone, corticosterone, deoxycorticosterone, progesterone, estradiol, prednisolone, 18-hydroxycorticosterone, spiralonolactone, prednisone, trans dehydroandrosterone, aldosterone.
  • the assay method is shown below. To the anti-mouse IgG antibody solid phase plate, assay buffer, aldosterone standard solution or similar steroid hormone solution (0.1 nM to 1000 ⁇ M), ALP-labeled aldosterone, and antibody solution are added as described above, and after stirring, room temperature 3 Reacted for hours. After washing with a washing solution, a substrate solution was added, and a chemiluminescence signal was detected 20 minutes later.
  • FIG. 18-Hydroxycorticosterone is a biosynthetic substrate for aldosterone, and its cross-reactivity was as low as 0.01% or less despite its structural formula being very similar to that of aldosterone. The cross-reactivity with other steroid compounds was very low, below 0.00008%. *
  • cortisol since cortisol has a blood concentration about 100 to 5000 times higher than that of aldosterone, it is necessary to avoid the influence of the aldosterone measurement system.
  • the antibody obtained this time has a low cross-reactivity with cortisol of 0.000012% or less, and the influence of cortisol on the aldosterone measurement system can be avoided.
  • this antibody is not inhibited except between 0.1 nM and 10 ⁇ M, except for biosynthetic substrates (about 0.01% cross-reactivity), whereas both commercial kits are reactive to several compounds.
  • the commercially available kit shown (FIG. 6, Table 2) has particularly high cross-reactivity with aldosterone biosynthetic substrates 18-hydroxycorticosterone, corticosterone, and progesterone.
  • aldosterone Since there are more corticosterone and progesterone (in the case of women) in blood than aldosterone, there is a possibility that aldosterone cannot be measured accurately with a commercially available kit.
  • cortisol has a much higher blood concentration (100 to 5000 times) than aldosterone.
  • the cross-reactivity with cortisol is 0.004-0.008%, which is higher than that of this antibody by 2 orders or more. large.
  • the monoclonal antibody of the present invention is useful for the selection of samples derived from patients with various diseases related to the amount of aldosterone such as primary aldosteronism.

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Abstract

本発明は、アルドステロンに対して特異的に結合することができるモノクローナル抗体を提供することを目的とする。そのため、本発明は親和性が高く、交差反応性が小さいアルドステロンに対するモノクローナル抗体を提供する。

Description

抗アルドステロン抗体
本発明は、アルドステロン（ＡＬＤ）を認識するモノクローナル抗体またはその断片、これらを用いたアッセイ方法または診断方法、およびこれらを含むキットに関する。
高血圧は、日本における代表的な生活習慣病であり、総患者数は約４４００万人とも報告されている。全高血圧の約９０％は本態性高血圧であり、約１０％は二次性高血圧が占める。この二次性高血圧のほとんどは、原発性アルドステロン症（Ｐｒｉｍａｒｙ　Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｉｓｍ；ＰＡ）と呼ばれる疾患であり日本人の推定患者数は、２２０～４４０万人とされる。
この疾患は、副腎皮質からの自律的アルドステロンの過剰分泌に起因する。この過剰分泌によって腎におけるナトリウム再吸収とカリウム排出が亢進する結果、循環血漿量が増加し、高血圧、低カリウム血症、血漿レニン活性（ＰＲＡ）の抑制が引き起こされる。また、患者が脳卒中や心筋梗塞になる確率は、本態性高血圧の４～６倍にいたる。
原発性アルドステロン症の診断には、血漿アルドステロン濃度（Ｐｌａｓｍａ　Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＰＡＣ）を測定して、血漿アルドステロン濃度と血漿レニン活性の比（血漿アルドステロン濃度／血漿レニン活性：ｐｌａｓｍａ　Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ－Ｒｅｎｉｎ　Ｒａｔｉｏ；ＡＲＲ）を求めることが臨床上推奨されている（原発性アルドステロン症の診断治療ガイドライン、日本内分泌学会、２０１０年）
モノクローナル抗体を用いたアルドステロンの測定方法に関しては多くの報告が存在している（例えば、非特許文献１～５）。一方、アルドステロンについては、生体内には類似体が数多く存在することから、これら類似体との交差反応を回避できる特異性の高いモノクローナル抗体の取得が試みられてきた（特許文献１、非特許文献６～７）。
アルドステロンの体外診断薬はＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）製品しかなく、設備の整っていない医療機関では簡便に測定・診断が出来ないという問題がある。ｎｏｎ－ＲＩＡタイプのアルドステロン測定キットは販売されているが、精度の担保不足やアルドステロンに対する特異性が低いなどの問題がある。この様な事実は、アルドステロンが関与する疾患が見過ごされ、効果の無い治療薬が投薬されている可能性を示唆する。
旧東ドイツ特許公開２６４０２４号
Ｓｔｅｒｏｉｄｓ　（２００９）、　７４（４－５）、　４５６－４６２ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　（２００８）、　１９６（２）、　２１５－２２４ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅ　（１９９０）、　５（１）、　４９－５２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８９）、　２２（４）、２８９－２９２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　（１９８７）、　１６４（１）、７１－８２ Ｓｔｅｒｏｉｄｓ　（１９８７）、　４９（６）、　５８１－７ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８７）、　２８（５）、　４５９－６３
本発明の目的は、アルドステロンに対して特異的に結合することができるモノクローナル抗体を提供することにある。
本発明者らは尿中または血中のアルドステロンを測定するために、親和性が高く、交差反応性が小さいモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
（１）（Ａ）下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ＴＳＤＹＡＷＮ（配列番号３）、ＹＩＮＹＳＧＲＴＧＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）、およびＲＰＹＳＹＧＰＴＹＧＦＴＹ（配列番号５）、あるいは、これらの３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲ、および
（Ｂ）下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ＲＳＳＴＧＰＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号６）、ＧＬＩＧＧＩＮＫＲＡＰ（配列番号７）、およびＡＬＷＹＳＮＨＷＬ（配列番号８）、あるいは、これらの３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲ、
を有する、アルドステロンに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
（２）（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、あるいは配列番号１のアミノ酸配列のうち配列番号３、配列番号４および配列番号５で示されるＣＤＲ以外の部分において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域；および
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、あるいは配列番号２のアミノ酸配列のうち配列番号６、配列番号７および配列番号８で示されるＣＤＲ以外の部分において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域、を有する、アルドステロンに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
（３）標識されたものである前記（１）および（２）のいずれかに記載の抗体またはその抗体断片、
（４）前記（１）～（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含むキット、
（５）前記（１）～（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いたアッセイ方法、
（６）前記（１）～（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた、アルドステロンが関与する疾患に罹患している被験者由来の試料の選別方法、および
（７）
以下の式（I）で示される化合物を、ＢＡＬＢ／cマウスに皮下免疫する工程を含むアルドステロンに対するモノクローナル抗体の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
に関する。
本発明のモノクローナル抗体は、アルドステロンを特異的に認識し、高い親和性でもって結合するため、当該アルドステロンの特異的検出に有用である。かかる本発明のモノクローナル抗体、その一部またはこれらの標識物（またはこれらのいずれかを含むアルドステロン検出試薬）並びにそれを利用したアルドステロンの特異的検出法によれば、アルドステロンの発現（発現亢進、発現不全／減少）に関連して生じる種々の疾患や病態を、免疫化学的または免疫組織学的に診断することが可能となる。
図１は、免疫用抗原および抗体スクリーニング用抗原の調製法を示したものである。 図２は、抗体のスクリーニング方法（A）とアルドステロン測定方法（B）を示したものである。 図３Ａは、KLHコンジュゲート、A/Jマウスおよび腹腔投与を組み合わせた場合の抗体価の推移を示したものである。 図３Ｂは、BSAコンジュゲート、A/Jマウスおよび皮下投与を組み合わせた場合の抗体価の推移を示したものである。 図３Ｃは、BSAコンジュゲート、BALB/ｃマウスおよび皮下投与を組み合わせた場合の抗体価の推移を示したものである。 図４は、アルドステロン測定の標準曲線を示したものである。比較対象の対外診断薬（スパック-S-アルドステロンキット）の標準曲線も示した。 図５は、アルドステロンおよびその類似物に対する交差反応性を調べたものである。 図６は、本抗体の交差反応性を調べたものである（濃度範囲は、０．１ｎＭ～１００μＭ）。 本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調べたものである。 市販のアルドステロンキット（Ａ社：Alpco社）の交差反応性を調べたものである。 市販のアルドステロンキット（Ｃ社：Cayman Chemical社）の交差反応性を調べたものである。
　Ｉ．モノクローナル抗体、及びその製造方法
以下、本発明で用いられる各種用語の意味を明らかにすることにより、本発明のモノクローナル抗体、およびその製造方法を詳細に説明する。
本発明において「アルドステロン」とは、以下の化学式で示される。アルドステロンは、副腎皮質球状層で生成・分泌される鉱質コルチコイドであり、電解質の恒常性・循環血液量・血圧の維持に重要な役割を果たしている。健常人における血漿濃度は３５－２４０　ｐｇ／ｍｌであるとされている。このアルドステロンが関与する高値の疾患としては原発性アルドステロン症、バーター症候群などが、また低値の疾患としてはアジソン病、先天性副腎皮質酵素欠損、低レニン性低アルドステロン症などが疑われる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
本発明の「モノクローナル抗体」とは、このアルドステロンに特異的に結合するモノクローナル抗体である。特異的に結合できるとは、類似物質に対して交差反応性が少ないことを意味する。
「交差反応性」は、免疫交差反応性のことをいう。ある抗原で免疫することにより得られた抗体が別の抗原（関連抗原）とも結合反応を示すときに、この反応を交差反応という。目的とする抗原とその抗体の反応量を基準とした場合に関連抗原とその抗体との反応量の程度を交差反応性として示すことができる。交差反応性の値が小さいほど、目的の抗原に対して特異性を有することを示す。
アルドステロンに対する抗体については、アルドステロンがその生合成原料の１８－ヒドロキシコルチコステロンとその構造が類似していることにより交差反応が起きやすいと考えられる。本発明にかかるモノクローナル抗体はアルドステロンと特異的に結合するモノクローナル抗体であり、アルドステロンに対する反応性を１００％とした場合、１８－ヒドロキシコルチコステロンに対する交差反応性が０．０１％以下であった。
本発明のモノクローナル抗体は、アルドステロンに対して高い親和性を有していることをもうひとつの特徴として挙げられる。「親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」とは抗原抗体間の結合力をいう。本明細書中においては、抗体に対する標識したアルドステロンの結合量を５０％阻害するアルドステロンの濃度（ＩＣ５０値）を指標として親和性を示した。ＩＣ５０値はｌｏｇｉｓｔｉｃ曲線による回帰モデル（Ｒｏｄｂａｒｄら、Ｓｙｎｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ＲＩＡ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉｎ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　Ｐ１６５，　Ｉｎｔ．Ａｔｏｍｉｃ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ａｇｅｎｃｙ，　１９７４）で算出した。
原発性アルドステロン症などの診断には、アルドステロン濃度およびアルドステロン／レニン活性が用いられる。このアルドステロン／レニン活性を調べるためにも、正確なアルドステロン濃度の測定が必要とされる。
一方で、アルドステロンの正常値は、随時：　３６～２４０ｐｇ／ｍＬ　、臥位：　３０～１５９ｐｇ／ｍＬ、立位：　３９～３０７ｐｇ／ｍＬであり、正常値を正確に測定可能な感度が要求される（原発性アルドステロン症　診断マニュアル（診断と治療社、４８ページ））。
この要求を満たすためには、アルドステロン抗体として、２５ｐｇ／ｍＬ以下の最小検出感度、親和性として５ｎＭ（ＩＣ５０％）が必要である。本抗体は、親和性が１ｎＭ（ＩＣ５０％）、最小検出限界は５ｐｇ／ｍＬであり上記の要求を満たす抗体であり、血液検体中のアルドステロンを直接測定するのに有用である。
本発明のモノクローナル抗体において、好ましい形態としては、配列中に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ａ）ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＴＳＤＹＡＷＮ（配列番号３）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＹＩＮＹＳＧＲＴＧＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＲＰＹＳＹＧＰＴＹＧＦＴＹ（配列番号５）を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）そしてｂ）ＣＤＲ１はアミノ酸配列 ＲＳＳＴＧＰＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号６）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＬＩＧＧＩＮＫＲＡＰ（配列番号７）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＬ（配列番号８）を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶL）を含む抗体を挙げることができる。上記のＣＤＲ領域の配列は、本発明の所望する活性（例えば、親和性または特異性）が保持される範囲内であれば、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された改変体も本発明のモノクローナル抗体に含まれる。この抗体の免疫グロブリンクラスはＩｇＧ1（λ）に属する。
本発明のモノクローナル抗体として、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌら、ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１９９０年発行）。
具体的には、目的とする抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体の定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本発明で使用される抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換させてもよい（例えば、特許第３５５９７９５号参照）。
他に、本発明のモノクローナル抗体は、常法に従っても製造できる（Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６，　４９５－４９７．（１９７５）参照）。免疫原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞（ミエローマ細胞）との融合細胞（ハイブリドーマ）を作製し、これよりアルデステロンを認識するモノクローナル抗体を産生するクローンをスクリーニングし、選択されたクローンを培養する。
免疫原には、アルドステロンを用いて調製することができる。アルドステロンは、合成によって取得してもよく、生体試料から精製してもよい。合成方法は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ．　Ｐｅｒｋｉｎ　ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　１　（１９７５）、　第２２巻、　２２４３－５１ページ、に記載されている。アルドステロンは、低分子化合物であるため単独で免疫原として抗体を産生することは難しいと考えられることから、キャリアタンパクと複合体を調製することが望ましい。
キャリアタンパクには、抗原性を高めることが知られている各種のタンパクをいずれも使用できる。その例としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシチオグロブリン（ＢＴＧ）、カギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）などの高分子物質のほかに合成ポリペプチドなどを例示できる。
アルドステロンとキャリアタンパクとの結合は、例えば、活性エステル法を用いれば可能である。その他にカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ法なども免疫原の作製に用いることができる。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）。
免疫原で免疫される哺乳動物としては、一般には、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが用いられる。
免疫方法は一般的方法により、例えば免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することにより行い得る。より具体的には、例えば免疫原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、生理食塩水などで適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に２～３週間間隔で数回投与する。マウスを用いる場合は、一回の投与量を一匹あたり５０～１００μｇ程度とする。ここで前記アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質をいう。通常用いられるアジュバントとしては、百日咳ワクチン、フロインドアジュバントなどを例示できる。最終免疫後３～１０日目に哺乳動物から形質細胞（免疫細胞）を採取することができる。
得られた免疫細胞からハイブリドーマを得るには、例えば、「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら １９９４）等に記載されている方法により、継体培養可能な細胞とすることを目的として、例えば、センダイウイルスやポリエチレングリコール存在下、形質細胞腫細胞と抗体を産生する免疫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることができる。ここで用いられる形質細胞腫細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物由来の形質細胞腫細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。形質細胞腫細胞はｐ３ｘ６３－Ａｇ８．ＵＩなどの公知のものを利用できる。
ハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択し、コロニーが確認された段階で、培養上清に分泌される抗体と抗原との結合を調べる（スクリーニングする）ことにより、目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
スクリーニングする方法としては、例えば、スポット法、凝集反応法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの一般に抗体の検出に用いられている種々の方法が挙げられるが、好ましくは、アルドステロンとの反応性を指標とするＥＬＩＳＡ法に従い実施される。このスクリーニングによって、アルドステロンと特異的に反応する抗体産生株をスクリーニングすることができる。
スクリーニングの結果得た抗体産生株のクローニングは、通常の限界希釈法、軟寒天法などにより実施できる。クローニングされたハイブリドーマは、必要に応じて、血清培地または無血清培地で大量培養することができる。この培養によれば、比較的高純度の抗体を培養上清として得ることができる。また、ハイブリドーマと適合性のある哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔に、ハイブリドーマを接種して抗体をマウス腹水として大量に回収することもできる。
抗体を含有する培養上清およびマウスの腹水は、常法に従って、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ法などにより、精製することができる。
本発明において「モノクローナル抗体の断片」とは、前述する本発明のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にアルドステロンに特異的な結合性を保持する領域を意味する（以下、これを単に「抗体断片」ともいう）。
かかる抗体断片としては、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、一本鎖抗体 （ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ;以下、「ｓｃＦｖ」と表記する）、２量化体Ｖ領域断片（以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ; 以下、「ｄｓＦｖ」と表記する）、ｄＡｄ（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１～４５６頁、１９９６年）。
ＩＩ．本発明の抗体の用途
上記のように抗体を用いてアッセイを行うにあたって、通常は抗体の挙動を検出可能とするため抗体そのものが種々の物質で標識されうる。抗体を標識するには、例えば「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら１９９４年）等に記載されている常法を用いることにより行うことができる。種々の物質としては化学発光物質、酵素、蛍光物質、着色ビーズ、放射性同位元素、元素、金属類、ビオチンが挙げられる。以下に具体例を示すがこれらに限定されるものではない。化学発光物質とは例えばルミノールやアクリジニウムエステルなどをさす。酵素とは例えばβ－ガラクトシダーゼやアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼなどをさす。蛍光物質とは例えばユウロピウムクリプテートやＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）やＲＩＴＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などをさす。着色ビーズとは例えばプロテインＡビーズ、ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）ビーズ、ストレプトアビジンビーズなどをさす。放射性同位元素とは例えば14Ｃや125Ｉや3Ｈなどをさす。元素とは例えばユウロピウムなどのランタニド元素をさす。金属類とは例えばフェリチンや金コロイドなどをさす。
本発明には上記のように標識したものであってもなくても、アルドステロンの抗体を用いたアッセイを含むものとする。抗体を用いたアッセイには競合的な測定でも非競合的な測定でも良い。また、ホモジニアスアッセイ法（均一系による測定）でもヘテロジニアスアッセイ法（不均一系による測定）でもよい。具体的には、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定（ＴＲ－ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法、イムノブロット法、ウエスタンブロット法、免疫染色法などの常法に従うことができる。なお、アッセイには治療剤・予防剤の開発を目的とする薬物スクリーニングを含むものとする。また疾患の診断に関するものも含むものとする。
本発明抗体を用いるアッセイの好ましい具体的方法としては、ＥＬＩＳＡ法が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法とは、酵素で標識された抗体または抗原を用い、抗体または抗原の量を標識酵素の活性度により定量する方法である。酵素で標識された抗原抗体結合物と遊離型の標識抗原、または抗体を分離するのに固相化された抗体や抗原が用いられる。固相はアガロース、マイクロタイタープレートの内面、ラテックス粒子等が利用できる。ＥＬＩＳＡ法として具体的には競合法イムノアッセイや２抗体サンドイッチイムノアッセイなどが挙げられる。また標識酵素としては西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰともいう）やアルカリホスファターゼ等が挙げられるが好ましくは西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼである。
本発明が提供する好適なアルドステロン検出用キットは、アルドステロンに特異的に結合する２つのモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ用のキットである。当該キットには、少なくとも、固体支持体に固定化されてなる本発明のモノクローナル抗体またはその断片、前述した標識剤で標識されてなる本発明のモノクローナル抗体またはその断片、および当該標識剤と反応して発色、発蛍光または発光する基質が含まれている。この場合、標識剤として、好ましくは前述する酵素、特にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を挙げることができ、また基質として、好ましくはＡＰＳ－５を挙げることができる。かかるサンドイッチＥＬＩＳＡによれば、より高い感度でアルドステロンを検出することができる。
本発明のキットには、上記本発明のモノクローナル抗体、その抗体断片またはこれら標識物のほか、免疫電気泳動法または免疫測定法などその用途に応じて、更に適当な反応液、希釈液、洗浄液、アルドステロンの標準液、転写溶液、泳動溶液、反応停止液、抗体検出試薬、標識活性測定試薬、染色液、反応プレート、ニトロセルロースフィルター、ポリアクリルアミドゲル等が含まれていてもよい。なお、ここで抗体検出試薬としては、本発明のモノクローナル抗体と結合する二次抗体、例えば放射性物質や酵素などで標識した抗ＩｇＧ抗体やプロテインＡ等を挙げることができる。
本発明のモノクローナル抗体、抗体断片またはこれらの標識物を結合または検出試薬として含む上記試薬キットを利用することにより、一般の免疫電気泳動法及び免疫測定法に従い、アルドステロンを簡便に、特異的にかつ高感度に検出及び測定することができる。
本発明のモノクローナル抗体、その抗体断片およびこれらの標識物は、アルドステロンを特異的に認識して高い親和性で結合するため、当該抗体を含む上記キットを利用したアルドステロンの測定法は、被験試料（例えば、血液、尿等）や各種組織中のアルドステロンの特異的検出や定量、アルドステロン発現組織の分布測定、及びアフィニティを利用したアルドステロンの精製に利用されるほか、アルドステロンの発現の増加を伴う（またはアルドステロン発現の増加に起因する）種々の疾患の免疫化学的及び免疫組織学的診断に有用である。
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
〔モノクローナル抗体の調製〕
(抗原の調製)
以前報告した特許文献（公開特許 昭６３－６０９９６）に従い、Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ－６－ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ　ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒを調製した。これをＢＳＡ［Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ］あるいはＫＬＨ［Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ］のアミノ基に結合させ、ハプテン抗原を調製した（図１）。
また、上記のＡｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ－６－ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ　ＮＨＳｅｓｔｅｒにＡｍｉｎｅ－ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎを結合させ、ビオチン化アルドステロンを調製した（図１）。
 (モノクローナル抗体の調製)
アルドステロンのハプテン抗原を、等量のＴｉｔｅｒＭａｘ　Ｇｏｌｄ［ＴｉｔｅｒＭａｘ　ＵＳＡ，　Ｉｎｃ．］と混和することにより乳剤を調製し免疫原とした。乳剤については、初回免疫には完全アジュバントと、２回目以降は不完全アジュバントと等量混和することによっても調製できる。
モノクローナル抗体は、Ｋ．　Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ　ａｓ　ａｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｆｅｅｄｂａｃｋ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１１４　（２００４），　８９８－９０７に記載した方法で作製した。即ち、５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ系マウスあるいはＡ／Ｊ系マウスに、投与１回につき、一匹当り５０μｇのハプテン抗原を皮下あるいは腹腔内に等量に分けて投与した。その後、５回目の免疫後に、最終のブースター（細胞融合の４日前）を行ったマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）との細胞融合は、Ｋ．　Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ　ａｓ　ａｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｒＩＶＥＤ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｆｅｅｄｂａｃｋ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１１４　（２００４）、　８９８－９０７に記載した方法で行った。
抗血清とハイブリドーマ上清の抗体価の評価は、下記に記述するＤＥＬＦＩＡ法（図２Ａ）にて行った。即ち、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を固相した９６穴マイクロプレートに、抗血清あるいはハイブリドーマ上清を添加し、さらにビオチン化アルドステロンとＥｕ標識ストレプトアビジンを混合攪拌後、室温で２時間あるいは４℃で終夜反応させた。反応後、洗浄液（０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０と０．１％　ＰｒｏＣｌｉｎ　１５０を含む生理食塩水)にて3回洗浄を行い、１００μＬ増強試薬を加え、撹拌後５分間静置し、６１５ｎｍにおける時間分解蛍光をＡＲＶＯ　ＭＸ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）にて測定し、抗血清やハイブリドーマを未添加の場合に得られるシグナルの３倍を超えるシグナル強度を示す場合を陽性と判断した。
当初、免疫は、アルドステロン－ＫＬＨコンジュゲートとＡ／Ｊマウスを用い、腹腔免疫にて行った。しかしながら、２回目の免疫後に高い抗体価が認められたものの、３回目免疫後より抗体価の低下を示すマウスが多く、４回目免疫後のアルドステロンに対する親和性も悪かった（＞400nM）。これは、（１）アルドステロン－ＫＬＨの組み合わせでは抗原性が高すぎること、それに加え、（２）免疫応答が高いＡ／Ｊを用いたこと、さらに（３）腹腔免疫では、マウスへの抗原性が強くなること、これらの３つが重なり、免疫の脱感作の状態が生じたと推察した。
そこで、通常とは逆に抗原性や免疫応答を下げるように免疫を行った。即ち、（１）アルドステロン－ＢＳＡコンジュゲートを抗原に使用、（２）免疫応答の低いＢＡＬＢ／cマウスを用い、（３）皮下免疫にて免疫を行った。その結果、免疫回数を重ねる毎に抗体価の上昇が認められ、非常に高い親和性（６nM）と高い抗体価を有するマウスも取得することができた（図３）。
この様にして、抗体価および親和性の高い抗血清を有するマウスを得ることができ、ミエローマ細胞との細胞融合により親和性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ取得することができた。モノクローナル抗体は、抗体産生ハイブリドーマの無血清培地あるいはハイブリドーマをマウスに投与して得られた腹水より、プロテインＡカラム（ＭＡＰＳ　ＩＩキット、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
以下の表１に、得られたモノクローナル抗体の特性について記載した。取得した抗体は、競合アッセイにおける５０％阻害率（ＩＣ５０％）は、０．５ｎＭであり、低分子化合物の抗体としては非常に高い親和性を有していた。この様な抗体が取得できたのは、上記の様な通常とは逆の方法、即ち抗原性を下げるなどの創意工夫することにより成し得た結果であり、単に常法に従った抗体作製法では得ることは出来ない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔モノクローナル抗体の感度確認〕
上述のＡｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ－６－ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ ＮＨＳｅｓｔｅｒとアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を５：１で反応させ、ＡＬＰ標識アルドステロンを調製した（図４）。このＡＬＰ標識アルドステロンを用い、アルドステロン測定系を構築した。アッセイ緩衝液（１ｍＭ　ＭｇＣＬ２、０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．４）２５μＬ、ＡＬＰ標識アルドステロン（０．１　ｐｏｌ／ｍＬ）２５μＬ、標準アルドステロン２５μＬ、および抗体希釈液（２　ｎｇ／ｍＬ）２５μＬを、図２Ｂに示したように抗マウスＩｇＧ抗体固相９６穴プレートに添加し、室温にて３時間反応させた。反応後、洗浄液で洗浄後基質溶液（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ）を１００μＬ添加し、撹拌後２０分間静置し、化学発光のシグナルをＡＲＶＯ ＭＸ (Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ)にて測定した。
その結果を図５に示した。５　ｐｇ／ｍＬ濃度で０濃度と有意に区別可能であり、体外診断薬（スパック－Ｓ－アルドステロンキット）に比べ高感度であった。
〔抗体の特異性の確認〕
得られたモノクローナル抗体がアルドステロン以外のステロイドホルモンと交差反応性を示すかどうか調べた。
調べたステロイド化合物は、以下の通りである。コルチゾール、コルチゾン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、エストラジオール、プレドニゾロン、１８－ヒドロキシコルチコステロン、スピラロノラクトン、プレドニゾン、トランスデヒドロアンドロステロン、アルドステロン。
アッセイ方法を以下に示す。抗マウスＩｇＧ抗体固相プレートに、上記に記載の通り、アッセイ緩衝液、アルドステロン標準液あるいは類似のステロイドホルモン溶液（０．１ｎＭ～１０００μＭ）、ＡＬＰ標識アルドステロン、抗体溶液を加え、撹拌後、室温３時間反応させた。洗浄液にて洗浄後、基質溶液を添加し、２０分後に化学発光のシグナルを検出した。
その結果を図６に示す。１８－ヒドロキシコルチコステロンは、アルドステロンの生合成基質であり、アルドステロンと構造式が非常に似ているにもかかわらず、交差反応性は０．０１％以下と低かった。それ以外のステロイド化合物との交差反応性は、全て０．００００８％を下回るほど非常に低かった。　
特に、コルチゾールはアルドステロンに比べ血中濃度が１００～５０００倍程度高いため、アルドステロン測定系には、その影響を回避する必要がある。今回得た抗体は、コルチゾールとの交差反応性が０．００００１２％以下と低く、コルチゾールのアルドステロン測定系への影響は回避できる。
〔市販キットとの交差反応性の比較〕
本抗体を用いたアルドステロン測定系と２種類の市販のアルドステロン測定キットを同時に比較した。方法は、上記に記載のアッセイ方法で行った。また、市販キットに関しては、添付の方法に従ってアッセイを行った。比較したステロイド化合物は、以下の通りである。コルチゾール、コルチゾン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、エストラジオール、プレドニゾロン、１８－ヒドロキシコルチコステロン、スピラロノラクトン、プレドニゾン、トランスデヒドロアンドロステロン、アルドステロン。濃度は、アルドステロンは、それぞれの測定キットの濃度を使用し、他の化合物は０．１ｎＭ～１０μＭの濃度で使用した。
その結果、本抗体は０．１ｎＭ～１０μＭの間では生合成基質（約０．０１％の交差反応性）以外は、阻害されないのに対し、２つの市販キットとも幾つかの化合物に反応性を示した（図６、表２）市販キットでは特に、アルドステロンの生合成基質１８－ヒドロキシコルチコステロンやコルチコステロン、プロゲステロンとの交差反応性が高い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
血中には、アルドステロンに比べ、コルチコステロンやプロゲステロン（女性の場合）が多く存在することから、市販キットではアルドステロンを正確に測定出来ない可能性が考えられる。
また、前述のように、コルチゾールはアルドステロンよりも血中濃度が非常に高い（１００～５０００倍）。市販キットでは、コルチゾールとの交差反応性が０．００４－０．００８％と、本抗体に比べ２オーダー以上交差反応性が高いことから、本抗体による測定系に比べてアルドステロン測定への影響が大きい。
本発明のモノクローナル抗体またはその断片を用いれば、他のステロイドホルモンの妨害を受けることなく、高感度でアルドステロンの定量が可能となる。そのため原発性アルドステロン症などのアルデステロン量と関係する各種疾患の患者に由来する試料の選別に、本発明のモノクローナル抗体は有用である。

Claims (7)

  1. （１）下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    TSDYAWN（配列番号３）、YINYSGRTGYNPSLKS（配列番号４）、およびRPYSYGPTYGFTY（配列番号５）、あるいは、これらの３つのCDRのうちの１つ以上のCDRにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのCDR、ならびに
    （２）下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    RSSTGPVTTSNYAN（配列番号６）、GLIGGINKRAP（配列番号７）、およびALWYSNHWL（配列番号８）、あるいは、これらの３つのCDRのうちの１つ以上のCDRにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのCDR、
    を有する、アルドステロンに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
  2. （１）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、あるいは配列番号１のアミノ酸配列のうち配列番号３、配列番号４および配列番号５で示されるCDR以外の部分において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域；ならびに
    （２）配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、あるいは配列番号２のアミノ酸配列のうち配列番号６、配列番号７および配列番号８で示されるCDR以外の部分において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域、
    を有する、アルドステロンに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
  3. 標識されたものである請求項１または２に記載の抗体またはその抗体断片。
  4. 請求項１～３のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含むキット。
  5. 請求項１～３のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いたアッセイ方法。
  6. 請求項１～３のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた、アルドステロンが関与する疾患に罹患している被験者由来の試料の選別方法。
  7. 以下の式（I）で示される化合物を、ＢＡＬＢ／cマウスに皮下免疫する工程を含むアルドステロンに対するモノクローナル抗体の製造方法
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
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