CN114369171B - 一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体及其效应细胞和在治疗卵巢癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及嵌合抗原受体修饰免疫细胞疗法技术领域，具体涉及一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体及其效应细胞和在治疗卵巢癌中的应用。融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体，其编码核苷酸序列包括CXCR3基因序列、编码αFR的抗体的基因序列和编码CAR的基因序列。本技术方案通过将CXCR3和整合有αFR抗体的嵌合抗原受体结合，可以解决现有技术的CAR‑NK细胞的卵巢癌趋向性和治疗效果有限的技术问题。本技术方案可以使CAR‑NK细胞具有更强的卵巢癌趋向性以及杀伤作用，一定程度上缓解CAR‑NK细胞治疗卵巢癌时转运障碍的难题，并同时提高卵巢癌免疫治疗疗效，具有广阔的应用前景。

Description

一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体及其效应细胞和在治疗卵巢癌中的应用

技术领域

本发明涉及嵌合抗原受体修饰免疫细胞疗法技术领域，具体涉及一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体及其效应细胞和在治疗卵巢癌中的应用。

背景技术

卵巢癌是威胁全球女性健康的三大恶性肿瘤之一。由于卵巢癌发病隐匿，早期缺乏特异的症状和有效的发现策略，约70％卵巢癌患者就诊时已处于晚期，晚期卵巢癌预后极差，5年生存率小于25％。研究表明，在卵巢癌免疫抑制性肿瘤微环境(Tumor immunemicroenvironment，TME)中存在T细胞和自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)浸润，肿瘤浸润性免疫细胞情况直接影响卵巢癌患者预后。在癌症免疫治疗中，利用基因改造技术发展而来的嵌合抗原受体修饰T细胞即CAR-T治疗技术发展尤其迅猛。第一代CAR-T细胞仅包含单一的CD3ζ信号传递结构域，CAR-T细胞难以完全激活，故其通常表现为失能或扩增不良。第二、三代CAR-T细胞则分别包括一种或两种共刺激分子的信号传递结构域，标志着CAR-T细胞拥有更强的细胞因子分泌水平、扩增能力和细胞杀伤活性。CAR-T细胞疗法已在血液系统恶性肿瘤中取得了令人瞩目的成就。特别是靶向CD19的CAR-T细胞在急性淋巴母细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者中的缓解率达到了70-90％。然而在实体瘤病例中，由于其特殊病理生理特征，包括靶抗原的异质性、TME固有的负性调节机制、CAR免疫细胞运输障碍等，均导致CAR免疫细胞疗法应用于非血液系统恶性肿瘤存在一定的限制。相较于CAR-T，选择脱靶毒性更低的免疫细胞如NK，以及优化CAR免疫细胞转运到肿瘤部位的策略可能会提高CAR细胞治疗实体瘤的疗效。

CAR-NK是将嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)表达于NK细胞中，使之能通过CAR依赖的机制杀伤表达肿瘤相关抗原的靶细胞。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞作用更广，不良反应更小，因此NK细胞是CAR的更优负载细胞。CAR-NK技术的关键在于寻找具有肿瘤特异性或相关性抗原。据相关文献报道，叶酸受体α(Folate receptorα，αFR)在90％的上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)中呈现高表达而在正常组织中αFR不表达或限制性低表达且其表达水平不以化疗药物的应用而改变。因此，αFR被认为是卵巢癌靶向治疗的理想抗原。中国专利CN109796535A公开了靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体及其在制备预防或治疗恶性肿瘤药物中的用途。在该技术方案中，靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体的组成依次包括：人CD8α信号肽、结合叶酸受体α的多肽、人免疫球蛋白G1Fc段、人CD8α铰链区、人CD28跨膜段、人CD28胞内段、人CD137胞内段和人CD3ζ胞内段。将上述嵌合抗原受体导入NK-92细胞，可以特异性识别并杀伤叶酸受体α表达阳性的人肿瘤细胞系及人卵巢癌移植瘤模型。但是，现有技术的表达靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体的NK-92细胞(CAR-NK细胞)仍然存在免疫细胞无法充分地激活以及迁移至肿瘤部位等问题，亟需对造成上述缺陷的原因进行研究，在一定程度上缓解CAR-NK细胞治疗卵巢癌时转运障碍的难题，使得CAR-NK细胞具有更强的卵巢癌趋向性以及杀伤作用，并同时提高卵巢癌免疫治疗疗效。

发明内容

本发明意在提供一种融合CXCR3和αFR的嵌合抗原受体，以解决现有技术的CAR-NK细胞的卵巢癌趋向性和治疗效果有限的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体，其包括CXCR3多肽片段、αFR的抗体片段和胞内以及跨膜区的多肽片段。

本方案还提供了一种表达融合CXCR3和αFR的嵌合抗原受体的免疫效应细胞。

本方案还提供了一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体在制备治疗或者预防卵巢癌的药物中的应用。

本方案的原理及优点是：

本方案构建了新型的融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体，并将其表达于自然杀伤细胞中，获得CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞(效应细胞)。CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞能通过CAR依赖的机制杀伤表达肿瘤相关抗原的靶细胞。叶酸受体α(Folate receptorα，αFR)在卵巢癌中呈现高表达，αFR可以作为卵巢癌靶向治疗的理想抗原。发明人使用表达融合αFR抗体的嵌合抗原受体的自然杀伤细胞与靶细胞进行共培养，发现在此类自然杀伤细胞的作用下，靶细胞大量表达CXCL10(参见实施例1)。发明人分析原因在于，αFR的αFR-CAR-NK92细胞与卵巢癌靶细胞共培养形成的肿瘤微环境(Tumor immune microenvironment，TME)，可以促进卵巢癌细胞产生趋化因子CXCL10。该现象的发现成为本发明创造产生的基础，发明人在此基础上对αFR-CAR融合基因进行改造，加入了CXCL10的受体CXCR3，利用趋化因子进一步趋化免疫细胞向肿瘤部位迁移。经过上述改造之后，使得表达融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体的自然杀伤细胞，具有更强的卵巢癌趋向性以及杀伤作用。

目前，卵巢癌的标准治疗策略是初始肿瘤细胞减灭术，并辅以紫杉醇联合铂类的化疗。手术联合化疗后大多数患者可达到缓解，但仍有约70％患者在3年内复发，且复发后容易出现化疗药物耐药，导致再次化疗失败，难以治愈。为克服上述问题，在传统的卵巢癌治疗策略范围内，引入了多种化疗药物。但由于卵巢癌患者总体生存率没有明确的增加，提示传统治疗已经到达了平台期。本技术方案首次揭示靶向αFR的CAR-NK92效应细胞与卵巢癌靶细胞在体外共培养后能促进卵巢癌细胞产生趋化因子CXCL10，进而制备了一种新型的共表达CXCL10受体CXCR3的嵌合抗原受体，并构建了CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞，使其可靶向αFR抗原并具有CXCL10的趋化性，具有更强的卵巢癌趋向性以及杀伤作用，从而为后续应用于治疗免疫反应型卵巢癌(即肿瘤组织高表达CXCL10)这一患者群体提供临床前研究数据，并在一定程度上缓解CAR-NK细胞治疗卵巢癌时转运障碍的难题，提高卵巢癌免疫治疗疗效。

综上所述，本技术方案的有益效果在于：

(1)在CAR靶向性免疫治疗中，NK细胞比T细胞更具有优势。CAR-T细胞不能消除异质性的癌细胞，而CAR-NK细胞可以通过持续治疗有效地消灭残留的癌细胞。不仅如此，CAR-T细胞产生的细胞因子风暴主要是通过促炎细胞因子如TNF-a、IL-1和IL-6实现的，CAR-NK细胞通常不会诱发细胞因子风暴、中枢神经系统相关毒性、脱靶效应等不良反应。更重要的是，由于移植物抗宿主病(GVHD)通常依赖于T细胞而非NK细胞，CAR-NK细胞无需人类白细胞抗原(HLA)配型，提供了异种移植NK细胞的机会。因此，CAR-NK细胞比CAR-T细胞的安全性更为优异。

(2)本发明首次发现αFR-CAR-NK92效应细胞在与高表达αFR的卵巢癌靶细胞共培养后，会释放一种名叫CXC趋化因子配体10(C-X-C motif chemokine 10，CXCL10，也称IP-10)的趋化因子，有证据表明CXCL10具有趋化免疫细胞、改善肿瘤免疫微环境等功能。CXCL10仅在少量的卵巢癌患者肿瘤组织中高表达，且在各种卵巢癌细胞系中均不表达CXCL10。目前尚未有相关研究报道CAR-T或CAR-NK细胞与靶细胞作用后产生CXCL10这一现象。

(3)本发明在αFR-CAR-NK92细胞的基础上共表达CXCL10的受体CXCR3，成功构建CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞，LDH释放实验表明CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞对高表达αFR的卵巢癌细胞(SK-OV-3、OVCAR3)具有更强的杀伤作用(实施例3)。transwell趋化实验的结果表明，CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞对CXCL10的趋化率显著提高(实施例4)。动物实验表明在体内CXCR3-αFR-CARNK92细胞对卵巢癌的抗肿瘤活性更强，同时增加了NK细胞向病灶部位的迁移(实施例5)，为研究CAR-NK细胞治疗卵巢癌提供了一种新的策略。

进一步，CXCR3多肽片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。CXCR3作为趋化因子CXCL10的受体，存在三种变体：CXCR3A、CXCR3B和CXCR3-alt。CXCR3A主要在免疫细胞中表达，具有免疫趋化的作用，并且促进细胞增殖；CXCR3B主要在纤维母细胞、内皮细胞、上皮细胞中表达，诱导细胞凋亡并抑制细胞迁移；CXCR3-alt的研究则较少。本方案中，选择了在免疫细胞表面表达的CXCR3A的蛋白质编码序列(Coding sequence，CDS)来制备嵌合抗原受体。在靶细胞受到肿瘤微环境的影响产生大量CXCL10时，CXCR3与CXCL10结合，进一步促进效应细胞的趋化作用，增加肿瘤治疗效果。

进一步，αFR的抗体片段的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO.6所示的轻链可变区序列。用于靶向αFR的多肽为抗αFR的抗体的单链可变区(scFv)，包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。采用上述序列所示的基因序列，其翻译得到的多肽具有良好的αFR靶向能力，特异性地与卵巢癌细胞结合，更为高效地清除肿瘤。

进一步，胞内以及跨膜区的多肽片段的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.9所示的人CD28跨膜段序列、如SEQ ID NO.10所示的人CD28胞内段序列、如SEQ ID NO.11所示的人CD137胞内段序列和如SEQ ID NO.12所示的人CD3ζ胞内段序列。CAR包括胞内信号区和跨膜区等，其与αFR的抗体联合作用，产生肿瘤杀伤作用。αFR的抗体一旦与αFR结合，可通过胞内信号区使自然杀伤细胞活化发挥效应功能，通过多种机制协同作用杀死肿瘤细胞。

进一步，人CD3ζ胞内段序列和CXCR3基因序列之间设有如SEQ ID NO.13所示的自剪切多肽2A序列。CXCR3与αFR-CAR中间由T2A连接，转录后可等量表达CXCR3蛋白和αFR-CAR融合蛋白，并可将两种蛋白剪切开来。

进一步，一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体，其编码核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；由如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列翻译获得的蛋白质经剪切，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CXCR3蛋白以及氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的αFR-CAR融合蛋白。

采用上述技术方案，将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因转染到包括自然杀伤细胞在内的效应细胞中，可以提升效应细胞的肿瘤趋向性能，克服现有技术的CAR-NK细胞再治疗卵巢癌时存在转运障碍，同时增强肿瘤治疗效果。体内实验证明(实施例5)，CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞对小鼠皮下异植瘤的抗肿瘤活性最强(相对于αFR-CAR-NK92细胞)，说明CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞增强对SK-OV-3-luc小鼠皮下异植瘤的杀伤效应。在本技术方案中，将CXCR3整合在原有的含有CAR和αFR的表达载体上，而不是使CXCR3单独在自然杀伤细胞中表达，出于以下两方面的原因：利用了αFR在卵巢癌细胞中高表达的特点，获得的效应细胞同时具有靶向作用和趋化作用，协同增效，进而提升靶向治疗的效果；嵌合抗原受体由胞外抗原识别域及多种胞内信号域组成，具有特异的肿瘤抗原识别性、非MHC限制性及高效杀伤的特性。若不将CXCR3构建在融合蛋白中，单独表达CXCR3的自然杀伤细胞则不具有卵巢癌靶向性和非MHC限制杀伤性。

进一步，表达融合CXCR3和αFR的嵌合抗原受体的免疫效应细胞，其由如下方法获取：将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CXCR3-αFR-CAR融合基因整合到空载的慢病毒表达载体，获得含有目的基因的表达载体；使用含有目的基因的表达载体转染宿主细胞获得含有目的基因的慢病毒；使用含有目的基因的慢病毒感染自然杀伤细胞，获得所述免疫效应细胞。将目的基因整合在表达载体上，再利用宿主细胞进行病毒包装，最后将包装好的病毒感染到自然杀伤细胞中。上述过程是现有技术中非常成熟且已经实现商业化批量生产的过程，可以实现效应细胞的高效制备。

进一步，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。叶酸受体α(Folate receptorα，αFR)在90％的上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)中呈现高表达而在正常组织中αFR不表达或限制性低表达，且其表达水平不以化疗药物的应用而改变。本技术方案的CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞可以大量表达用于靶向αFR的抗体，特异性地与上皮性卵巢癌细胞结合，实现更为高效地对肿瘤的清除。

附图说明

图1为本发明实施例1的αFR-CAR-NK92细胞与靶细胞共培养实验结果统计图。

图2为本发明实施例2的αFR-CAR和CXCR3-αFR-CAR融合基因结构示意图。

图3为本发明实施例2的CXCR3-αFR-CAR重组质粒结构示意图。

图4为本发明实施例2的质粒测序以及序列比对结果。

图5为本发明实施例3的四种效应细胞中的αFR-CAR和CXCR3的mRNA表达水平验证实验结果。

图6为本发明实施例3的LDH检测四种效应细胞分别与靶细胞共培养后的靶向杀伤效率。

图7为本发明实施例4的表达趋化因子受体CXCR3的趋化效应检测的实验结果。

图8为本发明实施例5的体内实验流程示意图。

图9为本发明实施例5的CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞增强对SK-OV-3-luc小鼠皮下异植瘤的杀伤效应的实验结果图。

图10为本发明实施例5的CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞增强对SK-OV-3小鼠皮下异植瘤的趋向性的实验结果。

具体实施方式

实施例1：αFR-CAR-NK92细胞与靶细胞共培养实验

效应细胞与靶细胞共培养实验的具体流程如下：4×10⁵个效应细胞(NK92细胞、NK92-EV细胞、αFR-CAR-NK92细胞)分别与2×10⁴个SK-OV-3细胞(人卵巢腺癌细胞，靶细胞)、OVCAR3细胞(人卵巢腺癌细胞，靶细胞)和人表皮癌A431细胞(阴性对照)在24孔板中共培养24h后，收集细胞共培养的上清，通过ELISA检测上清中CXCL10的分泌情况。其中，NK92-EV细胞代表转染有空载慢病毒(EV)的NK92细胞。αFR-CAR-NK92细胞的制备过程参见实施例2和实施例3，为参照中国专利CN109796535A制备αFR-CAR-NK92细胞。

(1)CXCL10标准品的稀释和使用：按照ELISA检测试剂盒(博士德公司)说明书进行操作，在使用前2h内准备。按照说明书提示配制2000、1000、500、250、125、62.5、31.2pg/ml梯度浓度的标准品。

(2)生物素标记抗人CXCL10抗体工作液：在使用前2h内准备。1μL生物素标记抗体加抗体稀释液99μL的比例配制工作液，根据每孔需要100μL计算总的用量。

(3)亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备：在使用前1h内准备。按1μLABC液加ABC稀释液99μL的比例配制工作液，根据每孔需要100μL计算总的用量。

(4)检测过程：确定检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数＝样品数+9；做三次检测时×3。将各浓度梯度的标准品各100μL依次加入一排7孔中，第8孔只加样品稀释液的作为零孔，其余样品各加100μL×3至酶标板孔中。酶标板加上封板膜，37℃反应90min。反应后甩去酶标板内液体，拍干、不洗。将准备好的生物素抗体工作液按每孔100μL依次加入。加上封板膜，37℃反应60min后1×洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1min左右。将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入。加上封板膜37℃反应30min后1×洗涤缓冲液洗涤5次。按每孔90μL依次加入TMB显色液，37℃避光反应15min。按每孔100μL依次加入终止液，用酶标仪在450nm测定OD值，最终得到CXCL10的浓度。

实验结果参见图1(mean±SE，n＝3)，αFR-CAR-NK92细胞(效应细胞)与人卵巢癌SK-OV-3(靶细胞)、OVCAR3细胞(靶细胞)和人表皮癌A431细胞(阴性对照)共培养之后发现，卵巢癌细胞与αFR-CAR-NK92细胞共培养后上清中CXCL10的分泌明显增加，而在A431中几乎无CXCL10的分泌。发明人分析原因在于，αFR的αFR-CAR-NK92细胞与卵巢癌靶细胞共培养形成的肿瘤微环境(Tumor immune microenvironment，TME)，可以促进卵巢癌细胞产生趋化因子CXCL10。该现象的发现成为本发明创造产生的基础，发明人在此基础上对αFR-CAR融合基因进行改造，加入了CXCL10的受体CXCR3，利用趋化因子进一步趋化免疫细胞向肿瘤部位迁移。经过上述改造之后，使得αFR-CAR-NK92细胞具有更强的卵巢癌趋向性以及杀伤作用。

实施例2：CXCR3-αFR-CAR重组质粒的构建

本方案的整合在慢病毒表达载体上的融合基因，是在专利CN109796535A的αFR-CAR融合基因的基础上进行的改造。在CN109796535A中，αFR-CAR融合基因包括胞外段和胞内段，胞外段包括来源于抗αFR的人源化单抗C4的scFv以及人IgG1 Fc段，CD8α铰链连接CD28分子的跨膜段；胞内段包含两个共刺激分子CD28和CD137以及CD3ζ胞内信号结构域(如图2的αFR-CAR所示)。本技术方案在上述结构上，通过自剪切多肽2A(self-cleaving 2Apeptide)将经典的CXCR3即CXCR3A(Gene ID 2833)的开放阅读框序列与αFR-CAR融合基因连接，送至上海和元生物科技有限公司合成，获得CXCR3-αFR-CAR融合基因(其编码核苷酸序列参见SEQ ID NO.1，其蛋白质序列参见SEQ ID NO.2)。在本技术方案中，CXCR3通过2A与αFR-CAR融合基因连接，从而使两种目的蛋白均衡表达并可将两种蛋白“切开”。在CXCR3-αFR-CAR融合基因中(结构参见图2的CXCR3-αFR-CAR)，CXCR3的核苷酸序列参见SEQ IDNO.3，2A的核苷酸序列参见SEQ ID NO.4，αFR-CAR融合基因参见SEQ ID NO.5。

在CXCR3-αFR-CAR融合基因中(结构参见图2的CXCR3-αFR-CAR)，从左到右依次为：编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的人CD8α信号肽；编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的重链可变区(VH)；编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的重链可变区(VL)；编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的人免疫球蛋白G1Fc段；编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的人CD8α铰链区；编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的人CD28跨膜段；编码核苷酸序列如SEQID NO.9所示的人CD28胞内段；编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的人CD137胞内段；编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的人CD3ζ胞内段；编码核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的自剪切多肽2A；编码核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的CXCR3(CXCR3A)。

CXCR3-αFR-CAR融合基因(SEQ ID NO.1，5’→3’，下划线处表示切割位点)：

ATGGCCCTCCCAGTTACCGCCCTTCTCCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGCCCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGAGCATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGGAGTTATAACCTGGTCTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGGCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACGCCGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTCGGAGGAGGCGGATCAGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGGCGGTCCCTGAGACTCTCCTGCACAACTTCTGGATTCACTTTTGGCGATTATGCTATGATCTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATCTACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGAACGGTACGATTTTTGGAGTGGAATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACCGTCACCGTGAGCAGTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCTTGCCCAGCACCTGAGCTCCTGGGGGGACCTTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCTCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCAGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCTGGCAAAGCCAAGCCCACCACTACACCCGCCCCACGCCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGCCCCGAGGCCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGCAGCAAGCGCAGCCGCCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGCCGCCCCGGCCCCACCCGCAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGCGACTTCGCCGCCTACCGCAGCAAGCGCGGCCGCAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCCGCTTCCCCGAAGAAGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGCGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGAGCCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGCTGAGGAAGCGGAGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCCATGGAGTTGAGGAAGTACGGCCCTGGAAGACTGGCGGGGACAGTTATAGGAGGAGCTGCTCAGAGTAAATCACAGACTAAATCAGACTCAATCACAAAAGAGTTCCTGCCAGGCCTTTACACAGCCCCTTCCTCCCCGTTCCCGCCCTCACAGGTGAGTGACCACCAAGTGCTAAATGACGCCGAGGTTGCCGCCCTCCTGGAGAACTTCAGCTCTTCCTATGACTATGGAGAAAACGAGAGTGACTCGTGCTGTACCTCCCCGCCCTGCCCACAGGACTTCAGCCTGAACTTCGACCGGGCCTTCCTGCCAGCCCTCTACAGCCTCCTCTTTCTGCTGGGGCTGCTGGGCAACGGCGCGGTGGCAGCCGTGCTGCTGAGCCGGCGGACAGCCCTGAGCAGCACCGACACCTTCCTGCTCCACCTAGCTGTAGCAGACACGCTGCTGGTGCTGACACTGCCGCTCTGGGCAGTGGACGCTGCCGTCCAGTGGGTCTTTGGCTCTGGCCTCTGCAAAGTGGCAGGTGCCCTCTTCAACATCAACTTCTACGCAGGAGCCCTCCTGCTGGCCTGCATCAGCTTTGACCGCTACCTGAACATAGTTCATGCCACCCAGCTCTACCGCCGGGGGCCCCCGGCCCGCGTGACCCTCACCTGCCTGGCTGTCTGGGGGCTCTGCCTGCTTTTCGCCCTCCCAGACTTCATCTTCCTGTCGGCCCACCACGACGAGCGCCTCAACGCCACCCACTGCCAATACAACTTCCCACAGGTGGGCCGCACGGCTCTGCGGGTGCTGCAGCTGGTGGCTGGCTTTCTGCTGCCCCTGCTGGTCATGGCCTACTGCTATGCCCACATCCTGGCCGTGCTGCTGGTTTCCAGGGGCCAGCGGCGCCTGCGGGCCATGCGGCTGGTGGTGGTGGTCGTGGTGGCCTTTGCCCTCTGCTGGACCCCCTATCACCTGGTGGTGCTGGTGGACATCCTCATGGACCTGGGCGCTTTGGCCCGCAACTGTGGCCGAGAAAGCAGGGTAGACGTGGCCAAGTCGGTCACCTCAGGCCTGGGCTACATGCACTGCTGCCTCAACCCGCTGCTCTATGCCTTTGTAGGGGTCAAGTTCCGGGAGCGGATGTGGATGCTGCTCTTGCGCCTGGGCTGCCCCAACCAGAGAGGGCTCCAGAGGCAGCCATCGTCTTCCCGCCGGGATTCATCCTGGTCTGAGACCTCAGAGGCCTCCTACTCGGGCTTGTGA；

CXCR3蛋白(SEQ ID NO.2，N端→C端)：

MELRKYGPGRLAGTVIGGAAQSKSQTKSDSITKEFLPGLYTAPSSPFPPSQVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSCCTSPPCPQDFSLNFDRAFLPALYSLLFLLGLLGNGAVAAVLLSRRTALSSTDTFLLHLAVADTLLVLTLPLWAVDAAVQWVFGSGLCKVAGALFNINFYAGALLLACISFDRYLNIVHATQLYRRGPPARVTLTCLAVWGLCLLFALPDFIFLSAHHDERLNATHCQYNFPQVGRTALRVLQLVAGFLLPLLVMAYCYAHILAVLLVSRGQRRLRAMRLVVVVVVAFALCWTPYHLVVLVDILMDLGALARNCGRESRVDVAKSVTSGLGYMHCCLNPLLYAFVGVKFRERMWMLLLRLGCPNQRGLQRQPSSSRRDSSWSETSEASYSGL；

αFR-CAR融合蛋白(SEQ ID NO.3，N端→C端)：

MALPVTALLLPLALLLHAARPQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYEGSKRPSGVSNRFSGSKSGNAASLTISGLQAEDEADYYCQSYDSSLSVVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFGDYAMIWARQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERYDFWSGMDVWGKGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPGVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；

人CD8α信号肽(SEQ ID NO.4，5’→3’)：

ATGGCCCTCCCAGTTACCGCCCTTCTCCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGCCCC：

结合叶酸受体α(αFR)的多肽为抗叶酸受体α(αFR)的抗体的单链可变区(scFv)包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，具体为：

重链可变区(SEQ ID NO.5，5’→3’)：

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGGCGGTCCCTGAGACTCTCCTGCACAACTTCTGGATTCACTTTTGGCGATTATGCTATGATCTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATCTACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGAACGGTACGATTTTTGGAGTGGAATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACCGTCACCGTGAGCAGT；

轻链可变区(SEQ ID NO.6，5’→3’)：

CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGAGCATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGGAGTTATAACCTGGTCTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGGCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACGCCGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTC；

人免疫球蛋白G1Fc段(SEQ ID NO.7，5’→3’)

GAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCTTGCCCAGCACCTGAGCTCCTGGGGGGACCTTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCTCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCAGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCTGGCAAA；

人CD8α铰链区(SEQ ID NO.8，5’→3’)：

GCCAAGCCCACCACTACACCCGCCCCACGCCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGCCCCGAGGCCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC；

人CD28跨膜段(SEQ ID NO.9，5’→3’)：

TTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTG；

人CD28胞内段(SEQ ID NO.10，5’→3’)：

CGCAGCAAGCGCAGCCGCCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGCCGCCCCGGCCCCACCCGCAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGCGACTTCGCCGCCTACCGCAGC；

人CD137胞内段(SEQ ID NO.11，5’→3’)：

AAGCGCGGCCGCAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCCGCTTCCCCGAAGAAGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG；

人CD3ζ胞内段(SEQ ID NO.12，5’→3’)：

CGCGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGAGCCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGCTGA；

自剪切多肽2A(SEQ ID NO.13，5’→3’)：

GGAAGCGGAGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCC；

人CXCR3(SEQ ID NO.14，5’→3’)：

ATGGAGTTGAGGAAGTACGGCCCTGGAAGACTGGCGGGGACAGTTATAGGAGGAGCTGCTCAGAGTAAATCACAGACTAAATCAGACTCAATCACAAAAGAGTTCCTGCCAGGCCTTTACACAGCCCCTTCCTCCCCGTTCCCGCCCTCACAGGTGAGTGACCACCAAGTGCTAAATGACGCCGAGGTTGCCGCCCTCCTGGAGAACTTCAGCTCTTCCTATGACTATGGAGAAAACGAGAGTGACTCGTGCTGTACCTCCCCGCCCTGCCCACAGGACTTCAGCCTGAACTTCGACCGGGCCTTCCTGCCAGCCCTCTACAGCCTCCTCTTTCTGCTGGGGCTGCTGGGCAACGGCGCGGTGGCAGCCGTGCTGCTGAGCCGGCGGACAGCCCTGAGCAGCACCGACACCTTCCTGCTCCACCTAGCTGTAGCAGACACGCTGCTGGTGCTGACACTGCCGCTCTGGGCAGTGGACGCTGCCGTCCAGTGGGTCTTTGGCTCTGGCCTCTGCAAAGTGGCAGGTGCCCTCTTCAACATCAACTTCTACGCAGGAGCCCTCCTGCTGGCCTGCATCAGCTTTGACCGCTACCTGAACATAGTTCATGCCACCCAGCTCTACCGCCGGGGGCCCCCGGCCCGCGTGACCCTCACCTGCCTGGCTGTCTGGGGGCTCTGCCTGCTTTTCGCCCTCCCAGACTTCATCTTCCTGTCGGCCCACCACGACGAGCGCCTCAACGCCACCCACTGCCAATACAACTTCCCACAGGTGGGCCGCACGGCTCTGCGGGTGCTGCAGCTGGTGGCTGGCTTTCTGCTGCCCCTGCTGGTCATGGCCTACTGCTATGCCCACATCCTGGCCGTGCTGCTGGTTTCCAGGGGCCAGCGGCGCCTGCGGGCCATGCGGCTGGTGGTGGTGGTCGTGGTGGCCTTTGCCCTCTGCTGGACCCCCTATCACCTGGTGGTGCTGGTGGACATCCTCATGGACCTGGGCGCTTTGGCCCGCAACTGTGGCCGAGAAAGCAGGGTAGACGTGGCCAAGTCGGTCACCTCAGGCCTGGGCTACATGCACTGCTGCCTCAACCCGCTGCTCTATGCCTTTGTAGGGGTCAAGTTCCGGGAGCGGATGTGGATGCTGCTCTTGCGCCTGGGCTGCCCCAACCAGAGAGGGCTCCAGAGGCAGCCATCGTCTTCCCGCCGGGATTCATCCTGGTCTGAGACCTCAGAGGCCTCCTACTCGGGCTTGTGA；

αFR-CAR融合基因(SEQ ID NO.15，5’→3’)：

ATGGCCCTCCCAGTTACCGCCCTTCTCCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGCCCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGAGCATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGGAGTTATAACCTGGTCTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGGCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACGCCGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTCGGAGGAGGCGGATCAGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGGCGGTCCCTGAGACTCTCCTGCACAACTTCTGGATTCACTTTTGGCGATTATGCTATGATCTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATCTACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGAACGGTACGATTTTTGGAGTGGAATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACCGTCACCGTGAGCAGTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCTTGCCCAGCACCTGAGCTCCTGGGGGGACCTTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCTCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCAGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCTGGCAAAGCCAAGCCCACCACTACACCCGCCCCACGCCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGCCCCGAGGCCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGCAGCAAGCGCAGCCGCCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGCCGCCCCGGCCCCACCCGCAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGCGACTTCGCCGCCTACCGCAGCAAGCGCGGCCGCAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCCGCTTCCCCGAAGAAGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGCGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGAGCCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGCTGA。

分别将CXCR3-αFR-CAR融合基因和αFR-CAR融合基因采用现有技术的常规手段插入到pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAGWPRE慢病毒表达载体的多克隆位点上，此步骤委托上海和元生物科技公司完成。分别获得pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-CXCR3-αFR-CAR-3xFLAG-WPRE慢病毒目的质粒(质粒图谱见图3)和pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-αFR-CAR-3xFLAG-WPRE慢病毒目的质粒。利用目的基因的引物进行测序分析，正向测序引物：CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG(SEQ ID NO.16)；反向测序引物：WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA(SEQ ID NO.17)。基因序列测序(委托华大基因完成测序)结果与设计的CXCR3-αFR-CAR目的基因序列完全相符，提示我们目的载体构建的成功(测序结果参见图4，SEQ表示对质粒的测序结果，ER-2A-CXCR3表示目标序列)。

实施例3：CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞的制备

使用慢病毒转染NK92细胞的方法制备CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞，其中，慢病毒的制备过程具体如下：

(1)慢病毒的包装

提前一天将293FT细胞均匀铺至10cm培养皿至汇合率达70％。

包装第一日：实验前1h将293FT细胞旧培养基吸净后PBS清洗一遍，加入DMEM高糖完全培养基8ml。在5ml无菌离心管中加入1.5ml不含FBS的DMEM高糖培养基、3μg pLP1质粒、3μg pLP2质粒、3μg pLP/VSVG质粒和3μg构建的质粒DNA(实施例2中制备获得)。另取1支5ml无菌离心管，加入1.5ml DMEM高糖培养基和36μl PolyJet转染试剂。分别将两管离心管轻柔混匀后室温静置5min。将离心管中转染试剂混合液加入质粒混合液的离心管中，轻柔混匀后室温静置15min。将上述转染复合物小心加入293FT细胞培养皿上清中，轻柔混匀后，置于37℃、5％CO₂孵箱培养。

包装第二日：吸净293FT细胞旧培养基，加入新鲜DMEM高糖完全培养基8ml，置于孵箱中继续培养。

包装第四日：转移293FT细胞的慢病毒上清于15ml无菌离心管中，使用0.45μm滤器过滤至新的15ml无菌离心管中，存放至4℃冰箱。在原培养皿中加入8ml新鲜DMEM高糖完全培养基，置于孵箱中继续培养。

包装第六日：重复第四步收集293FT细胞的慢病毒上清后丢掉细胞。

(2)慢病毒的浓缩

将所收的病毒上清补至20ml。按照慢病毒上清：PEG8000溶液为4：1的比例加入5mlPEG8000，上下颠倒10次使复合物混匀，放入4℃冰箱。30min后重复颠倒步骤后放回4℃冰箱。48h后，4℃、4000g高速离心30min。弃去上清，得到慢病毒沉淀。用100μL DMEM高糖完全培养基重悬沉淀，分装至5管1.5ml无菌离心管中，每管20μL，置于-80℃冰箱长期保存。

通过上述操作，制备得到表达含有目的基因的pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-CXCR3-αFR-CAR-3xFLAG-WPRE的慢病毒颗粒和不表达目的基因的pLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-3xFLAG-WPRE的对照慢病毒颗粒(EV)。

感染NK92细胞的具体过程如下：

(1)复苏NK92细胞：从液氮罐中取出NK92细胞，在37℃水浴锅中快速溶解后转移至1.5ml EP管中。1000rpm，离心5min后弃上清后用1ml MEM-α完全培养基(含12.5％FBS和12.5％HS)重悬后转移到T25培养瓶中，补加4ml MEM-α完全培养基，加入10μL IL-2(1×10⁵IU/ml)放入37℃、5％C0₂细胞培养箱中培养。

(2)NK92细胞培养：继续培养复苏的NK92细胞，每次传代时均加入200IU/ml的IL-2。细胞状态调整到最佳状态(即成团生长且镜下细胞透亮无杂质、单个细胞少)后开始感染细胞。

(3)NK92细胞的感染：细胞计数取2×10⁵个NK92细胞铺板于12孔板中，共4个孔，并加入1ml MEM-α完全培养基和2μL IL-2(1×10⁵IU/ml)，按照感染复数(Multiplicity OfInfection，MOI)为20的比例加入空载病毒颗粒(empty virus，EV)、含有αFR-CAR的慢病毒颗粒、含有CXCR3-αFR-CAR的慢病毒颗粒。最后向每孔中加入1μL的Polybrene(10mg/ml)，十字混匀12孔板并对每孔进行标记后置于细胞培养箱中继续培养。

(4)建立慢病毒感染的NK92细胞稳株：细胞感染72h后，向细胞悬液中加入2μg/ml的嘌呤霉素进行抗生素筛选，继续置于孵箱中培养。之后根据生长情况进行扩大培养，每次传代都需加入相应浓度的嘌呤霉素及IL-2。经过约2-3周筛选后可得到NK92-EV、αFR-CAR-NK92、CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞稳株。

为了进一步验证αFR-CAR和CXCR3在CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞中的表达，我们设计了αFR-CAR和CXCR3的引物并通过qRT-PCR验证了在mRNA水平上的基因表达情况。qRT-PCR检测αFR-CAR在mRNA水平上的表达使用的是CD3ζ的引物序列(Gene ID:919)；检测CXCR3 mRNA水平上的表达使用的是CXCR3A的引物序列(Gene ID:2833)。实验结果参见图5(mean±SE，n＝3)，αFR-CAR在αFR-CAR-NK92和CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞中高表达，而在NK92和NK92-EV细胞上几乎无表达；且在mRNA水平上，CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞中CXCR3表达明显高NK92、NK92-EV、αFR-CAR-NK92细胞。

通过LDH检测实验评价本方案获得的效应细胞的杀伤效率。LDH存在于细胞质中，细胞膜正常时不能释放到胞外，但当细胞受损或死亡时，细胞膜结构遭到破坏，大量LDH释放出来，因此，培养基中LDH的活性与受损细胞呈正比。效应细胞与靶细胞共培养实验的具体流程如下：效应细胞(NK92细胞、NK92-EV细胞、αFR-CAR-NK92细胞和CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞)分别与SK-OV-3细胞(人卵巢腺癌细胞，靶细胞)、OVCAR3细胞(人卵巢腺癌细胞，靶细胞)和人表皮癌A431细胞(阴性对照)在24孔板中采用效靶比为(1:1、5:1、10:1、20:1)进行效靶细胞培养，共培养24h后,进行培养基中的LDH检测。LDH释放实验结果表明(参见图6，mean±SE，n＝3)，与高表达αFR的SK-OV-3细胞进行效靶比20：1的共培养后，CXCR3-αFR-CAR-NK92及αFR-CAR-NK92细胞的杀伤率明显高于NK92、NK92-EV细胞，在OVCAR3细胞中也得到了类似的结果。为了证明CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞对靶细胞的特异性杀伤是具有αFR靶向性的，我们同时选用了阴性表达αFR的A431细胞进行了效靶细胞杀伤实验。LDH释放实验结果表明，CXCR3-αFR-CAR-NK92及αFR-CAR-NK92细胞对A431细胞没有呈现出特异性的细胞毒性。

实施例4：表达趋化因子受体CXCR3的趋化效应检测。

(1)将SK-OV-3细胞接种于6孔板中：加入含1×10⁵个SK-OV-3细胞的2ml RPMI1640完全培养基过夜培养待其贴壁。第二天弃去上清，按照效靶比20:1的比例加入3ml含2×10⁶个αFR-CAR-NK92细胞的MEM-α完全培养基。效靶细胞共培养24h后收集孔板中的上清，1500rpm，离心10min，该上清即为共培养上清。在transwell下室中加入上述步骤得到的培养上清600μL，共4孔。

(2)用无血清的MEM-α培养基制备NK92、NK92-EV、αFR-CAR-NK92、CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞悬液，每组各加1×10⁶/孔细胞200μL至上室，置于细胞培养箱中继续培养6h。统计效应细胞趋化率，公式如下：

趋化率＝(实验组趋化的效应细胞数量-只含培养基组趋化的效应细胞数量)/(全部效应细胞数量-只含培养基组趋化的效应细胞数量)×100％。

效靶细胞共培养后上清对不同效应细胞的趋化情况参见图7(mean±SE，n＝3)。实施例1已经证明αFR-CAR-NK92细胞与卵巢癌靶细胞共培养之后，上清液中CXCL10的分泌会增加。为了验证表达趋化因子受体CXCR3的CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞对CXCL10的趋向性，利用transwell实验，在下室中加入αFR-CAR-NK92细胞与SK-OV-3细胞的共培养上清(效靶比20:1，共培养24h)，上室中依次加入NK92、NK92-EV、αFR-CAR-NK92、CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞，统计这四种效应细胞迁移至下室中的数量。结果表明，在效靶细胞共培养上清条件下，与NK92、NK92-EV、αFR-CAR-NK92细胞相比，CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞趋化率最高。

实施例5：体内实验

本实施例建立体内小鼠卵巢癌免疫治疗模型评估CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞的抗肿瘤效应。为评估CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞在荷瘤小鼠体内抗肿瘤效果，我们使用荧光素酶慢病毒感染的人SK-OV-3-luc稳株细胞建立了B-NDG(严重免疫缺陷，不含T/B/NK细胞)小鼠皮下肿瘤模型。具体实验步骤如下(体内实验流程示意图参见图8)：

(1)建立人SK-OV-3-luc稳株细胞：使用汉恒生物公司购买的HBLV-LUCPURO慢病毒(滴度2×10⁸TU/ml)按照本领域常规手段感染人SK-OV-3细胞后获得人SK-OV-3-luc稳株细胞。

(2)从百奥赛图公司购买20只小鼠6-8周龄的雌性B-NDG小鼠，在SPF级动物房饲养，保持动物饮水和进食充足。每次实验操作前均对操作台和实验用品进行紫外消毒。

(3)皮下接种肿瘤细胞：取对数期生长旺盛的人SK-OV-3-luc细胞，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，将细胞注入皮下，注射量为100μl/只(即每只老鼠注射1×10⁶个SK-OV-3-luc细胞)。并将注射肿瘤细胞的时间设置为第-10天。

(4)效应细胞静脉注射：将20只小鼠分成四笼，每笼5只。第1笼小鼠在肿瘤细胞接种后14天后即第0天鼠尾静脉注射PBS 100μL，第2、3、4笼的每只小鼠在第0天分别鼠尾静脉注射由PBS重悬的NK92-EV、αFR-CAR-NK92、CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞1×10⁶个/100μL，并将每笼小鼠做好标记。第0、4、8、12天均进行鼠尾静脉给药，共给药4次，每次给药量均与第0天一致。在给药期间每2-3天腹腔注射人重组IL-2 1000IU/只小鼠。

(5)注射肿瘤细胞后每隔一天观察小鼠皮下成瘤情况并用游标卡尺测量、记录。

(6)活体成像分析：第0天效应细胞静脉注射前，使用1.5％戊巴比妥钠麻醉小鼠，按照40μL/每20g小鼠体重的剂量进行腹腔注射。待小鼠麻醉后腹腔注射150μL的D-萤光素钾盐DMSO溶液(10mg/ml)，5min后放入活体成像仪中进行活体成像并分析荧光强度值。第14天再次进行活体成像分析。

活体成像分析实验结果参见图9(左为活体成像图像，右为荧光强度统计图，mean±SE，n＝5)。提前10天在B-NDG小鼠右下腹皮下注射1×10⁶SK-OV-3-luc细胞；分别在第0、4、8、12天通过鼠尾静脉注射PBS或1×10⁶NK92-EV、αFR-CAR-NK92、CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞，注射NK92细胞期间每2天注射1000U IL-2/只小鼠。在第0、14天分别活体成像检测肿瘤大小。结果显示，CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞对小鼠皮下异植瘤的抗肿瘤活性最强，说明CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞增强对SK-OV-3-luc小鼠皮下异植瘤的杀伤效应。

(7)皮下肿瘤细胞注射的第20天处死小鼠(即3个疗程的免疫治疗后)，并将每只小鼠的肿瘤组织使用免疫组化染色检测瘤内CD56表达情况，以反映肿瘤组织中NK细胞的浸润迁移情况(CD56为NK细胞特异性标志物)。实验结果参见图10(左为免疫组化显微图像，右为视野中CD56⁺细胞数量统计图，mean±SE，n＝5)。免疫组化染色结果提示，CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞治疗组小鼠肿瘤组织中CD56表达明显高于其他组，表明其对肿瘤有显著的趋向性。免疫组化检测小鼠肿瘤中CD56的表达，结果表明CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞治疗组小鼠肿瘤组织中CD56表达明显高表达，而PBS组、NK92-EV组、αFRCAR-NK92组肿瘤组织中CD56呈现不同程度的低表达。进一步说明，CXCR3-αFR-CAR-NK92细胞增强对SK-OV-3小鼠皮下异植瘤的趋向性。

SEQUENCE LISTING

<110> 睿仕康（重庆）生物科技有限公司

<120> 一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体及其效应细胞和在治疗卵巢癌中

的应用

<130> 2022-01-26

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3618

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggccctcc cagttaccgc ccttctcctg cccctggccc tgctgctgca cgccgcccgc 60

ccccagtctg ccctgactca gcctgcctcc gtgtctgggt ctcctggaca gagcatcacc 120

atctcctgca ctggaaccag cagtgatgtt gggagttata acctggtctc ctggtaccag 180

cagcacccag gcaaagcccc caaactcatg atttatgagg gcagtaagcg gccctcaggg 240

gtttctaatc gcttctctgg ctccaagtct ggcaacgccg cctccctgac aatctctggg 300

ctccaggctg aggacgaggc tgattattac tgccagtcct atgacagcag cctgagtgtg 360

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctcggaggag gcggatcagg cggaggaggc 420

tctggcggag gcggaagcca ggtgcagctg gtggagtctg ggggaggcct ggtgcagcca 480

gggcggtccc tgagactctc ctgcacaact tctggattca cttttggcga ttatgctatg 540

atctgggccc gccaggctcc agggaagggg ctggagtggg tctcatccat tagtagtagt 600

agtagttaca tctactacgc agactcagtg aagggcagat tcaccatctc cagagacaac 660

gccaagaact cactgtatct gcagatgaac agcctgagag ccgaggacac cgctgtgtat 720

tactgtgcca gagaacggta cgatttttgg agtggaatgg acgtctgggg caaagggacc 780

accgtcaccg tgagcagtga gcccaaatct agcgacaaaa ctcacacatg cccaccttgc 840

ccagcacctg agctcctggg gggaccttca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 900

accctcatga tctcccggac ccctggggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 960

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1020

aagcctcggg aggagcagta caacagcacc tacagagtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1080

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1140

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc ccagagaacc acaggtgtac 1200

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1260

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gcctgagaac 1320

aactacaaga ccacccctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1380

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1440

gaggctctgc acaaccacta cacccagaag agcctctccc tgtctcctgg caaagccaag 1500

cccaccacta cacccgcccc acgccccccc acccccgccc ccaccatcgc cagccagccc 1560

ctgagcctgc gccccgaggc ctgccgcccc gccgccggcg gcgccgtgca cacccgcggc 1620

ctggacttcg cctgcgactt ctgggtgctg gtggtggtgg gcggcgtgct ggcctgctac 1680

agcctgctgg tgaccgtggc cttcatcatc ttctgggtgc gcagcaagcg cagccgcctg 1740

ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc cgccgccccg gccccacccg caagcactac 1800

cagccctacg cccccccccg cgacttcgcc gcctaccgca gcaagcgcgg ccgcaagaag 1860

ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg cgccccgtgc agaccaccca ggaggaggac 1920

ggctgcagct gccgcttccc cgaagaagag gagggcggct gcgagctgcg cgtgaagttc 1980

agccgcagcg ccgagccccc cgcctaccag cagggccaga accagctgta caacgagctg 2040

aacctgggcc gccgcgagga gtacgacgtg ctggacaagc gccgcggccg cgaccccgag 2100

atgggcggca agccccgccg caagaacccc caggagggcc tgtacaacga gctgcagaag 2160

gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagcgccg ccgcggcaag 2220

ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggacaccta cgacgccctg 2280

cacatgcagg ccctgccccc ccgctgagga agcggagagg gcaggggaag tcttctaaca 2340

tgcggggacg tggaggaaaa tcccggcccc atggagttga ggaagtacgg ccctggaaga 2400

ctggcgggga cagttatagg aggagctgct cagagtaaat cacagactaa atcagactca 2460

atcacaaaag agttcctgcc aggcctttac acagcccctt cctccccgtt cccgccctca 2520

caggtgagtg accaccaagt gctaaatgac gccgaggttg ccgccctcct ggagaacttc 2580

agctcttcct atgactatgg agaaaacgag agtgactcgt gctgtacctc cccgccctgc 2640

ccacaggact tcagcctgaa cttcgaccgg gccttcctgc cagccctcta cagcctcctc 2700

tttctgctgg ggctgctggg caacggcgcg gtggcagccg tgctgctgag ccggcggaca 2760

gccctgagca gcaccgacac cttcctgctc cacctagctg tagcagacac gctgctggtg 2820

ctgacactgc cgctctgggc agtggacgct gccgtccagt gggtctttgg ctctggcctc 2880

tgcaaagtgg caggtgccct cttcaacatc aacttctacg caggagccct cctgctggcc 2940

tgcatcagct ttgaccgcta cctgaacata gttcatgcca cccagctcta ccgccggggg 3000

cccccggccc gcgtgaccct cacctgcctg gctgtctggg ggctctgcct gcttttcgcc 3060

ctcccagact tcatcttcct gtcggcccac cacgacgagc gcctcaacgc cacccactgc 3120

caatacaact tcccacaggt gggccgcacg gctctgcggg tgctgcagct ggtggctggc 3180

tttctgctgc ccctgctggt catggcctac tgctatgccc acatcctggc cgtgctgctg 3240

gtttccaggg gccagcggcg cctgcgggcc atgcggctgg tggtggtggt cgtggtggcc 3300

tttgccctct gctggacccc ctatcacctg gtggtgctgg tggacatcct catggacctg 3360

ggcgctttgg cccgcaactg tggccgagaa agcagggtag acgtggccaa gtcggtcacc 3420

tcaggcctgg gctacatgca ctgctgcctc aacccgctgc tctatgcctt tgtaggggtc 3480

aagttccggg agcggatgtg gatgctgctc ttgcgcctgg gctgccccaa ccagagaggg 3540

ctccagaggc agccatcgtc ttcccgccgg gattcatcct ggtctgagac ctcagaggcc 3600

tcctactcgg gcttgtga 3618

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Leu Arg Lys Tyr Gly Pro Gly Arg Leu Ala Gly Thr Val Ile

1               5                   10                  15

Gly Gly Ala Ala Gln Ser Lys Ser Gln Thr Lys Ser Asp Ser Ile Thr

            20                  25                  30

Lys Glu Phe Leu Pro Gly Leu Tyr Thr Ala Pro Ser Ser Pro Phe Pro

        35                  40                  45

Pro Ser Gln Val Ser Asp His Gln Val Leu Asn Asp Ala Glu Val Ala

    50                  55                  60

Ala Leu Leu Glu Asn Phe Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr Gly Glu Asn Glu

65                  70                  75                  80

Ser Asp Ser Cys Cys Thr Ser Pro Pro Cys Pro Gln Asp Phe Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Phe Asp Arg Ala Phe Leu Pro Ala Leu Tyr Ser Leu Leu Phe Leu

            100                 105                 110

Leu Gly Leu Leu Gly Asn Gly Ala Val Ala Ala Val Leu Leu Ser Arg

        115                 120                 125

Arg Thr Ala Leu Ser Ser Thr Asp Thr Phe Leu Leu His Leu Ala Val

    130                 135                 140

Ala Asp Thr Leu Leu Val Leu Thr Leu Pro Leu Trp Ala Val Asp Ala

145                 150                 155                 160

Ala Val Gln Trp Val Phe Gly Ser Gly Leu Cys Lys Val Ala Gly Ala

                165                 170                 175

Leu Phe Asn Ile Asn Phe Tyr Ala Gly Ala Leu Leu Leu Ala Cys Ile

            180                 185                 190

Ser Phe Asp Arg Tyr Leu Asn Ile Val His Ala Thr Gln Leu Tyr Arg

        195                 200                 205

Arg Gly Pro Pro Ala Arg Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Val Trp Gly

    210                 215                 220

Leu Cys Leu Leu Phe Ala Leu Pro Asp Phe Ile Phe Leu Ser Ala His

225                 230                 235                 240

His Asp Glu Arg Leu Asn Ala Thr His Cys Gln Tyr Asn Phe Pro Gln

                245                 250                 255

Val Gly Arg Thr Ala Leu Arg Val Leu Gln Leu Val Ala Gly Phe Leu

            260                 265                 270

Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Tyr Cys Tyr Ala His Ile Leu Ala Val

        275                 280                 285

Leu Leu Val Ser Arg Gly Gln Arg Arg Leu Arg Ala Met Arg Leu Val

    290                 295                 300

Val Val Val Val Val Ala Phe Ala Leu Cys Trp Thr Pro Tyr His Leu

305                 310                 315                 320

Val Val Leu Val Asp Ile Leu Met Asp Leu Gly Ala Leu Ala Arg Asn

                325                 330                 335

Cys Gly Arg Glu Ser Arg Val Asp Val Ala Lys Ser Val Thr Ser Gly

            340                 345                 350

Leu Gly Tyr Met His Cys Cys Leu Asn Pro Leu Leu Tyr Ala Phe Val

        355                 360                 365

Gly Val Lys Phe Arg Glu Arg Met Trp Met Leu Leu Leu Arg Leu Gly

    370                 375                 380

Cys Pro Asn Gln Arg Gly Leu Gln Arg Gln Pro Ser Ser Ser Arg Arg

385                 390                 395                 400

Asp Ser Ser Trp Ser Glu Thr Ser Glu Ala Ser Tyr Ser Gly Leu

                405                 410                 415

<210> 3

<211> 768

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1               5                   10                  15

His Ala Ala Arg Pro Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser

            20                  25                  30

Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser

        35                  40                  45

Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly

    50                  55                  60

Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly

65                  70                  75                  80

Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ala Ala Ser Leu

                85                  90                  95

Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

            100                 105                 110

Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

        115                 120                 125

Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

    130                 135                 140

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

145                 150                 155                 160

Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly

                165                 170                 175

Asp Tyr Ala Met Ile Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

            180                 185                 190

Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp

        195                 200                 205

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

    210                 215                 220

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

225                 230                 235                 240

Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Met Asp Val Trp

                245                 250                 255

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp

            260                 265                 270

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

        275                 280                 285

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

    290                 295                 300

Ser Arg Thr Pro Gly Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

305                 310                 315                 320

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

                325                 330                 335

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

            340                 345                 350

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

        355                 360                 365

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

    370                 375                 380

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

385                 390                 395                 400

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

                405                 410                 415

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

            420                 425                 430

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

        435                 440                 445

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

    450                 455                 460

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

465                 470                 475                 480

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

                485                 490                 495

Gly Lys Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

            500                 505                 510

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

        515                 520                 525

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

    530                 535                 540

Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

545                 550                 555                 560

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

                565                 570                 575

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

            580                 585                 590

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

        595                 600                 605

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

    610                 615                 620

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

625                 630                 635                 640

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

                645                 650                 655

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

            660                 665                 670

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

        675                 680                 685

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

    690                 695                 700

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

705                 710                 715                 720

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

                725                 730                 735

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

            740                 745                 750

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

        755                 760                 765

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggccctcc cagttaccgc ccttctcctg cccctggccc tgctgctgca cgccgcccgc 60

ccc 63

<210> 5

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtgcagc cagggcggtc cctgagactc 60

tcctgcacaa cttctggatt cacttttggc gattatgcta tgatctgggc ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catctactac 180

gcagactcag tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgctgtgt attactgtgc cagagaacgg 300

tacgattttt ggagtggaat ggacgtctgg ggcaaaggga ccaccgtcac cgtgagcagt 360

<210> 6

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagag catcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggg agttataacc tggtctcctg gtaccagcag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgagggca gtaagcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacgccgcct ccctgacaat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgtggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtcctc 330

<210> 7

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gagcccaaat ctagcgacaa aactcacaca tgcccacctt gcccagcacc tgagctcctg 60

gggggacctt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgggg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagcctcg ggaggagcag 240

tacaacagca cctacagagt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gcccagagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagcctgaga acaactacaa gaccacccct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacccaga agagcctctc cctgtctcct ggcaaa 696

<210> 8

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gccaagccca ccactacacc cgccccacgc ccccccaccc ccgcccccac catcgccagc 60

cagcccctga gcctgcgccc cgaggcctgc cgccccgccg ccggcggcgc cgtgcacacc 120

cgcggcctgg acttcgcctg cgac 144

<210> 9

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttctgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgaccgtg 60

gccttcatca tcttctgggt g 81

<210> 10

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgcagcaagc gcagccgcct gctgcacagc gactacatga acatgacccc ccgccgcccc 60

ggccccaccc gcaagcacta ccagccctac gccccccccc gcgacttcgc cgcctaccgc 120

agc 123

<210> 11

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aagcgcggcc gcaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg ccccgtgcag 60

accacccagg aggaggacgg ctgcagctgc cgcttccccg aagaagagga gggcggctgc 120

gagctg 126

<210> 12

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgcgtgaagt tcagccgcag cgccgagccc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 60

tacaacgagc tgaacctggg ccgccgcgag gagtacgacg tgctggacaa gcgccgcggc 120

cgcgaccccg agatgggcgg caagccccgc cgcaagaacc cccaggaggg cctgtacaac 180

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgc 240

cgccgcggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccccgctga 339

<210> 13

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggaagcggag agggcagggg aagtcttcta acatgcgggg acgtggagga aaatcccggc 60

ccc 63

<210> 14

<211> 1248

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atggagttga ggaagtacgg ccctggaaga ctggcgggga cagttatagg aggagctgct 60

cagagtaaat cacagactaa atcagactca atcacaaaag agttcctgcc aggcctttac 120

acagcccctt cctccccgtt cccgccctca caggtgagtg accaccaagt gctaaatgac 180

gccgaggttg ccgccctcct ggagaacttc agctcttcct atgactatgg agaaaacgag 240

agtgactcgt gctgtacctc cccgccctgc ccacaggact tcagcctgaa cttcgaccgg 300

gccttcctgc cagccctcta cagcctcctc tttctgctgg ggctgctggg caacggcgcg 360

gtggcagccg tgctgctgag ccggcggaca gccctgagca gcaccgacac cttcctgctc 420

cacctagctg tagcagacac gctgctggtg ctgacactgc cgctctgggc agtggacgct 480

gccgtccagt gggtctttgg ctctggcctc tgcaaagtgg caggtgccct cttcaacatc 540

aacttctacg caggagccct cctgctggcc tgcatcagct ttgaccgcta cctgaacata 600

gttcatgcca cccagctcta ccgccggggg cccccggccc gcgtgaccct cacctgcctg 660

gctgtctggg ggctctgcct gcttttcgcc ctcccagact tcatcttcct gtcggcccac 720

cacgacgagc gcctcaacgc cacccactgc caatacaact tcccacaggt gggccgcacg 780

gctctgcggg tgctgcagct ggtggctggc tttctgctgc ccctgctggt catggcctac 840

tgctatgccc acatcctggc cgtgctgctg gtttccaggg gccagcggcg cctgcgggcc 900

atgcggctgg tggtggtggt cgtggtggcc tttgccctct gctggacccc ctatcacctg 960

gtggtgctgg tggacatcct catggacctg ggcgctttgg cccgcaactg tggccgagaa 1020

agcagggtag acgtggccaa gtcggtcacc tcaggcctgg gctacatgca ctgctgcctc 1080

aacccgctgc tctatgcctt tgtaggggtc aagttccggg agcggatgtg gatgctgctc 1140

ttgcgcctgg gctgccccaa ccagagaggg ctccagaggc agccatcgtc ttcccgccgg 1200

gattcatcct ggtctgagac ctcagaggcc tcctactcgg gcttgtga 1248

<210> 15

<211> 2307

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atggccctcc cagttaccgc ccttctcctg cccctggccc tgctgctgca cgccgcccgc 60

ccccagtctg ccctgactca gcctgcctcc gtgtctgggt ctcctggaca gagcatcacc 120

atctcctgca ctggaaccag cagtgatgtt gggagttata acctggtctc ctggtaccag 180

cagcacccag gcaaagcccc caaactcatg atttatgagg gcagtaagcg gccctcaggg 240

gtttctaatc gcttctctgg ctccaagtct ggcaacgccg cctccctgac aatctctggg 300

ctccaggctg aggacgaggc tgattattac tgccagtcct atgacagcag cctgagtgtg 360

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctcggaggag gcggatcagg cggaggaggc 420

tctggcggag gcggaagcca ggtgcagctg gtggagtctg ggggaggcct ggtgcagcca 480

gggcggtccc tgagactctc ctgcacaact tctggattca cttttggcga ttatgctatg 540

atctgggccc gccaggctcc agggaagggg ctggagtggg tctcatccat tagtagtagt 600

agtagttaca tctactacgc agactcagtg aagggcagat tcaccatctc cagagacaac 660

gccaagaact cactgtatct gcagatgaac agcctgagag ccgaggacac cgctgtgtat 720

tactgtgcca gagaacggta cgatttttgg agtggaatgg acgtctgggg caaagggacc 780

accgtcaccg tgagcagtga gcccaaatct agcgacaaaa ctcacacatg cccaccttgc 840

ccagcacctg agctcctggg gggaccttca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 900

accctcatga tctcccggac ccctggggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 960

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1020

aagcctcggg aggagcagta caacagcacc tacagagtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1080

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1140

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc ccagagaacc acaggtgtac 1200

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1260

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gcctgagaac 1320

aactacaaga ccacccctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1380

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1440

gaggctctgc acaaccacta cacccagaag agcctctccc tgtctcctgg caaagccaag 1500

cccaccacta cacccgcccc acgccccccc acccccgccc ccaccatcgc cagccagccc 1560

ctgagcctgc gccccgaggc ctgccgcccc gccgccggcg gcgccgtgca cacccgcggc 1620

ctggacttcg cctgcgactt ctgggtgctg gtggtggtgg gcggcgtgct ggcctgctac 1680

agcctgctgg tgaccgtggc cttcatcatc ttctgggtgc gcagcaagcg cagccgcctg 1740

ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc cgccgccccg gccccacccg caagcactac 1800

cagccctacg cccccccccg cgacttcgcc gcctaccgca gcaagcgcgg ccgcaagaag 1860

ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg cgccccgtgc agaccaccca ggaggaggac 1920

ggctgcagct gccgcttccc cgaagaagag gagggcggct gcgagctgcg cgtgaagttc 1980

agccgcagcg ccgagccccc cgcctaccag cagggccaga accagctgta caacgagctg 2040

aacctgggcc gccgcgagga gtacgacgtg ctggacaagc gccgcggccg cgaccccgag 2100

atgggcggca agccccgccg caagaacccc caggagggcc tgtacaacga gctgcagaag 2160

gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagcgccg ccgcggcaag 2220

ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggacaccta cgacgccctg 2280

cacatgcagg ccctgccccc ccgctga 2307

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgcaaatggg cggtaggcgt g 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catagcgtaa aaggagcaac a 21

Claims (5)

1. 一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，其编码核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.表达如权利要求1所述的融合CXCR3和αFR的嵌合抗原受体的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为CXCR3-αFR-CAR-NK92。

3. 根据权利要求2所述的免疫效应细胞，其特征在于，其由如下方法获取：将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CXCR3-αFR-CAR融合基因整合到空载的慢病毒表达载体，获得含有目的基因的表达载体；使用含有目的基因的表达载体转染宿主细胞获得含有目的基因的慢病毒；使用含有目的基因的慢病毒感染自然杀伤细胞NK92，获得所述免疫效应细胞。

4.根据权利要求1所述的一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体在制备治疗或者预防卵巢癌的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的一种融合CXCR3和αFR抗体的嵌合抗原受体在制备治疗或者预防卵巢癌的药物中的应用，其特征在于，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。

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