JP2023508023A - Ｃｘｃｌ１０結合タンパク質及びその使用 - Google Patents

Ｃｘｃｌ１０結合タンパク質及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）結合タンパク質、ならびに、対象における状態の検出及び／または診断方法であって、上記対象におけるＣＸＣＬ１０のレベルを測定することを含む、上記方法における、当該結合タンパク質の使用に関する。全ＣＸＣＬ１０（完全長、Ｎ末端切断、及びシトルリン化）に結合する特異的抗体、ならびに、活性ＣＸＣＬ１０（完全長）に結合する抗体を使用して、卵巣癌患者由来のサンプルにおける、全及び活性ＣＸＣＬ１０のレベルを測定した。全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＣＬ１０の計算割合は、良性腫瘍を有する患者、または健常な個体と比較したときに、悪性状態を有する患者において低かった。これは、悪性状態の診断方法、ならびに、腫瘍負荷及び疾患進行の監視方法において基礎となる。

Description

関連出願データ
本出願は、豪州特許出願第２０１９９０４８５９号（発明の名称「ＣＸＣＬ１０結合タンパク質及びその使用」）（２０１９年１２月２０日出願）からの優先権を主張し、この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、電子フォームの配列表と共に出願される。配列表の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質及びその使用に関する。
ケモカインインターフェロンγ誘導性タンパク質（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０；ＣＸＣＬ１０；インターフェロン誘導性タンパク質１０またはＩＰ－１０としても知られている）は、ＣＸＣケモカインファミリーのメンバーであり、対応するケモカイン受容体を発現する細胞において、走化性活性を生み出すことにより、白血球追跡において、重要な役割を果たす。
ＣＸＣＬ１０は、アゴニスト活性とアンタゴニスト活性の両方を有し、化学走性、アポトーシスの誘導、ならびに、細胞増殖の制御及び抗血管新生効果の媒介に関与する。ＣＸＣＬ１０は、受容体のＣＸＣＲ３を特異的に活性化することにより、その生物学的効果を発揮し、ＣＸＣＲ３は、活性化されたＴリンパ球（Ｔｈ１）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、炎症性樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞で優先的に発現する、７つの膜貫通型・Ｇタンパク質結合受容体である。ＣＸＣＬ１０の増殖性または抗増殖性作用は、細胞種依存性である、及び／または、その受容体であるＣＸＣＲ３のサブタイプに依存するようである。さらに、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるＣＸＣＬ１０の脱アミノ化もしくはシトルリン化、または、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）などのプロテアーゼによるＮＨ２末端切断などの翻訳後修飾は、ＣＸＣＲ３に結合可能ではあるが、シグナル伝達を誘導しないドミナントネガティブ型を生成することにより、その生物学的効果に寄与する。
ＣＸＣＬ１０は、感染症、中枢神経系疾患、慢性炎症、免疫機能不全、及びがんを含む様々なヒト疾患と関連している。
ＣＸＣＬ１０の、多数のヒト疾患との広範な関連を考慮すると、ＣＸＣＬ１０は魅力的なバイオマーカー、及び、標的療法の候補となっている。しかし、商業的に利用可能な診断の用途は、タンパク質の、生物学的に異なる関連を有する形態間における識別不可能性により、限定的である。
前述のことに基づくと、当業者には、潜在的なバイオマーカーとして、ＣＸＣＬ１０の全ての形態を正確に標的にすることができる、化合物（例えば、抗体及び抗体由来のタンパク質）が、当該技術分野において求められていることが明らかとなろう。
本発明を生み出すにあたって、発明者らは、ＣＸＣＬ１０の生物学的に関連する形体に
結合する試薬を生み出そうと試みた。発明者らは、完全長（即ち、生物学的に活性な）ＣＸＣＬ１０に結合する抗体、加えて、完全長ＣＸＣＬ１０、そしてさらに、Ｎ末端切断及びシトルリン化（即ち、不活性な）形態に結合する抗体を生み出した。驚くべきことに、異なる形態のＣＸＣＬ１０、及び、具体的には、異なる形態のＣＸＣＬ１０の比率を検出することで、良性状態と悪性状態の識別が可能であることを、発明者らは発見した。異なる形態のＣＸＣＬ１０の比率により、疾患が存在しないこと（即ち、健常な個体）から、疾患の存在（良性または悪性のいずれか）を区別することが可能であることもまた、発明者らは発見した。驚くべきことに、他の生物学的マーカー（例えば、ＤＰＰ４、ＣＡ－１２５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ）、ＨＥ４、及び／またはＩＬ－８）と組み合わせた、異なる形態のＣＸＣＬ１０の比率を検出することで、段階Ｉ（即ち、早期）のがんまたは前がん性損傷と、良性状態とを区別することが可能であることもまた、発明者らは発見した。
一実施例では、本開示は、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質であって、当該結合タンパク質が、完全長ヒトＣＸＣＬ１０、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０、及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０に結合する、上記結合タンパク質を提供する。
上記実施例の一実施形態では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、完全長ヒトＣＸＣＬ１０、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０、及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０のエピトープＮＨ２－ＬＳＲＴＶＲＣＴＣＩＳＩＳＮＱＰＶＮＰＲＳＬＥ－ＣＯＯＨ（配列番号２６）に結合する。
一実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、（ｉ）５０ｎＭ以下のＫＤで完全長ヒトＣＸＣＬ１０に結合する、及び／または、（ｉｉ）５ｎＭ以下のＫＤでＮ末端切断ヒトＣＸＣＬ１０に結合する。
一実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、５０ｎＭ以下のＫＤで完全長ヒトＣＸＣＬ１０に結合する、または、特異的に結合する。例えば、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、約５０ｎＭ、または約４０ｎＭ、または約３０ｎＭ、または約２０ｎＭ、または約１０ｎＭのＫＤで完全長ヒトＣＸＣＬ１０に結合する、または、特異的に結合する。一実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、約４９ｎＭのＫＤで完全長ヒトＣＸＣＬ１０に結合する、または、特異的に結合する。
上記実施例の一実施形態では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、完全長ヒトＣＸＣＬ１０に結合するために、エピトープＮＨ２－ＶＰＬＳＲＴＶＲＣＴＣＩＳＩＳＮＱＰＶＮＰＲＳＬＥ－ＣＯＯＨ（配列番号２５）のＮ末端バリン及び／またはプロリンを必要とする。
一実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、５ｎｍ以下のＫＤでＮ末端切断ヒトＣＸＣＬ１０に結合する、または、特異的に結合する。例えば、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、約５ｎＭ、または約４ｎＭ、または約３ｎＭ、または約２ｎＭ、または約１ｎＭのＫＤでＮ末端切断ヒトＣＸＣＬ１０に結合する、または、特異的に結合する。一実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、約３ｎＭのＫＤでＮ末端切断ＣＸＣＬ１０に結合する、または、特異的に結合する。
本開示は、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質であって、当該結合タンパク質が５０ｎＭ以下のＫＤで完全長ヒトＣＸＣＬ１０に結合するが、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０には結合しない、上記結合タンパク質もまた提供する。
一実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０に検出可能に結合しない、または、有意に結合しない。
ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の、ポリペプチドへの結合を測定する方法が、当事者に明らかとなろう。例えば、ポリペプチドが、固体または半固体表面上で固定され、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質が、固定されたポリペプチドに接触する。次に、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージングにより、結合が測定される。
一実施例では、（例えば、ＫＤにより測定される）結合レベルは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージングにより測定される。
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、可変領域または抗原結合ドメインを含む。
一実施例では、結合タンパク質は、
（ｉ）Ｆｖ；
（ｉｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）二量体ｓｃＦ（ジｓｃＦｖ）；
（ｉｖ）単一ドメイン抗体；
（ｖ）ミニボディ；
（ｖｉ）ダイアボディ；
（ｖｉｉ）トリアボディ；
（ｖｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｘ）Ｆａｂ；
（ｘ）Ｆ（ａｂ’）２；
（ｘｉ）抗体；
（ｘｉｉ）抗体ミメティック；
（ｘｉｉｉ）重鎖のみの免疫グロブリン；
（ｘｉｖ）Ｔ細胞受容体；
（ｘｖ）アドネクチン；
（ｘｖｉ）アンチカリン；
（ｘｖｉｉ）アフィボディ；
（ｘｖｉｉｉ）アビマー；
（ｘｉｘ）設計型アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ならびに
（ｘｘ）抗体、Ｆｃの定常領域に結合した（ｉ）～（ｘｉｘ）
のうちの１つ、あるいは、重鎖定常領域（ＣＨ２）及び／またはＣＨ３からなる群から選択される。
一実施例では、結合タンパク質は、抗体の抗原結合ドメインを含む。例えば、結合タンパク質は、少なくともＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨ及びＶＬは結合して、抗原結合ドメインのＦｖを形成する。
一実施例では、結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗体の可変領域を含むｓｃＦｖ）である。例示的抗体は、完全長及び／または裸（例えば、コンジュゲートしていない）抗体である。一実施例では、本開示の抗体は、完全長抗体である。
一実施例では、抗体は、ＩｇＧ、またはＩｇＥ、またはＩｇＭ、またはＩｇＤ、またはＩｇＡ、またはＩｇＹ抗体である。例えば、抗体はＩｇＧ抗体である。
一実施例では、ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１、またはＩｇＧ２、またはＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。例えば、抗体はＩｇＧ１抗体である。別の実施例では、抗体はＩｇＧ４抗体である。一実施例では、抗体は安定化ＩｇＧ４抗体である。
一実施例では、結合タンパク質は、組換え、キメラ、ＣＤＲグラフト、ヒト化、合成ヒト化、霊長類化、脱免疫化、またはヒトである。
一実施例では、本開示の抗原結合断片は半抗体である。例えば、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、一本の重鎖及び一本の軽鎖を含む半抗体である。
一実施例では、本開示の抗原結合断片は、ＩｇＧ４定常領域、または安定化ＩｇＧ４定常領域を含む。
一実施例では、結合タンパク質は抗体ミメティックである。例えば、結合タンパク質は、免疫グロブリンの抗原結合ドメイン、例えば、ＩｇＮＡＲ、ラクダ抗体、またはＴ細胞受容体を含む。
一実施例では、結合タンパク質は、ドメイン抗体（例えば、重鎖可変領域のみを、もしくは軽鎖可変領域のみを含む）、または、重鎖のみの抗体（例えば、ラクダ抗体もしくはＩｇＮＡＲ）、またはその可変領域である。
一実施例では、結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片の、
（ｉ）配列番号３に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び／または
（ｉｉ）配列番号１１に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２に記載するアミノ酸配列を含むＶＬ
を含むＣＸＣＬ１０への結合を競合的に阻害する。
一実施例では、結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片の、配列番号３に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含むＣＸＣＬ１０への結合を競合的に阻害する。
別の実施例では、結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片の、配列番号１１に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含むＣＸＣＬ１０への結合を競合的に阻害する。
一実施例では、結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号３に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＨ、及び、配列番号４に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＬ；または
（ｉｉ）配列番号１１に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＨ、及び、配列番号１２に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＬを含む。
一実施例では、結合タンパク質は、配列番号３に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＨ、及び、配列番号４に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＬを含む。例えば、結合タンパク質は、本明細書で開示する配列に少なくとも９０％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である、ＶＨ及び／またはＶＬを含む。
一実施例では、結合タンパク質は、配列番号１１に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＨ、及び、配列番号１２に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＬを含む。例えば、結合タンパク質は、本明細書で開示する配列に少なくとも９０％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である、ＶＨ及び／またはＶＬを含む。
一実施例では、本開示の結合タンパク質は、本明細書で開示する任意の配列の１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を任意選択的に含む。本開示で使用するのに好適なアミノ酸置換は、当業者に明らかとなり、自然に存在する置換、及び組換え置換が含まれる。
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号３に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４に記載するアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｉ）配列番号１１に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２に記載するアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、配列番号３に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片である。
別の実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、配列番号１１に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、
（ｉ）ＶＨであって、
ａ）配列番号３のアミノ酸２５～３４に記載する配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号３のアミノ酸４９～６５に記載する配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３のアミノ酸９８～１０８に記載する配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＨ、及び
ＶＬであって、
ａ）配列番号４のアミノ酸２３～３３に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号４のアミノ酸４９～５５に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号４のアミノ酸８８～９６に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＬ、または
（ｉｉ）ＶＨであって、
ａ）配列番号１１のアミノ酸２５～３４に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｂ）配列番号１１のアミノ酸４９～６５に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１１のアミノ酸９８～１０８に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＨ、及び
ＶＬであって、
ａ）配列番号１２のアミノ酸２３～３３に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１２のアミノ酸４９～５５に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１２のアミノ酸８８～９６に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＬ
を含む、抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、
（ｉ）ＶＨであって、
ａ）配列番号３のアミノ酸２５～３４に記載する配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号３のアミノ酸４９～６５に記載する配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３のアミノ酸９８～１０８に記載する配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＨ、及び
（ｉｉ）ＶＬであって、
ａ）配列番号４のアミノ酸２３～３３に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号４のアミノ酸４９～５５に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号４のアミノ酸８８～９６に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＬ
を含む、抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、
（ｉ）ＶＨであって、
ａ）配列番号１１のアミノ酸２５～３４に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１１のアミノ酸４９～６５に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１１のアミノ酸９８～１０８に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＨ、及び
（ｉｉ）ＶＬであって、
ａ）配列番号１２のアミノ酸２３～３３に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１２のアミノ酸４９～５５に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１２のアミノ酸８８～９６に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＬ
を含む、抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、
（ｉ）ＶＨであって、
ａ）配列番号５に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号６に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＨ、及び
ＶＬであって、
ａ）配列番号８に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号９に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１０に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＬ、または
（ｉｉ）ＶＨであって、
ａ）配列番号１３に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１４に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１５に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＨ、及び
ＶＬであって、
ａ）配列番号１６に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１７に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１８に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＬ
を含む、抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、
（ｉ）ＶＨであって、
ａ）配列番号５に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号６に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＨ、及び
（ｉｉ）ＶＬであって、
ａ）配列番号８に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号９に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１０に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＬ
を含む、抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、
（ｉ）ＶＨであって、
ａ）配列番号１３に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１４に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１５に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＨ、及び
（ｉｉ）ＶＬであって、
ａ）配列番号１６に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号１７に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号１８に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含むＶＬ
を含む、抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例では、タンパク質、抗体、またはその抗原結合断片は、前述のタンパク質、抗体、または機能的断片のいずれかをコードする核酸によりコードされる、タンパク質、抗体、またはその機能的断片のいずれかの形態である。
一実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、検出可能な標識にコンジュゲートされる。本開示で使用するのに好適な検出可能な標識は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。例えば、検出可能な標識は、放射能標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、配合基、及び造影剤からなる群から選択される。
一実施例では、検出可能な標識は放射能標識である。例えば、放射能標識は、放射性ヨウ素（１２５Ｉ、１３１Ｉ）、テクネチウム、イットリウム、３５Ｓ、または３Ｈであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は酵素である。例えば、酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は蛍光標識である。例えば、蛍光標識は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、フルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は発光標識である。例えば、発光標識は、ルミノールであることができるが、これに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は生物発光標識である。例えば、生物発光標識はルシフェラーゼ、ルシフェリン、またはエクオリンであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は磁気標識である。例えば、磁気標識はガドリニウム、または酸化鉄キレートであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は補欠分子族である。例えば、補欠分子族はストレプトアビジン／ビオチン、またはアビジン／ビオチンであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は造影剤である。
本開示は、本開示の結合タンパク質と担体を含む組成物もまた提供する。本開示で使用するのに好適な担体は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。
本開示は、本開示に従ったＣＸＣＬ１０結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた提供する。
本開示は、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに提供する。本開示で使用するのに好適な例示的なベクターは、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。
本開示は、インビトロで本開示の発現ベクターを含む細胞をさらに提供する。本開示で使用するのに好適な例示的な細胞は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。一実施例では、本開示は、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質を調製するための細胞の使用を提供する。例えば、使用は、本開示の細胞を培養し、当該細胞からＣＸＣＬ１０結合タンパク質を産生することと、産生した結合タンパク質を単離して精製することと、を含む。産生した結合タンパク質を単離して精製する方法は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。
本開示は、対象における悪性状態を検出及び／または診断する方法であって、当該方法が、
ａ）上記対象において活性ＣＸＣＬ１０のレベル、及び、上記対象において全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することと、
ｂ）上記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することと、を含む、上記方法を提供する。
一実施例では、活性ＣＸＣＬ１０及び全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することは、対象における、活性ＣＸＣＬ１０タンパク質の量、及び全ＣＸＣＬ１０タンパク質の量を測定することを含む。
一実施例では、方法は、対象におけるＣＸＣＬ１０の比率を、少なくとも１つの参照におけるＣＸＣＬ１０比率と比較することをさらに含む。参照の測定方法は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。
一実施例では、方法は、（ａ）対象におけるＣＸＣＬ１０比率が、参照におけるＣＸＣＬ１０比率よりも高いか否か、または、（ｂ）対象におけるＣＸＣＬ１０比率が、参照におけるＣＸＣＬ１０比率よりも低いか否かを測定することを含む。
一実施例では、（ｉ）参照におけるＣＸＣＬ１０比率と比較して、対象におけるＣＸＣＬ１０比率が低いことは、悪性状態を示す、または、（ｉｉ）参照におけるＣＸＣＬ１０比率と比較して、対象におけるＣＸＣＬ１０比率が高いことは、良性状態を示す。
一実施例では、方法は、
（ｉ）完全長ヒトＣＸＣＬ１０及びＮ末端切断ＣＸＣＬ１０及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０に特異的に結合するＣＸＣＬ１０結合タンパク質を使用して、対象における全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することと、
（ｉｉ）完全長ヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合するが、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０に結合しないＣＸＣＬ１０結合タンパク質を使用して、対象における活性ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することと、
を含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、本開示に従った少なくとも１つのＣＸＣＬ１０結合タンパク質を使用することを含む。
一実施例では、
（ｉ）対象における全ＣＸＣＬ１０のレベルは、配列番号１１に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片を使用して測定される、及び／または
（ｉｉ）対象における活性ＣＸＣＬ１０のレベルは、配列番号３に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片を使用して測定される。
一実施例では、対象における全ＣＸＣＬ１０のレベルは、配列番号１１に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片を使用して測定される。
別の実施例では、対象における活性ＣＸＣＬ１０のレベルは、配列番号３に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片を使用して測定される。
一実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質のうちの１つ以上は、検出可能な標識にコンジュゲートしている。本開示で使用するのに好適な検出可能な標識は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。例えば、検出可能な標識は、放射能標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、配合基、及び造影剤からなる群から選択される。
一実施例では、検出可能な標識は放射能標識である。例えば、放射能標識は、放射性ヨウ素（１２５Ｉ、１３１Ｉ）、テクネチウム、イットリウム、３５Ｓ、または３Ｈであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は酵素である。例えば、酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は蛍光標識である。例えば、蛍光標識は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、フルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は発光標識である。例えば、発光標識は、ルミノールであることができるが、これに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は生物発光標識である。例えば、生物発光標識はルシフェラーゼ、ルシフェリン、またはエクオリンであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は磁気標識である。例えば、磁気標識はガドリニウム、または酸化鉄キレートであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は補欠分子族である。例えば、補欠分子族はストレプトアビジン／ビオチン、またはアビジン／ビオチンであることができるが、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は造影剤である。
ＣＸＣＬ１０のレベルの検出方法は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。例えば、方法は、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、またはウエスタンブロットを行うことを含む。
一実施例では、方法は、フローサイトメトリーを行うことを含む。
一実施例では、方法は、酵素結合免疫吸着アッセイを行うことを含む。
一実施例では、方法は、ウエスタンブロットを行うことを含む。
一実施例では、方法は、対象にてインビトロまたはエクスビボで行われる。例えば、方法は、対象にてインビトロで行われる。別の実施例では、方法は、対象にてエクスビボで行われる。
一実施例では、方法は、対象から入手した少なくとも１つの生体サンプルで行われる。本開示で使用するのに好適な生体サンプルは、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。例えば、生体サンプルは、生検、流体サンプル、血漿サンプル、または細胞スワブからなる群から選択される。
一実施例では、生体サンプルは生検である。
一実施例では、生体サンプルは流体サンプルである。例えば、流体サンプルは子宮頸部液、膣液、または腹水である。一実施例では、生体サンプルは腹水流体である。
一実施例では、生体サンプルは血漿サンプルである。
一実施例では、生体サンプルは細胞スワブである。例えば、細胞スワブは子宮頸部スワブである。一実施例では、細胞スワブは頸腟スワブ（ＣＶＳ）である。
一実施例では、方法は、血漿サンプル及び頸腟スワブ（ＣＶＳ）で行われる。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、本発明は、対象における悪性状態の検出及び／または診断方法を提供する。例えば、悪性状態は、生殖癌である。一実施例では、生殖癌は卵巣癌である。一実施例では、卵巣癌はステージＩの癌である。別の実施例では、卵巣癌は、前癌性病変、例えば、ｐ５３遺伝子変異を有する病変である。
一実施例では、方法は、良性状態から悪性状態を検出及び／または診断することを含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、対象において、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）及び／またはがん抗原１２５（ＣＡ－１２５）のレベルを測定することをさらに含む。一実施例では、方法は、対象において、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）及びがん抗原１２５（ＣＡ－１２５）のレベルを測定することをさらに含む。別の実施例では、方法は、対象において、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）のレベルを測定することをさらに含む。さらなる実施形態では、方法は、対象において、がん抗原１２５（ＣＡ－１２５）のレベルを測定することをさらに含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子受容体Ｉ
Ｉ（ＴＮＦ－ＲＩＩ）、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、及びインターロイキン８（ＩＬ－８）のうちの１つ以上、または全てのレベルを測定することをさらに含む。例えば、方法は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＨＥ４、及びＩＬ－８のレベルを測定することをさらに含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、ＤＰＰ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＨＥ４、及びＩＬ－８のレベルを測定することをさらに含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、ＣＡ－１２５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＨＥ４、及びＩＬ－８のレベルを測定することをさらに含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、ＤＰＰ４、ＣＡ－１２５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＨＥ４、及びＩＬ－８のレベルを測定することをさらに含む。
対象における状態の検出及び／または診断方法であって、当該方法が、本発明の少なくとも１つのＣＸＣＬ１０結合タンパク質を使用して、上記対象においてＣＸＣＬ１０のレベルを測定することを含む、上記方法もまた提供する。
本実施例では、状態とは、完全長（即ち、生物学的に活性な）ＣＸＣＬ１０、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０、及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０のうちの１つ以上のレベル、及び／または、相対的比率により特性決定されるものである。一実施例では、状態は、炎症性の状態である。例えば、炎症性の状態は、関節炎、例えば、関節リウマチ及び／または乾癬性関節炎である。一実施例では、状態は、関節リウマチである。別の実施例では、状態は乾癬性関節炎である。一実施例では、状態はＣ型肝炎である。別の実施例では、状態は心不全である。
本開示は、悪性状態を患う対象における、腫瘍負荷を監視する方法であって、当該方法が、１つ以上の時点において、上記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することを含む、上記方法もまた提供する。
本開示は、対象における悪性状態の進行を監視する方法であって、当該方法が、１つ以上の時点において、上記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することを含む、上記方法をさらに提供する。
本開示は、悪性状態を患う対象における、腫瘍退行を測定する方法であって、当該方法が、１つ以上の時点において、上記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することを含む、上記方法もまた提供する。
本開示は、悪性状態を患う対象における、腫瘍再発を測定する方法であって、当該方法が、１つ以上の時点において、上記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することを含む、上記方法もまた提供する。
本開示は、悪性状態に苦しむ対象における、悪性状態の治療の有効性を測定する方法であって、当該方法が、１つ以上の時点において、上記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することを含む、上記方法もまた提供する。
一実施例では、対象は、悪性状態を有すると診断されている。例えば、対象は、悪性状
態に苦しんでいる。例えば、悪性状態は生殖癌、例えば卵巣癌である。
一実施例では、対象は無症候である。
一実施例では、対象は、悪性状態の治療を受けていない。例えば、対象は治療未経験である。一実施例では、対象は、悪性状態の治療を受けている。別の実施例では、対象は、悪性状態の治療を受けていた。悪性状態の治療に好適な治療法は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。例えば、治療は、手術、化学療法、放射線療法、標的薬物療法、免疫療法、またはこれらの組み合わせを含む。
一実施例では、治療は手術を含む。
一実施例では、治療は化学療法を含む。
一実施例では、治療は放射線療法を含む。
一実施例では、治療は標的薬物療法を含む。
一実施例では、治療は免疫療法を含む。
一実施例では、方法は、
（ａ）後の時点における、対象におけるＣＸＣＬ１０比率が、第１の時点における、対象におけるＣＸＣＬ１０比率よりも低いか否か、または
（ｂ）後の時点における、対象におけるＣＸＣＬ１０比率が、第１の時点における、対象におけるＣＸＣＬ１０比率よりも高いか否かを測定することを含む。
一実施例では、第１の時点と比較しての、後の時点における、対象における低いＣＸＣＬ１０比率は、当該対象における腫瘍負荷、及び／または腫瘍進行、及び／または腫瘍再発の増加を示す。例えば、治療前（即ち、第１の時点）と比較しての、治療後（即ち、後の時点）におけるＣＸＣＬ１０比率は、当該対象における腫瘍負荷、及び／または腫瘍進行、及び／または腫瘍再発の増加を示す。
一実施例では、第１の時点と比較しての、後の時点における、対象における高いＣＸＣＬ１０比率は、当該対象における腫瘍負荷、及び／または腫瘍退行、及び／または腫瘍再発の低下を示す。例えば、治療前（即ち、第１の時点）と比較しての、治療後（即ち、後の時点）における高いＣＸＣＬ１０比率は、当該対象における腫瘍負荷、及び／または腫瘍退行、及び／または腫瘍再発の低下を示す。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、治療を投与して、対象における腫瘍負荷及び／または腫瘍進行を低下させることをさらに含む。
本開示は、対象における悪性状態の治療方法であって、当該方法が、本開示に従い、上記対象における悪性状態を検出及び／または診断することと、上記対象に治療を投与することと、を含む、上記方法をさらに提供する。
悪性状態の治療に好適な治療法は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。例えば、治療は、手術、化学療法、放射線療法、標的薬物療法、免疫療法、またはこれらの組み合わせを含む。
本開示は、対象における悪性状態を検出及び／または診断するためのパネルまたはキッ
トであって、当該パネルまたはキットが、本開示の１つ以上のＣＸＣＬ１０結合タンパク質を含む、上記パネルまたはキットもまた提供する。
本開示は、対象において、悪性状態の腫瘍負荷を監視する、悪性状態の進行を監視する、悪性状態の腫瘍退行を測定する、悪性状態の腫瘍再発を測定する、及び／または、悪性状態の治療の有効性を測定するためのパネルまたはキットであって、当該パネルまたはキットが、本開示の１つ以上のＣＸＣＬ１０結合タンパク質を含む、上記パネルまたはキットをさらに提供する。
本明細書のいかなる実施形態も、特に明記されない限り、任意の他の実施形態に準用されるものとみなされる。例えば当業者であればわかるように、本発明の一実施例に関して上に概説した例は、本発明の他の実施例にも同様に当てはまる。
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲を制限されることはなく、それらの実施形態は、例示の目的のみを意図している。本明細書に記載されるように、機能的に同等の製品、組成物及び方法は明らかに本発明の範囲内である。
本明細書全体を通じて、特に明記されない限り、または文脈から特に必要とされない限り、単一のステップ、物質の組成、ステップの群または物質の組成の群への言及は、これらのステップ、物質の組成、ステップの群、または物質の組成の群の１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
活性ＣＸＣＬ１０と全ＣＸＣＬ１０との差を示すグラフ表示である。ＣＸＣＬ１０の検出のために、ＲＡ２及びＲＧ２を使用する、例示的な検量線。それぞれ、Ｒ２＞０．９９である。 Ａは、ＡＲＴと商用ＥＬＩＳＡとの間での、卵巣癌（ｎ＝２１２）由来の悪性腹水流体における、定量化した全ＣＸＣＬ１０の比較を示す。ＡＲＴと商用ＥＬＩＳＡとの間では、一致した腹水流体中で、定量化した全ＣＸＣＬ１０に有意差は観察されなかった。ＡＲＴと商用ＥＬＩＳＡによる、全ＣＸＣＬ１０の全体平均はそれぞれ、１１２６．１±２１５８．６ｐｇ／ｍＬ及び１１９２．４±１０５９．５ｐｇ／ｍＬであった。Ｂは、ＡＲＴと商用ＥＬＩＳＡとの間での、定量化した全ＣＸＣＬ１０の相関、及び、良性及び悪性腹水の両方に対する２つの試験における、緩やかな正の相関を示し、それぞれ、ｒ値は０．３０８４及び０．２５９４である。Ｐ≦０．０５。 Ａは、ｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２による、組換え完全長ＣＸＣＬ１０及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０の検出を示すウエスタンブロットである。ＣＸＣＬ１０をＰＡＤ２と共に（＋）、またはなしで（－）処理し、６０分にわたってシトルリン化を誘発した後、ウエスタンブロットにより分離した。なんら処理を行わない（ｎ／ｔ）組換え完全長ＣＸＣＬ１０を、陽性対照として使用した。商用の抗ＣＸＣＬ１０抗体（ａｂ９８０７）は、ＰＡＤ２インキュベーション期間の１５分後に、シトルリン化ＣＸＣＬ１０を検出しなかった。ｍＡｂ－ＲＡ２による、シトルリン化ＣＸＣＬ１０に対する検出の実質的な低下は、１５分後に観察され、ｍＡｂ－ＲＧ２によるＣＸＣＬ１０検出におけるシトルリン化の影響は観察されなかったことに留意されたい。Ｂは、ｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２の、ＡＲＴによるシトルリン化ＣＸＣＬ１０の検出を示す。ｍＡｂ－ＲＡ２による、シトルリン化ＣＸＣＬ１０の結合の実質的な低下が観察された一方で、ｍＡｂ－ＲＧは、シトルリン化ＣＸＣＬ１０の一定の結合を維持した。 活性及び全ＣＸＣＬ１０の定量化、及び活性ＣＸＣＬ１０による、卵巣癌由来の悪性腹水流体の良性の差を示す。Ａは、良性（ｎ＝５１）及び悪性腹水（ｎ＝２０８）における、活性ＣＸＣＬ１０濃度を示す：それぞれ、２４０．４±４１０．５ｐｇ／ｍＬ及び８１８．６±１０９８．０ｐｇ／ｍＬである。Ｂは、良性（ｎ＝５１）及び悪性腹水（ｎ＝２１２）における、全ＣＸＣＬ１０の濃度を示す：それぞれ、１６０．８±３６２．０ｐｇ／ｍＬ及び１１２６．１±２１５８．６ｐｇ／ｍＬである。Ｃは、良性（ｎ＝５１）及び悪性腹水（ｎ＝２２６）における、活性比率の有意差を示す：それぞれ、２．５９±１．１８及び１．４３±１．０４である。Ｄは、良性と比較しての、卵巣癌の段階に基づく活性割合である。良性：２．５９±１．１８；ステージ１：１．０７±０．４４；、及びステージ３：１．５５±１．２３。＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 悪性から良性を区別する、ＤＰＰ４及び血漿ＣＡ１２５を示す。Ａは、抗ＤＰＰ４ ＥＬＩＳＡによる、良性（ｎ＝４８）及び悪性腹水（ｎ＝１４８）におけるＤＰＰ４濃度の測定を示し、それぞれ、１８４．８±１７７．６ｎｇ／ｍＬ及び２０３．５±１５４．３ｎｇ／ｍＬである。Ｐ＝０．１０３１。Ｂは、良性（ｎ＝４９）及び悪性（ｎ＝５０）腹水における、ＤＰＰ４特異的活性（Ｕ／ｎｇ）の測定を示し、それぞれ、２．４９±３．８３及び１．６５±２．１３である。Ｐ＝０．４２２９。Ｃは、一致する患者における血漿ＣＡ１２５の測定を示し、それぞれ、良性（ｎ＝３０）及び悪性（ｎ＝１８８）患者サンプルに対して、２００．８±３６８．７Ｕ／ｍＬ及び１６９７．０±３４０９．０Ｕ／ｍＬである。＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 良性及び悪性腹水流体における、活性割合と、血漿ＣＡ１２５；ＤＰＰ４濃度、及びＤＰＰ４特異的活性との相関を示す。Ａは、良性または悪性サンプルのいずれかにおいて、活性比率と血漿ＣＡ１２５には有意な相関がないことを示す。Ｂは、悪性腹水サンプルにおいては、活性割合とＤＰＰ４（ｎｇ／ｍＬ）には、適度な負の相関がある（Ｐ＝０．０００２）一方で、良性サンプルには有意な相関が存在しないことを示す。Ｃは、良性サンプルにおいては、活性割合及びＤＰＰ４特異的活性（Ｕ／ｎｇ）には適度な負の相関がある一方で、悪性サンプルには相関が存在しないことを示す。 患者の腹水サンプルにおいて、ＡＲＴｖｓ他のマーカーに対する、優れたＡＵＣを示す受信者動作曲線（ＲＯＣ）を示す。Ａは、全ＣＸＣＬ１０及び活性ＣＸＣＬ１０の定量化のＡＵＣ（それぞれ、ＡＵＣは０．８１２２及び０．７８７２）よりも、高いＡＵＣ（０．８６１７）を達成する活性割合を示す。Ｂは、ＤＰＰ４及び血漿ＣＡ１２５のＡＵＣ（それぞれ、ＡＵＣは０．５５９８、及びＡＵＣは０．８２６２）よりも高いＡＵＣを達成する活性割合を示す。活性割合、ＤＰＰ４（ｎｇ／ｍＬ）、及び血漿ＣＡ１２５（Ｕ／ｍＬ）を組み合わせることにより、高いＡＵＣを示す。 バイオマーカーベースの試験として、ＡＲＴに理想的な、頸腟スワブ（ＣＶＳ）及び血漿を示す。Ａは、良性（ｎ＝５０）と悪性（ｎ＝５０）サンプルでの、ＣＶＳ中の活性割合の有意差を示し、それぞれ、良性及び悪性ＣＶＳにおける活性割合は、４．３９±４．５２及び１．１４±０．６２である。Ｂは、良性（ｎ＝３０）と悪性（ｎ＝３０）血漿サンプルでの、血漿中の活性割合の有意差を示し、それぞれ、良性及び悪性血漿における活性割合は、３．１８±１．７９及び２．０２±１．０５である。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１。 ＡＲＴは、良性状態または悪性卵巣癌の患者から、がんではない患者を識別する。Ａは、血漿サンプルで測定される活性及び全ＣＸＣＬ１０の濃度を示す。Ｂは、３つの患者群にまたがる、活性及び全ＣＸＣＬ１０の濃度を示す。Ｃ及びＤは、血漿（Ｃ）またはＣＶＳ（Ｄ）で検出された、がんではない（健常な）サンプルと、良性及び悪性サンプルとの間での、計算される活性割合を示す。＊ｐ≦０．０５；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。 予防のために収集したコホートにおいて、Ａは、ＤＰＰ４の量を、Ｂは、ＤＰＰ４特異的活性を示し、Ｃ及びＤは、活性割合と共にこれらの相関を示す。 がんではない状態と、良性及び悪性疾患との間で識別される、ＣＶＳスワプを使用して行われるＡＲＴを示す。Ａは、活性ＣＸＣＬ１０の全体濃度が、全ＣＸＣＬ１０よりも有意に高かったことを示す。Ｂは、がんではない（健常な）サンプルと、良性及び悪性サンプルとの間での、計算される活性割合を示す。＊ｐ≦０．０５；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。 Ａは、ＣＶＳでのＤＰＰ４の量を示し、Ｂは、計算したＣＶＳの活性割合との相関を示す。 Ａは、良性または悪性卵巣腫瘍のいずれかを有する患者に対する、予防のために収集したコホートにおける血漿ＣＡ１２５を示す。Ｂは、ＣＡ１２５と活性割合の相関を示す。 Ａ：血漿とＣＶＳの活性割合、Ｂ：ＤＰＰ４を含む血漿とＣＡ１２５の活性割合、及びＣ：ＤＰＰ４を含むＣＶＳとＣＡ１２５の活性割合、の組み合わせを示し、それぞれ、健常な女性と、悪性卵巣腫瘍を有する患者との間で識別される。 Ａ：ＣＡ１２５と比較しての個別のマーカー、及び、Ｂ：マーカー（良性＋健常ｖｓ悪性に基づいて構築）の組み合わせの、識別力を評価するためのＲＯＣを示す。
配列表の解読
配列番号１ プレ配列を含むヒトＣＸＣＬ１０のアミノ酸配列
配列番号２ 成熟ヒトＣＸＣＬ１０のアミノ酸配列
配列番号３ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の重鎖ＶＨアミノ酸配列
配列番号４ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の軽鎖ＶＬアミノ酸配列
配列番号５ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の重鎖ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号６ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の重鎖ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号７ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の重鎖ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号８ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の軽鎖ＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号９ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の軽鎖ＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号１０ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の軽鎖ＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号１１ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＧ２の重鎖ＶＨアミノ酸配列
配列番号１２ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＧ２の軽鎖ＶＬアミノ酸配列
配列番号１３ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＧ２の重鎖ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号１４ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の重鎖ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号１５ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＧ２の重鎖ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号１６ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＧ２の軽鎖ＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号１７ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の軽鎖ＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号１８ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＧ２の軽鎖ＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号１９ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の重鎖ＶＨヌクレオチド配列
配列番号２０ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＡ２の軽鎖ＶＬヌクレオチド酸配列
配列番号２１ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＧ２の重鎖ＶＨヌクレオチド配列
配列番号２２ 抗ＣＸＣＬ１０抗体ＲＧ２の軽鎖ＶＬヌクレオチド酸配列
配列番号２３ ヒトＣＸＣＬ１０のインタクトなＮ末端を含むペプチド配列
配列番号２４ ヒトＣＸＣＬ１０の切断Ｎ末端を含むペプチド配列
配列番号２５ ヒトＣＸＣＬ１０のインタクトなＮ末端エピトープ
配列番号２６ ヒトＣＸＣＬ１０の切断Ｎ末端エピトープ
概要
本明細書全体を通して、具体的に別段明記されない限り、または文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一のステップ、事象構成、ステップ群、または事象構成群への言及は、これらのステップ、事象構成、ステップ群、または事象構成群のうちの１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
本開示は、本明細書に記載の特定の実施例により範囲を限定されないものとし、このような特定の例は、例示目的のみであることが意図される。機能的に等価の産物、組成物、及び方法は、明らかに本開示の範囲内にある。
当業者であれば、広く記載される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態で示された本発明に多くの変形形態及び／または改変がなされ得ることを認識するであろう。したがって、本実施形態は、全ての点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
本明細書で議論及び／または参照される全ての公開物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、物品などのいかなる説明も、本発明の文脈を提供する目的のためだけのものである。これらの事項の一部または全ては、本出願の各請求項の優先日前に存在していた本発明に関連する分野における先行技術の基礎の一部または共通の一般的知識であったことが承認されたものとはみなさない。
本開示の任意の例は、別段の明記がない限り、必要な変更を考慮しながら本開示の任意の他の例に適用されるように解釈するものとする。別の言い方をすれば、本開示の任意の具体例を、本開示の任意の他の具体例（相互排他的なものを除く。）と組み合わせることができる。
特定の形質、または形質の群、または方法、または方法のステップを開示する、本開示の任意の例を利用して、当該特定の形質、または形質の群、または方法、または方法のステップを区別するための明示的なサポートが付与されるであろう。
別段の具体的な定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の（例えば、細胞培養、分子遺伝学、分子生物学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学における）当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有するように解釈するものとする。
特に断わらない限り、本開示で用いられている組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学の技術は、当業者に周知の標準的な手続きである。このような技術は、例えば、Ｐｅｒｂａｌ，１９８４；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｂｒｏｗｎ，１９９１；Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５ ａｎｄ １９９６；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１のソースにおける文献を通して記載及び説明されている。
本明細書における、可変領域及びその一部、免疫グロブリン、抗体、及びその断片の説明及び定義は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ａｎｄ １９９１；Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ
ｅｔ ａｌ．，１９８９、及び／またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７における議論により、さらに明らかとなり得る。
例えば、残基の範囲への、本明細書における言及は、包括的であると理解されるであろう。例えば、「アミノ酸５６～６５を含む領域」への言及は、包括的な様式で理解される、即ち、当該領域は、特定の配列中の、番号付けされた５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、及び６５アミノ酸の配列を含む。
「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味またはいずれかの意味に明確なサポートを提供するものとみなされる。
本明細書全体において、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐ
ｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形例は、述べられた要素、整数またはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数またはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の除外は意味しないことが理解されるであろう。
本明細書で使用する場合、用語「対象」とは、人を含む任意の動物、例えば哺乳類を意味するものとして理解されなければならない。例示的な対象としてはヒト及び非ヒト霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。一例において、対象はヒトである。例えば、対象はヒトである。
選択された定義
ヒトＣＸＣＬ１０は、プレ配列（配列番号１）として表され、Ｎ末端の２２個のアミノ酸が切断され、成熟「完全長」ヒトＣＸＣＬ１０（配列番号２）が生み出される。したがって、本明細書で使用する場合、用語「完全長ＣＸＣＬ１０」とは、「成熟」完全長ＣＸＣＬ１０を生成するために、２２個のＮ末端アミノ酸を取り除くための翻訳後切断以外の翻訳後修飾がされていないＣＸＣＬ１０を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０」とは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）により切断されている「成熟」完全長ＣＸＣＬ１０を意味し、例えば、配列番号２のアミノ酸３～７７からなる。
本明細書で使用する場合、用語「シトルリン化ＣＸＣＬ１０」とは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）により、例えば配列番号２のアミノ酸位置５におけるアルギニン残基で、脱アミノ化またはシトルリン化により翻訳修飾されているＣＸＣＬ１０を意味する。
他の種に由来するＣＸＣＬ１０の配列は、本明細書で提供する配列を使用して、及び／または一般に入手可能なデータベースで測定することが可能であり、及び／または、標準的な技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８（現在までのあらゆるアップデートを含む）、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されているようなもの）を使用して測定することができる。
用語「組換え」とは、人工的な遺伝子組換え製品を意味すると理解されなければならない。したがって、可変領域または抗原結合ドメイン（例えば、抗体抗原結合ドメイン）を含む組換えタンパク質の文脈において、本用語は、Ｂ細胞の成熟中に発生する自然組換えの産生物である対象の体内で自然発生するタンパク質は含まない。しかし、このようなタンパク質が単離される場合、当該タンパク質は、可変領域または抗原結合ドメインを含む単離したタンパク質とみなされる。同様に、タンパク質をコードする核酸が組換え手段を用いて単離して発現した場合、得られるタンパク質は、可変領域または抗原結合領域を含む組換えタンパク質である。組換えタンパク質はまた、そのタンパク質が、例えばそれが発現する細胞、組織、対象内に存在する時、人工的な組換え手段により発現したタンパク質を含む。
用語「タンパク質」とは、単一ポリペプチド鎖、即ち、ペプチド結合により連結した一連の連続アミノ酸、または、互いに共有結合、もしくは非共有結合した一連のポリペプチド鎖（即ち、ポリペプチド複合体）を含むものと理解されなければならない。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学またはジスルフィド結合を使用して共有結合的に結合させることができる。非共有結合の例には、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。
用語「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」は、前述の段落から、ペプチド結合により結合した一連の連続アミノ酸を意味すると理解されよう。
本明細書で使用する場合、用語「結合タンパク質」とは、抗原（例えば、細胞成分または分子、例えばタンパク質）と相互作用する、またはこれに特異的に結合することができる、タンパク質、またはその一部、または当該タンパク質の他の領域を意味するものとして理解されなければならない。
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合ドメイン」は、抗原、すなわちＶＨもしくはＶＬ、またはＶＨ及びＶＬの両方を含むＦｖに特異的に結合可能な抗体の領域を意味するものと理解されなければならない。抗原結合領域は、抗体全体を意味する必要はなく、例えば、単離（例えばドメイン抗原）、または、例えば本明細書に記載する、ｓｃＦｖなどの別の形態とすることができる。
本開示の目的のために、用語「抗体」は、Ｆｖ内に含まれる抗原結合領域によって、１つまたは少数の密接に関係した抗原（例えばＣＸＣＬ１０）に特異的に結合可能なタンパク質を含む。この用語は四本鎖抗体（例えば２つの軽鎖及び２つの重鎖）、組換えまたは修飾抗体（例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、合成ヒト化抗体、半抗体、二重特異的抗体）を含む。抗体は通常、定常ドメインを含み、定常領域または定常断片もしくは結晶性断片（Ｆｃ）中に組み込むことが可能である。抗体の代表的な形態は、基本単位として四本鎖構造を含む。完全長抗体は、共有結合した２つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）、及び２つの軽鎖（約２３ｋＤａ）を含む。軽鎖は一般に、可変領域（存在する場合）及び定常ドメインからなり、哺乳類では、κ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかである。重鎖は一般に可変領域、及びヒンジ領域により追加の定常ドメイン（複数可）に連結した１つまたは２つの定常ドメイン（複数可）からなる。哺乳類の重鎖は、以下の種類：α、β、ε、γ、またはμのいずれかである。各軽鎖もまた、重鎖の１つに共有結合している。例えば、２つの重鎖、ならびに重鎖及び軽鎖は鎖間ジスルフィド結合により、及び非共有相互作用により互いに結合している。鎖間ジスルフィド結合の数は、異なる種類の抗体間で変化する。各鎖はＮ末端可変領域（それぞれのアミノ酸長が約１１０であるＶＨまたはＶＬ）、及びＣ末端に１つ以上の定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメイン（約１１０のアミノ酸長であるＣＬ）は、重鎖の第一の定常ドメイン（３３０～４４０のアミノ酸長であるＣＨ１）と位置が合わさり、ジスルフィド結合している。軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と位置が合っている。抗体重鎖は、２つ以上のさらなるＣＨ領域（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３など）を含むことができ、ＣＨ１定常ドメインとＣＨ２定常ドメインとの間にヒンジ領域を含むことができる。抗体は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスであることができる。一実施例では、抗体はネズミ（マウスもしくはラット）抗体、または霊長類（例えばヒト）抗体である。一実施例では、抗体重鎖はＣ末端リジン残基を欠いている。一実施例では、抗体はヒト化、合成ヒト化、キメラ、ＣＤＲ移植または脱免疫化されている。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、または「全抗体」は同じ意味で用いられ、抗体の抗原結合断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を意味する。特に全抗体には、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものが含まれる。定常ドメインは、野生型配列定常ドメイン（例えば、ヒトの天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。
本明細書で使用する場合、「可変領域」とは、抗原に特異的に結合可能な、本明細書に定義する抗体の軽鎖及び／または重鎖の一部を意味し、相補性決定領域（ＣＤＲ）；即ち
、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに、フレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む。例えば、可変領域は、３つのＣＤＲと結合した、３つ、または４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び所望によりＦＲ４）を含む。ＶＨとは重鎖の可変領域を指す。ＶＬとは軽鎖の可変領域を指す。
本明細書で使用する場合、用語「相補性決定領域」（同義語：ＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原への特異的結合に主に寄与するものが存在する抗体可変領域のアミノ酸残基を意味する。各可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）は通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と表される３つのＣＤＲを有する。一実施例では、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられたアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ａｎｄ １９９１（本明細書においては、「Ｋａｂａｔの付番システム」としても呼ばれる）に従い定義される。別の実施例では、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられたアミノ酸の位置は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に従って定義される。Ｋａｂａｔの付番システムに従うと、ＶＨのＦＲ及びＣＤＲは、以下の通り位置する：残基１～３０（ＦＲ１）、３１～３５（ＣＤＲ１）、３６～４９（ＦＲ２）、５０～６５（ＣＤＲ２）、６６～９４（ＦＲ３）、９５～１０２（ＣＤＲ３）、及び１０３～１１３（ＦＲ４）。Ｋａｂａｔの付番システムに従うと、ＶＬのＦＲ及びＣＤＲは、以下の通り位置する：残基１～２３（ＦＲ１）、２４～３４（ＣＤＲ１）、３５～４９（ＦＲ２）、５０～５６（ＣＤＲ２）、５７～８８（ＦＲ３）、８９～９７（ＣＤＲ３）、及び９８～１０７（ＦＲ４）。本開示は、Ｋａｂａｔの付番システムにより定義されるＦＲ及びＣＤＲに限定されないが、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９；及び／またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７の正準付番システム；Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｋｔｈｕｎ，２００１の付番システム；または、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７で論じられるＴＭＧＴシステムを含む全ての付番システムを含む。一実施例では、ＣＤＲはＫａｂａｔの付番システムに従って定義される。所望により、Ｋａｂａｔの付番システムに従った重鎖ＣＤＲ２は、本明細書に列挙されている５つのＣ末端アミノ酸を含まないか、または、これらのアミノ酸のうちの１つ以上が、他の自然に存在するアミノ酸と置換される。これに関し、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５は、重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端アミノ酸が一般的には抗原結合に関与しないことを確立した。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｖ」（または、変形可能な断片）は、複数のポリペプチドで構成されているか、単一のポリペプチドで構成されているかにかかわらず、その中でＶＬ及びＶＨが会合して、抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを有する複合体を形成する、あらゆるタンパク質を意味するものと理解されなければならない。抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬは、単一ポリペプチド鎖または異なるポリペプチド鎖に存在することができる。さらに、本開示のＦｖ（同様に、本開示の任意のタンパク質）は、同一の抗原に結合可能な、または結合できない複数の抗原結合ドメインを有してよい。本用語は、抗体から直接誘導される断片、ならびに組換え手段を使用して産生したこのような断片に対応するタンパク質を包含するものと理解されなければならない。いくつかの実施例では、ＶＨは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）１に結合してないか、及び／またはＶＬは軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に結合していない。代表的なＦｖ含有ポリペプチドまたはタンパク質としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディもしくはそれ以上の高次複合体、またはその定常領域もしくはドメイン、例えばＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインに結合した、前述のいずれか、例えばミニボディが挙げられる。「抗原結合断片」または「Ｆａｂ断片」は、免疫グロブリンの一価の抗原結合断片からなり、これは、酵素パパインによる全抗体の分解により産
生され、これによって、インタクトな軽鎖、及び重鎖の一部からなる断片を得ることができるか、または、組換え手段を使用して産生することができる。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、全抗体をペプシンで処理し、続いて還元により処理することで得られ、インタクトな軽鎖、ならびにＶＨ及び単一の定常ドメインを含む重鎖の一部からなる分子を得ることができる。２つのＦａｂ’断片は、このようにして処理した抗体１つから得られる。Ｆａｂ’断片はまた、組換え手段により産生することができる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２個のジスルフィド結合によって結合している２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、全抗体分子を酵素のペプシンにより処理し、その後、還元を行わずに得られる。「Ｆａｂ２」断片は、例えばロイシンジッパーまたはＣＨ３ドメインを使用して２つのＦａｂ断片からなる組換え断片である。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が好適な可動性ペプチドリンカーにより共有結合している抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含有する、組換え分子である。
本明細書で使用する場合、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質またはその抗原結合ドメインと、抗原との相互作用に関する用語「結合する」は、当該相互作用が抗原中の特定構造（例えば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存していることを意味する。例えば、抗原は、タンパク質全てではなく特定のタンパク質の構造を認識し、結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、標識した「Ａ」及びタンパク質を含有する反応において、エピトープ「Ａ」（または遊離した非標識の「Ａ」）を含有する分子の存在により、抗体に結合した、標識した「Ａ」の量が減少する。
本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合する」は、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質が、代わりの抗原または細胞よりも、より長い期間及び／またはより高い親和性で、より頻繁に、より速く、特定の抗原または当該抗原を発現する細胞と反応または会合するものと理解されなければならない。例えば、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、他のケモカイン受容体、または、多反応性自然抗体により（即ち、ヒトで自然に発見される様々な抗原に結合することが知られている、自然に存在する抗体により）一般に認識される抗原に結合するよりも、ＣＸＣＬ１０に、物質的に高い親和性（例えば、１．５倍、または２倍、または５倍、または１０倍、または２０倍、または４０倍、または６０倍、または８０倍～１００倍、または１５０倍、または２００倍）でＣＸＣＬ１０に結合する。「結合」への言及により、用語「特異的結合」への明示的なサポートがもたらされ、この逆もまた同様である。
本明細書で使用する場合、用語「結合しない」とは、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質が、特定の抗原、または当該抗原を発現する細胞に結合しないことを意味するものと理解されなければならない。
本明細書で使用する場合、用語「検出可能に結合しない」とは、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質、例えば抗体が候補抗原に、１０％未満、または８％、または６％、または５％を上回るバックグラウンドのレベルで結合することを意味するものと理解されなければならない。バックグラウンドは、タンパク質の不在下及び／または陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、及び／または陰性対照抗原の存在下で検出される結合のレベルであり得る。一実施例では、結合レベルは、抗原（例えば、ポリペプチド）が固定され、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質と接触するバイオセンサー分析（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して検出される。
本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合しない」とは、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質の、ポリペプチドへの結合レベル、例えば、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の不存在下、及び／または陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、及び／または、陰性対照ポリペプチドの存在下で検
出される結合レベルが、バックグラウンドよりも統計的に有意に高くないことを意味するものと理解されなければならない。一実施例では、結合レベルは、抗原（例えば、ポリペプチド）が固定され、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質と接触するバイオセンサー分析（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して検出される。
明確性のため、及び、本明細書で例示される主題に基づいて当業者に明らかとなるように、本明細書での「親和性」への言及とは、タンパク質または抗体のＫＤへの言及である。
「少なくとも約～の親和性」への言及は、親和性（またはＫＤ）は、引用した値に等しいか、またはこれより大きい（即ち、親和性として引用した値が小さい）、即ち、２ｎＭの親和性は、３ｎＭの親和性よりも大きいことを意味するものと理解されるであろう。別の言い方をすれば、本用語は、「Ｘ以下の親和性」であることができ、ここでＸは、本明細書で引用する値である。
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」（「抗原決定基」の同義語）は、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質が結合する領域を意味するものと理解されなければならない。本用語は、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質が接触する特定の残基または構造に必ずしも限定されない。例えば、本用語は、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質と接するアミノ酸にまたがる領域、及び、当該領域の外側にある５～１０個（もしくはそれ以上）、または２～５、または１～３個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例では、エピトープは、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドが折り畳まれ、かつ例えば、別のＣＸＣＬ１０ポリペプチドと会合するときに互いに接近して位置する一連の不連続なアミノ酸、即ち、「配座エピトープ」を含む。
用語「競合的に阻害する」は、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質（または、その抗原結合ドメイン）が、引用した抗体またはＣＸＣＬ１０結合タンパク質の、ＣＸＣＬ１０への結合を低下させる、または妨げることを意味するものと理解されなければならない。これは、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質（または抗原結合ドメイン）及びこれに結合する抗体、または重なり合うエピトープに起因するものであり得る。前述の記載より、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は必ずしも完全に抗体の結合を阻害するわけではなく、むしろ、結合を低減させるには、統計的に有意な量、例えば少なくとも１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または９５％が必要なだけであることが明らかとなろう。例えば、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、抗体の結合を、少なくとも約３０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、またさらに好ましくは、少なくとも約８０％もしくは８５％、例えば少なくとも約９０％低下させる。結合の競合的阻害を測定するための方法は当技術分野で知られており、及び／または本明細書に記載されている。例えば、抗体をＣＸＣＬ１０結合タンパク質の存在下または不存在下にてＣＸＣＬ１０に曝露させる。ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の不存在下よりも、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の存在下において抗体の結合が少ない場合、タンパク質は、抗体の結合を競争的に阻害すると考えられる。一実施例では、拮抗阻害は立体障害によるものではない。
ＣＸＣＬ１０結合タンパク質
本明細書で論じるように、本開示の結合タンパク質は、様々な形態をとることが可能であり、完全長ヒトＣＸＣＬ１０、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０、及び／またはシトルリン化ＣＸＣＬ１０に結合可能である。
一実施例では、本開示は、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質であって、当該結合タンパク質が、完全長ヒトＣＸＣＬ１０、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０、及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０に結合する、上記結合タンパク質を提供する。
別の実施例では、本開示は、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質であって、当該結合タンパク質が、完全長ヒトＣＸＣＬ１０には結合するが、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０には結合しない、上記結合タンパク質を提供する。
抗体
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含む。
免疫化ベースの方法
抗体の生成方法は、当技術分野において既知である、及び／または、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８に記載されている。一般に、このような方法において、任意選択的に、任意の好適な、または所望の担体、補助剤、または薬学的に許容される賦形剤で製剤化された、タンパク質、または免疫原性断片もしくはそのエピトープ、またはこれらを発現し示す細胞（即ち、免疫原）を、非ヒト動物、例えばマウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、またはブタに投与する。免疫原は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、または他の既知の経路により投与することができる。
ポリクローナル抗体の産生は、免疫動物の血液を免疫化後の様々な時点でサンプル採取することにより、モニターすることができる。所望の抗体力価を達成するために必要な場合は、１回以上さらに免疫化してもよい。追加免疫及び力価測定のプロセスは、好適な力価が達成されるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られた場合は、免疫動物から採血し、血清を単離及び保管し、及び／または動物をモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成に使用する。
モノクローナル抗体は、本開示により想倒される抗体の、例示的な一形態である。「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、同じ抗原（複数可）に対し、例えば、抗原内の同じエピトープに対し結合可能である均質な抗体集団を指す。この用語は、抗体の供給源または抗体を作製する方式に対し限定されるようには意図されていない。
ｍＡｂの産生のために、多数の既知の技術のうちのいずれか１つ、例えば、ＵＳ４１９６２６５またはＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８で例示されている手順などを使用することができる。
例えば、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下にて、好適な動物を免疫原により免疫化する。ウサギならびに齧歯類（例えばマウス及びラット）が、例示的な動物である。ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現し、及び、例えば、ネズミ科動物免疫グロブリンタンパク質を発現しないように遺伝子操作されたマウスも、（例えば、ＷＯ２００２０６６６３０に記載のようにして）本開示の抗体を生成するために使用することができる。
免疫化後、抗体を産生する潜在能力を有する体細胞、例えば、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）が、ｍＡｂ生成プロトコルで使用するために選択される。このような細胞は、脾臓、扁桃腺、もしくはリンパ節の生検から、または末梢血サンプルから取得することができる。免疫動物からのＢ細胞は、次いで、不死化骨髄腫細胞の細胞と融合させる。この骨髄腫細胞は、概して、免疫原で免疫化した動物と同じ種に由来する。
ハイブリッドは、組織培地中のヌクレオチドの新規合成をブロックする薬剤を含む選択培地中で培養することによって増幅される。例示的な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、及びアザセリンである。
増幅したハイブリドーマは、例えば、フローサイトメトリー及び／または免疫組織化学検査及び／または免疫測定法（例えば、放射性免疫測定法、酵素免疫測定法、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫測定法など）により、抗体特異性及び／または力価についての機能的選択に供される。
あるいは、ＡＢＬ－ＭＹＣ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮｅｏＣｌｏｎｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ ５３７１３，ＵＳＡ）を使用して、ｍＡｂを分泌する細胞株（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９６に記載されているもの）を産生する。
ライブラリーベースの方法
本開示は、抗体またはその抗原結合断片（例えば、その可変領域を含む）のライブラリーのスクリーニングもまた包含する。
本開示で想倒されるライブラリーの例としては、ナイーブライブラリ－（抗原未投与の対象から）、免疫化ライブラリー（抗原で免疫化した対象から）、または合成ライブラリーが挙げられる。抗体またはその領域（例えば可変領域）をコードする核酸は、従来技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，２００１に開示されているもの）によってクローニングされ、当該技術分野において公知の方法を使用して、タンパク質をコードしてディスプレイするために使用される。タンパク質のライブラリーを作製する他の技術は、例えばＵＳ６３０００６４（例えば、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧのＨｕＣＡＬライブラリー）；ＵＳ５８８５７９３；ＵＳ６２０４０２３；ＵＳ６２９１１５８ｌまたはＵＳ６２４８５１６に開示されている。
本開示に従った抗原結合断片は可溶性分泌タンパク質であり得る、または細胞上の表面上の融合タンパク質、もしくは粒子（例えばファージもしくは他のウイルス、リボソームもしくはスポア）として提示される。様々なディスプレイライブラリーフォーマットが、当技術分野において知られている。例えば、ライブラリーはインビトロディスプレイライブラリー（例えば、リボソームディスプレイライブラリー、共有結合ディスプレイライブラリー、またはｍＲＮＡディスプレイライブラリー、例えばＵＳ７２７０９６９に開示されているもの）である。さらに別の実施例では、ディスプレイライブラリーは、例えば、ＵＳ６３０００６４；ＵＳ５８８５７９３；ＵＳ６２０４０２３；ＵＳ６２９１１５８；またはＵＳ６２４８５１６に開示されているような、抗体の抗原結合断片を含むタンパク質がファージ上に発現する、ファージディスプレイライブラリーである。他のファージディスプレイ法は当技術分野において既知であり、本開示により想倒される。同様に、本開示による細胞ディスプレイ法、例えば、細菌ディスプレイライブラリー（例えば、ＵＳ５５１６６３７に記載されているもの）；酵母ディスプレイライブラリー（例えば、ＵＳ６４２３５３８に記載されているもの）、または哺乳類ディスプレイライブラリーも想倒される。
スクリーニングディスプレイライブラリーの方法は、当技術分野において既知である。一実施例では、本開示のディスプレイライブラリーは、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，１９９４．に記載されているアフィニティ精製を使用してスクリーニングされる。アフィニティ精製の方法には通常、ライブラリーによりディスプレイした抗原結合断片を含むタンパク質を、標的抗原に接触させ、続いて洗浄し、抗原に結合して残留しているこれらのドメインを溶出させることを伴う。
所望する場合、スクリーニングにより識別される任意の可変領域またはｓｃＦｖを速やかに、完全抗体内に修飾させる。可変領域またはｓｃＦｖを完全抗体に修飾させる、または再フォーマットさせる例示的な方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１
０；またはＪｏｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００４；またはＷＯ２０１２０４０７９３に記載されている。あるいは、またはさらに、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７、及び／またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に記載されている、標準的なクローニング法を使用する。
脱免疫化、キメラ、ヒト化、合成ヒト化、霊長類化、及びヒト抗体または抗原結合断片
本開示の抗体または抗原結合断片は、ヒト化されていてよい。
用語「ヒト化抗体」とは、ヒト様可変領域を含むタンパク質を意味するものとして理解されなければならず、これは、ヒト抗体のＦＲ上に移植した、またはその中に挿入された、非ヒト種（例えばマウスもしくはラット、または非ヒト霊長類）の抗体のＣＤＲを含む（この種の抗体は、「ＣＤＲ移植抗体」とも呼ばれる）。ヒト化抗体には、ヒトタンパク質の１つ以上の残基が１つ以上のアミノ酸置換によって修飾されている、及び／またはヒト抗体の１つ以上のＦＲ残基が対応する非ヒト残基によって置き換えられている、抗体も含まれる。ヒト化抗体はさらに、ヒト抗体、または非ヒト抗体のいずれでも発見されない残基を含んでよい。さらなる抗体の領域（例えばＦｃ領域）は通常、ヒトである。ヒト化は、当技術分野で知られている方法、例えば、ＵＳ５２２５５３９、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ７５６６７７１、またはＵＳ５５８５０８９を用いて実施することができる。「ヒト化抗体」という用語は、例えば、ＵＳ７７３２５７８に記載のスーパーヒト化抗体も包含する。同様の意味は、用語「ヒト化抗原結合断片」に適用されるであろう。
本開示の抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体またはその抗原結合断片であることができる。本明細書で使用する場合、用語「ヒト抗体」とは、ヒトで、例えば、ヒト生殖細胞系もしくは体細胞において、または、このような領域を用いて産生されるライブラリーから見出される可変抗体領域、及び任意選択的に、定常抗体領域を有する抗体を意味する。「ヒト」抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、ランダムまたは部位特異的変異によりインビトロで導入される変異（詳細には、タンパク質の少数の残基、例えば、タンパク質の１、２、３、４、または５個の残基の保存的置換または変異を伴う変異）を含むことができる。このような「ヒト抗体」は、必ずしもヒト免疫応答の結果として生成される必要はなく、そうではなく、組換え手段（例えば、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング）を用いて、及び／またはヒト抗体定常及び／または可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）により、及び／または（例えば、ＵＳ５５６５３３２に記載のように）誘導性選択を用いて、生成することができる。本用語は、このような抗体の親和性成熟形態も包含する。本開示の目的のために、ヒト抗体はまた、ヒト抗体のＦＲ、またはヒトＦＲのコンセンサス配列からの配列を含み、その中の１つ以上のＣＤＲが、例えばＵＳ６３０００６４及び／またはＵＳ６２４８５１６に記載されているように、ランダムもしくはセミランダムであるＦＲを含むタンパク質を含むと考えられる。同様の意味は、用語「ヒト抗原結合断片」に適用されるであろう。
本開示の抗体またはその抗原結合断片は、合成ヒト化抗体またはその抗原結合断片であることができる。用語「合成ヒト化抗体」とは、ＷＯ２００７０１９６２０に記載されている方法により調製される抗体を意味する。合成ヒト化抗体は、可変領域が新世界霊長類抗体可変領域からのＦＲと非新世界霊長類抗体可変領域からのＣＤＲとを含む、抗体の可変領域を含む。
本開示の抗体またはその抗原結合断片は霊長類化されていてよい。「霊長類化抗体」は、非ヒト霊長類（例えば、マカク属カニクイザル）の免疫化の後に生成された抗体からの可変領域（複数可）を含む。任意選択的に、非ヒト霊長類抗体の可変領域は、ヒト定常領域と連結して霊長類化抗体を産生する。霊長類化抗体を産生するための例示的な方法は、
ＵＳ６１１３８９８に記載されている。
一実施例では、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体または断片である。用語「キメラ抗体」または「キメラ抗原結合断片」とは、可変ドメインのうちの１つ以上が、特定の種（例えば、ネズミ科動物、例えばマウスもしくはラット）に由来する、または、特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属するが、抗体または断片の残りが、別の種（例えば、ヒトもしくは非ヒト霊長類など）に由来するか、または、別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、抗体または断片を意味する。一実施例では、キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えば、ネズミ抗体）に由来するＶＨ及び／またはＶＬを含み、抗体の残りの領域はヒト抗体に由来する。このようなキメラ抗体及びその抗原結合断片の産生は、当該技術分野において公知であり、標準的な手段（例えばＵＳ６３３１４１５；ＵＳ５８０７７１５；ＵＳ４８１６５６７、及びＵＳ４８１６３９７に記載されている）により達成され得る。
本開示はまた、例えば、ＷＯ２００００３４３１７及びＷＯ２００４１０８１５８に記載されている、脱免疫化抗体またはその抗原結合断片もまた想到する。脱免疫化抗体及び断片は、１つ以上のエピトープ、例えば、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを除去する（すなわち、変異させる）ことにより、対象が抗体またはタンパク質に対する免疫応答を引き起こす可能性を低減する。例えば、本開示の抗体を分析して、１つ以上のＢまたはＴ細胞エピトープを識別し、当該エピトープ内の１つ以上のアミノ酸残基を変異させることで、抗体の免疫原性を低下させる。
抗体結合ドメイン含有タンパク質
単一ドメイン抗体
いくつかの実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、単一ドメイン抗体（用語「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」と同じ意味で用いられる）であるか、またはこれを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは部分を含む、単一のポリペプチド鎖である。
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
いくつかの実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、ＷＯ９８／０４４００１及び／またはＷＯ９４／００７９２１に記載されているものなどの、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはより高オーダーのタンパク質複合体であるか、またはこれを含む。
例えば、ダイアボディとは、各ポリペプチド鎖が構造ＶＬ－Ｘ－ＶＨまたはＶＨ－Ｘ－ＶＬを含む、２つの会合するポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、式中、Ｘは、単一ポリペプチド鎖中のＶＨ及びＶＬが会合する（もしくは、Ｆｖを形成する）には不十分な残基を含むリンカーであるか、または存在せず、式中、一方のポリペプチド鎖のＶＨは、他のポリペプチド鎖のＶＬに結合して、抗原結合部位を形成する、即ち、１つ以上の抗原に特異的に結合可能なＦｖ分子を形成する。ＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖で同じであることができるか、または、ＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖で異なり、二重特異性ダイアボディ（即ち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含むダイアボディ）を形成することができる。
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片
本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、ｓｃＦｖであることができる。当業者は、ｓｃＦｖは、単一ポリペプチド鎖中のＶＨ及びＶＬ領域、ならびに、ｓｃＦｖが、抗原結合のために所望の構造を形成可能にする（即ち、互いに会合してＦｖを形成するための、単一ポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬに対する）、ＶＨとＶＬとの間にあるポリペプチドリン
カーを含むことに気づくであろう。例えば、リンカーは、過剰な１２個のアミノ酸残基を含み、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が、ｓｃＦｖに対するより好ましいリンカーの１つである。
本開示はまた、単一のシステイン残基が、ＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲに導入され、システイン残基がジスルフィド結合により結合され、安定したＦｖが得られる、ジスルフィド安定化Ｆｖ（または、ｄｉＦｖもしくはｄｓＦｖ）もまた想到する。
あるいは、またはさらに、本開示は、二量体ｓｃＦ、即ち、非共有または共有結合により、例えば、例えば、ロイシンジッパードメイン（例えば、ＦｏｓまたはＪｕｎ）により結合した、２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を包含する。あるいは、２つのｓｃＦｖは、両方のｓｃＦｖが形成され、例えば、ＵＳ２００６０２６３３６７に記載されているような抗原に結合可能となるのに十分な長さのペプチドリンカーにより結合される。
半抗体
いくつかの実施例では、本開示の抗原結合断片は、半抗体または半分子である。当業者は、半抗体とは、単一の重鎖と単一の軽鎖を含むタンパク質を意味することに気付くであろう。用語「半抗体」とは、抗体軽鎖及び抗体重鎖を含むタンパク質もまた包含し、抗体重鎖は、別の抗体重鎖との会合を防ぐように変異されている。一実施例では、抗体が解離して、それぞれ単独の重鎖及び単独の軽鎖を含有する２つの分子を形成するときに半抗体が形成される。
半抗体の生成方法は、当技術分野において既知であり、例示的な方法を本明細書に記載する。
一実施例では、発現のために、対象となるＩｇＧを構成する単一の重鎖及び単一の軽鎖の細胞遺伝子に導入することにより、半抗体を分泌させることができる。一実施例では、定常領域（例えば、ＩｇＧ４定常領域）は、ヘテロ二量体の形成を防止するために、「鍵または鍵穴」（または、「ノブまたはホール」）変異を含む。一実施例では、定常領域（例えば、ＩｇＧ４定常領域）は、Ｔ３６６Ｗ変異（またはノブ）を含む。別の実施例では、定常領域（例えば、ＩｇＧ４定常領域）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異（またはホール）を含む。別の実施例では、定常領域は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ変異（ノブ）を含む。別の実施例では、定常領域は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異（ホール）を含む。例示的な定常領域のアミノ酸置換は、ＥＵ付番システムに従って番号付けされる。
他の抗体、及び、その抗原結合ドメインを含むタンパク質
本開示はまた、
（ｉ）例えば、ＵＳ５８３７８２１に記載されているミニボディ；
（ｉｉ）例えば、ＵＳ４６７６９８０に記載されているヘテロコンジュゲートタンパク質；
（ｉｉｉ）例えば、ＵＳ４６７６９８０に記載されている化学的架橋剤を使用して産生したヘテロコンジュゲートタンパク質；及び
（ｉｖ）Ｆａｂ３（例えば、ＥＰ１９９３０３０２８９４に記載されているもの）
などの他の抗体、及び、その抗原結合ドメインを含むタンパク質もまた想到する。
免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片
本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質の一例は、免疫グロブリンの可変領域を含むタンパク質であり、例えば、Ｔ細胞受容体または重鎖免疫グロブリン（例えば、ＩｇＮＡＲ、ラクダ科動物抗体）である。
重鎖免疫グロブリン
重鎖免疫グロブリンは、それらが重鎖を含むが軽鎖を含まないという点で、免疫グロブリンの他の多くの形態（例えば、抗体）とは構造的に異なる。したがって、これらの免疫グロブリンは、「重鎖のみの抗体」ともまた呼ばれる。重鎖免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科及び軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）で見出される。
自然に存在する重鎖免疫グロブリンに存在する可変領域は一般に、従来の四本鎖抗体に存在する重鎖可変領域（「ＶＨドメイン」とも呼ばれる）と、及び、従来の四本鎖抗体に存在する軽鎖可変領域（「ＶＬドメイン」とも呼ばれる）と、区別するために、ラクダ科Ｉｇでは「ＶＨＨドメイン」、及び、ＩｇＮＡＲではＶ－ＮＡＲと呼ばれる。
重鎖免疫グロブリンは、関連する抗原に、高親和性及び高特異性で結合するために、軽鎖の存在を必要としない。このことは、単一ドメイン結合断片が、発現が容易であり、一般に安定しており、可溶性である重鎖免疫グロブリンに由来することができることを意味する。
ラクダ科由来の重鎖免疫グロブリン、及びその可変領域、ならびに、その産生方法及び／または単離方法及び／または使用方法についての一般的な説明は、とりわけ、以下の参考文献：ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９７／４９８０５、及びＷＯ９７／４９８０５に見出される。
軟骨魚類由来の重鎖免疫グロブリン、及びその可変領域、ならびに、その産生方法及び／または単離方法及び／または使用方法についての一般的な説明はとりわけ、ＷＯ２００５１１８６２９に見いだされる。
Ｖ様タンパク質
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質はＴ細胞受容体を含む。Ｔ細胞受容体は２つのＶドメインを有し、これらは化合して、抗体のＦｖモジュールに類似した構造となる。Ｎｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１は、Ｔ細胞受容体の２つのＶドメイン（アルファ及びベータと呼ばれる）がどのように融合し、一本鎖ポリペプチドとして発現することができるか、またさらに、表面残基をどのように改変して、抗体ｓｃＦｖに類似の疎水性を直接低下させるかについて記載している。一本鎖Ｔ細胞受容体、または、２つのＶアルファ及びＶベータドメインを含む多量体Ｔ細胞受容体の産生について記載している他の公報としては、ＷＯ１９９９０４５１１０またはＷＯ２０１１１０７５９５が挙げられる。
抗原結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質としては、一般的に単量体である、Ｖ様ドメインを有するタンパク質が挙げられる。このようなＶ様ドメインを含むタンパク質の例としては、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８、及びＩＣＯＳが挙げられる。このようなＶ様ドメインを含むタンパク質のさらなる開示は、ＷＯ１９９９０４５１１０に含まれる。
アドネクチン
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質はアドネクチンを含む。アドネクチンは、ループ領域が抗原結合を付与するように改変されているヒトフィブロネクチンの第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインに基づいている。例えば、１０Ｆｎ３ドメインのβサンドイッチの一端における３つのループを改変して、アドネクチンに抗原を特異的に認識させることができるようになる。さらなる詳細に関しては、ＵＳ２００８０１３９７９１またはＷＯ２００５０５６７６４を参照されたい。
アンチカリン
さらなる実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質はアンチカリンを含む。アンチカリンは、疎水性小分子（例えば、ステロイド、ビリン、レチノイド、及び脂質）を輸送する細胞外タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、円錐構造の開口端に複数のループを有する、堅いβシート二次構造を有し、これを改変して抗原に結合させることができる。このような改変リポカリンはアンチカリンとして知られている。アンチカリンのさらなる説明に関しては、ＵＳ７２５０２９７またはＵＳ２００７０２２４６３３を参照されたい。
アフィボディ
さらなる実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質はアフィボディを含む。アフィボディは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのＺドメイン（抗原結合ドメイン）に由来するスキャフォールドであり、このＺドメインは抗原に結合するように操作することができる。Ｚドメインは、約５８アミノ酸の３つのヘリックスバンドルの束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって作られている。さらなる詳細に関しては、ＥＰ１６４１８１８を参照されたい。
アビマー
さらなる実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質はアビマーを含む。アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。約３５個のアミノ酸のネイティブドメインは、規定したジスルフィド結合構造に適合する。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される自然のバリエーションをシャッフルすることによって生み出される。さらなる詳細に関しては、ＷＯ２００２０８８１７１を参照されたい。
ＤＡＲＰｉｎ
さらなる実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を含む。ＤＡＲＰｉｎは、複合膜タンパク質が細胞骨格に付着するのを媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリン反復は、２つのα－ヘリックス及びβ－ターンからなる３３残基のモチーフである。これらを改変して、各反復の最初のα－ヘリックス及びβ－ターンにおける残基をランダム化することにより、異なる標的抗原を結合することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。さらなる詳細に関しては、ＵＳ２００４０１３２０２８を参照されたい。
結合タンパク質への変異
本開示は、本明細書で開示する配列に少なくとも９０％の同一性を有するＣＸＣＬ１０結合タンパク質、または、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質をコードする核酸もまた提供する。一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質または核酸は、本明細書で開示する配列に少なくとも約９０％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を含み、タンパク質は、任意の実施例に従い、本明細書に記載するＣＸＣＬ１０に特異的に結合する。
あるいは、またはさらに、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、任意の実施例に従い、本明細書に記載するＶＨまたはＶＬのＣＤＲ（複数可）に少なくとも約９０％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一であるＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ）を含み、タンパク質は、任意の実施例に従い、本明細書に記載するＣＸＣＬ１０に特異的に結合可能である。タンパク質の、ＣＸＣＬ１０への結合を測定する方法を、本明細書に記載する。
重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端残渣を、保存的、または非保存的アミノ酸置換（残基の３
１％）に変異させることができることが、当該技術分野において既知である（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。したがって、タンパク質は、本明細書で開示する重鎖ＣＤＲ２配列に、少なくとも約３５％の同一性を有するＣＤＲ２を含むことができる。
本開示は、本明細書で説明する配列と比較して、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質の変異型もまた想倒する。いくつかの実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、１０個以下、例えば、９、または８、または７、または６、または５、または４、または３、または２、または１個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖及び／または疎水性親水性及び／または親水性を有するアミノ酸残基で置き換えられた置換である。例示的な保存的アミノ酸置換を表１に示す。
Figure 2023508023000001
類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。疎水性親水性指標は、例えばＫｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）に記載されており、親水性指標は、例えばＵＳ４５５４１０１に記載されている。
本開示は、非保存的アミノ酸変化も想倒している。例えば、特に関心対象となるのは、荷電アミノ酸を別の荷電アミノ酸及び中性または正に荷電したアミノ酸で置換することである。いくつかの実施例では、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、１０個以下、例えば、９、または８、または７、または６、または５、または４、または３、または２、または１個の非保存的アミノ酸置換を含む。
一実施例では、変異（複数可）は、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質の抗原結合ドメインのＦＲ内で生じる。別の実施例では、変異（複数可）は、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質のＣＤＲ内で生じる。
ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の変異形態の代表的な作製方法としては、以下が挙げられる：
・ＤＮＡ（Ｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）またはＲＮＡ（Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ
ａｌ．，２００６；Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２００７；及びＷＯ１９９９／０５８６６１）の変異導入；
・ポリペプチドをコードする核酸をミューテーター細胞、例えばＸＬ－１Ｒｅｄ、ＸＬ－ｍｕｔＳ、及びＸＬ－ｍｕｔＳ－Ｋａｎｒ細菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に導入すること；
・例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４に開示されているＤＮＡシャッフリング；及び
・例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５に記載されている、部分特異的変異導入。
本開示の変異体ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の生物活性を測定する例示的な方法は当業者に明らかとなり、例えば、抗原結合、結合の競争的阻害、親和性、会合、及び解離が挙げられる。
別の実施例では、本開示の核酸は、本明細書で説明する配列に少なくとも約９０％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一であり、任意の実施例に従い、本明細書に記載する機能を有するＣＸＣＬ１０結合タンパク質をコードする配列を含む。本開示は、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質をコードする核酸もまた含み、これは、遺伝暗号の縮退の結果、本明細書で例示される配列とは異なる。
核酸またはポリペプチドの％同一性は、ギャップ開始ペナルティ＝５、ギャップ伸張ペナルティ＝０．３としたＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）により求められる。クエリー配列は少なくとも５０個の残基長であり、ＧＡＰ分析が２つの配列を、少なくとも５０個の残基の領域にわたってアラインメントする。例えば、クエリー配列は少なくとも１００残基長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。例えば、２つの配列はその長さ全体にわたってアラインメントされる。
定常領域
本開示は、抗体の定常領域を含む、本明細書に記載するＣＸＣＬ１０結合タンパク質及び／または抗体を包含する。これには、Ｆｃに融合した抗体の抗原結合断片を含む。
本開示のタンパク質を産生するのに有用な定常領域の配列は、多数の異なる源から入手することができる。いくつかの実施例では、タンパク質の定常領域またはその部分は、ヒト抗体に由来する。定常領域またはその部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含めた任意の抗体クラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含めた任意の抗体アイソタイプに由来し得る。一実施例では、定常領域はヒトアイソ
タイプＩｇＧ４、または安定化ＩｇＧ４定常領域である。一実施形態では、定常領域はＩｇＧκ定常領域である。
一実施例では、定常領域のＦｃ領域は、例えば、ネイティブまたは野生型ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３ Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能を誘発する能力が低下している。本開示との関係において、「エフェクター機能」とは、細胞の殺傷をもたらす抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域もしくはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に結合する細胞またはタンパク質により媒介される、これらの生物活性を意味する。抗体により誘発されるエフェクター機能の例としては、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；及びＢ細胞活性化が挙げられる。一実施例では、エフェクター機能はＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰ及び／またはＣＤＣである。タンパク質を含有するＦｃ領域のエフェクター機能のレベルの評価方法は、当技術分野において既知である、及び／または、本明細書に記載されている。
一実施例では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域（即ち、ＩｇＧ４定常領域に由来する）、例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。好適なＩｇＧ４ Ｆｃ領域の配列は、当業者に明らかとなるであろう、及び／または一般に入手可能なデータベースから入手可能である（例えば、国立生物工学情報センターから入手可能である）。
一実施例では、定常領域は安定化ＩｇＧ４定常領域である。「安定化ＩｇＧ４定常領域」という用語は、Ｆａｂアーム交換、またはＦａｂアーム交換もしくは半抗体の形成を経る傾向、または半抗体を形成する傾向を低減するように修飾されたＩｇＧ４定常領域を意味するものと理解されるであろう。「Ｆａｂアーム交換」とは、ＩｇＧ４重鎖、及び結合した軽鎖（半分子）が、別のＩｇＧ４分子から重軽鎖ペアに対して交換される、ヒトＩｇＧ４に対するタンパク質修飾の一種を意味する。したがって、ＩｇＧ４分子は、（二重特異的分子をもたらす）２つの異なる抗原を認識する２つの異なるＦａｂアームを獲得し得る。Ｆａｂアーム交換はインビボで自然に生じ、かつ、インビトロで、精製した血液、または、還元されたグルタチオンなどの還元剤により誘発することが可能である。「半抗体」は、ＩｇＧ４抗体が解離するときに形成して、それぞれ単一の重鎖及び単一の軽鎖を含有する２つの分子を形成する。
一実施例では、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔのシステム）（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７及び／または１９９１）に従うとヒンジ領域の位置２４１において、プロリンを含む。この位置は、ＥＵ付番（システムＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，２００１及びＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９）に従うと、ヒンジ領域の位置２２８に対応する。ヒトＩｇＧ４では、この残基は一般にセリンである。プロリンをセリンで置き換えた後、ＩｇＧ４ヒンジ領域は配列ＣＰＰＣを含む。これに関して、当業者は、「ヒンジ領域」とは、抗体の２つのＦａｂアームに移動性を付与するＦｃ及びＦａｂ領域と結合する、抗体重鎖定常領域のプロリンリッチな部分であることに気づくであろう。ヒンジ領域は、重鎖間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。Ｋａｂａｔの付番システムに従うと、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６からＰｒｏ２４３まで伸びるものと、一般に定義される。同一位置に、重鎖間ジスルフィドＳ－Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を配置することにより、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域を、ＩｇＧ１配列とアラインメントすることができる（例えば、ＷＯ２０１０／０８０５３８を参照されたい）。
安定化ＩｇＧ４抗体のさらなる例は、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の位置４に（ＥＵ付番システムに従う）におけるアルギニンが、リジン、トレオニン、メチオニン、またはロイシンで置換されている抗体（例えば、ＷＯ２００６／０３３３８６に開示されているもの）である。定常領域のＦｃ領域は、加えて、または代替的に、４０５（ＥＵ付番システ
ムに従う）に対応する位置において、アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン、及びロイシンからなる群から選択される残基を含む。任意選択的に、ヒンジ領域は、（上述のとおり）位置２４１にプロリン（即ち、ＣＰＰＣ配列）を含む。
別の実施例では、Ｆｃ領域は、エフェクター機能が低下するように修飾された領域、即ち、「非免疫活性化Ｆｃ領域」である。例えば、Ｆｃ領域は、２６８、３０９、３３０、及び３３１からなる群から選択される１つ以上の位置において置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。別の実施例では、Ｆｃ領域は、以下の変化：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、及び、Ｇ２３６の欠失のうちの１つ以上、及び／または、以下の変化：Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓのうちの１つ以上を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である（Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。非免疫活性化Ｆｃ領域のさらなる例は、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，２００６；及び／またはＨｅｚａｒｅｈ，２００１に記載されている。
別の実施例では、Ｆｃ領域は、例えば、ＩｇＧ４抗体由来の少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、及び、ＩｇＧ１抗体由来の少なくとも１つのＣＨ３ドメインを含む、キメラＦｃ領域であり、Ｆｃ領域は、（例えば、ＷＯ２０１０／０８５６８２に記載されているような）２４０、２６２、２６４、２６６、２９７、２９９、３０７、３０９、３２３、３９９、４０９、及び４２７（ＥＵ付番）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸の位置において、置換を含む。例示的な置換としては、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、及び４２７Ｆが挙げられる。
タンパク質産生
任意の実施例に従った、本明細書に記載するＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、例えば、本明細書に記載する、及び／または、当該技術分野において公知である、タンパク質を産生するのに十分な条件下にて、本発明の細胞を培養することにより産生される。
組換え発現
別の実施例では、任意の実施例に従った、本明細書に記載するＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、組換えである。
組換えタンパク質の場合、組換えタンパク質をコードする核酸を、発現構築物またはベクターにクローニングすることが可能であり、これを続いて、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞）、または、哺乳類細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞）、または、別の方法ではタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクションする。タンパク質を発現させるために使用する例示的な細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、またはＨＥＫ細胞である。これらの目的を達成するための、分子クローニング技術は、当技術分野において既知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８（現在までのあらゆるアップデートを含む）、または、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。幅広い種類のクローニング及びインビトロ増幅の方法が組換え核酸の構築に好適である。組換え抗体の産生方法もまた、当該技術分野において既知であり、例えば、ＵＳ４８１６５６７またはＵＳ５５３０１０１を参照されたい。
単離後、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）、または、細胞非含有系もしくは細胞内での発現のために、核酸が挿入され、発現構築物または発現ベクター内のプロモーターに作動可能に結合する。
本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、最も広い文脈で解釈するも
のとし、ゲノム遺伝子の転写制御配列（的確な転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックスまたは開始エレメントを含む）を含み、例えば、発生及び／または外部刺激に応答してあるいは組織特異的方式で核酸の発現を改変する、追加の制御エレメント（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、及びサイレンサー）を伴う場合も伴わない場合もある。また、本発明の文脈において「プロモーター」という用語は、作動可能に連結した核酸の発現を付与、活性化、または強化する組換え、合成、もしくは融合の核酸、または誘導体を説明するためにも使用される。例示的なプロモーターは、当該核酸の発現をさらに強化するため及び／または空間的発現及び／または時間的発現を改変するための、１つ以上の特定の制御エレメントのさらなるコピーを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「～に作動可能に連結した」という用語は、核酸の発現がプロモーターによってコントロールされるように、核酸に対するプロモーターの位置を定めることを意味する。
細胞内での発現向けには多くのベクターが利用可能である。概して、ベクター構成要素としては、以下のうちの１つ以上が挙げられるが、これに限定されない：シグナル配列（例えば、本明細書で提供される情報に由来する）、タンパク質をコードする配列、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。当業者は、タンパク質の発現に好適な配列を認識しているであろう。例示的なシグナル配列としては、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、もしくは熱安定性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー、もしくは酸性ホスファターゼリーダー）、または哺乳類分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。
哺乳類細胞内で活性の例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ－ＩＥ）、ヒト伸長因子１－αプロモーター（ＥＦ１）、小核ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α－ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主後期プロモーター、βアクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／βアクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターまたはその活性断片を含むハイブリッド制御エレメントが挙げられる。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養下での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；またはチャイニーズハムスター（ＣＨＯ）である。
酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ からなる群より選択される酵母細胞）内での発現に適した典型的なプロモーターとしては、以下に限定されないが、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、またはＴＥＦ１プロモーターが挙げられる。
単離された核酸またはこのような核酸分子を含む発現構築物を細胞内に導入するための手段は、当業者に知られている。所与の細胞に使用する技法は、好結果を収めている既知の技法に依存する。組換えＤＮＡを細胞内に導入するための手段としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介の形質移入、例えば、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）及び／またはセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）の使用によるリポソーム媒介の形質移入、ＰＥＧ媒介のＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション、ならびに微粒子衝撃（例えば、中でも、ＤＮＡコーティングされたタングステンま
たは金の粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡ）の使用による微粒子衝撃）が挙げられる。
タンパク質の産生に使用される宿主細胞は、使用する細胞タイプに応じて様々な培地で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭｌ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、哺乳類細胞の培養に好適である。本明細書で論じられる他の細胞タイプを培養するための培地は、当技術分野で知られている。
タンパク質の単離
タンパク質の単離方法は、当技術分野において既知である、及び／または、本明細書に記載されている。
ＣＸＣＬ１０結合タンパク質を培地中に分泌させる場合、最初に、このような発現系からの上清を市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害物質が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性夾雑物の成長を防止するために抗生物質が含まれてもよい。あるいは、またはさらに、例えば、連続濾過を使用して、上清を、タンパク質を発現する細胞から濾過、及び／または単離することができる。
細胞から調製されるＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーもしくはプロテインＧクロマトグラフィー）、または前述のものの任意の組合せを用いて精製することができる。これらの方法は、当技術分野において既知であり、例えば、ＷＯ９９／５７１３４、または、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８に記載されている。
また、当業者は、タンパク質が、精製または検出を推進するためのタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、またはインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、またはサルウイルス５型（Ｖ５）タグ、またはＦＬＡＧタグ、またはグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むように修飾され得ることも気づくであろう。得られたタンパク質は、次に当技術分野で知られている方法、例えば、親和性精製を用いて精製される。例えば、ヘキサ－ｈｉｓタグを含むタンパク質は、当該タンパク質を含むサンプルを、固体または半固体支持体上に固定したヘキサ－ｈｉｓタグと特異的に結合するニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）に接触させ、サンプルを洗浄して非結合タンパク質を除去し、次に結合タンパク質を溶離することにより、精製される。代替的または追加的に、タグに結合するリガンドまたは抗体は、親和性精製法で使用される。
コンジュゲート
一実施例では、本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質を検出可能な標識にコンジュゲートする。
本明細書で使用する場合、用語「コンジュゲート」、または「コンジュゲートされる」とは、間接及び直接結合の両方を包含するものと理解されなければならない。例えば、直接コンジュゲーションは、化学的コンジュゲーションを含み、これは、非共有または共有または遺伝コンジュゲーション（「融合」とも呼ばれる）であることができる。一実施例では、コンジュゲーションは共有、例えば、ジスルフィド結合である。
本明細書で使用する場合、「検出可能な標識」とは、視覚的に、または、好適な検出器を使用することで検出可能である、光学または他のシグナルまたは生成物を生成する、または、誘発によりこれを生成可能な、分子または原子タグまたはマーカーである。検出可能な標識は、当該技術分野において周知であり、例えば、放射能標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、補欠分子族、造影剤、及び超音波剤が挙げられる。
一般に使用される蛍光標識としては、Ａｌｅｘａ、シアニン（Ｃｙ５及びＣｙ５．５など）、ならびにインドシアニン、ならびにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示を実践するにあたり有用な蛍光標識としては、１，５－ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８－ＡＮＳ；４－メチルウンベリフェロン；５－カルボキシ－２，７－ジクロロフルオレセイン；５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）；５－カルボキシナフトフルオレセイン（ｐＨ１０）；５－カルボキシテトラメチルローダミン（５－ＴＡＭＲＡ）；５－ＦＡＭ（５－カルボキシフルオレセイン）；５－ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）；５－ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）；５－ＲＯＸ（カルボキシ－Ｘ－ローダミン）；５－ＴＡＭＲＡ（５－カルボキシテトラメチルローダミン）；６－カルボキシローダミン６Ｃ；６－ＣＲ ６Ｇ；６－ＪＯＥ；７－アミノ－４－メチルクマリン；７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）；７－ヒドロキシ－４－メチルクマリン；９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン；ＡＢＱ；酸性フクシン；ＡＣＭＡ（９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン）；アクリジンオレンジ＋ＤＮＡ；アクリジンオレンジ＋ＲＮＡ；アクリジンオレンジ（ＤＮＡとＲＮＡの両方）；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳＡ；エクオリン（発光タンパク質）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０；アリザリンコンプレクソン；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ、ＡＭＣＡ－Ｓ；ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）；ＡＭＣＡ－Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；アニリンブルー；アントロシルステアレート；ＡＰＣ（アロフィコシアニン）；ＡＰＣ－Ｃｙ７；ＡＰＴＲＡ－ＢＴＣ＝Ｒａｔｉｏ Ｄｙｅ、Ｚｎ２＋；ＡＰＴＳ；Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ４Ｇ；Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｏｒａｎｇｅ Ｒ；Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｒｅｄ ６Ｂ；Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ ７ ＧＬＬ；アタブリン；ＡＴＴＯ－ＴＡＧ ＣＢＱＣＡ；ＡＴＴＯ－ＴＡＧ ＦＱ；オーラミン；オーロホスフィンＧ；オーロホスフィン；ＢＡＯ ９（ビスアミノフェニルオキサゾール）；ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）；ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）；ベルベリンサルフェート；βラクタマーゼ；ＢＦＰ青色移動ＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）；青色蛍光タンパク質；ＢＦＰ／ＧＦＰ ＦＲＥＴビマン；ビスベンズアミド；ビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ）；ビス－ＢＴＣ＝Ｒａｔｉｏ Ｄｙｅ、Ｚｎ２＋；Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＦＦＧ；Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＳＶ；ＢＯＢＯ－１；ＢＯＢＯ－３；Ｂｏｄｉｐｙ ４９２／５１５；Ｂｏｄｉｐｙ ４９３／５０３；Ｂｏｄｉｐｙ ５００／５１０；Ｂｏｄｉｐｙ ５０５／５１５；Ｂｏｄｉｐｙ ５３０／５５０；Ｂｏｄｉｐｙ ５４２／５６３；Ｂｏｄｉｐｙ ５５８／５６８；Ｂｏｄｉｐｙ ５６４／５７０；Ｂｏｄｉｐｙ ５７６／５８９；Ｂｏｄｉｐｙ ５８１／５９１；Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０－Ｘ；Ｂｏｄｉｐｙ ６５０／６６５－Ｘ；Ｂｏｄｉｐｙ ６６５／６７６；Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ；Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ ＡＴＰ；Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ－Ｃｅｒアミド；Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ ＳＥ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘコンジュゲート；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘ、ＳＥ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ ＡＴＰ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ－Ｘ ＳＥ；ＢＯ－ＰＲＯ－１；ＢＯ－ＰＲＯ－３；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｕｌｐｈｏｆｌａｖｉｎ ＦＦ；ＢＴＣ－Ｒａｔｉｏ Ｄｙｅ Ｃａ２＋；ＢＴＣ－５Ｎ－ａｔｉｏ Ｄｙｅ、Ｚｎ２＋；カルセイン；カルセイ
ンブルー；カルシウムクリムゾン；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン１ Ｃａ２＋ Ｄｙｅ；カルシウムグリーン－２ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン－５Ｎ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン－Ｃ１８ Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；カルコフルオールホワイト；カルボキシ－Ｘ－ローダミン（５－ＲＯＸ）；カスケードブルー；カスケードイエロー３９９；カテコールアミン；ＣＣＦ２（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）；ＣＦＤＡ；ＣＦＰ－－シアン蛍光タンパク質；ＣＦＰ／ＹＦＰ；ＦＲＥＴ；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＬ－ＮＥＲＦ（Ｒａｔｉｏ Ｄｙｅ，ｐＨ）；ＣＭＦＤＡ；セレンテラジン；セレンテラジンｃｐ（Ｃａ２＋ Ｄｙｅ）；セレンテラジンｆ；セレンテラジンｆｃｐ；セレンテラジンｈ；セレンテラジンｈｃｐ；セレンテラジンｉｐ；セレンテラジンｎ；セレンテラジンＯ；クマリンファロイジン；Ｃ－サイコシアニン；ＣＰＭ Ｉメチルクマリン；ＣＴＣ；ＣＴＣホルマザン；Ｃｙ２；Ｃｙ３．１ ８；Ｃｙ３．５；Ｃｙ３；Ｃｙ５．１ ８；Ｃｙ５．５；Ｃｙ５；Ｃｙ７；Ｃｙａｎ ＧＦＰ；環状ＡＭＰフルオロセンサー（ＦｉＣＲｈＲ）；ＣｙＱｕａｎｔ細胞増殖アッセイ；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；ダンシルクロリド；ダンシルＤＨＰＥ；ダンシルフルオライド；ＤＡＰＩ；ダポキシル；ダポキシル２；ダポキシル３；ＤＣＦＤＡ；ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）；Ｄｉ－４－ＡＮＥＰＰＳ；Ｄｉ－８－ＡＮＥＰＰＳ（ノンレイシオ）；ＤｉＡ（４－Ｄｉ－１６－ＡＳＰ）；ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ）；ＤｉＤ－親油性トレーサー；ＤｉＤ（ＤｉＩＣ１８（５））；ＤＩＤＳ；ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）；ＤｉＩ（ＤｉＩＣ１８（３））；ジニトロフェノール；ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（ＤｉＩＣ１８（７））；ＤＭ－ＮＥＲＦ（高ｐＨ）；ＤＮＰ；Ｄｏｐａｍｉｎｅ；ＤｓＲｅｄ；赤色蛍光タンパク質；ＤＴＡＦ；ＤＹ－６３０－ＮＨＳ；ＤＹ－６３５－ＮＨＳ；ＥＢＦＰ；ＥＣＦＰ；ＥＧＦＰ；ＥＬＦ９７；エオシン；エリスロシン；エリスロシンＩＴＣ；臭化エチジウム；エチジウムホモ二量体－１（ＥｔｈＤ－１）；Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ；ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ；ユーロピウム（ＩＩＩ）クロリド；ＥＹＦＰ；Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ；ＦＤＡ；フォイルゲン（Ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ）；ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘発性蛍光）；ＦＩＴＣ；ＦＩＴＣ抗体；フラゾオレンジ；Ｆｌｕｏ－３；Ｆｌｕｏ－４；フルオレセイン（ＦＩＴＣ）；フルオレセインジアセテート；Ｆｌｕｏｒｏ－Ｅｍｅｒａｌｄ；Ｆｌｕｏｒｏ－Ｇｏｌｄ（ヒドロキシスチルバミジン）；Ｆｌｕｏｒ－Ｒｕｂｙ；ＦｌｕｏｒＸ；ＦＭ
１－４３；ＦＭ ４－４６；Ｆｕｒａ Ｒｅｄ（高ｐＨ）；Ｆｕｒａ Ｒｅｄ／Ｆｌｕｏ－３；Ｆｕｒａ－２、高カルシウム；Ｆｕｒａ－２、低カルシウム；Ｆｕｒａ－２／ＢＣＥＣＦ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ Ｂ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １０ＧＦ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｐｉｎｋ ３Ｇ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｙｅｌｌｏｗ ５ＧＦ；ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ（ＣＣＦ２）；ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）；赤色移動ＧＦＰ（ｒｓＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰｕｖ；Ｇｌｏｘａｌｉｃ Ａｃｉｄ；Ｇｒａｎｕｌａｒ Ｂｌｕｅ；ヘマトポルフィリン；Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８；Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２；Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０；ＨＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ）；ヒドロキシトリプタミン；Ｉｎｄｏ－１、高カルシウム；Ｉｎｄｏ－１、低カルシウム；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ Ｃｆ；ＪＣ－１；ＪＯ－ＪＯ－１；ＪＯ－ＰＲＯ－１；ＬａｓｅｒＰｒｏ；Ｌａｕｒｏｄａｎ；ＬＤＳ ７５１（ＤＮＡ）；ＬＤＳ ７５１（ＲＮＡ）；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＰＡＦ；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＳＦ；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＷＳ；リサミンローダミン；リサミンローダミンＢ；ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｋｉｔ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、Ｃａｌｃｅｉｎ／Ｅｔｈｉｄｉｕｍホモ二量体；ＬＯＬＯ－１；ＬＯ－ＰＲＯ－１；ルシファーイエロー；Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ；Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ；Ｌｙｓｏ
Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ；Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ；Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｇ
ｒｅｅｎ；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ；Ｍａｇ Ｇｒｅｅｎ；Ｍａｇｄａｌａ Ｒｅｄ（Ｐｈｌｏｘｉｎ Ｂ）；Ｍａｇ－Ｆｕｒａ Ｒｅｄ；Ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２；Ｍａｇ－Ｆｕｒａ－５；Ｍａｇ－Ｉｎｄｏ－１；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ；Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ；Ｍａｘｉｌｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ １０ ＧＦＦ；Ｍａｘｉｌｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ ８ ＧＦＦ；メロシアニン；メトキシクマリン；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ；ミトラマイシン、モノブロモビマン；モノブロモビマン（ｍＢＢｒ－ＧＳＨ）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンプロリンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンゾキサジドール；ノルアドレナリン；Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ；Ｎｕｃｌｅａｒ Ｙｅｌｌｏｗ；Ｎｙｌｏｓａｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｉａｖｉｎ Ｅ８Ｇ；オレゴングリーン；オレゴングリーン４８８－Ｘ；オレゴングリーン；オレゴングリーン４８８；オレゴングリーン５００；オレゴングリーン５１４；パシフィックブルー；パラロサニン（Ｆｅｕｌｇｅｎ）；ＰＢＦＩ；ＰＥ－Ｃｙ５；ＰＥ－Ｃｙ７；ＰｅｒＣＰ；ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５；ＰＥ－テキサスレッド［Ｒｅｄ ６１３］；フロキシンＢ（Ｍａｇｄａｌａ Ｒｅｄ）；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＡＲ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＢＫＬ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ Ｒｅｖ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＲＰＡ；ホスフィン３Ｒ；フォトレジスト；フィリコエリトリンＢ［ＰＥ］；フィリコエリトリンＲ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ；ポントクロームブルーブラック；ＰＯＰＯ－１；ＰＯＰＯ－３；ＰＯ－ＰＲＯ－１；ＰＯ－ＰＲＯ－３；プリムリン；プロシオンイエロー；ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；Ｐｙｒｏｚａｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ ７ＧＦ；ＱＳＹ ７；キナクリンマスタード；Ｒｅｄ ６１３［ＰＥ－テキサスレッド］；レゾルフィン；ＲＨ ４１４；Ｒｈｏｄ－２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５ ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ２００；ローダミンＢエクストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン；ローダミンファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ－サイコシアニン；Ｒ－フィリコエリトリン（ＰＥ）；ｒｓＧＦＰ；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；サファイアＧＦＰ；ＳＢＦＩ；セロトニン；Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ２Ｂ；Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ４Ｇ；Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ Ｂ；Ｓｅｖｒｏｎ Ｏｒａｎｇｅ；Ｓｅｖｒｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌ；ｓｇＢＦＰ；ｓｇＢＦＰ（スーパーグローＢＦＰ）；ｓｇＧＦＰ；ｓｇＧＦＰ（スーパーグローＧＦＰ）；ＳＩＴＳ；ＳＩＴＳ（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ）；ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ－１；ＳＮＡＦＬ－２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦ１；ナトリウムグリーン；ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ；ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ；ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ；ＳＰＱ（６－メトキシ－Ｎ－（３－スルホプロピル）キノリ二ウム）；スチルベン；スルホローダミンＢ ｃａｎ Ｃ；スルホローダミンＧエクストラ；ＳＹＴＯ １１；ＳＹＴＯ １２；ＳＹＴＯ １３；ＳＹＴＯ １４；ＳＹＴＯ １５；ＳＹＴ；ＳＹＴＯ １７；ＳＹＴＯ １８；ＳＹＴＯ ２０；ＳＹＴＯ ２１；ＳＹＴＯ ２２；ＳＹＴＯ ２３；ＳＹＴＯ ２４；ＳＹＴＯ ２５；ＳＹＴＯ ４０；ＳＹＴＯ ４１；ＳＹＴＯ ４２；ＳＹＴＯ ４３；ＳＹＴＯ ４４；ＳＹＴＯ ４５；ＳＹＴＯ ５９；ＳＹＴＯ ６０；ＳＹＴＯ ６１；ＳＹＴＯ ６２；ＳＹＴＯ ６３；ＳＹＴＯ ６４；ＳＹＴＯ ８０；ＳＹＴＯ ８１；ＳＹＴＯ ８２；ＳＹＴＯ ８３；ＳＹＴＯ ８４；ＳＹＴＯ ８５；ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ；ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ；ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド；テキサスレッド－Ｘコンジュゲート；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＣＮ；チオライト；チオゾールオレンジ；Ｔｉｎｏｐｏｌ ＣＢＳ（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ）；ＴＭＲ；ＴＯ－ＰＲＯ－１；ＴＯ－ＰＲＯ－３；ＴＯ－
ＰＲＯ－５；ＴＯＴＯ－１；ＴＯＴＯ－３；ＴｒｉＣｏｌｏｒ（ＰＥ－Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン－イソチオシアネート）；Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ；ＴｒｕＲｅｄ；Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ；ウラニンＢ；Ｕｖｉｔｅｘ ＳＦＣ；ｗｔ ＧＦＰ；ＷＷ ７８１；Ｘ－ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；Ｙｅｌｌｏｗ ＧＦＰ；ＹＦＰ；ＹＯ－ＰＲＯ－１；ＹＯ－ＰＲＯ－３；ＹＯＹＯ－１；及びＹＯＹＯ－３が挙げられるが、また、これらに限定されない。
一実施例では、検出可能な標識は酵素である。酵素は、適切な基質にて作用し、検出可能な染料の産生をもたらすことができる。開示で有用な酵素の例としては、アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、またはさらに、酵素は例えば、ルシフェラーゼであることができる。酵素は、従来の化学的方法により抗体に結合することができるか、または、融合タンパク質として抗体と共に発現することができる。
本開示で検出可能な標識として有用な放射性同位体は、当該技術分野において周知であり、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、及び１３１Ｉを挙げることができる。カルシトニン受容体に結合する化合物のカルボキシル、アミノ、またはスルフヒドリル基と反応することができる、任意のγ線を放出する放射性物質、例えば、９９ｍＴｃ及び１１１Ｉｎの結合が、ガンマシンチグラフィを使用する検出法での使用に好適である。化合物のカルボキシル、アミノ、またはスルフヒドリル基と反応することができる、放射性１１Ｃ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２４Ｉ、及び１３１Ｉの結合が、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴイメージングを使用する検出法での使用に好適である。
ＣＸＣＬ１０結合タンパク質のアッセイ
ＣＸＣＬ１０、及びその修飾形態への結合
本開示のいくつかのＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、完全長ＣＸＣＬ１０、及び／または、ＣＸＣＬ１０の特定の翻訳後修飾形態（例えば、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０及び／またはシトルリン化ＣＸＣＬ１０）に結合することが、本明細書における開示から当業者には明らかとなろう。タンパク質への結合を評価する方法は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，１９９４に記載されているように、当技術分野において既知である。このような方法は一般に、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の固定化、及び、当該タンパク質を、標識した抗原と接触させることを伴う。洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した後、標識の量、そして結果として結合抗原が検出される。当然ながら、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は検出可能であり、抗原は固定することができる。パニング型アッセイも使用することができる。あるいは、またはさらに、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することができる。
親和性の測定
任意選択的に、結合タンパク質の解離定数（Ｋｄ）または結合速度定数（Ｋａ）または平衡定数（ＫＤ）を測定する。結合領域（例えば、抗体または抗原結合断片）に対するこれらの定数は、一例では、表面プラズモン共鳴アッセイを使用するバイオセンサー分析により測定される。例示的なＳＰＲ法は、ＵＳ７２２９６１９に記載されている。
親和性測定は、抗体反応に対する標準的手法、例えば、イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ，２０００；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ，１９９８）、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）、または、当該技術分野において既知の動力学的相互作用アッセイにより測定することができる。
競合的結合の測定
本明細書に記載するＣＸＣＬ１０結合タンパク質の結合を競合的に阻害する抗体または
その抗原結合断片を測定するためのアッセイは、当業者に明らかとなるであろう、及び／または、本明細書に記載する。
例えば、抗体またはその抗原結合断片を検出可能な標識、例えば、蛍光標識または放射能標識にコンジュゲートさせる。次に、標識抗体及び試験ＣＸＣＬ１０結合タンパク質を混合し、ＣＸＣＬ１０、またはその領域、または、ＣＸＣＬ１０を発現する細胞と接触させる。次に、標識抗体のレベルを測定し、標識抗体が、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の不存在下でＣＸＣＬ１０、領域、または、細胞と接触したときに測定したレベルと測定する。標識抗体のレベルが、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の不存在下と比較して、試験ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の存在下で低下した場合、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質は、抗体の、ＣＸＣＬ１０への結合を競合的に阻害するものと考えられる。
任意選択的に、試験ＣＸＣＬ１０結合タンパク質を、異なるレベルで抗体にコンジュゲートさせる。この代替標識により、試験ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の、ＣＸＣＬ１０、またはその領域、または細胞への結合レベルの検出が可能となる。
別の実施例では、ＣＸＣＬ１０、領域、細胞を抗体と接触させる前に、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質を、ＣＸＣＬ１０、またはその領域、またはＣＸＣＬ１０を発現する細胞に結合させる。ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の不存在下と比較して、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の存在下で、結合抗体の量が低下することは、タンパク質が、抗体の、ＣＸＣＬ１０への結合を競合的に阻害することを示す。標識ＣＸＣＬ１０結合タンパク質を使用し、まず、抗体をＣＸＣＬ１０に結合させることにより、相互アッセイもまた実施することができる。この場合、抗体の不存在下と比較して、抗体の存在下でＣＸＣＬ１０に結合した、標識ＣＸＣＬ１０結合タンパク質の量が低下することは、ＣＸＣＬ１０結合タンパク質が、抗体の、ＣＸＣＬ１０への結合を競合的に阻害することを示す。
ＣＸＣＬ１０レベルの測定
上述のとおり、ＣＸＣＬ１０は、感染症、中枢神経系疾患、慢性炎症、免疫機能不全、及びがんを含む様々なヒト疾患と関連している。
本発明者らはＣＸＣＬ１０結合タンパク質を開発し、異なる形態のタンパク質、即ち、完全長または成熟ＣＸＣＬ１０、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０、及び／またはシトルリン化ＣＸＣＬ１０を検出した。
本発明者らは、良性及び悪性状態において、異なる形態のタンパク質が異なるレベルで存在することを見出した。
したがって、本明細書に記載する任意の開示の方法は、対象においてＣＸＣＬ１０のレベルを測定することを含む。
本明細書で使用する場合、ＣＸＣＬ１０を参照する用語「レベル」とは、タンパク質の機能性のレベル（即ち、機能レベル）を指すものとして理解されなければならない。例えば、レベル（または「発現度合い」）とは、コードしたタンパク質の測定値を意味する。
特に、発明者らは、対象において、活性ＣＸＣＬ１０タンパク質と全ＣＸＣＬ１０タンパク質のレベルを測定することで、良性及び悪性状態を区別することができることを発見した。本手順は、本明細書においては活性割合試験（ＡＲＴ）と呼ばれる。
本明細書で使用する場合、ＣＸＣＬ１０のレベルの文脈における、用語「活性」とは、生物学的に活性な形態のＣＸＣＬ１０を意味する。例えば、「活性ＣＸＣＬ１０に結合す
る本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質」とは、完全長または成熟（即ち、Ｎ末端がインタクトな）ＣＸＣＬ１０には結合するが、Ｎ末端切断またはシトルリン化ＣＸＬＣ１０には結合しない、結合タンパク質を意味する。
本明細書で使用する場合、ＣＸＣＬ１０のレベルの文脈における「全」とは、全形態のＣＸＣＬ１０を意味する。例えば、「全ＣＸＣＬ１０に結合する本開示のＣＸＣＬ１０結合タンパク質」とは、完全長または成熟（即ち、Ｎ末端がインタクトな）ＣＸＣＬ１０、加えて、Ｎ末端切断及びシトルリン化ＣＸＬＣ１０に結合する結合タンパク質を意味する。
一実施例では、活性ＣＸＣＬ１０及び全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することは、対象における、活性ＣＸＣＬ１０タンパク質の量、及び全ＣＸＣＬ１０タンパク質の量を測定することを含む。
本明細書で使用する場合、ＣＸＣＬ１０のレベルを参照する際の用語「量」とは、タンパク質（即ち、活性または全ＣＸＣＬ１０のいずれか）の量を意味することが理解されよう。タンパク質の量を評価する様々な方法が当業者に利用可能であり、当業者は、特定の値または量が、使用する評価方法に応じて変化し得ることを認識するであろう。本用語は、絶対値と相対値の両方を包含することもまた、明らかであろう。例えば、量は、参照または対照サンプルに対して相対的であってよい。別の実施例では、量は、サンプルに存在するタンパク質の量の絶対値であってよい。
驚くべきことに、発明者らは、対象でのＣＸＣＬ１０比率を測定することにより、良性及び悪性状態を区別することができることを発見した。
本明細書で使用する場合、用語「ＣＸＣＬ１０比率」とは、対象における、全ＣＸＣＬ１０のレベルに対する活性ＣＸＬＣ１０のレベルの比率を意味する。
一実施例では、方法は、対象におけるＣＸＣＬ１０の比率を、少なくとも１つの参照におけるＣＸＣＬ１０比率と比較することをさらに含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、（ａ）対象におけるＣＸＣＬ１０比率が、参照におけるＣＸＣＬ１０比率よりも高いか否か、または、（ｂ）対象におけるＣＸＣＬ１０比率が、参照におけるＣＸＣＬ１０比率よりも低いか否かを測定することを含む。
ＣＸＣＬ１０比率を参照しての用語「（より）高い」とは、対象における割合が、対照または参照レベルと比較して大きい、または増加していることを意味する。前述より、ＣＸＣＬ１０比率は、統計的に有意な量、例えば、少なくとも約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％だけ増加する必要があるのみであることが明らかとなるであろう。
ＣＸＣＬ１０比率を参照しての用語「（より）低い」とは、対象における割合が、対照または参照レベルと比較して低下している、または減少していることを意味する。前述より、ＣＸＣＬ１０比率は、統計的に有意な量、例えば、少なくとも約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％だけ減少する必要があるのみであることが明らかとなるであろう。
ＣＸＣＬ１０のレベルの測定方法
ＣＸＣＬ１０のレベルの測定方法は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。例えば、方法としては、免疫組織化学法、免疫蛍光法、イムノブロット、ウエスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、質量分析（タンデム質量分析、例えばＬＣ ＭＳ／ＭＳを含む）、バイオセンサー技術、一過性繊維光学技術、またはタンパク質チップ技術が挙げられる。例えば、好適なアッセイは半定量アッセイ、及び／または定量アッセイである。
一実施例では、サンプル中のＣＸＣＬ１０のレベルを測定する方法は、対象由来の生体サンプルを、一定時間、及び、結合タンパク質と、ポリペプチドまたはタンパク質との複合体が形成するのに十分な条件下で、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する（本明細書に記載する）ＣＸＣＬ１０結合タンパク質と接触させることと、当該複合体を検出することと、を含む。例えば、本明細書に記載するいずれかの方法において、活性ＣＸＣＬ１０のレベルを測定し、全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定し、活性ＣＸＣＬ１０の、全ＣＸＣＬ１０に対する比率を測定する。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）
標準的な固相ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡ形式は、様々なサンプルからタンパク質の濃度を測定する上で特に有用である。一形態において、このようなアッセイは、生体サンプルを固体マトリックス、例えばポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェルもしくはディップスティック、メンブレン、またはガラス支持体（例えばスライドガラス）などの上に固定することを伴う。
ＣＸＣＬ１０ポリペプチド内でマーカーに特異的に結合する抗体を、固定された生体サンプルと直接接触させ、上記サンプルに存在する標的タンパク質のいずれかと直接結合を形成する。本抗体は一般に、例えば、ＦＬＩＳＡの場合、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣもしくはテキサスレッド）、もしくは蛍光半導体ナノ結晶（ＵＳ６，３０６，６１０に記載されている）、または、ＥＬＩＳＡの場合、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、もしくはβ－ガラクトシダーゼ）などの、検出可能なレポーター分子で標識される、あるいは、第１の抗体に結合する第２の標識抗体を使用することができる。洗浄して、未結合のあらゆる抗体を取り除いた後、標識を、蛍光標識の場合は直接検出し、または、酵素標識の場合は、例えば、過酸化水素、ＴＭＢ、もしくはトルイジン、もしくは５－ブロモ－４－クロロ－３－インドール－β－Ｄ－ガラオトピラノシド（ｘ－ゲル）などの基質を添加することにより、検出する。
このようなＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡベースのシステムは、抗体が、例えば、単離、及び／または組換えＣＸＣＬ１０ポリペプチド、もしくはその免疫原性断片、もしくはそのエピトープなどに結合する、既知の量のタンパク質標準に対して検出システムを較正することにより、サンプル中のタンパク質の量を定量化するのに好適である。
別の実施例では、ＥＬＩＳＡは、固体マトリックス上で、ＣＸＣＬ１０ポリペプチド内の疾患または障害のマーカーに特異的に結合する抗体またはリガンド、例えば、膜、ポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェル、ポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェルディップスティック、またはガラス支持体などを固定することで構成される。次に、サンプルを上記抗体と物理的に関連させ、サンプル中の上記マーカーを結合または「捕捉」させる。次に、結合タンパク質を、標識抗体を使用して検出する。あるいは、第２の（検出）抗体に結合する第３の標識抗体を使用してもよい。
一実施例では、固定抗体はポリクローナル抗体である。
本明細書に記載するアッセイフォーマットは、例えば、Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．，１９９９に記載する、スクリーニングプロセスまたはマイクロアレイフォーマットのオートメーションなどのハイスループットフォーマットの影響を受けやすいことが、当業者に明らかとなろう。さらに、上述したアッセイのバリエーション、例えば、競合ＥＬＩＳＡなどが、当業者には明らかとなろう。
一実施例では、アッセイフォーマットは、マイクロ流体デバイス、例えば、マイクロ流体チップ、または液滴ベースのマイクロ流体デバイスである。マイクロ流体チップ（例えば、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）デバイス）は、典型的には、数平方ミリメートル～数平方センチメートルのサイズの範囲である。これらのマイクロ流体チップは、生物学的または医学的処理または試験を行うために、少ない液量を取り扱う、または操作するように設計されている。流体を、単一のマイクロ流体チップで移動、混合、または処理してよい。
別の実施例では、アッセイフォーマットはディップスティック、例えば、ポリカーボネートディップスティックである。
ＳＩＭＯＡアッセイ
本発明で使用可能な別のアッセイは、単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ）アッセイであり、これは、Ｋｕｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）及びＧｉｓｓｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）に詳述されている。
ウェスタンブロット
別の実施例では、ウエスタンブロットを使用して、サンプルのＣＸＣＬ１０ポリペプチド内のマーカーのレベルを測定する。このようなアッセイでは、当該技術分野において既知の技術を使用する、及び、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，１９９４に記載されている、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を使用して、タンパク質をサンプルから分離する。分離したタンパク質を次に、当該技術分野において既知の方法、例えば、電子移動を使用して、固体支持体、例えば、メンブレン（例えば、ＰＶＤＦメンブレン）などに移す。このメンブレンを次に遮断し、ＣＸＣＬ１０ポリペプチド内でマーカーに特異的に結合する標識抗体またはリガンドでプローブする。あるいは、標識した第２の、またはさらに第３の抗体または配位子を使用して、特異的一次抗体の結合を検出する。次に、標識のレベルを、使用する標識に適切なアッセイを使用して測定する。
適切なアッセイは当業者に明らかであり、例えば、デンシトメトリーが挙げられる。一実施例では、タンパク質のバンドまたはスポットの強度は、当該技術分野において既知の方法を使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードしたタンパク質の総量に対して正規化される。あるいは、検出されたマーカーのレベルを、対照／参照タンパク質のレベルに対して正規化する。このような対照タンパク質は、当技術分野において既知であり、例えば、アクチン、グリセルアルデヒド３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、β２マイクログロブリン、ヒドロキシ－メチルビランシンターゼ、ヒポキサンチンホスホリボシル－トランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、リボソームタンパク質Ｌ１３ｃ、サクシネートデヒドロゲナーゼ複合体サブユニットＡ、及びＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）が挙げられる。
ラジオイムノアッセイ
あるいは、ＣＸＣＬ１０のレベルを、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して検出する。アッセイの基本原理は、放射能標識した抗体または抗原を使用して、抗体－抗原相互作用を検出することである。ＣＸＣＬ１０ポリペプチド内でマーカーに特異的に結合する抗体またはリガンドが、固体支持体に結合し、サンプルが上記抗体と直接接触するようになる。結合抗原のレベルを検出するために、単離及び／または組換え形態の抗原を放射能標識し、同じ抗体と接触させる。洗浄後、結合した放射能のレベルを検出する。生体サンプル中の任意の抗原が、放射能標識した抗原の結合を阻害するため、検出した放射能のレベルは、サンプル中の抗原のレベルに反比例する。このようなアッセイは、単離した抗原の既知の濃度を増加させることを用いる検量線を使用するにより定量化することができる。
このようなアッセイを改良して、放射能標識の代わりに任意のレポーター分子、例えば、酵素または蛍光分子などを使用することができる。
バイオセンサーまたは光学免疫センサーシステム
あるいは、サンプル中のＣＸＣＬ１０のレベルを、バイオセンサーまたは光学免疫センサーシステムを使用して測定する。一般に、光学バイオセンサーは、光学原理を用いて、リガンドまたは抗体の、ターゲットポリペプチドとの結合を、電気シグナルに定量的に変換するデバイスである。これらのシステムは、４つの主要なカテゴリー：反射技術；表面プラズモン共鳴；光ファイバー技術、及び一体化光学デバイスに分類することができる。反射技術としては、偏光解析法、複数積分反射分光法、及び蛍光キャピラリー充填デバイスが挙げられる。光ファイバー技術としては、エバネッセント場蛍光、光ファイバー毛管、及び光ファイバー蛍光センサーが挙げられる。一体化光学デバイスとしては、平面エバネッセント場蛍光、入力勾配カップラー免疫センサー、マッハツェンダー干渉計、ハートマン干渉計、及び差干渉計センサーが挙げられる。これらの光学免疫センサーの例は、Ｒｏｂｉｎｓ，１９９１に概して記載されている。これらのデバイスについてのより具体的な説明は、例えば、米国特許第４，８１０，６５８号；同第４，９７８，５０３号；同第５，１８６，８９７号；及びＢｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７に見出される。
生体サンプル
当業者に明らかとなるとおり、生体サンプルの種類及びサイズは、使用する検出方法に応じて変化するであろう。例えば、タンパク質ベースのアッセイでは、抗原ベースアッセイ様の十分なタンパク質をもたらすために、十分な細胞を必要とする。
本明細書で使用する場合、用語「サンプル」または「生体サンプル」とは、対象から入手される任意の種類の好適な材料を意味する。この用語は、臨床サンプル（例えば、子宮頸部スワブまたは頸腟スワブ）、生物学的流体（例えば、子宮頸部液、膣液、血漿、腹水）、組織サンプル、生細胞を包含し、これらに由来する培養物、細胞上清、細胞溶解物中の細胞もまた含む。サンプルは、源から直接入手したものとして使用することができる、または、少なくとも１ステップの（部分的）精製の後で使用することができる。サンプルは、本開示の方法と干渉しない任意の培地で調製可能であることが、当業者に明らかとなろう。典型的には、サンプルは、細胞もしくは組織を含む、及び／または、水溶液、もしくは、細胞もしくは組織を含む生物学的流体である。当業者は、選択及び前処理方法を認識するであろう。前処理は、例えば、粘稠流体の希釈を伴ってよい。サンプルの処理は、濾過、蒸留、分離、濃縮を伴ってよい。
一実施例では、生体サンプルは対象から、以前にもたらされている。したがって、一実施例では、任意の実施形態に従った、本明細書に記載する方法はさらに、生体サンプルを提供することを含む。
一実施例では、生体サンプルを、２回以上の時点で対象から収集し、例えば、悪性状態の進行を監視する、再発を監視する、及び／または、治療プロトコルの有効性を評価することができる。一実施例では、生体サンプルは、対象の悪性状態を治療する前、間、及び／またはその後に、対象から収集することができる。サンプルは毎週１回、隔週に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、または６ヶ月に１回収集して、悪性状態の進行を監視する、または、治療レジメンの有効性を評価することができる。
一実施例では、任意の実施形態に従った、本明細書に記載する方法を、サンプル、例えば、タンパク質などからの抽出物を使用して実施する。
参照サンプル
前述の記載から明らかとなるように、本開示のいくつかのアッセイは、定量化のために、好適な参照サンプルまたは対照を使用することができる。
本開示の方法で使用するのに好適な参照サンプルは、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。例えば、参照は、通常の個体に由来する内部参照であってよい（即ち、同じ対象に由来することができる）か、または、（例えば、年齢、サンプルの種類、及び／またはサイクルのステージで一致した）確立されたデータセットであってよい。
一実施例では、参照は内部参照またはサンプルである。例えば、参照は自己参照である。一実施例では、内部参照は、分析中のサンプルと同時に、対象から入手される。別の実施例では、内部参照は、分析中のサンプルよりも早い時点で、対象から入手される。
本明細書で使用する場合、用語「通常の個体」とは、対象が、悪性及び／または良性状態を有しないこと、または、このような状態を有することが疑われないことに基づいて選択されることを意味するものと理解されなければならない。例えば、通常の個体は、健常な個体である。
一実施例では、参照は確立されたデータセットである。本開示で使用するのに好適な、確立されたデータセットは、当業者に明らかとなり、例えば、
・年齢またはサンプルの種類が一致した通常の対象、または通常の対象の集団からのデータセット；
・年齢、サンプルの種類、及び／または疾患／状態が一致した別の対象、または対象の集団からのデータセット；
・インビトロで細胞を含み、細胞が、ＣＸＣＬ１０発現を誘発するように処理されている、データセット；ならびに
・インビトロで子宮内膜上皮細胞を含み、細胞が、ＣＸＣＬ１０発現を阻害するように処理されている、データセットが挙げられるであろう。
一実施例では、参照はアッセイに含まれない。代わりに、好適な参照は、以前に生成した、確立されたデータセットから導かれる。試験サンプルの処理、分析、及びアッセイで導き出したデータを続いて、サンプルから入手したデータと比較する。
悪性状態の検出及び／または診断
本明細書にて開示するとおり、本開示の発明者らは、悪性状態の検出及び／または診断における、ＣＸＣＬ１０の役割を示した。本明細書で開示する方法は、対象の良性状態から悪性状態を区別するのに有用であることが、当業者に明らかとなろう。例えば、本開示の方法は、対象の悪性状態を診断するためのスクリーニングテストとして有用である。
したがって、本開示は、例えば、対象における悪性状態を検出及び／または診断する方法であって、当該方法が、
（ｉ）上記対象において活性ＣＸＣＬ１０のレベル、及び、上記対象において全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することと、
（ｉｉ）上記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することと、を含む、上記方法を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「検出する」、「検出すること」、「診断」、または「診断すること」とは、対象における悪性状態の識別を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「悪性状態」とは、制御されない様式で増殖し、通常の組織に侵入し、多くの場合転移して、元の組織とは離れた部位で増殖する、状態または疾患を意味する。一実施例では、悪性の疾患または病状は、がんであるか、またはがんに関連している。当業者は、がんは、体内のほとんど全ての組織で生じ得、本明細書で使用する場合、この用語は、例えば、がん腫、肉腫、リンパ腫、及び白血病（即ち、充実性及び非充実性がん）を含む、あらゆる形態の疾患を包含することを理解するであろう。
一実施例では、本開示は、悪性状態を良性状態から区別する方法を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「良性状態」とは、隣接する組織に侵入する能力を欠いている、細胞の塊を意味する。
一実施例では、本開示は、前がん性病変を良性状態から区別する方法を提供する。
用語「前がん性病変」とは、異常増殖し、サイズ、形状、または概観が通常の細胞とは異なるように見える、細胞の塊を意味するが、これらはまだ、がん性または悪性ではない。一実施例では、前がん性病変はｐ５３前がん性病変である。本明細書で使用する場合、用語「ｐ５３前がん性病変」とは、ｐ５３遺伝子変異を有する細胞を意味する。
一実施例では、対象は、悪性状態（即ち、がん）を患う。例えば、がんは、肉腫またはがん腫などの充実性腫瘍である。例えば、がん腫は、前立腺、卵巣、胸、肺、肝臓、結腸、膵臓、または胃のがん腫である。例えば、対象は卵巣癌を患う。一実施例では、がんは非充実性腫瘍、例えば、白血病またはリンパ腫である。一実施例では、対象はステージ０のがんを患う。例えば、がん腫はｉｎ ｓｉｔｕである。一実施例では、対象はステージＩ、ＩＩ、またはＩＩＩのがんを患う。例えば、がん腫は、元の器官を超えて、リンパ節及び／または組織付近まで、または、原発腫瘍の場所に隣接する器官まで広がる。一実施例では、対象はステージＩＶのがんを患う。例えば、がんは、離れた組織及び／または器官まで広がる。
一実施例では、対象は、悪性状態の治療を受けていない。例えば、対象は治療未経験である。
一実施例では、対象は、悪性状態の治療を受けている。一実施例では、対象は、悪性状態の治療を受けていた。悪性状態の治療に好適な治療法は、当業者に明らかであろう、及び／または、本明細書に記載される。例えば、治療は、手術、化学療法、放射線療法、標的薬物療法、免疫療法、またはこれらの組み合わせを含む。
卵巣癌
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、対象で卵巣癌を検出及び／ま
たは診断することを含む。例えば、対象は卵巣癌を患う。
本明細書で使用する場合、用語「卵巣癌」とは、卵巣から始まる任意のがん腫性増殖を意味する。
一実施例では、方法は、対象における卵巣癌を、良性状態と区別する方法を含む。
本明細書に記載の方法を、例えば、上皮、類内膜腫瘍、胚芽細胞腫瘍、明細胞、及び粘液性腺癌を含む、あらゆるサブタイプの卵巣癌を検出及び／または診断するのに適用可能であることが、当業者に明らかとなろう。
一実施例では、本開示は、対象において、上皮卵巣癌を検出及び／または診断する方法を提供する。
当業者は、卵巣癌は、下表２で記載するように、国際産婦人科連盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ／ＦＩＧＯ）のステージ分けシステムを使用して、ステージ分けされることを理解するであろう。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、本開示は、がんのステージに関係なく、対象において、卵巣癌を検出及び／または診断する方法を提供する。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、本開示は、対象において、ステージＩの卵巣癌を検出及び／または診断する方法を提供する。
卵巣癌が、がんの等級に基づいて分類されることもまた、当業者は理解するであろう。例えば、等級１の腫瘍は十分分化した細胞を有し、等級２の腫瘍は、十分適度に分化しており、等級３は、分化が不十分である。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、本開示は、がんの等級に関係なく、対象において、卵巣癌を検出及び／または診断する方法を提供する。
別の実施例では、卵巣癌は漿液、粘液性、類内膜、明細胞、ＧＣＴ、またはこれらの混合の、卵巣癌である。一実施例では、卵巣癌は漿液性癌である。
一実施例では、対象は卵巣癌のリスクにある。
本明細書で使用する場合、卵巣癌の「リスクにある」対象は、検出可能な卵巣癌、または卵巣癌の症状を有し得る、または有し得ない。「リスクにある」とは、対象が、当技術分野において既知の、及び／または、本明細書に記載する、疾患または病状の進行と相関する、測定可能なパラメーター、１つ以上の危険因子を有することを意味する。例えば、対象はｐ５３遺伝子変異を有する。
Figure 2023508023000002
リスク因子としては、以下が挙げられる：
・卵巣及び乳癌の家族歴；
・妊娠歴、即ち、３５歳を超えて妊娠、または、妊娠したことがないことは、高いリスクと関連している；
・乳癌歴
・閉経後のホルモン療法、例えば、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）が、リスクの増加と関連する；ならびに
・肥満、例えば、３０を超える体格指数。
対照集団よりも卵巣癌の進行リスクが高いと、対象はリスクにある。対照集団は、卵巣癌を患っていない、または、卵巣癌の家族歴がある、全集団（例えば、年齢、性別、人種、及び／またはエスニシティにより一致）から無作為に選択される１名以上の対象を含むことができる。卵巣癌と関連する「リスク因子」が、対象と関連することが発見される場合、当該対象はリスクにあると考えることができる。リスク因子は、例えば、対象の集団における、統計的または疫学的研究を通しての、所与の疾患と関連する、任意の活性、形質、事象、または性質を含むことができる。したがって、根底にある危険因子を識別する研究が、対象を特異的に含まなかった場合であっても、対象は、リスクにあるものと分類される可能性がある。
一実施例では、本開示の方法を、卵巣癌の症状の開始前、または開始後に実施する。卵巣癌の症状は、当業者に明らかであり、例えば、以下が挙げられる：
・腹部膨満または腫れ；
・腹部の膨満感及び痛み；
・下腹部の痛み；
・ほんの少し食べた後の満腹感；
・疲れ；
・排便習慣の変化；
・衣類が上手くフィットしない；
・足の腫れ；
・呼吸困難；
・膣からの出血；
・異常な月経周期；
・体重の減少または増加；及び
・原因不明の背中痛。
本開示の方法を、他の生物学的マーカーの検出と組み合わせることができることもまた、本発明者らは発見した。
一実施例では、本開示の方法は、対象において、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）及び／またはがん抗原１２５（ＣＡ－１２５）を測定することをさらに含む。一実施例では、方法は、ＤＰＰ４のレベルを測定することをさらに含む。別の実施例では、方法は、ＣＡ－１２５のレベルを測定することをさらに含む。さらなる一実施例では、方法は、ＤＰＰ４及びＣＡ－１２５のレベルを測定することをさらに含む。
ＤＰＰ４及び／またはＣＡ－１２５の測定方法は、当技術分野において既知である（例えば、ＵＳ ５，３５６，８１７，Ｓａｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７、及びＶｕｅｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７を参照されたい）、及び／または、本明細書に記載されている。
一実施例では、本開示の方法は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ－ＲＩＩ）、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、及びインターロイキン８（ＩＬ－８）のうちの１つ以上、または全てのレベルを測定することをさらに含む。
一実施例では、方法は、ＧＭ－ＣＳＦのレベルを測定することをさらに含む。
一実施例では、方法は、ＩＬ－６のレベルを測定することをさらに含む。
一実施例では、方法は、ＴＮＦ－ＲＩＩのレベルを測定することをさらに含む。
一実施例では、方法は、ＨＥ４のレベルを測定することをさらに含む。
一実施例では、方法は、ＩＬ－８のレベルを測定することをさらに含む。
一実施例では、方法は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＨＥ４、及びＩＬ－８のレベルを測定することをさらに含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、ＤＰＰ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＨＥ４、及びＩＬ－８のレベルを測定することをさらに含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、ＣＡ－１２５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＨＥ４、及びＩＬ－８のレベルを測定することをさらに含む。
本明細書に記載する任意の方法の一実施例では、方法は、ＤＰＰ４、ＣＡ－１２５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＨＥ４、及びＩＬ－８のレベルを測定することをさらに含む。
悪性状態の治療方法
一実施例では、本発明は、対象における悪性状態の治療方法であって、当該方法が、本明細書に記載する方法を実施することと、対象の悪性状態を治療することと、を含む、上記方法を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「治療すること」、「治療する」、または「治療」は、がんの全部もしくは一部を外科的に取り除くこと、または、悪性状態の少なくとも１つの症状を軽減もしくは取り除くのに十分な、治療に有効な量の化合物／分子／放射線を投与することを含む。例えば、治療のための使用に関する「有効量」とは、過度の副作用の影響を伴わずに、病徴の臨床的に有意な低下をもたらすために必要な化合物の量である。任意の個体の症例における、適切な「有効量」は、用量増加研究などの技術を使用して測定することができる。化合物の「有効量」とは、過度の副作用の影響を伴わずに、所望の薬理学的効果または治療の改善を実現するのに効果的な量である。「有効量」または「治療に有効な量」は、対象の年齢、体重、全身状態のいずれかによる、化合物の代謝の変動、治療される状態、治療される状態の深刻度、及び、指示する医師の判断によって、対象によって変化し得ると理解されている。
一実施例では、治療は、手術、化学療法、放射線療法、標的薬物療法、またはこれらの組み合わせを含む。
一実施例では、治療は手術を含む。例えば、手術は減量手術である。
別の実施例では、治療は化学療法を含む。例示的な化学療法剤としては、例えば、カボプラチン、シタラビン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、フルダラビン、イダルビシン、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、メトトレキサート、マイトキサントロン、パクリタキセル、トポテカン、ビンクリスチン、及びビンブラスチンが挙げられる。
一実施例では、治療は放射線療法を含む。例えば、放射線療法は、外照射療法（ＥＢＲＴ）、３次元原体照射療法（３Ｄ－ＣＲＴ）、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、強度変調回転療法（ＶＭＡＴ）、原体プロトンビーム放射線療法、定位手術的照射（ＳＲＳ）／定位放射療法（ＳＲＴ）、イメージガイド放射線療法（ＩＧＲＴ）、近接照射療法（内部放射線療法）、ならびに、全脳及び脊髄放射線療法（頭蓋脊柱照射）からなる群から選択される。
例えば、標的薬物療法は治療用抗体である。たとえば、標的薬物療法は治療用抗体です。例示的な治療用抗体は当業者に既知であり、アバゴボマブ；アブシキシマブ；アビツズマブ；アブリルマブ；アクトクスマブ；アダリムマブ；アデカツムマブ；アデュカヌマブ；アフェリモマブ；アフツズマブ；アラシズマブペゴル；アレムツズマブ；アリロクマブ；ペンテト酸アルツモマブ；アマツキシマブ；アナツモマブマフェナトックス；アネツマブラブタンシン；アニフロルマブ；アンルキンズマブ；アポリズマブ；アルシツモマブ；アスクリンバツマブ；アセリズマブ；アテゾリズマブ；アティヌマブ；アトリズマブ（トシリズマブ）；アトロリムマブ；バピネウズマブ；バシリキシマブ；バビツキシマブ；ベクツモマブ；ベゲロマブ；ベリムマブ；ベンラリズマブ；ベルチリムマブ；ベシレソマブ；ベバシズマブ；ベズロトクスマブ；ビシロマブ；ビマグルマブ；ビメキズマブ；ビバツズマブメルタンシン；ブリナツモマブ；ブロソズマブ；ボコシズマブ；ブレンツキシムアブベドチン；ブリアキヌマブ；ブロダルマブ；ブロルシズマブ；ブロンチツズマブ；カナキヌマブ；カンツズマブメルタンシン；カンツズマブラブタンシン；カプラシズマブ；カプロマブペンデチド；カルルマブ；カツマキソマブ；ｃＢＲ９６－ドキソルビシンイムノコンジュゲート；セデリズマブ；セルトリズマブペゴル；セツキシマブ；シタツズマブボガトックス；シクスツムマブ；クラザキズマブ；クレノリキシマブ；クリバツズマブテトラキセタン；コドリツズマブ；コルツキシマブラブタンシン；コナツムマブ；コンシズマブ；クレネズマブ；ダセツズマブ；ダクリズマブ；ダロツズマブ；ダピロリズマブペゴル；ダラツムマブ；デクトレクマブ；デムシズマブ；デニンツズマブマフォドチン；デノスマブ；デルロツキシマブビオチン；デツモマブ；ジヌツキシマブ；ディリダブマブ；ドリモマブアリトックス；ドロジツマブ；デュリゴツマブ；デュピルマブ；デュルバルマブ；ドュシギツマブ；エクロメキシマブ；エクリズマブ；エドバコマブ；エドレコロマブ；エファリズマブ；エファリズマブ；エルデルマブ；エルゲムツマブ；エロツズマブ；エルシリモマブ；エマクツズマブ；エミベツズマブ；エナバツズマブ；エンホルツマブベドチン；エンリモマブペゴル；エノブリツズマブ；エノキズマブ；エノチクマブ；エンシツキシマブ；エピツモマブシツキセタン；エプラツズマブ；エリズマブ；エルツマキソマブ；エタネルセプト；エタラシズマブ；エトロリズマブ；エビナクマブ；エボロクマブ；エクスビビルマブ；ファノレソマブ；ファラリモマブ；ファルレツズマブ；ファシヌマブ；フェルビズマブ；フェザキヌマブ；フィクラツズマブ；フィギツムマブ；フィリブマブ；フランボツマブ；フレティクマブ；フォントリズマブ；フォラルマブ；フォラビルマブ；フレソリムマブ；フラヌマブ；フツキシマブ；ガリキシマブ；ガニツマブ；ガンテネルマブ；ガビリモマブ；ゲムツズマブオゾガマイシン；ゲボキズマブ；ジレンツキシマブ；グレムバツムマブベドチン；ゴリムマブ；ゴミリキシマブ；グセルクマブ；イバリズマブ；イブリツモマブチウキセタン；イクルクマブ；イダルシズマブ；イゴボマブ；イマルマブ；イマルマブ；イムガツズマブ；インクラクマブ；インダツキシマブラブタンシン；インデュサツマブベドチン；インフリキシマブ；イノリモマブ；イノツズマブオゾガマイシン；インテツムマブ；イピリムマブ；イラツムマブ；イサツキシマブ；イトリズマブ；イキセキズマブ；ケリキシマブ；ラベツズマブ；ランブロリズマブ；ランパリズマブ；レブリキズマブ；レマレソマブ；レンジルマブ；レルデリムマブ；レクサツムマブ；リビビルマブ；リファスツズマブベドチン；リゲリズマブ；リロトマブサテトラキセタン；リンツズマブ；リリルマブ；リデルシズマブ；ロキベットマブ；ロルボツズマブメルタンシン；ルカツムマブ；ルリズマブペゴル；ルミリキシマブ；ルムレツズマブ；マパツムマブ；マルゲツキシマブ；マスリムマブ；マツズマブ；マブリリムマブ；メポリズマブ；メテリムマブ；
ミラツズマブ；ミンレツモマブ；ミルベツキシマブソラブタンシン；ミツモマブ；モガムリズマブ；モロリムマブ；モタビズマブ；モキセツモマブパスドトックス；ムロモナブ－ＣＤ３；ナコロマブタフェナトックス；ナミルマブ；ナプツモマブエスタフェナトクス；ナルナツマブ；ナタリズマブ；ネバクマブ；ネシツムマブ；ネモリズマブ；ネレリモマブ；ネスバクマブ；ニモツズマブ；ニボルマブ；ノフェツモマブメルペンタン；オビルトキサキシマブ；オビヌツズマブ；オカラツズマブ；オクレリズマブ；オデュリモマブ；オファツムマブ；オララツマブ；オロキズマブ；オマリズマブ；オナルツズマブ；オンツキシズマブ；オピシヌマブ；オポルツズマブモナトックス；オレゴボマブ；オルティクマブ；オテリキシズマブ；オトレルツズマブ；オキシルマブ；オザネズマブ；オゾラリズマブ；パギバキシマブ；パリビズマブ；パニツムマブ；パンコマブ；パノバクマブ；パルサツズマブ；パスコリズマブ；パソツキシズマブ；パテクリズマブ；パトリツマブ；ペムブロリズマブ；ペムツモマブ；ペラキズマブ；ペルツズマブ；ペクセリズマブ；ピジリズマブ；ピナツズマブベドチン；ピンツモマブ；プラツルマブ；ポラツズマブベドチン；ポネズマブ；プリリキシマブ；プリトキサキシマブ；プリツムマブ；キリズマブ；ラコツモマブ；ラドレツマブ；ラフィビルマブ；ラルパンシズマブ；ラムシルマブ；ラニビズマブ；ラキシバクマブ；レファネズマブ；レガビルマブ；レスリズマブ；リロツムマブ；リヌクマブ；リツキシマブ；ロバツムマブ；ロレヅマブ；ロモソズマブ；ロンタリズマブ；ロベリズマブ；ルプリズマブ；サシツズマブゴビテカン；サマリズマブ；サリルマブ；サツモマブペンデチド；セクキヌマブ；セリバンツマブ；セトキサキシマブ；セビルマブ；シブロツズマブ；シファリムマブ；シルツキシマブ；シムツズマブ；シプリズマブ；シルクマブ；ソフィツズマブベドチン；ソラネズマブ；ソリトマブ；ソネプシズマブ；ソンツズマブ；スタムルマブ；スレソマブ；スビズマブ；タバルマブ；タカツズマブテトラキセタン；タドシズマブ；タリズマブ；タネズマブ；タプリツモマブパプトックス；タレクツマブ；テフィバズマブ；テリモマブアリトックス；テナツモマブ；テネリキシマブ；テプリズマブ；テプロツムマブ；テシドルマブ；テツロマブ；チシリムマブ；チガツズマブ；チルドラキズマブ；トシリズマブ；トラリズマブ；トサトクスマブ；トシツモマブ；トベツマブ；トラロキヌマブ；トラスツズマブ；トレガリズマブ；トレメリムマブ；トレボグルマブ；ツコツズマブセルモロイキン；ツビルマブ；ウブリツキシマブ；ウロツプルマブ；ウレルマブ；ウルトキサズマブ；ウステキヌマブ；ヴァンドルツズマブベドチン；バンチクツマブ；バヌシズマブ；バパリキシマブ；バルリルマブ；バテリズマブ；ベドリズマブ；ベルツズマブ；ベパリモマブ；べセンツマブ；ビシリズマブ；ボロシキシマブ；ボルセツズマブマフォドチン；ボツムマブ；ザルツムマブ；ザノリムマブ；ザツキシマブ；ジラリムマブ；ゾリモマブアリトックスが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施例では、治療は免疫療法を含む。例えば、免疫療法は、チェックポイント阻害剤、腫瘍崩壊ウイルス療法、Ｔ細胞療法、及びがんワクチンからなる群から選択される。
一実施例では、免疫療法はチェックポイント阻害剤である。好適なチェックポイント阻害剤としては、例えば、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））が挙げられる。
一実施例では、免疫療法は腫瘍崩壊ウイルス療法である。例えば、腫瘍崩壊ウイルス療法は、タリモジェンラヘルパレプベック（（Ｉｍｌｙｇｉｃ（登録商標））、またはＴ－ＶＥＣである。
一実施例では、免疫療法はＴ細胞療法である。例えば、Ｔ細胞療法はＣＡＲ Ｔ細胞療法である。
一実施例では、免疫療法はがんワクチンである。
腫瘍負荷、進行、再発、及び退行の監視
本開示は、悪性状態を患う対象において、腫瘍負荷を監視する、進行を監視する、再発を監視する、及び／または、腫瘍退行を測定する方法であって、当該方法が、（ｉ）上記対象において活性ＣＸＣＬ１０のレベル、及び、上記対象において全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することと、（ｉｉ）上記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することと、を含む、上記方法もまた提供することが、当業者に明らかとなろう。
本明細書で使用する場合、用語「監視すること」とは、予後、薬物療法への応答、進行中の薬物療法の評価、アウトカムの予測、治療法への応答の測定（合併症の診断を含む）、その後の腫瘍体積の進行を測定すること、または、治療法の恩恵を最も受ける可能性がある患者を選択することを含むことができる。
本明細書で使用する場合、用語「腫瘍負荷」とは、腫瘍細胞の体積を意味し、炎症、壊死、または浮腫などの他の変化を含まない。
本明細書で使用する場合、用語「進行」とは、腫瘍の増殖及び侵襲性の継続を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「退行」とは、腫瘍のサイズまたは体積の減少を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「再発」とは、悪性状態が検出不可能だった期間の後に復元した、または戻った、悪性状態を意味する。
一実施例では、悪性状態を患う対象において、腫瘍負荷を監視する、進行を監視する、再発を監視する、及び／または、腫瘍退行を測定する方法は、当該対象において、１回以上の時点においてＣＸＣＬ１０比率を測定することを含む。例えば、ｍｉＲＮＡの発現度合いは、１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０回の時点で測定される。
一実施例では、ＣＸＣＬ１０比率は、対象から入手した少なくとも１つの生体サンプルで、治療前、治療中、及び／または治療後に測定される。例えば、ＣＸＣＬ１０比率は、治療前の１回以上の時点で測定される。別の実施例では、ＣＸＣＬ１０比率は、治療中の１回以上の時点で測定される。さらなる実施例では、ＣＸＣＬ１０比率は、治療後の１回以上の時点で測定される。別の実施例では、ＣＸＣＬ１０比率は、治療前及び治療中に測定される。さらなる実施例では、ＣＸＣＬ１０比率は、治療前及び治療後に測定される。別の実施例では、ＣＸＣＬ１０比率は治療中及び治療後に測定される。さらなる実施例では、ＣＸＣＬ１０比率は、治療前、治療中、及び治療後に測定される。
一実施例では、方法は、第１の時点における対象でのＣＸＣＬ１０比率を、後の時点における対象でのＣＸＣＬ１０比率と比較することを含む。
本開示より、第１及び後の時点への言及は、定義された、または、特定の時点への言及を行うものではなく、対比目的のためだけのものであることが当業者に明らかとなるであろう。第１、第２（及び、任意のその後の）時点は、対象の悪性状態を監視することが所望される、任意の時点により分離される。本開示の監視方法は、さらなる時点において、さらなるサンプル（例えば、第１及び第２のサンプルに加えて、第３の時点において、第
３のサンプル）を使用し得る。
当業者に明らかとなるとおり、疾患の経過にわたって、本開示のＣＸＣＬ１０比率を監視する能力は、腫瘍負荷及び疾患進行の監視を補助するであろう。
対象において、腫瘍負荷及び疾患進行を監視する方法は、対象において、腫瘍退行及び／または再発を監視するのに有用であることが、当業者に明らかとなろう。
パネル及びキット
本開示は、対象において、悪性状態を検出及び／または診断するためのパネルまたはキットを提供する。本開示は、腫瘍負荷、腫瘍進行、及び／または腫瘍退行を監視するためのパネルまたはキットもまた提供する。本発明のパネルまたはキットは、本明細書に記載する、１つ以上、または両方のＣＸＣＬ１０結合タンパク質を含むのが好ましい。任意選択的に、パネルまたはキットは、本明細書に記載する方法で使用するための取扱説明書を含む。
一実施例では、パネルまたはキットは参照サンプルを含む。
一実施例では、本明細書に記載するパネルまたはキットは、エクスビボ分析用のものである。一実施例では、キットは、全血、血漿、頸腟（ＣＶＳ）スワブ、及び／または血清サンプルと共に使用するのに好適である。
一実施例では、本明細書に記載するパネルまたはキットは、ハイスループットスクリーニングに好適である。用語「ハイスループットスクリーニング」とは、一度に２つ以上のサンプルを試験または評価するために使用可能であり、複数のサンプルを試験するために時間を少なくすることができるスクリーニング法を意味する。一実施例では、方法は、一度に少なくとも５個のサンプル、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも７０個、少なくとも９０個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも３００個のサンプルを試験または評価するのに好適である。このようなハイスループットスクリーニング法は、２つ以上のサンプルを速やかに、例えば、少なくとも３０分以内に、少なくとも１時間以内に、少なくとも２時間以内に、少なくとも３時間以内に、少なくとも４時間以内に、少なくとも５時間以内に、少なくとも６時間以内に、少なくとも７時間以内に、少なくとも８時間以内に、少なくとも９時間以内に、または少なくとも１０時間以内に分析することができる。ハイスループットスクリーニングは、液体処理デバイスの使用もまた伴うことができる。一実施例では、ハイスループット分析は自動化することができる。
本開示は以下の非限定的実施例を含む。
実施例１：材料及び方法
試薬
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌの９６ウェル固体プレートを、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入した。ＴＭＢ色素原溶液を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ＵＳＡ）から購入した。組み換えヒトＣＸＣＬ１０タンパク質（免疫化及びアッセイ標準に使用）を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（香港）から購入した（配列番号２）。ＣＸＣＬ１０の活性または切断Ｎ末端のいずれかを含む短鎖ペプチドを、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により合成した。ビオチン（Ａ型）高速コンジュゲーションキット、抗ＩＰ－１０抗体、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ、抗ヒトＩＰ－１０ ＥＬＩＳＡキット、ヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶ ＥＬＩＳＡキット、及び、活性ペプチジ
ルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）カクテルを、Ａｂｃａｍ（ＵＫ）から購入した。他の試薬は全て、分析グレードのものであった。
臨床サンプル
臨床サンプルは、卵巣癌研究基金組織バンク（Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ）に保管された、アーカイブサンプルから入手し、２００７～２０１４年の間に、婦人性悪性腫瘍が疑われるために手術を受けている女性から、将来を見越して収集した。サンプルは全て、以前に外科治療を受けていない、麻酔を打った、化学療法を受けていない患者から入手した。
腫瘍の種類、ステージ、及びグレード、手術前のＣＡ１２５測定値、年齢、閉経状態、以前から存在する病状、ならびに、悪性腫瘍のあらゆる以前の病歴の組織学的評価を、匿名化した患者の診療記録から入手した。サンプルでの血清ＣＡ１２５の測定を、Ｍｏｎａｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａの診断病理学ラボで行った。倫理的認可は、南半球健康ヒト研究倫理学委員会（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＨＲＥＣ認可番号＃０６０３２Ｃ、＃０２０３１Ｂ）から入手し、参加者全員に、以前の署名済みインフォームドコンセントを渡した。
患者サンプルを、病状；良性及び悪性に従い、２つの群に分けた。
変動性に関する四分位数間領域（ＩＱＲ）を有する中央ＣＡ１２５測定を、各群で測定する。
良性及び悪性群の両方で、閉経前及び閉経後の女性（即ち、混合）が関与した。
本研究で試験したサンプルの種類は、腹水、血漿、頸腟スワブ（ＣＶＳ）であり、表３に詳述する。
Figure 2023508023000003
ヒトＣＸＣＬ１０に対するモノクローナル抗体の生成
Ｍｏｎａｓｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙで、完全長の組換えＣＸＣＬ１０タンパク質（配列番号２）に対するモノクローナル抗体を生成した。ヒトＣＸＣＬ１０のインタクトな（ＮＨ２－ＶＰＬＳＲＴＶＲＣＴＣＩＳＩＳＮＱＰＶＮＰＲＳＬＥ－ＣＯＯＨ）（配列番号２５）、または切断（ＮＨ２－ＬＳＲＴＶＲＣＴＣＩＳＩＳＮＱＰＶＮＰＲＳＬＥ－ＣＯＯＨ）（配列番号２６）Ｎ末端を含む短鎖ペプチ を、スクリーニングに使用した。
マウスに、１６ｕｇのアジュバント化Ｓｉｇｍａ ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；Ｓ６３２２）完全長ＣＸＣＬ１０を、隔週で３回の用量で、メチル化ＣｐＧを同時注射して腹腔内播種した。ＥＬＩＳＡにより血清力価を試験し、免疫化の前に収集したナイーブな血清と比較した。最も高い力価を示すマウスを、ハイブリドーマ生成のために選択した。脾細胞を抽出し、ポリエチレングリコールを使用してＳＰ２／０－Ａｇ１４骨髄腫細胞に融合した。得られたハイブリドーマ細胞を、９６ウェル組織培養プレート内のアザセリンヒポキサンチン含有培地で１３日間成長させた。各個別のハイブリドーマ
に対する血清を、完全長タンパク質と、各ペプチド抗原の両方に対する反応性に関して、マイクロアレイによりスクリーニングし、陽性のクローンをＥＬＩＳＡにより再度スクリーニングした。
適切な抗原特異性を示す、最も応答の高いクローンを拡大してサブクローニングし、モノクローナルハイブリドーマ株を確実に誘導した。プロテインＧセファロースを使用して、モノクローナル抗体を上清から精製し、Ｉｇアイソタイプを、市販されているアッセイキットを使用して測定した。対象となる最終のモノクローナルハイブリドーマ株を、８０％コンフルエンスまで増殖させて、凍結防止剤としての１０％ＤＭＳＯを用いて冷凍し、液体Ｎ２に保管した。
表面プラズモン共鳴イメージング
２つのモノクローナル抗体、即ち、完全長のＮ末端がインタクトなＣＸＣＬ１０に特異的なｍＡｂ－ＲＡ２、ならびに、完全長及び切断ＣＸＣＬ１０の両方に特異的なｍＡｂ－ＲＧ２の、両方の形態のＣＸＣＬ１０に対する結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析した。ＧＬＣチップを装着した、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６ ＳＰＲｉバイオセンサー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、実験を行った。チップを０．５％ ＳＤＳ、５０ｍＭ ＮａＯＨ、及び１００ｍＭ ＨＣｌでコンデショニングし、その後、当量の１－エチル－３（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用して、レーンを活性化した。抗体を、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で、５０μｇ／ｍＬの濃度で個別のレーンに固定した後、各レーンを、エタノールアミンを使用して脱活性化した。抗原を各レーンにアプライし、結合をＲＵとして記録した。チャンネルを全て、抗原適用の間で０．８５％ Ｈ３ＰＯ３を使用して再生成した。スポット間、及び対照ＲＵを差し引いて、特異的結合を得た。
ＲＡ２及びＲＧ２モノクローナル抗体のビオチン化
ビオチン化キット（Ａｂｃａｍ；ａｂ２０１７９５）を使用して、ｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２抗体をビオチン化し、これらを、本発明の活性割合試験（ＡＲＴ）で検出抗体として使用し、この実験において、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼを検出試薬として使用した。１０μＬのビオチン修飾試薬を、１００μＬの精製した各モノクローナル抗体（２ｍｇ ｍＬ－１；ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に添加した後、穏やかに混合した。混合物を凍結乾燥ビオチンに直接添加し、穏やかに混合した。これらを１５分間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、１０μＬのビオチンクエンチャー試薬を添加して、２つの抗体のビオチン化を終了した。
活性及び全ＣＸＣＬ１０の定量化
腹水流体及び血漿サンプルを、遠心分離（１８，４００ｘｇ、４℃で２０分）により予めクリアランスし、クリアランスした上清をきれいなチューブに移した。サンプルを、アッセイ緩衝液（０．１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈し（１：５）、アッセイ前に氷上で保持した。ＣＶＳサンプルを３０秒間ボルテックスし、氷浴で１５分間超音波処理した後、さらに３０秒間ボルテックスした。上清を上述のとおりに遠心分離にかけ、アッセイまで氷上で保持した。
ＡＲＴによる評価のために、コーティング緩衝液（１５ｍＭ ＮＡＣＯ３及び３５ｍＭ
ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で調製した抗ヒトＩＰ－１０ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ；＃ａｂ９８０７）を、０．５μｇ ｍＬ－１のコーティング濃度で２時間、室温で、９６ウェルマイクロプレート（ウェルあたり１００μＬ）に固定した。プレートを、２８０μＬの洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏ）で１回洗浄した後、３００μＬのブロック溶液（５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で２時間、室温でインキュベートした。プレートを４回、洗浄液で洗浄した後
、標準（組換えＣＸＣＬ１０（配列番号２）、４８．８ｐｇ ｍＬ－１～２００，０００ｐｇ ｍＬ－１）、またはサンプルを、それぞれのウェル（ウェル当たり１００μＬ）に４通りで添加した。２時間のインキュベーション後、各ウェルを洗浄液中で４回洗浄した。ビオチン化した検出抗体であるｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２（アッセイ緩衝液中に１μｇ ｍＬ－１）を、適切に添加し（ウェルあたり１００μＬ）、１時間室温でインキュベートした。インキュベーション後に、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、その後、希釈（１：１０００）したストレプトアビジンペルオキシダーゼ（１μｇ／ｍＬ／ウェル）を用いて４５分間、室温でインキュベートした。プレートをさらに、洗浄液で４回洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ色素原溶液を各ウェルに添加し、２０分間暗室で、室温でインキュベートした。停止溶液（１Ｍ塩酸、ウェルあたり５０μＬ）を添加して、反応を停止した。Ｇｅｎ５ ｖ３．０８解析ソフトウエアを装着したＣｙｔａｔｉｏｎ ３マルチモードプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を使用して、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。メーカーの指示に従い、比色分析抗ヒトＩＰ－１０ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ＃ａｂ１００５７９）を使用して、ＡＲＴと標準ＥＬＩＳＡ（全ＣＸＣＬ１０のみを検出する）との比較を行った。
ＤＰＰ４の定量化、及び、ＤＰＰ４特異的活性の分析
メーカーの指示に従い、商用抗ヒトＤＰＰ４ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ２２２８７２）を使用して、一致した腹水サンプル（１：４で希釈）の中のＤＰＰ４の量を評価した。Ｃｙｔａｔｉｏｎマルチモードプレートリーダー（上述のもの）を使用して、検出及び濃度分析を行った。ＤＰＰ４濃度に対して非対称シグモイドの、非線形回帰対数曲線を構築し、サンプル中の可溶性ＤＰＰ４を定量化した。
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－７－アミド－４－メチルクマリンヒドロブロミド（Ｈ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ）を、以前に記載されている（Ｓｉｎｎａｔｈｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）ＤＰＰ４基質として使用して、ＤＰＰ４特異的活性（μｍｏｌ／分／ｎｇ ＤＰＰ４）を測定した。３７℃で最大１時間、ヒトタンパク質－アルギニンデイミナーゼ２（ＰＡＤ２）によりインキュベートすることにより、完全長ＣＸＣＬ１０のシトルリン化を行った。時間経過測定のために、インキュベーションの間、アリコートを１５分毎に採取した。次に、時間経過サンプルをＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、以前に記載されている（Ｌｏｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）とおりに、ウエスタンブロッティングにより、ｍＡｂ－ＲＡ２、ｍＡｂ－ＲＧ２、商用抗ＣＸＣＬ１０抗体、及び抗シトルリン抗体でプローブした。
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を使用して統計分析を行い、アッセイデータを全て、適切な正規性に対数変換した。ｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２アッセイに関して、全ＣＸＣＬ１０濃度に対する非対称シグモイドの非線形回帰対数曲線により、ベストフィットラインを測定して、活性な、及び活性または切断ＣＸＣＬ１０をそれぞれ定量化した。アッセイから入手したＣＸＣＬ１０の濃度は、ｐｇ ｍＬ－１である。有意性を、一元ＡＮＯＶＡ及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストホック試験を使用して測定し、スチューデントのｔ検定を使用して、一対比較を行った。有意差のある変動を有する群に関しては、ウェルチの補正を適用した。補正分析には、スピアマンの順位試験を使用した。Ｐ＜０．０５の結果を有意であるとみなした。
実施例２：全ＣＸＣＬ１０から活性を区別する機能アッセイの生成
本発明者らは、Ｎ末端がインタクトな、走化性活性形態のＣＸＣＬ１０と、他の全てのバリアントとを区別することができるモノクローナル抗体を開発した。抗原として完全長ＣＸＣＬ１０タンパク質を使用することで、ハイブリドーマクローンを単離し、ＣＸＣＬ
１０のインタクトな、または切断Ｎ末端のいずれかを表す、（ｉ）完全長ＣＸＣＬ１０タンパク質；及び（ｉｉ）短鎖合成ペプチドに対する反応性をスクリーニングした。クローンｍＡｂ－ＲＡ２により分泌された抗体は、完全長、及びＮ末端がインタクトなＣＸＣＬ１０の両方を認識したが、Ｎ末端が切断された形態は認識しなかった（表４）。クローンｍＡｂ－ＲＧ２により分泌された抗体は、試験したＣＸＣＬ１０の全てのプロテオフォームと反応した。ＳＰＲ分析は、各ケースにおいて、結合親和性をｎＭ～ｐＭ範囲で示した。両方の抗体の可変領域をコードするオープンリーディングフレームを配列決定した。
検出抗体として、ビオチン化ｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２を使用することで、サンドイッチＥＬＩＳＡを構築して、インタクトな、または全ＣＸＣＬ１０を独立して測定した。検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、直線性、アッセイ間及びアッセイ内の精度、ならびにダイナミックレンジを含む特定のパラメーターを評価した（表４）。ｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２はそれぞれ、完全長ＣＸＣＬ１０に対して良好な親和性を示し、０．９９６のＲ２、及び５等級（ＯＯＭ）のダイナミックレンジを有した（図１）。ｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２に対する検出限界は、それぞれ、９５．９ｐｇ ｍＬ－１、及び１１６．３ｐｇ ｍＬ－１であった（表４）。アッセイ間の精度は、単回投与としての１０回の独立して調製した複製物を使用して評価し、アッセイ内の変動は、異なる日に実施した、１０回の個別のアッセイの間で測定した。アッセイ内及びアッセイ間の両方に対する変動係数（ＣＶ）は、各ケースで１０％を下回っており、このことは、良好な再現性及びアッセイの精度を示している（表４）。
Figure 2023508023000004
本発明者らは次に、ＡＲＴを使用して、市販されているＥＬＩＳＡキットと比較しての、ＣＸＣＬ１０の定量的検出を確認しようとした。ＣＸＣＬ１０は、卵巣癌患者由来の腹水流体には十分に存在し、ここでは、ＣＸＣＬ１０は、がん細胞及び特異的Ｔ細胞サブセットの、ＣＸＣＲ３が媒介する移動に関与する（Ｒａｉｎｃｚｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗｉｎｄｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。それ故、本発明者らは、代表的な複雑な生物学的マトリックスとして、卵巣癌患者（ｎ＝２１２）に由来する腹水流体において、ＣＸＣＬ１０検出を評価した。サンプル群では、濃度範囲の相当な変動があった（ＣＶは８８．４％～２２５．１％の範囲）一方で、ＡＲＴと商用ＥＬＩＳＡとにおける全ＣＸＣＬ１０の定量化では、有意差はなかった（図２ａ）。良性及び悪性腹水流体の両方に対して、ＡＲＴと商用ＥＬＩＳＡとにおいて、定量化全ＣＸＣＬ１０に正の相関が観察され、それぞれ、０．３０８４及び０．２５９４のｒ値が得られた（図２ｂ）。
実施例３：ｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２は、機能的ＣＸＣＬ１０を非機能的ＣＸＣＬ１０と区別する
ＣＸＣＬ１０のタンパク質分解Ｎ末端切断に加えて、他の翻訳後修飾が、ＣＸＣＬ１０活性に影響を及ぼす可能性がある（Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。具体的には、ＣＸＣＬ１０のＮ末端領域における、アルギニンのシトルリンへの脱アミノ化（Ｒ５Ｃｉｔ）は、インビボで生じる、確立された機能的修飾であるが故に、ＣＸＣＬ１０機能を評価する任意のアッセイを考慮する必要がある（Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。故に、本発明者らは、Ｒ５Ｃｉｔ修飾が、ｍＡｂ－ＲＡ２またはｍＡｂ－ＲＧ２のいずれかにより、完全長ＣＸＣＬ１０の検出に影響を及ぼし得るか否かを調査した。
組換え・完全長ＣＸＣＬ１０（配列番号２）を、タンパク質－アルギニンデイミナーゼ２（ＰＡＤ２）でインキュベートして、Ｒ５における脱アミノ化を誘導し、タンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離して、ウエスタンブロットにより分析した。インビトロシトルリン化は、ｍＡｂ－ＲＧ２を用いるＣＸＣＬ１０検出（全ＣＸＣＬ１０の検出）に影響を有しなかった。このことは、翻訳後修飾に関係なく、ｍＡｂ－ＲＧ２がＣＸＣＬ１０に結合したことを示唆している（図３ａ）。対照的に、ｍＡｂ－ＲＡ２は、Ｒ５Ｃｉｔ－ＣＸＣＬ１０の、実質的な検出の低下を示し（図３ａ）、このことは、Ｎ末端におけるＲ５Ｃｉｔ修飾の後の、エピトープの修飾と一致している。
Ｒ５Ｃｉｔ－ＣＸＣＬ１０をＥＬＩＳＡにより評価したときに、同様の結果が得られた。シトルリン化は、ｍＡｂ－ＲＡ２の結合を実質的に低下した一方で、ｍＡｂ－ＲＧ２は依然として、Ｒ５Ｃｉｔ－ＣＸＣＬ１０を検出可能であった（図３ｂ）。これらを合わせると、ｍＡｂ－ＲＡ２及びｍＡｂ－ＲＧ２を使用して、活性ＣＸＣＬ１０を全ＣＸＣＬ１０から効率的に区別可能であることをデータは示す。
実施例４：活性割合試験は、悪性卵巣癌サンプルから良性卵巣癌サンプルを区別する
本発明者らは、良性または悪性卵巣腫瘍のいずれかを有する患者から収集した腹水流体にて、活性ＣＸＣＬ１０濃度と全ＣＸＣＬ１０濃度を測定した（図３）。全ＣＸＣＬ１０を、良性（１６０．８ ± ３６２．０ｐｇ ｍＬ－１）腹水流体と比較して、悪性（８５３．１ ± １５７４．０ｐｇ ｍＬ－１）で評価した（図４ｂ）。同様に、広範囲での活性ＣＸＣＬ１０測定値もまた、観察された（それぞれ、２４０．４ ± ４１０．５ｐｇ ｍＬ－１及び８１８．６ ± １０９８．０ｐｇ ｍＬ－１）（図４ａ）。集団内での、この広い偏差（ＣＶ％が、１３４．１～２２５．１％の間の範囲にある）により、良性サンプルと悪性サンプルの区別に対しての感度の低さがもたらされ（表５）、診断または予後目的での直接ＣＸＣＬ１０測定と関連する困難さが強調される。
比例してより高いレベルの活性ＣＸＣＬ１０が、良性ｖｓ悪性サンプルで観察されたため、各サンプル中での、機能的：全ＣＸＣＬ１０の比率を、患者間でのＣＸＣＬ１０機能を正規化するためのメカニズムとして調査した（図４ｃ）。この「活性割合」測定は、群間での分離を著しく改善し、それぞれ、９０％及び９５％の特異度において、＜１．４３及び＜１．２５のカットオフ値で、良性サンプルと悪性サンプルの区別をもたらした（表５）。この関係は、悪性サンプルを疾患のステージ（ＦＩＧＯステージＩ ｖｓ ステージＩＩＩ、図４ｄ）に従って分離した際にもまた、有効であった。血漿ＣＡ１２５は、悪性ｖｓ良性疾患を有する患者にて有意に評価された（図５ｃ）が、腹水流体と血漿ＣＡ１２５レベルとで測定した活性割合の間では、明らかな相関は存在しなかった（図６ａ）。したがって、活性割合は、血漿ＣＡ１２５濃度とは無関係に、悪性マーカーをもたらす。
実施例５：ＤＰＰ４の量及び活性は、機能的ＣＸＣＬ１０と相関しない
ＤＰＰ４は、ＣＸＣＬ１０のＮ末端からの、Ｖａｌ－Ｐｒｏ、またはＡｌａ－Ｐｒｏジペプチドの除去を触媒し、これを、Ｔ細胞動員のアンタゴニストに転換する。それ故、以
前の研究では、生物学的流体内での、ＤＰＰ４切断ＣＸＣＬ１０のレベルを、疾患の指標として定量化しようとしていた（Ｃａｓｒｏｕｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ ａｎｄ ２０１２）。しかし、ＣＸＣＬ１０への複数の修飾－タンパク質分解及び非タンパク質分解の両方－は、ＤＰＰ４が触媒する単純なＮ末端処理を超えて、ＣＸＣＬ１０バリアントの拡大したレパートリーをもたらすことができる（Ｌｏｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。したがって、これらの複数のバリアントを考慮しないことは、臨床サンプルにおけるＣＸＣＬ１０の、測定量と総量の不一致をもたらし、機能的状態のＣＸＣＬ１０を十分に捕捉しない（Ｃａｓｒｏｕｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
Figure 2023508023000005
Figure 2023508023000006
臨床サンプルにおける、ＤＰＰ４活性とＣＸＣＬ１０機能の関係を明らかにするために、同じセットの良性及び悪性腹水において、ＤＰＰ４の量及び特異的活性を測定した。
患者のサンプルの結果に基づいて、まず、各マーカー（活性割合、ＤＰＰ４、ＣＡ１２５）の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を構築し、曲線下面積（ＡＵＣ）を入手した。組み合わせたＲＯＣを入手して、２元ロジスティック回帰を実施した。良性及び悪性群の両方に対する従属変数として、各マーカーの測定値を使用して、試験変数としての確率を入手し、これをその後使用して、組み合わせたＲＯＣを構築した。
いずれかのケースにおいて、量または活性の有意差は観察されなかった（図５ａ及び図５ｂ）。ＤＰＰ４の量は、悪性サンプルにおいては計算した活性割合と相関した（ｐ＝０．００２）が、ＤＰＰ４の特異的活性は相関しなかった。興味深いことに、良性サンプルは、特異的活性と活性割合測定値の相関を示唆する逆（有意でない）トレンドを示した（図６ｂ及び図６ｃ）。ＤＰＰ４活性は、非悪性疾患におけるＣＸＣＬ１０機能と関係し得る一方で、ＣＸＣＬ１０バリアントは、悪性腫瘍におけるＣＸＣＬ１０の機能状態全体を測定するのに、重要である可能性が高いことを、これらのデータは示唆する。
実施例６：活性割合は、良性疾患と悪性疾患の予後区別をもたらす
活性割合が有用な臨床情報をもたらすことができるか否かを評価するために、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して、腹水流体における活性割合の性能を評価した（図７）。活性割合は、活性または全ＣＸＣＬ１０のみのいずれかの測定と比較して、高いＡＵＣ、及び、感度／特異度の実質的な改善を実現し（図７ａ；表３）、これらの単一の測定における、実用性の向上を強調している。感度、特異度、及び活性割合の予測値もまた、血漿ＣＡ１２５より高かった（図７ｂ；表３）。活性割合もまた、ＤＰＰ４、ＣＡ１２５、またはＣＸＣＬ１０（活性もしくは全て）のいずれかの測定値のみよりも大きな効果量を実現した（Ｃｏｈｅｎ’ｓ ｄ）（表４）。したがって、活性割合、ＤＰＰ４、及び血漿ＣＡ１２５測定を組み合わせることにより、良性疾患と悪性疾患を区別するための、良好なＰＰＶ（８７～９４％）及びＮＰＶ（９３～９５％）を有するＡＵＣ＞０．９５が得られた。したがって、ＡＲＴを、ＤＰＰ４及び血漿ＣＡ１２５と組み合わせることにより、腹水流体を示す患者における、良性疾患と悪性疾患の区別における有用性がもたらされた。
Figure 2023508023000007
実施例７：臨床診断としてのＡＲＴ
本発明者らは、生殖器を代表して頸腟スワブ（ＣＶＳ）を使用して、活性割合測定を行うことができるか否かを調査した。
腹水流体での我々の発見と並行して、ＣＶＳ抽出物（ｎ＝５０／群）で実施した活性割合の測定は、良性疾患サンプルと悪性疾患サンプルとの良好な区別を示し、ＡＵＣは０．８であった（ｐ＜０．０００１）（図８ａ；表６）。一致した血漿サンプル（ｎ＝３０）において、ＡＲＴもまた、群間の区別を行うことが可能であった（ＡＵＣ ０．８、ｐ＜０．００１）。
本発明者らは、各バイオマーカー及びサンプル種に対しての効果量（Ｃｏｈｅｎ’ｓ ｄ）もまた調査した（表６）。血漿ＣＡ１２５の測定値は、０．８３のＡＵＣに戻り、これは、腹水流体におけるＡＲＴ測定値に次いで２番目であった（ＡＵＣ ０．８６）。しかし、効果量は「中程度」であった（Ｃｏｈｅｎ’ｓ ｄ＝０．６２）。対照的に、ＡＲＴの測定値は、腹水流体及びＣＶＳにおいて「大きな」効果量を実現し（それぞれ、Ｃｏｈｅｎ’ｓ ｄ＝０．８６及び１．０）、このことは、同じ集団において、偏差が大きく減ったことを示唆している。同様に、血漿で行ったＡＲＴ測定も、Ｃｏｈｅｎ’ｓ ｄ＝
０．７９に戻った（表６）。
ＡＲＴは、統計的にロバストな測定を実現するための好ましいバイオマーカーであり、ＣＶＳを用いてＡＲＴを分析することにより、ロバストで臨床的に有用な測定値をもたらし、悪性疾患と非悪性疾患とを区別することができることを、この結果は示す。
実施例８：ＡＲＴは良性または悪性卵巣腫瘍を有する患者から、がんでない患者を区別する
ＡＲＴを適用して、新しい患者コホート（即ち、予防のために集められたコホート）－予防のための、リスクを減らす卵管卵巣摘除を受け、ＢｒＣＡ１／２の変異を有するか、あるいは、乳及び／または卵巣癌の強力な家族歴を有するかのいずれかである患者を試験した。したがって、これらの患者は、早期卵巣癌の存在を検出するために設計された、ＡＲＴの認証のための、理想的な非対照コホートを示す。
活性ＣＸＣＬ１０の濃度は、健常な女性における全ＣＸＣＬ１０よりも著しく高く（図９ａ）、このことは、がんではない患者が、高レベルの活性で機能的なＣＸＣＬ１０を有し得ることを示唆している。予防のために集められたコホートにおける、健常な女性での全体の活性及び全ＣＸＣＬ１０濃度を、良性及び悪性のそれぞれのＣＸＣＬ１０濃度と比較したときに、これらの濃度は、良性及び悪性の両方よりも著しく低かった（図９ｂ）。活性割合に関して、健常な女性における活性割合は、血漿及びＣＶＳの両方において、良性及び悪性群よりも有意に低かった（図９ｃ及びｄ）。
健常な女性における、活性ＣＸＣＬ１０及び活性割合のレベルが、それぞれ、良性及び悪性患者の全ＣＸＣＬ１０及び活性割合よりも有意に高いことを考慮すると、良性状態または悪性卵巣腫瘍を有しない患者における、ＤＰＰ４が開始する機能的ＣＸＣＬ１０の切断の度合いは低い可能性があることを、データは示唆している。
実施例９：ＤＰＰ４の量及び活性は、活性割合と相関しない
予防のために集められたコホートにおける、ＤＰＰ４とＣＸＣＬ１０の関係を確立するために、血漿サンプルにおけるＤＰＰ４の量及びその特異的活性を測定し、良性または悪性卵巣癌を有する患者の結果と比較した。
健常な患者の血漿サンプル中でのＤＰＰ４のレベルは、良性及び悪性患者群の両方よりも、有意に高かった。しかし、ＤＰＰ４の量は、健常な女性サンプルにおいて計算した活性割合と相関しなかった（図１０ａ）。健常な女性におけるＤＰＰ４の量は、良性及び悪性患者群よりも有意に高かったものの、健常な女性の血漿中でのその特異的活性は、良性及び悪性の両方で有意に低かった（図１０ｂ）。特異的活性は、計算した活性割合のいずれとも相関しなかった。健常な女性におけるＤＰＰ４の機能は、未知の因子により抑制される可能性があることを、これらのデータは示唆する。
実施例１０：ＣＶＳは、健常な患者を、良性または悪性卵巣腫瘍を有する患者と区別する
ＣＶＳは、バイオマーカーベースの試験のための最適なサンプルであるため、予防のために集められたコホートのＣＶＳにおける、活性及び全ＣＸＣＬ１０濃度のレベルを測定して、活性割合を入手した。さらに、予防のために集められたコホートにおける健常な患者と、良性または悪性卵巣腫瘍を有する患者との、活性割合の比較を行った。
健常な女性に関しては、活性、機能的ＣＸＣＬ１０の全体のレベルが、全ＣＸＣＬ１０よりも有意に高かった（図１１ａ）。良性または悪性卵巣腫瘍を有する患者とは対照的に、健常な患者のＣＶＳの、計算した活性割合は、血漿の結果と一致し、健常な女性由来の
サンプルにおける全体の活性割合は、良性及び悪性患者群の両方よりも有意に高かった（図１１ｂ）。
実施例１１：ＣＶＳのＤＰＰ４量と、ＣＶＳの活性割合との相関
ＣＶＳ由来の抽出物の量が限られていたため、ＣＶＳにおけるＤＰＰ４の量は、Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｂａｎｋが関与する以前の研究では測定されなかった。同じサンプル源に由来する、活性割合及びＤＰＰ４の量の両方を測定し、同じサンプルの種類における相関を確立するのが望ましいため、ＣＶＳの調製を、ＣＶＳの活性割合及びＤＰＰ４の両方を測定し、これらを相関させるように最適化した。図１２に示すように、ＣＶＳのＤＰＰ４を定量化することができ、計算した活性割合はＤＰＰ４と逆相関した（ｐ＝０．００９４）。活性割合がＣＶＳのＤＰＰ４と相関する可能性ことを、このデータは示唆する。
実施例１２：活性割合及び血漿ＣＡ１２５
健常な女性のＣＡ１２５測定値は、良性及び悪性群の両方よりも有意に低かった。このデータは、ＣＡ１２５のレベルが、悪性疾患を有する患者において増加するという事実に一致する（図１３）。計算した活性割合は、ＣＡ１２５と正に相関する（ｐ＝０．００１５）。
実施例１３：活性割合及び血漿ＣＡ１２５
活性割合が有用な臨床情報をもたらすことができるか否かを評価するために、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して、血漿及びＣＶＳにおけるその性能を評価した。予防のために集められたコホートにおける健常な女性と、悪性卵巣腫瘍を有する患者との比較に基づき、ＲＯＣ曲線を構築した。
以前の腹水研究においては、活性割合は、活性または全ＣＸＣＬ１０のいずれかのみの定量化と比較して、感度／特異度の実質的な改善を実現したため、血漿及びＣＶＳの活性割合を組み合わせることもまた、高いＡＵＣを実現した（図１４ａ）。これは、両方のサンプルの種類を使用することで、ＡＲＴの予後有効性が増加することを実証する。健常な女性と悪性疾患との区別に関して、血漿、ＤＰＰ４、及び血漿ＣＡ１２５測定の活性割合を組み合わせることで、ＡＵＣ＞０．９８が得られた（図１４ｂ）一方で、ＣＶＳ、ＤＰＰ４、及び血漿ＣＡ１２５の活性割合を組み合わせることで、ＡＵＣ＞０．９９が得られた。２つのサンプルの種類を組み合わせると共に、ＤＰＰ４及び血漿ＣＡ１２５の活性割合を組み合わせることが、健常な女性と悪性疾患との区別に有用であることが証明されることを、これらのデータは示唆する。
実施例１４：ＡＲＴは、悪性腫瘍を有する患者を、複雑なバックグラウンドと区別する
ＡＲＴが、悪性腫瘍を、多様なバックグラウンドと識別する予後能力を調査するため、健常及び良性コホートの女性を組み合わせて、悪性群に対してＲＯＣ分析を行った。血漿サンプルに適用したときは、ＡＲＴのみが０．７９のＡＵＣに戻り、ＣＶＳサンプルに適用したときは、０．７２のＡＵＣに戻った。比較によって、ＣＡ１２５が０．９３のＡＵＣを実現した（図１５Ａ）。しかし、ＣＡ１２５は、コホート内で高い変動（ＣＶ １８９．５％）及び小さな効果量（Ｃｏｈｅｎ’ｓ ｄ ０．０９７）を示し、このことは、健常＋良性コホートの組み合わせから悪性サンプルを区別するための、ロバストな測定ではなかったことを示唆する（表７）。
対照的に、活性割合の測定は、ＣＶＦＳ（ｄ＝０．６４）及び血漿（ｄ＝１．０１）の両方において大きな効果量を有し、このことは、同じ集団において、偏差が大きく減ったことを示唆している（表７）。ＡＲＴは、統計的にロバストな測定を実現することができ、健常な女性、または良性疾患を有する患者の複雑なバックグラウンドに対して、悪性卵
巣癌を区別するための、現在のＣＡ１２５判断基準のパフォーマンスを上回ることができることを、この結果は示唆している。
Figure 2023508023000008
ＡＲＴ（ＣＶＳ及び／または血漿）、ＤＰＰ４、ならびにＣＡ１２５の組み合わせもまた、群間の区別を改善するためのメカニズムとして調査した。ＣＡ１２５（ＡＵＣ ０．９４）と比較して、ＣＶＳを使用して測定した、血漿で測定した他の全てのマーカーとのＡＲＴの組み合わせは、０．９８のＡＵＣに戻った（表８）。
全てのバイオマーカー（ＡＲＴ、ＤＰＰ４、及びＣＡ１２５）の組み合わせは、０．９８のＡＵＣを実現し、本コホート内での悪性腫瘍の検出のための感度は９３．１％であった（表８）。対照的に、ＣＡ１２５のみは、０．９４のＡＵＣを示したが、わずか７８．６％の感度を示した（表８）。
Figure 2023508023000009
したがって、ＡＲＴ、ＤＰＰ４、及びＣＡ１２５の組み合わせは、健常な女性及び良性疾患を有する女性で構成される複雑なバックグラウンドから悪性腫瘍を区別し、現在の臨床判断基準である、ＣＡ１２５のみが有意にパフォーマンスが上回っていた。
実施例１５：ＡＲＴは、早期（ステージＩ）がん患者の識別を改善する
診断時のがんのステージは、卵巣癌患者に対する臨床的アウトカムと強力に関連している。具体的には、ＦＩＧＯステージＩの疾患（「早期」）と診断された患者は、ステージＩＩＩ～ＩＶ（＜４０％）と診断された患者と比較して、５年及び全体の生残割合が実質的に改善された（約９５％）。したがって、ＡＲＴ（単独、または組み合わせ）が、健常な女性、または良性疾患を有する女性のいずれかから、早期のがん患者を上手く区別することができるか否かを評価した。
ＣＡ１２５は、早期がん患者と、良性疾患を有する患者または健常な女性とにおいて、最も高い、単一マーカー区別をもたらした（表９）。しかし、ＡＲＴ（血漿）をＤＰＰ４及びＣＡ１２５と組み合わせることにより、実質的に、良性と早期悪性腫瘍との区別が改善された（ＡＵＣ ０．７５ｖｓ０．６３；表９）。
著しいことに、ＣＡ１２５単独（ＡＵＣ ０．８８；感度８１．８％）と比較して、３つのマーカーの組み合わせ（ＡＵＣ＝０．９９；感度９５．４％）を使用することで、早期の悪性腫瘍を有する患者は、高い精度で、健常な女性から区別することができた。
したがって、ＡＲＴを使用して、現在のＣＡ１２５判断基準と比較して、特に、早期がんと関連する疾患特異的な変化の検出に関して、患者の診断または予後評価を改善することができた。
Figure 2023508023000010
実施例１６：ＡＲＴパネルと、マルチプレックスの５つのマーカーパネルとの組み合わせにより、予想のために集められたコホートにおける前がん性病変を有する患者が識別される
卵巣癌の病院は不明瞭なままであるが、多くの卵巣腫瘍の形成により、卵管に前がん性の「ｐ５３シグネチャー」が存在し始めることが明らかとなっている。他の種類のがんと同様に、非常に初期、即ち、前がん性のステージにおける病変の検出により、実質的に改善されたアウトカムが可能となる。
本発明者らは以前に、ハイグレードの上皮卵巣癌を診断プロファイリングするための、関連するいくつかの追加のバイオマーカー（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＨＥ４、ＩＬ８）を同定している（ＰＭＩＤ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－５９００９－ｚ）。したがって、これらの、ＡＲＴ、ＤＰＰ４、及びＣＡ１２５の既存のパネルとの組み合わせにおける、潜在的に改善された診断パフォーマンスを評価した。
これらの研究に関して、マーカーの組み合わせを、予想のために集められた、卵巣癌が進行する既知の遺伝的リスクに対する、予防的なリスク軽減手術（典型的には、両方の卵
管卵巣摘出術）を受けた女性のコホートにおいて評価した。組織学評価を使用して、全ての患者を、「健常」（即ち、疾患がないことを確認）または「がん」（ｐ５３病変もしくは早期の潜在的腫瘍が存在）のいずれかとして明らかにした。
結果を表１０に示す（最もパフォーマンスの良い組み合わせのみを示す）。早期／前がん性病変の検出に関して、５つのマーカーパネルが、０．８７の組み合わせＡＵＣに戻った。一方で、確立されたＡＲＴパネルは、０．９７のＡＵＣを実現した（表１０）。これらは、ＣＡ１２５よりも実質的に良好で、０．７７のＡＵＣに戻った。
しかし、著しいことに、両方のパネルを組み合わせたときに、１．０の完璧なＡＵＣが実現し、このことは、マーカーのこの特定の組み合わせが、卵巣の初期段階及び前がん性病変の診断に関して、高い可能性を有することを示している。

Figure 2023508023000011
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Claims (41)

  1. Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）結合タンパク質であって、前記結合タンパク質が、完全長ヒトＣＸＣＬ１０、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０、及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０に結合する、前記結合タンパク質。
  2. 完全長ヒトＣＸＣＬ１０、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０、及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０のエピトープＮＨ２－ＬＳＲＴＶＲＣＴＣＩＳＩＳＮＱＰＶＮＰＲＳＬＥ－ＣＯＯＨ（配列番号２６）に結合する、請求項１に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  3. 前記結合タンパク質が、
    （ｉ）５０ｎＭ以下のＫＤで完全長ヒトＣＸＣＬ１０に結合する、及び／または
    （ｉｉ）５ｎｍ以下のＫＤでＮ末端切断ヒトＣＸＣＬ１０に結合する、
    請求項１または請求項２に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  4. Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）結合タンパク質であって、前記結合タンパク質が、５０ｎＭ以下のＫＤで完全長ヒトＣＸＣＬ１０に結合するが、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０には結合しない、前記結合タンパク質。
  5. 完全長ヒトＣＸＣＬ１０に結合するために、エピトープＮＨ２－ＶＰＬＳＲＴＶＲＣＴＣＩＳＩＳＮＱＰＶＮＰＲＳＬＥ－ＣＯＯＨ（配列番号２５）のＮ末端バリン及び／またはプロリンを必要とする、請求項４に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  6. 前記結合タンパク質が、可変領域または抗原結合ドメインを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  7. 前記結合タンパク質が、
    （ｉ）Ｆｖ；
    （ｉｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
    （ｉｉｉ）二量体ｓｃＦ（ジｓｃＦｖ）；
    （ｉｖ）単一ドメイン抗体；
    （ｖ）ミニボディ；
    （ｖｉ）ダイアボディ；
    （ｖｉｉ）トリアボディ；
    （ｖｉｉｉ）テトラボディ；
    （ｉｘ）Ｆａｂ；
    （ｘ）Ｆ（ａｂ’）２；
    （ｘｉ）抗体；
    （ｘｉｉ）抗体ミメティック；
    （ｘｉｉｉ）重鎖のみの免疫グロブリン；
    （ｘｉｖ）Ｔ細胞受容体；
    （ｘｖ）アドネクチン；
    （ｘｖｉ）アンチカリン；
    （ｘｖｉｉ）アフィボディ；
    （ｘｖｉｉｉ）アビマー；
    （ｘｉｘ）設計型アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；あるいは
    （ｘｘ）抗体、Ｆｃの定常領域に結合した（ｉ）～（ｘｉｘ）のうちの１つ、あるいは、重鎖定常領域（ＣＨ２）及び／またはＣＨ３
    からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＸＣＬ１０結合タン
    パク質。
  8. 前記結合タンパク質が、抗体またはその抗原結合断片の、
    （ｉ）配列番号３に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び／または
    （ｉｉ）配列番号１１に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２に記載するアミノ酸配列を含むＶＬ
    を含むＣＸＣＬ１０への結合を競合的に阻害する、請求項１～７のいずれか１項に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  9. 前記結合タンパク質が、
    （ｉ）配列番号３に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＨ、及び、配列番号４に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＬ；または
    （ｉｉ）配列番号１１に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＨ、及び、配列番号１２に記載する配列に少なくとも９０％同一である配列を含むＶＬ
    を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  10. 前記結合タンパク質が、
    （ｉ）配列番号３に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４に記載するアミノ酸配列を含むＶＬ；または
    （ｉｉ）配列番号１１に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２に記載するアミノ酸配列を含むＶＬ
    を含む、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１～９のいずれか１項に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  11. 前記結合タンパク質が、
    （ｉ）ＶＨであって、
    ａ）配列番号３のアミノ酸２５～３４に記載する配列を含むＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号３のアミノ酸４９～６５に記載する配列を含むＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号３のアミノ酸９８～１０８に記載する配列を含むＣＤＲ３と、を含む前記ＶＨ、及び
    ＶＬであって、
    ａ）配列番号４のアミノ酸２３～３３に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号４のアミノ酸４９～５５に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号４のアミノ酸８８～９６に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含む前記ＶＬ、または
    （ｉｉ）ＶＨであって、
    ａ）配列番号１１のアミノ酸２５～３４に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号１１のアミノ酸４９～６５に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号１１のアミノ酸９８～１０８に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含む前記ＶＨ、及び
    ＶＬであって、
    ａ）配列番号１２のアミノ酸２３～３３に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号１２のアミノ酸４９～５５に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号１２のアミノ酸８８～９６に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含む前記ＶＬ
    を含む、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１～９のいずれか１項に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  12. 前記結合タンパク質が、
    （ｉ）ＶＨであって、
    ａ）配列番号５に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号６に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含む前記ＶＨ、及び
    ＶＬであって、
    ａ）配列番号８に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号９に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号１０に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含む前記ＶＬ、または
    （ｉｉ）ＶＨであって、
    ａ）配列番号１３に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号１４に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号１５に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含む前記ＶＨ、及び
    ＶＬであって、
    ａ）配列番号１６に記載の配列を含むＣＤＲ１と、
    ｂ）配列番号１７に記載の配列を含むＣＤＲ２と、
    ｃ）配列番号１８に記載の配列を含むＣＤＲ３と、を含む前記ＶＬ
    を含む、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  13. 前記結合タンパク質が検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の結合タンパク質と、担体とを含む組成物。
  15. 請求項１～１３のいずれか１項に記載のＣＸＣＬ１０結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  16. 請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  17. インビトロで請求項１６に記載の発現ベクターを含む細胞。
  18. ＣＸＣＬ１０結合タンパク質を調製するための、請求項１７に記載の細胞の使用。
  19. 請求項１７に記載の細胞を培養し、前記細胞から前記ＣＸＣＬ１０結合タンパク質を産生することと、任意選択的に、前記産生した結合タンパク質を単離して精製することと、を含む、請求項１８に記載の使用。
  20. 対象における悪性状態を検出及び／または診断する方法であって、前記方法が、
    （ｉ）前記対象において活性ＣＸＣＬ１０のレベル、及び、前記対象において全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することと、
    （ｉｉ）前記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することと、
    を含む、前記方法。
  21. 活性ＣＸＣＬ１０及び全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することが、前記対象における、活性ＣＸＣＬ１０タンパク質の量、及び全ＣＸＣＬ１０タンパク質の量を測定することを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記方法が、前記対象におけるＣＸＣＬ１０の比率を、少なくとも１つの参照におけるＣＸＣＬ１０比率と比較することをさらに含む、請求項２０または請求項２１に記載の方
    法。
  23. 前記方法が、
    ａ）前記対象における前記ＣＸＣＬ１０比率が、前記参照における前記ＣＸＣＬ１０比率よりも高いか否かを測定すること、または
    ｂ）前記対象における前記ＣＸＣＬ１０比率が、前記参照における前記ＣＸＣＬ１０比率よりも低いか否かを測定すること
    を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. （ｉ）前記参照における前記ＣＸＣＬ１０比率と比較して、前記対象における前記ＣＸＣＬ１０比率が低いことが、悪性状態を示す、または
    （ｉｉ）前記参照における前記ＣＸＣＬ１０比率と比較して、前記対象における前記ＣＸＣＬ１０比率が高いことが、良性状態を示す、
    請求項２３に記載の方法。
  25. 前記方法が、
    （ｉ）完全長ヒトＣＸＣＬ１０及びＮ末端切断ＣＸＣＬ１０及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０に特異的に結合するＣＸＣＬ１０結合タンパク質を使用して、前記対象における全ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することと、
    （ｉｉ）完全長ヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合するが、Ｎ末端切断ＣＸＣＬ１０及びシトルリン化ＣＸＣＬ１０に結合しないＣＸＣＬ１０結合タンパク質を使用して、前記対象における活性ＣＸＣＬ１０のレベルを測定することと、
    を含む、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記方法が、請求項１～１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＣＸＣＬ１０結合タンパク質を使用することを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. （ｉ）前記対象における全ＣＸＣＬ１０のレベルが、配列番号１１に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１２に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片を使用して測定される、及び／または
    （ｉｉ）前記対象における活性ＣＸＣＬ１０のレベルが、配列番号３に記載するアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４に記載するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片を使用して測定される、
    請求項２０～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記ＣＸＣＬ１０結合タンパク質のうちの１つ以上が、検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記検出可能な標識が、放射能標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、補欠分子族、及び造影剤からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記方法が、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、またはウエスタンブロットを行うことを含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記方法が、前記対象から入手した少なくとも１つの生体サンプルで行われる、請求項２０～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記生体サンプルが生検、流体サンプル、血漿サンプル、または細胞スワブである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記悪性状態が生殖癌である、請求項２０～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記生殖癌が卵巣癌である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記方法が、前記対象において、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）及び／またはがん抗原１２５（ＣＡ－１２５）を測定することをさらに含む、請求項２０～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記方法が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦ－ＲＩＩ）、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、及びインターロイキン８（ＩＬ－８）のうちの１つ以上、または全てのレベルを測定することをさらに含む、請求項２０～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 悪性状態を患う対象における、腫瘍負荷を監視する方法であって、前記方法が、１つ以上の時点において、前記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することを含む、前記方法。
  38. 対象における悪性状態の進行を監視する方法であって、前記方法が、１つ以上の時点において、前記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することを含む、前記方法。
  39. 悪性状態を患う対象における、腫瘍退行を測定する方法であって、前記方法が、１つ以上の時点において、前記対象における、全ＣＸＣＬ１０に対する活性ＣＸＬＣ１０のＣＸＣＬ１０比率を測定することを含む、前記方法。
  40. 対象における悪性状態の治療方法であって、前記方法が、請求項２０～３６のいずれか１項に記載の、前記対象において前記悪性状態を検出及び／または診断することと、前記対象に治療を投与することと、を含む、前記方法。
  41. 対象における状態を検出及び／または診断する方法であって、前記方法が、請求項１～１３のいずれか１項に記載の、少なくとも１つのＣＸＣＬ１０結合タンパク質を使用して、前記対象においてＣＸＣＬ１０のレベルを測定することを含む、前記方法。
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