RU2747011C2 - Общие легкие цепи и способы их применения - Google Patents

Общие легкие цепи и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
RU2747011C2
RU2747011C2 RU2017121326A RU2017121326A RU2747011C2 RU 2747011 C2 RU2747011 C2 RU 2747011C2 RU 2017121326 A RU2017121326 A RU 2017121326A RU 2017121326 A RU2017121326 A RU 2017121326A RU 2747011 C2 RU2747011 C2 RU 2747011C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antigen
binding
molecule
cells
domain
Prior art date
Application number
RU2017121326A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017121326A3 (ru
RU2017121326A (ru
Inventor
Кристиан КЛЯЙН
Эккехард Мёсснер
Ральф Хоссе
Петер Брюнкер
Пабло Умана
Кристиане Егер
Original Assignee
Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of RU2017121326A publication Critical patent/RU2017121326A/ru
Publication of RU2017121326A3 publication Critical patent/RU2017121326A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2747011C2 publication Critical patent/RU2747011C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

Настоящая группа изобретений относится к иммунологии. Предложена активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включающая первую и вторую антигенсвязывающие части, в которой первая антигенсвязывающая часть способна специфически связываться с CD3, а вторая - с фолатным рецептором 1 (FolR1), причем обе части содержат одинаковую легкую цепь. Также описаны: полинуклеотид, кодирующий упомянутую молекулу, вектор, клетка-хозяин, способ получения молекулы, полипептиды, фармацевтическая композиция, применение молекулы для получения лекарственного средства и способ лечения FolR1-положительного рака. Данная группа изобретений может найти применение в терапии заболеваний, связанных с FolR1. 10 н. и 37 з.п. ф-лы, 43 ил., 46 табл., 48 пр.

Description

Перечень последовательностей
В настоящей заявке содержится перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и сущность которого полностью включена в настоящее описание в виде ссылки. Настоящую копию ASCII размером 537667 байт, созданную 10 ноября 2015 г., обозначают 32398_SL.txt.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение главным образом относится к биспецифическим антигенсвязывающим молекулам для активации Т-клеток. Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим такие биспецифические антигенсвязывающие молекулы, к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим такие полинуклеотиды. Изобретение также относится к способам получения биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению и к способам применения этих биспецифических антигенсвязывающих молекул в лечении заболеваний.
Предпосылки создания изобретения
Избирательное разрушение отдельной клетки или клеток определенного типа часто является желательным в разных схемах лечения. Например, основная цель в лечении рака заключается в том, чтобы уничтожить определенные опухолевые клетки, оставив здоровые клетки и ткани неповрежденными.
Привлекательным способом достижения этого является индуцирование иммунного ответа в отношении опухоли для получения иммунных эффекторных клеток, например, природных клеток-киллеров (natural killer cells - NK) или цитотоксических Т-лимфоцитов (cytotoxic T-lymphocytes - CTL), и разрушение опухолевых клеток. CTL являются наиболее эффективными эффекторными клетками иммунной системы, однако они не могут быть активированы эффекторным механизмом, опосредованным доменом Fc обычных терапевтических антител.
В связи с этим в последние годы активно исследуют биспецифические антитела, предназначенные для связывания одним «плечом» с поверхностным антигеном на клетках-мишенях (целевых клетках) и вторым «плечом» с активирующим постоянным компонентом комплекса рецептора Т-клеток (T-cell receptor - TCR). Одновременное связывание такого антитела с обеими мишенями заставляет временно взаимодействовать клетки-мишени и Т-клетки, вызывая активирование какой-либо цитотоксической Т-клетки и последующий лизис клетки-мишени. Таким образом, иммунный ответ перенаправляют к клеткам-мишеням, и он не зависит от презентации пептидного антигена клеткой-мишенью или от специфичности Т-клетки, что могло бы быть значимым для обычного активирования CTL, ограниченного главным комплексом гистосовместимости (МНС). В связи с этим чрезвычайно важно, чтобы CTL были активированы только в момент связывания биспецифического антитела с клеткой-мишенью и CTL, т.е. когда имитируется иммунологический синапс. Особенно желательными являются биспецифические антитела, которые не требуют предварительного доведения до требуемого состояния лимфоцитов или ко-стимуляции для того, чтобы вызвать эффективный лизис клеток-мишеней.
Разработано несколько биспецифических форматов антител и исследовано их применение в иммунотерапии, опосредованной Т-клетками. Из них, так называемые молекулы BiTE (bispecific T-cell engager - биспецифические T-клетки-захватчики) были очень хорошо охарактеризованы и уже показали некоторые перспективы в клиническом исследовании (рассмотренные в публикации Nagorsen и
Figure 00000001
, Exp Cell Res 317, 2011, 1255-1260). BiTE представляют собой тандемные молекулы scFv, в которых две молекулы scFv слиты с помощью гибкого линкера. К другим биспецифическим форматам, оцененным по взаимодействию Т-клеток, относят двойные антитела (диантитела) (Holliger с соавт., Prot Eng 9, 1996, 299-305) и их производные, например, тандемные диантитела (Kipriyanov с соавт., J Mol Biol 293, 1999, 41-66). Более поздними разработками являются так называемые молекулы двойного аффинного перенацеления (dual affinity retargeting - DART), которые основаны на формате двойных антител (диантител), но имеют С-концевой дисульфидный мостик для дополнительной стабилизации (Moore с соавт., Blood 117, 2011, 4542-4551). Так называемые тройные антитела (триантитела), которые являются целыми гибридными молекулами IgG мыши/крысы и в настоящее время оцениваются в клинических исследованиях, представляют формат большего размера (см. обзор Seimetz с соавт., Cancer Treat Rev 36, 2010, 458-467).
Разнообразие разрабатываемых форматов показывает большой потенциал, связанный с перенаправлением и активацией Т-клеток в иммунотерапии. Задача получения применимых с этой целью биспецифических антител, однако, ни в коем случае не является простой, и включает ряд проблем, которые необходимо решить, и которые связаны с эффективностью, токсичностью, применимостью и технологичностью антител.
Малые конструкции, например, молекулы BiTE, будучи способными эффективно сшивать эффекторные клетки и клетки-мишени, имеют очень короткий период полураспада в сыворотке, поэтому их следует вводить путем непрерывной инфузии. С другой стороны, IgG-подобные форматы, которые обладают большим преимуществом за счет длительного периода полураспада, имеют недостаток в виде токсичности, ассоциированной с нативными эффекторными функциями, присущими молекулам IgG. Их иммуногенный потенциал представляет собой еще одну неблагоприятную особенность IgG-подобных биспецифических антител, особенно не принадлежащих человеку, для успешной терапевтической разработки. Наконец, основной проблемой в общем развитии биспецифических антител является получение конструкций биспецифического антитела в клинически достаточном количестве и в чистом состоянии из-за неправильного спаривания тяжелых и легких цепей антител с различной специфичностью при совместной экспрессии, что уменьшает выход правильно собранной конструкции и приводит к ряду нефункциональных побочных продуктов, от которых желаемое биспецифическое антитело может быть трудно отделимым.
Учитывая трудности и недостатки, связанные с имеющимися в настоящее время биспецифическими антителами для иммунотерапии, опосредованной Т-клетками, остается потребность в новых улучшенных форматах таких молекул.
Краткое описание изобретения
В первом объекте настоящего изобретения предусматривают активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую первую и вторую антигенсвязывающие части молекулы, в которой первая антигенсвязывающая часть молекулы включает первую легкую цепь, и в которой первая антигенсвязывающая часть молекулы способна специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, и вторая антигенсвязывающая часть молекулы включает вторую легкую цепь, причем вторая антигенсвязывающая часть молекулы способна специфически связываться с антигеном целевых клеток, и аминокислотные последовательности первой и второй легких цепей идентичны. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы является Fab. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторая антигенсвязывающая часть молекулы является Fab. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первой и второй антигенсвязывающей частью молекулы является Fab.
В одном из объектов настоящего изобретения предусматривают активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую первую и вторую антигенсвязывающие части молекулы, одна из которых является молекулой Fab, способной специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, а вторая является молекулой Fab, способной специфически связываться с антигеном целевых клеток, причем первая и вторая молекулы Fab содержат идентичные легкие цепи VLCL.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, дополнительно включает домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц, способных к стабильной ассоциации.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает легкую цепь, включающую CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, представляет легкую цепь, включающую SEQ ID NO: 31.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула Fab включает тяжелую цепь, содержащую CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39.
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения не более одной антигенсвязывающей части молекулы, способной специфически связываться с антигеном, активирующем Т-клетки, присутствует в активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекуле, что обеспечивает моновалентное связывание с антигеном, активирующим Т-клетки.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первую и вторую антигенсвязывающие части активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, сливают друг с другом необязательно с помощью пептидного линкера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторую антигенсвязывающую часть молекулы сливают на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом Fab тяжелой цепи первой антигенсвязывающей части молекулы. В другом близком варианте осуществления настоящего изобретения первую антигенсвязывающую часть молекулы сливают на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом Fab тяжелой цепи второй антигенсвязывающей части молекулы. В еще одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения вторую антигенсвязывающую часть молекулы сливают на С-конце легкой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab легкой цепи первой антигенсвязывающей части молекулы. В еще одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения первую антигенсвязывающую часть молекулы сливают на С-конце Fab легкой цепи с N-концом Fab легкой цепи второй антигенсвязывающей части молекулы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первую антигенсвязывающую часть активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающ молекулы сливают на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом первой или второй субъединицы домена Fab.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторую антигенсвязывающую часть активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы сливают на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом первой или второй субъединицы домена Fab.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения первую антигенсвязывающую часть молекулы сливают на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каждую из первой и второй антигенсвязывающих частей активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы сливают на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом одной из субъединиц домена Fc.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включает третью антигенсвязывающую часть молекулы, которая является молекулой Fab, способной специфически связываться с антигеном целевых клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанной третьей антигенсвязывающей частью молекулы является молекула Fab, включающая идентичную VLCL легкую цепь в качестве первой и второй антигенсвязывающих частей молекулы.
В одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения каждая из первой, второй и третьей антигенсвязывающих частей молекулы является молекулой Fab, включающей CDR легкой цепи SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34.
В одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения каждая из первой, второй и третьей антигенсвязывающих частей молекулы является молекулой Fab, включающей легкую цепь, включающую SEQ ID NO: 31.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третья антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каждая из второй и третьей антигенсвязывающих частей молекулы, связывающей антиген, который активирует Т-клетки, слита на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом одной из субъединиц домена Fc, и первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом Fab тяжелой цепи второй антигенсвязывающей части молекулы. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения каждая из первой и третьей антигенсвязывающих частей молекулы, связывающей антиген, который активирует Т-клетки, слита на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом одной из субъединиц домена Fc, и вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом Fab тяжелой цепи первой антигенсвязывающей части молекулы. Компоненты активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы могут быть слиты напрямую или через соответствующие пептидные линкеры. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторая и третья антигенсвязывающие части молекулы и домен Fc являются частью молекулы иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая и третья антигенсвязывающие части молекулы и домен Fc являются частью молекулы иммуноглобулина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекулой иммуноглобулина является иммуноглобулин класса IgG. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулин является иммуноглобулином подкласса IgG1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулин является иммуноглобулином подкласса IgG4.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG1. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG4. В еще одном более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG4, включающим замещение аминокислоты S228P. В еще одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG4, включающим замещения аминокислот L235E и S228P (SPLE). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доменом Fc является домен Fc человека.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc включает модификацию, которая индуцирует ассоциацию первой и второй субъединицы домена Fc. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислотный остаток в домене СН3 первой субъединицы домена Fc замещен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, тем самым, создавая выступ в домене СН3 первой субъединицы, который располагается в полости внутри домена СН3 второй субъединицы, и аминокислотный остаток в домене СН3 второй субъединицы домена Fc замещен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, тем самым, создавая впадину в домене СН3 второй субъединицы, в которую выступ в домене СН3 первой субъединицы устанавливается.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc проявляет пониженное связывающее сродство с рецептом Fc и/или пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативным доменом Fc IgG1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc конструируют таким образом, чтобы иметь пониженное связывающее сродство с рецептором Fc и/или пониженную эффекторную функцию по сравнению с не реконструированным доменом Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc включает одно или несколько аминокислотных замещений, которые снижают связывание с рецептором Fc и/или эффекторную функцию. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения одно или несколько аминокислотных замещений в домене Fc, которые снижают связывание с рецептором Fc и/или эффекторную функцию, находятся в положении, выбранном из группы L234, L235 и Р329 (нумерация по Kabat). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения каждая субъединица в домене Fc включает три аминокислотных замещения, которые снижают связывание с рецептором Fc и/или эффекторную функцию, причем указанными аминокислотными замещениями являются L234A, L235A и P329G. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доменом Fc является домен Fc IgG1, особенно домен Fc IgG1 человека. В других вариантах осуществления настоящего изобретения каждая субъединица домена Fc включает два аминокислотных замещения, которые снижают связывание с рецептором Fc и/или эффекторную функцию, причем указанными аминокислотными замещениями являются L235E и P329G. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доменом Fc является домен Fc IgG4, особенно домен Fc IgG4 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является рецептором Fcγ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является рецептором Fc человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептором Fc является активирующим рецептором Fc. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является рецептором FcγRIIa, FcγRI и/или FcγRIIIa человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффекторная функция является антителозависимой клеточно-обусловленной цитотоксичностью (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулой является CD3. В других вариантах осуществления настоящего изобретения антигеном целевой клетки, который может связывать биспецифическая антигенсвязывающая молекула, является антиген опухолевой клетки. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антиген опухолевой клетки выбран из группы, включающей: рецептор фолиевой кислоты 1 (Folate Receptor 1 - FolR1), муцин-1 (Mucin-1 - MUC1) и антиген созревания В-клеток (B-Cell Maturation Antigen - ВСМА). В одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения антиген целевой клетки не является ВСМА.
В другом объекте настоящего изобретения предусматривают легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34 для использования в активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекуле. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В другом объекте настоящего изобретения предусматривают легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34 для использования в библиотеке для получения активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В другом объекте настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
В другом объекте настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В другом объекте настоящего изобретения предусматривают выделенный полинуклеотид, кодирующий активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению или ее фрагмент. Настоящее изобретение также охватывает полипептид, кодируемый полинуклеотидом по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также предусматривает вектор экспрессии, включающий выделенный полинуклеотид по настоящему изобретению, и клетку-хозяина, включающую выделенный полинуклеотид или вектор экспрессии по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин является эукариотической клеткой, особенно клеткой млекопитающих.
В другом объекте настоящего изобретения предусматривают способ получения активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, включающий стадии а) культивирования клеток-хозяев по настоящему изобретению в условиях, пригодных для экспрессии активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению б) выделения активирующую Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы. Настоящее изобретение также предусматривает активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, получаемую способом настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую композицию, включающую активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также предусматривает способы применения активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы и фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению для применения в лечении заболевания индивидуума, нуждающегося в этом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения заболеванием является рак.
В настоящем изобретении также предусматривают применение активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы для получения лекарственного средства для лечения заболевания индивидуума, нуждающегося в этом, а также предусматривают способ лечения заболевания индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, включающей активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемой форме. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболеванием является рак. В каком-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения индивидуумом предпочтительно является млекопитающее, особенно человек.
Настоящее изобретение также предусматривает способ индукции лизиса целевых клеток, особенно раковых клеток, включающий контакт целевых клеток с активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулой в присутствии Т-клеток, особенно цитотоксических Т-клеток.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают способ идентификации вариабельной тяжелой цепи для применения в активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекуле и антигена целевых клеток, включающий стадию скрининга комбинаторной библиотеки, содержащей вариабельные тяжелые цепи с легкой цепью, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
Краткое описание фигур
Фиг. 1А-И. Примеры конфигураций активирующих Т-клетки (ТСВ) биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Все конструкции, кроме формата каппа-лямбда (фиг. 1I), имеют мутации P329G LALA и содержат фрагменты Fc по типу «выступ-во-впадину» с модификациями типа «выступ-во-впадину». (Фиг. 1А). Иллюстрация конфигурации молекулы «FolR1 ТСВ 2+1 инвертированная (общая легкая цепь)». Связующее FolR1 сливают на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом первой субъединицы домена Fc, содержащей модификацию выступа. Эти конструкции не пересекаются и трижды содержат одну и ту же легкую цепь VLCL. (Фиг. 1Б) Иллюстрация конфигурации молекулы «FolR1 ТСВ 1+1 «голова-к-хвосту» (общая легкая цепь)». Эти конструкции не пересекаются и дважды содержат одну и ту легкую цепь VLCL. (Фиг. 1В) Иллюстрация конфигурации молекулы «FolR1 ТСВ 1+1 классическая (общая легкая цепь)». Эти конструкции не пересекаются и дважды содержат одну и ту же VLCL легкой цепи. (Фиг. 1Г) Иллюстрация конфигурации молекулы «FolR1 ТСВ 2+1 классическая (обычная легкая цепь)». Связующее CD3 слито на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом первой субъединицы домена Fc, содержащей модификацию выступа. Эти конструкции не пересекаются и трижды содержат одну и ту же легкую цепь VLCL. (Фиг. 1Д) Иллюстрация конфигурации молекулы «FolR1 ТСВ 2+1 crossfab классическая». Эти конструкции содержат цепь Ck-VH для связующего CD3 вместо обычной цепи CH1-VH. Связующее CD3 сливают на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом первой субъединицы домена Fc, содержащей модификацию выступа. (Фиг. 1Е) Иллюстрация конфигурации молекулы «FolR1 ТСВ 2+1 crossfab инвертированная». Эти конструкции содержат цепь Ck-VH для связующего CD3 вместо обычной цепи CH1-VH. Связующее FolR1 слито на С-конце Fab тяжелой цепи с N-концом первой субъединицы домена Fc, содержащего модификацию выступа. (Фиг. 1Ж) Иллюстрация конфигурации молекулы «FolR1 ТСВ 1+1 crossfab голова-к-хвосту». Эти конструкции содержат цепь Ck-VH для связующего CD3 вместо обычной цепи CH1-VH. (Фиг. 13) Иллюстрация конфигурации молекулы «FolR1 ТСВ 1+1 crossfab классическая». Эти конструкции включают цепь Ck-VH для связующего CD3 вместо обычной цепи CH1-VH. Фиг. 1И показывает CD3/FolR1 каппа-лямбда формат антитела. Эти конструкции включают перекрестную общую легкую цепь VLCH1 и одну перекрестную цепь VHCL, специфичную для CD3, и одну перекрестную цепь VHCL, специфичную в отношении FolR1.
Фиг. 2А-В. Графики, суммирующие связывание связующих FoLR1 IgG с клетками HeLa. Связывание вновь полученных связующих FolR1 с FolR1, экспрессируемых на клетках HeLa, определяют с помощью жидкостной цитометрии. Связанные антитела обнаруживают с помощью флуоресцентно меченого anti-human вторичного антитела.
Фиг. 3А-Б. Графики, суммирующие специфичность связующих FolR1 в отношении FolR1. Связывание FolR1 IgG с клетками HEK, временно трансфецированными FolR1 или FolR2, исследуют методом жидкостной цитометрии для выявления клонов, специфически связывающихся с FolR1, но не с FolR2. Антитела выявляют с помощью флуоресцентно меченого anti-human вторичного антитела.
Фиг. 4А-Б. Графики, суммирующие перекрестную реактивность связующих FolR1 с cyFoLR1 (FoLR1 макака крабоеда). Перекрестную реактивность FolR1 антител к cyFolR1 рассматривают на клетках HEK, временно трансфецированных cyFolR1, методом жидкостной цитометрии. Антитела выявляют с помощью флуоресцентно меченого anti-human вторичного антитела.
Фиг. 5. Графики, иллюстрирующие интернализацию FolR1 ТСВ после связывания. Интернализацию четырех FALR1 ТСВ после связывания с FolR1 исследуют на клетках HeLa. Остальные FolR1 ТСВ на поверхности выявляют с помощью флуоресцентно меченого anti-human вторичного антитела после установленного времени инкубирования при 37°C. Рассчитывают процент интернализации.
Фиг. 6А-Д. Графики, суммирующие связывание FolR1 IgG с клетками с разным уровнем экспрессии FolR1. Связывание 9D11, 16D5 и Mov19 IgG с опухолевыми клетками с разными уровнями экспрессии FolR1 исследуют методом жидкостной цитометрии. DP47 IgG включают в качестве контроля изотипа, MKN-45 включают в качестве FolR1-отрицательной линии клеток. Антитела выявляют с помощью флуоресцентно меченого anti-human вторичного антитела.
Фиг. 7А-М. Графики, суммирующие опосредованное Т-клетками уничтожение клеток НТ-29 и SKOV3. FolR1 ТСВ применяют для тестирования опосредованного Т-клетками уничтожения опухолевых клеток НТ-29 и SKOV3 и повышения регуляции маркера активации на Т-клетках после уничтожения. (Фиг. 7А-Г) Опосредованное Т-клетками уничтожение клеток НТ-29 и SKOV3 в присутствии 9D11 FolR1 ТСВ и 16D5 FolR1 ТСВ измеряют по высвобождению LDH через 24 ч и 48 ч. DP47 ТСВ включают в качестве отрицательного контроля. После 48 ч инкубирования повышение регуляции маркера активации CD25 и CD69 на CD8 Т-клетках и CD4 Т-клетках после уничтожения опухолевых клеток SKOV3 (фиг. 7Д-З) или НТ-29 (фиг. 7И-М) оценивают методом жидкостной цитометрии.
Фиг. 8. Графики, показывающие отсутствие анти-FolR1 связывания с эритроцитами. Эритроциты рассматривают в виде CD235a-положительной популяции, и связывание IgG 9D11, IgG 16D5, IgG Mov19 и IgG DP47 с этой популяцией определяют с помощью жидкостной цитометрии. Антитела выявляют с помощью флуоресцентно меченого anti-human вторичного антитела.
Фиг. 9А-Г. Графики, суммирующие повышение регуляции маркера активации в цельной крови. Повышение регуляции маркера активации CD25 и CD69 CD4 Т-клеток и CD8 Т-клетки через 24 ч после внесения 15 9D11 FolR1 ТСВ, 16D5 FolR1 ТСВ, Mov19 FolR1 ТСВ и DP47 ТСВ определяют с помощью жидкостной цитометрии.
Фиг. 10. Связывание вариантов a-glyco 9D11 ТСВ с клетками HeLa. Связывание агликовариантов 9D11 FolR1 ТСВ с клетками Hela сравнивают со связыванием исходного 9D11 ТСВ с клетками HeLa. Антитела выявляют с помощью флуоресцентно меченого anti-human вторичного антитела, связывание определяют с помощью жидкостной цитометрии.
Фиг. 11А-Е. Графики, суммирующие опосредованное Т-клетками уничтожение с 9D11 FolR1 ТСВ агликовариантами опухолевых клеток. Варианты a-glyco 9D11 FolR1 ТСВ используют для тестирования опосредованного Т-клетками уничтожения опухолевых клеток (фиг. А-Г) SKOV3, MKN-45 (отрицательный контроль FolR1) и (фиг. 11Д-Е) НТ-29 по сравнению с уничтожением с исходным 9D11 FolR1 ТСВ. Заключение делают по оценке высвобождения LDH через 24 ч и 48 ч.
Фиг. 12А-Ч. Графики, суммирующие опосредованное Т-клетками уничтожение первичных эпителиальных клеток. Первичные эпителиальные клетки с очень низкими уровнями FolR1 применяют для тестирования опосредованного Т-клетками уничтожения с 16D5 FolR1 ТСВ и 9D11 FolR1 ТСВ, DP47 ТСВ включают в качестве отрицательного контроля, а клетки НТ29 включают в качестве положительного контроля. (Фиг. 12А-З) Высвобождение LDH пигментными клетками сетчатки человека (human retinal pigment - HRP), клетками коры почки человека (human renal cortical - HRC), бронхиальными клетками человека (human bronchial - НВ) и клетками НТ29 определяют через 24 ч и 48 ч. Повышение регуляции маркера активации CD25 и CD69 на CD4 Т-клетках и CD8 Т-клетках после уничтожения (фиг. 12И-М) HRP, (фиг. 12Н_Р) HRC, (фиг. 12Q-T) НВ и (фиг. 12 Х-Ш) НТ29 определяют через 48 ч методом жидкостной цитометрии.
Фиг. 13А-В. Сравнение различных форматов ТСВ с 16D5. Четыре разных формата ТСВ, включающих FolR1 связующее 16D5. Фиг. 13А - связывание с клетками HeLa, фиг. 14Б - опосредованное Т-клетками уничтожение клеток SKOV3 через 24 ч и 48 ч, фиг. В - повышение регуляции маркеров активации CD25 and CD69 на CD4 Т-клетках и CD8 Т-клетках через 48 ч после уничтожения.
Фиг. 14А-В. Сравнение различных форматов ТСВ с 9D11. Три разных формата ТСВ, содержащих FolR1 связующее 9D11, сравнивают при А) связывании с клетками HeLa, Б) опосредованном Т-клетками уничтожении клеток SKOV3 через 24 ч и 48 ч в и В) повышенной регуляции маркеров активации CD25 и CD69 на CD4 Т-клетках и CD8 Т-клетках через 48 ч после уничтожения.
Фиг. 15. PK-профиль FOLR1 ТСВ в мышах NOG для трех разных доз.
Фиг. 16. Протокол эксперимента для изучения эффективности с FOLR1 ТСВ.
Фиг. 17А-Б. Кривые роста опухоли. Средние величины и SEM объемов опухолей в группах с разным лечением (фиг. 17А). Рост опухоли одиночных мышей во всех группах лечения (фиг. 17Б). Показатель TGI (подавление роста опухоли - tumor growth inhibition) означает процент среднего объема опухоли по сравнению с группой, в которой применяют растворитель.
Фиг. 18. Вес опухоли при завершении исследования.
Фиг. 19А-Б. Анализ методом FACS инфильтрации в опухоль Т-клеток на 32 сутки исследования. (Фиг. 19А) Суспензии отдельных опухолевых клеток окрашивают анти-human CD3/CD4/CD8 и исследуют методом жидкостной цитометрии. (фиг. 19Б) Средние величины и SEM подсчетов Т-клеток на мг ткани опухоли в группах с разным лечением.
Фиг. 20А-Б. Анализ методом FACS активации/дегрануляции и секреции цитокина Т-клетками на 32 сутки исследования. CD4+ (фиг. 20А) и CD8+ (фиг. 20Б) инфильтрующиеся в опухоль Т-клетки окрашивают на маркеры цитокинов, активации и дегрануляции. Представлены средние величины и SEM подсчетов Т-клеток на мг ткани опухоли в группах с разным лечением.
Фиг. 21А-Б. Процент лизиса опухолевых клеток. Клетки SKOV3 инкубируют вместе с МКПК в присутствии или каппа-лямбда FoLR1 ТСВ, или DP47 ТСВ. Через 24 ч (фиг. 21А) и 48 ч (фиг. 21В) уничтожение опухолевых клеток определяют путем измерения высвобождения LDH.
Фиг. 22А-Г. Повышение регуляции CD25 и CD69 на CD4 Т-клетках. Клетки SKOV3 инкубируют с МКПК в присутствии или каппа-лямбда FoLR1 ТСВ, или DP47 ТСВ. Через 48 ч CD25 и CD69 повышенную регуляцию на CD4 Т-клетках (фиг. 22А-Б) и CD8 Т-клетках (фиг. 22В-Г) определяют методом жидкостной цитометрии.
Фиг. 23А-Б. Процент лизиса опухоли. Уничтожение Т-клетками клеток SKov-3 (среднее содержание FolR1), индуцированное 36F2 ТСВ, Mov19 ТСВ и 21А5 ТСВ через 24 ч (фиг. 23А) и 48 ч (фиг. 23Б) инкубирования (Е:Т=10:1, эффекторные МКПК человека).
Фиг. 24А-В. Уничтожение Т-клетками, индуцированное конструкциями 36F2 ТСВ, 16D5 ТСВ, 16D5 ТСВ классическая, 16D5 ТСВ 1+1 и 16D5 ТСВ НТ, опухолевых клеток человека Hela (высокое содержание FolR1) (фиг. 24A), Skov-3 (среднее содержание FolR1) (фиг. 24Б) и НТ-29 (низкое содержание FolR1) (фиг. 24В) (Е:Т=10:1, эффекторные МКПК человека, время инкубирования 24 ч). DP47 ТСВ включают в качестве несвязывающегося контроля.
Фиг. 25А-В. Повышение регуляции CD25 и CD69 на CD8+ (фиг. 25А, Б) и CD4+ (фиг. 25В) Т-клетках человека после опосредованного Т-клетками уничтожения клеток Hela (высокое содержание FolR1) (фиг. 25А), клеток SKov-3 (среднее содержание FolR1) (фиг. 25Б) и клеток НТ-29 (низкое содержание FolR1) (фиг. 25В) (Е:Т=10:1, 48 ч инкубирования), индуцированного 36F2 ТСВ, 16D5 ТСВ и DP47 ТСВ (несвязывающий контроль).
Фиг. 26А-Е. Уничтожение Т-клетками, индуцированное 36F2 ТСВ, 16D5 ТСВ и DP47 ТСВ, эпителиальных клеток коркового вещества почки человека (фиг. 26А, Б), пигментированных эпителиальных клеток сетчатки (фиг. 26В, Г) и клеток Т-29 (фиг. 26Д, Е) после 24 ч (фиг. 26А, В, Д) и 48 ч (фиг. 26Б, Г, Е) инкубирования (Е:Т=10:1, эффекторы МКПК человека).
Фиг. 27. Представлена таблица, суммирующая подсчет сайтов связывания FolR1 на различных здоровых и раковых линиях клеток.
Фиг. 28А-Б. Связывание конструкции 16D5 ТСВ и соответствующих ей CD3 дезаминированных вариантов 16D5 ТСВ N100A и 16D5 ТСВ S100aA, а также 9D11 ТСВ и соответствующих ей 9D11 ТСВ N100A и 9D11 ТСВ S100aA с CD3 человека, экспрессированными на клетках Jurkat.
Фиг. 29А-Б. Уничтожение Т-клетками опухолевых клеток человека SKov-3 (среднее содержание FolR1), индуцированное 16D5 ТСВ и соответствующими дезамидированными вариантами CD3 16D5 ТСВ N100A и 16D5 ТСВ S100aA (фиг. 29А), а также 9D11 ТСВ и соответствующими дезамидированными вариантами 9D11 ТСВ N100A и 9D11 ТСВ S100aA (фиг. 29Б) (Е:Т=10:1, эффекторные МКПК человека, время инкубирования 24 ч). DP47 ТСВ включают в качестве несвязывающего контроля.
Фиг. 30А-Б. Уничтожение Т-клетками опухолевых клеток человека НТ-29 (низкое содержание FolR1), индуцированное 16D5 ТСВ и соответствующими CD3 дезамидированными вариантами 16D5 ТСВ N100A и 16D5 ТСВ S100aA (фиг. 30А), а также 9D11 ТСВ и соответствующими дезамидированными вариантами 9D11 ТСВ N100A и 9D11 ТСВ S100aA (фиг. 30Б) (Е:Т=10:1, эффекторные МКПК человека, время инкубирования 24 ч). DP47 ТСВ включают в качестве несвязывающего контроля.
Фиг. 31. Выравнивание последовательности доменов VH и трех выявленных MUC1-специфических связующих. Все три клона производны от зародышевой линии IGHV3-23 (SEQ ID NO: 136). Клоны 15 58D6 (SEQ ID NO: 60) и 110A5 (SEQ ID NO: 64) происходят из библиотеки, которая была рандомизирована только в CDR3, тогда как клон 106D2 (SEQ ID NO: 62) был идентифицирован из библиотеки, рандомизированной во всех 3 CDR. Положения в CDR1 и 2, которые отклоняются от последовательности зародышевой линии, напечатаны курсивом.
Фиг. 32А-Б. Результаты описания связующих CLC. (Фиг. 32А) Анализ SPR. Основанный на SPR кинетический анализ трех клонов, специфически связывающихся с MUC1. Сплошные линии означают общую установку данных к модели взаимодействия 1:1. (Фиг. 32Б) Суммирование кинетических и термодинамических параметров.
Фиг. 33. Схематическое представление полученной конструкции ТСВ. Конструкция CLC ТСВ состоит из 3 разных цепей иммуноглобулина: 1) тяжелой цепи IgG, несущей мутации типа «полость» в части Fc и содержащей специфичный в отношении мишени домен VH; 2) цепи Ig, содержащей специфичный в отношении мишени домен VH и домен СН1, за ним CD3-специфичный домен VH и домен СН1, за ними часть Fc, содержащую мутации типа «выступ»; и 3) общей легкой цепи, которая отжигает как MUC1-специфичные, так и CD3-специфичные последовательности.
Фиг. 34А-Б. Очистка и анализ полученных MUC1-специфичных ТСВ (фиг. 34А и фиг. 34Б). Метод очистки включает стадию аффинной хроматографии (белок А) с последующей эксклюзионной хроматографией (колонка Superdex 200, фирма GE Healthcare). Конечный продукт исследуют и описывают с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии (колонка Superdex 200) и капиллярного электрофореза.
Фиг. 35. Исследование методом SPR MUC1 -специфических связующих в формате ТСВ. Показано связывание 2 MUC1-специфических ТСВ в разных концентрациях (см. текст) как с MUC1, так и с неродственным антигеном. Сплошные линии означают общую установку данных к модели взаимодействия 1:1.
Фиг. 36А-Ж. Биспецифические двухвалентные и трехвалентные антитела, включающие только фрагменты Fab (специфичные в отношении CD3 и ВСМА) с частью Fc: (A) Fab ВСМА10 Fc-Fab CD3; (Б) Fab BCMA-Fc-Fab CD3-Fab ВСМА; (В) Fab BCMA-Fc-Fab BCMA-Fab CD3; (Г) Fc-Fab CD3-Fab ВСМА; (Д) Fc-Fab BCMA-Fab CD3; (E) Fab CD3-Fab BCMA-Fab ВСМА; (Ж) Fab CD3-Fab BCMA. Предпочтительно, LC CD3 Fab и ВСМА Fab идентичны (общая LC), что позволяет избежать ошибочного спаривания LC и снизить возникновение побочных продуктов. CD3 Fab и ВСМА Fab связаны между собой гибкими линкерами.
Фиг. 37. Утрата связывания ВСМА IgG антитела с рецептором TACI, установленная методом поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance - SPR). Кривая 1 соответствует сигналу контрольного канала, кривая 2 соответствует каналу, по которому происходит связывание (связывающий канал) и кривая 2-1 представляет сигнал субстрата (канал связывания - контрольный канал), из чего следует, что это сигнал, возникающий из-за связывания. Анализ связывания SPR четко показывает, что pSCHLI372 IgG не связывается с рецептором TACI человека.
Фиг. 38А-В. Получение и очистка ВСМА-ТСВ CLC. Изображение CE-SDS (невосстановленный (вверху) и восстановленный (внизу)) итоговых белковых препаратов после стадий очистки аффинной хроматографии с белком A (Protein А - РА) и эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatographic - SEC) применительно к (A) pSCHLI333-TCB CLC, (Б) pSCHLI372-TCB CLC, (В) pSCHLI373-TCB CLC. Молекулярный формат всех трех молекул показан на фиг. 36Б.
Фиг. 39А-Б. Связывание антител ВСМА-ТСВ CLC на BCMAhi-положительных клетках Н929, показанное методом жидкостной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции ВСМА-ТСВ CLC антител нанесена на график в зависимости от концентраций антитела (от 0,12 до 500 нМ); (А) pSCHLI372-TCB CLC и pSCHLI373-TCB CLC на клетках Н929 (А) и клетках MKN45 (Б). DP47-TCB представляет отрицательный контроль ТСВ, который не связывается с ВСМА в концентрациях ниже 100 нМ (см. пример 7).
Фиг. 40А-Б. Связывание антител ВСМА-ТСВ CLC на CD3-положительных Jurkat Т-клетках, показанное методом жидкостной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции для ВСМА-ТСВ CLC антител (pSCHLI372-TCB CLC и pSCHLI373-TCB CLC), связывающихся с Jurkat Т-клетками, представлена на графике в зависимости от концентрации антитела. Не установлено связывания с ВСМА-отрицательными и CD3-отрицательными клетками MKN45 в концентрациях ниже 100 нМ.
Фиг. 41. Активация Т-клеток, опосредованная ВСМА-ТСВ CLC антителами в присутствии клеток Н929, по результатам жидкостной цитометрии. Уровень экспрессии маркера ранней активации CD69 и маркера поздней активации CD25 на CD4+ и CD8+ Т-клетках через 48 ч инкубирования. pSCHLI372-TCB CLC и pSCHLI373-TCB CLC антитела индуцируют повышение регуляции маркеров активации CD69 и CD25 зависящим от концентрации образом и специфически в присутствии ВСМА-положительных целевых клеток. Применяют соотношение Е:Т = 10 МКПК:1 клетка Н929; клетки инкубируют в течение 48 ч перед измерением повышенной регуляции CD69 и CD25. DP47-TCB является отрицательным контролем ТСВ, который не индуцирует активации Т-клеток. Представленные результаты получены от двух независимых экспериментов.
Фиг. 42А-Б. ВСМА-ТСВ CLC антитела индуцируют перенаправление уничтожения Т-клетками BCMAhi-положительных клеток миеломы Н929, установленное колориметрическим методом по высвобождению LDH. ВСМА-ТСВ CLC антитела pSCHLI372-TCB CLC (А, Б) и pSCHLI373-TCB CLC (А) индуцируют зависящее от концентрации уничтожение BCMAhi-положительных клеток миеломы Н929, установленное по высвобождению LDH. DP47-TCB является отрицательным контролем ТСВ, который не связывается с ВСМА, а только с CD3, и не индуцирует уничтожение клеток Н929. Соотношение Е:Т 10 МКПК:1 Н929 клетка; клетки инкубируют в течение 24 ч перед измерением высвобождение LDH. Результаты получены от трех независимых экспериментов.
Фиг. 43. ВСМА-ТСВ CLC антитела индуцируют перенаправление уничтожения Т-клетками BCMAmed/lo-положительных клеток со средним и низким уровнем ВСМА миеломы U266, установленное колориметрическим методом по высвобождению LDH. ВСМА-ТСВ CLC антитела pSCHLI372-TCB CLC и pSCHLI373-TCB CLC индуцируют зависящее от концентрации уничтожение BCMAmed/lo-положительных клеток со средним и низким уровнем ВСМА клеток миеломы U266, установленное по высвобождению LDH. DP47-ТСВ является отрицательным контролем ТСВ, который не связывается с ВСМА, а только с CD3, и не индуцирует уничтожение клеток Н929. Соотношение Е:Т равно 10 МКПК:1 U266 клетка; клетки инкубируют в течение 24 ч перед измерением высвобождение LDH. Результаты получены от двух независимых экспериментов.
Подробное описание изобретения
Определения
Термины, используемые в настоящем изобретении, являются теми же, которые обычно применяют в данной области, если ниже в описании не указано иначе. Понятие «антигенсвязывающая молекула» в самом широком смысле слова относится к молекуле, которая специфически связывает антигенный детерминант. Примерами антигенсвязывающих молекул являются иммуноглобулины и их производные, например, фрагменты.
Понятие «биспецифическая» означает, что антигенсвязывающая молекула может специфически связываться, по меньшей мере, с двумя разными антигенными детерминантами. Обычно биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает два антигенсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для определенного антигенного детерминанта. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна одновременно связывать два антигенных детерминанта, в частности два антигенных детерминанта, экспрессируемых на двух разных клетках.
Используемое в настоящем изобретении понятие «валентность» означает наличие определенного числа сайтов связывания антигена в антигенсвязывающей молекуле. Таким образом, понятие «моновалентное связывание с антигеном» означает наличие одного (не более одного) сайта связывания антигена, специфичного в отношении антигена в антигенсвязывающей молекуле.
Понятие «сайт связывания антигена» относится к сайту, то есть к одному или нескольким аминокислотным остаткам антигенсвязывающей молекулы, которая обеспечивает взаимодействие с антигеном. Например, сайт связывания антигена антитела содержит аминокислотные остатки из областей, определяющих комплементарность (complementarity determining region - CDR). Нативная молекула иммуноглобулина обычно имеет два антигенсвязывающих сайта, а молекула Fab обычно имеет единственный сайт связывания антигена. В настоящем изобретении понятие «антигенсвязывающий фрагмент» относится к молекуле полипептида, которая специфически связывается с антигенным детерминантом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающая часть молекулы способна направлять объект, к которому она присоединена (например, вторую антигенсвязывающую часть молекулы), к целевому сайту, например, к определенному типу опухолевой клетки или к телу опухоли, несущей антигенный детерминант. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающая часть молекулы способна активировать передачу сигнала через соответствующий целевой антиген, например, комплексный антиген рецептора Т-клеток. Антигенсвязывающие части молекулы включают антитела и их фрагменты, подробно описанные в настоящем изобретении. Конкретные антигенсвязывающие части молекулы включают антигенсвязывающий домен антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие части молекулы могут включать константные области антитела, которые дополнительно определены в настоящем изобретении и известны в данной области. Пригодные константные области тяжелой цепи включают какие-либо из пяти изотипов: α-, γ-, δ-, ε- или μ. Пригодные константные области легкой цепи включают какие-либо из двух изотипов: κ и λ.
Используемое в настоящем изобретении понятие «антигенная детерминанта» является синонимом «антигена» и «эпитопа» и относится к сайту (например, к смежному участку аминокислот или конформационной конфигурации, состоящей из разных областей несмежных аминокислот) в полипептидной макромолекуле, с которой связывается антигенсвязывающая часть молекулы, образуя комплекс антигенсвязывающей части молекулы с антигеном. Применимые антигенные детерминанты можно найти, например, на поверхностях опухолевых клеток, на поверхностях зараженных вирусом клеток, на поверхностях других связанных с болезнями клеток, на поверхности иммунных клеток, в свободном виде в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (extracellular matrix - ЕСМ). Белки, называемые в настоящем изобретении антигенами (например, MCSP, FAP, СЕА, EGFR, CD33, CD3), могут быть какими-либо нативными формами белков от какого-либо позвоночного животного, в том числе от млекопитающего, например, от приматов (например, от людей) и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иначе. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигеном является белок человека. В настоящем изобретении в отношении определенных белков данное понятие охватывает белок «полной длины», не подвергнутый воздействию белок, а также какую-либо форму белка, которая возникает в результате процессирования в клетке. Это понятие также охватывает природные варианты белка, например, варианты сплайсинга или аллельные варианты. К примерам белков человека, которые могут быть применены, относятся, но ими перечень не ограничивается, рецептор фолиевой кислоты 1 (или фолатный рецептор 1; Folate Receptor 1 - FolR1), рецептор фолиевой кислоты альфа (Folate receptor alpha - FRA), фолат-связывающий белок (Folate binding protein - FBP); FolR1 человека UniProt no.: P15328; FolR1 мыши UniProt no.: P35846; FolR1 макака крабоеда UniProt no.: G7PR14, Mucin-1 (MUC1) и антиген созревания B-клеток (B-Cell Maturation Antigen - ВСМА), CD3, особенно эпсилон-субъединица CD3 (см. UniProt no. Р07766 (версия 130), NCBI RefSeq no. NP 000724.1 для последовательности человека или UniProt no. Q95LI5 (версия 49), NCBI GenBank no. ВАВ71849.1 для последовательности макака крабоеда Macaca fascicularis).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению связывается с эпитопом активирующего Т-клетки антигена или антигена клетки-мишени, который сохраняется среди активирующего Т-клетки антигена или целевого антигена разных видов.
Понятие «специфическое связывание» означает, что связывание является избирательным в отношении антигена и его можно отличить от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность антигенсвязывающей части молекулы связывать специфический антигенный детерминант может быть измерена либо с помощью иммуноферментного анализа (ELISA), либо с помощью других методов, известных специалисту в данной области, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance - SPR; анализ на приборе BIAcore; Liljeblad с соавт., Glyco J 17, 2000, 323-329) и традиционными методами анализа связывания (Heeley, Endocr Res 28, 2002, 217-229). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения степень связывания антигенсвязывающей части молекулы с несоответствующим белком составляет примерно менее 10% связывания антигенсвязывающей части молекулы с антигеном, что следует из результатов измерений, например, с помощью SPR. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающая часть молекулы, которая связывается с антигеном, или антигенсвязывающая молекула, содержащая такую антигенсвязывающую часть молекулы, имеет константу диссоциации (KD) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10-8 М или менее, например от 10-8 М до 10-13 М, например от 10-9 М до 10-13 М).
Понятие «сродство (аффинность)» относится к силе суммарного количества нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, рецептором) и ее связывающим партнером (например, лигандом). Если не указано иное, в контексте настоящего изобретения понятие «связывающее сродство» относится к аффинности связывания, отражающей взаимодействие 1:1 между компонентами связывающейся пары (например, антигенсвязывающей части молекулы и антигеном или рецептором и его лигандом). Аффинность молекулы X в отношении партнера Y обычно может быть выражена константой диссоциации (KD), которая представляет соотношение констант скорости диссоциации и ассоциации (koff и kon, соответственно). Таким образом, равные величины сродства могут включать константы разной скорости, если соотношение констант скоростей остается неизменным. Аффинность может быть измерена с помощью известных методов, разработанных в данной области, включая описанные в настоящем изобретении. Известным методом измерения аффинности является поверхностный плазмонный резонанс (SPR).
Понятие «уменьшенное связывание», например, уменьшенное связывание с рецептором Fc, относится к уменьшению аффинности соответствующего взаимодействия, что следует из результатов измерения, например, методом SPR. Для ясности, это понятие включает также уменьшение сродства до нуля (или ниже предела обнаружения аналитического метода), т.е. полное упразднение взаимодействия. И наоборот, «повышенное связывание» относится к увеличению связывающей аффинности для соответствующего взаимодействия.
Используемое в настоящем изобретении понятие «антиген, активирующий Т-клетки» относится к антигенному детерминанту, экспрессируемому на поверхности Т-лимфоцита, в частности цитотоксического Т-лимфоцита, который способен индуцировать активацию Т-клеток при взаимодействии с антигенсвязывающей молекулой. В частности, взаимодействие антигенсвязывающей молекулы с антигеном, активирующим Т-клетки, может индуцировать активацию Т-клеток путем запуска сигнального каскада рецепторного комплекса Т-клеток. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения антигеном, активирующим Т-клетки, является CD3.
В контексте настоящего изобретения понятие «активация Т-клеток» означает один или несколько клеточных ответов Т-лимфоцитов, в частности цитотоксического Т-лимфоцита, выбранных из: пролиферации, дифференциации, секреции цитокинов, выделения цитотоксической эффекторной молекулы, цитотоксической активности и экспрессии маркеров активации. Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению способны индуцировать активацию Т-клеток. Соответствующие методы исследования для измерения активации Т-клеток, известные в данной области, описаны в настоящем изобретении.
В контексте настоящего изобретения понятие «антиген целевой клетки» означает антигенный детерминант, презентированный на поверхности целевой клетки, например, клетки опухоли, например раковой клетки, или клетки стромы опухоли.
В настоящем изобретении понятия «первый» и «второй» применительно к антигенсвязывающим частям антигена и т.д. применяют, чтобы было легче различать, когда есть более одного из каждого типа частей молекулы.
Использование этих понятий не предназначено для того, чтобы придать конкретный порядок или ориентацию в активирующей Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекуле, если это явно не указано.
Аббревиатура «ВСМА» в контексте настоящего изобретения означает антиген созревания В-клеток (B-Cell Maturation Antigen - ВСМА) человека; TR17_HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), который является представителем суперсемейства рецепторов некроза опухолей, который предпочтительно экспрессируется в дифференцированных клетках плазмы. Внеклеточный домен ВСМА состоит из UniProt аминокислот 1-54 (или 5-51).
Понятие «антитело против ВСМА» или «анти-ВСМА антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, специфически связывающемуся с ВСМА.
Понятие «CD3ε или CD3» в контексте настоящего изобретения относится к CD3ε человека, который обозначается в базе белков под номером UniProt Р07766 (CD3E_HUMAN). Понятие «антитело против CD3» или «анти-CD3 антитело» относится к антителу, связывающемуся с CD3ε.
Понятие «молекула Fab» относится к белку, состоящему из VH и домена СН1 тяжелой цепи («Fab тяжелой цепи») и VL и домена CL легкой цепи («Fab легкой цепи») иммуноглобулина. Понятие «молекулы Fab, имеющие идентичные легкие цепи VLCL» в контексте настоящего изобретения относится к связующим, которые имеют одну легкую цепь, но все еще имеют разную специфичность. Биспецифические молекулы, активирующие Т-клетки по настоящему изобретению, содержат, по меньшей мере, две молекулы Fab, имеющие идентичные легкие цепи VLCL. Соответствующие тяжелые цепи являются ремоделированными и обладают специфическим связыванием с биспецифическим антигеном, активирующим Т-клетки, и антигеном целевых клеток, соответственно.
Под понятием «слитые» подразумевают, что компоненты (например, молекула Fab и субъединица домена Fc) связаны пептидными связями либо непосредственно, либо через один или несколько пептидных линкеров.
В настоящем изобретении понятие «общая легкая цепь» относится к легкой цепи, которая внутри пары биспецифических или мультиспецифических молекул спарена с более чем одной тяжелой цепью или ее фрагментом для формирования, по меньшей мере, первого и второго сайтов связывания антигена, например Fab, каждый из которых специфичен для другого антигена. Например, пары общей легкой цепи с первой тяжелой цепью или ее фрагментом в антигенсвязывающей молекуле для образования первого сайта связывания, специфичного в отношении опухолевого антигена, и другая копия пары общей легкой цепи со второй тяжелой цепью или ее фрагментом в антигенсвязывающей молекуле для образования второго сайта связывания, специфичного в отношении активирующего Т-клетки антигена, например CD3.
Понятие «молекула иммуноглобулина» относится к белку, имеющему структуру природного антитела. Например, иммуноглобулины класса IgG являются гетеротетрамерными гликопротеинами, размером примерно 150000 Да, состоящими из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, которые связаны дисульфидом. От N-конца к С-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, затем по три константных домена (СН1, СН2 и СН3), также называемых константными областями тяжелой цепи. Аналогично, от N-конца к С-концу каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, затем константный домен легкой цепи (CL), также называемый константой областью легкой цепи. Тяжелая цепь иммуноглобулина может быть отнесена к одному из пяти типов, обозначаемых α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) или μ (IgM), некоторые из которых могут быть далее разделены на подтипы, например γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) и α2 (IgA2). Легкая цепь иммуноглобулина может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности константной области. Иммуноглобулин по существу состоит из двух Fab-молекул и домена Fc, связанных через шарнирную область иммуноглобулина.
В контексте настоящего изобретения понятие «антитело» применяют в самом широком смысле, оно охватывает разные структуры антител, включая, но ими не ограничиваясь, моноклональные антитела, поликлональные антитела и фрагменты антител такой длины, при которой сохраняется антигенсвязывающая активность.
Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, которая отличается от интактного антитела и содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается данное интактное антитело. К примерам фрагментов антител относятся, но ими перечень не ограничивается, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, диантитела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и однодоменные антитела. См. обзор некоторых фрагментов антител Hudson с соавт., Nat Med 9, 2003, 129-134. Обзор фрагментов scFv см., например, в публикациях в кн.: «The Pharmacology of Monoclonal Antibodies» под ред. Rosenburg и Moore, Т. 113, изд-во Springer-Verlag, Нью-Йорк, 1994, 269-315; WO 93/16185; US 5571894, US 5587458. Анализ фрагментов Fab и F(ab')2, включающих реутилизируемые остатки эпитопа связывания рецептора и обладающих повышенным периодом полураспада in vivo, см. US 5869046. Диантитела являются фрагментами антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть бивалентными или биспецифическими. См., например, ЕР 404097, WO 1993/01161, Hudson с соавт., Nat Med 9, 2003, 129-134, Hollinger с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 90, 1993, 6444-6448. Триантитела и тетраантитела также описаны в работе Hudson с соавт., Nat Med 9, 2003, 129-134. Однодоменные антитела являются фрагментами антител, которые включают полностью или частично вариабельный домен тяжелой цепи и полностью или частично вариабельный домен легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения однодоменным антителом является однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Waltham, Массачусетс, см. US 6248516 В1). Фрагменты антител могут быть получены разными методами, включая, но ими не ограничиваясь, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также метод с применением рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фага), что описано в настоящем изобретении.
Понятие «антигенсвязывающий домен» относится к части антитела, которая включает область, специфически связывающуюся и комплементарную части или всему антигену. Антигенсвязывающий домен может быть обеспечен, например, одним или несколькими вариабельными доменами антител (также называемыми вариабельными областями антител). В частности, антигенсвязывающий домен содержит вариабельный участок легкой цепи антитела (VL) и вариабельный участок тяжелой цепи антитела (VH).
Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, которая участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен состоит из четырех консервативных каркасных областей (framework region - FR) и трех гипервариабельных областей (hypervariable region - HVR). См., например, Kindt с соавт. В кн.: «Kuby Immunology», 6-е изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91. Один домен VH или VL может быть достаточным для определения антигенсвязывающей специфичности.
В контексте настоящего изобретения понятие «гипервариабельная область (hypervariable region - HVR)» относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, последовательность которых гипервариабельная и/или формирует структурно выраженные петли («гипервариабельные петли»). Обычно нативные четырех-цепочечные антитела включают шесть HVR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR обычно включают аминокислотные остатки из гипервариабельных цепей и/или из комплементарных областей (complementarity determining region - CDR), причем последние обладают наивысшей вариабельностью последовательности и/или участвуют в распознавании антигена. За исключением CDR1 в VH, обычно CDR включает аминокислотные остатки, которые формируют гипервариабельные области. Гипервариабельные области (hypervariable regions - HVR) также называют «областями, определяющими комплементарность (complementarity determining regions - CDR)», и эти определения в настоящем изобретении применяют взаимозаменяемо в отношении частей вариабельной области, которые формируют антигенсвязывающие области. Такие области описаны в работах Kabat с соавт., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) и Chothia с соавт., J Mol Biol 196, 1987, 901-917, где определения включают перекрывающиеся или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее, применение каждого из определений применительно к CDR антитела или его вариантов предусмотрено в рамках охвата понятия, данного и применяемого в настоящем изобретении. Соответствующие аминокислотные остатки, которые охватывают CDR, что выражено в каждой из цитируемых выше работ, приведены ниже в таблице А для сравнения. Точные номера остатков, которые охватывают определенную CDR, могут варьировать в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области могут определить, какие остатки содержат конкретную CDR данной аминокислотной последовательности вариабельной области антитела.
Figure 00000002
1Нумерацию всех CDR в табл.А приводят в соответствии с системой, предложенной Kabat с соавт.(см. ниже).
2Обозначение «AbM» со стирочной буквой «b» в табл. А означает CDR, которые так определены в программном обеспечении для моделирования антител Oxford Molecular's «AbM».
Kabat с соавт. также разработали систему нумерации последовательностей вариабельных областей, которая применима к любому антителу. Специалист в данной области однозначно может применить эту систему «нумерации по Kabat» к какой-либо последовательности вариабельной области, не полагаясь на какие-либо экспериментальные данные за пределами самой последовательности. Используемое в настоящем изобретении понятие «нумерация по Kabat» относится к системе нумерации, изложенной Kabat с соавт. в публикации Отдела здравоохранения и социальных служб США «Sequence of Proteins of Immunological Interest» (1983). Если не указано иначе, ссылки на нумерацию положений определенных аминокислотных остатков в вариабельной области антитела соответствуют системе нумерации по Kabat.
Последовательности полипептидов из перечня последовательностей не нумеруют по системе Kabat. Однако специалисту в данной области известен метод преобразования нумерации последовательностей из перечня последовательностей в нумерацию по Kabat.
Понятие «каркасная область (Framework - FR)» относится к остаткам вариабельной области, отличным от остатков гипервариабельной области (hypervariable region - HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно возникают в следующем порядке в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
«Класс» антитела или иммуноглобулина соотносится с типом константного домена или константной области его тяжелой цепи. Существует пять больших классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно поделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, обозначают α, γ, δ, ε и μ, соответственно.
Понятие «домен Fc» или «область Fc» в настоящем изобретении используют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит, по меньшей мере, часть константной области. Это понятие включает нативные последовательности областей Fc и варианты областей Fc. Хотя границы области Fc тяжелой цепи IgG могут незначительно варьировать, область Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяют по протяженности от Cys226 или от Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) области Fc может присутствовать или отсутствовать. Если не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или константной области соответствует системе нумерации ЕС, также называемой индексом ЕС, что описано в работе Kabat с соавт. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5e изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Мэриленд, 1991. Понятие «субъединица» домена Fc в контексте настоящего изобретения относится к одному из двух полипептидов, образующих димерный домен Fc, т.е. полипептид, включающий С-концевые константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, способной к устойчивой самоассоциации. Например, субъединица домена Fc IgG содержит константные домены СН2 IgG и СН3 IgG.
Понятие «стимуляция модификации ассоциации первой и второй субъединиц домена Fc» означает манипуляцию с каркасом пептида или посттрансляционные модификации домена Fc, которая снижает или предупреждает ассоциацию полипептида, включающего домен Fc, с идентичным полипептидом для формирования гомодимера. Стимуляция модификации ассоциации в контексте настоящего изобретения в частности включает отдельные модификации, произведенные в каждой из двух субъединиц домена Fc, желательных для ассоциации (т.е. первой и второй субъединицы домена Fc), причем модификации комплементарны друг другу таким образом, чтобы стимулировать ассоциацию двух субъединиц домена Fc. Например, стимуляция модификации ассоциации может менять структуру или заряд одной или двух субъединиц домена Fc таким образом, чтобы сделать их ассоциацию стерически или электростатически благоприятными, соответственно. Таким образом, (гетеро)димеризация происходит между полипептидом, включающим первую субъединицу домена Fc, и полипептидом, включающим вторую субъединицу домена Fc, которые могут быть неидентичными в том смысле, что дополнительные компоненты, слиты с каждой из субъединиц (например, антигенсвязывающими частями молекулы), разные. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стимуляция модификации ассоциации включает аминокислотную мутацию в домене Fc, особенно аминокислотное замещение. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стимуляция модификации ассоциации включает отдельную аминокислотную мутацию, особенно аминокислотное замещение, в каждой из двух субъединиц домена Fc.
Понятие «эффекторные функции» относятся к таким биологическим активностям, связанным с областью Fc антитела, которые варьируют с изотипом антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (complement dependent cytotoxicity - CDC), связывание рецептора Fc, антителозависимую клеточно-обусловленную цитотоксичность (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC), антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (antibody dependent cell-mediated phagocytosis - ADCP), секрецию цитокина, immune complex-mediated antigen uptake антигенпрезентирующими клетками, снижение регуляции рецепторов на поверхности клеток (например, рецепторов В-клеток) и активацию В-клеток.
Используемые в настоящем изобретении понятия «конструирование, сконструированный, конструируемый» включают какие-либо манипуляции с пептидным каркасом или пост-трансляционные модификации природных или рекомбинантных полипептидов или их фрагментов. Конструирование включает модификации аминокислотной последовательности, схему гликозилирования или группы боковых цепей отдельных аминокислот, а также комбинации этих подходов.
Используемое в настоящем изобретении понятие «аминокислотная мутация» подразумевает включение аминокислотных замещений, делеций, инсерций и модификаций. Какая либо комбинация замещения, делеций, инсерции и модификации может быть произведена для получения окончательной конструкции, при условии, что окончательная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, восстановленным связыванием с Fc-рецептором или более высокой ассоциацией с другим пептидом. Аминокислотные последовательности делеций и инсерций включают амино- и/или карбокси-концевые делеций и инсерции аминокислот. Конкретные аминокислотные мутации являются аминокислотными замещениями. С целью изменения, например, связывающих свойств Fc-области, неконсервативные аминокислотные замещения, то есть замена одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей отличные структурные и/или химические свойства, особенно предпочтительны. Аминокислотные замещения включают замещение неприродными аминокислотами или природными аминокислотными производными 20 стандартных аминокислот (например, 4-гидроксипролином, 3-метилгистидином, орнитином, гомосерином, 5-гидроксилизином). Мутации аминокислот могут быть получены с использованием генетических или химических методов, известных в данной области. Генетические методы могут включать сайт-направленный мутагенез, ПЦР, синтез генов и другие. Предполагают, что методы изменения группы боковой цепи аминокислот методами, отличными от генной инженерии, например химической модификацией, также могут быть полезны. Различные обозначения можно использовать в настоящем изобретении для обозначения одной и той же мутации аминокислоты. Например, замещение пролина в положении 329 домена Fc на глицин может быть обозначено 329G, G329, P329G или Pro329Gly.
Используемое в настоящем изобретении понятие «полипептид» относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также называемыми пептидными связями). Понятие «полипептид» относится к какой-либо цепи из двух или более аминокислот и не означает продукта определенной длины. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, «белок», «аминокислотная цепь» или какие-либо другие определения, используемые для обозначения цепи из двух или более аминокислот, соответствуют определению «полипептид», и термин «полипептид» можно использовать вместо или взаимозаменяемо с любым из этих понятий. Понятие «полипептид» также обозначает продукты постэкспрессионных модификаций полипептида, к которым относятся, но которыми перечень не ограничивается, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизация известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификация неприродными аминокислотами. Полипептид может быть получен из природного биологического источника или в результате метода рекомбинации, но необязательно путем трансляции с заданной последовательности нуклеиновой кислоты. Полипептид может быть получен каким-либо способом, в том числе путем химического синтеза. Полипептид по настоящему изобретению может быть размером около 3 аминокислот или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более, или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя это не обязательно. Полипептиды с определенной трехмерной структурой называют уложенными, а полипептиды, которые не обладают определенной трехмерной структурой, но скорее могут принимать большое количество различных конформаций, называют развернутыми.
Понятие «выделенный» полипептид, или вариант, или производное полипептида означает полипептид, который не находится в своей естественной среде. Особого уровня очистки не требуется. Например, выделенный полипептид можно удалить из его естественной среды. Полипептиды и белки, образуемые в результате рекомбинации и экспрессируемые в клетках-хозяевах, считают выделенными для целей настоящего изобретения, а также нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были разделены, фракционированы или частично или существенно очищены каким-либо подходящим методом.
Понятие «процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно контрольной полипептидной последовательности определяют в виде процента аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в контрольной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и, при необходимости, интродукции гэпов, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и без учета каких-либо консервативных замещений в качестве части идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, известными в данной области, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, например, BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая какие-либо алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения определяют проценты идентичности аминокислотных последовательностей, используя компьютерное программное обеспечение ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана фирмой Genentech, Inc., а исходный код установлен по документации пользователя в Бюро по защите авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под номером U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна и ее можно получить на фирме Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или она может быть скомпилирована из исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для использования в операционной системе UNIX 5, включая цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей задаются программой ALIGN-2 и не меняются. В ситуациях, когда используют ALIGN-2 для сравнения аминокислотных последовательностей, процент идентичности данной аминокислотной последовательности А с или против данной аминокислотной последовательности Б (которая в другом варианте может быть выражена в виде данной аминокислотной последовательности А, которая обладает определенным процентом идентичности аминокислотной последовательности с или против данной аминокислотной последовательности Б), рассчитывают следующим образом:
100-кратная фракция X/Y
где X означает число аминокислотных остатков, рассчитанных в качестве идентичных пар по программе выравнивания ALIGN-2 по выравниванию по программе А и Б, и где Y означает общее число аминокислотных остатков в Б. Следует учесть, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, процент аминокислотной идентичности А к Б не равен проценту аминокислотной идентичности Б к А. Если специально не указано иное, все величины процентов аминокислотной идентичности в настоящем изобретении получают согласно описанию в предыдущем абзаце, используя компьютерную программу ALIGN-2.
Понятие «полинуклеотид» относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например, к матричной РНК (мРНК), РНК, производной от вирусной РНК, или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может включать обычную фосфодиэфирную связь или необычную связь (например, амидную связь, обнаруженную в пептидо-нуклеиновых кислотах (ПНК). Понятие «молекула нуклеиновой кислоты» относится к какому-либо одному или нескольким сегментам нуклеиновой кислоты, например к фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.
Понятие «выделенная» молекула нуклеиновой кислоты или полинуклеотида относится к молекуле нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая удалена из ее естественной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий содержащийся в векторе полипептид, в целях настоящего изобретения рассматривают в качестве выделенного. Другие примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах или очищенные (частично или в существенной степени) полинуклеотиды в растворе. К выделенным полинуклеотидам относится молекула полинуклеотида, содержащаяся в клетках, которые обычно содержат молекулу полинуклеотида, но молекула полинуклеотида присутствует внехромосомально или на хромосоме, расположение которой отличается от обычного. К молекулам выделенной РНК относятся in vivo или in vitro транскрипты РНК по настоящему изобретению, а также формы положительной и отрицательной цепей и двухцепочечные формы. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением также включают молекулы, полученные химическим синтезом. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут быть или могут включать регуляторный элемент, например, промотор, сайт связывания рибосомы или терминатор транскрипции.
К нуклеиновой кислоте или полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, которая, по меньшей мере, например, на 95% «идентична» контрольной нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, относят нуклеотидную последовательность полинуклеотида, идентичную контрольной последовательности, но которая может включать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов контрольной нуклеотидной последовательности. Другими словами, чтобы получить полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную контрольной нуклеотидной последовательности, до 5% нуклеотидов в контрольной последовательности могут быть делетированы или замещены другими нуклеотидами или количество нуклеотидов, составляющее до 5% от общего числа нуклеотидов в контрольной последовательности, могут быть инсертированы в контрольную последовательность. Такие изменения контрольной последовательности могут быть в 5'- или 3'-концевых положениях контрольной нуклеотидной последовательности или где-нибудь между этими концевыми положениями, рассредоточиваясь либо по отдельности среди остатков в контрольной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в контрольной последовательности. Практически важно установить, может ли какая-либо определенная полинуклеотидная последовательность, которая, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, быть определена, используя известные компьютерные программы, например, описанные выше для полипептидов (например, ALIGN-2).
Термин «экспрессирующая кассета» относится к полинуклеотиду, продуцируемому рекомбинантно или получаемому синтетически, с серией определенных элементов нуклеиновой кислоты, которые позволяют транскрибировать определенную нуклеиновую кислоту в клетке-мишени. Кассета рекомбинантной экспрессии может быть включена в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, ДНК пластиды, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Обычно часть рекомбинантной экспрессирующей кассеты экспрессирующего вектора включает, наряду с другими последовательностями, последовательность транскрибируемой нуклеиновой кислоты и промотор. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессирующая кассета по настоящему изобретению включает полинуклеотидные последовательности, которые кодируют биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению или их фрагменты.
Понятия «вектор» или «экспрессирующий вектор» являются синонимами понятия «экспрессирующая конструкция» и относится к молекуле ДНК, которую применяют для интродукции и направления экспрессии определенного гена, с которым она оперативно связана в клетке-мишени. К этому понятию относят вектор в качестве самовоспроизводящейся структуры, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был интродуцирован. Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению включает экспрессионную кассету. Экспрессирующие векторы позволяют транскрибировать большие количества стабильной мРНК. Когда вектор экспрессии находится внутри клетки-мишени, молекула рибонуклеиновой кислоты или белок, кодируемый геном, вырабатывается в результате механизма клеточной транскрипции и/или трансляции. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессирующий вектор по настоящему изобретению включает экспрессионную кассету, которая включает полинуклеотидные последовательности, кодирующие биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, или их фрагменты.
Понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используют взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированную клетку и полученное от нее потомство независимо от числа пересевов. Потомство может быть не полностью идентичным по составу нуклеиновой кислоты родительской клетке и может содержать мутации. К данному понятию также относят мутантное потомство с такой же функцией или биологической активностью, что и выявленные или отобранные клетки среди первоначально трансформированных клеток. Клеткой-хозяином является какой-либо тип клеточной системы, который может быть использован для выработки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, например, CHO, BHK, NS0, клетки SP2/0, клетки миеломы YO, клетки миеломы мыши P3X63, PER, PER.C6 или клетки гибридомы, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки растений, а также клетки, включенные в трансгенное животное, трансгенное растение или культивируемые растительные или животные ткани.
«Активирующим рецептором Fc» является рецептор Fc, который при последующем взаимодействии с доменом Fc антитела вызывает сигналы, которые стимулируют несущую рецептор клетку для осуществления эффекторных функций. К активирующим рецепторам Fc человека относят FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) и FcαRI (CD89).
Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) представляет собой иммунный механизм, приводящий к лизису покрытых антителом клеток-мишеней иммунными эффекторными клетками. Клетки-мишени представляют клетки, с которыми специфически связываются антитела или их производные, содержащие область Fc, в основном, через белковую часть, которая является N-концевой по отношению к области Fc. В контексте настоящего изобретения понятие «пониженная ADCC» означает уменьшенное количество клеток-мишеней, которые лизируются за определенное время при данной концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, за счет механизма ADCC, описанного выше, и/или увеличение концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, необходимое для достижения лизиса заданного количества клеток-мишеней за определенное время с помощью механизма ADCC. Снижение ADCC определяют относительно ADCC, опосредуемой тем же антителом, образуемым клетками-хозяевами того же типа с использованием тех же стандартных способов получения, очистки, переработки и хранения (которые известны специалистам в данной области), но которое не было сконструировано. Например, снижение ADCC, опосредованное антителом, содержащим в домене Fc аминокислотное замещение, которое уменьшает ADCC, относится к ADCC, опосредованную тем же антителом без такого аминокислотного замещения в домене Fc. Соответствующие методы измерения ADCC хорошо известны в данной области (см., например, WO 2006/082515 или РСТ/ЕР 2012/055393).
Понятие «эффективное количество» агента относится к количеству, необходимому для получения физиологического изменения в клетке или ткани, к которым вводят агент.
Понятие «терапевтически эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, относится к эффективному количеству, в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество агента, например, устраняет, уменьшает, задерживает, минимизирует или предотвращает неблагоприятные проявления заболевания.
Понятие «индивидуум» или «субъект» относится к млекопитающим. Млекопитающими в настоящем изобретении могут быть, но ими перечень не ограничивается, домашние животные (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматы (например, люди и обезьяны), кролики и грызуны (например, мыши и крысы). В частности, индивидуумом или субъектом является человек.
Понятие «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в форме, допускающей эффективную биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в композиции, и которая не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому эта композиция может вводиться.
Понятие «фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличающемуся от активного ингредиента, который не токсичен для субъекта. К фармацевтически приемлемым носителям относятся, но ими перечень не ограничивается, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
В контексте настоящего изобретения понятие «лечение» (и его грамматические формы, например, «лечить») относится к клиническому вмешательству с целью изменить естественный ход заболевания индивидуума, подвергаемого лечению, и может быть выполнено для профилактики или по ходу протекания клинической патологии. К желательным эффектам лечения относятся, но ими не ограничиваются, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, ослабление симптомов, уменьшение каких-либо прямых или опосредованных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазов, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или ослабление состояние болезни, ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующие биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению используют для отсрочки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.
Понятие «вкладыш в упаковку» применяют для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или противопоказаниях относительно применения таких терапевтических продуктов.
Подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения
В настоящем изобретении предусматривают биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предназначенные для активации Т-клеток и их перенаправления, которые сочетают в себе хорошую эффективность и продуктивность, а также методы их создания и применения. В частности, настоящее изобретение относится к биспецифическим молекулам, в которых, по меньшей мере, две связывающие части молекулы имеют идентичные легкие цепи, а в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения имеют соответствующие трансформированные тяжелые цепи, которые придают специфическое связывание активируемому Т-клетками биспецифическому антигену и антигену клетки-мишени, соответственно. Применение так называемого принципа «общей легкой цепи», то есть объединение двух связующих, которые разделяют одну легкую цепь, но по-прежнему имеют разную специфичность, предотвращает ошибочные спаривания легкой цепи. Таким образом, во время выработки возникает меньше побочных продуктов, что облегчает гомогенное получение активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул.
Настоящее изобретение, в частности, относится к заранее определенной редкой легкой цепи, которая в значительной степени способствует связыванию антигена и гетеромультимерному спариванию с разными связывающими партнерами, например, с тяжелыми цепями и их фрагментами. Эта общая легкая цепь, таким образом, применима для использования в библиотеке, из которой могут быть получены новые би- или мультиспецифичные антигенсвязывающие молекулы. Преимущественно, общая легкая цепь, используемая в связи с антигенсвязывающими молекулами и способами, описанными в настоящем изобретении, может применяться для образования антигенсвязывающей молекулы, полезной для активации Т-клеток. Специалист в данной области может признать выгодную эффективность наличия такой легкой цепи, которая может функционировать и в Т-клетки-активирующих антигенсвязывающих частях молекулы, и в целевых антигенсвязывающих частях молекулы. Это позволяет эффективно вырабатывать Т-клетки-активирующие биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые включают компонент активации Т-клеток и целевой антигенсвязывающий компонент. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения общая легкая цепь является константным доменом легкой цепи лямбда. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения общая легкая цепь является легкой цепью лямбда человека или гуманизированной. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения общей легкой цепью является редкая легкая цепь человека из семейства лямбда 7. Применение легкой цепи лямбда, особенно редкого семейства лямбда 7, представляет необычный подход и предположительно может снижать вероятность идентификации подходящих партнеров для связывания тяжелой цепи для создания антигенсвязывающих молекул, специфичных в отношении различных мишеней. Таким образом, в предшествующих настоящему изобретению исследованиях не было установлено, что легкая цепь лямбда 7 с соответствующими свойствами может быть разработана для различных отличающихся неродственных целевых антигенов, например, FolR1, MUC1 и ВСМА. Также не было известно, что легкая цепь лямбда может быть разработана для создания стабильных функциональных связующих с высокой аффинностью для улучшения получения активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул с CD3-специфичностью и специфичностью в отношении целевого антигена, причем целевые антигены не являются родственными, например, FolR1, MUC1 и ВСМА. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такая общая легкая цепь может быть применена для конструирования библиотеки общей легкой цепи (common light chain - CLC), которая основана на специфичном связующем CD3, не зародышевой линии антитела, для получения специфических CD3-связующих, способствующих связующему, что описано ниже. Преимущество этого подхода состоит в том, что он позволяет поддерживать ранее идентифицированное и проверенное CD3-связующее таким образом, что единственное новое связующее антигена для части молекулы, связывающей целевой антиген, в составе активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул идентифицируют по тяжелой цепи. Это позволяет применять модульный подход к получению различных активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул с идентичными или в высокой степени гомологичными цепями. Хотя легкая цепь идентична в данной активирующей Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекуле, легкие цепи различных активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул могут быть идентичны или в высокой степени гомологичны. Понятие «в высокой степени гомологичны» означает, что легкие цепи разных активирующее Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, полученные с помощью указанного модульного подхода, включают аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична. Предпочтительно, в высокой степени гомологичные легкие цепи по настоящему изобретению имеют идентичные вариабельные области легкой цепи и отличаются только константными областями. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения различие по аминокислотам ограничивается областью линкера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения общая легкая цепь включает константный домен легкой цепи каппа.
В дополнение к вышеизложенным преимуществам, выход правильно спаренных гетеромультимерных молекул с использованием данного подхода усиливается, что было описано выше, поскольку легкая цепь, используемая в антигенсвязывающих частях активирующей Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы идентична. Иными словами, используя общую легкую цепь, облегчают получение этих молекул, поскольку какое-либо ошибочное спаривание легкой цепи с несоответствующей тяжелой цепью отменяется. Таким образом, с высокой степенью чистоты облегчается выделение активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, в активирующей Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекуле задействованы фрагменты Fab в качестве строительных блоков. По сравнению с другими форматами использование фрагментов Fab в качестве строительных блоков, в отличие, например, от использования фрагментов scFv, приводит к более высокой термической стабильности и отсутствию агрегации scFv и межмолекулярного формирования scFv.
В предшествующих исследованиях не было известно, что может образоваться общая легкая цепь, которая может не только служить обычной легкой цепью в би- или мультиспецифической молекуле, но также поддерживать функцию по активации Т-клеток активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулой. Кроме того, в предшествующих исследованиях не было установлено, что может быть сформирована общая легкая цепь, которая в значительной степени способствует связыванию антигена антигенсвязывающей части молекулы в молекуле, связывающей биспецифические антиген, который активирует Т-клетки. Известная стратегия состоит в том, чтобы идентифицировать тяжелые цепи или их фрагменты, которые способствуют большинству связывающих свойств, например, прочности и специфичности. В соответствии с настоящим изобретением общая легкая цепь значительно способствует способности связывать. Соответственно, первая задача, решаемая в настоящем и, предусматривает активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, причем указанная молекула содержит первую и вторую антигенсвязывающую части, при этом первая антигенсвязывающая часть молекулы включает первую легкую цепь и первая антигенсвязывающая часть молекулы способна специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, а вторая антигенсвязывающая часть молекулы содержит вторую легкую цепь и вторая антигенсвязывающая часть молекулы способна специфически связываться с антигеном целевых клеток, причем аминокислотные последовательности первой и второй легких цепей идентичны. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первой антигенсвязывающей частью молекулы является Fab. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающей частью молекулы является Fab. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую первую и вторую антигенсвязывающие части молекулы, одна из которых является молекулой Fab, способной специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, а вторая антигенсвязывающая часть молекулы является молекулой Fab, способной специфически связываться с антигеном целевых клеток, причем первая и вторая молекулы Fab содержат идентичные легкие цепи (вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи, VLCL). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь (VLCL) включает CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная идентичная легкая цепь (VLCL) включает SEQ ID NO. 35.
Форматы активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул.
Компоненты активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул могут быть слиты друг с другом в разных конфигурациях. К примерам конфигураций относятся, но ими перечень не ограничивается, конфигурации, представленные на фиг. 1А-Г.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно включает домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц, способных к стабильной ассоциации. Ниже приведены примерные варианты активирующей Т-клетки биспецифические антигенсвязывающий молекулы, включающей домен Fc. Все подобные активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы содержат по меньшей мере два фрагмента Fab, имеющих идентичные легкие цепи (VLCL) и различные тяжелые цепи (VHCL), которые обусловливают специфические функции в отношении двух разных антигенов, т.е. один фрагмент Fab способен специфически связывать антиген, активирующий Т-клетки, и другой фрагмент Fab способен специфически связывать целевой клеточный антиген.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения части молекулы, связывающие первый и второй антиген, в активирующей Т-клетки биспецифические антигенсвязывающий молекуле сливают друг с другом необязательно через пептидный линкер. В одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения вторая антигенсвязывающая часть молекулы сливают на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой антигенсвязывающей части молекулы. В еще одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы сливают на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй антигенсвязывающей части молекулы. В другом подобном варианте осуществления настоящего изобретения вторая антигенсвязывающая часть молекулы сливают на С-конце легкой цепи Fab с N-концом легкой цепи Fab первой антигенсвязывающей части молекулы. В еще одном подобном варианте осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы сливают на С-конце легкой цепи Fab с N-концом легкой цепи Fab второй антигенсвязывающей части молекулы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc.
В еще одном подобном варианте осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй антигенсвязывающей части молекулы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула состоит из первой и второй антигенсвязывающих частей молекулы, включающих идентичные легкие цепи (VLCL), домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц, и необязательно один или несколько пептидных линкеров, причем первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй антигенсвязывающей части молекулы, и вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc. В другом подобном варианте осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу степени состоит из первой и второй антигенсвязывающих частей молекулы, включающих идентичные легкие цепи (VLCL), домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц, и необязательно один или несколько пептидных линкеров, причем каждая из первой и второй антигенсвязывающей частей молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc.
В другом подобном варианте осуществления настоящего изобретения вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце легкой цепи Fab с N-концом легкой цепи Fab первой антигенсвязывающей части молекулы. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первой и второй антигенсвязывающих частей молекулы, включающих идентичные легкие цепи (VLCL), домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц, и необязательно один или несколько пептидных линкеров, причем первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на N-конце легкой цепи Fab с С-концом легкой цепи Fab второй антигенсвязывающей части молекулы, и вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой и второй субъединицы домена Fc.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой антигенсвязывающей части молекулы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первой и второй антигенсвязывающих частей молекулы, включающих идентичные легкие цепи (VLCL), домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц, и необязательно один или несколько пептидных линкеров, причем вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой антигенсвязывающей части молекулы, и первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы способная специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки. В других вариантах осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы способная специфически связываться с антигеном целевой клетки.
Антигенсвязывающие части молекулы могут быть слиты с доменом Fc или друг с другом непосредственно или через пептидный линкер, включающим одну или несколько аминокислот, обычно примерно 2-20 аминокислот. Пептидные линкеры известны в данной области и описаны в настоящем изобретении. К соответствующим неиммуногенным пептидным линкерам относят, например, пептидные линкеры (G4S)n (SEQ ID NO: 41), (SG4)n (SEQ ID NO: 42), (G4S)n (SEQ ID NO: 41) или G4(SG4)n (SEQ ID NO: 43). Буква «n» обычно означает число от 1 до 10, обычно от 2 до 4. Особенно подходящим пептидным линкером для гибридизации легких цепей первой и второй антигенсвязывающих частей молекулы друг с другом является (G4S)2 (SEQ ID NO: 44). Кроме того, линкеры могут содержать (часть) шарнирной области иммуноглобулина. В частности, если антигенсвязывающая часть молекулы, слита на N-конце субъединицы домена Fc, может быть слита через шарнирную область иммуноглобулина или его часть с дополнительным пептидным линкером или без него.
Полезной является активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула с одной антигенсвязывающей частью молекулы, способной специфически связываться с антигеном целевых клеток, особенно в тех случаях, когда следует ожидать интернализации антигена целевой клетки после связывания антигенсвязывающей части молекулы, обладающей высоким сродством. В таких случаях присутствие более чем одной антигенсвязывающей части молекулы, специфичной для антигена целевой клетки, может усилить интернализацию антигена целевой клетки, тем самым, снижая его доступность.
Во многих других случаях, однако, будет полезно иметь активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую две или более антигенсвязывающие части молекулы, специфичные для антигена целевой клетки, например, для оптимизации нацеливания на целевой сайт или для обеспечения поперечных связей антигенов целевых клеток.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению дополнительно содержит третью антигенсвязывающую часть молекулы, которая является молекулой Fab, способной специфически связываться с антигеном целевых клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третья антигенсвязывающая часть молекулы способна специфически связываться с одним и тем же антигеном целевых клеток, что и первая или вторая антигенсвязывающая часть молекулы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы способна специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, а вторая и третья антигенсвязывающие части молекулы способны специфически связываться с антигеном целевых клеток. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первая, вторая и третья антигенсвязывающие части молекулы включают идентичные легкие цепи (VLCL).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третья антигенсвязывающая часть молекулы сливается на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая и третья антигенсвязывающие части молекулы каждая слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc, а вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой антигенсвязывающей части молекулы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первой, второй и третьей антигенсвязывающих частей молекулы (фрагмента Fab), домена Fc, состоящего из первой и второй субъединицы, и необязательно через один или несколько пептидных линкеров, причем вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой антигенсвязывающей части молекулы, и первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы домена Fc, причем третья антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы домена Fc. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первая антигенсвязывающая часть молекулы способна специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, а вторая и третья антигенсвязывающие части молекулы способны специфически связываться с антигеном целевых клеток, причем первая, вторая и третья антигенсвязывающие части молекулы являются фрагментами Fab, включающими идентичные легкие цепи (VLCL).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каждая из второй и третьей антигенсвязывающих частей молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc, а первая часть антигенсвязывающей молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй антигенсвязывающей части молекулы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из молекулы иммуноглобулина, способной специфически связываться с антигеном целевых клеток, и молекулы Fab, способной специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, слитой с N-концом одной из тяжелых цепей иммуноглобулина, необязательно через пептидный линкер. Предпочтительно в указанном варианте осуществления настоящего изобретения молекула иммуноглобулина, способная специфически связываться с антигеном целевых клеток, и молекула Fab, способная специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, включают идентичные легкие цепи (VLCL).
Первая и третья антигенсвязывающие части молекулы (или вторая и третья антигенсвязывающие части молекулы, соответственно) могут быть слиты с доменом Fc непосредственно или через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая и третья антигенсвязывающие части молекулы (или вторая и третья антигенсвязывающие части молекулы, соответственно) слиты с доменом Fc через шарнирную область иммуноглобулина.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения шарнирной областью иммуноглобулина является шарнирная область IgG1 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая и третья антигенсвязывающие части молекулы (или вторая и третья антигенсвязывающие части молекулы, соответственно) и домен Fc являются частью молекулы иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула иммуноглобулина является иммуноглобулином класса IgG. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекула иммуноглобулина является иммуноглобулином подкласса IgG1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулин является иммуноглобулином подкласса IgG4. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноглобулин является иммуноглобулином человека. В других вариантах осуществления настоящего изобретения иммуноглобулин является химерным иммуноглобулином или гуманизированным иммуноглобулином.
Домен Fc
Домен Fc активирующей Т-клетки биспецифические антигенсвязывающей молекулы состоит из пары полипептидных цепей, включающих домены тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина. Например, домен Fc молекулы иммуноглобулина G (IgG) представляет собой димер, каждая субъединица которого содержит константные домены СН2 и СН3 тяжелой цепи IgG. Две субъединицы домена Fc способны к устойчивой ассоциации друг с другом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению включает не более одного домена Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доменом Fc активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, является домен Fc IgG. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доменом Fc является домен Fc IgG1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения доменом Fc является домен Fc IgG4. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения доменом Fc является домен Fc IgG4, включающий аминокислотное замещение в положении S228 (нумерация по Kabat), в частности замещение S228P. Такое аминокислотное замещение снижает in vivo замену плеча Fab антитела IgG4 (см. Stubenrauch с соавт., Drug Metabolism and Disposition 38, 2010, 84-91). В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом человека.
Модификации домена Fc, индуцирующие гетеродимеризацию
Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы в соответствии с настоящим изобретением содержат различные антигенсвязывающие части молекулы, слитой с одной или другой из двух субъединиц домена Fc таким образом, что две субъединицы домена Fc обычно состоят из двух неидентичных полипептидных цепей. Рекомбинантная совместная экспрессия этих полипептидов и последующая димеризация приводят к нескольким возможным комбинациям двух полипептидов. Для улучшения выхода и чистоты активирующих Т-клеток биспецифических антигенсвязывающих молекул при получении рекомбинанта было бы полезно интродуцировать в домен Fc активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы модификацию, индуцирующую ассоциацию требуемых полипептидов.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы содержит модификацию, способствующую ассоциации первой и второй субъединиц домена Fc. Сайт наиболее интенсивного взаимодействия белок-белок между двумя субъединицами домена Fc IgG человека находится в СН3 домена Fc. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная модификация находится в СН3 домена Fc.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная модификация представляет собой, так называемую модификацию по типу «выступ-во-впадину», содержащую модификацию «выступ» в одной из двух субъединиц домена Fc и модификацию «впадина» в другой из двух субъединиц домена Fc.
Технология «выступ-во-впадину» описана, например, в US 5731168, US 7695936, Ridgway с соавт., Prot Eng 9, 1996, 617-621, Carter, J Immunol Meth 248, 2001, 7-15. Обычно эта технология включает введение выступа на поверхности первого полипептида и соответствующей впадины на поверхности второго полипептида таким образом, что выступ может быть расположен во впадине таким образом, чтобы вызывать образование гетеродимера и препятствовать образованию гомодимеров. Выступы создаются путем замены малых боковых цепей аминокислот на поверхности первого полипептида на аминокислоты с более длинными боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). Компенсирующие полости идентичного или близкого размера с выступами создают на поверхности второго полипептида путем замещения аминокислот с длинными боковыми цепями на аминокислоты с меньшей длиной боковой цепи (например, аланин или треонин).
Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в домене СН3 первой субъединицы домена Fc активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, тем самым, формируя выступ в домене СН3 первой субъединицы, которая размещается во впадине в домене СН3-домена второй субъединицы, и в домене СН3 второй субъединицы домена Fc аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим меньший объем боковой цепи, тем самым, создавая впадину внутри домена СН3 второй субъединицы, в которой помещается выступ в домене СН3 первой субъединицы.
Выступы и впадины могут быть сформированы путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, например, методом сайт-направленного мутагенеза, или синтезом пептида.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в домене СН3 первой субъединицы домена Fc остаток треонина в положении 366 заменен остатком триптофана (T366W), а в домене СН3 второй субъединицы домена Fc тирозин остаток в положении 407 заменен валиновым остатком (Y407V). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения во второй субъединице домена Fc дополнительно остаток треонина в положении 366 замещен остатком серина (T366S), а остаток лейцина в положении 368 замещен остатком аланина (L368A).
В еще одном из вариантов этого изобретения в первой субъединице домена Fc дополнительно остаток серина в положении 354 замещен остатком цистеина (S354C), а во второй субъединице домена Fc дополнительно остаток тирозина в положении 349 замещенный остатком цистеина (Y349C). Введение этих двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя субъединицами домена Fc, дополнительно стабилизируя димер (Carter, J Immunol Methods 248, 2001, 7-15).
В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающая часть молекулы, способная связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, слита (необязательно через антигенсвязывающую часть молекулы, способную связываться с антигеном целевой клетки) с первой субъединицей домена Fc (содержащей модификацию по типу «выступ»). Не опираясь на теорию, можно предположить, что гибридизация антигенсвязывающей части молекулы, способной связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, с содержащей выступ субъединицей домена Fc может (дополнительно) минимизировать выработку антигенсвязывающих молекул, включающих две антигенсвязывающие части молекулы, способные связываться с антигеном, активирующим Т-клетки (стерическое столкновение двух полипептидов, содержащих выступы).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения модификация, способствующая объединению первой и второй субъединиц домена Fc, включает модификацию, опосредующую электростатические направляющие эффекты, например, описанные в РСТ WO 2009/089004. Обычно этот метод включает замещение одного или нескольких аминокислотных остатков на границе двух субъединиц домена Fc остатками заряженных аминокислот, таким образом, что образование гомодимера становится электростатически неблагоприятным, но гетеродимеризация электростатически выгодна.
Модификации домена Fc, снижающие связывание и/или эффекторную функцию рецептора Fc
Домен Fc придает активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекуле благоприятные фармакокинетические свойства, включая длительный период полураспада в сыворотке, что способствует хорошему накоплению в целевой ткани и благоприятному распределению в ткани и крови. В то же время он может, однако, приводить к нежелательному нацеливанию активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы на клетки, экспрессирующие рецепторы Fc, в большей степени, чем на предпочтительные антигеннесущие клетки. Более того, совместная активация сигнальных метаболических путей рецептора Fc может приводить к высвобождению цитокинов, которые в сочетании с активирующими свойствами Т-клеток и длительным периодом полураспада антигенсвязывающей молекулы приводят к чрезмерной активации рецепторов цитокинов и сильным побочным эффектам при системном введении. Активация иммунных клеток (несущих рецептор Fc), отличных от Т-клеток, может даже снизить эффективность активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы из-за потенциального разрушения Т-клеток, например, клетками NK.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению проявляет пониженное связывающее сродство с рецептором Fc и/или пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативным доменом Fc IgG1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc (или активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включающая указанный домен Fc) проявляет менее 50%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10% и наиболее предпочтительно менее 5% связывающего сродства с рецептором Fc по сравнению с нативным доменом Fc IgG1 (или активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекулой, включающая нативный домен Fc) и/или менее 50%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10% и наиболее предпочтительно менее 5% эффекторной функции по сравнению с нативным доменом Fc IgG1 (или активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулой, включающей нативный домен Fc IgG1). В одном из вариантов этого изобретения домен Fc (или активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включающая указанный домен Fc) по существу не связывается с рецептором Fc и/или вызывает эффекторную функцию. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является рецептором Fcγ. В одном из вариантов этого изобретения Fc-рецептор является рецептором Fc человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является активирующим рецептором Fc. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является активирующим рецептором Fcγ человека, точнее FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, наиболее точно FcγRIIIa человека. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффекторная функция является одной или несколькими, выбранными из группы CDC, ADCC, ADCP и секреции цитокинов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффекторной функцией является ADCC. В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc демонстрирует в существенной степени близкое связывающее сродство с неонатальным рецептором Fc (FcRn) по сравнению с нативным доменом Fc IgG1. По существу аналогичное связывание с FcRn достигают, когда домен Fc (или активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включающая указанный домен Fc) проявляет связывающее сродство, которое примерно более чем 70%, примерно более чем на 80%, особенно более чем на 90% превышает связывающее сродство нативного домена Fc IgG1 (или активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включающая нативный домен Fc) с FcRn.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc сконструирован таким образом, чтобы иметь уменьшенное связывающее сродство с рецептором Fc и/или пониженную эффекторную функцию по сравнению с не реконструированным доменом Fc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc активирующей Т-клетки биспецифические антигенсвязывающей молекулы включает одну или несколько мутаций аминокислот, которые уменьшает связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc и/или эффекторную функцию. Как правило, одна и та же одна или несколько аминокислотных мутаций присутствует в каждой из двух субъединиц домена Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутация аминокислоты снижает связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутация аминокислоты снижает связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз. В тех вариантах осуществления настоящего изобретения, когда содержится более одной аминокислотной мутации, которая снижает связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc, комбинация таких аминокислотных мутаций может понизить связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc, по меньшей мере, в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, или даже по меньшей мере в 50 раз. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включающая сконструированный домен Fc, проявляет менее 20%, особенно менее 10%, точнее менее 5% связывающего сродства с рецептором Fc по сравнению с активирующей Т-клетки биспецифические антигенсвязывающий молекулой, включающей не реконструированный домен Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептором Fc является рецептор Fcγ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рецептор является рецептором Fc человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является активирующим рецептором Fc. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является активирующим рецептором Fcγ человека, точнее рецепторами человека FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, наиболее предпочтительно рецептором человека FcγRIIIa. Предпочтительно связывание с каждым из этих рецепторов снижается. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения связывающее сродство с компонентом комплемента, специфически связывающее сродство с C1q, также понижается. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения связывающее сродство с неонатальным рецептором Fc (neonatal Fc receptor - FcRn) не снижается. В существенно схожей степени связывание с FcRn, т.е. сохранение связывающего сродства домена Fc с указанным рецептором, достигают, когда домен Fc (или активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включающая указанный домен Fc) проявляет связывающее сродство, которое примерно на 70% больше, чем у не реконструированной формы домена Fc (или активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, включающей указанную не реконструированную форму домена Fc) с FcRn. Домен Fc и активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула согласно настоящему изобретению, включающие указанный домен Fc, могут проявлять такое связывающее сродство, которое больше примерно на 80% и даже больше примерно на 90%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы конструируют таким образом, чтобы понизить эффекторную функцию по сравнению с эффекторной функцией молекулы с не реконструированным доменом Fc. Пониженная эффекторная функция может включать одну или несколько из функций (но ими перечень не ограничивается), к которым относятся: пониженная комплементзависимая цитотоксичность (complement dependent cytotoxicity - CDC), пониженная антителозависимая клеточно-обусловленная цитотоксичность (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC), пониженный антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (antibody dependent cell-mediated phagocytosis - ADCP), пониженная секреция цитокинов, пониженное поглощение антигенпрезентирующими клетками опосредованного иммунным комплексом антигена пониженное связывание с клетками NK, пониженное связывание с макрофагами, пониженное связывание с моноцитами, пониженное связывание с полиморфноядерными клетками, пониженная прямая сигнальная индукция апоптоза, пониженное поперечное сшивание связанных с мишенью антител, пониженное созревание дендритных клеток или пониженное примирование Т-клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пониженная эффекторная функция является одной или несколькими, выбранными из группы пониженной CDC, пониженной ADCC, пониженного ADCP и пониженной секреции цитокина. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пониженная эффекторная функция является пониженной ADCC. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пониженная ADCC меньше на 20% ADCC, индуцированной несконструированным доменом Fc (или активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулой, включающей не реконструированный домен Fc).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислотной мутацией, которая снижает связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc и/или эффекторную функцию, является аминокислотным замещением. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc включает замещение аминокислоты в положении, выбранном из группы Е233, L234, L235, N297, Р331 и Р329. В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc включает аминокислотное замещение в положении, выбранном из группы L234, L235 и Р329. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc включает аминокислотные замещения L234A и L235A. В одном из таких вариантов осуществления настоящего изобретения доменом Fc является домен Fc IgG1, особенно домен Fc IgG1 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc включает аминокислотное замещение в положении Р329. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислотным замещением является Р329А или P329G, особенно P329G. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc включает аминокислотное замещение в положении Р329 и дополнительное аминокислотное замещение в положении, выбранном из Е233, L234, L235, N297 и Р331. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения дополнительным аминокислотным замещением может быть Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc включает аминокислотные замещения в положениях Р329, L234 и L235. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc включает аминокислотные мутации L234A, L235A и P329G («P329G LALA»). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доменом Fc является домен Fc IgG1, особенно домен Fc IgG1 человека. Комбинация «P329G LALA» аминокислотных замещений почти полностью отменяет связывание рецептора Fcγ домена Fc IgG1 человека согласно описанию в патентной заявке РСТ/ЕР2012/055393, сущность которой включена в настоящее изобретение в виде ссылки. В РСТ/ЕР2012/055393 также описывают способы получения таких мутантных доменов Fc и способы определения их свойств, например, связывание рецептора Fc или эффекторные функции.
Антитела IgG4 проявляют пониженное связывающее сродство с рецепторами Fc и пониженные эффекторные функции по сравнению с антителами IgG1. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доменом Fc активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению является домен Fc IgG4, особенно домен Fc IgG4 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc IgG4 включает аминокислотные замещения в положении S228. Для дополнительного снижения связывающего сродства с рецептором Fc и/или эффекторной функции, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc IgG4 включает аминокислотное замещение в положении L235, особенно аминокислотное замещение L235E. В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc IgG4 включает аминокислотное замещение в положении Р329, особенно аминокислотное замещение P329G. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc IgG4 включает аминокислотные замещения в положениях S228, L235 и Р329, особенно аминокислотные замещения S228P, L235E и P329G. Такие мутантные домены Fc IgG4 и их свойства по связыванию рецептора Fcγ описаны в патентной заявке РСТ/ЕР2012/055393, включенной в настоящее изобретение в виде ссылки на его сущность.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc, проявляющий пониженное связывающее сродство с рецептором Fc и/или пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативным доменом Fc IgG1, является доменом Fc IgG1, включающим аминокислотные замещения L234A, L235A и необязательно P329G, или доменом Fc IgG1 человека, включающим аминокислотные замещения S228P, L235E и необязательно P329G.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения N-гликозилирование домена Fc было элиминировано. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc включает аминокислотное замещение N297, особенно аминокислотное замещение аспарагина на аланин (N297A) или аспарагиновую кислоту (N297D). Помимо доменов Fc, описанных выше в настоящем изобретении и в патентной заявке РСТ/ЕР2012/055393, домены Fc с пониженным связыванием рецептора Fc и/или пониженной эффекторной функцией также включают замещения одного или нескольких остатков домена Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US 6737056). К таким мутантам Fc относят мутанты Fc с замещениями по двум или нескольким аминокислотам в положениях 265, 269, 270, 297 и 327, в том числе, так называемый мутант Fc «DANA» с замещением остатков в положениях 265 и 297 на аланин (US 7332581).
Мутантные домены Fc могут быть получены путем делеции, замещения, введения или модификации аминокислот с использованием генетических или химических методов, известных в данной области. Генетические методы могут включать сайт-специфический мутагенез кодирующей последовательности ДНК, ПЦР, синтез гена и т.д. Корректные замещения нуклеотидов можно проверить, например, путем секвенирования.
Связывание с рецепторами Fc может быть легко определено, например, методом ELISA или поверхностным плазмонным резонансом (Surface Plasmon Resonance - SPR) с использованием стандартного оборудования, например, прибора BIAcore (фирмы GE Healthcare), а рецепторы Fc могут быть получены рекомбинантной экспрессией. Соответствующий анализ связывания описан в настоящем изобретении. В другом варианте связывающее сродство доменов Fc или активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, включающих Fc-домен для Fc-рецепторов, может быть оценено с использованием клеточных линий, о которых известно, что они экспрессируют определенные рецепторы Fc, например, клеток человека NK, экспрессирующих рецептор FcγIIIa.
Эффекторную функцию домена Fc или включающей домен Fc активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы можно измерить способами, известными в данной области. Соответствующий метод измерения ADCC описан в настоящем изобретении. Другие примеры анализа активности ADCC in vitro исследуемой молекулы описаны в работах US 5500362, Hellstrom с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, 7059-7063, Hellstrom с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1985, 1499-1502, US 5821337, Bruggemann с соавт., J Exp Med 166, 1987, 1351-1361. В другом варианте могут применять нерадиоактивные методы исследования (см., например, ACTI™ нерадиоактивный метод для жидкостной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Mountain View, Калифорния); и CytoTox 96® нерадиоактивный метод исследования цитотоксичности (фирма Promega, Мэдисон, Висконсин)). К эффекторным клеткам, которые могут быть применены для таких исследований, относят мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). В другом варианте или дополнительно активность ADCC исследуемой молекулы может быть оценена in vivo, например, на модели животных, описанной в работе Clynes с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 95, 1998, 652-656.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения связывание домена Fc с компонентом комплемента, особенно с C1q, понижено. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, где домен Fc спроектирован таким образом, что понижена эффекторная функция, указанная эффекторная функция включает пониженную комплемент-зависимую цитотоксичность (complement dependent cytotoxicity - CDC). Анализ связывания C1q может быть проведен, чтобы определить, может ли активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывать C1q и, следовательно, проявлять активность CDC. См., например, C1q и С3с связывание ELISA в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ CDC (см., например, публикации Gazzano-Santoro с соавт., J Immunol Methods 202, 1996, 163, Cragg с соавт., Blood 101, 2003, 1045-1052, Cragg и Glennie, Blood 103, 2004, 2738-2743).
Антигенсвязывающие части молекул
Антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению является биспецифической, то есть она содержит, по меньшей мере, две антигенсвязывающие части молекулы, способные специфически связываться с двумя разными антигенными детерминантами. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие части молекулы являются молекулами Fab (т.е. антигенсвязывающими доменами, состоящими из тяжелой и легкой цепи, каждая из которых содержит вариабельную и константную область), где легкая цепь (VLCL), по меньшей мере, в двух Fab-молекул, содержит идентичные последовательности. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная легкая цепь VLCL молекул Fab, способная к специфическому связыванию с антигеном целевых клеток и антигеном, активирующим Т-клетки, соответственно, включает CDR легкой цепи SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная легкая цепь VLCL молекул Fab способна специфически связываться с антигеном целевых клеток и антигеном, активирующим Т-клетки, соответственно, представляет SEQ ID NO: 31.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанные молекулы Fab являются молекулами человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные молекулы Fab являются гуманизированными молекулами. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанные молекулы Fab включают константные области тяжелой и легкой цепей.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна одновременно связываться с антигеном целевых клеток, особенно с антигеном опухолевых клеток, и антигеном, активирующим Т-клетки. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна перекрестно связываться с Т-клеткой и целевой клеткой за счет одновременного связывания с антигеном целевых клеток и антигеном, активирующим Т-клетки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения такое одновременное связывание приводит к лизису целевых клеток, особенно опухолевых клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое одновременное связывание приводит к активации Т-клеток. В других вариантах осуществления настоящего изобретения такое одновременное связывание приводит к клеточному ответу Т-лимфоцитов, особенно цитотоксических Т-лимфоцитов, выбранных из группы, в которую входят: пролиферация, дифференциация, секреция цитокина, высвобождение цитотоксической эффекторной молекулы, цитотоксическая активность и экспрессия маркеров активации. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения связывание активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы с антигеном, активирующим Т-клетки, без одновременного связывания с антигеном целевых клеток не приводит к активации Т-клеток.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна перенаправлять цитотоксическую активность Т-клеток на целевые клетки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное перенаправление не зависит от опосредованной ГКГ презентации пептидного антигена целевыми клетками и/или от специфичности Т-клеток.
В частности, Т-клетки в соответствии с каким-либо из вариантов осуществления настоящего изобретения являются цитотоксическими Т-клетками. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Т-клетки являются CD4+ или CD8+ Т-клетками, особенно CD8+ Т-клетками.
Часть молекулы, связывающая антиген, который активирует Т-клетки
Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает по меньшей мере одну антигенсвязывающую часть молекулы, способную связываться с антигеном, активирующим Т-клетки (также называемую в настоящем изобретении «Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы»). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает не более одной антигенсвязывающей части молекулы, способной специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула обеспечивает моновалентное связывание с антигеном, активирующим Т-клетки. Часть молекулы, способная связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, является молекулой Fab и включает идентичную легкую цепь VLCL в качестве антигенсвязывающей части молекулы, способной специфически связываться с антигеном целевых клеток.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения Т-клетки активирующим антигеном является CD3, в частности CD3 человека или CD3 макака крабоеда, наиболее предпочтительно CD3 человека. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения часть молекулы, связывающая антиген, который активирует Т-клетки, обладает перекрестной активностью (т.е. специфически связывает) в отношении CD3 человека и CD3 макака крабоеда. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активирующий Т-клетки антиген представляет субъединицу эпсилон CD3 (SEQ ID NO: 56).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы может конкурировать с моноклональным антителом Н2С (описанным в публикации РСТ WO 2008/119567) за связывание с эпитопом CD3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы может конкурировать с моноклональным антителом V9 (описанным в работах Rodrigues с соавт., Int J Cancer Suppl 7, 1992, 45-50, и US 6054297) за связывание с эпитопом CD3. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы может конкурировать с моноклональным антителом FN18 (described in Nooij с соавт., Eur J Immunol 19, 1986, 981-984) за связывание с эпитопом CD3. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы может конкурировать с моноклональным антителом SP34 (described in Pessano с соавт., EMBO J 4, 1985, 337-340) за связывание с эпитопом CD3. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы связывается с тем же эпитопом CD3, что и моноклональное антитело SP34.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы содержит CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 15, CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 16, CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 33 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 34. В другом варианте осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы включает последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 36 или ее вариантам, которые сохраняют функциональность.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы включает последовательность вариабельной области легкой цепи, которая, по меньшей мере, примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 31 или ее вариантам, которые сохраняют функциональность.
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая антигенсвязывающая часть молекулы включает тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 36, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 31.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения часть молекулы, связывающая антиген, который активирует Т-клетки, включает тяжелую цепь SEQ ID NO: 40 и легкую цепь, включающую SEQ ID NO: 35.
Часть молекулы, связывающая антиген, который активирует Т-клетки
Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению включает по меньшей мере одну антигенсвязывающую часть молекулы, способную связываться с антигеном целевых клеток (также называемую в настоящем изобретении «частью молекулы, связывающей антиген целевых клеток»). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает части молекулы, связывающие два антигена, способные связываться с антигеном целевых клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения каждая из таких антигенсвязывающих частей молекулы специфически связывается с одним и тем же антигенным детерминантом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с антигеном целевых клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает не более двух антигенсвязывающих частей молекулы, способных связываться с антигеном целевых клеток. Часть молекулы, связывающая антиген целевых клеток, обычно является молекулой Fab, которая связывается со специфическим антигенным детерминантом и способная направлять активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу к целевому сайту, например, к специфическому типу опухолевых клеток, несущих антигенный детерминант. Указанная молекула Fab имеет идентичную легкую цепь VLCL, поскольку молекула Fab способна специфически связываться с активирующим Т-клетки антигеном. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная легкая цепь VLCL молекулы Fab, способная к специфическому связыванию с антигенным клеточным антигеном, и молекула Fab, способная к специфическому связыванию с активирующим Т-клетки антигеном, содержат CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 33 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 34. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная легкая цепь VLCL молекулы Fab, способная к специфическому связыванию с антигеном целевых клеток, и молекулы Fab, способная к специфическому связыванию с антигеном, активирующим Т-клетки, содержит легкую цепь VLCL SEQ ID NO. 31.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения часть молекулы, связывающая антиген целевых клеток, включает последовательность вариабельной области легкой цепи, которая, по меньшей мере, примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 31, или ее варианты, сохранившие функциональность.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения часть молекулы, связывающая антиген целевых клеток, включает последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 35, или ее варианты, сохранившие функциональность.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения часть молекулы, связывающая антиген целевых клеток, направлена на антиген, связанный с патологическим состоянием, например, антиген, презентированный на клетках опухоли или инфицированной вирусом клетке. Соответствующими антигенами являются антигены на поверхности клетки, например, рецепторы на поверхности клетки, но ими перечень примеров не ограничивается. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антиген является антигеном человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антиген целевых клеток выбран из группы, включающей: рецептор фолиевой кислоты 1 (Folate Receptor 1 - FolR1), муцин-1 (Mucin-1 - MUC1) и антиген созревания В-клеток (B-Cell Maturation Antigen - ВСМА).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Т-клетки-активирующая биспецифическая антигенсвязывающая молекула представляет полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидной последовательностью, которая, по меньшей мере, примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 272, включая их функциональные фрагменты или варианты.
Полинуклеотиды
В настоящем изобретении также предусматривают выделенные полинуклеотиды, кодирующие активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению или ее фрагмент.
К полинуклеотидам по настоящему изобретению относят те полинуклеотиды, которые, по меньшей мере, примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны следующим последовательностям: SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 198, 5 SEQ ID NO: 267 и SEQ ID NO: 272, включая их функциональные фрагменты или варианты.
Полинуклеотиды, кодирующие активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению могут эксрессироваться в виде одного полинуклеотида, кодирующего всю активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу или нескольких полинуклеотидов (например, двух или нескольких), которые экспрессируются совместно. Полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые экспрессируются совместно, могут ассоциировать, например, через дисульфидные связи или иным образом, для формирования функциональной активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы. Например, часть легкой цепи антигенсвязывающей части молекулы может кодироваться отдельным полинуклеотидом из части активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, включающей часть тяжелой цепи антигенсвязывающей части молекулы, субъединицу домена Fc и необязательно (часть) другой антигенсвязывающей части молекулы. При совместной экспрессии полипептиды тяжелой цепи могут ассоциировать с полипептидами легкой цепи с образованием антигенсвязывающей части молекулы. В другом примере часть активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы и содержащей одну из двух субъединиц домена Fc и необязательно (часть) одной или нескольких антигенсвязывающих частей активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, может быть кодирована отдельным полинуклеотидом из части активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей другую из двух субъединиц домена Fc и необязательно (часть) антигенсвязывающей части молекулы. При совместной экспрессии субъединицы домена Fc ассоциируют с образованием домена Fc.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полинуклеотидом или нуклеиновой кислотой является ДНК. В других вариантах осуществления настоящего изобретения полипептидом по настоящему изобретению является РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК). РНК по настоящему изобретению может быть одноцепочечной или двухцепочечной.
Методы рекомбинации
Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть получены, например, твердофазным синтезом пептидов (например, твердофазным синтезом по Меррифилду) или путем рекомбинации. Для получения с помощью рекомбинации выделяют один или несколько полинуклеотидов, кодирующих активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (или ее фрагмент), например, согласно приведенному выше описанию, и инсертируют в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такой полинуклеотид может быть легко выделен и секвенирован, используя обычные процедуры. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают вектор, предпочтительно экспрессирующий вектор, включающий один или несколько полинуклеотидов по настоящему изобретению. Известные в данной области методы могут быть применены для конструирования векторов экспрессии, содержащих кодирующую последовательность активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы (или ее фрагмента), наряду с соответствующими контрольными сигналами транскрипции/трансляции. Эти методы включают in vitro методы рекомбинации ДНК, методы синтеза и рекомбинации in vivo/генетической рекомбинации. См., например, методы, описанные в кн. Maniatis с соавт. «MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL», 1989, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, и в кн. Ausubel с соавт. «CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY», 1989, изд-во Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, Нью-Йорк. Вектор экспрессии может быть частью плазмиды, вируса или может быть фрагментом нуклеиновой кислоты. Вектор экспрессии включает кассету экспрессии, в которой полинуклеотид, кодирующий активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (или ее фрагмент) (т.е. кодирующую область), клонирован в оперативной ассоциации с промотором и/или другими элементами контроля транскрипции или трансляции. В контексте настоящего изобретения понятие «кодирующая область» представляет часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя «стоп-кодон» (TAG, TGA или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, если присутствует, но какие-либо фланкирующие последовательности, например промоторы, сайты связывания рибосомы, терминаторы транскрипции, интроны, 5'- и 3'-нетранслируемые области и другие участки, не являются частью кодирующей области. Две или несколько кодирующих областей могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например, на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, на отдельных (разных) векторах. Кроме того, какой-либо вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или несколько кодирующих областей, например, вектор по настоящему изобретению может кодировать один или несколько полипептидов, которые после трансляции или при одновременно протекающей трансляции разделяются на конечные белки за счет протеолитического расщепления. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота по настоящему изобретению могут кодировать гетерологичные кодирующие области, которые или гибридизированы, или не гибридизированы с полинуклеотидом, кодирующим активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулу (или ее фрагмент) или ее производное, или ее вариант. К гетерологичным кодирующим областям относят, но ими перечень не ограничивается, специализированные элементы или мотивы, например, секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. Оперативная ассоциация заключается в том, что кодирующая область генного продукта, например полипептида, ассоциирована с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы экспрессировать продукт гена под воздействием или под контролем регуляторной последовательности (последовательностей). Два фрагмента ДНК (например, область кодирования полипептида и связанный с ним промотор) являются «оперативно связанными», если индукция промоторной функции приводит к транскрипции мРНК, кодирующей требуемый генный продукт, и если природа связи между двумя фрагментами ДНК не препятствует последовательностям, регулирующим экспрессию, направлять экспрессию генного продукта, или не мешает транскрипции с матрицы ДНК. Таким образом, область промотора может быть оперативно связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен осуществлять транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотор может быть клеточноспецифичным промотором, который главным образом направляет транскрипцию ДНК только в заранее определенных клетках. Помимо промотора другие элементы контроля транскрипции, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть оперативно ассоциированы с полинуклеотидом для направления клеточноспецифичной транскрипции. Соответствующие промоторы и другие области контроля транскрипции описаны в настоящем изобретении. Специалистам в данной области известны различные области, контролирующие транскрипцию. К ним относятся, но ими перечень не ограничивается, области контроля транскрипции, которые функционируют в клетках позвоночных, например, но ими перечень не ограничивается, сегменты промотора и энхансера цитомегаловирусов (например, промотор гена немедленного ответа в сочетании с интроном-А), вируса обезьян 40 (например, ранний промотор) и ретровирусов (например, вируса саркомы Рауша). К другим областям контроля транскрипции относят те, которые получены от генов позвоночных, например, генов актина, белка теплового шока, гормона роста крупного рогатого скота и а-глобина кролика, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. К другим областям контроля транскрипции относят тканеспецифичные промоторы и энхансеры, а также индуцируемые промоторы (например, промоторы, индуцируемые тетрациклинами). Сходным образом специалистам в данной области техники известны различные элементы контроля трансляции. К ним относят, но ими не ограничиваются, сайты связывания рибосомы, кодоны инициации и терминации трансляции, а также элементы, полученные от вирусных систем (в частности, участок внутренней посадки рибосомы (internal ribosome entry site - IRES), также называемый последовательностью CITE). Кассета экспрессии также может включать другие свойства, например, происхождение репликации и/или элементы интеграции хромосом, например, ретровирусные длинные концевые повторы (long terminal repeat - LTR) или инвертированные концевые повторы (inverted terminal repeat - ITR) аденоассоциированного вируса (adeno-associated viral - AAV).
Кодирующие области полинуклеотида и нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть ассоциированы с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, направляющие секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом по настоящему изобретению. Например, если требуется секреция активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, кодирующая сигнал последовательность ДНК может быть размещена выше по цепи нуклеиновой кислоты, кодирующей активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению или ее фрагмент. Согласно сигнальной гипотезе, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которая отщепляется от зрелого белка после инициации начала экспорта растущей белковой цепи через шероховатую эндоплазматическую сеть. Специалистам в данной области известно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, обычно имеют сигнальный пептид, гибридизированный с N-концом полипептида, который отщепляется от транслируемого полипептида для получения секретируемой или «зрелой» формы полипептида. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используют нативный сигнальный пептид, например, тяжелой цепи иммуноглобулина или легкой цепи сигнального пептида, или функциональное производное такой последовательности, которое сохраняет способность направлять секрецию полипептида, оперативно с ней связанного. В другом варианте можно использовать гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих или его функциональное производное. Например, лидерная последовательность дикого типа может быть заменена лидерной последовательностью активатора плазминогена ткани человека (tissue plasminogen activator - TPA) или β-глюкуронидазы мыши.
ДНК, кодирующая короткую последовательность белка, которая может быть применена для облегчения последующей очистки (например, гистидиновая метка) или способствующая маркировке активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающие молекулы может быть включена в состав или присоединена к концам активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, (фрагмент) кодирующего полинуклеотида.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают клетку-хозяина, включающую один или несколько полинуклеотидов по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают клетку-хозяина, включающую один или несколько векторов по настоящему изобретению. Полинуклеотиды и векторы могут обладать каким-либо из признаков, отдельно или в комбинации, описанных в настоящем изобретении в отношении полинуклеотидов и векторов, соответственно. В одном из таких вариантов клетка-хозяин содержит (например, после трансформации или без трансформации) вектор, содержащий полинуклеотид, который кодирует (часть) активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы. В контексте настоящего изобретения понятие «клетка-хозяин» относится к какому-либо типу клеточной системы, который может быть сконструирован для выработки активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению или их фрагментов. Клетки-хозяева, применимые для репликации и для поддержки экспрессии активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул известны в данной области. Такие клетки могут быть соответствующим образом трансфицированы или трансдуцированы определенным вектором экспрессии, и большие количества клеток, содержащих вектор, можно выращивать для засева ферментеров большого объема для получения достаточных количеств активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул для клинических применений. К применимым клеткам-хозяевам относятся прокариотические микроорганизмы, например, Е. coli, или различные эукариотические клетки, например, клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки насекомых или другие. Например, полипептиды могут быть получены в бактериях, особенно, когда гликозилирование не требуется. После экспрессии полипептид может быть выделен из биомассы бактериальных клеток в растворимую фракцию и может быть дополнительно очищен. Помимо прокариот, можно применять эукариотические микроорганизмы, например, мицелиальные грибы или дрожжи, у которых метаболические пути гликозилирования были «гуманизированы», что приводит к получению частично или полностью гликозилированного полипептида человека. См. Gerngross, Nat Biotech 22, 2004, 1409-1414, Li с соавт., Nat Biotech 24, 2006, 210-215. Соответствующие клетки-хозяева для экспрессии (гликозилированных) полипептидов также могут быть производны от многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). К примерам клеток беспозвоночных относятся клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные штаммы бакуловируса, которые можно применять вместе с клетками насекомых, особенно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Культуры клеток растений также можно применять в качестве клеток-хозяев. См., например, US 5959177, US 6040498, US 6420548, US 7125978 и US 6417429 (в которых описана технология PLANTIBODIES™, с помощью которой получают антитела в трансгенных растениях). Клетки позвоночных также могут применяться в качестве клеток-хозяев. Например, применимы линии клеток млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. К другим примерам соответствующих линий клеток-хозяев млекопитающих относятся линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированных вирусом SV40 (COS-7), линия эмбриональных клеток почки человека (клетки 293 или 293Т, описанные, например, в работе Graham с соавт., J Gen Virol 36, 1977, 59), клетки почки новорожденного хомяка (baby hamster kidney - ВНК), клетки Сертоли мыши (клетки ТМ4, описанные, например, в публикации Mather, Biol Reprod 23, 1980, 243-251), клетки почки обезьяны (CV1), клетки почки зеленой африканской мартышки (VERO-76), клетки карциномы шейки матки человека (HELA), клетки почки собаки (MDCK), клетки печени серой крысы (BRL 3А), клетки легкого человека (W138), клетки печени человека (Hep G2), опухолевые клетки молочной железы мыши (ММТ 060562), клетки TRI (описанные, например, в работе Mather с соавт., Annals N.Y. Acad Sci 383, 1982, 44-68), клетки MRC и клетки FS4. К другим линиям клеток-хозяев, которые также могут быть применены, относятся клетки яичника китайского хомяка (Chinese hamster ovary - СНО), включая клетки dhfr - СНО (Urlaub с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 77, 1980, 4216), и линии клеток миеломы, например, YO, NS0, Р3Х63 и Sp2/0. Для обзора определенных линий клеток-хозяев млекопитающих, применимых для выработки белка, см., например, публикацию Yazaki и Wu в кн. «Methods in Molecular Biology», Т. 248, 2003, 255-268, под ред. В.K.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, Нью-Джерси). К клеткам-хозяевам относят культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, дрожжевые клетки, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки растений, а также клетки, входящие в состав трансгенных животных, трансгенных растений или культивируемых растительных или животных тканей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева являются эукариотическими клетками, предпочтительно клетками млекопитающих, например, клетками яичника китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary - СНО), эмбриональными клетками почки человека (human embryonic kidney - HEK) или лимфоидными клетками (например, клетки Y0, NS0, Sp20).
В данной области известны стандартные технологии, позволяющие экспрессировать чужеродные гены в этих системах. Клетки, экспрессирующие полипептид, содержащий либо тяжелую, либо легкую цепь антигенсвязывающего домена, например антитела, могут быть сконструированы таким образом, чтобы дополнительно экспрессировать другую цепь антитела, при этом экспрессируемый продукт представляет антитело, которое имеет и тяжелую, и легкую цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают способ получения активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, в котором культивируют клетки-хозяева, включающие полинуклеотид, который кодирует активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулу по настоящему изобретению, в условиях, пригодных для экспрессии активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы и выделяют из клеток-хозяев или из культуральной среды клеток-хозяев активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулу.
Компоненты активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, генетически гибридизируют друг с другом. Активирующей Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула может быть сконструирована таким образом, что ее компоненты гибридизированы непосредственно друг с другом или гибридизированы через линкерную последовательность. Состав и длина линкера могут быть определены в соответствии с методами, известными в данной области и их эффективность может быть протестирована. Примеры линкерных последовательностей между различными компонентами активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул установлены в последовательностях, предусмотренных в настоящем изобретении. Дополнительные последовательности также могут быть включены для инкорпорации сайта расщепления для разделения отдельных компонентов гибридной молекулы в случае необходимости, например, последовательности для распознавания эндопептидазой.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения одна или несколько антигенсвязывающих частей активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул включают по меньшей мере вариабельную область антитела, способную связывать антигенный детерминант. Вариабельные области могут формировать часть и происходить от природных или неприродных антител и их фрагментов. Способы получения поликлональных антител и моноклональных антител известны в данной области (см., например, Harlow и Lane, «Antibodies, a laboratory manual», изд-во Cold Cold Harbor Laboratory, 1988). Неприродные антитела могут быть сконструированы с использованием твердофазного синтеза пептидов, или получены методом рекомбинации (например, по описанию US 4186567) или, например, путем скрининга комбинаторных библиотек, содержащих вариабельные тяжелые цепи и вариабельные легкие цепи (см., например, US 5969108).
Антитела каких-либо видов животных, фрагменты антител, антигенсвязывающие домены или вариабельные области могут быть применены в активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекулах по настоящему изобретению. Антителами, фрагментами антител, антигенсвязывающими доменами или вариабельными областями, используемыми в настоящем изобретении, по происхождению могут быть от мышей, приматов или от человека. Если активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула предназначена для использования человеком, может быть использована химерная форма антитела, в которой константные области антитела происходят от человека. Гуманизированная или полученная от человека форма антитела также могут быть получены в соответствии с методами, известными в данной области (см., например, US 5565332). Гуманизация может быть достигнута разными методами, включая, но ими не ограничиваясь: (а) перенос области CDR, не входящей в состав антитела человека (например, антитела донора), на каркас антитела человека (например, реципиентного антитела) и константных областей с сохранением или без сохранения критических остатков каркаса (например, тех, которые важны для сохранения хорошего связывающего сродства с антигеном или функций антитела), б) перенос только областей, определяющих специфичность, полученных не от антитела человека (SDR или a-CDR; остатков, критических для взаимодействия антитело-антиген), в каркас антитела человека, и константных областей, или (в) перенос всех вариабельных доменов, не относящихся к антителу человеку, за исключением их «маскировки» участком, напоминающим участок из молекулы человека, путем замены остатков на поверхности. Гуманизированные антитела и методы их получения рассмотрены, например, в обзоре Almagro и Fransson, Front Biosci 13, 2008, 1619-1633, а также, например, в работах Riechmann с соавт., Nature 332, 1988, 323-329, Queen с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 86, 1989, 10029-10033, US 5821337, US 7527791, US 6982321, US 7087409, Jones с соавт., Nature 321, 1986, 522-525, Morrison с соавт., Proc Natl Acad Sci 81, 1984, 6851-6855, Morrison и Oi, Adv Immunol 44, 1988, 65-92, Verhoeyen с соавт., Science 239, 1988, 1534-1536, Padlan, Molec Immun 31(3), 1994, 169-217, Kashmiri с соавт., Methods 36, 2005, 25-34 (описание переноса SDR (a-CDR)), Padlan, Mol Immunol 28, 1991, 489-498 (описание «перекладки»),
Figure 00000003
с соавт., Methods 36, 2005, 43-60 (описание «перестановки FR»); Osbourn с соавт., Methods 36, 2005, 61-68, Klimka с соавт., Br J Cancer 83, 2000, 252-260 (описание подхода «направленная селекция» к перестановке FR). Антитела человека и вариабельные области антител человека могут быть получены, используя различные методы, известные в данной области. В основном антитела человека описаны в публикациях van Dijk и van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 2001, 368-374, и Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 2008, 450-459. Вариабельные области антител человека могут формировать часть моноклонального антитела и могут происходить от моноклональных антител человека, полученных гибридомным методом (см., например, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, стр. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Нью-Йорк, 1987)). Антитела и вариабельные области антител человека также могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для получения интактных антител человека или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на антигенную провокацию (см., например, Lonberg, Nat Biotech 23, 2005, 1117-1125. Антитела человека и вариабельные области антител человека также можно получить путем выделения последовательностей вариабельной области клона Fv, выбранных из библиотек для фагового дисплея, производных от человека (см., например, Hoogenboom с соавт., Methods in Molecular Biology 178, 2001, 1-37 (
Figure 00000004
с соавт., изд-во Human Press, Totowa, Нью-Джерси) и McCafferty с соавт., Nature 348, 1991, 552-554, Clackson с соавт., Nature 352, 1991, 624-628). Фаг обычно отображает фрагменты антител либо в виде одноцепочечных фрагментов Fv (single-chain Fv - scFv), либо в виде Fab-фрагментов.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие части молекулы, применяемые в настоящем изобретении, конструируют для повышения связывающего сродства, например, в соответствии с описанием методов в патентной заявке US 2004/0132066, сущность которой включена в настоящее описание в виде ссылки. Способность активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению связываться со специфическим антигенным детерминантом может быть измерена или методом фермент-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) или другими методами, известными специалистам в данной области, например, методом поверхностного плазменного резонанса (анализ в системе BIACORE Т100) (Liljeblad с соавт., Glyco J 17, 2000, 323-329) и традиционными методами анализом связывания Heeley, Endocr Res 28, 2002, 217-229). Методы анализа конкуренции могут быть использованы для идентификации антитела, фрагмента антитела, антигенсвязывающего домена или вариабельного домена, которые конкурируют с контрольным антителом за связывание с определенным антигеном, например, с антителом, которое конкурирует с антителом V9 за связывание с CD3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такое конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается контрольное антитело. Подробное описание примеров методов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, приведены в работе Morris в кн.: «Methods in Molecular Biology», vol. 66, 1983, изд-во Humana Press, Totowa, Нью-Джерси. В примере конкурентного анализа иммобилизованный антиген (например, CD3) инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с антигеном (например, антителом V9), и вторым немеченым антителом, которое тестируют на способность конкурировать с первым антителом за связывание с антигеном. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный антиген инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубирования в условиях, разрешающих связывание первого антитела с антигеном, избыточное несвязанное антитело удаляют и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным антигеном. Если количество метки, связанной с иммобилизованным антигеном, существенно уменьшается в тестируемом образце относительно контрольного образца, это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с антигеном. См. публикацию Harlow и Lane в кн.: «Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, глава 14, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк.
Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы получают по описанному в настоящем изобретении методу, и они могут быть очищены методами, известными в данной области, например, с помощью высоко эффективной жидкостной хроматографии, ионообменной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии, эксклюзионной хроматографии и др. Фактические условия, используемые для очистки определенного белка, будут частично зависеть от ряда факторов, например, от суммарного заряда, гидрофобности, гидрофильности и т.д., которые известны специалистам в данной области. Для очистки аффинной хроматографией могут быть применены антитело, лиганд или антиген, с которыми связывается активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула. Например, для очистки аффинной хроматографией активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению могут быть применены матрицы с белком А или белком G. Последующую аффинную хроматографию с белком А или белком G и эксклюзионную хроматографию можно использовать для выделения активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, что описано в примерах. Чистота активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы может быть определена каким-либо из различных известных аналитических методов, включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и других. Например, показано, что гибридные белки тяжелых цепей, экспрессированные согласно описаниям в примерах, интактны и надлежащим образом собраны, что показано путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE). Три полосы с молекулярной массой приблизительно в 25000, 50000 и 75000 соответствуют прогнозируемым молекулярным массам легкой цепи, тяжелой цепи и гибридного белка легкой цепи/тяжелой цепи активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы.
Исследования
Предусмотренные в настоящем изобретении активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы могут быть идентифицированы, подвергнуты скринингу или у них могут быть описаны физические/химические свойства и/или биологические активности различными методам исследования, известными в данной области.
Изучение связывающего сродства (аффинности)
Аффинность активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы с рецептором Fc или целевым антигеном, может быть определена методами, описанными ниже в примерах, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR), используя стандартную аппаратуру, например, инструмент BIAcore (фирма GE Healthcare), а также рецепторов или целевых белков, которые могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии. В другом варианте связывание активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул с разными рецепторами или целевыми антигенами можно оценивать с использованием клеточных линий, экспрессирующих специфический рецептор или целевой антиген, например, методом жидкостной цитометрии (FACS). Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, в которых описано измерение аффинности, описано ниже, в частности в примерах.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения KD измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса, используя прибор BIACORE® Т100 (фирма GE Healthcare) при 25°С.
Для анализа взаимодействия между частью Fc и рецепторами Fc рекомбинантный рецептор Fc с меткой His-tag захватывается анти-Penta His антителом (фирма Qian) («Penta His» представляет последовательность SEQ ID NO: 45), иммобилизованным на чипах СМ5, а биспецифические конструкции применяют в качестве исследуемых соединений. Вкратце, биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма GE Healthcare) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлоридом (EDC) и N-5-гидроксисукцинимидом (hydroxysuccinimide - NHS) по инструкциям поставщика. Анти-Penta-His антитело (описание «Penta His» представляет последовательность SEQ ID NO: 45) разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 5,0, до 40 мкг/мл перед закалыванием при скорости тока 5 мкл/мин до достижения примерно 6500 единиц ответа (RU) присоединенного белка. После закалывания лиганда вводят 1 М этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Затем рецептор Fc захватывается в течение 60 сек в количестве 4-10 нМ. Для измерения кинетики четырехкратные серийные разведения биспецифической конструкции (диапазон от 500 нМдо 4000 нМ) впрыскивают в HBS-EP (фирма GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% поверхностно-активного вещества Р20, рН 7,4) при 25°С со скоростью тока 30 мкл/мин в течение 120 сек.
Для определения сродства с целевым антигеном биспецифические конструкции захватывают антителом, специфичным в отношении Fab человека (фирма GE Healthcare), которое иммобилизуют на активированной поверхности сенсорного чипа СМ5, согласно описанию для антитела против Penta-His («Penta His», раскрытого как SEQ ID NO: 45). Конечное количество связанного белка составляет приблизительно 12000 RU. Биспецифические конструкции захватываются в течение 90 сек в количестве 300 нМ. Целевые антигены пропускают через проточные кюветы в течение 180 сек в диапазоне концентраций от 250 до 1000 нМ со скоростью тока 30 мкл/мин. Проводят мониторинг диссоциации в течение 180 сек.
Различия величин индекса преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в контрольной проточной кювете. Реакцию устойчивого состояния применяют для получения константы диссоциации KD с помощью нелинейной кривой, соответствующей изотерме связывания Лэнгмюра. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) рассчитывают, используя простую один-к-одному модель связывания Лэнгмюра (BIACORE® Т100 Evaluation Software version 1.1.1), путем одновременной установки сенсограм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия диссоциации (KD) рассчитывают как соотношение koff/kon. См., например, Chen с соавт., J Mol Biol 293, 1999, 865-881.
Определение активности
Биологическую активность активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению можно измерять разными методами, что описано в примерах. Биологическая активность может включать, например, индукцию пролиферации Т-клеток, индукцию передачи сигналов в Т-клетках, индукцию экспрессии маркеров активации в Т-клетках, индукцию секреции цитокинов Т-клетками, индукцию лизиса целевых клеток, например, опухолевых клеток и индукции регрессии опухолей и/или улучшения выживаемости.
Композиции, составы и способы введения
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают фармацевтические композиции, включающие какие-либо из активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению например, для применения в каком-либо из указанных ниже терапевтических методов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает какую-либо из активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает какую-либо из активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, согласно приведенному ниже описанию.
Также предусматривают способ получения активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, подходящей для введения in vivo, причем способ включает (а) получение активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению и (б) переработку активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, при этом препарат активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы перерабатывают для введения in vivo.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически эффективное количество одной или нескольких активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, растворенных или диспергированных в фармацевтически приемлемом носителе. Фраза «фармацевтические или фармакологически приемлемые» относится к молекулам и композициям, которые обычно нетоксичны для реципиентов при используемых дозах и концентрациях, то есть не вызывают неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении животному, например, человеку, в зависимости от потребности. Получение фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одну активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулу и, необязательно, дополнительный действующий ингредиент, известно специалистам в данной области в свете настоящего описания, и осуществляется подобно описанному в кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 1990, 18-е изд., изд-во Mack Printing Company, включенной в настоящее изобретение в виде ссылки. Кроме того, для введения животными (например, человеку) следует учитывать, что препараты должны соответствовать требованиям стерильности, переменности, общим стандартам безопасности и чистоты, согласно требованиям Управления по биологическим стандартам FDA или соответствующих органов в других странах. Предпочтительными композициями являются лиофилизированные составы или водные растворы. В настоящем изобретении понятие «фармацевтически приемлемый носитель» включает какие-либо или все растворители, буферы, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты замедления всасывания, соли, консерванты, антиоксиданты, белки, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, полимеры, гели, связующие агенты, эксципиенты, разрыхлители, смазывающие вещества, подсластители, ароматизаторы, красители, а также их комбинации, что известно специалистам в данной области (см. например, кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 1990, 18-е изд., изд-во Mack Printing Company, включенную в настоящее изобретение в виде ссылки). В тех случаях, когда какой-либо обычный носитель несовместим с действующим ингредиентом, и его применение в терапевтических или фармацевтических композициях исключают.
Композиция может содержать различные типы носителей в зависимости от того, следует ли ее вводить в твердой, жидкой или аэрозольной форме и она должна быть стерильной для таких способов введения, как инъекция. Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению (и какой-либо дополнительный терапевтический агент) можно вводить внутривенно, внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутрь повреждений, внутричерепным способом, внутрисуставно, внутрь простаты, внутрь селезенки, внутрипочечно, внутриплеврально, внутритрахеально, интраназально, интравитреально, интравагинально, внутриректально, внутрь опухоли, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, субконъюнктивно, интравезикулярно, через слизистую, внутрь перикарда, в пупочный пузырек, внутрь глаза, перорально, местно, локально, путем ингаляции (например, аэрозольной ингаляцией), инъекционно, инфузионно, непрерывной инфузией, непосредственно с помощью локализованных перфузионных ванн с целевыми клетками, через катетер, через лаваж, в кремах, в липидных композициях (например, в липосомах) или другим способом или какой-либо комбинацией указанных способов, известных социалистам в данной области (см. например, кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 1990, 18-е изд., изд-во Mack Printing Company, включенную в настоящее изобретение в виде ссылки). Парентеральное введение, в частности внутривенную инъекцию, наиболее часто используют для введения полипептидных молекул, например, активирующих Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению.
Парентеральные композиции включают композиции, предназначенные для введения путем инъекции, например, подкожной, внутрикожной, внутрь повреждений, внутривенной, внутриартериальной, внутримышечной, интратекальной или внутрибрюшинной. Для инъекции активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению могут быть переработаны в водные растворы, предпочтительно в физиологически совместимые буферы, например, раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический раствор. Раствор может содержать вспомогательные вещества, например, суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В другом варианте активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы могут быть в виде порошка для состава с подходящим носителем, например, со стерильной апирогенной водой, добавляемой перед применением. Стерильные растворы для инъекций по мере необходимости получают путем включения активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в требуемом количестве в подходящем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными ниже. Стерильность может быть достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Обычно дисперсии получают путем включения различных стерильных действующих ингредиентов в стерильный растворитель, который содержит основную дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, суспензий или эмульсий предпочтительными способами являются вакуумная сушка или лиофилизация, в результате которых получают порошок активного ингредиента плюс какой-либо дополнительный требуемый ингредиент из ранее стерилизованной фильтрацией жидкой среды. Жидкая среда при необходимости должна быть соответствующим образом забуферена, и жидкий разбавитель сначала, до инъекции, восстанавливает изотоничность за счет достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Композиция должна быть стабильной в условиях получения и хранения и она защищена от контаминации микроорганизмами, например, бактериями и грибами. Следует учитывать, что загрязнение эндотоксином допустимо на минимальном безопасном уровне, например, менее 0,5 нг/мг белка. Соответствующие фармацевтически приемлемые носители включают, но ими перечень не ограничивается, буферы, например, фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, октадецилдиметилбензиламмоний хлорид, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, например, метилпарабен или пропилпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон; аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, ЭДТА; сахара, например, сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, например, натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ). Водные инъекционные суспензии могут содержать соединения, которые увеличивают вязкость суспензии, например, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, сорбит, декстран и другие. Необязательно, суспензия также может содержать соответствующие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость соединений, чтобы обеспечить получение высококонцентрированных растворов. Кроме того, суспензии действующих соединений могут быть получены в виде соответствующих масляных суспензий для инъекций. Соответствующие липофильные растворители или носители включают жирные масла, например, кунжутное масло или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например, этиловые связки, или триглицериды, или липосомы.
Действующие ингредиенты могут быть захвачены в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или межфазной полимеризацией, например, гидроксиметилцеллюлозы или желатиновых микрокапсул и поли-(метилметакрилатных) микрокапсул, соответственно, в системах доставки коллоидных лекарственных средств (например, в липосомах, микросферах из альбумина, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методы описаны в кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 1990, 18-е изд., изд-во Mack Printing Company. Можно получить препараты с замедленным высвобождением. Соответствующие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие полипептид, причем матрицы находятся в форме формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения продолжительное всасывание инъекционной композиции может быть достигнуто путем использования в композициях агентов, замедляющих всасывание, например, моностеарата алюминия, желатина или их комбинаций.
В дополнение к ранее описанным композициям активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекулы также могут быть разработаны в виде препарата-депо. Такие составы длительного действия можно вводить имплантацией (например, подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекцией. Соответственно, активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы могут быть переработаны с использованием соответствующих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в приемлемом масле), или ионообменных смол, или малорастворимых производных, например, в виде труднорастворимой соли.
Фармацевтические композиции, содержащие активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть получены с помощью обычных процессов смешивания, растворения, эмульгирования, инкапсулирования, захвата или лиофилизации. Фармацевтические композиции могут быть получены обычным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ, которые облегчают переработку белков в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически. Надлежащий состав зависит от выбранного способа введения.
Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы могут быть переработаны в композицию в форме свободных кислоты или основания, в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли являются солями, которые в существенной степени сохраняют биологическую активность свободных кислоты или основания. К ним относятся кислотно-аддитивные соли, например, те, которые образуются со свободными аминогруппами белковой композиции, или которые образованы с неорганическими кислотами, например, с хлористоводородными или фосфорными кислотами, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная или миндальная кислота. Соли, образованные с помощью свободных карбоксильных групп, также могут быть получены из неорганических оснований, например, гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция или трехвалентного железа; или такие органические основания, как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин. Фармацевтические соли обычно более растворимы в водных и других протонных растворителях, чем соответствующие формы свободного основания.
Терапевтические методы и композиции
Какая-либо из активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению может быть применена в терапевтических методах. Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве иммунотерапевтических агентов, например, в лечении рака.
Для применения в терапевтических методах активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению могут перерабатываться, дозироваться и вводиться в соответствии с разработанной медицинской практикой. При этом к учитываемым факторам относят определенное подвергаемое лечению расстройство, вид подвергаемого лечению млекопитающего, клиническое состояние конкретного пациента, причину расстройства, место для доставки лекарственного агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. В других вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в лечении заболевания. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в способе лечения заболевания. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в лечении заболевания индивидуума, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы для применения в способе лечения больного индивидуума, причем способ включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения заболеванием, подлежащим лечению, является пролиферативное расстройство. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболеванием является рак. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного дополнительного терапевтического агента, например, протиракового агента, если подлежащее лечению заболевание является раком. В других вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в индукции лизиса целевых клеток, в частности опухолевых клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы для применения в способе индукции лизиса целевых клеток, в частности опухолевых клеток, у индивидуума, указанный способ включает введение индивидууму эффективного количества активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы индукции лизиса целевых клеток. Понятие «индивидуум» в соответствии с каким-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения означает млекопитающее, предпочтительно человека.
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в получении лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для лечения индивидуума, нуждающегося в этом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения лекарственное средство для применения в способе лечения заболевания, включающем введение больному индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения заболеванием, подлежащим лечению, является пролиферативное расстройство. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболеванием является рак. В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного дополнительного терапевтического агента, например, противоракового агента, если подлежащее лечению заболевание является раком. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для индукции лизиса целевых клеток, в частности опухолевых клеток. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе индукции у индивидуума лизиса целевых клеток, в частности опухолевых клеток, включающем введение индивидууму эффективного количества лекарственного средства для индукции лизиса целевых клеток. «Индивидуум» в соответствии с каким-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения может быть млекопитающим, предпочтительно человеком.
В другом варианте осуществления настоящее изобретения изобретение относится к способу лечения заболевания. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает введение индивидууму, имеющему такое заболевание, терапевтически эффективного количества активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанному индивидууму вводят композицию, включающую активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемой форме. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения заболевание, подлежащее лечению, является пролиферативным расстройством. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения болезнью является рак. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного дополнительного терапевтического агента, например, противоракового агента, если подлежащее лечению заболевание является раком. «Индивидуум» в соответствии с каким-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения может быть млекопитающим, предпочтительно человеком.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают способ индукции лизиса целевых клеток, в частности опухолевых клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает контактирование целевых клеток с активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению в частности цитотоксических Т-клеток. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ индукции у индивидуума лизиса целевых клеток, в частности опухолевых клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает введение индивидууму эффективного количества активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы для индукции лизиса целевых клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения понятие «индивидуум» означает человека.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения заболеванием, подвергаемым лечению, является пролиферативное расстройство, в частности рак. К примерам заболеваний раком относят, но ими перечень не ограничивают, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легких, рак молочной железы, рак яичников, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак желудка, рак предстательной железы, рак крови, рак кожи, плоскоклеточный рак, рак кости и рак почки. Другие расстройства, связанные с пролиферацией клеток, которые можно лечить с применением активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению включают, но ими перечень не ограничивается, новообразования, расположенные в брюшной полости, кости, груди, пищеварительной системе, печени, поджелудочной железе, брюшине, эндокринных железах (надпочечниках, паращитовидных железах, гипофизе, семенниках, яичниках, тимусе, щитовидной железы), глазах, голове и шее, нервной системе (центральной и периферической), лимфатической системе, тазе, коже, мягких тканях, селезенке, торакальной области и мочеполовой системе. Также включены предраковые состояния или поражения и метастазы рака. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак выбран из группы, включающей: рак почки, рак кожи, рак легких, рак прямой кишки, рак молочной железы, рак головного мозга, рак головы и шеи. Специалисту в данной области очевидно, что во многих случаях активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула может не вызвать излечения, но обеспечить частичное улучшение. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения физиологическое изменение, обладающее некоей пользой, также рассматривают в качестве терапевтически полезного. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения определенное количество активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, которое обеспечивает физиологическое изменение рассматривают в качестве «эффективного количества» или «терапевтически эффективного количества». Субъектом, пациентом или индивидуумом, нуждающимся в лечении, являются млекопитающие, более предпочтительно люди.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению вводят в клетку. В других вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению вводят индивидууму для лечения заболевания.
Для профилактики или лечения заболевания соответствующая доза активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению (при использовании отдельно или в сочетании с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими агентами) зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, способа введения, массы тела пациента, типа активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы тяжести и течения заболевания, возможного введения активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы для применения с целью предупреждения или лечения, предшествующих или одновременно осуществляемых терапевтических вмешательств, клинической историй пациента и реакции на активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулы, а также от решения лечащего врача. Практикующий врач, ответственный за применения лекарств, в каком-либо из случаев определит концентрацию действующего ингредиента (ингредиентов) в композиции и соответствующей дозы (доз) для конкретного субъекта. Различные схемы дозирования, включая, но ими не ограничиваясь, однократное или многократное введение, введение в различные моменты времени, болюсные введения и пульс-инфузию, рассматривают в настоящем изобретении.
Активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулу должным образом вводят пациенту однократно или на протяжении времени в виде серии введений. В зависимости от типа и тяжести заболевания первоначальной дозой-кандидатом для введения пациенту может быть доза активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, который активирует Т-клетки, составляющая примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг), которая может быть введена за одно или несколько отдельных введений или путем непрерывной инфузии. Одна типичная суточная доза может варьировать примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от указанных выше факторов. Для повторных введений на протяжении нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение в общем может быть длительным до требуемого подавления симптомов заболевания. Одна примерная доза активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы может быть в диапазоне примерно от 0,005 мг/кг до примерно 10 мг/кг. В других примерах, не ограничивающих рамок охвата настоящего изобретения, доза может включать примерно 1 мкг/кг массы тела, примерно 5 мкг/кг массы тела, примерно 10 мкг/кг массы тела, примерно 50 мкг/кг массы тела, примерно 100 мкг/кг массы тела, примерно 200 мкг/кг массы тела, примерно 350 мкг/кг массы тела, примерно 500 мкг/кг массы тела, примерно 1 мг/кг массы тела, примерно 5 мг/кг массы тела, примерно 10 мг/кг массы тела, примерно 50 мг/кг массы тела, примерно 100 мг/кг массы тела, примерно 200 мг/кг массы тела, примерно 350 мг/кг массы тела, примерно 500 мг/кг массы тела, до примерно 1000 мг/кг массы тела или более за одно введение, и какой-либо диапазон, разработанный в соответствии с настоящим изобретением. В примерах, не ограничивающих рамок охвата настоящего изобретения, расчетный диапазон на основании перечисленных величин примерно от 5 мг/кг массы тела до примерно 100 мг/кг массы тела, примерно от 5 мкг/кг массы тела до примерно 500 мг/кг массы тела, и т.д., может быть введен, основываясь на описанных выше числах. Таким образом, одна или несколько доз, составляющих примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 5,0 мг/кг или 10 мг/кг (или какие-либо их комбинации), могут быть введены пациенту. Такие дозы могут вводить с перерывами, например, еженедельно или раз в три недели (например, таким образом, что пациент получает примерно от 2 до 20, или например, примерно 6 доз активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы). Может быть введена первоначальная повышенная доза с последующими одной или несколькими более низкими дозами. Однако могут быть полезны другие режимы дозирования. Прогресс такой терапии легко подвергать мониторингу с помощью обычных методов и анализов.
Активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулу в основном можно применять в эффективным количестве для достижения намеченной цели. Для применения для лечения или предупреждения болезни активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулу по настоящему изобретению или ее фармацевтическую композицию вводят или применяют в терапевтически эффективном количестве. Определение эффективного количества доступно специалистам в данной области, особенно с помощью подробного описания в настоящем изобретении.
Для системного введения терапевтически эффективная доза может быть установлена первоначально в исследованиях in vitro, например, в культуре клеток. Затем доза может быть разработана на моделях животных для достижения диапазона концентраций в крови, включающего величину IC50, определенную в культуре клеток. Такую информацию можно применять для более точного определения доз, полезных для людей.
Первоначальные дозы можно также оценить по данным, полученным in vivo, например, на животных моделях, используя методы, известные в данной области. Специалист в данной области способен оптимизировать введение лекарственного средства людям, основываясь на данных о животных.
Дозируемое количество и интервалы дозирования можно регулировать индивидуально для обеспечения в плазме уровней активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, достаточных для поддержания терапевтического эффекта. Обычные дозы для введения пациентам путем инъекции варьируют примерно от 0,1 до 50 мг/кг/сутки, обычно примерно от 0,5 до 1 мг/кг/сутки. Терапевтически эффективные уровни в плазме могут быть достигнуты путем ежедневного введения нескольких доз. Уровни в плазме могут быть измерены, например, с помощью ВЭЖХ.
В случаях локального введения или избирательного потребления эффективная локальная концентрация активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул может быть не связана с их концентрацией в плазме. Специалист в данной области может оптимизировать терапевтически эффективные местные дозы без проведения чрезмерного эксперимента.
Терапевтически эффективная доза активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению может полностью обеспечивать терапевтическую пользу без существенной токсичности. Токсичность и терапевтическая эффективность активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению можно определить стандартными фармацевтическими методами в культуре клеток или в моделях экспериментальных животных. Исследования культур клеток, а также опыты на животных, могут применяться для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз, обладающих токсическим и терапевтическим эффектами, является терапевтическим индексом, который может быть выражен в виде соотношения LD50/ED50. Активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, показывающие высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению проявляет высокий терапевтический индекс. Данные, полученные в исследованиях на культурах клеток, а также на животных моделях, могут быть применены при разработке диапазона доз, применимых для лечения людей. Предпочтительно дозы находятся в диапазоне концентраций в крови, которые включают ED50 с малой токсичностью или без токсичности. Доза может варьировать в пределах этого диапазона в зависимости от различных факторов, например, используемой дозированной формы, способа введения, состояния субъекта и других. Точный состав, способ введения и дозировка могут быть выбраны каждым врачом с учетом состояния пациента (см., например, публикацию Fingl с соавт., 1975, в кн.: «The Pharmacological Basis of Therapeutics», глава 1, 1975, стр. 1, включенную в настоящее описание в виде ссылки на ее сущность).
Лечащий врач для пациентов, подвергаемых лечению активирующими Т-клетки биспецифическими антигенсвязывающими молекулами по настоящему изобретению может знать, как и когда прекращать, прерывать или регулировать введение из-за токсичности, дисфункции органа и по другим подобным причинам. И наоборот, лечащий врач также должен знать, каким образом скорректировать лечение путем повышения уровней, если клинический ответ недостаточен (исключая уровней, связанных с токсичностью). Величина вводимой дозы при лечении расстройства в зависимости от тяжести состояния может варьировать, например, изменяя способ введения и применяя другие меры. Степень тяжести состояния можно оценивать, например, стандартными прогностическими методами. Кроме того, доза и, возможно, частота дозирования также могут варьировать в зависимости от возраста, массы тела и реакции конкретного пациента.
Другие лекарственные агенты и способы лечения
Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы можно вводить в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими агентами. Например, активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулу по настоящему изобретению можно вводить совместно, по меньшей мере, с одним дополнительным терапевтическим агентом. Понятие «терапевтический агент» охватывает любой агент, вводимый для лечения симптома или заболевания у индивидуума, нуждающегося в таком лечении. Такой дополнительный терапевтический агент может включать какие-либо действующие ингредиенты, применимые для определенного лечения, предпочтительно исключающего нежелательный эффект от взаимодействия терапевтических агентов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительным терапевтическим агентом является иммуномодулирующий агент, цитостатический агент, ингибитор клеточной адгезии, цитотоксический агент, активатор клеточного апоптоза или агент, который повышает чувствительность клеток к индукторам апоптоза. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения дополнительным терапевтическим агентом является противораковый агент, например, разрушающий микротрубочки, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, интеркалятор ДНК, алкилирующий агент, гормональная терапия, ингибитор киназы, антагонист рецептора, активатор апоптоза опухолевых клеток или антионкогенный агент.
Такие дополнительные агенты, которые могут быть в комбинации, присутствуют в количествах, которые эффективны для намеченной цели. Эффективное количество таких дополнительных агентов зависит от количества активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, типа расстройства или характера лечения, а также от других факторов, описанных выше. Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению обычно применяют в тех же дозах и с теми же способами введения, что и описанные в настоящем изобретении, или примерно от 1 до 99% от доз, описанных в настоящем изобретении, или в какой-либо дозе и каким-либо способом, которые являются эмпирически/клинически обоснованными.
Такая описанная выше комбинированная терапия включает комбинированное введение (где два или более терапевтических агентов включены в одну и ту же или в отдельные композиции) и раздельное введение, причем в последнем случае введение активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению может производиться до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению также можно использовать в комбинации с лучевой терапией
Стадии получения
В другом варианте осуществления настоящего предусматривают продукты, содержащие материалы, полезные для лечения, предупреждения и/или диагностики расстройств, описанных выше. Продукты включают контейнер и этикетку или вкладыш, прикрепленный к контейнеру или вложенный в него. К соответствующим контейнерам относят, например, бутыли, флаконы, шприцы, пакеты для внутривенного раствора и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, например, из стекла или пластика. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией, эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики определенного состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть пакетом с внутривенным раствора или флаконом с пробкой, которую прокалывают иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере, один действующий агент в композиции является активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению. Этикетка или вкладыш указывает, что композицию используют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, причем композиция включает активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсязывающую молекулу по настоящему изобретению и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, причем композиция включает дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Полученный продукт в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать вкладыш, указывающий, что композиции могут использоваться для лечения конкретного состояния. В другом варианте или дополнительно данный продукт может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, например, бактериостатическую воду для инъекций (bacteriostatic water for injection - BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера или раствор декстрозы. Данный продукт может также включать другие материалы, наличие которых желательно по коммерческим основаниям или с точки зрения пользователя, например, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Методы скрининга
Описание настоящего изобретения представляет предпочтительную эффективностью использования одной легкой цепи или ее высоко гомологичных вариантов для способов идентификации соответствующих вариабельных областей тяжелой цепи для создания активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул. Чтобы сконструировать такие связующие, легкая цепь не только должна быть способной спариваться с различными тяжелыми цепями для получения связывающих частей молекулы различной специфичности, но также сохранять способность образовывать связывающую часть молекулы, которая может активировать Т-клетки, с которыми она связывается. Описанная в настоящем изобретении легкая цепь может быть применена в качестве общей легкой цепи (common light chain - CLC) для идентификации соответствующих вариабельных областей тяжелой цепи, например, путем скрининга библиотеки вариабельных областей тяжелой цепи. Это позволяет поддерживать ранее идентифицированное и подтвержденное связующее CD3 таким образом, что необходимо идентифицировать только новое связующее целевого антигена для части активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают способ идентификации вариабельной тяжелой цепи для применения в активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекуле и антигена целевых клеток, включающий стадию скрининга комбинаторной библиотеки, включающей вариабельные тяжелые цепи с легкой цепью, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. Этот способ может быть применен для развития стабильных, функциональных с высокой степенью сродства связующих для улучшения продуктивности активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул например, специфичных по CD3 и по целевому антигену, причем целевые антигены не являются родственными, например, FolR1, MUC1 и ВСМА.
Примеры
Ниже приведены примеры способов и композиций по настоящему изобретению. Следует учитывать, что могут быть осуществлены различные другие варианты осуществления настоящего изобретения, исходя из приведенного выше описания.
Основные методы
Методы рекомбинации ДНК
Стандартные методы применяют для манипуляции с ДНК по описанию в книге Sambrook с соавт., «Molecular cloning: A laboratory manual», изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1989. Реагенты для молекулярной биологии применяют по инструкциям производителей. Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, приведена в книге Kabat, Е.А. с соавт., «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5e изд., NIH Publication No. 91-3242.
Сиквенс ДНК
Последовательности ДНК определяют стандартным двухцепочечным секвенированием по методу Synergene (шлирен-метод).
Синтез генов
Необходимые сегменты гена, если это требуется, либо получают с помощью ПЦР с использованием соответствующих матриц, либо используют сегменты, синтезированные фирмой Geneart AG (Regensburg, Германия) из синтетических олигонуклеотидов и продуктов ПЦР путем автоматического синтеза генов. В тех случаях, когда отсутствует достоверная информация о генной последовательности, олигонуклеотидные праймеры конструируют на основе последовательностей ближайших гомологов, а гены выделяют с помощью РВ-ПЦР из РНК, происходящей из соответствующей ткани. Сегменты генов, фланкированные сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции, клонируют в стандартных векторах клонирования/ секвенирования. Плазмидную ДНК очищают от трансформированных бактерий и определяют концентрацию с помощью УФ-спектроскопии. Последовательность ДНК фрагментов субклонированных генов подтверждают секвенированием ДНК. Сегменты генов конструируют с соответствующими сайтами рестрикции, чтобы обеспечить субклонирование в соответствующих векторах экспрессии. Все конструкции разрабатывают с 5'-концевой последовательности ДНК, кодирующей лидерный пептид, который нацеливает белки для секреции в эукариотических клетках.
Выделение первичных пан-Т-клеток человека из МКПК
Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получают центрифугированием в градиенте плотности Histopaque препаратов, обогащенных лимфоцитами (светлых слоев кровяного сгустка), полученных из местных банков крови или из свежевзятой крови здоровых людей-доноров. Вкратце, кровь разводят стерильным ФСБ и тщательно наслаивают поверх градиента Histopaque (фирма Sigma, номер в каталоге Н8889). После центрифугирования в течение 30 мин в режиме 450 g при комнатной температуре (без торможения), выбрасывают часть плазмы выше осадки МКПК. Клетки МКПК переносят в новые пробирки Falcon объемом 50 мл, которые наполняют ФСБ до общего объема 50 мл. Смесь центрифугируют при комнатной температуре в течение 10 мин в режиме 400 g (с торможением). Супернатант выбрасывают и осадок МКПК дважды промывают стерильным ФСБ (стадии центрифугирования при 4°С в течение 10 мин в режиме 350 g). Полученную популяцию МКПК подсчитывают автоматически (анализатор ViCell) и хранят в среде RPMI1640, содержащей 10% ФСБ и 1% L-аланин-L-глутамин (фирма Biochrom, K0302), при 37°С, 5% СО2 в инкубаторе до начала исследования. Концентрирование клеток из МКПК проводят, используя набор Pan Т Cell Isolation Kit II (фирма Miltenyi Biotec, номер в каталоге 130-091-156) по инструкциям производителя. Вкратце, осадок клеток разводят из расчета 40 мкл холодного буфера на 10 миллионов клеток (ФСБ с 0,5% БСА, 2 мМ EDTA, стерилизация фильтрацией) и инкубируют с Biotin-Antibody Cocktail из расчета 10 мкл на 10 миллионов клеток в течение 10 мин при 4°С. Добавляют 30 мкл холодного буфера и магнитных гранул Anti-Biotin из расчета 20 мкл на 10 миллионов клеток, смесь инкубируют в течение дополнительных 15 мин при 4°С. Клетки промывают добавлением 10-20-кратного объема и последующего центрифугирования в режиме 300 g в течение 10 мин. До 100 миллионов клеток ресуспендируют в 500 мкл буфера. Магнитное разделение пан-Т-клеток без метки осуществляют, используя колонки LS (фирма Miltenyi Biotec, номер в каталоге 130-042-401) по инструкциям производителя. Полученную популяцию Т-клеток подсчитывают автоматически (анализатор ViCell) и хранят в среде AIM-V при 37°С, 5% CO2 в инкубаторе до начала исследования (не более 24 ч).
Выделение первичных наивных Т-клеток человека из МКПК
Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получают центрифугированием в градиенте плотности Histopaque препаратов, обогащенных лимфоцитами (светлых слоев кровяного сгустка), полученных из местных банков крови или из свежевзятой крови здоровых людей-доноров. Концентрирование Т-клеток из МКПК проводят, используя набор для выделения Naive CD8+ 25 Т cell isolation Kit (фирма Miltenyi Biotec, номер в каталоге 130-093-244), по инструкциям производителя, но без последней стадии выделения CD8+ Т-клеток (также см. описание выделения первичных пан-Т-клеток человека).
Выделение пан-Т-клеток из селезенок мышей
Селезенки удаляют из мышей линии C57BL/6, переносят в пробирку GentleMACS C-tube (фирма Miltenyi Biotec, номер в каталоге 130-093-237), содержащий буфер MACS (ФСБ + 0,5% БСА + 2 мМ EDTA), и диссоциируют в диссоциаторе GentleMACS Dissociator для получения суспензии отдельных клеток по инструкциям производителя. Суспензию клеток пропускают через фильтр предварительного разделения для удаления оставшихся недиссоциированных частиц ткани. После центрифугирования в режиме 400 g в течение 4 мин при 4°С добавляют лизирующий буфер АСК Lysis Buffer для лизиса эритроцитов (инкубирование в течение 5 мин при комнатной температуре). Оставшиеся клетки промывают дважды буфером MACS, подсчитывают и применяют для выделения пан-Т-клеток из мышей. Проводят отрицательный (магнитный) отбор, используя набор для выделения клеток Pan Т Cell Isolation Kit (фирма Miltenyi Biotec, номер в каталоге 130-090-861), по инструкциям производителя. Полученную популяцию Т-клеток подсчитывают автоматически (анализатор ViCell) и сразу применяют для последующих исследований.
Выделение первичных МКПК макака крабоеда из гепаринизированной крови
Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получают центрифугированием в градиенте плотности свежеполученной крови от здоровых доноров макак крабоедов следующим образом: гепаринизованную кровь разводят 1:3 стерильным ФСБФ и среду Lymphoprep (фирма Axon Lab, номер в каталоге 1114545) разводят до 90% стерильным ФСБ. Два объема разведенной крови наслаивают поверх одного объема разведенного градиента плотности и фракцию МКПК выделяют центрифугированием в течение 30 мин в режиме 520 g без торможения при комнатной температуре. Зону МКПК переносят в новую пробирку Falcon объемом 50 мл и промывают стерильным ФСБ путем центрифугирования в течение 10 мин в режиме 400 g при 4°С. Однократно центрифугируют на низкой скорости для удаления тромбоцитов (15 мин в режиме 150 g при 4°С) и полученную популяцию МКПК автоматически просчитывают (анализатор ViCell) и сразу используют в исследованиях.
Пример создания антигена
Антиген экспрессируют в двух разных вариантах. Для конструкции, не содержащей Fc, внеклеточный домен гибридизируют с меткой avi-His по С-концу. Для антигена, содержащего Fc, гибридизируют Fc, используя метод выступ-во-впадину, с N-конца гетеродимерной части Fc (Merchant с соавт.), чтобы иметь только одну молекулу целевого белка на димер Fc. Это осуществляют для того, чтобы избежать образования каких-либо искусственных димерных структур целевого белка. Метку avi-His присоединяют к С-концу Fc. Эти белки легко могут быть временно экспрессированы в клетках млекопитающих, например, в клетках HEK или СНО, очищены аффинной хроматографией с белком А, биотинилированы и могут быть присоединены к гранулам стрептавидина для фагового отбора через биотинилированную метку avi в соответствии со стандартными методами.
Созревание аффинности (антител по мере формирования иммунного ответа)
Созревание аффинности фрагментов Fab, поступающих из CLC-библиотеки, ограничивают только тяжелой цепью для того, чтобы сохранить легкую цепь незаряженной чтобы сохранить аффинность связывания CD3e. Поскольку исходная библиотека в настоящем изобретении рандомизирована по CDR3 только тяжелой цепи, работу сосредоточивают на этапе созревания CDR 1 и 2. Для этого конструируют ПЦР праймеры для каждого каркаса, которые интродуцируют отдельно случайным образом в CDR1 и CDR2. Каждый праймер предназначен для связывания с одной из шести каркасов тяжелой цепи и может быть использован обычным образом для каждого клона антитела, поступающего из этой конкретной библиотеки фагов. Процесс созревания осуществляют по описанию Knappik или Steidl (Knappik с соавт., J. Mol. Biol. 296, 2000, 57-86, Steidl с соавт., Molecular Immunology 46, 2008, 135-144).
Фаговый пэннинг осуществляют согласно вышеописанному, но с отличием, заключающимся в том, что концентрации растворимого антигена применяют в количестве 2×10-8 М и снижают до итоговой концентрации 2×10-10 М.
Клонирование, получение, очистка и биохимические свойства CLC ТСВ
Получаемую вариабельную область последовательностей ДНК тяжелой и легкой цепей субклонируют в рамке либо с константной тяжелой цепью, либо с константной легкой цепью, предварительно инсертированной в соответствующий вектор экспрессии млекопитающего-реципиента. Экспрессия антитела управляется промотором MPSV и несет синтетическую сигнальную последовательность polyA на 3'-конце CDS. Кроме того, каждый вектор содержит последовательность EBV OriP для временной экспрессии в клетках HEK293-EBNA. В качестве изотипов антител используют IgG1 P329G LALA или IgG4 SPLE PG.
CLC ТСВ получают путем совместной трансфекции клеток HEK293-EBNA с векторами экспрессии млекопитающих с использованием полиэтиленимина. Клетки трансфицируют соответствующими векторами экспрессии в соотношении 1:1:3 («вектор тяжелой цепи Fc (впадина)» : «вектор тяжелой цепи Fc (выступ) - FabCrossfab»): «вектор общей легкой цепи».
Для трансфекции HEK293 EBNA клетки культивируют в культуральной среде CD СНО без суспензии сыворотки. Для получения в качалочные колбы объемом 500 мл высевают 400 миллионов клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугируют в течение 5 мин в режиме 210 g, супернатант замещают предварительно подогретой средой CD СНО в количестве 20 мл. Векторы экспрессии смешивают в 20 мл среды CD СНО до конечного количества ДНК 200 мкг. После добавления 540 мкл раствора PEI перемешивают в вортексе в течение 15 сек и затем инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки перемешивают с раствором ДНК/PEI, переносят в качалочную колбу объемом 500 мл и инкубируют в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После завершения инкубирования добавляют 160 мл среды F17 и клетки культивируют в течение 24 ч. Через сутки после трансфекции добавляют 1 мМ вальпроевой кислоты и 7% Feed 1. Через 7 суток культивирования супернатант собирают для очистки центрифугированием в течение 15 мин в режиме 210 g, раствор стерилизуют фильтрацией (фильтр с порами 0,22 мкм) и азидом натрия до конечной концентрации 0,01% мас./об. и хранят при 4°С.
Секретированный белок очищают от супернатантов культур клеток аффинной хроматографией, используя белок А. Супернатант загружают в колонку HiTrap ProteinA HP (CV = 5 мл, фирма GE Healthcare), уравненную 40 мл 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 7,5. Несвязанный белок удаляют промыванием, по меньшей мере, в 10 объемах колонки 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 7,5. Целевой белок элюируют 20 объемами колонки в градиенте, начиная с 20 мМ цитрата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 7,5 до 20 мМ цитрата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 2,5. Раствор белка нейтрализуют добавлением 1/10 0,5 М фосфата натрия, рН 8. Целевой белок концентрируют и фильтруют перед загрузкой в колонку HiLoad Superdex 200 (фирма GE Healthcare), уравненную 10 мМ гистидином, 140 мМ раствора хлорида натрия, рН 6,0.
Концентрацию белка в очищенных белковых образцах определяют путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент мольной экстинции, рассчитанный исходя из аминокислотной последовательности.
Чистоту и молекулярную массу молекул исследуют методом CE-SDS при наличии или отсутствии восстанавливающего агента. Систему Caliper LabChip GXII (фирма Caliper lifescience) применяют по инструкциям производителя. Для анализа используют 2 мкг образца. Содержание агрегатов образцов антител анализируют, используя аналитическую колонку для эксклюзионной хроматографии TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh) в 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ L-аргинин моногидрохлорид, 0,02% (масс./об.) NaN3, рН 6,7 подвижный буфер при 25°С.
Описание CLC ТСВ в исследованиях, основанных на клетках
Связывание CLC ТСВ с клетками, экспрессирующими опухолевый антиген ECD, и клетками, экспрессирующими CD3.
Связывание CLC ТСВ исследуют, используя опухолевые клетки, экспрессирующие исследуемый антиген X, и бессмертную линию Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD3e (клетки Jurkat). Вкратце, клетки собирают, подсчитывают, проверяют жизнеспособность и ресуспендируют для получения суспензии с титром 2×106 клеток/мл в буфере FACS (100 мкл ФСБ 0,1% БСА). 100 мкл суспензии клеток (содержащей 0,2×106 клеток) инкубируют в 96-луночном круглодонном планшете в течение 30 мин при 4°С с повышением концентраций CLC ТСВ (3 пМ - 200 нМ), дважды промывают холодным ФСБ 0,1% БСА, повторно инкубируют в течение дополнительных 30 мин при 4°С с фрагментом специфического вторичного козьего антитела РЕ-конъюгированного аффинночистого фрагмента F(ab')2 против Fcg IgG человека (продукт РЕ-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment goat anti-human IgG Fcg Fragment Specific secondary antibody, фирма Jackson Immuno Research Lab РЕ, номер в каталоге 109-116-170), дважды промывают холодным ФСБ 0,1% БСА и сразу анализируют методом FACS, используя FACS CantoII (Software FACS Diva) пропуская живые DAPI-отрицательные клетки. Кривые связывания получают, используя программу GraphPadPrism5.
Пример 1. Очистка гибридов биотинилированного рецептора фолата-Fc
Для получения новых антител против FolR1 человека получают следующие антигены и инструменты скрининга, а именно одновалентных гибридных белков Fc (внеклеточный домен антигена, связанный с шарнирной областью Fc-выступа, который совместно экспрессируется с молекулой Fc-дырки). Гены антигенов синтезируют (фирма Geneart, Regensburg, Германия) на основе последовательностей, полученных из GenBank или SwissProt, и инсертируют в векторы экспрессии для получения гибридных белков с выступом Fc с С-концевой Avi-меткой для биотинилирования in vivo или in vitro. Биотинилирования in vivo достигают путем совместной экспрессии бактериального гена birA, кодирующего бактериальную биотинлигазу, во время получения. Экспрессию всех генов проводят под контролем химерного промотора MPSV на плазмиде, содержащей элемент oriP для стабильного поддержания плазмид в линиях клеток, содержащих EBNA.
Для получения биотинилированных гибридных молекул мономерный антиген/Fc, экспоненциально растущую суспензию клеток HEK293 EBNA трансфецируют совместно тремя векторами, кодирующими два компонента гибридного белка (цепи выступа и впадины), а также BirA - фермент, требуемый для реакции биотинилирования. Соответствующие векторы применяют при соотношении 9,5:9,5:1 («антиген ECD-Fc выступ-метка avi» : «впадина Fc» : «BirA»).
Для получения белка в качалочные колбы объемом 500 мл высевают 400 миллионов клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугируют в течение 5 мин в режиме 210 g и супернатант замещают предварительно подогретой средой CD СНО. Векторы экспрессии ресуспендируют в 20 мл среды CD СНО, содержащей 200 мкг ДНК вектора. После добавления 540 мкл полиэтиленимина (polyethylenimine - PEI), раствор перемешивают в течение 15 сек и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки перемешивают с раствором ДНК/PEI, переносят в качалочную колбу объемом 500 мл и инкубируют в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После завершения инкубирования добавляют 160 мл среды F17 и клетки культивируют в течение 24 ч. Через сутки после трансфекции к культуре добавляют 1 мМ вальпроевой кислоты и 7% Feed 1 (фирма Lonza). Среду для клеток также обогащают 100 мкМ биотина. Через 7 суток культивирования супернатант собирают для очистки центрифугированием в течение 15 мин в режиме 210 g. Раствор стерилизуют фильтрацией (фильтр с порами 0,22 мкм), добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и хранят при 4°С.
Секретированный белок очищают от супернатантов культур клеток аффинной хроматографией, используя белок А, с последующей эксклюзионной хроматографией. Для аффинной хроматографии супернатант загружают в колонку HiTrap ProteinA HP (CV = 5 мл, фирма GE Healthcare), уравненную 40 мл 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 7,5. Несвязанный белок удаляют промыванием, по меньшей мере, в 10 объемах колонки 20 мМ фосфатом натрия, 20 мМ цитратом натрия, рН 7,5. Связанный белок элюируют, используя линейный рН-градиент, создавая более 20 объемов колонки 20 мМ цитрата натрия, 100 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, рН 3,0.
Затем колонку промывают 10 объемами колонки 20 мМ цитрата натрия, 100 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина, рН 3,0. рН собранных фракций корректируют добавлением 1/10 (об./об.) 0,5 М фосфата натрия, рН 8,0. Белок концентрируют и фильтруют перед загрузкой в колонку HiLoad Superdex 200 (фирма GE Healthcare), уравненную 20 мМ гистидином, 140 мМ хлоридом натрия, рН 6,0.
Концентрацию определяют по измерению оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент мольной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу гибрида FolR1-Fc исследуют капиллярным электрофорезом SDS при наличии или отсутствии восстанавливающего агента по инструкциям производителя (прибор Caliper LabChipGX, фирма Perkin Elmer). Содержание агрегатов в образцах исследуют, используя TSKgel G3000 SW XL аналитическую эксклюзионную колонку (фирма Tosoh), уравненную 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ L-аргинин моногидрохлорид, 0,02% (масс./об.) NaN3, рН 6,7 подвижный буфер при 25°С.
Гибридные белки типа очищенный антиген-Fc исследуют методом поверхностного плазмонного резонанса, используя коммерчески доступные антитела для подтверждения точности и естественности конформации антигенов (данные не представлены).
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Пример 2. Получение общей легкой цепи со специфичностью CD3ε
Активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну часть молекулы, связывающую CD3. Эта часть молекулы может быть получена путем иммунизации лабораторных животных, скрининга фаговой библиотеки или при использовании известных анти-CD3-антител. Общую легкую цепь с CD3ε-специфичностью получают путем гуманизации легкой цепи исходного анти-CD3ε-антитела мыши (СН2527). Для гуманизации антитела, полученного не от человека, остатки CDR из антитела (донора), полученного не от человека, следует перенести на каркас антитела человека (акцептора). Как правило, последовательности акцепторных каркасов выбирают путем выравнивания последовательности донора с коллекцией потенциальных акцепторных последовательностей и выбора той из них, которая имеет либо выраженную гомологию с донором, либо показывает аналогичные аминокислоты в некоторых положениях, имеющих критическое значение для структуры и активности. В данном случае поиск акцепторного каркаса антитела осуществляют путем выравнивания последовательности VL-домена мыши исходного антитела с коллекцией последовательностей зародышевой линии человека и выбора последовательности человека, которая проявляет высокую идентичность последовательности. Неожиданно хорошее совпадение по гомологии каркасных последовательностей было обнаружено в довольно редкой человеческой легкой цепи, принадлежащей семейству V-домену семейства 7 типа лямбда, точнее, hVL_7_46 (номенклатура IMGT, GenBank Acc No. Z73674). Эту редкую легкую цепь человека впоследствии выбирают в качестве акцепторного каркаса для гуманизации легкой цепи СН2527. Три области, определяющие комплементарность (CDR), вариабельного домена легкой цепи мыши переносят на такой акцепторный каркас молекулы. Поскольку область каркаса 4 не является частью вариабельной области V-гена зародышевой линии, выравнивание для этой области (J-элемент) выполняют отдельно. Следовательно, последовательность IGLJ3-02 выбирают для гуманизации этой легкой цепи. Получают 13 гуманизированных вариантов (с CH2527-VL7_46-1 по VL7_46-10, с VL7_46-12 по VL7_46-14). Они различаются по остаткам каркаса (и их комбинациям), которые были обратно мутированы к первоначальной последовательности V-домена мыши, или по остаткам CDR (определение по Kabat), которые могут быть идентичны последовательности зародышевой линии человека. Следующие остатки каркаса вне CDR были обратно мутированы к остаткам мыши в конечном гуманизированном варианте VL-домена VL7_46-13 (перечислены остатки мыши): V36, Е38, F44, G46, G49 и G57, соответственно. J-элемент человека IGLJ3-02 на 100% идентичен J-элементу исходного антитела мыши.
Пример 3. SPR оценка гуманизированных вариантов со специфичностью CD3ε.
Гуманизированные варианты VL оценивают в качестве химеры в классическом формате 2+1 (фиг. 1Г), т.е. гуманизированные V-домены легкой цепи спаривают с V-доменами тяжелой цепи мыши. SPR оценку осуществляют на приборе ProteOn XPR36 (фирма Bio-Rad). Точнее, варианты захватывают непосредственно из супернатанта культуры на анти-Fab-дериватизированный GLM сенсорный чип (козье антитело против IgG человека, специфический фрагмент F(ab')2, фирма Jackson ImmunoResearch) в вертикальной ориентации. Следующие исследуемые вещества последовательно впрыскивают горизонтально в единичных концентрациях для оценки связывания с CD3ε человека и макака крабоеда: 3 мкМ hu CD3ε(-1-26)-Fc(выступ)-avi (ID807) и 2,5 vrM cy CD3ε-(-1-26)-Fc(выступ)-Avi-Fc(впадина) (ID873), соответственно. Ответы по связыванию качественно сравнивают со связыванием контрольной конструкции мыши и оценивают следующим образом: + (наблюдают сопоставимое связывание), +/- (наблюдают уменьшенное связывание) и - (не наблюдают связывания). Захваченное антитело регенерируют после каждого цикла захвата лигандом и связывания исследуемого вещества, а конструкцию мыши повторно впрыскивают в конце исследования для подтверждения активности захватывающей поверхности. Результаты суммированы в табл. 3.
Таблица 3. Качественная оценка связывания, произведенная методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR), гуманизированных вариантов легкой цепи в комбинации с тяжелой цепью СН2527 мыши. Только вариант гуманизированной легкой цепи CH2527-VL7_46-13, который в итоге был выбран, выделенный жирным шрифтом, показывает сопоставимое связывание с CD3ε человека и макака крабоеда.
Figure 00000008
Пример 4. Свойства гуманизированной легкой цепи со специфичностью СВ3ε
Вариантом V-домена легкой цепи, выбранным для гуманизированной лидерной молекулы, является VL7_46-13. Определяют степень гуманизированности, т.е. гомологии последовательности гуманизированного V-домена относительно последовательности V-домена зародышевой линии человека. Для последовательности VL7_46-13 общая идентичность последовательности с наиболее близким гомологом зародышевой линии человека составляет 65% до гуманизации и 80% после. Не включая области CDR, идентичность последовательности составляет 92% к ближайшему гомологу зародышевой линии человека. Из табл. 3 следует, что VL7_46-13 является единственным гуманизированным вариантом VL из панели, включающей 13 вариантов, которые показали сопоставимое связывание с исходным антителом мыши, а также сохраняет перекрестную реакционную способность в отношении CD3ε макака крабоеда. Этот результат показывает, что гуманизирование VL-домена мыши без потери связывания с CD3ε является необычным и требует нескольких обратных мутаций к остаткам каркаса молекулы мыши (в частности, G46), хотя сохраняется G24 в CDR1. Кроме того, этот результат показывает, что VL-домен играет решающую роль в распознавании мишени. Важно отметить, что гуманизированный VL-домен VL7_46-13 на основе редкой зародышевой линии человека, принадлежащий V-домену семейства 7 типа лямбда и сохраняющий аффинность и специфичность в отношении CD3ε, также применим для использования в качестве общей легкой цепи в библиотеках фагового дисплея антитела Fab-формата и позволяет успешно выбирать новые свойства, которые существенно облегчают возникновение и получение биспецифических молекул, связывающихся с CD3ε и, например, опухолевую мишень, и разделяющих одну и ту же «общую» легкую цепь.
Пример 5. Получение библиотеки фагового дисплея антитела с применением общей легкой цепи зародышевой линии человека, производной от HVK1-39
В нескольких подходах к выработке биспецифических антител, которые напоминают IgG человека полной длины, используют модификации в области Fc, которые индуцируют гетеродимеризацию двух различных тяжелых цепей. К таким примерам относятся выступ-во-впадину (Merchant с соавт., Nat Biotechnol, 16 (7), 1998, 677-81), SEED (Davis с соавт., Protein Eng Des Sel., 23 (4), 2010, 195-202) и электростатические направляющие технологии (Gunasekaran с соавт., J Biol Chem., 285 (25), 2010, 19637-19646). Хотя эти подходы обеспечивают эффективную гетеродимеризацию двух разных тяжелых цепей, сохраняется проблема сопряжения родственных легких и тяжелых цепей. Использование общей легкой цепи (LC) может решить эту проблему (Merchant, с соавт. Nat Biotech 16, 1998, 677-681).
В настоящем изобретении описывают получение библиотеки антитела для дисплея на фаге М13. Важно подчеркнуть, что в настоящем изобретении разработана библиотека большого количества каркасов молекул тяжелой цепи с одной константной (или «общей») легкой цепью. Эта библиотека разработана для получения мультиспецифичных антител без необходимости использования сложных технологий для исключения неправильного спаривания легкой цепи. Используя общую легкую цепь можно облегчить получение таких молекул, поскольку больше не происходит какое-либо неправильное спаривание и облегчается выделение высокочистого биспецифического антитела. По сравнению с другими форматами применение фрагментов Fab в качестве строительных блоков, например, в отличие от применения фрагментов scFv, приводит к повышенной термостабильности и утрате агрегации scFv и межмолекулярного формирования scFv.
Создание библиотеки
Ниже описывают получение библиотеки антител для дисплея на фаге М13. По существу, в настоящем изобретении разработана библиотека большого количества каркасов молекул тяжелой цепи с одной константной (или «общей») легкой цепью.
В настоящем изобретении применяют тяжелые цепи из библиотеки (их номера в GenBank указаны в скобках):
IGHV1-46*01 (Х92343) (SEQ ID NO: 104),
IGHV1-69*06 (L22583), (SEQ ID NO: 105)
IGHV3-15*01 (X92216), (SEQ ID NO: 106)
IGHV3-23*01 (M99660), (SEQ ID NO: 107)
IGHV4-59*01 (AB019438), (SEQ ID NO: 108)
IGHV5-51*01 (M99686), (SEQ ID NO: 109).
Во всех тяжелых цепях применяют IGHJ2 в качестве J-элемента, за исключением IGHV1-69*06, где применяют последовательность IGHJ6. Конструкция рандомизации включает CDR-H1, CDR-5 Н2 и CDR-H3. Для CDR-H1 и CDR-H2 выбирают «мягкую» стратегию рандомизации, а олигонуклеотиды рандомизации таковы, что кодон для аминокислоты последовательности зародышевой линии присутствует на уровне 50%. Все остальные аминокислоты, за исключением цистеина, суммируют в объеме оставшихся 50%. В CDR-H3, где отсутствует аминокислота зародышевой линии из-за присутствия генетического элемента D10, были разработаны олигонуклеотиды, которые позволяют использовать рандомизированные инсерты между V-элементом и J-элементом длиной от 4 до 9 аминокислот. Эти олигонуклеотиды содержатся в их рандомизированной части, например, три аминокислоты G/Y/S составляют по 15% каждая, аминокислоты A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E составляют до 4,6% каждая.
Примеры методов получения библиотек антител описаны в работах Hoogenboom с соавт., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413, Lee с соавт., J. Mol. Biol. 340, 2004, 1073-1093.
Легкая цепь является производной последовательности человека hVK1-39 и ее применяют немодифицированной форме и нерандомизированным образом. Это гарантирует, что одна и та же легкая цепь может быть применена для других проектов без дополнительных модификаций.
Пример выбора библиотеки:
Выбор со всеми библиотеками созревания аффинности выполняют в растворе в соответствии с приведенной ниже процедурой с использованием мономерного и биотинилированного внеклеточного домена целевого антигена X.
1. 1012 частиц фагмид из каждой библиотеки связывают со 100 нМ биотинилированного растворимого антигена в течение 0,5 ч в общем объеме 1 мл.
2. Биотинилированный антиген, захваченный и специфически связанный с фаговыми частицами, выделяют добавлением ~5×107 магнитных частиц с покрытием из стрептавидина в течение 10 мин.
3. Гранулы промывают 5-10 раз 1 мл ФСБ/Tween20 и 5-10 раз 1 мл ФСБ.
4. Элюцию фаговых частиц выполняют добавлением 1 мл 100 мМ TEA (триэтиламина) в течение 10 мин и нейтрализацией путем добавления 500 мкл 1M Tris/HCl рН 7,4.
5. Повторное инфицирование бактерии Е. coli TG1 в экспоненциальной стадии роста, заражение хэлперным фагом VCSM13 и последующее осаждение фагмидных частиц PEG/NaCl применяют в последующих отборочных циклах. Выделение проводят в течение 3-5 циклов, используя либо постоянную, либо уменьшающуюся (от 10-7 М до 2×10-9 М) концентрацию антигена. Во втором цикле захват комплексов антиген/фаг осуществляют с использованием пластинок нейтравидина вместо гранул стрептавидина. Все реакции связывания дополняют либо 100 нМ бычьего сывороточного альбумина, либо нежирного молочного порошка, чтобы убирать нежелательные клоны, возникающие в результате простого связывания антител с пластиковой подложкой.
Отбор проводят в течение трех или четырех циклов, используя уменьшающиеся концентрации антигена, начиная со 100 нМ и понижаясь до 5 нМ в заключительном цикле отбора. Специфические связующие задают в виде примерно 5-кратной большей концентрации, чем фоновое значение и идентифицируют с помощью метода ELISA. Специфические связующие выявляют следующим образом: 100 мкл. 10 нМ биотинилированного антигена на лунку в планшет с нанесенным нейтравидином. Добавляют Fab-содержащие бактериальные супернатанты и определяют связывание Fab по их меткам Flag с использованием анти-Flag/HRP вторичного антитела. ELISA-положительные клоны экспрессируются бактериями в виде растворимых Fab-фрагментов в 96-луночном формате и супернатанты подвергают эксперименту кинетического скрининга с помощью SPR-анализа с использованием ProteOn XPR36 (фирма BioRad). Клоны, экспрессирующие Fab с наивысшими константами аффинности, идентифицируют и соответствующие фагмиды секвенируют. Для дальнейшей характеристики последовательности Fab амплифицируют посредством ПЦР из фагмид и клонируют через соответствующие сайты рестрикции в векторы экспрессии IgG1 человека для получения в млекопитающих.
Создание библиотеки фагового дисплея антител с использованием гуманизированной CD3ε специфической общей легкой цепи
Описывают создание библиотеки антител для дисплея на фаге М13. Важно подчеркнуть, что в настоящем изобретении разработана библиотека большого количества каркасов молекул тяжелой цепи с одной константной (или «общей») легкой цепью. Эта библиотека разработана для получения Fc-содержащих, но FcgR-связывающих неактивных Т-клеточных биспецифических антител IgG1 P329G LALA или IgG4 SPLE PG изотипа, в которых один или два Fab распознают поверхностный антиген опухоли, экспрессируемый в опухолевой клетке, тогда как оставшееся плечо Fab антитела распознает CD3e на Т-клетке.
Создание библиотеки
Ниже приводится создание библиотеки антител для дисплея на фаге М13. По сути, была разработана многокаркасная библиотека для тяжелой цепи с одной константной (или «общей») легкой цепью. Эта библиотека разработана исключительно для получения Fc-содержащих, но FcgR-связывающих неактивных Т-клеточных биспецифических антител изотипов IgG1 P329G LALA или IgG4 SPLE PG.
Разнообразие интродуцировалось путем рандомизации олигонуклеотидов только в CDR3 различных тяжелых цепей. Методы получения библиотек антител известны в данной области (Hoogenboom с соавт., Nucleic Acids Res., 19, 1991, 4133-413; Lee с соавт., A1 J. Mol. Biol. 340, 2004, 1073-1093).
В библиотеке используют следующие тяжелые цепи:
IGHV1-46*01 (Х92343), (SEQ ID NO: 104)
IGHV1-69*06 (L22583), (SEQ ID NO: 105)
IGHV3-15*01 (X92216), (SEQ ID NO: 106)
IGHV3-23*01 (M99660), (SEQ ID NO: 107)
IGHV4-59*01 (AB019438), (SEQ ID NO: 108)
IGHV5-51*01 (M99686), (SEQ ID NO: 109)
Используют легкую цепь, производную от гуманизированного CD3ε-специфического антитела СН2527 человека и макака крабоеда, в библиотеке: (VL7_46-13; SEQ ID NO: 112). Эту цепь не рандомизируют и применяют без каких-либо дополнительных модификаций для обеспечения совместимости с различными биспецифическими связующими.
Все тяжелые цепи применяют IGHJ2 в качестве J-элемента, исключая IGHV1-69*06, где применена последовательность IGHJ6. Конструкция рамдомизации сосредоточена только на CDR-H3, и олигонуклеотиды ПЦР конструируют таким образом, чтобы допустить применение рандомизированных инсертов между V-элементом и J-элементом длиной от 4 до 9 аминокислот.
Пример 6. Отбор фрагментов антител из библиотек общей легкой цепи (в том числе легкой цепи со специфичностью CD3ε) к FolR1
Антитела 16А3, 15А1, 18D3, 19Е5, 19А4, 15Н7, 15В6, 16D5, 15Е12, 21D1, 16F12, 21А5, 21G8, 19Н3, 20G6 и 20Н7, включающие общую легкую цепь VL7_46-13 со специфичностью CD3ε получают методом фагового дисплея против разных видов FolR1 (человека, макака крабоеда и мыши). Клоны 16А3, 15А1, 18D3, 19Е5, 19А4, 15Н7, 15В6, 21D1, 16F12, 19Н3, 20G6 и 20Н7 отбирают из суб-библиотеки, в которой общую легкую цепь спаривают с набором тяжелой цепи, основанным на зародышевой линии человека VH1_46. В такой суб-библиотеке CDR3 из VH1_46 рандомизируют, основываясь на 6 разных отрезках CDR3. Клоны 16D5, 15Е12, 21А5 и 21G8 выбирают из суб-библиотеки, в которой общая легкая цепь спарена с набором тяжелой цепи на основе зародышевой линии VH3_15 человека. В такой суб-библиотеке CDR3 в VH3_15 рандомизируют на основе 6 разных отрезков CDR3. Для получения специфических антител с перекрестной реакционноспособностью (или реакционноспособных в отношении FolR1 мыши), FolR1 разных видов изменяют (или оставляют неизменными) разными способами на протяжении 3 циклов биопэннинга: 16А3 и 15А1 (FolR1 человека-макака крабоеда-человека); 18D3 (FolR1 макака крабоеда-человека-мыши); 19Е5 и 19А4 (3 цикла против FolR1 мыши); 15Н7, 15В6, 16D5, 15Е12, 21D1, 16F12, 21А5, 21G8 (FolR1 человека-макака крабоеда-человека); 19Н3, 20G6 и 20Н7 (3 цикла против FolR1 мыши).
FolR1 человека, мыши и макака крабоеда в качестве антигенов для отбора методом фагового дисплея, а также скрининги на основе ELISA и SPR, временно экспрессируют в качестве N-концевого мономерного Fc-гибрида в клетках HEK EBNA_и in vivo сайт-специфически биотинилируют посредством совместной экспрессии BirA биотинлигазы в последовательности распознавания avi-метки, локализованной с С-конца части Fc, несущей рецепторную цепь (цепь Fc с выступом). Для оценки специфичности в отношении FolR1 таким же образом получают два родственных рецептора человека FolR2 и FolR3.
Циклы отбора (биопэннинга) осуществляют в растворе по следующей схеме:
1. Предварительная очистка ~ 1012 фагмидных частиц на планшетах maxisorp, покрытых 10 мкг/мл несвязанного IgG человека, для истощения библиотек антител, распознающих Fc-часть антигена.
2. Инкубирование несвязывающих Fc фагмидных частиц со 100 нМ биотинилированного FolR1 человека, макака крабоеда или мыши течение 0,5 ч в присутствии 100 нМ несвязанной небиотинилированной конструкции Fc выступ-во-впадину для дальнейшего истощения Fc-связующих в общем объеме 1 мл.
3. Захват биотинилированного FolR1 и прикрепление специфически связывающегося фага путем переноса в 4 лунки планшета для микротитрований с предварительным покрытием нейтравидином в течение 10 мин (в циклах 1 и 3).
4. Промывание соответствующих лунок 5 × ФСБ/Tween20 и 5×ФСБ.
5. Элюирование фаговых частиц путем добавления 250 мкл 100 мМ TEA (триэтиламина) на лунку в течение 10 мин и нейтрализация путем добавления 500 мкл 1 М Tris/HCl рН 7,4 к объединенным элюатам из 4 лунок.
6. Последующее осветление нейтрализованных элюатов путем инкубирования на планшете для микротитрований с предварительно нанесенным покрытием из нейтравидина со 100 нМ захваченным биотином FolR2 или FolR3 для окончательного удаления Fc- и неспецифических связующих.
7. Повторное инфицирование клеток Е. coli TG1 в логарифмической фазе роста супернатантом элюированных частиц фага, заражение хелперным фагом VCSM13, инкубирование на качалке при 30°С в течение ночи и последующее осаждение PEG/NaCl фагмидных частиц, которые применяют для последующего цикла отбора.
Отбор осуществляют на протяжении трех циклов, используя постоянные концентрации антигена 100 нМ. На втором цикле, чтобы избежать обогащения связующих нейтравидином, захват комплексов антиген : фаг осуществляют путем добавления 5,4×107 магнитных гранул, покрытых стрептавидином. Специфические связующие выявляют методом ELISA следующим образом: 100 мкл 25 нМ биотинилированного FolR1 человека, макака крабоеда или мыши и 10 мкг/мл IgG человека наносят на планшеты с нейтравидином и планшеты maxisorp, соответственно. Fab-содержащие бактериальные супернатанты добавляют и определяют связывание Fab через их Flag-метки, используя анти-Flag/HRP вторичное антитело. Клоны, вырабатывающие сигналы на FolR1 человека и не вырабатывающие на IgG человека, отбирают для дальнейшего исследования, а также тестируют сходным образом в отношении оставшихся двух видов FolR1. Их получают путем бактериальной экспрессии в 0,5 л культуральной жидкости, очищают аффинной хроматографией и дополнительно описывают методом SPR, используя биосенсор ProteOn XPR36 фирмы BioRad.
Аффинность (KD) выбранных клонов измеряют поверхностным плазмонным резонансом (SPR), используя прибор ProteOn XPR36 (фирма Biorad) при 25°С с биотинилированным FolR1 человека, макака крабоеда и мыши, а также FolR2 и FolR3 (отрицательные контроли), иммобилизованным на чипах NLC с нейтравидиновым захватом. Иммобилизация антигена (лиганд): Рекомбинантные антигены разводят ФСБТ (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия рН 7,4, 0,005% Tween 20) до 10 мкг/мл, затем закалывают в количестве 30 мкл/мин в вертикальной ориентации. Закалывание исследуемых веществ: для измерения «разовой кинетики» направление закалывания заменяют на горизонтальное, двукратные серийные разведения очищенного Fab (варьирование диапазонов концентраций) вводят одновременно по отдельным каналам 1-5 со временем ассоциации 200 сек, и временем диссоциации 600 сек. Буфер (ФСБТ) вводят по шестому каналу, чтобы обеспечить контроль «на линии». Константы скорости ассоциации (kon) и константы скорости диссоциации (koff) рассчитывают, используя простую один-к-одному модель связывания Лэнгмюра по программе ProteOn Manager v3.1 путем одновременной установки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу уравнения диссоциации рассчитывают (KD) в виде соотношения koff/kon. Таблица 4 перечисляет константы уравнения диссоциации (KD) отобранных клонов, специфичных для FolR1.
Figure 00000009
Figure 00000010
Пример 7. Отбор фрагментов антител из генерических библиотек, состоящих из многих каркасных участков молекул против FolR1
Антитела 11F8, 36F2, 9D11, 5D9, 6В6 и 14Е4 получают методом фагового дисплея, основанного на генерических суб-библиотеках из многих каркасных участков молекул против разных видов FolR1 (человека, макака крабоеда и мыши). В таких мультикаркасных суб-библиотеках разные домены VL с рандомизированными CDR3 (3 разных отрезка) спарены с разными VH-доменами с рандомизированной CDR3 (6 разных отрезков). Выбранные клоны представляют следующие пары VL/VH: 11F8 (Vk_1_5/VH_1_69), 36F2 (Vk_3_20/VH_1_46), 9D11 (Vk2D_28/VH1_46), 5D9 (Vk3_20/VH1_46), 6B6 (Vk3_20/VH1_46) и 14E4 (Vk3_20/VH3_23). Для получения специфических антител с перекрестной реакционноспособностью (или реакционноспособных в отношении FolR1 мыши), FolR1 разных видов изменяют (или оставляют неизменными) разными способами на протяжении 3 или 4 циклов биопэннинга: 15 11F8 (FolR1 макака крабоеда - мыши - человека); 36F2 (FolR1 человека - мыши - макака крабоеда - мыши); 9D11 (FolR1 макака крабоеда - человека - макака крабоеда); 5D9 (FolR1 человека - макака крабоеда - человека); 6В6 (FolR1 человека - макака крабоеда - человека) и 14Е4 (3 цикла против FolR1 мыши).
FolR1 человека, мыши и макака крабоеда в качестве антигенов для отбора методом фагового дисплея, а также скрининга на основе ELISA и SPR, временно экспрессируют в качестве N-концевого мономерного Fc-гибрида в клетках HEK EBNA_и in vivo сайт-специфически биотинилируют посредством совместной экспрессии BirA биотинлигазы в последовательности распознавания avi-метки, локализованной с С-конца части Fc, несущей рецепторную цепь (цепь Fc с выступом). Для оценки специфичности в отношении FolR1, два родственных рецептора человека, FolR2 и FolR3, получают одним и тем же способом. Циклы отбора (биопэннинг) проводят в растворе по следующей схеме:
1. Предварительная очистка ~ 1012 фагмидных частиц в планшетах maxisorp, покрытых 10 мкг/мл неродственного IgG человека для истощения библиотек антител, распознающих Fc-часть антигена.
2. Инкубирование фагмидных частиц, не связанных с Fc, с 100 нМ биотилинированных FolR1 человека, макака крабоеда или мыши в течение 0,5 ч в присутствии 100 нМ неродственной небиотинилированной конструкции Fc выступ-во-впадину для дальнейшего истощения Fc-связующих в общем объеме 1 мл.
3. Захват биотинилированного FolR1 и присоединенного специфически связанного фага путем переноса в 4 лунки планшета для микротитрований, предварительно покрытым нейтравидином, в течение 10 мин (в циклах 1 и 3).
4. Промывка соответствующих лунок, используя 5×ФСБ/Tween20 и 5×ФСБ.
5. Элюирование фаговых частиц добавлением 250 мкл 100 мМ TEA (триэтиламин) на лунку в течение 10 мин и нейтрализацией добавлением 500 мкл 1 М Tris/HCl рН 7,4 к объединенным элюатам из 4 лунок.
6. Последующее осветление нейтрализованных элюатов путем инкубирования в планшете для микротитрования, с предварительно нанесенным нейтравидином, 100 нМ биотин-захваченного FolR2 или FolR3 для заключительного удаления Fc и неспецифических связующих.
7. Повторное инфицирование клеток штамма Е. coli TG1 в логарифмической фазе роста супернатантом элюированных фаговых частиц, инфицирование хэлперным фагом VCSM13, инкубирование на шейкере при 30°С в течение ночи и затем осаждение PEG/NaCl фагмидных частиц для применения в последующем цикле отбора.
Отбор проводят за три цикла, используя константные концентрации антигенов 100 нМ. В циклах 2 и 4, чтобы избежать обогащения связующих нейравидином, осуществляют захват антигена: фаговые комплексы формируют путем добавления 5,4×107 покрытых стрептавидином магнитных гранул. Специфические связующие идентифицируют методом ELISA следующим образом: 100 мкл 25 нМ биотинилированного FolR1 человека, макака крабоеда или мыши и 10 мкг/мл IgG человека наносят на планшеты с нейтравидином и планшеты maxisorp, соответственно. Fab-содержащие бактериальные супернатанты добавляют и определяют связывание Fab через Flag-маркеры, используя анти-Flag/HRP вторичное антитело. Клоны, проявляющие сигналы в отношении FolR1 человека, и отрицательные в отношении IgG человека, отбирают для дальнейшего анализа, а также тестируют сходным образом против оставшихся двух видов FolR1. Их экспрессируют в бактериях в 0,5 л культуральной жидкости, очищают аффинным методом и дополнительно описывают методом SPR, используя биосенсор BioRad's ProteOn XPR36.
Аффинность (KD) выбранных клонов измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR), используя прибор ProteOn XPR36 (фирма Biorad) при 25°С, с биотинилированным FolR1 человека, макака крабоеда и мыши, а также FolR2 и FolR3 человека (отрицательные контроли), иммобилизованными на чипах NLC путем захвата нейтравидином. Иммобилизация антигена (лиганд): рекомбинантные антигены разводят ФСБТ (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,4, 0,005% 5 Tween 20) до 10 мкг/мл, затем впрыскивают со скоростью 30 мкл/мин в вертикальной ориентации. Закалывание исследуемых веществ: для измерения «разовой кинетики» направление закалывания заменяют на горизонтальное, двукратные серийные разведения очищенного Fab (варьирование диапазонов концентраций) вводят одновременно по отдельным каналам 1-5 со временем ассоциации 200 сек, и временем диссоциации 600 сек. Буфер (ФСБТ) вводят по шестому каналу, чтобы обеспечить контроль «на линии». Константы скорости ассоциации (kon) и константы скорости диссоциации (koff) рассчитывают, используя простую один-к-одному модель связывания Лэнгмюра по программе ProteOn Manager v3.1 путем одновременной установки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу уравнения диссоциации рассчитывают (KD) в виде соотношения koff/kon. В табл. 5 перечислены равновесные константы диссоциации (KD) отобранных клонов, специфичных в отношении FolR1.
Figure 00000011
Figure 00000012
Пример 8. Получение и очистка новых связующих в IgG- и Т-клетки-специфичных форматах
Чтобы идентифицировать связующих FolR1, которые способны индуцировать Т-клетки-зависимое уничтожение выбранных целевых клеток, антитела, выделенные из общей легкой цепи или Fab-библиотеки, конвертируют в соответствующий формат IgG1 человека. Вкратце, вариабельные тяжелые и вариабельные легкие цепи уникальных связующих FolR1 из фагового дисплея амплифицируют стандартными реакциями ПЦР с использованием клонов Fab в качестве матрицы. Продукты ПЦР очищают и инсертируют (либо путем клонирования на основе эндонуклеазы рестрикции и лигазы, либо путем «рекомбинирования» с использованием набора InFusion от фирмы Invitrogen) в подходящие векторы экспрессии, в которых они гибридизированы с соответствующей константной тяжелой цепью человека или константой легкой цепью человека. Кассеты экспрессии в этих векторах состоят из химерного промотора MPSV и синтетического сайта полиаденилирования. Кроме того, плазмиды содержат область oriP вируса Эпштейна Барра (EBV) для стабильного поддержания плазмид в клетках HEK293, несущих ядерный антиген EBV (EBNA). После опосредованной PEI трансфекции антитела временно получают в клетках ЕВЕК HEK293 и очищают стандартной аффинной хроматографией с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией по следующему описанию:
Временная трансфекция и получение
Все (биспецифические) антитела (если они не получены из коммерческого источника), используемые в настоящем изобретении, временно вырабатываются клетками HEK293 EBNA, используя процедуру PEI-опосредованной трансфекции для соответствующих векторов по приведенному ниже описанию. Клетки HEK293 EBNA культивируют в суспензии без сыворотки в культуральной среде CD СНО. Для получения антител 400 миллионов клеток HEK293 EBNA высевают в качалочные колбы объемом 500 мл за 24 ч до трансфекции (для других масштабов все величины соответствующим образом корректируют). Для трансфекции клетки центрифугируют в течение 5 мин в режиме 210 g, супернатант замещают 20 мл предварительно подогретой среды CD СНО. Векторы экспрессии перемешивают в 20 мл среды CD СНО до конечного количества 200 мкг ДНК. После добавления 540 мкл PEI раствор встряхивают на вортексе в течение 15 сек, и затем инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого клетки перемешивают с ДНК/PEI раствором, переносят в качалочную колбу 500 мл и инкубируют в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере 5% СО2. После инкубирования добавляют 160 мл среды F17 и клетки культивируют в течение 24 ч. Через сутки после трансфекции добавляют 1 мМ вальпроевой кислоты и 7% Feed 1. Через 7 суток культивирования супернатант собирают для очистки центрифугированием в течение 15 мин в режиме 210 g, раствор стерилизуют фильтрацией (фильтр с размером пор 0,22 мкм), добавляют азид натрия в конечной концентрации 0,01% (масс./об.) и хранят при 4°С. После получения супернатанты собирают, содержащие антитело супернатанты фильтруют через стерильные фильтры 0,22 мкм и хранят при 4°С до очистки.
Очистка антитела
Все молекулы очищают за две стадии, используя стандартные процедуры, например, аффинную очистку с белком А (фирма Akta Explorer) и эксклюзионную хроматографию. Кислотность супернатанта, полученного в результате временной трансфекции, доводят до величины рН 8,0 (используя 2 М TRIS, рН 8,0) и применяют к колонке HiTrap PA FF (фирма GE Healthcare, объем колонки = 5 мл), уравненной 8 объемами колонки буфера А (20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, рН 7,5). После промывки 10 объемами колонки (cv) буфера А белок элюируют, используя градиент рН буфера Б (20 мМ цитрат натрия рН 3, 100 мМ NaCl, 100 мМ глицин) в количестве более 12 объемов колонки. Фракции, содержащие исследуемый белок, объединяют и рН раствора осторожно доводят до рН 6,0 (используя 0,5 М Na2HPO4, рН 8,0). Образцы концентрируют до 2 мл, используя ультраконцентраторы (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, фирма Sartorius), и затем вносят в препаративную колонку HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200 (фирма GE Healthcare) уравновешенную 20 мМ гистидина, рН 6,0, 140 мМ NaCl, 0,01% Tween-20. Содержание агрегатов элюированных фракций исследуют аналитической эксклюзионной хроматографией. Для этого 30 мкл каждой фракции вносят в колонку TSKgel G3000 SW 5 XL для аналитической эксклюзионной хроматографии (фирма Tosoh), уравновешенную 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ L-аргинин моногидрохлорид, 0,02% (масс./об.) NaN3, рН 6,7 подвижный буфер при 25°С. Фракции, содержащие менее 2% олигомеров, объединяют и концентрируют до конечной концентрации 1-1,5 мг/мл, используя ультраконцентраторы (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, фирма Sartorius). Концентрацию белка определяют путем измерения оптической плотности (OD) при 280 нм с использованием коэффициента мольной экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу конструкций исследуют капиллярным электрофорезом SDS в присутствии или в отсутствие восстанавливающего агента по инструкциям производителя (система электрофореза Caliper LabChipGX, фирма Perkin Elmer). Очищенные белки замораживают в жидком N2 и хранят при -80°С. Основываясь на результатах in vitro, отобранные связующие конвертируют в биспецифический формат Т-клеток. В таких молекулах FolR1:CD3 связывающие части молекулы собраны в пропорции 2:1 с FolR1 Fab, расположенными на N-концах.
Для клонов, выделенных из библиотеки стандартных Fab, получают CD3-связывающую часть в виде CrossFab (CH1Ck-пересечение), но для клонов из обычной библиотеки легкой цепи пересечение не было необходимым. Биспецифические молекулы вырабатывают и очищают аналогично IgG.
Figure 00000013
Figure 00000014
CLC: общая легкая цепь (Common light chain)
Пример 9. 2+1 и 1+1 Т-клеточные биспецифические форматы
Получают четыре разных биспецифических формата Т-клеток для одного связующего общей легкой цепи (16D5) и три формата для одного связующего из библиотеки Fab (9D11) для сравнения их способности к уничтожению in vitro. Стандартным форматом является ранее описанный инвертированный формат 2+1 (FolR1:CD3 связующие части молекулы, собранные в порядке 2:1 с FolR1 Fab, локализованными с N-конца). В классическом формате 2+1 FolR1:CD3 связующие части молекулы собраны в порядке 2:1 с CD3 Fab, расположенными с N-конца. Также получают два моновалентных формата. Формат 1+1 голова-хвост имеют FolR1:CD3 связующие части молекулы, собранные в порядке 1:1 на одном плече молекулы с FolR1 Fab, локализованным с N-конца. В классическом формате 1+1 FolR1:CD3 связывающие части молекулы присутствуют однократно, каждый на одном плече молекулы. Для клона 9D11, выделенного из стандартной библиотеки Fab, CD3-связывающую получают в виде CrossFab (CH1Ck пересечение), тогда как для 16D5 из обычной библиотеки пересечение легкой цепи не было необходимым. Такие биспецифические молекулы получают и очищают аналогично стандартным инвертированным Т-клеточным биспецифическим форматам.
Figure 00000015
Figure 00000016
Пример 10. Биохимическое описание методом поверхностного плазмонного резонанса связующих FolR1.
Связывание связующих FolR1, например, IgG или Т-клеточного биспецифического формата, с разными рекомбинантными фолатными рецепторами (FolR1, 2 и 3 человека, FolR1 мыши и FolR1 макака крабоеда; высев виде гибридов Fc) оценивают методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Все эксперименты методом SPR проводят на приборе Biacore Т200 при 25°С с HBS-EP в качестве подвижного буфера (0,01 М HEPES рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% Surfactant Р20, фирма Biacore, Фрайбург, Германия).
Однократные инъекции
Сначала анти-FolR1 IgG исследуют однократными инъекциями (табл. 1) для описания их перекрестной реакционной способности (в отношении FolR1 человека, мыши и макака крабоеда) и специфичности (к human FolR1, human FolR2, human FolR3). Рекомбинантные биотинилированные мономерные гибриды Fc фолатного рецептора человека, макака крабоеда и мыши (FolR1-Fc) или фолатного рецептора человека 2 и 3 (FolR2-Fc, FolR3-Fc) непосредственно связывают с SA, используя стандартную инструкцию по связыванию (фирма Biacore, Фрайбург, Германия). Уровень иммобилизации составляет примерно 300-400 RU. IgG вводят инъекцией на протяжении 60 сек в концентрации 500 нМ. Связывание IgG с huFolR2 и huFolR3 отторгается из-за отсутствия специфичности. Большинство связующих обладает перекрестной реакционной способностью только между FolR1 человека и макака крабоеда, дополнительная перекрестная реакционная способность в отношении FolR1 мыши большую часть времени сочетается с потерей специфичности.
Figure 00000017
Figure 00000018
Авидность к фолатному рецептору 1
Авидность взаимодействия анти-FolR1 IgG или биспецифичностей Т-клеток и рекомбинантных фолатных рецепторов определяют согласно описанному ниже (табл. 9).
Рекомбинантные биотинилированные мономерные гибриды Fc и фолатного рецептора 1 человека, макака крабоеда и мыши (FolR1-Fc) непосредственно связывают с SA, используя стандартную инструкцию по связыванию (фирма Biacore, Фрайбург, Германия). Уровень иммобилизации составляет примерно 300-400 RU. Анти-FolR1 IgG или биспецифичности Т-клеток пропускают в диапазоне концентраций от 2,1 до 500 нМ при скорости потока 30 мкл/мин через проточную кювету на протяжении 180 сек. Мониторинг диссоциации проводят в течение 600 сек. Различия в индексах величин преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в результате анализа контрольной проточной кюветы с иммобилизованным гибридом рекомбинантного биотинилированного гибрида IL2 рецептора Fc. Для анализа взаимодействия 19Н3 IgG фолатный рецептор 1 мыши фолат (фирма Sigma F7876) вносят в HBS-EP подвижный буфер в концентрации 2,3 мкМ. Кривые связывания, полученные в результате бивалентного связывания IgG или биспецифичности Т-клеток, приближены к модели связывания Ленгмюра 1:1 и адаптированы по этой модели (что неточно, но дает представление об авидности). Очевидные константы авидитета для взаимодействий получены в качестве производных от констант скорости адаптации, используя программное обеспечение Bia Evaluation (фирма GE Healthcare).
Figure 00000019
1. Сродство с фолатным рецептором 1
Аффинность взаимосвязи между анти-FolR1 IgG или биспецифичностями Т-клеток и рекомбинантными фолатными рецепторами определяют согласно описанному ниже (табл. 10).
Для измерения аффинности прямое соединение примерно 6000-7000 резонансных единиц (RU) специфического антитела против Fab человека (набор Fab capture kit, фирма GE Healthcare) осуществляют на чипе СМ5 при рН 5,0, используя стандартный набор для соединения с амином (фирма GE Healthcare). Анти-FolR1 IgG или биспецифичности Т-клеток захватывают в количестве 20 нМ при скорости тока 10 мкл/мин в течение 20 или 40 сек, контрольную проточную кювету оставляют без захвата. Серии разведений (от 6,17 до 500 нМ или от 12,35 до 3000 нМ) гибрида Fc с фолатным рецептором 1 человека или макака крабоеда пропускают во все проточные кюветы при 30 мкл/мин в течение 120 или 240 сек для регистрации фазы ассоциации. Фазу диссоциации подвергают мониторингу в течение 240 сек и приводят в действие путем переключения с раствора образца на HBS-EP. Поверхность чипа регенерируют после каждого цикла, используя двойную инъекцию длительностью 60 сек 10 мМ глицин-HCl рН 2,1 или рН 1,5. Различия в индексах величин преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в результате анализа контрольной проточной кюветы 1. Константы аффинности для взаимодействий определяют по константам скорости путем приближения к модели связывания Лэнгмюра 1:1, используя программное обеспечение Bia Evaluation (фирма GE Healthcare).
Figure 00000020
2. Связывающее сродство с CD3
Аффинность взаимодействия между анти-FolR1 биспецифичностей Т-клеток и рекомбинантного human CD3ed-Fc определяют согласно описанному ниже (табл. 11).
Для измерения аффинности прямое соединение примерно 9000 резонансных единиц (RU) специфического антитела против Fab человека (набор Fab capture kit, фирма GE Healthcare) осуществляют на чипе СМ5 при рН 5,0, используя стандартный набор для соединения с амином (фирма GE Healthcare). Анти-FolR1 биспецифичности Т-клеток захватываются при 20 нМ и скорости тока 10 мкл/мин в течение 40 сек, контрольную проточную кювету оставляют без захвата. Серии разведений (от 6,17 до 500 нМ) гибрида human CD3ed-Fc пропускают во все проточные кюветы со скоростью 30 мкл/мин в течение 240 сек для записи фазы ассоциации. Мониторинг фазы диссоциации проводят в течение 240 сек и индуцируют путем переключения с раствора образца на HBS-ЕР. Поверхность чипа регенерируют после каждого цикла, используя двойное впрыскивание 10 мМ Glycine-HCl рН 2,1 длительностью 60 сек. Различия в индексах величин преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в результате анализа контрольной проточной кюветы 1. Константы аффинности для взаимодействий определяют по константам скорости путем приближения к модели связывания Лэнгмюра 1:1, используя программное обеспечение Bia Evaluation (фирма GE Healthcare).
Figure 00000021
CD3-связывающая часть идентична для всех конструкций, и связывающее сродство является близким для измеренных биспецифичностей Т-клеток (диапазон KD между 60 и 90 нМ).
Пример 11. Одновременное связывание Т cell bispecifics с фолатным рецептором 1 и CD3
Одновременное связывание анти-FolR1 биспецифичностей Т-клеток с рекомбинантным с фолатным рецептором 1 и рекомбинантным human CD3ed-Fc определяют методом поверхностного плазмонного резонанса, описанного ниже. Рекомбинантные биотинилированные мономерные гибриды Fc с фолатным рецептором 1 человека, макака крабоеда и мыши (FolR1-Fc) непосредственно соединяют на чипе SA, используя стандартную инструкцию связывания (фирма Biacore, Фрайбург, Германия). Уровень иммобилизации составляет примерно 300-400 RU. Анти-FolR1 биспецифичности Т-клеток впрыскивают в течение 60 сек в количестве 500 нМ со скоростью тока 30 мкл/мин через проточные кюветы, после чего впрыскивают hu CDed-Fc в течение 60 сек в количестве 500 нМ. Различия в индексах величин преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в результате анализа контрольной проточной кюветы, иммобилизованной с гибридом рекомбинантным биотинилированным IL2 рецептором Fc. Согласно ожиданию, исследованные биспецифичности Т-клеток (16D5 ТСВ, 21А5 ТСВ, 51С7 ТСВ и 45D2 ТСВ) способны одновременно связываться с фолатным рецептором 1 и CD3 человека.
Пример 12. Эпитоп-специфическая сортировка
Для эпитоп-специфической сортировки анти-FolR1 IgG или биспецифичности Т-клеток непосредственно иммобилизуют на чипе СМ5 при рН 5,0, используя стандартный набор аминного соединения (фирма GE Healthcare), с итоговым ответом примерно 700 RU. 500 нМ huFolR1-Fc затем захватывают в течение 60 сек, затем 500 нМ разных связующих в течение 30 сек. Поверхность регенерируют двумя впрыскиваниями 10 нМ глицина рН 2, каждое длительностью 30 сек. Оценивают, могут ли различные связующие связываться с huFolR1, захваченным на иммобилизованных связующих (табл. 12).
Figure 00000022
Основываясь на этих результатах и дополнительных данных по одновременному связыванию с иммобилизованным huFolR1, связующие делят на три группы. Это не очевидно, если 9D11 имеет отдельный эпитоп, поскольку он смещает все другие связующие. Предположительно 16D5 и 21А5 входят в одну группу, a Mov19, фарлетузумаб (Coney с соавт., 1991; Kallie с соавт., 2007) и 36F2 - к другой (табл. 13). Однако 36F2 связывается с другим эпитопом, в отличие от Mov 19 и фарлетузумаба, поскольку он связывается с FolR1 человека, макака крабоеда и мыши.
Figure 00000023
Пример 13. Выбор связующих.
Связующие FolR1 в форматах IgG подвергают скринингу методом поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance - SPR) и исследованием in vitro на клетках для отбора наилучших кандидатов.
Анти-FolR1 IgG анализируют методом SPR для описания их перекрестной реакционноспособности (в отношении FolR1 человека, макака крабоеда и мыши) и специфичности (для FolR1 человека, FolR2 человека, FolR3 человека). Неспецифическое связывание с FolR2 человека и FolR3 человека расценивают в качестве исключающего фактора. Связывание и специфичность с FolR1 человека были подтверждены на клетках. Некоторые связующие не связывают клетки, экспрессирующие FolR1, хотя они распознают рекомбинантный FolR1 человека при использовании метода SPR. Температура агрегации была определена, но она не является исключающим фактором, поскольку все выбранные связующие стабильны. Выбранные связующие тестируют на множественную реакционноспособность методом ELISA для проверки неспецифического связывания, что приводит к исключению четырех связующих. Этот процесс привел к первоначальному выбору трех связующих: 36F2 (библиотека Fab), 9D11 (библиотека Fab) и 16D5 (общая легкая цепь). 36F2 быстро диссоциирует с huFolR1 и поэтому изначально был забракован.
Пример 14. Специфическое связывание вновь полученных связующих FolR1 с опухолевыми клетками, положительными по FolR1 человека.
Новые связующие FolR1 получают методом фагового дисплея, используя либо библиотеку Fab, либо библиотеку общей легкой цепи, используя легкую цепь CD3. Идентифицированные связующие конвертируют в формат IgG1 человека и определяют связывание с клетками HeLa, экспрессирующими на высоком уровне FolR1. В качестве контрольной молекулы включают связующее Mov19 FolR1 человека (см. фиг. 2). Клоны 16А3, 18D3, 15Н7, 15В6, 21D1, 14Е4 и 16F12 исключают, поскольку связывание с FolR1 на клетках нельзя подтвердить жидкостной цитометрией. На следующей стадии выбранные клоны тестируют на специфичность в отношении FolR1 человека, исключая связывание с близкородственным FolR2 человека. Клетки HEK временно трансфицируют либо FolR1 человека, либо FolR2 человека, для определения специфичности. Клоны 36F2 и 9D11, полученные из библиотеки Fab, и клонов 16D5 и 21А5, полученные из библиотеки CLC, специфично связываются с FolR1 человека, но не с FolR2 человека (см. фиг. 3А-Б). Все другие исследованные клоны показывают, по меньшей мере, некоторое связывание с FolR2 человека (см. фиг. 3А-Б). Соответственно эти клоны исключают из дальнейшего описания. Параллельно перекрестную реакционную способность клонов FolR1 в отношении FolR1 макака крабоеда исследуют путем проведения исследований связывания с клетками HEK, временно трансфицированными FolR1 макака крабоеда. Все тестируемые клоны могут связывать FolR1 макака крабоеда и четыре выбранных специфических по FoLR1 человека клоны 36F2, 9D11, 16D5 и 21А5 связываются сравнительно хорошо с FoLR1 человека и макака крабоеда (фиг. 4). Впоследствии три специфических связующих в отношении FolR1 человека с перекрестной реакционной способностью с FolR1 макака крабоеда конвертируют в формат ТСВ и тестируют на индукцию уничтожения Т-клеток и активацию Т-клеток. Этими клонами являются 9D11 из библиотеки Fab и 16D5 и 21А5 из библиотеки CLC. В качестве контрольной молекулы Mov19 FolR1 ТСВ включают во все исследования. Затем такие FolR1 ТСВ используют для сравнения индукции интернализации после связывания с FolR1 на клетках HeLa. Все три исследованных клона интернализуются при связывании с FolR1, сравнимым с интернализацией при связывании Mov19 FoLR1 ТСВ (фиг. 5). Работа с 21А5 FolR1 ТСВ была прекращена из-за признаков полиреактивности.
Пример 15. Опосредованное Т-клетками уничтожение FolR1-экспрессирующих опухолевых целевых клеток, индуцированное антителами FolR1 ТСВ.
FolR1 ТСВ применяют для определения опосредованного Т-клетками уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих FoLR1. Панель потенциальных линий целевых клеток используют для определения сайтов связывания FoLR1 с помощью анализа Qifikit.
Используемая панель опухолевых клеток содержит клетки, экспрессирующие FolR1 на высоком, среднем и низком уровне, а также FolR1 - отрицательную линию клеток.
Figure 00000024
Определяют связывание трех различных FoLR1 ТСВ (содержащих связующие 9D11, 16D5 и Mov19) с такой панелью линий опухолевых клеток и показывают, что FolR1 ТСВ специфически связываются с опухолевыми клетками, экспрессирующими FolR1, и не связываются с линией клеток опухолей, отрицательных по FoLR1. Количество связанной конструкции пропорционально уровню экспрессии FolR1, и все еще сохраняется хорошее связывание конструкций с клетками линии НТ-29 с низким уровнем экспрессии FolR1. Кроме того, нет связывания отрицательного контроля DP47 ТСВ с какой-либо из использованных клеточных линий (фиг. 6А-Д).
Временно экспрессирующие клетки линии SKOV3 и клетки линии НТ-29 с низким уровнем экспрессии дополнительно используют для тестирования опосредованного Т-клетками уничтожения и активации Т-клеток с использованием 16D5 ТСВ и 9D11 ТСВ; DP47 ТСВ включают в исследование в качестве отрицательного контроля. Клетки обеих линий уничтожаются в присутствии уже очень низких уровней 16D5 ТСВ и 9D11 ТСВ, причем нет разницы в активности между двумя ТСВ, хотя 9D11 ТСВ сильнее связывается с FolR1, чем 16D5 ТСВ. Общее уничтожение клеток SKOV3 выше относительно клеток НТ-29, что отражает повышенные уровни экспрессии FolR1 на клетках SKOV3 (фиг. 7А-Г). В соответствии с этим обнаружено сильное усиление регуляции маркера активации CD25 и CD69 на CD4+ Т-клетках и CD8+ Т-клетках. Активация Т-клеток весьма близка в присутствии клеток SKOV3 и клеток НТ-29. Отрицательный контроль DP47 ТСВ не вызывает какого-либо уничтожения клеток в использованных концентрациях и нет значительного повышения регуляции CD25 и CD69 на Т-клетках.
Figure 00000025
Figure 00000026
Пример 16. Связывание эритроцитов и активация Т-клеток в цельной крови.
Чтобы доказать, что нет спонтанной активации в отсутствии опухолевых клеток, экспрессирующих FoLR1, проводят исследование связывания клонов FolR1 с эритроцитами, которые могут потенциально экспрессировать FolR1. Нельзя наблюдать какое-либо специфическое связывание 9D11 IgG, 16D5 IgG и Mov19 IgG с эритроцитами, поскольку был включен отрицательный контроль DP47 (фиг. 8).
Для исключения какого-либо неспецифического связывания с клетками крови или неспецифической активации через FoLR1 ТСВ, 9D11 ТСВ, 16D5 ТСВ и Mov19 ТСВ добавляют к цельной крови и повышенную регуляцию CD25 и CD69 на CD4+ Т-клетках и CD8+ Т-клетках исследуют методом жидкостной цитометрии. DP47 ТСВ включают в качестве отрицательного контроля. Отсутствие активирования Т-клеток какими-либо из исследуемых конструкций можно наблюдать с помощью анализа повышенной регуляции CD25 и CD69 на CD4+ Т-клетках и CD8+ Т-клетках (фиг. 9).
Пример 17. Удаление сайта N-гликозилирования в легкой цепи 9D11.
При анализе различных связующих FolR1 для идентификации потенциальных горячих точек последовательности, в конце CDR L3 клона 9D11 идентифицируют предполагаемый сайт N-гликозилирования. Обычно консенсусный мотив для N-гликозилирования определяют в виде N-X-S/T-X (где X не является Р). Последовательность CDR L3 (MQASIMNRT (SEQ ID NO: 46)) идеально соответствует этому консенсусному мотиву с последовательностью N-R-T. Так как гликозилирование не может быть полностью воспроизводимым в разных партиях продукции, это может повлиять на связывание FolR1, если гликозилирование в CDR L3 способствует связыванию антигена. Чтобы оценить, является ли такой сайт N-гликозилирования важным для связывания FolR1 или может быть заменен без ухудшения связывания, получают различные варианты легкой цепи 9D11, в которых сайт N-гликозилирования заменен путем сайтспецифичного мутагенеза.
1. Временная трансфекция и наработка
Четыре биспецифичности Т-клеток временно вырабатывают в клетках HEK293 EBEK, используя метод PEI-опосредованной трансфекции для требуемых векторов, согласно приведенному ниже описанию. Клетки HEK293 EBNA культивируют в культуральной среде CD СНО без сыворотки. Для наработки антител в 500 мл качалочной колбе высевают 400 миллионов клеток HEK293 EBNA за 24 часа до трансфекции (для других объемов проводят соответствующую корректировку). Для трансфекции клетки центрифугируют в течение 5 мин в режиме 210 g, супернатант замещают предварительно подогретой средой CD СНО в количестве 20 мл. Векторы экспрессии перемешивают в 20 мл среды CD СНО до итогового количества ДНК 200 мкг. После добавления 540 мкл раствора PEI встряхивают в течение 15 сек и затем инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивают с раствором ДНК/PEI, переносят в качалочную колбу емкостью 500 мл и инкубируют в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере 5% СО2. После инкубирования 160 мл среды F17 добавляют и клетки культивируют в течение 24 ч. Через сутки после трансфекции добавляют 1 мМ вальпроевой кислоты и 7% корма 1. Через 7 суток культивирования супернатант собирают для очистки центрифугированием в течение 15 мин в режиме 210 g, раствор стерилизуют фильтрацией (фильтр с порами 0,22 мкм), добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и хранят при 4°С. После наработки антител супернатанты собирают и те из них, в которых содержатся антитела, фильтруют через стерилизующие фильтры с порами 0,22 мкм и хранят при 4°С до очистки.
2. Очистка антител
Все молекулы очищают в две стадии, используя стандартные процедуры, например, аффинную очистку с белком А (фирма
Figure 00000027
Explorer) и эксклюзионную хроматографию. Супернатант, полученный в результате временной наработки, в котором рН доводят до 8,0 (с использованием 2 М TRIS рН 8,0), вносят в колонку HiTrap PA HP (фирма GE Healthcare, объем колонки (cv) = 5 мл), уравновешенную буфером А (20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, 0,5 М NaCl, 0,01% Твин-20, рН 7,5) в количестве 8 cv. После промывки буфером А белок элюируют, используя градиент рН в буфер В (20 мМ цитрат натрия, рН 2,5, 0,5 М NaCl, 0,01% Твин-20) в количестве более 20 cv. Фракции, содержащие целевой белок, объединяют и рН раствора осторожно доводят до 6,0 (используя 2М Tris, рН 8,0). Образцы концентрируют до 1 мл, используя ультраконцентраторы (Vivaspin 15R 30,000 MWCO HY, фирма Sartorius), и затем вносят в колонку SuperdexTM 200 10/300 GL (фирма GE Healthcare), уравновешенную 20 мМ гистидином, рН 6,0, 140 мМ NaCl, 0,01% Твин-20. Совокупное содержание элюированных фракций исследуют с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии. Для этого по 30 мкл каждой фракции вносят в аналитическую эксклюзионную колонку TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh), уравновешенную подвижным буфером, включающим 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорид L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN3, рН 6,7, при 25°С. Фракции, содержащие менее 2% олигомеров, объединяют и концентрируют до конечной концентрации 1-1,5 мг/мл с использованием ультра концентраторов (Vivaspin 15R 30,000 MWCO HY, фирма Sartorius). Концентрацию белка определяют путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм с использованием коэффициента мольной экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу конструкций анализируют SDS капиллярным электрофорезом в присутствии и в отсутствие восстановителя в соответствии с инструкциями производителя (прибор Caliper LabChipGX, фирма Perkin Elmer). Очищенные белки замораживают в жидком N2 и хранят при -80°С.
3. Температура агрегирования
Стабильность четырех конструкций тестируют на анализаторе белка Optim1000 (фирма Avacta, PALL Corporation) путем нагрева градиента от 25° до 80° при шаге 0,1°С/мин. Температуру в начале агрегации записывают.
Таблица 34. Продуктивность, содержание мономера и температура агрегации четырех мутантов с нокаутом сайта N-гликозилирования связующего 9D11 в 2+1 инвертированном формате биспецифичностей Т-клеток. Все четыре мутанта ведут себя аналогично связующему 9D11 дикого типа.
Figure 00000028
Получают следующие варианты: N100S (N95S), N100Q (N95Q), Т102А (Т97А) и T102N (T97N) (нумерация по Kabat указана в скобках), которые преобразуют в биспецифический формат Т-клеток. После временного продуцирования в клетках HEK293 ЕВЕК и очистки различные варианты исследуют для выявления связывания с мишенью и определения активности по уничтожению клеток по сравнению с исходным клоном 9D11.
Figure 00000029
Пример 18. Связывание и опосредованное Т-клетками уничтожение с вариантами 9D11 5 a-glyco.
Вследствие сайта гликозилирования в CDR были получены четыре разных варианта 9D11 с мутацией, удаляющей сайт гликозилирования (пример 17). Эти четыре варианта сравнивают с исходным клоном 9D11 по связыванию с FolR1 на клетках HeLa (фиг. 10) и по индукции уничтожения опухолевых клеток SKOV3 и НТ-29 (фиг. 11А-Б, Д-Е). Ни один из вариантов не выявил различий в связывании или индукции уничтожения опухолевых клеток. Параллельно исследуют неспецифическое взаимодействие FolR1-отрицательных клеточных линий MKN-45 (фиг. 11В, Г). Также не наблюдают различий между вариантами и исходным связующим. Ни одна из конструкций не индуцирует неспецифического уничтожения FolR1-отрицательных опухолевых клеток.
Пример 19. Экспрессия FolR1 на первичных эпителиальных клетках.
FolR1 экспрессируется на низких уровнях на первичных эпителиальных клетках. Задача исследования заключается в том, чтобы установить, достаточны ли эти уровни для индукции опосредованного Т-клетками уничтожения в присутствии ТСВ FolR1. Для этого используют первичные бронхиальные эпителиальные клетки человека, первичные эпителиальные клетки хороидного сплетения человека, первичные эпителиальные клетки коры почки человека и первичные пигментированные эпителиальные клетки человека. В качестве положительного контроля включают либо SalR1-положительные клетки SKOV3, либо клетки НТ-29. Сначала подтверждают экспрессию FolR1 на используемых первичных клетках и определяют количество сайтов связывания FolR1 на этих клетках. Бронхиальные эпителиальные клетки, эпителиальные клетки коры почки и пигментированные эпителиальные клетки сетчатки экспрессируют FolR1 на очень низких уровнях по сравнению с уровнями экспрессии в опухолевых клетках. Эпителиальные клетки хороидного сплетения не экспрессируют на существенных уровнях FolR1.
Figure 00000030
Первичные эпителиальные клетки, которые проявляют экспрессию FolR1 на поверхности, используют для ответа на вопрос, могут ли эти клетки быть уничтожены Т-клетками в присутствии FoLR1 ТСВ. Никаких существенных уровней уничтожения нельзя измерить, но обнаруживают индукцию активации Т-клеток в присутствии эпителиальных пигментных клеток сетчатки, бронхиальных эпителиальных клеток и клеток коры почек, что приводит к повышению регуляции CD25 и CD69. Самую сильную активацию наблюдают с эпителиальными пигментными клетками сетчатки, которая выражается в повышении регуляции CD25 и CD69 как на CD4+ Т-клетках, так и на CD8+ Т-клетках. При наличии бронхиальных эпителиальных клеток пониженная активация Т-клеток индуцируется с повышением регуляции CD69 на CD4+ Т-клетках и CD8+ Т-клетках, но очень низкой регуляцией CD25 только на CD4+ Т-клетках, но не на CD8+ Т-клетках. Наименьшую активацию Т-клеток наблюдают в присутствии эпителиальных клеток почки без повышенной регуляции CD25 на CD4+ Т-клетках и CD8+ Т-клетках и только регуляция CD69 повышена на CD8+ Т-клетках (фиг. 12А-Ш).
Пример 20. Сравнение разных форматов ТСВ. содержащих связующее 16D5 или 9D11.
Чтобы определить, является ли инвертированный формат ТСВ 2+1 самым активным форматом с выбранным связующим FolR1, получают и сравнивают разные форматы, содержащие 16D5 или 9D11, по способности связывать целевые клетки, уничтожать посредством Т-клеток и активировать Т-клетки. Связующее 16D5 тестируют в конструкциях: ТСВ 2+1 инвертированная (фиг. 1А), ТСВ 2+1 классическая (фиг. 1Г), ТСВ 1+1 классическая (фиг. 1В) и ТСВ 1+1 голова-к-хвосту (фиг. 1Б); связующее 9D11 тестируют в конструкциях: ТСВ 2+1 инвертированная (фиг. 1А), ТСВ 1+1 классическая (фиг. 1В) и ТСВ 1+1 голова-к-хвосту (фиг. 1Б). Все конструкции тестируют на связывание с FolR1 на клетках HeLa. Молекулы, бивалентные для связывания с FolR1, связываются сильнее по сравнению с моновалентными конструкциями из-за авидности. Различие между двухвалентными и одновалентными конструкциями более выражено для 16D5. Причина может заключаться в том, что из-за более низкой аффинности 16D5 эффект авидности для этого связующего сильнее. Между двумя 1+1 ТСВ нет существенной разницы в связывании, но есть разница между двумя конструкциями 2+1. Инвертированная конструкция 2+1 сильнее связывается с FolR1, чем классическая конструкция 2+1. Это указывает на то, что в классической конструкции 2+1 связывание с FoLR1 зависит от присутствия CD3 Fab, тогда как в перевернутой конструкции связывание менее подвержено влиянию.
Путем тестирования опосредованного Т-клетками уничтожения с помощью этих конструкций можно показать, что более сильное связывание 2+1 инвертированного ТСВ преобразуется в более сильное уничтожение опухолевых клеток и активацию Т-клеток по сравнению с 2+1 классическим форматом ТСВ. Формат 16D5 FolR1 ТСВ 2+1 классический лишь немного более активен, чем соответствующая конструкция 1+1 голова-к-хвосту. Конструкция 1+1 голова-к-хвосту значительно более активна, чем классическая конструкция 1+1. Это не отражает ситуацию, наблюдаемую при связывании, и может быть вызвано лучшей поперечной сшивкой с конструкцией голова-к-хвосту. Общее уничтожение опухолевых клеток и активация Т-клеток сопоставимы со всеми тестируемыми конструкциями, различия в эффективности относятся только к значениям ЕС50. В целом можно сделать вывод о том, что инвертированный FolR1 ТСВ 2+1, не зависящий от использованного связующего, является предпочтительным форматом для индуцирования опосредованного Т-клетками уничтожения опухолевых клеток и активации Т-клеток (см. фиг. 13А-В и фиг. 14А-В).
Figure 00000031
Figure 00000032
Пример 21. Линии опухолевых клеток и первичные клетки
Клетки HeLa (CCL-2) получают из коллекции АТСС и культивируют в среде DMEM с 10% ФСТ и 2 мМ глутамином, клетки SKOV3 (НТВ-77) получают из коллекции АТСС и культивируют в среде RPMI с 10% ФСТ и 2 мМ глутамином, клетки OVCAR5 получают из Национального института рака США (NCI) и культивируют в среде RPMI с 10% ФСТ и 2 мМ глутамином, клетки НТ-29 (АСС-299) получают из коллекции DSMZ и культивируют в среде McCoy's 5А с 10% ФСТ и 2 мМ глутамином, клетки MKN-45 (АСС-409) получают из коллекции DSMZ и культивируют в среде RPMI с 10% ФСТ и 2 мМ глутамином.
Все исследуемые первичные эпителиальные клетки получают от фирмы ScienCell Research Laboratories. Бронхиальные эпителиальные клетки человека (фирма HBEpiC, номер в каталоге 3210) культивируют в среде для бронхиальных эпителиальных клеток (фирма BEpiCM, номер в каталоге 3211, ScienCell). Эпителиальные клетки кишечника человек (фирма HCoEpiC, номер в каталоге 2950) культивируют в среде для эпителиальных клеток кишечника (фирма CoEpiCM, номер в каталоге 2951, ScienCell). Эпителиальные пигментные клетки сетчатки человека (фирма HRPEpiC, номер в каталоге 6540) культивируют в среде для эпителиальных клеток (фирма EpiCM, номер в каталоге 4101, ScienCell). Кортикальные эпителиальные клетки почки человека (фирма HRCEpiC, номер в каталоге 4110) культивируют в среде для эпителиальных клеток (фирма EpiCM, номер в каталоге 4101, ScienCell). Эпителиальные клетки сосудистого сплетения человека (фирма HCPEpiC, номер в каталоге 1310), культивируют в среде для эпителиальных клеток (фирма EpiCM, номер в каталоге 4101, ScienCell).
Пример 22. Определение связывание мишени методом жидкостной цитометрии
Намеченные целевые клетки собирают буфером для диссоциации клеток, промывают ФСБ и ресуспендируют в буфере FACS. Окрашивание антител проводят в 96-луночном круглодонном планшете. Для этого высевают в лунки по 200000 клеток. Планшет центрифугируют в течение 4 мин в режиме 400 g и супернатант удаляют. Исследуемые антитела разводят в буфере FACS и 20 мкл раствора антитела добавляют к клеткам на 30 мин при 4°С. Для удаления несвязанного антитела клетки дважды промывают буфером FACS перед добавлением разбавленного вторичного антитела (FITC conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG, Fcg Fragment, Jackson ImmunoResearch #109-096-098 или PE-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment goat anti-human IgG Fcg Fragment Specific, фирма Jackson ImmunoResearch #109-116-170). Через 30 мин инкубации при 4°С несвязанное вторичное антитело отмывают. Перед измерением клетки ресуспендируют в 200 мкл буфера FACS и анализируют с помощью жидкостной цитометрии с использованием проточных цитофлуориметров BD Canto II или BD Fortessa.
Пример 23. Интернализация.
Клетки собирают и определяют их жизнеспособность. Предварительно клетки ресуспендируют в свежей холодной среде до концентрации 2 млн клеток/мл и суспензию клеток переносят в пробирку Falcon объемом 15 мл для каждого антитела. Антитела, которые нужно тестировать на интернализацию, добавляют к клеткам до конечной концентрации 20 мкг/мл. Пробирки инкубируют в течение 45 мин в холодной комнате на шейкере. После инкубирования клетки трижды промывают холодным ФСБ для удаления несвязанных антител. 0,2 млн клеток/лунку переносят в планшет FACS в нулевой точке времени.
Меченые клетки повторно суспендируют в теплой среде и инкубируют при 37°С. В определенные моменты времени 0,2 млн клеток/лунку переносят в холодный ФСБ, промывают на планшете FACS. Для обнаружения конструкций, которые остаются на поверхности, клетки окрашивают меченным РЕ меченным вторичным антителом против Fc человека. Поэтому по 20 мкл разбавленного антитела добавляют в лунки и планшет инкубируют в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки дважды промывают для удаления несвязанных антител, осле чего фиксируют 1% PFA для предотвращения дальнейшей интернализации. Флуоресценцию измеряют, используя проточный цитофлуориметр BD FACS CantoII.
Пример 24. Анализ антигенов на поверхности клеток с помощью набора QIFIKIT®.
Набор QIFIKIT® содержит серии гранул диаметром 10 мкм, покрытых разным, но строго определенным количеством молекул моноклонального антитела (Mab) мыши (анти-human CD5 высокой аффинности, клон CRIS-1, изотип IgG2a). Гранулы имитируют клетки с разной плотностью антигена, которые метят первичным Mab мыши, изотип IgG. Вкратце, клетки метят первичным моноклональным антителом мыши, направленным против исследуемого антигена. В отдельной лунке клетки метят чужеродным моноклональным антителом мыши (контроль изотипа). Затем клетки, структурированные гранулы и калибровочные гранулы метят конъюгированным с флуоресцеином анти-мышиным вторичным антителом, включенным в набор. Первичное антитело, применяемое для нанесения метки на клетки, следует применять при насыщающей концентрации. Первичное антитело может быть кого-либо изотипа IgG мыши. В этих условиях количество связанных первичных молекул антител соответствует числу антигенных сайтов, присутствующих на поверхности клетки. Вторичное антитело также применяют при насыщающей концентрации. Следовательно, флуоресценция коррелирует с числом связанных молекул первичных антител на клетках и на гранулах.
Пример 25. Опосредованное Т-клетками уничтожение опухолевых клеток и активация Т-клеток
Собирают целевые клетки с помощью трипсина/EDTA, подсчитывают и проверяют жизнеспособность. Клетки ресуспендируют в соответствующей им среде до конечной концентрации 3000000 клеток/мл. Затем 100 мкл суспензии целевых клеток переносят в лунки 96-луночного круглодонного планшета. Планшеты инкубируют в течение ночи при 37°С в инкубаторе для осуществления адгезии клеток на планшете. На следующие сутки МКПК отделяют от цельной крови здоровых доноров. Кровь разводят 2:1 ФСБ и наслаивают на 15 мл Histopaque-1077 (фирма Sigma-Aldrich, номер в каталоге 10771) в пробирки Leucosep, центрифугируют в течение 30 мин в режиме 450 g без торможения. После центрифугирования полосу, содержащую клетки, собирают пипеткой объемом 10 мл и переносят в пробирки объемом 50 мл. Пробирки наполняют ФСБ до 50 мл и центрифугируют (в режиме 400 g, 10 мин, комнатная температура). Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в ФСБ. После центрифугирования (в режиме 300 g, 10 мин, комнатная температура) супернатанты удаляют, наполняют 2 пробирки и повторяют стадию промывки (в режиме 350 g, 10 мин, комнатная температура). Затем клетки ресуспендируют и осадки помещают в 50 мл ФСБ для подсчета клеток. После подсчета клетки центрифугируют (в режиме 350 g, 10 мин, комнатная температура), после чего по 6 млн клеток/мл в среде RPMI с 2% ФСТ и 2 нМ глутамина. Среду удаляют от высеянных целевых клеток и исследуемые антитела разводят в RPMI 2% с ФСТ и 2 нМ глутамином. 300000 клеток раствора эффекторных клеток переносят в каждую лунку, что приводит к соотношению Е:Т = 10:1. Для определения максимального высвобождения целевые клетки лизируют Triton Х-100. Высвобождение LDH определяют через 24 ч и 48 ч, используя набор Cytotoxicity Detection Kit (фирма Roche Applied Science, номер в каталоге 1644793). Повышение регуляции маркеров активации на Т-клетках после уничтожения опухолевых клеток измеряют методом жидкостной цитометрии. Вкратце, МКПК собирают, переносят в 96-луночный круглодонный планшет и окрашивают CD4 25 РЕ-Су7 (#3557852, фирма BD Bioscience), CD8 FITC (#555634, фирма BD Bioscience), CD25 АРС (фирма #555434, BD Bioscience), CD69 РЕ (#310906, фирма BioLegend) антителами, разведенными в буфере FACS. После 30 мин инкубирования при 4°С клетки дважды отмывают буфером FACS. Перед измерением флуоресценции с использованием BD Canto II клетки ресуспендируют в 200 мкл буфера FACS.
Пример 26. Активация Т-клеток в цельной крови.
280 мкл свежей крови вносят в 96-луночный планшет с коническими глубокими лунками. Затем 20 мкл разведенных ТСВ добавляют к крови и хорошо перемешивают путем встряхивания планшета. Через 24 ч инкубирования при 37°С в инкубаторе кровь перемешивают и 35 мкл переносят в 96-луночный круглодонный планшет. Затем добавляют 20 мкл смеси для окрашивания антител, состоящей из CD4 РЕ-Су7 (#3557852, фирма BD Bioscience), CD8 FITC (#555634, фирма BD Bioscience), CD25 АРС (фирма #555434, BD Bioscience), CD69 РЕ (#310906, фирма BioLegend) и CD45 V500 (#560777, фирма BD Horizon) и инкубируют в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Перед измерением к крови добавляют 200 мкл свежеприготовленного лизирующего раствора BD FACS (#349202, фирма BD FCAS). После 15 мин инкубирования при комнатной температуре клетки измеряют по протоколу BD Fortessa.
Пример 27. Однодозовое фармакокинетическое исследование (SDPK - single dose pharmacokinetics) гуманизированного FOLR1 ТСВ (клон 16D5) в иммунодефицитных NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG) мышах.
Самок мышей NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG) в возрасте 6-7 недель в начале эксперимента (выращенных на фирме Taconic, Дания) содержат в специфических условиях, исключающих патогенов, при суточных циклах 12 ч света/12 ч темноты в соответствии с общепризнанным руководством (GV-Solas, Felasa, TierschG). Протокол экспериментальных исследований был рассмотрен и одобрен местными органами власти (Р 2011/128). После прибытия животных содержат в течение одной недели, чтобы они привыкли к новой обстановке, а также для наблюдения за ними. Постоянный мониторинг состояния здоровья животных проводят на регулярной основе.
Мышам внутривенно вводят 10/1/0,1 мкг/мышь FOLR1 ТСВ и в каждой временной точке у трех мышей спускают кровь. Всем мышам вводят инъекцией 200 мкл соответствующего раствора. Для получения требуемого количества FOLR1 ТСВ в 200 мкл при необходимости исходные растворы разводят ФСБ. Образцы сыворотки собирают через 5 мин, 1 ч, 3 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 168 ч после терапевтической инъекции.
Фиг. 15 показывает, что 16D5 FOLR1 ТСВ проявляет типичные и пропорциональные дозе IgG-подобные PK свойства в мышах NOG с медленным клиренсом.
Figure 00000033
Пример 28. Эффективность in vivo FOLR1 ТСВ (клон 16D5) после переноса МКПК человека в Skov3-несущих мышей NOG.
FOLR1 ТСВ исследуют в линии клеток карциномы яичника человека Skov3, которые вводят подкожно мышам NOG, трансплантированных МКПК.
Линию клеток карциномы яичника человека Skov3 получают из коллекции ATCC (НТВ-77). Линию опухолевых клеток культивируют в среде RPMI, содержащей 10% ФСТ (фирма Gibco) при 37°C во влажной атмосфере с 5% СО2. Пассаж 35 применяют для трансплантации, жизнеспособность составляет >95%. Вводят подкожно в правый бок животных 5×106 клеток на животное в общем количестве 100 мкл культуральной среды для МКПК (фирма Gibco).
Самок мышей NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG) в возрасте 6-7 недель в начале эксперимента (выращенных на фирме Taconic, Дания) содержат в специфических условиях, исключающих патогенов, при суточных циклах 12 ч света/12 ч темноты в соответствии с общепризнанным руководством (GV-Solas, Felasa, TierschG). Протокол экспериментальных исследований был рассмотрен и одобрен местными органами власти (Р 2011/128). После прибытия животных содержат в течение одной недели, чтобы они привыкли к новой обстановке, а также для наблюдения за ними. Постоянный мониторинг дыхания проводят на регулярной основой. По протоколу (фиг. 16) мышам вводят подкожной инъекцией в 0 сутки 5×106 клеток Skov3. На 21 сутки исследования МКПК человека, полученные от здорового донора, выделяют методом Ficoll и 10×106 клеток вводят внутрибрюшинной инъекцией мышам с опухолями. Через 2 суток мышей рандомизируют и равным образом распределяют по 5 группам лечения (n=12), после чего вводят внутривенно 10/1/0,1 мкг/мышь FOLR1 ТСВ или 10 мкг/мышь DP47 контроль ТСВ раз в неделю в течение трех недель. Всем мышам вводят внутривенной инъекцией 200 мкл соответствующего раствора. Мышам в группе контроля вводят ФСБ. Чтобы получить требуемое количество ТСВ в 200 мкл, при необходимости исходные растворы разводят ФСБ. Рост опухоли измеряют один раз в неделю с помощью циркуля (фиг. 17) и объем опухоли (Tv) рассчитывают следующим образом:
Tv: (W210/2)×L
где (W: ширина, L: длина)
Инъекция раз в неделю FOLR1 ТСВ приводит к дозозависимому противоопухолевому эффекту. При дозе 10 мкг/мышь и 1 мкг/мышь индуцируется сжатие опухоли, а при 0,1 мкг/мышь - стаз опухоли (фиг. 17, табл. 22). Максимальное сжатие опухоли достигают в дозе 15 мкг/мышь по сравнению с нецелевым контрольным DP47 ТСВ.
Figure 00000034
Для считывания PD умерщвляют по 3 мыши в группе на 32 сутки исследования, опухоли удаляют и получают суспензию отдельных клеток ферментативным расщеплением коллагеназой V, диспазой II и ДНКазой для последующего анализа методом FACS (фиг. 19 и 20). Отдельные клетки либо применяют непосредственно для окрашивания внеклеточными антигенами и маркерами активации, либо повторно стимулируют, используя 5 нг/мл РМА и 500 нг/мл иономицина в присутствии ингибитора транспорта белка монензина в течение 5 ч в нормальной культуральной среде. После повторной стимуляции клетки окрашивают на поверхностные антигены с последующей стадией фиксации и стадией проницаемости. Затем фиксированные образцы окрашивают внутриклеточно на TNF-a, IFN-g, IL-10 и IL-2 и анализируют методом проточной цитометрии. Такую же процедуру используют для дегрануляции клеток, но анти-CD107a антитело добавляют в ходе периода рестимуляции и фиксированные образцы окрашивают на содержание внутриклеточного перфорина и сериновой протеазы гранзим_В. Методом FACS выявляют статистически большее количество инфильтрирующих CD4+ и CD8+ Т-клеток в опухолевой ткани после лечения FOLR1 ТСВ по сравнению с растворителем и контролем ТСВ без специфического нацеливания. Кроме того, повышенное число CD4+ и CD8+ T-клеток, вырабатывающих TNF-1, IFN-1 и IL-2, а также перфорин/гранзим-В+, выявляют в опухолях, обработанных FOLR1 ТСВ. Инфильтрующиеся в опухоль Т-клетки, обработанные FOLR1 ТСВ, также проявляют повышенную скорость дегрануляции по сравнению с контрольными группами.
В конце исследования на 38 сутки всех животных умерщвляют, опухоли удаляют и взвешивают (фиг. 18). Масса опухолей, обработанных 10 и 1 мкг/мышь FOLR1 ТСВ, показывает статистически значимое различие с контрольной группой.
Figure 00000035
Пример 29. Получение биспецифического FolR1/CD3-каппа-лямбда антитела.
Для получения биспецифического антитела (моновалентного для каждого антигена), который одновременно может связываться с CD3 человека и фолатным рецептором альфа человека (FolR1) без применения какого-либо метода гетеродимеризации (например, технологии «выступ-во-впадину»), применяют комбинацию библиотеки общей легкой цепи с так называемой технологией CrossMab: вариабельную область гуманизированного связующего CD3 (CH2527_VL7_46/13) гибридизируют с доменом СН1 стандартного антитела IgG1 человека для образования гибридной молекулы VLVH (гибридизированной с Fc), которая является общей для обеих специфичностей. Для получения пересеченных аналогов (VHCL), CD3 специфический вариабельный домен тяжелой цепи (CH2527_VH_23/12) гибридизируют с константной легкой цепью человека λ, а вариабельный домен тяжелой цепи, специфичный в отношении FolR1 человека (клон 16D5, выделенный из библиотеки общей легкой цепи), гибридизируют с константной легкой цепью человека k. Это позволяет очищать необходимое биспецифическое антитело путем применения последовательных стадий очистки с колонками KappaSelect и LambdaFabSelect (фирма GE Healthcare) для удаления нежелательных гомодимерных антител. Векторы экспрессии антител получают, используя стандартный метод рекомбинации ДНК, описанный в кн. Sambrook J. с соавт. «Molecular cloning: A laboratory manual», изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1989. Реагенты для молекулярной биологии применяют по инструкциям производителя. Гены или фрагменты генов либо амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), либо вырабатывают из синтетических олигонуклеотидов от фирмы Geneart AG (Регенсбург, Германия) путем автоматического синтеза генов. Амплифицированные методом ПЦР или субклонированные фрагменты ДНК подтверждают сиквенсом ДНК (фирма Synergene GmbH, Швейцария). Плазмидную ДНК трансформируют и амплифицируют в соответствующих штаммах-хозяевах Е. coli для получения пригодной для трансфекции плазмидной ДНК с использованием стандартных наборов Maxiprep (фирма Qiagen). Для получения биспецифических молекул клетки НЕК293 EBNA трансфицируют плазмидами, кодирующими соответствующие гены, с использованием стандартного метода на основе полиэтиленимина (polyethlenimine - PEI). Соотношение используемых плазмид трех векторов экспрессии составляет 1:1:1. Трансфецированные клетки культивируют в течение 7 суток, после чего для очистки отбирают супернатанты. Биспецифические FolR1/CD3-каппа-лямбда антитела получают и очищают описанным ниже образом.
1. Временная трансфекция и выработка антител
Биспецифическое антитело каппа-лямбда получают путем временной трансфекции в клетках НЕК293 EBNA, используя PEI-опосредованную трансфекцию для необходимых векторов согласно описанному ниже. НЕК293 EBNA клетки культивируют в культуральной среде CD СНО без суспензии сыворотки. Для получения в качалочных колбах объемом 500 мл высевают 400 миллионов клеток НЕК293 EBNA за 24 ч до осуществления трансфекции (для других объемом производят соответствующее изменение). Для трансфекции клетки центрифугируют в течение 5 мин в режиме 210 g и супернатант замещают 20 мл предварительно подогретой среды CD СНО. Векторы экспрессии перемешивают в 20 мл среды CD СНО, в итоге количество ДНК составляет 200 мкг. После добавления 540 мкл раствора PEI встряхивают на вортексе течение 15 сек и затем инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивают с раствором ДНК/PEI, переносят в качалочную колбу объемом 500 мл и инкубируют в течение 3 ч при 37°C в инкубаторе в атмосфере 5% CO2. После инкубирования добавляют 160 мл среды F17 и клетки инкубируют 24 ч. Через сутки после трансфекции добавляют 1 мМ вальпроевой кислоты и 7% Feed 1. Через 7 суток культивирования супернатант собирают для очистки центрифугированием в течение 15 мин в режиме 210 g, раствор стерилизуют фильтрацией (фильтр с порами 0,22 мкм), добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,01% (масс./об.) и хранят при 4°C.
2. Очистка
Биспецифическое антитело каппа-лямбда очищали в три стадии с использованием стадии аффинности, специфичной для легких цепей каппа, с последующей стадии аффинности, специфичной для легких цепей лямбда, и, наконец, на стадии исключения эксклюзионной хроматографии для удаления агрегатов. Супернатант, полученный от культуры клеток с временной продуктивностью, доводят до рН 8,0 (используя 2 М TRIS рН 8,0) и наносят на аффинную матрицу Capture Select kappa или HiTrap KappaSelect, фирма GE Healthcare, объем колонки = 1 мл, уравнивают 5 объемами колонки буфера А (50 мМ Трис, 100 мМ глицина, 150 мМ NaCl, рН 8,0). После промывки 15 объемами колонки буфером А белок элюируют с использованием градиента рН в буфере Б (50 мМ Трис, 100 мМ глицин, 150 мМ NaCl, рН 2,0) более чем 25 объемами колонки. Фракции, содержащие целевой белок, объединяют и рН раствора доводят до рН 8,0 (используя 2 М Tris, рН 8,0). Нейтрализованные объединенные фракции наносят на аффинную матрицу Capture Select lambda (в настоящее время: HiTrap LambdaFabSelect, фирма GE Healthcare, объем колонки =1 мл), уравновешенную 5 объемами колонки буфера А (50 мМ Tris, 100 мМ глицин, 150 мМ NaCl, рН 8,0). После промывки 15 объемами колонки буфера А белок элюируют, используя градиент рН в буфере Б (50 мМ Tris, 100 мМ глицин, 150 мМ NaCl, рН 2,0) в 25 объемах колонки. Фракции, содержащие целевой белок, объединяют и рН раствора доводят до рН 8,0 (используя 2 М Tris, рН 8,0). Полученный раствор концентрируют, используя ультраконцентраторы (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, фирма Sartorius) и затем вносят в колонку SuperdexTM 200 10/300 GL (фирма GE Healthcare), уравновешенную 20 мМ гистидином, рН 6,0, 140 мМ NaCl, 0,01% Tween-20. Объединенные фракции после прохождения колонки опять концентрируют, используя ультраконцентраторы (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, фирма Sartorius).
Концентрацию белка определяют по оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент мольной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу конструкций исследуют SDS капиллярным электрофорезом в присутствии или в отсутствие восстанавливающего агента по инструкциям производителя (прибор для электрофореза Caliper LabChipGX, фирма Perkin Elmer). Только небольшое количество белка может быть очищено с итоговым выходом 0,17 мг/л.
Пример 30. Опосредованное Т-клетками уничтожение биспецифическим FolR1/CD3-каппа-лямбда антителом.
Активность каппа-лямбда FolR1 ТСВ тестируют на клетках SKOV3 в присутствии свежевыделенных МКПК. В качестве отрицательного контроля включают DP47 ТСВ. Опосредованное Т-клетками уничтожение клеток SKOV3 определяют через 24 ч и 48 ч по высвобождению LDH. Через 48 ч Т-клетки собирают и повышенную регуляцию CD69 и CD25 на CD4 Т-клетках и CD8 Т-клетках измеряют методом жидкостной цитометрии.
Конструкция каппа-лямбда FolR1 индуцирует уничтожение клеток SKOV3 зависимым от концентрации образом, которое сопровождается повышенной регуляцией CD69 и CD25 и на СВ4-Т-клетках, и на CD8-Т-клетках.
Клетки SKOV3 инкубируют с МКПК в присутствии или каппа-лямбда FoLR1 ТСВ, или DP47 ТСВ. Через 24 ч и 48 ч уничтожение клеток опухоли определяют по измерению высвобождения LDH (фиг. 21). Клетки SKOV3 инкубируют с МКПК в присутствии или каппа-лямбда FoLR1 ТСВ, или DP47 ТСВ. Через 48 ч повышение регуляции CD25 и CD69 на CD4 Т-клетках и CD8 Т-клетках измеряют методом жидкостной цитометрии (фиг. 22).
Пример 31. Биохимическое описание 16D5 и 36F2 FolR1 связующих методом поверхностного плазмонного резонанса.
Связывание анти-FolR1 16D5 в разных одновалентных или двухвалентных биспецифических форматах Т-клеток и анти-FolR1 36F2 в качестве IgG или биспецифичностей Т-клеток с рекомбинантным фолатным рецептором 1 человека, макака крабоеда и мыши (все в виде гибридов Fc) оценивают методом поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance - SPR). Все эксперименты SPR выполняют на устройстве Biacore Т200 при 25°C с HBS-EP в качестве подвижного буфера (0,01 М HEPES рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% Surfactant Р20, фирма Biacore, GE Healthcare).
1. Тестирование молекул
Молекулы, примененные для определения связывающего сродства (аффинности) и авидности, описаны в табл. 24.
Figure 00000036
2. Авидность в отношении фолатного рецептора 1
Авидность взаимодействия между анти-FolR1 IgG или биспецифичностями Т-клеток и рекомбинантными фолатными рецепторами определяют согласно описанному ниже (табл. 25).
Рекомбинантные биотинилированные мономерные гибриды Fc фолатного рецептора 1 человека, макака крабоеда и мыши (FolR1-Fc) непосредственно соединяют с чипом SA, используя стандартную инструкцию по соединению (фирма Biacore, GE Healthcare). Уровень иммобилизации составляет примерно 300-400 RU. Анти-FolR1 IgG или биспецифичности Т-клеток (ТСВ) пропускают в диапазоне концентраций от 3,7 до 900 нМ со скоростью тока 30 мкл/мин через проточные кюветы в течение 180 сек. Мониторинг диссоциации проводят в течение 240 или 600 сек. Поверхность чипа регенерируют после каждого цикла, используя двойную инъекцию длительностью 30 сек 10 мМ глицин-HCl, рН 2. Различия в индексах величин преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в результате анализа контрольной проточной кюветы с иммобилизованным гибридом рекомбинантного биотинилированного мышиного CD 134 Fc. Кривые связывания, полученные в результате двухвалентного связывания IgG или биспецифичностей Т-клеток, приближают к модели связывания Лэнгмюра 1:1 (хотя это связывание 1:2) и оперируют этой моделью, чтобы получить четкую КД, представляющую авидность двухвалентного связывания. Явные константы авидности для взаимодействий определяют из констант степени соответствия с использованием программного обеспечения Bia Evaluation (фирма GE Healthcare). Для формата 1+1 Т cell bispecifics format взаимодействие действительно составляет 1:1, a KD представляет аффинность, поскольку в этой конструкции имеется только одно связующее FolR1.
Figure 00000037
3. Аффинность в отношении фолатного рецептора 1
Аффинность взаимодействия между анти-FolR1 IgG или биспецифичностями Т-клеток и рекомбинантными фолатными рецепторами определяют согласно описанному ниже (табл. 26).
Для измерения аффинности осуществляют непосредственное связывание примерно 12000 резонансных единиц (RU) специфического антитела против Fab человека (набор Fab capture kit, фирма GE Healthcare) на чипе СМ5 при рН 5,0 с использованием стандартного набора для связывания амина (фирма GE Healthcare). Анти-FolR1 IgG или биспецифичности Т-клеток захватывают при 20 нМ при скорости тока 10 мкл/мин в течение 40 сек, контрольная проточная кювета остается без захвата. Серии разведений (от 12,3 до 3000 нМ) гибрида Fc с фолатным рецептором 1 человека, макака крабоеда или мыши пропускают через все проточные ячейки при скорости тока 30 мкл/мин в течение 240 сек для записи фазы ассоциации. Мониторинг фазы диссоциации проводят в течение 300 сек и запускают путем переключения с раствора образца на HBS-EP. Поверхность чипа регенерируют после каждого цикла с использованием двойной инъекции длительностью 60 сек раствора 10 мМ глицин-HCl рН 1,5. Различия в индексах величин преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в результате анализа контрольной проточной кюветы 1. Константы аффинности для взаимодействий определяют по константам скорости путем соответствия модели связывания Ленгмюра 1:1, используя программное обеспечение BIA Evaluation (фирма GE Healthcare).
Figure 00000038
Аффинность (моновалентное связывание) человека и макака крабоеда FolR1-Fc с 36F2 ТСВ сходны и составляют примерно 1000 нМ для обоих, тогда как сродство с мыши FolR1-Fc немного лучше и составляет примерно 300 нМ. 36F2 можно использовать в моделях грызунов и приматов, при этом нет необходимости в замещении. Авидность (четкая KD) 36F2 ТСВ в отношении FolR1 человека примерно в 30 раз ниже, чем сродство 16D5 ТСВ к FolR1 человека. В двухвалентном формате 36F2 ТСВ находится в низком наномолярном диапазоне, тогда как 16D5 ТСВ находится в низком пикомолярном диапазоне (разность в 1000 раз). FolR1 избыточно экспрессируется на опухолевых клетках с перемежающимися и высокими уровнями, на поверхности раковых клеток из спектра эпителиальных злокачественных новообразований, включающего солидные опухоли рака яичника, груди, почек, толстой кишки, легких и другие, а также экспрессируется на апикальной поверхности ограниченного подмножества поляризованных эпителиальных клеток в здоровой ткани. Такие неопухолевые здоровые клетки экспрессируют FolR1 только на низких уровнях и включают, например, бронхиальные эпителиальные клетки на альвеолярной поверхности, клетки на границе просвета почечных канальцев, пигментированный эпителий сетчатки (базолатеральная мембрана) и сосудистое сплетение.
16D5 ТСВ связывается с клетками здоровых тканей, экспрессирующими низкие количества FolR1, что приводит к их уничтожению Т-клетками. Это может, по крайней мере, частично, объяснить ограниченную устойчивость, наблюдаемую при 10 мкг/кг у макака крабоеда. В настоящем изобретении была выдвинута задача установить, возможно ли путем снижения сродства биспецифической молекулы Т-клеток увеличить дифференциацию между тканями с высокой и низкой плотностью мишеней и, таким образом, снизить токсичность за счет применения двухвалентного связывания и авидности. Связующие с низкой аффинностью обычно не выбираются в качестве подходящих кандидатов для дальнейшего анализа, поскольку низкая аффинность часто связана с низкой эффективностью. Тем не менее, связующее 36F2 с низкой аффинностью в отношении FolR1 разработано в нескольких форматах, биологические свойства которых описаны. Для 36F2, используемого в бивалентном биспецифическом формате Т-клеток, эффект авидности (разница между моновалентным и двухвалентным связыванием) отличается примерно в 250 раз (1000 нМ против 4 нМ). При низкой плотности мишени аффинность, отражающая взаимодействие, при 1000 нМ приводит к низкой активности ТСВ. Однако при высокой плотности мишени авидность молекул проявляется и при 4 нМ приводит к высокой активности ТСВ (см. пример 32).
В альтернативном подходе получают одновалентные форматы 16D5 и вариант с низким сродством 16D5 (сродство около 10-40 нМ) в двухвалентном формате. Связующее 16D5, используемое в одновалентном формате (1+1), имеет сродство примерно 50 нМ. Дифференциация между тканями высокой и низкой плотности цели может быть лучше достигнута за счет использования преимущества эффекта авидности.
Пример 32. Уничтожение Т-клетками клеток SKov-3, индуцированное 36F2 ТСВ, Mov19 ТСВ и 21А5 ТСВ.
Уничтожение Т-клетками, опосредованное 36F2 ТСВ, Mov19 ТСВ и 21А5 ТСВ, оценивают на клетках SKov-3 (средний уровень FolR1). МКПК человека применяют в качестве эффекторов, и уничтожение фиксируют на 24 ч и 48 ч инкубирования с биспецифическими антителами. Вкратце, целевые клетки собирают раствором Trypsin/EDTA, промывают и помещают с плотностью 25000 клеток/лунку в плоскодонные 96-луночные планшеты. Клетки оставляют для прикрепления на ночь. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получают центрифугированием в градиенте плотности Histopaque обогащенных лимфоцитами препаратов (светлых слоев кровяного сгустка), полученных от здоровых людей (доноров). Свежую кровь разводят стерильным ФСБ и наслаивают поверх градиента плотности Histopaque (фирма Sigma, номер в каталоге Н8889). После центрифугирования (в режиме 450 g, 30 мин, комнатная температура) плазму над МКПК-содержащем промежуточном слоем выбрасывают и МКПК переносят в новую пробирку фалькон, в которую затем вносят 50 мл ФСБ. Смесь центрифугируют (в режиме 400 g, 10 мин, комнатная температура), супернатант выбрасывают и осадок из МКПК дважды промывают стерильным ФСБ (стадии центрифугируют в режиме 350 g, 10 мин). Получаемую популяцию МКПК просчитывают автоматически (ViCell) и хранят в среде RPMI1640, содержащей 10% ФСТ и 1% L-аланил-L-глютамин (Biochrom, К0302) при 37°C, 5% CO2, в инкубаторе для клеток до дальнейшего использования (не больше 24 ч). Для анализа уничтожения антитело добавляют в указанных концентрациях (диапазон 0,005 пМ - 5 нМ в трех повторах). МКПК добавляют к целевым клеткам при конечном соотношении Е:Т=10:1. Уничтожение целевых клеток оценивают через 24 ч и 48 ч инкубирования при 37°C, 5% CO2, путем количественной оценки LDH, высвобождаемой в супернатанты клеток апоптическими/некротическими клетками (набор для обнаружения LDH, фирма Applic Science Roche, номер в каталоге 11 644 793 001). Максимального лизиса клеток-мишеней (=100%) достигают путем инкубирования клеток-мишеней с 1% Triton Х-100. Минимальный лизис (=0%) относится к целевым клеткам, совместно инкубируемым с эффекторными клетками без биспецифической конструкции.
Результаты показывают, что уничтожение, индуцированное 36F2, значительно снижено по сравнению с Mov19 ТСВ и 21А5 ТСВ (фиг. 23А-Б). Величины ЕС50, связанные с исследованием уничтожения клеток, рассчитывают с помощью GraphPadPrism6 и суммируют в табл. 27.
Figure 00000039
* кривая не достигает насыщения, величина гипотетическая
Пример 33. Уничтожение Т-клетками, индуцированное 36F2 ТСВ и 16D5 ТСВ в при разных одновалентных и двухвалентных Т-клеточных биспецифических форматах Т-клеток.
Оценивают уничтожение Т-клетками, опосредованное 36F2 ТСВ, 16D5 ТСВ, 16D5 ТСВ классическая, 16D5 ТСВ 1+1 и 16D5 ТСВ НТ антителами опухолевых клеток человека Hela (высокое содержание FolR1, примерно 2 миллиона копий, табл. 14, фиг. 27), Skov-3 (среднее содержание FolR1, примерно 70000-90000 копий, табл. 14, фиг. 27) и НТ-29 (низкое содержание FolR1, примерно 10000, табл. 14, фиг. 27). Антитело DP47 ТСВ включают в исследование в качестве отрицательного контроля. МКПК человека применяют в качестве эффекторов, и уничтожение клеток определяют через 24 ч инкубирования с биспецифическим антителом. Вкратце, целевые клетки собирают раствором Trypsin/EDTA, промывают и помещают с плотностью 25000 клеток/лунку в плоскодонные 96-луночные планшеты. Клетки оставляют для прикрепления на ночь. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получают центрифугированием в градиенте плотности Histopaque обогащенных лимфоцитами препаратов (светлых слоев кровяного сгустка), полученных от здоровых людей-доноров. Свежую кровь разводят стерильным ФСБ и наслаивают поверх градиента плотности Histopaque (фирма Sigma, номер в каталоге Н8889). После центрифугирования (в режиме 450 g, 30 мин, комнатная температура) плазму поверх МКПК-содержащей интерфазы выбрасывают и МКПК переносят в новую пробирку фалькон, которую затем заполняют 50 мл ФСБ. Смесь центрифугируют (в режиме 400×g, 10 мин, комнатная температура), супернатант выбрасывают и осадок из МКПК дважды промывают стерильным ФСБ (стадии центрифугируют в режиме 350 g, 10 мин). Получаемую популяцию МКПК просчитывают автоматически (ViCell) и хранят в среде RPMI1640, содержащей 10% ФСТ и 1% L-аланил-L-глютамин (фирма Biochrom, K0302) при 37°C, 5% CO2, в инкубаторе для клеток до дальнейшего использования (не больше 24 ч). Для анализа уничтожения антитело добавляют в указанных концентрациях (диапазон 0,01 пМ - 100 нМ в трех повторах). МКПК добавляют к целевым клеткам при конечном соотношении Е:Т=10:1. Уничтожение целевых клеток оценивают через 24 ч инкубирования при 37°C, 5% CO2, путем количественной оценки LDH, высвобождаемой в супернатанты клеток апоптическими/некротическими клетками (набор для обнаружения LDH, фирма Applic Science Roche, номер в каталоге 11 644 793 001). Максимального лизиса клеток-мишеней (=100%) достигают путем инкубирования клеток-мишеней с 1% Triton Х-100. Минимальный лизис (=0%) относится к целевым клеткам, совместно инкубируемым с эффекторными клетками без биспецифической конструкции.
Результаты показывают, специфическое в отношении мишени уничтожение всех трех линий клеток с мишенью FolR1+, индуцированное 36F2 ТСВ, значительно слабее по сравнению с уничтожением, индуцированным 16D5 ТСВ (фиг. 24А-В, табл. 29). Специфическое в отношении мишени уничтожение, индуцированное моновалентными 16D5 ТСВ (16D5 НТ и 16D5 +1), хуже по сравнению с бивалентными 16D5 ТСВ (16D5 ТСВ и 16D5 ТСВ classic). Значения ЕС50, связанные с исследованием уничтожения, рассчитанные с использованием программы GraphPadPrism6, суммированы в табл. 28. Важно, что эти данные показывают, что использование связующего 36F2 FolR1 в двухвалентном 2+1 формате ТСВ расширяет терапевтическое окно по сравнению с 16D5 FOLR1 ТСВ (фиг. 24А-В). Хотя снижение результативности между 16D5 и 36F2 FOLR1 ТСВ составляет примерно 45-кратную величину для клеток Hela (высокий уровень экспрессии FOLR1, см. табл. 28: 16D5 ТСВ=0,8 против 36F2 ТСВ 36,0) и примерно 297-кратную величину для клеток Skov3 (средний уровень экспрессии FOLR1, см табл. 28: 16D5 ТСВ=0,6 против 36F2 ТСВ 178,4), это снижение составляет почти 7000-кратную величину для НТ29 с низким уровнем экспрессии FOLR1 (см. табл. 28: 16D5 ТСВ=5,7 против 36F2 ТСВ 39573). Таким образом, 36F2 FOLR1 ТСВ дифференцирует клетки с высоким и низким уровнем экспрессии, что имеет особое значение для снижения токсичности, поскольку клетки некоторых нормальных, неопухолевых тканей экспрессируют очень низкие уровни FolR1 (приблизительно менее 1000 копий на клетку). В соответствии с этим наблюдением результаты, описанные в примере 35 ниже, показывают, что 36F2 ТСВ не индуцирует уничтожение Т-клетками первичных клеток (фиг. 26А-Г), несмотря на то, что в случае 16D5 ТСВ уничтожение можно наблюдать для клеток HRCEpiC и HRPEpiC через 48 ч инкубирования (фиг. 26Б и В). Это важное свойство 36F2 ТСВ позволяет вводить дозы для лечения FolR1-положительных опухолей таким образом, чтобы способствовать интенсивному уничтожению опухолевых тканей с высокой или средней экспрессией FOLR1, но не здоровых тканей с низкой (частично поляризованной) экспрессией. Примечательно, что это свойство, по-видимому, опосредовано авидностью 36F2 ТСВ в двухвалентном 2+1 инвертированном формате, поскольку оно не наблюдается при использовании одновалентных форматов 1+1, несущих такой же связующий 36F2 с низким сродством. С другой стороны, 36F2 ТСВ в двухвалентном 2+1 формате содержит FolR1-связывающие части молекулы с относительно низким сродством, но обладает авидным эффектом, который позволяет дифференцировать клетки с высоким и низким уровнем экспрессии FolR1. Поскольку опухолевые клетки экспрессируют FolR1 на высоком или промежуточном уровнях, такие ТСВ избирательно связываются с опухолевыми клетками, но не со здоровыми, т.е. не раковыми, клеткам, которые экспрессируют FolR1 на низких уровнях или вообще не экспрессируют.
В дополнение к вышеуказанным предпочтительным свойствам, 36F2 ТСВ в двухвалентном 2+1 инвертированном формате также имеет то преимущество, что он не требует химического сшивания или другого гибридного подхода. Это делает его пригодным для получения лекарственного средства для лечения пациентов, например, пациентов, имеющих FolR1-положительные раковые опухоли. 36F2 ТСВ в двухвалентном +1 инвертированном формате может быть получен с использованием стандартных процессов СНО с низким агрегированием. Кроме того, 36F2 ТСВ в двухвалентном формате 2+1 содержит последовательности человека и гуманизированные последовательности, что делает его предпочтительнее молекул, в которые входят полипептиды крыс и мышей, которые являются высокоиммуногенными при введении людям. Кроме того, 36F2 ТСВ в двухвалентном формате 2+1 разработан для того, чтобы избежать связывания FcgR и, как таковой, не вызывает реакций сшивания и инфузии FcgR, что еще больше повышает его безопасность при введении пациентам.
Из описанных выше результатов следует, что геометрия «голова-к-хвосту» делает 36F2 ТСВ в двухвалентном 2+1 инвертированном формате сильнодействующей молекулой, которая индуцирует полное уничтожение целевых клеток. Двухвалентность повышает авидность и уровень активности, но также позволяет дифференцировать клетки с высокой и низкой экспрессией. Предпочтение 36F2 ТСВ в отношении клеток с высоким или средним уровнем экспрессии из-за авидности влияет на снижение токсичности, вызванной опосредованным Т-клетками уничтожением здоровых клеток, которые экспрессируют FolR1 на низких уровнях.
Дополнительное преимущество 36F2 ТСВ в двухвалентном 2+1 формате и в других вариантах осуществления настоящего изобретения заключается в том, что их клиническая разработка не требует применения суррогатных молекул, поскольку они связываются с FolR1 человека, макака крабоеда и мыши. Таким образом, описанные в настоящем изобретении молекулы распознают другой эпитоп, чем ранее описанные антитела к FolR1, которые не распознают FolR1 от всех трех видов.
Figure 00000040
* кривая не достигает насыщения, величина гипотетическая
Табл. 29 показывает сравнение величин ЕС50 для 16D5 ТСВ и 36F2 ТСВ на разных исследованных линиях клеток. Из полученных величин ЕС50 рассчитывают дельту (ЕС50 16D5 ТСВ минус ЕС50 36F2 ТСВ) и х-кратность (величину ЕС50 16D5 ТСВ делят на ЕС50 36F2 ТСВ).
Figure 00000041
* кривая не достигает насыщения, величина гипотетическая
Вычисленные значения ЕС50 ясно показывают, что разница между 36F2 ТСВ и 16D5 ТСВ становится тем больше, чем ниже экспрессия FolR1 на целевых клетках.
Те же вычисления, что и для сравнения значений ЕС50 для 16D5 ТСВ и 36F2 ТСВ, выполняют для 16D5 ТСВ и двух моновалентных 16D5 ТСВ (16D5 ТСВ НТ и 16D51+1). В табл. 30 и 31 показывают сравнение величин ЕС50 16D5 ТСВ против 16D5 ТСВ НТ (табл. 30) и 16D5 ТСВ против 16D5 ТСВ 1+1 (табл. 31), а также соответствующие дельты (ЕС50 16D5 ТСВ минус ЕС50 16D5 ТСВ НТ/1+1) и х-кратность разности (величина ЕС50 16D5 ТСВ, поделенная на величину ЕС50 16D5 ТСВ НТ/1+1).
Figure 00000042
Figure 00000043
* кривая не достигает насыщения, величина гипотетическая
Сравнение величин ЕС50 16D5 ТСВ и 36F2 ТСВ (табл. 29) показывает, что различия в величинах ЕС50 становится тем больше, чем ниже экспрессия FolR1 на целевых клетках-мишенях. Этот эффект не может быть замечен при сравнении 16D5 ТСВ и моновалентных 16D5 ТСВ (табл. 29 и табл. 30). Для 16D5 ТСВ 1+1 (табл. 31) также наблюдают небольшое увеличение различия между ЕС50 16D5 ТСВ и 16D5 ТСВ 1+1 с уменьшением экспрессии FolR1, но далеко не так ярко выраженное по сравнению с 16D5 ТСВ против 36F2 ТСВ.
Пример 34. Повышенная регуляция CD25 и CD69 на CD8+ и CD4+ эффекторных клетках после уничтожения Т-клетками FolR1-экспрессирующих опухолевых клеток, индуцированная 36F2 ТСВ и 16D5 ТСВ антителом.
Активация CD8+ и CD4+ Т-клеток после уничтожения Т-клетками FolR1-экспрессирующих опухолевых клеток Hela, SKov-3 и НТ-29, опосредованного 36F2 ТСВ и 16D5 ТСВ, оценивают методом FACS, используя антитела распознавания маркеров активации Т-клеток CD25 (маркер поздней активации) и CD69 (маркер ранней активации). DP47 ТСВ включают в исследование в качестве контроля отсутствия связывания. Антитело и условия анализа уничтожения клеток в значительной степени идентичны с описанными выше (пример 32) с использованием того же диапазона концентраций (0,01 пМ - 100 нМ в трех повторах), соотношение Е:Т=10:1 и время инкубирования 48 ч.
После инкубирования МКПК переносят в круглодонный 96-луночный планшет, центрифугируют в режиме 400 g в течение 4 мин и дважды промывают ФСБ с 0,1% БСА. Окрашивание на поверхности CD8 (РЕ анти-human CD8, BD #555635), CD4 (Brilliant Violet 421™ против CD4 человека, фирма Biolegend, номер в каталоге 300532), CD69 (FITC против CD69 человека, BD #555530) и CD25 (АРС против CD25 человека, BD 10 #555434) осуществляют по инструкциям производителя. Клетки дважды промывают 150 мкл/лунку ФСБ с 0,1% БСА. После центрифугирования образцы ресуспендируют в 200 мкл/лунку 0,1% ФСБ для измерения методом FACS. Образцы исследуют на проточном цитофлуориметре BD FACS Canto II.
Индуцированная 36F2 ТСВ специфичная в отношении мишени повышенная регуляция маркеров активации (CD25, CD69) на CD8+ и CD4+ Т-клетках после уничтожения клеток Hela (фиг. 25А) и клеток SKov-3 (фиг. 25Б). По сравнению с 16D5 ТСВ повышенная регуляция CD25 и CD69 на CD8+ и CD4+ Т-клетках, индуцированная 36F2, значительно слабее.
На НТ-29 (низкий уровень FolR1) повышенная регуляция маркеров активации может быть видна только при максимальной концентрации 36F2 ТСВ. Напротив, 16D5 ТСВ с повышением регуляции CD25 и CD69 уже можно наблюдать при гораздо более низких концентрациях антител (фиг. 25В).
В эксперименте по лизису опухоли показано, что анализ маркеров активации (CD25 и CD69) на Т-клетках (CD4+ и CD8+) после уничтожения клеток очевидно указывает на то, что разница между 16D5 ТСВ и 36F2 ТСВ становится тем больше, чем ниже уровень экспрессии FolR1 на целевых клетках.
Пример 35. Уничтожение Т-клетками первичных клеток, индуцированных 36F2 ТСВ и 16D5 ТСВ.
Уничтожение Т-клетками, опосредованное 36F2 ТСВ и 16D5 ТСВ, оценивают на первичных клетках (эпителиальных клетках коры почки человека - Human Renal Cortical Epithelial Cells (HRCEpiC) (фирма ScienCell Research Laboratories; номер в каталоге 4110) и пигментированных эпителиальных клетках сетчатки человека - Human Retinal Pigment Epithelial Cells (HRPEpiC) (фирма ScienCell Research Laboratories; номер в каталоге 6540)). Клетки линии НТ-29 (низкий уровень FolR1) включают в исследование в качестве контроля. DP47 ТСВ включают в качестве контроля отсутствия связывания. МКПК человека используют в качестве эффекторов, уничтожение клеток фиксируют на 24 и 48 ч инкубирования с биспецифическими антителами. Вкратце, целевые клетки собирают с помощью трипсина/EDTA, промывают и высевают с плотностью 25000 клеток/лунку, используя плоскодонные 96-луночные планшеты. Клетки оставляют на ночь для адгезии. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получают центрифугированием в градиенте плотности Histopaque обогащенных лимфоцитами препаратов (светлых слоев кровяного сгустка), полученных от здоровых людей-доноров. Свежую кровь разводят стерильным ФСБ и наслаивают поверх градиента плотности Histopaque (фирма Sigma, номер в каталоге Н8889). После центрифугирования (в режиме 450 g, 30 мин, комнатная температура) плазму поверх МКПК-содержащей интерфазы выбрасывают и МКПК переносят в новую пробирку фалькон, которую затем заполняют 50 мл ФСБ. Смесь центрифугируют (в режиме 400×g, 10 мин, комнатная температура), супернатант выбрасывают и осадок из МКПК дважды промывают стерильным ФСБ (стадии центрифугируют в режиме 350 g, 10 мин). Получаемую популяцию МКПК просчитывают автоматически (фирма ViCell) и хранят в среде RPMI1640, содержащей 10% ФСТ и 1% L-аланил-L-глютамин (фирма Biochrom, К0302) при 37°C, 5% CO2, в инкубаторе для клеток до дальнейшего использования (не больше 24 ч). Для анализа уничтожения антитело добавляют в указанных концентрациях (диапазон 0,01 пМ - 10 нМ в трех повторах). МКПК добавляют к целевым клеткам при конечном соотношении Е:Т=10:1. Уничтожение целевых клеток оценивают через 24 ч и 48 ч инкубирования при 37°C, 5% СО2, путем количественной оценки LDH, высвобождаемой в супернатанты клеток апоптическими/некротическими клетками (набор для обнаружения LDH, фирма Applic Science Roche, номер в каталоге 11 644 793 001). Максимального лизиса клеток-мишеней (=100%) достигают путем инкубирования клеток-мишеней с 1% Triton Х-100. Минимальный лизис (=0%) относится к целевым клеткам, совместно инкубируемым с эффекторными клетками без биспецифической конструкции.
Результаты показывают, что 36F2 ТСВ не индуцирует уничтожение Т-клетками первичных клеток (фиг. 26А-Г), хотя для 16D5 ТСВ можно наблюдать некоторое уничтожение клеток HRCEpiC и HRPEpiC после 48 ч инкубирования (фиг. 26Б и Г). Выше описано, что наблюдают существенное различие в уничтожении Т-клетками клеток НТ-29 между 16D5 ТСВ и 36F2 ТСВ (фиг. 26Д, Е).
Пример 36. Получение DP47 GS ТСВ (2+1 Crossfab-IgG P329G LALA инвертированная конструкция = «не нацеливаемый ТСВ»).
«Ненацеливаемые ТСВ» используют в качестве контроля в вышеприведенных экспериментах. Биспецифическое антитело взаимодействует с CD3e, но не связывается с каким-либо другим антигеном и поэтому не может сшивать Т-клетки с целевыми клетками (и в связи с этим не может вызывать их уничтожения). Поэтому он используют в качестве отрицательного контроля при мониторинге какой-либо неспецифической активации Т-клеток. Такие ненацеливаемые ТСВ получают согласно описанию WO 024/131712. Вкратце, вариабельную область последовательностей ДНК тяжелой и легкой цепей субклонируют в рамке либо с константной тяжелой цепью, либо с константной легкой цепью, предварительно инсертированной в соответствующий реципиентный экспрессирующий вектор млекопитающих. Экспрессию антитела индуцируют промотором MPSV помещают синтетическую полиА сигнальную последовательность с 3'-конца CDS. Кроме того, каждый вектор содержит последовательность OriP вируса Эпштейна-Барра (EBV). Молекулу получают путем совместной трансфекции клеток HEK293-EBNA векторами экспрессии млекопитающих с использованием полиэтиленимина. Клетки трансфицируют соответствующими векторами экспрессии в соотношении 1:2:1:1 («вектор тяжелой цепи Fc(впадина)» : «вектор легкой цепи» : «вектор легкой цепи Crossfab» : «вектор тяжелой цепи Fc(выступ)-FabCrossfab»).
Для трансфекции клетки НЕК293 EBNA культивируют в суспензии без сыворотки в культуральной среде CD СНО. Для получения в качалочные колбы объемом 500 мл высевают 400 млн клеток НЕК293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугируют в течение 5 мин в режиме 210 g, супернатант замещают предварительно подогретой средой CD СНО в количестве 20 мл. Векторы экспрессии смешивают в 20 мл среды CD СНО до конечного количества ДНК 200 мкг. После добавления 540 мкл раствора PEI перемешивают в вортексе в течение 15 сек и затем инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки перемешивают с раствором ДНК/PEI, переносят в качалочную колбу объемом 500 мл и инкубируют в течение 3 ч при 37°C в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После завершения инкубирования добавляют 160 мл среды F17 и клетки культивируют в течение 24 ч. Через сутки после трансфекции добавляют 1 мМ вальпроевой кислоты и 7% Feed 1. Через 7 суток культивирования супернатант собирают для очистки центрифугированием в течение 15 мин в режиме 210 g, раствор стерилизуют фильтрацией (фильтр с порами 0,22 мкм) и азидом натрия до конечной концентрации 0,01% мас./об. и хранят при 4°C. Секретированный белок очищают от супернатантов культур клеток аффинной хроматографией, используя белок А. Супернатант загружают в колонку HiTrap ProteinA HP (объем колонки =5 мл, фирма GE Healthcare), уравненную 40 мл 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 7,5. Несвязанный белок удаляют промыванием, по меньшей мере, в 10 объемах колонки 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 7,5. Целевой белок элюируют 20 объемами колонки в градиенте, начиная с 20 мМ цитрата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 7,5 до 20 мМ цитрата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 2,5. Раствор белка нейтрализуют добавлением 1/10 0,5 М фосфата натрия, рН 8. Целевой белок концентрируют и фильтруют перед загрузкой в колонку HiLoad Superdex 200 (фирма GE Healthcare), уравненную 20 мМ гистидином, 140 мМ раствора хлорида натрия, рН 6,0. Концентрацию образцов очищенного белка определяют путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент мольной экстинции, рассчитанный на основе последовательности аминокислот.
Чистоту и молекулярную массу молекул анализируют с помощью анализа CE-SDS при наличии восстановителя или в его отсутствии. Систему Caliper LabChip GXII (фирма Caliper lifescience) используют по инструкциям производителя. Для анализа используют 2 мкг образца. Совокупное содержание образцов антител анализируют с использованием аналитической эксклюзионной колонки TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh) в подвижном буфере 25 мМ К2НРО4, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлориде L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN3, рН 6,7 при 25°C.
Figure 00000044
Figure 00000045
Пример 37. Связывание 16D5 ТСВ и 9D11 ТСВ и их соответствующих вариантов CD3-дезамидированных вариантов N100A и S100aA с CD3-экспрессирующими клетками Jurkat.
Связывание 16D5 ТСВ и соответствующих CD3-дезамидированных вариантов 16D5 ТСВ N100A и 16D5 ТСВ S100aA и 9D11 ТСВ и дезамидированных вариантов 9D11 ТСВ N100A и 9D11 ТСВ S100aA с CD3 человека оценивают на CD3-экспрессирующих иммортализованных Т-лимфоцитах (клетки Jurkat). Вкратце, клетки собирают, подсчитывают, проверяют жизнеспособность и ресуспендируют в количестве 2×106 клеток/мл в буфере FACS (100 мкл ФСБ с 0,1% БСА). По 100 мкл клеточной суспензии (содержащей 2×106 клеток) инкубируют в круглодонном 96-луночном планшете в течение 30 мин при 4°C с разными концентрациями биспецифических антител (от 686 пМ до 500 нМ). После двух стадий промывки холодным ФСБ с 0,1% БСА образцы повторно инкубируют в течение дополнительных 30 мин при 4°C с РЕ-конъюгированным AffiniPure F(ab')2 Fragment goat anti-human IgG Fcg Fragment Specific вторичным антителом (фирма Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170). После двукратной промывки образцов холодным ФСБ с 0,1% БСА немедленно проводят анализ методом FACS, используя систему проточной цитометрии FACS CantoII (фирма Software FACS Diva). Кривые связывания получают, используя программу GraphPadPrism6 (фиг. 28А-Б).
Результаты показывают пониженное связывание дезамидированных вариантов N100A и S100aA с CD3 по сравнению с родительскими антителами 16D5 ТСВ (фиг. 28А) и 9D11 ТСВ (фиг. 28Б).
Пример 38. Уничтожение Т-клетками клеток SKov-3 и НТ-29, индуцированное 16D5 ТСВ и 9D11 ТСВ, а также их CD3 дезамидированными вариантами N100A и S100aA.
Уничтожение Т-клетками, опосредованное 16D5 ТСВ и соответствующими CD3 дезамидированными вариантами 16D5 ТСВ N100A и 16D5 ТСВ S100aA, а также 9D11 ТСВ и дезамидированными вариантами 9D11 ТСВ N100A и 9D11 ТСВ, оценивают на клетках SKov-3 (средний уровень FolR1) и НТ-29 (низкий уровень FolR1). МКПК человека применяют в качестве эффекторов и уничтожение определяют через 24 ч инкубирования с биспецифическими антителами. Вкратце, целевые клетки собирают раствором Trypsin/EDTA, промывают и помещают с плотностью 25000 клеток/лунку в плоскодонные 96-луночные планшеты. Клетки оставляют для прикрепления на ночь. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получают центрифугированием в градиенте плотности Histopaque обогащенных лимфоцитами препаратов (светлых слоев кровяного сгустка), полученных от здоровых людей-доноров. Свежую кровь разводят стерильным ФСБ и наслаивают поверх градиента плотности Histopaque (фирма Sigma, номер в каталоге Н8889). После центрифугирования (в режиме 450 g, 30 мин, комнатная температура) плазму поверх МКПК-содержащей интерфазы выбрасывают и МКПК переносят в новую пробирку фалькон, которую затем заполняют 50 мл ФСБ. Смесь центрифугируют (в режиме 400 g, 10 мин, комнатная температура), супернатант выбрасывают и осадок из МКПК дважды промывают стерильным ФСБ (стадии центрифугируют в режиме 350 g, 10 мин). Получаемую популяцию МКПК просчитывают автоматически (в анализаторе ViCell) и хранят в среде RPMI1640, содержащей 10% ФСТ и 1% L-аланил-L-глютамин (фирма Biochrom, К0302) при 37°C, 5% CO2, в инкубаторе для клеток до дальнейшего использования (не больше 24 ч). Для анализа уничтожения антитело добавляют в указанных концентрациях (диапазон 0,01 пМ - 10 нМ в трех повторах). МКПК добавляют к целевым клеткам при конечном соотношении Е:Т=10:1. Уничтожение целевых клеток оценивают через 24 ч инкубирования при 37°C, 5% СО2, путем количественной оценки LDH, высвобождаемой в супернатанты клеток апоптическими/некротическими клетками (набор для обнаружения LDH, фирма Applic Science Roche, номер в каталоге 11 644 793 001). Максимального лизиса целевых клеток (=100%) достигают путем инкубирования целевых клеток с 1% Triton Х-100. Минимальный лизис (=0%) относится к целевым клеткам, совместно инкубируемым с эффекторными клетками без биспецифической конструкции.
Результаты показывают, что на клетках SKov-3 уничтожение, вызванное CD3 дезамидированными вариантами 16D5 ТСВ N100A и 16D5 S100aA, сравнимо с уничтожением, которое индуцируется 16D5 ТСВ (фиг. 29А). То же справедливо для 9D11 ТСВ и соответствующих вариантов 9D11 ТСВ N100A и 9D11 5 ТСВ S100aA (фиг. 29Б). На клетках НТ-29 с низким уровнем экспрессии FolR1 вариант S100aA показывает пониженную эффективность по уничтожению, которую в случае 16D5 ТСВ (фиг. 30А), а также 9D11 ТСВ (фиг. 30Б). Величины ЕС50, связанные с анализом уничтожения, рассчитывают с применением GraphPadPrism6 и приводят в табл. 35.
Figure 00000046
Пример 39. Получение Mucin-1 Т-клеточных биспецифических конструкций, которые содержат общую легкую цепь.
Синтез гена
Требуемые генные сегменты синтезируют на фирме Geneart AG (Регенсбург, Германия) из синтетических олигонуклеотидов и продуктов ПЦР путем автоматизированного генного синтеза.
Получение и очистка антигена MUC1
Для получения антител с общей легкой цепью (common light chain - CLC) против домена «белка спермы морского ежа, энтерокиназы и агрина (sea urchin sperm protein, enterokinase and agrin - SEA)» муцина-1 человека (Mucin-1 - MUC1), синтезируют фрагмент ДНК, кодирующий домен SEA (база данных Uniprot, Р15941, аминокислоты 1041-1151). Ранее был описан процесс предотвращение аутопротеолиза SEA между позициями G1097 и S1098 (Ligtenber с соавт., 1992). Связанный с клеткой эпизиалин является комплексом, содержащим два белка, полученных из общего предшественника. J Biol Chem 267, 6171-6177. Parry с соавт., Biochem Biophys Res Commun 283, 715-720, инсертировали четыре дополнительных остатка глицина между G1097 и S1098. Эта инсерция приводит к ослаблению конформационного стресса, а белок остается интактным. Фрагмент ДНК инсертируют в рЕТХХ, индуцибельный бактериальный вектор экспрессии. Полученная в результате плазмида экспрессирует домен SEA с С-концевой меткой avi и меткой His6 (SEQ ID NO: 47). Хотя метку avi применяют для биотинилирования in vivo, опосредуемого BirA, для очистки используют метку His6 (SEQ ID NO: 47).
500 мл культуры инокулируют бактериальным штаммом BL21 D3, трансформированным соответствующей плазмидой и плазмидой, экспрессирующей BirA, и индуцируют 1 мМ IPTG при OD600 0,8. Затем культуры инкубируют при 25°C в течение ночи и собирают центрифугированием. Бактериальный осадок ресуспендируют в 25 мл реагента для экстракции белков BugBuster® (фирма Millipore) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре согласно описанию в протоколе. После центрифугирования в течение 20 мин в режиме 16000 g супернатант фильтруют и загружают в колонку IMAC (His gravitrap, фирма GE Healthcare). Колонку промывают 40 мл промывного буфера (500 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 20 мМ NaH2PO4 рН 7,4). После элюирования колонки (500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, 20 мМ NaH2PO4 рН 7,4), элюат повторно забуферивают, используя колонки PD10 (фирма GE Healthcare).
Отбор связующих домена anti-human MUC1 SEA из библиотек CLC Fab
Отбор MUC1 человека против домена SEA осуществляют с применением Е. coli-производного и биотинилированного in vivo MUC1. Антигены ферментативно биотинилируют путем совместной экспрессии биотин-лигазы Bir А через С-концевую метку avi. Циклы пэннинга осуществляют в растворе по следующей схеме: 1. связывание фагмидных частиц библиотек CLC со 100 нМ биотинилированного антигенного белка в течение 0,5 ч в общем объеме 1 мл, 2. захват биотинилированного антигена и присоединение специфически связывающегося фага путем добавления 5,4×107 покрытых стрептавидином магнитных гранул в течение 10 мин, 3. промывка гранул 5×1 мл ФСБ/Tween 20 и 5×1 мл ФСБ, 4. элюция фаговых частиц путем добавления 1 мл 100 мМ триэтиламина (triethylamine - TEA) в течение 10 мин и нейтрализация добавлением 500 мкл 1М 1М Tris/HCl рН 7,4, 5. Повторное инфицирование клеток Е. coli TG1 в логарифмической фазе роста фаговыми частицами в супернатанте, инфицирование хэлперным фагом VCSM13 и последующее осаждение PEG/NaCl фагмидных частиц, которые будут использоваться в последующих циклах отбора. Выделение проводят на протяжении 3 циклов, используя либо постоянные, либо уменьшающиеся (от 10-7 М до 2×10-9 М) концентрации антигена. Во втором цикле захват комплексов антиген : фаг осуществляют, используя планшеты с нейтравидином вместо гранул стрептавидина. Специфические связующие идентифицируют методом ELISA следующим образом: по 100 мкл 50 нМ биотинилированного антигена 50 нм вносят в лунки планшета с покрытием из нейтравидина. Вносят Fab-содержащие бактериальные супернатанты, и связывание Fab выявляют по меткам Flag с использованием анти-Flag/HRP вторичного антитела. Домены VH клонов, проявляющих существенные сигналы относительно фона, подвергают предварительному отбору для секвенирования (58D6 VH, 106D2 VH, 110А5 VH) и последующих исследований. Все клоны происходят из последовательности зародышевой линии IGHV3-23 (фиг. 31). Следует отметить, что клон 58D6 и 110А5 происходят из библиотеки, которая была рандомизирована только по CDR3, хотя клон 106D2 был идентифицирован из библиотеки, рандомизированной по всем трем CDR. Позиции в CDR1 и 2, которые отклоняются от последовательности зародышевой линии, печатаются курсивом. Все варианты VH были экспрессированы в комбинации с одной и той же общей легкой цепью (общая легкая цепь VL).
Очистка Fab
Для точного анализа кинетических параметров Fab очищают от бактериальных культур (последовательность белка вариабельных доменов тяжелых цепей для 58D6 VH, 106D2 VH, 110А5 VH, все клоны экспрессируют один и тот же вариабельный домен CLC, последовательность которого представлена в перечне как SEQ ID NO: 31). Для каждого клона 500 мл культуры инокулируют бактериями, содержащими соответствующую фагмиду, и индуцируют 1 мМ IPTG при оптической плотности при длине волны 600 нм (ОП600), равной 0,9. Затем культуры инкубируют при 25°C в течение ночи и собирают центрифугированием. После инкубирования ресуспендированных пеллет в течение 20 мин в 25 мл буфера РРВ (30 мМ Tris-HCl рН8, 1 мМ EDTA, 20% сахароза) бактерии снова центрифугируют и супернатант отбирают. Эту стадию инкубирования повторяют один раз с 25 мл 5 мМ раствора MgSO4. Супернатанты обеих стадий инкубирования объединяют, фильтруют и загружают в колонку IMAC (His gravitrap, фирма GE Healthcare). Затем колонку промывают 40 мл промывочного буфера (500 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 20 мМ NaH2PO4, рН 7,4). После элюирования (500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, 20 мМ NaH2PO4, рН 7,4) элюат повторно забуферивают с использованием колонок PD10 (фирма GE Healthcare). Кинетические параметры очищенных Fab затем изучают с помощью SPR-анализа (система Proteon XPR36, фирма BioRad) в ряду разбавления, который варьируют от 100 нМ до 6,25 нМ.
Определение аффинности с помощью SPR, используя биосенсор ProteOn XPR36 фирмы BioRad
Аффинность (KD) отобранных клонов Fab измеряют поверхностным плазмонным резонансом с использованием прибора ProteOn XPR36 (фирма Biorad) при 25°C с биотинилированным антигеном MUC1, иммобилизованным на чипах NLC, путем захвата нейтравидином. Иммобилизация рекомбинантных антигенов (лиганд): антигены разбавляют ФСБТ (10 мМ фосфат, 150 мМнатрия рН 7,4, 0,005% Твин 20) до 10 мкг/мл, затем вводят со скоростью 30 мкл/мин при изменяющемся времени контакта для достижения уровней иммобилизации около 200 единиц ответа (RU) в вертикальной ориентации. Инъекция аналитов: для измерений одного события кинетики направление впрыска заменяют на горизонтальную ориентацию, серию двукратных разбавлений очищенного Fab (диапазон изменения концентрации между 100 и 6,25 нМ) вводят одновременно со скоростью 50 мкл/мин по отдельным каналам 1-5, со временем ассоциации 250 или 300 сек и временем диссоциации 300 сек. Буфер (ФСБТ) вводят по шестому каналу, чтобы обеспечить «встроенный» пробел для контроля. Константы скорости ассоциации (kon) и константы скорости (koff) рассчитывают с использованием простой один-к-одному модели связывания Ленгмюра и программного обеспечения ProteOn Manager v3.1 путем одновременной установки сенсорных диаграмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (KD) рассчитывают в виде соотношение koff/kon. Регенерацию проводят в горизонтальной ориентации с использованием 10 мМ глицина, рН 1,5, при скорости потока 100 мкл/мин и времени контакта 30 сек. Три клона специфически связываются с MUC1 (фиг. 32А), но не к «встроенному» пробелу, демонстрируя специфичность таких связующих. Кинетические и термодинамические данные всех измерений суммированы в фиг. 32Б.
Клонирование, экспрессия и описание на основе MUC1
Все Fab, проявляющие специфическое связывание с MUC1, с помощью SPR конвертируют в биспецифический формат Т-клеток (T-cell bispecific - ТСВ). Для этого ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК VH-доменов тяжелой и легкой цепей инсертируют в рамку в обе Fc-содержащие цепи Ig, необходимые для получения ТСВ (фиг. 33). Экспрессия цепочки антитела управляется промотором MPSV, а транскрипция терминируется синтетической сигнальной последовательностью полиА, расположенной ниже по цепи от CDS. В дополнение к кассете экспрессии каждый вектор содержит последовательность EBV oriP для автономной репликации в EBV-EBNA экспрессирующих линиях клеток. Получаемые конструкции ДНК совместно экспрессируют в комбинации с CLC (клоном 58D6; клон 110А5) и очищают от супернатанта культуры клеток млекопитающих (клон 58D6: клон 110А5). Обобщение аналитических данных по двум биспецифическим антителам показано клонами на фиг. 34А и Б.
Анализ связывания MUC1-специфических ТСВ, используя биосенсор ProteOn XPR36 фирмы BioRad
Связывание полученных MUC1-специфических ТСВ измеряют поверхностным плазмонным резонансом с использованием прибора ProteOn XPR36 (фирма Biorad) при 25°C. Биотинилированный антиген MUC1 и несвязанный биотинилированный антиген иммобилизуют на чипах NLC путем захвата нейтравидином.
Иммобилизацию антигенов проводят согласно ранее описанному. Для измерений одного события кинетики направление впрыска заменяют на горизонтальную ориентацию, серию двукратных разбавлений очищенных конструкций (диапазоны концентраций варьируют от 30 до 1,88 нМ или от 100 до 6,25 нМ) вводят одновременно со скоростью 50 мкл/мин вдоль отдельных каналов 1-5, со временем ассоциации 120 сек и временем диссоциации до 600 сек. Буфер (ФСБТ) вводят по шестому каналу, чтобы обеспечить «встроенный» пробел для контроля.
Регенерацию осуществляют в горизонтальной ориентации, используя 10 мМ глицин, рН 1,5 при скорости тока 100 мкл/мин на протяжении времени контакта 30 сек. Три клона специфически связываются с MUC1 (фиг. 35), но не со «встроенным» пробелом, демонстрируя специфичность таких связующих. Из-за эффекта авидности бивалентного формата ТСВ наблюдают очень сильное связывание с MUC1. Напротив, не установлено связывания с неродственным антигеном, что свидетельствует о специфическом связывании конструкций ТСВ.
Пример 40. Получение анти-ВСМА антител.
1.1: Получение антигенов и реагентов-инструментариев
1.1.1: Рекомбинантный растворимый внеклеточный домен человека human ВСМА
Внеклеточные домены ВСМА человека, макака крабоеда и мыши, которые использовались в качестве антигенов для селекции фаговым дисплеем, временно экспрессируют в качестве N-концевого мономерного гибрида Fc в клетках НЕК EBNA и in vivo сайт-специфически биотинилируют посредством совместной экспрессии биотинлигазы BirA при последовательность распознавания avi-метки, расположенной на С-конце участка Fc, несущего рецепторную цепь (цепь выступа Fc). Внеклеточные домены ВСМА человека, макака крабоеда и мыши включают от метионина 4 до аспарагина 53, от метионина 4 до аспарагина 52 и от аланина 2 до треонина 49, соответственно. Их гибридизируют с N-конца с шарниром IgG1 человека, обеспечивая гетеродимеризацию с негибридизированной частью FcIgG1 человека (цепь с впадиной) с помощью технологии выступ-впадина.
Для выделения внеклеточного домена ВСМА применяют следующие праймеры:
Figure 00000047
, инкорпорируя сайт BamH1 (жирный шрифт, подчеркивание) и обратный праймер
Figure 00000048
праймер
Figure 00000049
и обратный праймер
Figure 00000050
включая сайт рестрикции HindIII (жирный шрифт, подчеркивание) и консенсусную последовательность Kozak, и обратный праймер
Figure 00000051
. Синтез гена также может быть применен для получения внеклеточного домена ВСМА.
1.2: ВСМА-экспрессирующие клетки в качестве инструментов
1.2.1: Линия клеток миеломы, экспрессирующих на своей поверхности ВСМА
Экспрессию ВСМА оценивают на четырех линиях клеток миеломы человека (NCI-H929, RPMI-8226, U266B1 и L-363) методом жидкостной цитометрии. Клетки NCI-H929 ((Н929) ATCC® CRL-9068™) культивируют в 80-90% среде RPMI-1640 с 10-20% инактивированной нагреванием ФСТ, которая может включать 2 мМ L-глутамин, 1 мМ пируват натрия и 50 мкМ меркаптоэтанол. Клетки RPMI-8226 ((RPMI) ATCC® CCL-155™) культивируют в среде, содержащей 90% RPMI-640 и 10% инактивированной нагреванием ФСТ. Клетки U266B1 ((U266) ATCC® TIB-196TM) культивируют в среде RPMI-1640, модифицированной включением 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 4500 мг/л глюкозы и 1500 мг/л натрия бикарбоната и 15% инактивированной нагреванием ФСТ. Линию клеток L-363 (фирма Leibniz Institute DSMZ - German collection of microorganisms and cell cultures; DSMZ No. ACC 49) культивируют в 85% RPMI-1640 и 15% инактивированной нагреванием ФСТ. Вкратце, клетки собирают, промывают, подсчитывают количество жизнеспособных клеток, ресуспендируют, вносят в количестве 50000 клеток/лунку 96-луночного круглодонного планшета и инкубируют с антителом против ВСМА человека (фирма Abeam, #ab54834, IgGl мыши) в количестве мкг/мл в течение 30 мин при 4°C (для предотвращения интернализации). IgGl мыши применяют в качестве контроля изотипа (фирма BD Biosciences, #554121). Затем клетки центрифугируют (5 мин в режиме 350 g), дважды промывают и инкубируют с FITC-конъюгированным анти-мышиным вторичным антителом в течение 30 мин при 4°C. В конце инкубирования клетки центрифугируют (5 мин в режиме 350 g), дважды промывают буфером FACS, ресуспендируют в 100 мкл буфера FACS и исследуют в устройстве CantoII с программным обеспечением FACS Diva. Относительная количественная оценка числа рецепторов ВСМА на поверхностной мембране клеточных линий миеломы Н929, U266B1, RPMI-8226 и L-363 оценивают с помощью анализа QIFIKIT (фирма Dako, #К0078, по инструкциям производителя). Клетки Н929 экспрессируют ВСМА человека с наивысшей плотностью, доходящей до от 3,8- до 27-кратного превышения по сравнению с другими клеточными линиями миеломы. Н929 рассматривают в качестве линии клеток, экспрессирующих BCMAhi, по сравнению с U266, которая является клетками миеломы с умеренным или низким уровнем экспрессии ВСМА, и RPMI-8226 и L363, которые являются миеломы с низким уровнем экспрессии ВСМА. Табл. 36 суммирует относительное число рецепторов ВСМА на поверхности клеток разных линий множественной миеломы человека.
Figure 00000052
1.3. Получение связующих ВСМА in vitro, рекомбинантная библиотека
1.3.1. Конструкция общей легкой цепи библиотек Fab
Получают библиотеки антител в формате Fab на основе легкой цепи гуманизированного анти-CD3 антитела. Разнообразие было внедрено только в тяжелую цепь. Используют шесть различных каркасных областей тяжелой цепи: VH1-46, VH1-69, VH3-15, VH3-23, VH4-59 и VH5-1. CDR 1, 2 и 3 рандомизируют и каждую библиотеку тяжелой цепи комбинируют с нерандомизированной легкой цепью. Библиотеки создают согласно описанию в статьях Nissim с соавт., EMBO J., 13(3), 1994, 692-698, и Silacci с соавт., Proteomics. 5(9), 2005, 2340-2350.
1.3.2. Выбор клонов анти-ВСМА Fab.
Анти-ВСМА Fab устанавливают с помощью фагового дисплея из синтетических библиотек Fab, состоящих из одной константной последовательности VL и шести разных VH последовательностей человека.
Figure 00000053
Циклы отбора (биопэннинг) проводят в растворе по следующей схеме: 1) предварительная очистка ~1012 частиц фагмид на библиотечный пул в иммунотрубках, покрытых 10 мкг/мл неродственного IgG человека, для истощения библиотек антител, распознающих Fc-часть антигенов; 2) инкубирование фагмидных частиц, не связывающих Fc, с 100 нМ биотинилированного ВСМА в течение 0,5 ч в присутствии 100 нМ неродственной небиотинилированной конструкции Fc выступ-во-впадину для дальнейшего истощения Fc-связующих в общем объеме 2 мл; 3) захват биотинилированного ВСМА и специфическое связывание фага путем разделения и переноса реакции пэннинга в 16 лунок планшета для микротитрования с предварительно нанесенным покрытием нейтравидина или стрептавидин в течение 20 мин на шейкере; 4) промывка соответствующего лунок 10-30х ФСБ/Tween20 и 10-30х ФСБ с использованием устройства для промывки планшетов; 5) необязательную стадию конкурентной промывки путем добавления 230 нМ APRIL мыши для вытеснения клонов Fab, которые распознают сайт связывания природного лиганда, таким образом выбирая для APRIL-неконкурирующие фаговые антитела; 6) элюирование фаговых частиц добавлением 125 мкл 100 мМ TEA (триэтиламин) на лунку в течение 5-10 мин и нейтрализация путем добавления равного объема 1М Tris/HCl рН 7,4; 7) повторное инфицирование клеток Е. coli TG1 в логарифмической фазе роста элюированными частицами фага, инфицирование хэлперным фагом VCSM13, инкубирование на шейкере при 30°C в течение ночи и последующее осаждение PEG/NaCl фагмидных частиц, которые будут использоваться в следующем цикле отбора. Отбор проводили в течение 3-5 циклов с использованием постоянных концентраций антигена 100 нМ. Помимо стадий отбора, в ходе которых в качестве антигена используют только ВСМА человека, проводят дополнительные стадии отбора, в ходе которых также используют ВСМА макака крабоеда и мыши в качестве иных образцов, отличных от ВСМА человека, для отбора антител с перекрестной реакционной способностью. Кроме того, в качестве альтернативы захвату на основе стрептавидина на планшетах осуществляют захват антиген-фаговыми комплексами путем добавления 5,4×107 покрытых стрептавидином магнитных гранул для реакции пэннинга с последующими стадиями промывки, используя соответствующие магниты в описанных выше условиях.
Специфические связующие идентифицируют скринингом методом поверхностного плазмонного резонанса супернатантов Fab-содержащих бактериальных культур, используя биосенсор BioRad ProteOn XPR36. Вкратце, после инфицирования клеток Е. coli TG1 в логарифмической фазе роста элюированными частицами фага, высевают и получают клоны из колониеобразующих единиц (КОЕ), которые пересевают для инокуляции 1 мл экспрессирующих культур в 96-луночных планшетах. Fab захватывают из супернатантов на чип ProteOn GLM, который дериватизирован 8000-10000 RU козьего против IgG человека, F (ab') 2-фрагмент-специфического поликлонального антитела (продукт goat anti-human IgG, F(ab')2 fragment specific polyclonal antibody, фирма Jackson ImmunoResearch, номер в каталоге 109-005-006) в вертикальной ориентации. Затем ВСМА человека, макака крабоеда и мыши, а также несвязывающуюся конструкцию Fc выступ-во-впадину впрыскивают в качестве исследуемых веществ в горизонтальной ориентации. Клоны, которые проявляют существенные связывающие реакции в отношении ВСМА и которые не связывают Fc-часть антигенов, экспрессируют в бактериях в 0,5 л культуральной среды, затем проводят аффинную очистку и кинетическое описание методом SPR, используя протокол однократной кинетики на биосенсоре BioRad's ProteOn XPR36.
Пример 41. Анализ связывания ВСМА: поверхностный плазмонный резонанс
Оценку связывания анти-ВСМА антител с рекомбинантным ВСМА методом поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance - SPR) проводят следующим образом. Все эксперименты SPR осуществляют на приборе Biacore Т200 при 25°C с подвижным буфером HBS-EP (0,01 М HEPES рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% сурфактант Р20; фирма Biacore, Фрайбург/Германия). Определяют авидность взаимодействия между анти-ВСМА антителами и рекомбинантным ВСМА Fc(kih) (человека, макака крабоеда и мыши) (табл. 38-40). Биотинилированные рекомбинантные ВСМА Fc(kih) человека, макака крабоеда и мыши непосредственно присоединяют к чипу SA по инструкциям производителя (фирма Biacore, Фрайбург Германия). Уровень иммобилизации варьирует от 80 до 120 RU. Анти-ВСМА антитела пропускают в диапазоне 4-кратных концентраций (от 1,95 до 500 нМ) со скоростью тока 30 мкл/мин через проточные кюветы на протяжении 120 сек. Мониторинг диссоциации осуществляют в течение 180 сек. Различия в индексах величин преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в результате анализа контрольной проточной кюветы. Для этого анти-ВСМА антитела пропускают поверх ранее активированной и дезактивированной пустой поверхности, о чем написано в стандартном наборе для связывания амина.
Кинетические константы рассчитывают, используя программное обеспечение Biacore Т200 Evaluation Software (v 1.0, фирма Biacore AB, Уппсала, Швеция), для установления уравнений скорости для 1:1 связывания Ленгмюра путем численного интегрирования, несмотря на бивалентность взаимодействия для целей сравнения.
Figure 00000054
Figure 00000055
Figure 00000056
Также определяют аффинность взаимодействия между анти-ВСМА антителами или антителами CLMA-TCB CLC и рекомбинантным ВСМА Fc (kih) человека. Антитело против Fab человека (фирма GE Healthcare) непосредственно соединяют с чипом СМ5 при рН 5,0, используя стандартный набор для связывания амина (фирма Biacore, Фрайбург, Германия). Уровень иммобилизации составляет примерно 6500 RU. Анти-ВСМА-антитело или ВСМА-ТСВ CLC антитело захватывают в течение 90 сек при 25 нМ. Рекомбинантный ВСМА Fc человека (kih) пропускают в диапазоне 4-кратной концентрации (от 1,95 до 500 нМ) с потоком 30 мкл/мин через проточные кюветы в течение 120 или 180 сек. Диссоциацию контролируют в течение 120 или 400 сек. Различия в индексах величин преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в контрольной проточной кювете. В самом деле, рекомбинантный ВСМА двигается над поверхностью с иммобилизованным антителом против Fab человека, но на которую инъецировали HBS-EP, а не анти-ВСМА-антитело или ВСМА-ТСВ CLC-антитело. Кинетические константы получают, используя программное обеспечение Biacore Т200 Evaluation Software (v 1.0, Biacore AB, Уппсала, Швеция), чтобы соответствовать уравнениям скорости связывания по модели Ленгмюра 1:1 путем численного интегрирования (табл. 41).
Figure 00000057
Figure 00000058
Пример 42. Получение двухвалентного анти-ВСМА IgG антитела с общей легкой цепью.
Чтобы проверить гипотезу о том, что использование общей легкой цепи может быть применено к каким-либо антителам ВСМА, получают бивалентное антитело ВСМА 83A10-CLC путем замещения нативной легкой цепи бивалентного антитела 83А10 ВСМА, ранее описанного в WO/2014/122143, с общей легкой цепью (CD3 LC (CLC)). Анти-ВСМА-антитело, содержащее две тяжелые цепи 83А10 и две общие легкие цепи, получают с использованием общих методов получения бивалентных антител IgG согласно описанию в разделе «Материал и общие методы». Аффинность антитела IgA 83A10-CLC к ВСМА человека измеряют с помощью SPR методами, подобными описанным в примере 41. В табл. 42 показывают связывание рекомбинантного ВСМА Fc человека (kih) с антителом 83A10-CLC ВСМА IgG.
Figure 00000059
Пример 43. Специфический тест антител анти-ВСМА IgG к huTACI-R и huBAFF-R.
В качестве представителей суперсемейства TNF-TNF-R рецепторы TACI и BAFF связаны с рецептором ВСМА с гомологией 22% и 18,5% во внеклеточном домене, соответственно. Поэтому эксперименты по связыванию методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) проводят для изучения специфичности антител анти-ВСМА IgG. Все эксперименты методом SPR выполняют на Biacore Т200 (фирма GE Healthcare) при 25°C с HBS-EP в качестве подвижного буфера (0,01 М HEPES рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% Surfactant Р20). Гибриды Fc с huBCMA, huBAFF-R и huTACI-R химически иммобилизуют с высоким уровнем иммобилизации (~5000 RU) в разных проточных каналах сенсорного чипа Biacore СМ5 при рН 5,0 с использованием стандартного набора для связывания амина (фирма GE Healthcare). Первоначально вводят инъекцией высококонцентрированные растворы (3 мкМ, растворенные в HBS-EP) анти-ВСМА IgG pSCHLI372, а также Ig-huTACI-R IgG или a-huBAFF-R IgG в качестве положительных контролей (время ассоциации: 80 сек, время диссоциации: 600 сек, поток: 30 мкл/мин), чтобы проверить, происходит ли связывание. Положительное связывание IgG-huTACI-R с huTACI-R, а также антитела a-huBAFFR IgG с huBAFF-R и анти-ВСМА IgG с huBCMA показывает, что все рецепторы все еще распознаются после иммобилизации. Для антител анти-ВСМА IgG, связывающихся с быстрыми константами кинетической скорости с huBAFF-R и/или huTACI-R, осуществляют тщательный анализ кинетического параметра с низкими уровнями иммобилизации (300 RU) на новом сенсорном чипе СМ5. Инъецируют антитела анти-ВСМА IgG в концентрациях от 3000 до 93,75 нМ (двукратное разведение в HBS-EP) (время ассоциации: 80 сек, время диссоциации: 300 сек, течение 30 мкл/мин) и образец (образцы) тестируют в двух повторах. Регенерацию также осуществляют, когда это возможно, то есть без быстрой и полной диссоциации. Кинетическую оценку взаимодействия антител анти-ВСМА IgG с huBAFF-R или huTACI-R проводят путем глобальной коррекции данных по модели взаимодействия 1:1, которая включает термин для массового переноса (Biacore Т200 evaluation Version 1.0). Также проводят исследование устойчивости состояния.
Из фиг. 37 следует, что кривая 1 соответствует сигналу контрольного канала, кривая 2 - каналу, в котором происходит связывание (канал связывания), и кривая 2-1 означает вычитаемый сигнал (канал связывания - контрольный канал), а это означает, что этот сигнал происходит из-за связывания. На фиг. 37 показано, что анализ связывания методом SPR устанавливает, что IgG pSCHLI372 не связывается с рецептором TACI человека. В качестве положительного контроля для связывания используют другой ВСМА IgG, о котором известно, что он слабо связывается с рецептором TACI, но с очень быстрым включением и выключением (данные не показаны).
Пример 44. Получение и очистка антител, включающих ВСМА-ТСВ CLC Fc (2+1).
Для получения биспецифических антител осуществляют временную экспрессию биспецифических антител за счет совместной трансфекции на основе полимера соответствующих векторов экспрессии млекопитающих в клетках HEK293-EBNA, которые совместно культивируют в суспензии. За сутки до трансфекции клетки HEK293-EBNA высевают в количестве 1,5 миллионов жизнеспособных клеток/мл в среду Ex-Cell, обогащенную 6 мМ L-глутамином. Центрифугируют таким образом, что в каждом мл конечного полученного объема содержится 2,0 миллионов жизнеспособных клеток (5 мин в режиме 210 g). Супернатант отсасывают и клетки ресуспендируют в 100 мкл среды CD СНО. ДНК для каждого мл конечного объема получают путем смешивания 1 мкг ДНК (соотношение полученное биспецифическое антитело : тяжелая цепь : модифицированная тяжелая цепь : легкая цепь : модифицированная легкая цепь =1:1:2:1; соотношение стандартное антитела : тяжелая цепь : легкая цепь = 1:1) в 100 мкл среды CD СНО. После добавления 0,27 мкл раствора PEI (1 мг/мл) смесь встряхивают в течение 15 сек и оставляют при комнатной температуре в течение 10 мин. Через 10 мин ресуспендированные клетки и смесь ДНК/PEI объединяют и затем переносят в соответствующий контейнер, который помещают во встряхивающее устройство (37°C, 5% CO2). После 3 ч инкубирования 800 мкл среды Ex-Cell, обогащенной 6 мМ L-глутамина, 1,25 мМ вальпроевой кислоты и 12,5% Pepsoy (50 г/л), добавляют к каждому мл конечного полученного объема. Через 24 ч добавляют 70 мкл питательного раствора для каждого мл конечного полученного объема. Через 7 суток или когда жизнеспособность клеток равна или ниже 70%, клетки отделяют от супернатанта центрифугированием и стерилизующей фильтрацией. Антитела очищают на стадии аффинной хроматографии и дочищают с помощью стадии эксклюзионной хроматографии. Для стадии аффинной хроматографии супернатант загружают в колонку с белком A (HiTrap Protein A FF, 5 мл, фирма GE Healthcare), уравновешенную 6 объемами колонки (cv) 20 мМ фосфатом натрия, 20 мМ цитратом натрия, рН 7,5. После стадии промывки тем же буфером антитело элюируют из колонки 20 мМ фосфатом натрия, 100 мМ хлоридом натрия, 100 мМ глицином, рН 3,0. Фракции с требуемым антителом немедленно нейтрализуют 0,5 М фосфатом натрия, рН 8,0 (1:10), объединяют и концентрируют центрифугированием. Концентрат стерилизуют фильтрованием и далее обрабатывают методом эксклюзионной хроматографии.
Для стадии эксклюзии концентрированный белок закалывают в колонку ХК16/60 HiLoad Superdex 200 (фирма GE Healthcare) и 20 мМ гистидина, 140 мМ хлорида натрия, рН 6,0, с или без Tween20 в качестве буферной смеси. Фракции, содержащие мономеры, объединяют, концентрируют центрифугированием, стерилизуют фильтрацией и помещают в стерильный флакон.
Определение концентрации антител проводят путем измерения поглощения при 280 нм с использованием теоретического значения абсорбции 0,1% раствора антитела. Это значение основывают на аминокислотной последовательности и рассчитывают с помощью программного обеспечения GPMAW (фирма Lighthouse data). Чистоту и содержание мономеров в конечном белковом препарате определяют с помощью системы CE-SDS (Caliper LabChip GXII system (фирма Caliper Life Sciences)) относительно ВЭЖХ (TSKgel G3000 SW XL аналитическая эксклюзионная колонка (фирма Tosoh)) в буфере 25 мМ фосфате калия, 125 мМ натрия хлориде, 200 мМ моногидрохлориде L-аргинина, 0,02% (масса/объем) азида натрия, рН 6,7.
Фиг. 38А-В представляет графики CE-SDS (без восстановления (верхние панели) и с восстановлением (нижние панели)) конечных белковых препаратов после стадии аффинной хроматографии с белком А (РА) и стадии очистки методом эксклюзионной хроматографии (SEC) (фиг. 38A) pSCHLI333-TCB CLC, (фиг. 38В) pSCHLI372-TCB CLC, (фиг. 38С) pSCHLI373-TCB CLC. Стадии очистки аффинной хроматографией РА и SEC, примененных к pSCHLI333-TCB CLC антителу, приводят к чистоте 89,2% и 100% по содержанию мономеров (фиг. 38А), чистоте 88,5% и 100% по содержанию мономеров для pSCHLI372-ТСВ CLC антитела (фиг. 38Б) и чистоте 91,8% и 100% содержания мономеров для антитела CLSC pSCHLI372-TCB (фиг. 38Б).
В табл. 43 суммированы свойства pSCHLI333-TCB CLC, pSCHLI372-TCB CLC, и pSCHLI373-TCB CLC антител после аффинной хроматографии РА и очистки SEC. Во всех ВСМАТСВ CLC антителах последовательно достигают >88% чистоты и 100% содержание мономеров. Общие результаты наглядно демонстрируют, что преимущества в методах получения/очистки могут быть достигнуты с использованием общей легкой цепи (common light chain - CLC) в антителах ТСВ и что только две стадии очистки (т.е. аффинная РА хроматография и SEC) необходимы для достижения уже высококачественных белковых препаратов с очень хорошими свойствами.
Figure 00000060
Пример 44. Связывание ВСМА-ТСВ CLC антител с ВСМА-положительными линиями клеток множественной миеломы.
Методом жидкостной цитометрии ВСМА-ТСВ CLC антител (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373) исследуют связывание с ВСМА человека на BCMAhi-экспрессирующих клетках Н929. MKN45 (линия клеток аденокарциномы желудка человека, которая не экспрессирует ВСМА) применяют в качестве отрицательного контроля. Вкратце, культивируемые клетки собирают, подсчитывают и оценивают жизнеспособность клеток с использованием ViCell. Затем жизнеспособные клетки доводят до концентрации 2×106 клеток на мл в БСА-содержащем окрашивающем буфере FASS Stain Buffer (фирма BD Biosciences). Затем по 100 мкл полученной клеточной суспензии вносят в лунки круглодонного 96-луночного планшета и инкубируют с 30 мкл антител CLC-TCB CLC или соответствующего ТСВ контроля в течение 30 мин при 4°C. Все антитела CLC-TCB CLC (и контроль ТСВ) титруют и анализируют в конечном диапазоне концентраций от 0,12 до 500 нМ. Затем клетки центрифугируют (5 мин, режим 350 g), промывают 120 мкл/лунку окрашивающим буфером FACS Stain Buffer (фирма BD Biosciences), ресуспендируют и инкубируют в течение дополнительных 30 мин при 4°C с конъюгированным с флуорохром-конъюгированным РЕ15 конъюгированным AffiniPure F(ab')2 фрагментом козьего против IgG человека Fc специфического фрагмента (fluorochrome-conjugated РЕ15 conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment goat anti-human IgG Fc Fragment Specific; фирма Jackson Immuno Research Lab, номер в каталоге 109-116-170).
Затем клетки дважды промывают окрашивающим буфером Stain Buffer (фирма BD Biosciences), фиксируют с использованием 100 мкл фиксирующего буфера BD на лунку (фирма BD Biosciences, номер в каталоге 554655) при 4°C в течение 20 мин, ресуспендируют в 120 мкл буфера FACS и анализируют с использованием BD FACS CantoII. На фиг. 39А-Б показано, что средняя интенсивность флуоресценции CLMA-TCB CLC антител построена в зависимости от концентрации антител; (фиг. 39А) CLCHLI372-TCB CLC и pSCHLI373-TCB CLC на клетках Н929; (фиг. 39Б) pSCHLI372-TCB CLC и pSCHLI373-TCB CLC на клетках MKN45. Антитела CLMA-TCB CLC (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373) не связываются с ВСМА-отрицательными и CD3-отрицательными клетками MKN45 при концентрациях ниже 100 нМ. Если есть применимость, рассчитывают ЕС50 с использованием программного обеспечения Prism GraphPad (фирма LaJolla, Калифорния, США) и значений ЕС50, обозначающих концентрацию антитела, необходимую для достижения 50% максимального связывания для связывания анти-ВСМА/анти-CD3 ТСВ антител с клетками Н929 (табл. 44).
Figure 00000061
Пример 45. Связывание ВСМА-ТСВ CLC антител с CD3-положительными линиями Т-клеток Jurkat (метод жидкостной цитометрии).
ВСМА-ТСВ CLC антитела (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373) также анализируют методом жидкостной цитометрии для выяснения их связывания с CD3 человека, экспрессированной на Т-клетках лейкоза человека Jurkat (ATCC TIB-152). Т-клетки Jurkat культивируют в среде RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием ФСТ. Вкратце, культивируемые клетки собирают, подсчитывают и оценивают жизнеспособность с использованием ViCell. Затем концентрацию жизнеспособных клеток корректируют до 2×106 клеток на мл в окрашивающем буфере FASS Stain Buffer (фирма BD Biosciences), содержащем 0,1% БСА. Затем по 100 мкл полученной клеточной суспензии вносят в лунки в круглодонном 96-луночном планшете. По 30 мкл ВСМА-ТСВ CLC антител или соответствующего ТСВ контроля добавляют в лунки с клетками для получения конечных концентраций от 0,12 нМ до 500 нМ. ВСМА-ТСВ CLC антитела и контрольный IgG применяют в равной молярности. После инкубирования в течение 30 мин при 4°C клетки центрифугируют (5 мин, в режиме 350 g), дважды промывают 150 мкл/лунку БСА-содержащего буфера FASS Stain Buffer (фирма BD Biosciences), затем клетки фиксируют, используя 100 мкл фиксирующего буфера BD (фирма BD Biosciences, норма в каталоге 554655) при 4°C в течение 20 мин, ресуспендируют в 120 мкл буфера FACS и анализируют с использованием BD FACS CantoII.
Связывание ВСМА-ТСВ CLC антител с Т-клетками оценивают и определяют среднюю интенсивность флуоресценции, исходящую от CD3-экспрессирующих Т-клеток Jurkat, которую наносят на график.
Фиг. 40А-Б показывают среднюю интенсивность флуоресценции для ВСМА-ТСВ CLC антител (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373), связывающихся с Т-клетками Jurkat (фиг. 40А) или клетками MKN45 (фиг. 40Б), представленную на графике в зависимости от концентрации антител. Значения ЕС50 и максимальное связывание анти-ВСМА/анти-CD3 ТСВ антител с CD3-положительными Т-клетками Jurkat не были достигнуты. Контрольное антитело изотипа не связывается с Т-клетками Jurkat, а ВСМА-ТСВ CLC антитела (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373) не связываются с ВСМА-отрицательными и CD3-отрицательными клетками MKN45 в концентрациях ниже 100 нМ.
Пример 46. Активация Т-клеток человека при связывании ВСМА-ТСВ CLC антител с CD3-положительными Т-клетками и ВСМА-положительными линиями клеток множественной миеломы.
ВСМА-ТСВ CLC антитела (pSCHLI372, pSCHLI373) исследуют методом жидкостной цитометрии на способность индуцировать активацию Т-клеток путем оценки экспрессии на поверхности маркера ранней активации CD69 или маркера поздней активации CD25 на CD4+ и CD8+ Т-клетках в присутствии или в отсутствие клеток ММ, экспрессирующих ВСМА человека. Вкратце, ВСМА-положительные клетки Н9-29 собирают с помощью буфера для диссоциации клеток, подсчитывают и проверяют на жизнеспособность. Концентрацию жизнеспособных клеток доводят до 0,3×106 клеток/мл модифицированной среды RPMI-1640, по 100 мкл этой клеточной суспензии переносят пипеткой в лунки круглодонного 96-луночного планшета (согласно указанному). По 50 мкл (разведенных) ВСМА-ТСВ CLC антител добавляют в лунки с клетками до конечной концентрации 0,012 пМ - 100 нМ. Эффекторные МКПК человека выделяют из свежей крови здорового донора и доводят до концентрации 6×106 (жизнеспособных) клеток/мл модифицированной среды RPMI-1640. По 50 мкл этой клеточной суспензии вносят в лунки планшета для получения итогового соотношения Е:Т МКПК к клеткам опухоли миеломы 10:1. Чтобы проанализировать, способны ли ВСМА-ТСВ CLC антитела специфически активировать Т-клетки в присутствии целевых клеток, экспрессирующих ВСМА человека, были включены в исследование лунки, которые содержат от 3 до 10 нМ соответствующих молекул антител, а также РВМСМКПК, но не целевые клетки. После 48 ч инкубации при 37°C, 5% CO2, клетки центрифугируют (5 мин, режим 350 g) и дважды промывают 150 мкл/лунку ФСБ, содержащим 0,1% БСА. Поверхностное окрашивание для CD4 (IgG1 мыши, K; клон RPA-T4), CD8 (IgG1 мыши, K; клон HIT8a, BD # 555635), CD69 (IgG1 мыши, клон L78, BD # 340560) и CD25 (IgG1 мыши, K, клон М-А251, BD # 555434) осуществляют при 4°C в течение 30 мин в соответствии с рекомендациями поставщика.
Клетки дважды промывают 150 мкл/лунку ФСБ, содержащим 0,1% БСА, и фиксируют в течение 15 мин при 4°C, используя 100 мкл/лунку фиксирующего буфера (BD #554655). После центрифугирования образцы ресуспендируют в 200 мкл/лунку ФСБ, содержащего 0,1% БСА, и исследуют с помощью проточного цитофлуориметра FACS Canto II (программное обеспечение Software FACS Diva). На фиг. 41 показан уровень экспрессии маркера ранней активации CD69 и маркера поздней активации CD25 на CD4+ и CD8+ Т-клетках через 48 ч инкубирования (репрезентативные результаты двух независимых экспериментов). pSCHLI372-TCB CLC и pSCHLI373-TCB CLC антитела индуцируют повышение регуляции маркеров активирования CD69 и CD25 в зависимости от концентрации и специфически в присутствии МКПК-положительных целевых клеток. Не наблюдают активирования CD4+ и CD8+ Т-клеток в случае обработки МКПК человека контрольным антителом DP47-TCB, подтверждая, что несмотря на связывание с CD3 на Т-клетках, активация Т-клеток не происходит, когда антитело ТСВ не связывается с ВСМА-положительными целевыми клетками.
Пример 47. Перенаправление Т-клеточной цитотоксичности BCMAhi - экспрессирующих клеток миеломы, индуцированное анти-ВСМА/анти-CD3 Т-клеточными биспецифическими антителами (колориметрическая оценка высвобождения LDH).
ВСМА-ТСВ CLC антитела (pSCHLI372, pSCHLI373) также анализируют по способности индуцировать опосредованный Т-клетками апоптоз в клетках ММ с высоким уровнем экспрессии ВСМА при сшивании конструкции через связывание антигенсвязывающих частей молекул с ВСМА на клетках. Вкратце, ВСМА человека-экспрессирующие целевые клетки множественной миеломы Н929 собирают с помощью буфера для диссоциации клеток, промывают и ресуспендируют в среде RPMI, обогащенной 10% фетальной сыворотки теленка (фирма Invitrogen). Примерно 30000 клеток на лунку высевают в круглодонный 96-луночный планшет, и соответствующие разведения конструкции добавляют до требуемой конечной концентрации (в трех повторах); конечные концентрации находятся в диапазоне от 0,12 пМ до 100 нМ. Для соответствующего сравнения все ТСВ конструкции и контроли корректируют до такой же молярности. В лунки добавляют совокупные Т-клетки человека (эффектор) для получения конечного соотношения Е:Т=5:1. Когда МКПК человека используют в качестве эффекторных клеток, используют конечное соотношения Е:Т=10:1. Группы отрицательного контроля представлены только эффекторными или целевыми клетками. В качестве положительного контроля для активации сортируемых Т-клеток человека используют 1 мкг/мл РНА-М (фирма Sigma, номер в каталоге L8902). Для нормализации определяют максимальный лизис целевых клеток Н929 MM (=100%) путем инкубирования целевых клеток с Triton Х-100 в конечной концентрации 1%, индуцирующей гибель клеток. Минимального лизиса (=0%) достигают совместным инкубированием целевых клеток только с эффекторными клетками, то есть без какого-либо биспецифического антитела Т-клеток. После 20-24 ч инкубирования при 37°C, 5% CO2, высвобождение LDH из апоптических/ некротических целевых клеток ММ в супернатант измеряют с помощью набора для обнаружения LDH (фирма Roche Applied Science) по инструкциям производителя. Процент высвобождения LDH наносят на график относительно концентраций ВСМА-ТСВ CLC антител в кривых зависимости реакции от концентрации. Значения ЕС50 измеряют с использованием программного обеспечения Prism (фирма GraphPad) и определяют в виде концентрации ТСВ антитела, которая приводит к 50% максимальному высвобождению LDH. На фиг. 42А-Б показано, что ВСМА-ТСВ CLC антитела, pSCHLI372-TCB CLC (фиг. 42А, Б) и pSCHLI373-TCB CLC (фиг. 42Б), индуцируют зависящее от концентрации уничтожение ВСМА-положительных клеток Н929 миеломы по данным измерения высвобождения LDH. Уничтожение клеток Н929 специфично, поскольку контрольное антитело DP47-TCB, которое не связывается с ВСМА-положительными целевыми клетками, не индуцирует высвобождение LDH 30 даже при самой высокой исследованной концентрации 100 нМ. Таблица 45 суммирует величины ЕС50 для перенаправления уничтожения Т-клетками ВСМА-положительных клеток U266, индуцированного ВСМА-ТСВ CLC антителами.
Figure 00000062
Пример 48. Перенаправленная цитотоксичность Т-клеток BCMAmed/lo-экспрессирующих клеток миеломы U266. индуцированных антителами ВСМА-ТСВ CLC (анализ высвобождения LDH).
ВСМА-ТСВ CLC-антитела (pSCHLI372, pSCHLI373) анализируют по способности индуцировать опосредованный Т-клетками апоптоз в BCMAmed/lo-экспрессирующих клетках ММ при перекрестном сшивании конструкции через связывание антигенсвязывающих частей молекулы с ВСМА на клетках. Вкратце, human BCMAmed/lo-экспрессирующие целевые клетки множественной миеломы U266 собирают буфером для диссоциации клеток, промывают и ресуспендируют в среде RPMI, обогащенной 10% фетальной сыворотки теленка (фирма Invitrogen). Примерно 30000 клеток на лунку высевают в круглодонный 96-луночный планшет и соответствующее разведения конструкции добавляют до требуемой конечной концентрации (в трех повторах); конечные концентрации находятся в диапазоне от 0,12 пМ до 100 нМ. Для соответствующего сравнения все ТСВ конструкции и контроли корректируют до такой же молярности. В лунки добавляют совокупные Т-клетки человека (эффектор) для получения конечного соотношения Е:Т=5:1. Когда МКПК человека используют в качестве эффекторных клеток, используют конечное соотношения Е:Т=10:1. Группы отрицательного контроля представлены только эффекторными или целевыми клетками. В качестве положительного контроля для активации Т-клеток человека используют 1 мкг/мл РНА-М (фирма Sigma, номер в каталоге L8902). Для нормализации определяют максимальный лизис целевых клеток ММ (=100%) путем инкубирования целевых клеток с Triton Х-100 в конечной концентрации 1%, индуцирующей гибель клеток. Минимального лизиса (=0%) достигают совместным инкубированием целевых клеток только с эффекторными клетками, то есть без какого-либо биспецифического антитела Т-клеток. После 20-24 ч инкубирования при 37°C, 5% СО2, высвобождение LDH из апоптических/ некротических целевых клеток ММ в супернатанте измеряют с помощью набора для обнаружения LDH (фирма Roche Applied Science), по инструкциям производителя. Процент высвобождения LDH наносят на график относительно концентраций ВСМА-ТСВ CLC антител в кривых зависимости реакции от концентрации. Значения ЕС50 измеряют с использованием программного обеспечения Prism фирма (GraphPad) и определяют в виде концентрации ТСВ антитела, которая приводит к 50% максимальному высвобождению LDH. Табл. 46 суммирует значения ЕС50 для перенаправленного уничтожения Т-клетками ВСМА-положительных клеток U266, индуцированного ВСМА-ТСВ CLC антителами.
Figure 00000063
Аминокислотные последовательности вариантов осуществления настоящего изобретения
1) Связующие FolR, применимые в формате общей легкой цепи, вариабельной тяжелой цепи
Figure 00000064
Figure 00000065
Figure 00000066
2) CD3 связующий общей легкой цепи (common light chain - CLC).
Figure 00000067
3) CD3 связующий, тяжелая цепь.
Figure 00000068
Figure 00000069
4) Связующие MUC1, применимые в формате общей легкой цепи, вариабельной тяжелой цепи.
Figure 00000070
Figure 00000071
Figure 00000072
Figure 00000073
Figure 00000074
5) Связующие ВСМА, применимые в формате общей легкой цепи, вариабельной тяжелой цепи.
Figure 00000075
Figure 00000076
Figure 00000077
Figure 00000078
Figure 00000079
Figure 00000080
Figure 00000081
Figure 00000082
Figure 00000083
Figure 00000084
6) Не нацеливаемый DP47
Figure 00000085
Figure 00000086
7) Примеры целевых последовательностей.
Figure 00000087
8) Нуклеотидные последовательности примеров осуществления настоящего изобретения
Figure 00000088
Figure 00000089
Figure 00000090
Figure 00000091
Figure 00000092
Figure 00000093
Figure 00000094
Figure 00000095
Figure 00000096
Figure 00000097
Figure 00000098
Figure 00000099
Figure 00000100
Figure 00000101
Figure 00000102
Figure 00000103
Figure 00000104
Figure 00000105
Figure 00000106
Figure 00000107
Figure 00000108
Figure 00000109
Figure 00000110
Figure 00000111
Figure 00000112
Figure 00000113
Figure 00000114
Figure 00000115
Figure 00000116
Figure 00000117
Figure 00000118
9) Последовательности белков и нуклеиновых кислот дополнительной общей легкой цепи
Figure 00000119
Figure 00000120
10) Гуманизированные последовательности ДНК CD3 СН2527 (CDR/VH/VL)
Figure 00000121
Figure 00000122
Figure 00000123
Хотя в приведенном выше описании настоящее изобретение пояснено примерами и иллюстрациями для лучшего понимания, примеры и иллюстрации не следует рассматривать в качестве ограничения рамок охвата настоящего изобретения. Все цитируемые патенты и научные публикации упоминаются в настоящем изобретении в виде ссылок на их сущность.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ
<120> ОБЩИЕ ЛЕГКИЕ ЦЕПИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 32398
<140>
<141>
<150> EP 14194097.3
<151> 2014-11-20
<160> 273
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Thr Gly Gly Ser Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 3
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Ile Gly Ile Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Val Gly Val Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Phe Thr Val Leu Arg Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Ile Gly Val Val Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 8
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 9
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 10
Asn Tyr Tyr Ile Gly Val Val Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Trp Arg Arg Tyr Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 12
Gly Glu Trp Arg Arg Tyr Thr Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Trp Ile Arg Trp Glu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 14
Gly Gly Trp Ile Arg Trp Glu His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 16
Asn Ala Trp Met Ser
1 5
<210> 17
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 17
Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 18
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 18
Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 19
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 20
Pro Trp Glu Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 21
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ala Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 22
Pro Trp Glu Trp Ala Trp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 24
Pro Trp Glu Trp Ala Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 25
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Ser Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 26
Thr Gly Trp Ser Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Trp Ile Arg Tyr Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 28
Gly Glu Trp Ile Arg Tyr Tyr His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Trp Tyr Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 30
Val Gly Trp Tyr Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 31
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 32
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 32
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 33
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 34
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 35
<211> 215
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 35
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 36
<211> 125
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 36
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 37
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 37
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 38
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 38
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 39
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 39
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 228
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys
225
<210> 41
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<220>
<221> измененное свойство
<222> (1)..(50)
<223> /примечание = «Эта последовательность может включать
повторяющиеся единицы 1-10 'Gly Gly Gly Gly Ser',
причем некоторые положения могут отсутствовать»
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «См. правила подробного описания замещений и
предпочтительных вариантов осуществления»
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 42
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<220>
<221> измененное свойство
<222> (1)..(50)
<223> /примечание = «Эта последовательность может включать
повторяющиеся единицы 1-10 'Ser Gly Gly Gly Gly',
причем некоторые положения могут отсутствовать»
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «См. правила подробного описания замещений и
предпочтительных вариантов осуществления»
<400> 42
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 43
<211> 54
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<220>
<221> измененное свойство
<222> (5)..(54)
<223> /примечание = «Эта последовательность может включать
повторяющиеся единицы 1-10 'Ser Gly Gly Gly Gly',
причем некоторые положения могут отсутствовать»
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «См. правила подробного описания замещений и
предпочтительных вариантов осуществления»
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50
<210> 44
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический пептид»
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетическая метка 5×His»
<400> 45
His His His His His
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 46
Met Gln Ala Ser Ile Met Asn Arg Thr
1 5
<210> 47
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетическая метка 6×His»
<400> 47
His His His His His His
1 5
<210> 48
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 48
aagcttggat ccatgttgca gatggctggg cagtgctcc 39
<210> 49
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 49
gaattcgcgg ccgctcatcc tttcactgaa ttggtcacac ttgcattac 49
<210> 50
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 50
acgttagatc tccactcagt cctgcatctt gttccagtta ac 42
<210> 51
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 51
aacgttgcgg ccgctagttt cacaaacccc agg 33
<210> 52
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 52
gaattcaagc ttgccaccat gttgcagatg gctgggcagt gctcc 45
<210> 53
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 53
gaattctcta gattacctag cagaaattga tttctctatc tccgtagc 48
<210> 54
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Arg Gln Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Leu Phe Gly Tyr Trp Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 207
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 56
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 57
<211> 426
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 57
atgagctttt ttttcctgag ctttcatatt agcaacctgc agtttaatag cagcctggaa 60
gatccgagca ccgattatta tcaagaactg cagcgtgata tcagcgaaat gtttctgcag 120
atctataaac agggtggttt tctgggtctg agcaacatca aatttcgtcc gggtggtggc 180
ggtggttcag ttgttgtgca gctgaccctg gcatttcgtg aaggcaccat taatgttcat 240
gatgtggaaa cccagtttaa ccagtataaa accgaagcag caagccgtta taatctgacc 300
attagtgatg ttagcgtttc cgatgttccg tttccgttta gcgcacagag tgtcgacggt 360
ctgaatgata tttttgaagc ccagaaaatc gaatggcatg aactcgagca ccaccaccac 420
caccac 426
<210> 58
<211> 142
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид»
<400> 58
Met Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn
1 5 10 15
Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg
20 25 30
Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu
35 40 45
Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Val
50 55 60
Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His
65 70 75 80
Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg
85 90 95
Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro
100 105 110
Phe Ser Ala Gln Ser Val Asp Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
115 120 125
Lys Ile Glu Trp His Glu Leu Glu His His His His His His
130 135 140
<210> 59
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 59
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttgaa 300
tggtctactc tgctgtactt cgactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360
<210> 60
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Glu Trp Ser Thr Leu Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 61
<211> 348
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 61
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg gtttatgcaa tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt atttctgaaa ctggttctta cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgttacccg 300
tacggtttcg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagt 348
<210> 62
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 62
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Val Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Glu Thr Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Pro Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 63
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatactct 300
taccgttacg ttctggcttt cgactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360
<210> 64
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Ser Tyr Arg Tyr Val Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 65
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 65
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtccta 327
<210> 66
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 66
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 67
<211> 648
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 67
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtgctgcgt acgcaaccca aggctgcccc cagcgtgacc 360
ctgttccccc ccagcagcga ggaactgcag gccaacaagg ccaccctggt ctgcctgatc 420
agcgacttct acccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 480
gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 540
tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag agccacaggt cctacagctg ccaggtgacc 600
cacgagggca gcaccgtgga gaaaaccgtg gcccccaccg agtgctcc 648
<210> 68
<211> 216
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 68
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 69
<211> 2067
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 69
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttgaa 300
tggtctactc tgctgtactt cgactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020
agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 70
<211> 689
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Glu Trp Ser Thr Leu Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
<210> 71
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 71
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttgaa 300
tggtctactc tgctgtactt cgactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 72
<211> 450
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Glu Trp Ser Thr Leu Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 73
<211> 2067
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 73
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatactct 300
taccgttacg ttctggcttt cgactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020
agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 74
<211> 689
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Ser Tyr Arg Tyr Val Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
<210> 75
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 75
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatactct 300
taccgttacg ttctggcttt cgactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 76
<211> 450
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 76
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Ser Tyr Arg Tyr Val Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 77
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 77
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Val Gly Gln Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Tyr Pro Pro Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 79
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Arg Gln Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Leu Phe Gly Tyr Trp Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 80
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 80
Gly Tyr Met Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 81
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 81
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met Ile
1 5 10
<210> 82
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 82
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser Trp Met Asn
1 5 10
<210> 83
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 83
Trp Ile Tyr Pro Val Gly Gln Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 84
<211> 103
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 84
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 85
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 85
His Ile Arg Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 86
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 86
Thr Ile Arg Gln Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 87
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 87
Val Ser Tyr Pro Pro Ser His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 88
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 88
Gly Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 89
Gly Gly Leu Phe Gly Tyr Trp Asp Tyr
1 5
<210> 90
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 90
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 91
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 91
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 92
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 92
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 93
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 93
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 94
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 94
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 95
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 96
<211> 125
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 96
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 97
<211> 648
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (603)..(603)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 97
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatacca acgaacatta ttatacgttc 300
ggccagggga ccaaagtgga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 360
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600
canggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 648
<210> 98
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 98
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 99
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 99
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 100
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 100
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 101
<211> 215
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 101
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 102
<211> 688
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Val Gly Gln Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Tyr Pro Pro Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
245 250 255
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
260 265 270
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
275 280 285
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
325 330 335
Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
340 345 350
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
355 360 365
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
370 375 380
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
385 390 395 400
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
405 410 415
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
420 425 430
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
435 440 445
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
450 455 460
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
465 470 475 480
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
485 490 495
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
500 505 510
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
515 520 525
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
530 535 540
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
545 550 555 560
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
565 570 575
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
580 585 590
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
595 600 605
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
610 615 620
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
625 630 635 640
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
645 650 655
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
660 665 670
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680 685
<210> 103
<211> 449
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 103
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Val Gly Gln Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Tyr Pro Pro Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 104
<211> 642
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 104
caaggcttga ggtatgaaat aatctgtctc aatgaatatg caaataacct tagatctact 60
gaggtaaata tggatacatc tgggccctga aagcatcatc caacaaccac atcccttctc 120
tacagaagcc tctgagagga aagttcttca ccatggactg gacctggagg gtcttctgct 180
tgctggctgt agctccaggt aaagggccaa ctggttccag ggctgaggaa gggatttttt 240
ccagtttaga ggactgtcat tctctactgt gtcctctccg caggtgctca ctcccaggtg 300
cagctggtgc agtctggggc tgaggtgaag aagcctgggg cctcagtgaa ggtttcctgc 360
aaggcatctg gatacacctt caccagctac tatatgcact gggtgcgaca ggcccctgga 420
caagggcttg agtggatggg aataatcaac cctagtggtg gtagcacaag ctacgcacag 480
aagttccagg gcagagtcac catgaccagg gacacgtcca cgagcacagt ctacatggag 540
ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc gtgtattact gtgcgagaga cacagtgtga 600
gaaaccacat cctcagagtg tcagaaaccc tgagggagga gt 642
<210> 105
<211> 869
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 105
gcaggattta gggcttggtc tctcagcatc ccacacttgt acagctgatg tggcatctgt 60
gttttctttc tcatcctaga tcaggctttg agctgtgaaa taccctgcct catgcatatg 120
caaataacct gaggtcttct gagataaata tagatatatt ggtgccctga gagcatcaca 180
taacaaccac attcctcctc tgaagaagcc cctgggagca cagctcatca ccatggactg 240
gacctggagg ttcctctttg tggtggcagc agctacaggt aaggggcttc ctagtcctaa 300
ggctgaggaa gggatcctgg tttagttaaa gaggatttta ttcacccctg tgtcctctcc 360
acaggtgtcc agtcccaggt gcagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 420
tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct ggaggcacct tcagcagcta tgctatcagc 480
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gagggatcat ccctatcttt 540
ggtacagcaa actacgcaca gaagttccag ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc 600
acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 660
tgtgcgagag acacagtgtg aaaacccaca tcctgagagt gtcagaaacc ctgagggaga 720
aggcagctgt gccgggctga ggagatgaca ggggttatta ggtttaaggc tgtttacaaa 780
atgggttata tatttgagaa aaaaagaaca gtagaaacaa gtacatactc taattttaag 840
ataaatattc cattcaagag tcgtaatat 869
<210> 106
<211> 502
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (128)..(128)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 106
catggagttt gggctgagct ggattttcct tgctgctatt ttaaaaggtg atttatggag 60
aactagagag attaagtgtg agtggacgtg agtgagagaa acagtggata tgtgtggcag 120
tttctganct tagtgtctct gtgtttgcag gtgtccagtg tgaggtgcag ctggtggagt 180
ctgggggagg cttggtaaag cctggggggt cccttagact ctcctgtgca gcctctggat 240
tcactttcag taacgcctgg atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt 300
gggttggccg tattaaaagc aaaactgatg gtgggacaac agactacgct gcacccgtga 360
aaggcagatt caccatctca agagatgatt caaaaaacac gctgtatctg caaatgaaca 420
gcctgaaaac cgaggacaca gccgtgtatt actgtaccac agacacagtg aggggaggtc 480
agtgtgagcc cggacacaaa cc 502
<210> 107
<211> 514
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 107
gaactcacca tggagtttgg gctgagctgg ctttttcttg tggctaaaat aaaaggtaat 60
tcatggagaa atagaaaaat tgagtgtgaa tggataagag tgagagaaac agtggatacg 120
tgtggcagtt tctgaccagg gtttcttttt gtttgcaggt gtccagtgtg aggtgcagct 180
gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc 240
ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc cgccaggctc cagggaaggg 300
gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtagc acatactacg cagactccgt 360
gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa 420
cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg aaagacacag tgaggggaag 480
tcattgtgag cccagacaca aacctccctg cagg 514
<210> 108
<211> 200000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 108
tgttcttgcc tcttcccctg gggtagagtc ctcctgtttt ccccagttgt tccctcccac 60
agctctcaca atctctgttg gtgtccccat cttccagatc tgctgccatg acctgcagat 120
taaggctctg attccataag aaactgaggg gagctgcttc tcaatagatc tttgatgggg 180
acctctgttc ccatatcagt tcatgagggg ctgctccagt gccctaggat gctgattttc 240
atggcttgct cctgcagggt aatatctgag tttcatagtg ggaatcagag agttgggtct 300
ggatgcattt cagaagtgtg ggctctcatt ctctcccaga cagtcacttt gggaaggata 360
gattcttgtg actgtaaagg ttcttcaaga gaatagcaca actcttcagt atgttgtccc 420
ttagaatttc tcactacaac acgcttaaca cactcgactt caagcaatgc aatgtgtatt 480
tgtgctccat cttgtaatgg cctacgttga atacgacaga ctgtgcctca ggtaatttca 540
tatcttgact ttattactct gtacaagaac ttgcctctcc ctagatttca attttttttg 600
ttttaaacct tcagttatct gaagcattta ataaaatttg cgaacttcca tcttttctgt 660
ttatctgtta ttgctgatgt tattgtttta aaaataaata tatatttctc attcatgtac 720
atttttaagc tgagcagcat atttttaagt aaaacctgga ataataaaag aatccaaaca 780
tttttcagct gccccaaaaa aaccaaatta tggtaaatgt gttcactgga acactactca 840
tcacttataa taaatatatt tctggtacac agagcaacaa agaaaaatat ctaagtgttt 900
atgctgagta aaatacgcca gacaaataag aatatgtacc atattactcc atttatgcaa 960
tttcttttaa gtgaaaaaga atctaaagca atatccagaa gatcagtagt tacctggaaa 1020
aagggtagac caaaggaagg ggaaaggagg aaacttacag aagaacaaga gaaaatgttg 1080
aggggagttc acttgtccag cttggaaatg atgggttaca tcatgttgat caattgcaca 1140
ctttaaatat gtgaagtcta ttatctgcca attaacactc gcaaaattta ttgcaagcag 1200
acaaatgaaa aattagacag agagaggatg gtataaagat agaaaatata tattaaatgt 1260
cagaaatgtc tgagaattta actcctgacc ctagttccgt ccttattttt aggtgaatgg 1320
tagcgtgcac caaaatcaca cacattctca gtacaggaag tgggttccac aaagcacacg 1380
aggtatgtcc aattcttacc aagatttggt tcagggagta acagtgatga ggaatcacag 1440
gcccagatac cggggctcac tcatctcaga catgacctcg tggacacaca cttagcccct 1500
cctccatgtg taggttgact tccacatatg taaatggaga aaccattgac tcctacagaa 1560
cataatttac agaaatatac aaaagataaa atagtgcaaa tacttatcac aacaaaattt 1620
cctaataaga cagtgtattt tccaaatacc gtaattgtca cccaactcct gtggggccgt 1680
gtcattttat ctggggtctg ccgtctcctc aggattccca ccccagagct ctctatgtag 1740
taggagacaa gcaaataggg ccctccctct gctgctgaaa atcagccaaa tcctgaccct 1800
gcagctctgg gagaggagcc cccgccccgg gattcccagc tgtctccact tggtcatgaa 1860
cactgaacac agaagacaca ccatggagtc tgggctgagc tggattttcc ttgttgcagt 1920
tttaaaaggt gatttatgga gaatgagaca cactgagtgt gactggacat aagtgagaga 1980
aacagtggat ttgtgtggca gtttctgacc agggtgtctc cgtgtttgca ggtgtccagt 2040
gtgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttagtaaa gactggaggg gtctctgaga 2100
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc agtagctctg ctatgcactg ggtccaccag 2160
gctccaggaa agggtttgga gtgggtctca gttattagta caagtggtga taccgtactc 2220
tacacagact ctgtgaaggg ctgattcacc atctctagag acaatgccca gaattcactg 2280
tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgac gacatggctg tgtattactg tgtgaaagac 2340
gcagtgagaa gtcagtgtga gcccagacac aaacctcctg cagggtacct gggacaacca 2400
gggaaagcct gggacactgt atactgggct gtccccaggg gcaagtccag gtggtataag 2460
gctgggtttc ctgtcatggt ctagggttgc cttgttagca aattacccca gggaccatct 2520
ctagatttcc aattctgtaa taacatttga tgtcgtctct gactgcacaa tgtcccctca 2580
actttgtatc tttttttttt ttgtaacagg aggacacatc ctcaccctgc agaagcctga 2640
gtgtcacttt gggggcagaa atgacctgcc ttgatcacat tgatcactgt cctgaggaaa 2700
ataccccaca ggggaccccg atgactccag caaaggctct gcctcaaaac cattgaagag 2760
tccttccttt cattagaatt gaccacagca cctgggcttc agcacaagcc ataccacaga 2820
cgtcacaaag cagcagcttg acacctgatc caggtgcatt ttctcacctt tagaagctga 2880
gagaggggtg tactctcaag gtcaacacac tctttgtggg tttttacaca gaaaacctgg 2940
ttttacttta tttcatttga agataaatga acaaatgtgc atctataaat gattgtaatt 3000
ttcacattta ttccaattcc aatatttctg aattctgcat aatgtcctgg cacaaggttg 3060
tgttttctat aggtattttt caacagacca agaaaatgca ttttccaatt tccctgtttt 3120
tcctccatgt gcagagacct tgagtagagc acgtctgact gtgtttgtct gttttcacgc 3180
tgctgatgaa gacataccag agacgaggaa acttacaaca gaaagagttt tattggactt 3240
acagttccac gtggctggaa aggcctcaca atcatggtgg aaggtgaaag gcacatctga 3300
catggcggca gacaagagaa gagagcttgt gctgggtctc ccctttttaa aaccatcaga 3360
tctcatgaga ctcattcact attaagagaa cagtgcagga gagacacaac acccataact 3420
cagtcacctc ccactggtcc ctcccacaac attgagaatt atgggagtta cacataaaaa 3480
tgagatttga gtgaggacac atccgaccca tatcattcca ccgcaggttc cctcccaaat 3540
ctcacgtcct cacatttcaa aaccaatcat gccttcccaa cagctcccca aaggctaaac 3600
tcatttcatc attaacacag aagtccacag tacaacattt cacctgagac aaggcaagtc 3660
ctttccactt ataagcctgt aaattcaaaa gcaagttaca agcattgggt aaacacaccc 3720
attggaaatg acagaaattg cccataacaa aaagacccca tgcaagtcca aaatccagca 3780
gggcagtcaa atcataaagc tccacaatga tcacctgtaa ctccccttct cacatccggg 3840
acatgttgat gcaacaggtg agttcccatg gtcttgggca gctccacccc tgtggctttg 3900
cagggtacag cctccctcct ggctgctttc acaggctggt gttcagtgtc tgtggatttt 3960
ccaggcacaa agtgcaaact gtcagtggat ctaccattcc agggtctgga ggatagcagc 4020
cctcttctca cagctccact aggcagtgcc ccagtaggga ctctgtgtgg gagctcgggc 4080
cctatatttc ctttcctcac tgccgtagca gaggttcccc atgaatgagc caccactgca 4140
gccaacttgt gactggacat ccaggtgttt tcatacacct tctgaaatct aggcagaggt 4200
tctcaaaccc caattcttag cactctttcc ataatggttc atttttttgg cctgttcatt 4260
actggtattt ttcaaaggaa tctcacttga atctttactc ttttgcaatt tgtctccatg 4320
acaatgttgg gaagttttat ctccaccatc ataacatgat ctagtgatct cacacatttg 4380
tggcaaacaa tacctacaaa ttcagaagct ctttgctttt ctttccatga aatataattc 4440
tttctgttct gtgtataagc atatcttagc aaccctgcac acacccacat agatgtccac 4500
aagcctatga attattctct gtaaataaaa acttatatca atttccctca atgttcataa 4560
ttctcctgag tgtgaggaag ctccttctcg atctgttcaa acaaaatgcc cagagaccat 4620
ccggtaggta aggagttcac ctggctctgg tgtggggtct gtctctttcc ctctgttgtc 4680
ccacaggtca gcccagttgt tcaggtccta agaagaaagc ccaggtttgt cctgatttta 4740
aaacacttca aacttctgat gactctcctg ttacccacat ccatggagat agattattta 4800
ttatataatt caccaaacta atgtcaaatg tccaagttgc aataccgcac atcctagggt 4860
atgttcatgc aattcaatgg aggagaaagt ctttcagaga cagatggatc tgaaatgata 4920
aatatgtggg taaggactct ggacttgagt gtcattgtcc agccatgttg cacaagtgtg 4980
tcctgtcagg gaaggatcag agttccttgt gctctcagag ggaaggggtc acagagttcc 5040
tctctggttc ccaggaaagg taatcgcact aatcttcatg atcttcatga gactatcctc 5100
cagtgctgac ctgttataga gtttttgtct gaagttctca ctgcaatccc caatctacat 5160
attttcaatc agaagtgttt agaggccagg acacatcttc aaggtcacac attgagaagg 5220
atgtagatat gtcccactac cttctcctga gatctcagac agaatcccag atttcaaaag 5280
gacacagaag gacagctctc aggtgctttt aaaaaatgac ccacttccag ggacagggag 5340
cttccctata accatggtgg atgttctgaa ctacaataaa cattggatgg atccaggatt 5400
gtttgaagtc actgtcatta ttacattcag ctgctgtttc aatgtgtctg aagtagtaaa 5460
tgacaattta gatgacaatt tatatgaatc ttcaagggta gaacaatatt gaccatattc 5520
caaaatctgt ccttgatcca tgatcacact catctcccag accaggtcct tcagcacgtc 5580
tctttacctg aaagaagagg actctgggct tggagagggg agaccccaag aagacaactg 5640
agttctcaaa gggcacagcc agcatcctac tcccagggcg agcccaaaag actggggcct 5700
ccctcctcct ttttcacctc tccatacaaa ggcaccaccc acatgcaaat cctcacttaa 5760
gcacccacag gaaaccacca cacatttcct taaattcagg ttccagctca catgggaaat 5820
actttctgag agtcctggac ctcctgtgca agaacatgaa acatctgtgg ttcttccttc 5880
tcctggtggc agctcccaga tgtgagtatc tcagggatcc agacatgggg atatgggagg 5940
tgcctctgat cccagggctc actgtgggtc tctctgttca caggggtcct gtcccaggtg 6000
cagctgcagg agtcgggccc aggactggtg aagccttcgg agaccctgtc cctcacctgc 6060
actgtctctg gtggctccat cagtagttac tactggagct ggatccggca gcccccaggg 6120
aagggactgg agtggattgg gtatatctat tacagtggga gcaccaacta caacccctcc 6180
ctcaagagtc gagtcaccat atcagtagac acgtccaaga accagttctc cctgaagctg 6240
agctctgtga ccgctgcgga cacggccgtg tattactgtg cgagagacac agtgagggga 6300
ggtgagtgtg agcccagaca aaaacctccg tgcagggagg cggaggggac cggcgcaggt 6360
gctgctcagc gccagcaggg ggcgcgcggg gcccacagag caggaggccc ggtcaggagc 6420
aggtgcaggg agggcggggc ttcctcatct gctcagtggt ctccctcctc gccagcacct 6480
cagctgtccc caggggtcct ctttctttat tatctgtggt tctgcttcct cacattcttg 6540
tgccaagaaa gaaatgagga agacaaattt tcgtctgtag ttgaagtttc accaattact 6600
aggaactttc ctagaagttc ctgcatggcc cattatagct tacagattaa atatatatca 6660
agcttctcat ctcttgattt gtgtcatcaa ctgaattgtg ccctctttga aattcatatg 6720
cagaaacctt aaattcaatt gatgtatatt ggaattttaa tgaaataatt aaggttaaat 6780
gtggtcataa gtgtaagact ctaattcaac agacgtgtcg tctttataag aagaggaaga 6840
gacaccagag acctctcact tttcacgtgc aggcagagaa gaggccatgt ggagacgtaa 6900
tgcactagaa ggtggcccag tgcaagccag gaagaagcct caccaagaac caaccctgcc 6960
agaacattga tcttcaacat tcagactgca gaattttaag aaaatcaata tttgttgttt 7020
aagccaccca ctcctgttgt cttcttatga agatccagac agactaatac cacataactc 7080
tgttagcgct gtcccctgga tgcagaatca gcccgctggg gctgggcaca tctctcagat 7140
ttccacataa agtaggcaaa aaatagtagt tctgatataa aaatttgtca tgtccctgtt 7200
ggccaatttc tgggcaaggt cttttaaaga agccctgggg gctttgtcac aaaagttgcc 7260
ttttatcatt tattaggaca taactgatga acaatgagta ccagttggat ggagactgac 7320
cactgaccat cttctgctgt ctcctaagta tgccacagaa aaccacacca acattactct 7380
atgtcttcaa ctttctaaat ttgcactgat tggtatttaa ggcaggccca gcgttgaata 7440
actcctttag tttttgcttc tctgggaaag gtcttatcta tcctggcctt ggtcttcaag 7500
tttcagcaat tctgggaagc caaggacgcc tctatctcct cctccatgct ctgcaactca 7560
cctgagaaca gctttctcat tggaatgtct tctgtttaag gaataagagt ccctgtttca 7620
ggcttgggtg cctgagtaca cctactggat ccagcccagg attggagaaa ctttccagaa 7680
cacatcacct gagaaatgac cagtcacact gttacacttt cacaatttcc gcttcctcat 7740
gagaaaatta aaattgcaga gactttttca taagcgttgt gccatgtcct ttcttgtttt 7800
cttgcctgtt catttatgtc agaccaggtg ccacatctat gtaatcaggt tagaatcctg 7860
cctccagtaa cacatgaaaa ggacctatgg ttgtactttt ggtctttgct ccaaagtgta 7920
aagattacaa aagtcatcac cctcattctt atgccaagag tcatctgcac aatctgatct 7980
tcaatacatt ttagaatcca tcaaatgaat gaaattccat tttttaaatt accaccccaa 8040
aaactagaga gatgggcatg tccagaatag cagttgatgg ttgcttaact ggaagagaag 8100
tttcagaagc cacaagctgt tgaaggcact tacgtggtta gcactataga cgtctgcaag 8160
acagatgtgg actagggtga aatgacagtt ccagagggcc gcactctcct cagtcttctg 8220
gaatttccct ctagaaatct ccagaatcta aaaaatacaa tccaaatatg tttcctatgg 8280
gtcataactg gggaagttta attactgaaa aatataccag gagccttctc caaaagatcc 8340
tacagggaag aacttttcca gaacctcata ctatgtgaag ggaagaaaaa tctgcccatt 8400
ccagatccct ccccacttcc tccattatta tacaaatgag taaggttagc caatagggta 8460
agatgtaagc aaatagtcca gggaaactga agccacaaaa aggagtaaag atgaaaattc 8520
agcttttccc ctggagatgc ctggtcaagg tcacagccca gaaaaggaat ctgattgagt 8580
ctctaggttt ccatggtcag aacaagcagt gctgacccgc actgcacaat cctttctaac 8640
caggatgatg gctctggatt aaatatgaga gtgtgccaat gcacagtctc tgaggagaac 8700
atagggacac taaaaaagca atggcaggga gttagacaag gacagtagag caatatgaag 8760
cctctgacgt gaacattttt aaaaacaaga tcttggaaac tccctcattc acctcagctt 8820
cttttatcat gaagactttc caagattctt aactgagaca aagaaaataa caacctgcat 8880
gcacttccga agtctccgct tgtatcctgt ttgctttaga tctctaggag aaaaatgtca 8940
gacacctggg cctagtgtca atgtgggagg cactttctac agatgaggcg caagaaggaa 9000
gggaaaacgt gtgttattgg aatagtggat atgaagtgtg ctctcatctg aaagcatctg 9060
cacctgctgg aaatctcaga tgcaacattc aactgcaaga accaaggcac acccaaatct 9120
cctgtaagat tttggattca ttatccactg attcagtgca actggagctt cagagaaggg 9180
gctccctcct gtgtcatagc atccttgctt tgagttcatt agatttagta aggctaatca 9240
attgtttgaa gagatggtgt cagcagcgta tgctgtcact gaaggagtat tctaaaccag 9300
gacaaagcca tttcatgtta ggcgagggaa gctggcggaa aatgctttat gagccccaca 9360
ggaacttcct tgcaaggcaa gggctgggct ggagggggcg cgcaggaacc gcccagcaca 9420
ggttccatcc ccggaggggt gcacaggagg ctggggacga ggttccctct cagcgcctgt 9480
gtcttccttt ggcaacaaaa aaaatcctaa gtgttcaaga agttgctgat gtgtctttaa 9540
gtatcctgtt ccgtcagagc ctttcctata actgaaggca accagaactg tgttttaaag 9600
tcggttccga ggactgcaag tatcttaata gtgaggatat aaaggatagg aatggtttta 9660
ctaattgaaa ggatacagaa ttgtggggtt ccgaggactg caagtatctt aatagtgagg 9720
atataaagga taggaatggt ttcactaatt gaaaggatac agaattgtgg gagtcactat 9780
gttcctatga ataaaaaatt cagatttcag tgttaagtaa tgttgcctac attgtgtgag 9840
tgacagggca gtggtggatc tgagagtgtg gcaggtgcac agacctagtg agtcagaaat 9900
caatatggaa agatgaggat ctatggatat gaactgaaag taagtaaaca gttcatgaaa 9960
ttctattaaa tggagtagga aataaaaccc aaacttatcc aaaacacaaa ttccttggcg 10020
attattttgg gagcagtgag ttcatcagga accccaaact tctcttacgt cttctgattc 10080
ctgttgtcca tgagatgaga aattcagctc taattgtgca tcacagggca aatctgtaaa 10140
ccaggagtgt ttctattgag gatcatggtg gatcaggatt ccaggcaggt gctggagaca 10200
ctgtctcagg agcgcccaga tgatctcagg gggacctgct ggacactcac gtggaacatc 10260
agcagtcact ttctcagagt aaccagtgag ctgtgctggt gcctgatggg actaggatgg 10320
ggtcaaggca ccttctcagt gtcatggaga gtgattgttc cagaaatcat ccaggtggtc 10380
tctacgctaa tcaaatatgg gttcacaggg aggaacatgt gctctgggtg cttggtcttc 10440
agtgaaagga cgtctggcca ccaaaagttt gtaaatggag cagggcatgc atttcctcaa 10500
ggaggattag ggcttggagc atcagcatcc cactcttgta aggctgatgt gtcatttacc 10560
ttccctttct tatcccaaat cagggtcttc agctatgaaa tgctctgact catgaatatg 10620
caaataacct gagatgcact gaggtaaata tggatatttg tcagccctga gagcatcatc 10680
cagaaaccac atccctccgc tagagaagcc cctgacggca cagttcctca ctatggactg 10740
gatttggagg gtcctcttct tggtgggagc agcgacaggc aaggagatgc caagtcccag 10800
tgatgaggag gggattgagt ccagtcaagg tggctttcat ccactcctgt gttctctcca 10860
caggtgccca ctcccaaatg cagctggtgc agtctgggcc tgaggtgaag aagcctggga 10920
cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gattcacctt tactagctct gctatgcagt 10980
gggtgcgaca ggctcgtgga caacgccttg agtggatagg atggatcgtc gttggcagtg 11040
gtaacacaaa ctacgcacag aagttccagg aaagagtcac cattaccagg gacatgtcca 11100
caagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatccga ggacacggcc gtgtattact 11160
gtgcggcaga cacagtgtga aaacccacat cctgagagtg tcagaaacgc caggaaggag 11220
gcagctgtac tggcatggag gggatgacaa aggttattag attgaagatt ttcttagaaa 11280
acgacttcaa gtcattaaag aagaggaaca acataaatgt gtatttgtga aattttaatt 11340
gagagatttt tcatacaaca tttattctgt aagctatttc agggattgga atatgaatca 11400
aattaataaa gctgatatag acatcctctg aaggcatctt cgtaaacatc aatttctgaa 11460
tcagtgttgt aaatattttg gaacacagac acaagatcac atttttactc tacttttatc 11520
tctattttta aaaaatgcca aaaagaatct tattttgtgc atgccccatt ttgaattccc 11580
accgtcaatg catgatagtt cttggttttc ctcattcaag ttgtcatttg tcattaagag 11640
tgttgtgtgt tttaaccatt ctaataggtg agtaacggta tctaattttt atttaaatgc 11700
acatgtccct aaaaaattca tatttaacaa tttttatata atttttggtg agatgcctct 11760
cgtgatattt ggttcatttt ttaaatgcat tttttatcag ttgtaagtat gcttgcatat 11820
tgattataaa agtcatttaa caaattaaaa taattcattt aacaaatatg catcttggaa 11880
tttttttctc caagtctgca gttgtctttt actcccttat ccctgtgtat tgcagaaaaa 11940
tgtttgtgtg tgtgtgtgcc tgtgtatgta caaatttaga ttttaaaaat gtacattttt 12000
attcatttaa agatcatgtc tttggcagta tatctgaaat ctcattgtaa aagacacaat 12060
agtcattatt ttttccatgt ctctaatctt aggacacaat caactcatga gtgtttaacc 12120
ttccctacct gattggagga ctatccacct gagacatttg gaatacttct gtaaggagat 12180
gtgtccttcc cattatttct ttatttagtc atctattgat gttcctattg gtttatggat 12240
gtctatttca tactccgaag aagatccttg ttacattact tgttttattg ttcaaaacac 12300
cacagcttta ttaggtgctg ggagctcatt tagtttggat cctgcatcct tacagcacac 12360
ctcatctttt tgtttttaga catttccctg tttccaagta ttacaataaa ttctaagctt 12420
gttctctacg ttaccttttt tgtacataga atcagccatt tttctaaaga ctgctcgttt 12480
ttcatgttaa agaacagtat tgaaatttaa aaatgtgatc ctgggtatgt gtgttgttaa 12540
tgtggtatca gtacttcttc taggatatct ccaccaattg gcctagtaaa tgggcatgtt 12600
tataggaacc caagtttatg gacacatcga aactatttat gtatctaatc ctctgtaatg 12660
tgattacatt aaaaatgaga acacactggt gtctccatcc aactatgcta ccatatggat 12720
gtttccagcc ttccttccct cactgtccat aaccacccac tgcaaagtga ggaaccccat 12780
cccaccatat gccattttat tacttagctg cacaatttca ggacacatgc atagcagtat 12840
cagaaatgta aagctcgttg gaaacatgtt tatctactag aacagactgc ttatgtgcag 12900
tttctttaca ctgtaaactt atagaatttc ttcattttca aagttgctta ggtcagcaac 12960
ttcattttcc actctcctca gtgaagtcat ttcaatgaca atgtataatg tcatttattt 13020
gaaattcttt caaagccaaa actatagtcc ggtaaacata tagaggatat tcaaggaatt 13080
tagagagtgg gtataaaata agtaaaaatg gcactgttta agaagagtaa aattgttttt 13140
agtgatatac aatggttgag acacaacaca attaatttgg ctaagctcat acttttgtga 13200
cagaaaatat aaacctaaat atatacaatt tttgtaaaaa aactttagca gttcattaac 13260
cccagggtta aacaagactg tgtaaaatta tctaataact tatttgatga gggtggggat 13320
atcatgagac atatgcaaca aagaatgaag gcattttcct catttgcatg taagatgtta 13380
ccattcacta aagaccttta ataaaaaaaa atttctacgt gatccagtat ttttttcctt 13440
ctgtcaagca aataactcat aggattcttt tctttccttg gttgagaaag attttcctac 13500
aagcttcagc acacgtcagg catacactgt ccctgaatgg gcatttaccc tcagatgggt 13560
acacacacct gtcaacatgg gggctcttct gtcagacaaa cacaccttta ctcatgtgga 13620
ttcttccctc agacaaacac acatgtcccc acgtggactc tttcctcaga ttacaacatt 13680
tgtccttaca tttactattt cctcagaaaa cagacattgc atcatgtggt ctcttgtctc 13740
agacaagcaa acatgtcttc agtcagataa gtctgtggat ttccacattg actgtttcct 13800
tacacaagca cctatatcca atatttaact gttttgtgag aaatttatcc cttttctctg 13860
gaaatgtatt tttatgttct tactggacat attttttaat aatgtttggt actatgaaga 13920
tacccgaaca ctgtccatac gagagaataa gaaagagtaa taagcagatt aaccctgtgc 13980
atccagaccc aggagtcctt tgatcctgcc cttccgaaat ggagacacag aggaaggatg 14040
agcaatgctg agcagtgcac ccatgaccac aaaaggaaag acatggcaat gtgtcccctc 14100
ccctcctcat gaaaggcagc tcatcccctg ttccttcagg ccctggtgag gagccacccc 14160
atgtatattc ccttgatcag tgtccacacc atggggtctg cactgatctg ggcttccctt 14220
ctcatcaccc tcaatattag tgtcccttgt gaatcaggtc cagctgcggc tgttccacat 14280
ggggccgttc ttccatttcc tcagtgtttg cagaagtcct gtgtgaagtt tattgatgga 14340
gtcagaggca gaaaattgta cagcccagtg gttcactgag actctcctgc aaagcctctg 14400
atttcacctt tactggctac agcatgagct tggtccagca ggcttcatga cagggattgg 14460
tgtgggtgga aacagtgagt gatcaagtgg gagttctcag agttactctc catgagtaca 14520
aataaattaa cagtcccaag cgacaccttt tcatgtgcag tctaccttac aatgaccaac 14580
ctgaaagcca aggacaaggc tgtgtattac tgtgagggac acaggagagg gaatatctgt 14640
gtgagcccag acacaaaaat ctctgcagag agacaggagg gaactgcatg gtagatgctc 14700
ctcataacca caaaggggca gtcaggacca tcaggaggag ctcaggacac ctgggggtgc 14760
tcagaaccat gaggggtgct caggacatcg ggggctctca gaaccatgag gggtgctcag 14820
gacatcaggg ggctctcaga accaccaggg ggcgctcagg acacctgggg gcgctcagaa 14880
gcatcagggg tgctcaggat atcagagtgc cctcagtacc acgagggggc gctcatgaca 14940
ccaggggcac tcagaaccac cagggggggc tcagtacacg ggggttctct taggaagcag 15000
ctccacatca ggagcctgag aggctgtgat tgcgttttaa acctgggtga ttcccgacct 15060
ggtcaagaaa aagtctcccc caggatctct caccatttct tcttggtaat tccatgattt 15120
ttttttacct acaaaacatt aagttagaac agggatttaa ttcaactttt aattctgcag 15180
attttccgag taatagtagc aatgttccct caggacaatt tttaaaattg gctatttata 15240
tattttattt atgtaaaatg atactatctt gaaaatagta aaatttttaa aatcatacct 15300
ctaatcccag cactttagga ggttcgggca ggcagatcag ttgcgctcag gagttttaga 15360
acagcctggc aacacattta gatcttttcc atacaaaaag aaaaagaaaa agaaaatagc 15420
taggtgtggt gctacctctg gtaccagcta tttgaaagtc tgaggtggga ggatccctta 15480
agcctgggag gttgatgctg cagtgagctg tgattgtgcc actacactcc ggcctggttg 15540
acagagtgag accctttctt aaaaatacaa actgtttcaa taagtagagc tttgtgtctt 15600
tgtgctgtaa taatcagttg tatatatttt ctaactgtaa ctcagcatat gcatggtgtt 15660
ctgtttcttt ttctttcatt tgctgttggt ggaaattaaa cacctcttta aacgctcttg 15720
ttctcccctt tggttcgctt cgggtgtcct gtttaacaga ctatttcttc atcttccctt 15780
tttctttgaa agtctttttc tttctcagtt tccatgcagg ataaagaaag tccctttact 15840
ttctgtcctc caagtctggt gaacagctcc cttctcttca taaccactga agccaaccaa 15900
gtttaggagg ataacagctc tccttagaat atgctcgtct acctggagac tctctgccct 15960
cctcaccctt ttctagggtc ctgcacacat cacactcatc ccatcccctc ccttccctaa 16020
gtaccacaga gtgggctctg cagttcctgc ttccctgtgt gtgctcagcc ctggggctca 16080
ctagtgcttt gatgatgacg ttcaaatccc catgtgctta gactctctaa gaccaccctc 16140
taggaagatg ccattgtgag tgagtcctgg aaatcatggg ctgtgttcag tttcatattg 16200
ctggatcttc tctattttaa aggaatactg gcaattaaga ttagagtttg tattgaatat 16260
tcatgccaaa aaagttttct ttcaaaactt ttcaaataaa acaatttttc ctgcctagtt 16320
tgaaaactac aatgtaaatt caacaaataa tataatacaa ttttaaaggt gacgtttgtc 16380
ttattggtta ttcaatttat taaaaacaga agatatttaa aataaattcc attgcacatt 16440
taagtgatgt atttgacaag aatggcattt acatacattt ttaccaaaac acgtatttaa 16500
atatatttgt ctttttaata ttggtagagg cagacataca cgtagaaaag catcattttg 16560
tactacaatc tcaaactgta aacacaattt aaattcagtt aaataattag aataatatga 16620
aacaggccgg gcgtggtggc tcatgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaggcggg 16680
cggatcacga ggtcaggaga tcaagaccat tctggctaaa acggtgaaac cccgtctcta 16740
ctaaaaatac aaaaaattag ccgggcgcag tggcgggcgc ctgtagtccc agctacttgg 16800
gaggctgagg caggagaatg gcgtgaaccc gggaggcgga gcttgcagtg agccgagatc 16860
ccgccactgc actccagcct gggcgacaga gcgagactcc gtctcaaaaa aaaaaaaaaa 16920
aaaaaaaatg aaacaaatag gtgcgttgtt ttggtgttta gatatacatt cacttttgca 16980
tgggcacatg tatgtgtctt tgctgggctg ttgtgtatgt atgtgtgctt gtatgaccat 17040
caagttttca aatacatcat taaatttcat agttacattc gtcttggcca ggcacggagg 17100
ctcaggcctg taatcccagc attttgggag gcttaggcaa gcagatgact tggagttaag 17160
agttcaagac cagccttgtc aacatgccaa aaccccatct ctacgaaaaa tacaaaaatt 17220
agccaggtgt tgtggcacgt gcctttagtc ccagtgcgac agggaaatgc tgggtcagaa 17280
atcccacaca aagtctctac ttggttacca cctaatggaa ctgtaggaag aaagccacca 17340
tccttcagaa cccagaatgg tagatccact gacagcttgc acagtgtgcc tggaagagcc 17400
agaaacactc agtgacagcc catgagtgta gccagaaggg agattgtgcc ctgcaaagcc 17460
acaagggcag aactgtccaa gaccatggga acccaccagt tgcatccggt aacctggatt 17520
tgagacatgg agtcaaagaa gactattttg gaacgttaag atttgactgc ccagctggat 17580
ttcagacttg cacgtggcct gcagtttgga ccaatttctc ccatttgcaa tggctgtatt 17640
tacacaatgc ctgaaccccc attgtaccta ggaagtaact tgcttgtttt ttattttaca 17700
ggctcataga tggaagggag ttgccttgtc tcagaaaaga ccatgggctg tggacttttg 17760
agttggggct caaatgagtt aagacttcag gggcctgttg gaaagtcatg aatggttttg 17820
aaacgtaagg acattagatt taagaggcgc cagtgttgga atcatatggt ttggctgtgt 17880
ccctgcacaa atctcatctt gaattgtatc tcccacaatt cccacgtgtc gtgggagaaa 17940
cccagtggga ggtgattaaa tcatggaggg agttcttctt tgtgcgttat tgtgatagtg 18000
gatgactctc atgagatctg atggttttaa aaaacgggag ttccctgccc tctctttgtc 18060
tgctgccatc tccatgtaag ataaaacttg ctcctccttg ccttccacca tgatgtggag 18120
gcctcccaag ccatgtgtaa ctgtaagtcc attaaacttt ttcctctata aattactcag 18180
tctcatgtat gtctttatta gcagtgtgaa aacagactaa tacagcaaat atcaatctct 18240
taaaatattt tgttgttctg catgtaatat agcacagtct aatatgggag gtaaaataaa 18300
tcatccatgg accttcagat ataagtcata gggtaattat gcctgtgtcc ctgaaggagt 18360
gaactagagg ttatacacac tagtggcact acctttggca aagggtgttc aggggtttct 18420
gaaagttctg ataattttaa ttttaaaatt gaatttacta tgtatttctt catcaacctt 18480
tccagaagat ttttggcagt aagaacagcc tagtattgga gtaatactga tgaattagag 18540
agttattttg taattattct cctgagattt gcatgaatca attgatatag aagttcgtat 18600
gtcccaagtt gaaacatcag aatcaagaag gcttcatcac ccttaatggc tgtggttttt 18660
ggcaaggcag tacttcaatt cagccagaaa gagagacaac aataaaactt tcaaatgcag 18720
gggagtctga cctcagtctc tctctcttat aaaggcaaag gcaaagctgt gccacatcaa 18780
gatttttctt caagccttca gagtcaacat tgggaatgga aaagccaatc actttgtcct 18840
tagagaaggc gaagatctga gaggaatgca gagttgtgtt catgaaggtg atgacattgt 18900
tatttcttct cctttgccca gtgactgctt tcaagttgag tgtttcagat gtcagacctg 18960
acttataggg atggttgtga ctgcacgtgt ctgacagggg ctgagactct atatctctaa 19020
gtgtcctgtc ctaggagcag ctacaggagt cagccctaga ctggaagtgc cctcactgac 19080
cctctgcctc acctgtgcag cctctggcca gttgaagaaa gttttatccc tggaacatct 19140
tttgtcaaaa ccactccaac tagtattcat gacctatggt ccacaccctc aagtacacag 19200
acatgatcat gctatgactt ggtgtctaga agatccctgc acttttaatt ttacctctaa 19260
tattagactc cactttatca catgcggaca cagcagaata ttttaagact ttcatatgtt 19320
atgctgaaaa attcaatagt tcataaaagt ctacttccca tcactgccag tgtttactac 19380
tgagtaagga tctgccatcc cctagggagg aactataatg gatggtgtgc cctgttagtg 19440
gttatgggaa tgaatccatc ttgtggcaaa tggcagcatc ttcttgtttt gcaagattaa 19500
atagttttct atggtgtata aatacaacat tgtctttatc catttgtcta tctactgaca 19560
ctcagattgt ttccatatat tggctaagat taatagtgtt tcaataaaca taggattcaa 19620
ctatcttaac aaggtggtaa tttcatctgc tttgggtata tttctaaaag cagaatttct 19680
ggtcatataa catttccagt tttaattcat ttggtgcctt tatattgctt tccataattg 19740
tgaaaatata gagtggtata gccattatga aaaacagttt cagttttgag gtatgatcca 19800
taaacaaata atgtttgatt atggctctcc atgagaattt ctaataaata tgatagaagt 19860
caagaaagcg tctcacatta aagcaaggat taattttatc ccttactccc tcaaaagcaa 19920
aagattggaa gcatgcatga tggaggctgt tagcagggtt cagaatgata tcataaaagg 19980
aaactcagtt ggataaaaat gttgggcttt cagtcatagg tatgtcgata ctcaatatga 20040
aaccgcgaag tcaaatgagg atctagaatg tgttcacttg aaccaacagc acattctcag 20100
acgcacctat tgctgcatca caagggtgat gaacttttga aacaagtaaa gtgtgagtgc 20160
acagtaagtg ataaagttat cacctttaca tgaagtttgt tcaatatgcc aaaggcttgt 20220
acagattaat catacacaaa tatacacaat gtatttttgc atacacagat gtctagagga 20280
tgattctttt agggaaaatt cttcaggtca cagaaatctg tgtaagttgg aggtcccatg 20340
aaaaagtatc tctttataaa tactggtcta ttgctcaatt agggaaaatg atctctgttg 20400
gagaaagctt ccaatttggg agatttcttc attgcttctt gagttgtaag acatgaacca 20460
aaaaattgac tggagttttt tggagtttca tggctggagt ttcatggctg tgttgttaaa 20520
aatttcttat acggtttctt tcaattattt gagatcagtt tttctgattt ttttctccag 20580
tagataaatt ttcacaagat ctcaggaaac catgtctctg gtgctttagt ttgaaaaact 20640
aacttcctag gtaaagaagc ttctgtctaa ccatgatgag ctcatttctt ctgcatacca 20700
tgaagtttga gaccccattg tccagaatca tgaaaatttt acactccagt ttactgaaaa 20760
tcttgacttt gaatttaata ttgattggca ttgacaaaaa tggttcattc ttggatgtgt 20820
cctaagttgc tcacccaaca tatcagtgga ctgagaatct tccattagct ccctctgtcc 20880
atagcactga gtctattgac aatctttgca gtcctctatg aaggagagtc ctgaggttca 20940
tcagattctt gtagacactc agatgaacca aaggaattaa cggaattgag gactgccagc 21000
catttccaca acactaggaa taattaccat ctaagtgtaa aggtctacat cattcagaat 21060
accctgcatg acaggctgat gcaaaaaaaa atccaaccct gcagaggctt cacagcaacc 21120
ctcacagttc cttcagggaa gaaataatct ccaagttcag tgagtcagta aagctgttct 21180
gagctacagt aaacattgga ttgggcccag ttttgtctga gttcaatgtg attgttatac 21240
tcagctgctg atcctatatg gactgagtat ggataattta aatgagcctg gctgcgtggt 21300
ttgttatatg aaaacctgaa ctaaatataa ataaagggca tgtctggact agcatgaggg 21360
tgagagattc tgggagctcc acccccctta ctcttattgc cctttcctcc aggaacctcc 21420
aggtcctcag ggtgagaatc cacacagatc ccttcatggc tctattgcca ggagaccaaa 21480
tctctgataa aatcactcag accttcttca gacagacaac ccagggaaag ggcattttta 21540
cacccttatg tatgtgggga aaggtaatcc atacccatta gaagcccctg ccagcagcct 21600
aactttatca tgaaaatggg taaaattagc caataggggt acatttaaga aaattttcct 21660
gtgatgttcc atccagaaaa gagcaaaaat cagcttcaca cctggagact tcctgtatcg 21720
ggcacagctc agagaaagaa gatcaccaca gaattaaaat gcaactgtaa gaacatgtaa 21780
tgcttccgtg ttccacacat tatgtctcac cagtttagtc aatatggatt aaatatgaga 21840
gcgtggcaat gcacaaactc tatctgagga ggaaagtcag agaaaaaatg ttaaagaaaa 21900
tatggcaatt tgaagcctct gacaccagca acttcagcac caaggaaatg atttcaccct 21960
cattggcctc aaatttactt ttcatggagc attttcaggg ttccaaagtg agaccaggtg 22020
aattcaatgt gcatgcactt ctcaggtgtc cacgtgtatt ttgtttattt tatttctatt 22080
tgcagaaagt aaacacatat tcagccttag tgtcagtgta gggagtgctt tccatgacat 22140
gaataccaga aaaaaaggaa aaacatgggg ccaattaatg taaaaattag ccactgtgtg 22200
tgtgtgtgtg tgtgtgtgta ggtgtgattt gaatactaga gttggagtgg gcttctatcc 22260
acatgcacct gcacctgcag gtagtctcag gtgcaataat caactgcctg accctaaagg 22320
aaacaagaat ctccccaaac ccctgaagag tgtttgggtt taccgtgtgt ccagtgattc 22380
agtgcctcta gagctccagg aaggggctcc cccggtgatg cctgagatct tttcttcagg 22440
tctcccctgc agagttcctc tgggtttcct aagggcaatt cactatttca aaagatggtg 22500
tgagaagcac atgctgtcac taaaggagaa ttctgagcca cggcacagcc actttatact 22560
gggctagaga cactggtatg aatatactct gtaagtttag acagaaagcc tcgtgcatgg 22620
taggggctgg gctgcagggg gtgctcagga taaacgcagc acagtctccc gccccagagc 22680
aggtgcacag gaggctgggg aggggttcct ctcagggcct gggacttcct ttgaaaatat 22740
ctaaaataag tatttcacaa gggctgctgt tgtttgtata aatatcctat tcaattgtga 22800
gcatttatca aactggatgt tgtaatgaca accactttta caatggggat ttcaaactcc 22860
cctagatatc ttaatagtaa gcagctggag gtcaagaaga gatcctttct tttaaataag 22920
tgcaattttt ggagaaacat actcattccc aaaataacgc attcacatat taaggtctag 22980
aaatggctca agttgtccct ggtgcattcg aatgtgggtt caaagtgagg tgcgtgtcct 23040
gagggagctt gttctccagt ggaggaagct ctgtcaacac agagttcagg gatgtgtagg 23100
ggtcgtatcg cctctaacag gattacggct tgaaccctca gcatgtacaa ttgtgtcgtc 23160
catctgtcat gtatttgctc tatctcatcc tggctcagga attgggctat tcaatagcat 23220
ccttcgtgaa tatgcaaatc actaaggtta atacagatat ctctgtgccg tgagagcatc 23280
acccaacaac cacacccctc cttgggagaa tcccctagat cacagctcct caccatggac 23340
tggacctgga gcatcctctt cttggtggca gcagcaacag gtaagggact ccccagtccc 23400
agggctgagg gagaaaccag gccagtcatg tgagacttca cccactgctg tctcctctcc 23460
acaggtgccc actcccgagt gcagctggtg cagtctgggc ctgaggtgaa gcagcctggg 23520
gcctcggcga aggtctcctg caaggtgtct ggttaaactg tcatcaccta tggtatgaat 23580
tggatacgac agaccccagg acaggggctt gagtggatgg gatggatcat cctaccctgg 23640
tgaacccaat gtatgcccac agattcacac acggtttgtc ttctccatgg acacctctgt 23700
cagcacggcg gatctgcaga ctagctgcct aaagactgag gatgcagcca tttattactg 23760
tgtgaggtac accgtgtgga aacccacatc ccgagagttt tagaaaccct gaggaaggag 23820
gcagctgtga tgagctgagg cagtggtgca gcatgtctct aaacttccat tttatctaag 23880
tttgcattga gttccgcttt aatattagcc aggaatgtgg gatagacggg tgctcctaag 23940
aggtccttaa tttgcccatt ttgatgggtt ttccagaaga cgtgagaagc cactttgtta 24000
acaaagcatc ccaaagccat gccctgctcc agaaacacgt gtacccattt cctggtcttt 24060
ggttaactga caagctctca tcagcgcacc tgggctaatt tctcatcagg tagaaaaatg 24120
tgttgtaaag caaggctaac gttgtgatag caattcctgc tcaataacct tcagcatcgt 24180
tgttgttgtg ttctatcaac taattacgtg acttcaaggt tctcattggg agtgtcttat 24240
aaatttaagg gatatataga agttccccta attaaaataa aacaattgtg agcacaacct 24300
cagtgttcaa ccatgtctcc acccttccca ccattcaccc caaagaaatg ttcacctctc 24360
ctggaagtcg ggttcatttt caaattagtt attttttatt ttactatatc aagattattg 24420
tatgtgacta ctgtagcaga aagtgaatta tgggaacttg aagtaaccaa cgaaagataa 24480
attcagaact aattaaacaa gatgtcagaa cgtgattggc tctagtcttt taaaattcag 24540
caggttatgt aaccaggctt taaatttaca catcttcctg ttaccttcac ggcacagtca 24600
actcccatta tgtaagaaat ggcaactgca ttcccaagcg tcatccaaaa ttgtaaaaat 24660
agactgggtg aggtgaggag ttgattgttt aaattccgct ctgaagaagc agcatcaact 24720
caacaaacca ccgcttttcc ctcagtgact agagctatgt cgcaggccac atggacctaa 24780
atatccttga tagagataat aggactacat aaattgggct gatcattttt atgctgtaaa 24840
attaataggt gagtctgcac tccagcctgg gcaacaaaac aagtcttgcc tgtaaataca 24900
aaagaaagat aaattaatag gtactgactt tgacatttcg gataataata ttttcataaa 24960
ccgaatttaa ttatacccac attgttacct acaccttcac tgaaaagttc ctagttatca 25020
tgagttccat caacactcca cgtgttcaaa tctggacatc caagagagtc tggagaataa 25080
aatgcaatga gggcagtgaa acttgcatat attcagcacc tcttaactca ggaggactca 25140
atacaccctg gaacactctg cttttctgaa tggctcacaa tgactccagc tcactctcca 25200
acctcctcaa acatctggct tctgtttgcc ctaagttcac gctctgctct tagtctgtgc 25260
tctgaagtct ttgcaaaggt gaaaatgagc tgtcagatgg aacttccttc tcacctcagc 25320
atggaattta ctgtttcatt taatgaccac tctttccata atggttgatt tctttcagcc 25380
tgttcattac tggtgatttt caagggaatc tctattgaat ttttacattt ttgcattttt 25440
gtctcggtga caatgttgag aagtttttac ctctagcatc ataacatgat ctagtgacct 25500
gacacatttg tggcaagcaa tacctacaaa ttcagaagtt ctttggttac tttccacaaa 25560
atataattat ttctggtctg tgtatgagca tatcctagca accttgtact ccacacaggt 25620
agatgtctac aagcctatga attaatctct gtaaataaaa atttatctca atttctttca 25680
atgttcataa ttcttctgag gatgaggaag atctttctgg atctattcag acaataggcc 25740
cagagaccac ctggtatgta aggagctcac ctggctcacc tggttccccc tgttgtctca 25800
cataaggtca agcccacttg ttcaggtcct aagaagagag ctcagtttta tctgatttta 25860
caacactccc aatttctgct gactctcctg ttacccacat ccatggagat acattattta 25920
ttatacaatt aaccaaagta atgtcaaagg cccaatgtgc aatattgcac atcctagggt 25980
atgttcatgc aattgaatcg aggagaaagt ctttcagaga cagatggatc tgaactggta 26040
aatatgtgtg taaggactct gggcttaagt gtcattgtcc agccatgttt cacaggtgtg 26100
acctgtcagg gaagaaccag agttccttgt gttctcagag gggaggggtc ccagaagtcc 26160
tctctggttc ccaggaaagg taattgcatt aatcttggtg atgagactat catccagtga 26220
tgatgtacta tagagtttat gtttgaagtt gacactctat cgcaatctac atcttttcac 26280
acagaagtgt ttagaggtca ggccacatct tcaggatccc acattgagaa ggacagagat 26340
atattccact accttctcct gagatctcag gcagaaaccc aaatttcaaa aggtctcaga 26400
agggcagctc tcaggggcta tttaaaaata acccacttcg tgggacaggg agcatccttc 26460
taaccatgat ggatgttctg aactacaata aacattgcat ggaaccaggg tctgaattca 26520
ctgtgattat tacactccac tgctgtttca atgtgtctga aggggtaaat gacaatttag 26580
atgacctggg tgtgtggttt gttttacata aatcttcaag gatagaacag cattgaacct 26640
attccaaaat ctgtccctga tccaagatca cactgatctc ccagagcagc atcttcagca 26700
catttcccta cctggaagaa gaggactatg ggcttggtaa ggggaggcca caggaagaga 26760
actgagttct cagagggcac agccagcttc ctactcccag ggcaagccca aaagactggg 26820
gcctccctcc tcccttttca cctgtccata caaagtcacc gcccacatgc aaatcctcac 26880
ttaggcacct acaggaaacc agcacacatt tccttaaatt tgggatccag ctcacatggg 26940
aaatactttc tgagactcat gggcctcctg cacaagaaca tgaaacacct gtggttcttc 27000
ctcctgctgg tggcagctcc cagatgtgag tgcctcaggg atccagacct gaagatatga 27060
gatgctgcct ctcatcccag ggctcaccgt ggttctctct gttcacaggg gtcctgtccc 27120
aggtgcagct gcaggagtcg ggcccaggac tggtgaagcc ttcggagacc ctgtccctca 27180
tctgcgctgt ctctggtgac tccatcagca gtggtaactg gtgaatctgg gtccgccagc 27240
ccccagggaa ggggctggag tggattgggg aaatccatca tagtgggagc acctactaca 27300
acccgtccct caagagtcga atcaccatgt ccgtagacac gtccaagaac cagttctacc 27360
tgaagctgag ctctgtgacc gccgcggaca cggccgtgta ttactgtgcg agatacacag 27420
tgaggggagg tgagtgtgag cccagacaca aacctcccta cagataggca gagggggcgg 27480
gcacaggtgc tgctcaggac caacaggggg cgcgcgaggc cacagagccc gaggccgggt 27540
caggagcagg tgcagggagg gcggggcttc ctcatcagct cagtgatctc cctcctcgcc 27600
agcactcaga tgtccccagg gctcctgttt ctttattgtc tgtggttctg cttcctcaca 27660
tccttgtggc agacaagaaa ggaggaagac aatttttctg tttactgttg aggtttcacc 27720
aattactagg aactttccta caagttcctg cgtgactcat tttaccgtat atgtgtgtgt 27780
gtataaatat atacacatac acacacacac catatatata caccatatat attatataga 27840
tacacaccat atatattata tatatacaca ccatatatat tatatatata cacaccatat 27900
atattatata tatacacacg atatatataa tatatatata cacaccatat gtatattata 27960
tataaacaca ccgtatatat atatggtttc tcaccatctc ttgatttgtg tcatcaatgg 28020
aattgtgccc tatttgaaat tcatttaccc aaaccttaaa tccaatggat ctataccgga 28080
attttaatga tgcaattaag gttaaatgtg gtcaaagtgt gagaccctaa ttcaataaac 28140
cagttgtctt tataagaaga ggaagagaca cccgagacct ctcacttttc gcgtgcacac 28200
agagaagaag ccgtgaggag acgtagtgca ctagaaggtg gccctgtgca agccaggaag 28260
aagccgcgct aagaaccaat ttttacagct ccttgatctt ccacattcag actgcagaat 28320
tgtaagaaaa tcaatatttg ttgtttaacc cacccactcc tgttgtcttc ttatgaagat 28380
ccaaacagac tgataccacg taattctgtt agctctggtt cgtggaggga ggagcagccc 28440
cctgaggctg gacacttctc tcagatttcc acgtgaagta ggtaaaaata gtagctctca 28500
tataaaaatg tgtcatgacc ctgttggcca tttttgagca aggtctctga aaccagccct 28560
tgtgtgtgtg tcacaaatgt tttcttttat cttttatttg gacataacac atagacaagg 28620
cgtaccagct ggatggagac tggtcactgc ccatcttctg ttgtctcctt aggatgtcac 28680
agaaaaccac accaacatca ccaacgtcac tgtttttctt caaccacctc aaaccgacta 28740
tagaaatgat ccctgcagta taagtctatt tcttcaaact ttctaaattt gcactggaat 28800
ctcttcctaa atggggagct acatggggtc tgagttttgt tcctttcttc ccagtcttcc 28860
ccaagtgcca aggacagaat agacttaaaa taaaatttgg ccgtcagtgg ccccaacccc 28920
acatcacttt ctaaaaccca catcctgcat ccatccttct ctggacaccc ctcatcgggc 28980
tacctacgaa tggccagaag ctgccatcac cttctgggct gaggccacga gttatacaca 29040
cgtgtgattt cagtcacaca cactctactg caggacacac ctgtgttctt gaggcactca 29100
ggcaccctgc tgatctcagt cattctctaa taaattacac atctcttatt aataaaggtc 29160
cagatggtcc catcagctgc agagcagtgg agtaaagctc atgggtgggt ccgtcaggta 29220
gaagtcagac aatggatggg atggctggtc acttcccttt tcactgatgt ccccagtgaa 29280
tattaatgga ataaaaccat attaactaca gagggacaga aaagaagact agctcatcaa 29340
ggtatttaag gaccaggaac tttatttggg gggaaagtga agacactttt aaatggaaag 29400
ccctaaagca catacaacag ctgacagagt ggccactgtg cacatgaagg ctgaggagac 29460
ggatggcagc gtccgttcct ccaagatgtc cctgggtgtg tgatggttgg actccttatg 29520
catatgaata taagagctgg actcagggag aaaaaagggc catatctcat aggaaaggaa 29580
gcccaaaaaa gcagatgggc atccctggag agagctcatt agatttggtg tgtttaagac 29640
aaaaatttct tccaaaaatt gtaatgttct aagctaaata tgaacctctt caataaactg 29700
agaattaaca ggagaataga gctatgagtt gagagaagaa acaaatcatg agagagcaga 29760
aagcaaatcc acaaaaaact gtcatatgac agaagtcaga atggagctgg ggcagctact 29820
tcattattct gaagacttgt tgaccatgtg gagaaggggc ttgaacaaat ggggacgttc 29880
tccaaccttc tgaatcagcc tccttcttat gcatgagtaa aaatcatagt tctgggtgtg 29940
accttcccaa atttcctgtc tgtacctctt cccccagggg tagagtgtct tcccaccaca 30000
atggtttctc accagtgtcc tcagcttctc ctccattgaa cttaccctgc agattaagaa 30060
tttcttctag atgtagttct ttgggaattt tctgttttct ttagtttctg ttgactccac 30120
cacaccccat aggtcacagg tttgattgat ttcccctgga gacagtggag gtggatccag 30180
gcgttcaaca gtcctcgctg ttcctccctt cctgtcagca ccacaggaca gcagataagg 30240
gagttgactg tagatttttc gaattcttgg gaaaatcctg caaggactag tagattcaca 30300
ctccaatacc attagcacat gcatccaaaa aaaatactca cgaaatattt ccaggttagc 30360
ctgttcctct ctcaatgcca tccagtggca cctgccctgg gttcaccaac atgtgggccc 30420
cactcctctc tgctggcatc tctctcctca catttcagtc ttctcgttag ctctgtgaaa 30480
gcaactcaga tatgttaaaa ggttttcttc ttcatttatt cagtttttca ggtttgttgt 30540
taatgaggtc agaataagac catagttttc tcatttttca cattcccaca ctgagtagcc 30600
actttctata taaaagccag aaactaaggg aacaaatcaa atatccatat ccactacagg 30660
tgaacgttaa acaatttgac atatgattat gaactaaagt acaatgcaga attagaatca 30720
aggcatcctc attctcataa aagcatgtct acattctcaa ataactctgc tgagtgaaag 30780
tagctgaaga attaagagtg caattcataa acttctaatt gtataaactg caaaaggtcc 30840
aactattcta aagtaacaga gcagatttga aatttgtgag aaacgggtgt tgaaagtaat 30900
tggctggtga gatgaaatta cagagaagtg acagaaagat ttaggggtta acttaattgt 30960
acacaacctg attaaagttt gcacacatac gttaccattt tccaaattgt gcagtgtaga 31020
tttgaattaa ttattaattg tacttaaaaa aagcagtaac aaataaacac atgaatatgt 31080
ttactgagga ggaacaaaaa atagatgggt atgaacactg gaaacatctc agactcttga 31140
aagtacacag gcttgaacac tggttctctc cgtatacttc cggtaaacgg ctgaatacac 31200
taaaagaaaa cagagatgtc ctggcagggg tggaatcctg cagacctcac taggtgtgtc 31260
ccacactgcc ctggagttgt ctcaggggag cagtctcctc tagtggtcag aggcacaggc 31320
tgagataatg gggttaactc tgtccagctg tgtgactttg aatgcattgt ataaacactc 31380
tgttctgtat gtaatttatc ttccttaaaa tgcaacattg acacttacat taaatgtatt 31440
ctacaaatat gtcaaaaaga agatgatgac tgctaaatga ttatcaaggc acaatcacat 31500
aatataatga tattttcctg agtgataaga tgactaccaa tctcgggggc actttgtctg 31560
ctctgagccc tgcccctcct caggattccc atcccagagc ttgctataca gtaggagaca 31620
tgcaaatagg tttctccctc tgctgatgac cagtcctgac cccatagctc tgggagagaa 31680
gcgccagccc tgggattccc aggggtttcc atttggtgat caggactaaa gacagaggac 31740
ccaccatgga gcttgggctg agctgggttt tcactgttgc tgttttaaaa ggtgaactag 31800
agagattgag tgtgaatgga tacacttgag agaaacagtg gatatgtctg gaactttctg 31860
accaggacac ctacaagttt gcaggtgtcc agtgtgaggt acagctggtg gagtctgaag 31920
aaaaccaaag acaacttggg ggatccctga gactctcctg tgcagactct ggattaacct 31980
tcagtagcta ctgaatgagc tcagattccc aggctccagg gaaggggctg gagtgagtag 32040
tagatatata gtaggataga agtcagctat gttatgcaca atctgtgaag agcagattca 32100
ccatctccaa agaaaatgcc aagaactcac tctgtttgca aatgaacagt ctgagagcag 32160
agggcacggc cgtgtattac tgtatgtgag tcaccaggta agaagacatc agtgtgaaca 32220
cagacacaga atttcctgaa ataagggagg agtctgggct aaaagggcac tcaggaccca 32280
cagaaaacag gggaagctct agggcaggtg cagatggtca tcatgggctg ctttccttga 32340
gggtctgagg cttcctctgc atctaacagt ttccctggga gcctctggac atttatgctt 32400
ctgtggccac ccctgaggtc tctggacatt ctcatttgtt gcaaaggcag atgtaagtat 32460
tggaggcata aaaatgcaca ggaggccagg gagtctgtag acattgttac cccagaaggt 32520
caatctcacc actagtgctg gaggagggtg ggagtttgat gaagctgccc taagtatcct 32580
gtggtctaag ctaagtccaa cgaggccatt tgtgcctccc tgagcacagt tatccatcag 32640
agatgtccca tgtgtcccag cagcagccat gtctcagtgt cttcactgtg cacagccagt 32700
gtctgggagg agctcccagg atgggtgtct ttggcacaca ccaggtggcg ggtgttagag 32760
tgcggtgcag cagctggctg cctgttctat tgggctccct gatgctggag agatgggagg 32820
tgcattctca ggtccagcac cctgtttgtg aatttttata taaaaaccat gattttactt 32880
cattttctca gatgacatag ataattagga acagaacctg caaagaaatt gtaattttca 32940
actttacccc aaatttattg tttcttaatt ctgtgtaaga tccagacata ttattgcctt 33000
cctcatgaga aattgttcta tttaaaatga aattagtttt ttctcacatt ctttgtttct 33060
gttcaagtac agagatcttg attaaagtaa gttgggttct ttccacacac taaccctcac 33120
ctcccccaga gaaagagcag agattttcct cactctgagt ctaagggagg agctgttcct 33180
gcacgattca gagcctgcag agaccccccc cgccaggtgc agcttcagtg agtcaggtat 33240
ttctccttgt gggtgacctc caccgccagt gattgctgct caggtctaat tgtgggttaa 33300
gcattaggac acccttcagg tgatcacatc tcagtcttat tctgaaaatc accatgaaca 33360
gggatagttc aatgcctatt ctcctgacat tagtttctct ttattatttg gttccaagta 33420
tggagaaaaa tgtgacaata aatttgtcag aatctaacct cagaatccac tgcattactc 33480
taggatactc acaaattgaa cacaaatgag ctctttattc tcataaaagt atacgtattt 33540
gggaatttca atgtgttctc cagaacctgt gcatgccaac aactgtgttt ctcagtgccc 33600
acttggcctg gtgaagccct cacagaccct ctccctcacc tgtgctgtct ctggattccc 33660
catcacaacc agtgcttcct gctgtagctg cattcataaa ccccccagga agggactgga 33720
gtgaatccag tgcacaggtc atgagggagt gcacattcca acccactcct caagagtcca 33780
gtcaccatct ccagatccat gtccaaaaag cagttcttcc tacagccgag ctaagtgagt 33840
cacaagcaca cagccatgta tttttaacaa aagacacagt aaggtaacca cagtgggaac 33900
tcacacccaa acctccctgt gggggtgcac aggacagcca cagttactca ggaccccagg 33960
attcctcagg acaccaaggg gcactcaagg ccattgtaga tgccctcagg tagccaaggg 34020
ttctcaggaa acatggagga aaaccaggac cccaaaaggt gctccgtaca gcaggggact 34080
caggacaatt gcggggactc agagcaggct caaagctcag cttcagggca ggtgcagctg 34140
gggttgaaag gggctggatg aggggttttg tgacaccatc atatttcacc actagacaca 34200
ctccactttg tctattctaa cgcatgtgag tgtatgatta gaaaatgata tttatataaa 34260
tacataacca tagttagctg tgtcaagttg tcctcttgct aggtgtccat agctaggtgc 34320
atcagccttg tccataagga ctaattcccc gcaattactg gagaatctca taaattgtgg 34380
tcaattatgt cagattcctc tctttttctg ccttcctttc tcccttcttc tctctctctc 34440
acacagaaac ttacatacac ccaccccaca acacaccaaa atctataact tttattacct 34500
gatatattca ataaacctga ttaatgtgca gcttttccag cttcgttatt tatgctgttg 34560
taacaataag aacaatgtgt ttcctagctg tgtacttctc taagctgagt agcatctttg 34620
tttataatac ctagaattaa aaacaaccca aatgtcaatc accagcttaa ttggtaaaca 34680
aattgaggaa aagtcattca ttgacatact atccactact accatcaact aatgttgggt 34740
acactcaaca gcatggttaa attcacaagt acttgtgatg agtaaaatga gccaaagtaa 34800
caaaagtgca tacataagat acaactttca taaattctat agaacaaaaa gtaatcttaa 34860
gttacataaa aatcagtagt tccactgtga gtattgtagg agaggggaag gactaggaag 34920
gaggaattat agtacaagac aaaattttga gggaattgac ttgttatcta tgttgctcgc 34980
gatgatgtct atgacccatt tgtaaaattg aacacttcat atggagatta ttatttttaa 35040
tttaactcca ttaatgatag tactaattat agcaggtata atttggtatc aaaagaatta 35100
gacagagata aataaaatac atgaaaagtc agagactctt gaatatacac ataaatgagc 35160
cctgggcatc tctgtatttt tagagaaatg ctagaatata gaaaaataat ggcataattt 35220
tatgtcacta aaaaagttta tcgaactcca ccagtcatgt ggtattagtt cattttcaca 35280
ctggtataaa gaactacctg cgactgggta gtttacaagg aaaagagatt tagttggctc 35340
accgttcttc atggctgggg aggccacagg aaacttacaa tcatggtgga aggtgaaggg 35400
gaaacaaggc acatctccca gggcagcagg agagagagag aggggggaag tgacacatac 35460
ttttaaacaa tcagtggttg ttagaactca ctcactacca tgagaacaac atggggaaac 35520
tggacccatg atccaatcac ctctcacctg gtccctcccc tgacatgtgg ggattacaat 35580
ttgagatgat actttgatgg ggatacgaaa tcaatctata tcacatgtcc agctctgtcc 35640
tggagttgtt tcagggatcc agggtgtccg gctgatagaa ccagtgacac caagctcaca 35700
ccctcagctg tagttgacac cacgcaaagc caagagatta caactaagat ttagtttgaa 35760
tgtcgtgtct gatgaagtca cacactcaga gaaagtgaat atggaaaagt ttattatttg 35820
cactctatag gtgtctggtg agtgcagggc aggtctccca ggaaaatctg aaacagcttg 35880
aaagaagagg aaaggagact ggctcagcat ttttatgatg gtttggtcct gggggcagag 35940
tgaggcttcc cactcacaga aaggggtttg cagggtttga aactccccct ggcatcgaat 36000
gaagaagctc ctgtgatttc aaactagagc caccttgtgt ggcaaaaaag gagatgatgg 36060
aggaatatgc tttaaatcat cagcagtcac gcacccaaaa atagtgtgac aacttattct 36120
atgcagcagg aataaaaata attaataaga aagaagataa gggttcagtg tgggtggaca 36180
acacgcaggt ctacagaaat gagatgactt tagaaatata agcaaaggat aatgaaaaaa 36240
aggaggggaa ggggaattaa acagggtcct ggtctgatgt cttgggtaga agcttctcac 36300
aatcaaggac taccagctca ttctgcaggt cttaggtcag ccatctgctt aaaaacatca 36360
gaaacgccag agaatctatg aacatggtca gtttaacatt tcctatttga gtagctttac 36420
agttgtgtgg aattcttaac tggttcttgt tttttctttt agatacaggc tctcaccctg 36480
tcacacagtt taaagtgcag tggtgtgatc atagctcgct gtaattttga actcctgact 36540
catattcttc ccatcttagc ctcttgaata tctagaacta gaggggcatg ccactcatcc 36600
cctccttatt ttttatttta ttttttcata taaataaggt ctctttgtgt tgcccaggct 36660
ggttttgatt gcctggtctc atgggatttc cctcacttcc cttctgaaag tggtgtgatt 36720
atacagatga tccagtgcat ctggcctgaa ttgattcttt aattgtaaaa tacgaaccca 36780
ataattaact tcctgaatgt tttctgcagt gagttagtta aaaggatctg acaagattcc 36840
ttccaatatg attcaagagc agtattgtcc actgatgttc cttccagttt ccttgttgaa 36900
gatcacaaga gtctgtggaa aagaggtagt aaaaaggccg cctcaaactc ttcgtggttg 36960
gagtgggtac cacacatgca agcagtagga caaggatgat ctctggggta aagtctataa 37020
acatataggc cttttagctg ccaagtcata gggtaataac tgatgcagcc tgaggagtgg 37080
accatggttt catagtgcta gtgggagaac ccttggccaa gcaagtttta cattttatta 37140
cattttatta aagatttgat aattttaatg taaagatgac attttttaaa cattcccaga 37200
agattgtgag tggtattgat tctgtctcgt atgaacaatg acagtgccct ccacggttag 37260
attatgttat aaactagaat gaggtagagt gtttggtgtg ttaaatcact atttttttag 37320
cttctatgtt agttttttgt ttgtgtgtta gcatttgctt taaaattcta ttaatcagat 37380
ctctagttgg tagaaattca tctgaaagtt tcttccattg ttgtccattt tgataggatt 37440
tccagaagat gtaagaaccc tctctgtttg caaaaatatt ccaaagttgt gcaccatcta 37500
gaaacatagt tacttaattc taatttttaa tttattaaaa agttgtgata agtgcaaagt 37560
tttctgcctt ctgaattgat ttcataacac acagaataat atatactaaa tggaagtttg 37620
tactagtaat acaaattact gattaataac ctctactttt attattgagg tattatccat 37680
caatatataa tcttaaatca atgatctcag tgggaatctt acctaagtaa tatacaaaat 37740
attttcctga tctcgacaca aaatagatgt gaacacattc ttcatattca gccatgtctc 37800
ctgtctatca cattatgaac cacatgctaa ctttgattta cttgggactt gctctaaatt 37860
caaactagtt atcttttatc ttcacgcagc tggattatta tgtgtggcta ttttatcaga 37920
gtgataagat acaatactaa caattttcac tgcaggcatg tctaggcaag ccccctgtgc 37980
acaatgacct tggtgggttg gacattctat ggggactctc ccctgtctgc ctaggagagt 38040
tatctgcctc ctccctctat cattttcctc tttgaataag tgcatctaac tgccgttaga 38100
atacagacaa aggccaacct taactgcttc cagctgacag gggatgctgt ttcgggaaga 38160
tctcccttga ggtctgtcta agggacccag taaaagggag ccattatccc aggcttcact 38220
tggatgacca tttggagttg atgcctgaag gtgagaagag acaaaccggg ttattagaag 38280
acatgtatca aaaccaaaca aggtggtaag gacagtttga aaaaaaattc caaggctgct 38340
gacacaccca gatatctggt ggctgtagtt atgcctgcta agatttgggt gcatggggct 38400
tggctttcgt tagctccctt ggacttattt tcccaaacaa agaaacctcc gggttagggg 38460
gaccctattt attccagtca cctggcatga tttgccggat aattgctcag aattaaaata 38520
ttcgtccaga tgtttatata gcccatgcct gtgtttcttc tgagctgcag ccagagatca 38580
ttggttggtt cacagcgata agcagagtta gtctaaaatg gaggcaaata cttaaaactt 38640
atttcttctc tcagttaatg gattctatag agaaaagtag ctactcagca tgggaatgta 38700
aaaaaatgag taaactatga tcttattctg aactcattaa caacaaacct gaaaaaccaa 38760
ttgaagagac tgtaatttaa agacaagtgt atgatatgtt ttgaaacata atttttctct 38820
ctccagttct gatttttgtc agaaactaat cattatagga ctgagttgtt tgcaaaataa 38880
actttagtct tatggttggt ctgatcattt gcataaagtg aagccataat aattaataat 38940
aattctgtag gaaaagcctg caagcatgag gagcttcaca gtctaacact atgagcacat 39000
gcatcctcca gcaactcact gaatattttc aagtcagccg gttcttagct taaataacat 39060
ccagttggta tctgtcccag gaacactaat atatggttct ctctgcaggc ccctttctcc 39120
acagattaag ggtttttttt ttttctctgt aatatcaact cagatatgtt gaatgctttt 39180
tccttattag tggtttttca ggtttgttgt taatgatttc agaataagat cattgtttac 39240
tcattttttt taaattcccg tgccgagtag ctacttttct ctatagaatc cattaactgg 39300
gagaaaaaat aacattttct tatgggtgaa caattaaata gtttgacata tatttatgta 39360
ctggtatata atgcagcttg aaatcaaggc atgcctcaat cataaaaatc atggctaaat 39420
tctcaaagaa ttgtgctgag tgaaagaagc taaggaatta agagtaaatt ttatataatt 39480
cattgtagaa atattagaag atgccactac cataaattaa aatgaagaag acttaaattt 39540
ttctgagaaa atggtgttgg gaatgatgcg gatgtgattt aagtttcaga ggaataagaa 39600
aaaagattta gggattaatt taattattca aaacttgatt gaagtgccga gtgaatggct 39660
ccaaacatag tctacatttt tcaaatcatt ccctataaat ttgaattaat tatttatttt 39720
tatacttgaa taaagcaata acaaagaaat aaatgaatat ttttgctaaa atggagcaat 39780
aaaaagactg atattgacag aagaaatatg actgacttct gaaaatacac acacatgagc 39840
cgtggttctc tctacatatt tagataaatt acagaaagtt gtcataactg atggggaatc 39900
ctgcagactt cactaggcat agtccacact gccctggagt tgtctcaggg gagctgcctc 39960
ctccagtggt tagagcacag gcccaggtaa taggactcat ttttttagat gtgtaatttt 40020
agacacactg cacaactgct gtgttctctg tgcaaattat ctcctgtaaa atgtaacatt 40080
gaaacctgcc ttaaatatat tgtgtaaata tgtaaaaata aaatcagatt gtgagagcta 40140
aatgctaatc aaggcgcaat cacgtaatat acaattatat tttcctgaat gatggaatta 40200
ataccaatct cccccaggac acttcatctg cacggagccc ggcctctcct cagatgtccc 40260
accccagagc ttgctatata gtcggggaca tccaaatagg gccctccctc tgctgatgaa 40320
aaccagccca gctgaccctg cagctctggg agaggagccc agcactggga ttccgaggtg 40380
tttccattcg gtgatcagca ctgaacacag aggactcacc atggagtttt ggctgagctg 40440
ggttttcctt gttgctattt taaaaggtga ttcatggaga actagagata ttgagtgtga 40500
gtgaacacga gtgagagaaa cagtggatat gtgtggcagt ttctaaccaa tgtctctgtg 40560
tttgcaggtg tccagtgtga ggtgcagctg gtggagtctg gaggaggctt gatccagcct 40620
ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagcc tctgggttca ccgtcagtag caactacatg 40680
agctgggtcc gccaggctcc agggaagggg ctggagtggg tctcagttat ttatagcggt 40740
ggtagcacat actacgcaga ctccgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaattcc 40800
aagaacacgc tgtatcttca aatgaacagc ctgagagccg aggacacggc cgtgtattac 40860
tgtgcgagag acacagtgag gggaagtcat tgtgcgccca gacacaaacc tccctgcagg 40920
aacgctgggg ggaaatcagc ggcagggggc gctcaggagc cactgatcag agtcagcccc 40980
ggaggcaggt gcagatggag gctgatttcc tgtcaggatg tgggactttg tcttcttctg 41040
acggttcccc agggaacctc tctaagttta gcattctgtg cctatgaacg tcttctctaa 41100
gtatttgaaa gagattattt taatatgaag agcagttctc actcgcccaa aatgtggatt 41160
gatgcttact gggatgaaaa gtccccaaac atggtcaccc cgataagagt ctgagtgagc 41220
tcagggcttc ctgctgagtc tcctcctatc agaccaagga cagggacctc agtgaggttc 41280
ccccgtcaag aacagtcttt atggatactg attgtgggcg gcaacccacc caggtgccga 41340
cgcaagagac cgaggacacg agctgttcca gtacaataaa atataaaaca agaatagtta 41400
taccagatat agatcttaga tatgattata tatgaatatc attaatcatt agttggtagc 41460
aattactctt tattccaata ttataataat cctcactcta caatcataac ctaggaaaag 41520
ccaggccata cagagatagg agctgagggg acatagtgag aagtgaccag aagacaagag 41580
tgcgagcctt ctgttatgcc tggacagggc gaccagaggg ctccttggtc tagcagtaat 41640
gccagcatct gggaagacgc ctgttgccaa gcggaccatg gtctagtggt agactcagtg 41700
tcaaggaaaa acacctgcta cttagcagac caggaaaggg agtctccctt tccccgggga 41760
gtttagagaa gactctgctc ctccacctcc tgtggagggc ctgatatcag tcagacccgc 41820
ccgcacttat ccggaggcct aacagtctcc ctgtgatgct gtgcttcagt ggccacactc 41880
ctagtccgcc ttcgtgttcc atcctgtaca cctggctctg ccttctagat agcagtagca 41940
aatcagtgaa agtactaaca gtctctgata agcagaaata atattgtaag ctgtttctct 42000
ccttctcctc tctctctctg cctcagctgc caggcaggaa agggccccct gtccagtgga 42060
cacgtgaccc atgtgacctt acctatcatt ggagatggct cacactcctt accctgtccc 42120
tttgtcttat atccaattaa tatcagcgca gcctggcatt cagggccact actagtctcc 42180
gcatcttggt ggtagtggtc ccccgggccc agctgtcttt tcttttatct ctttgtcttg 42240
tgtctttatt tctatgctct ctcgtctccg cacacgggga gaaacccact gaccctgtgg 42300
ggctggtccc tacactgatc acagacaata gagggtaggc caggatcagt gtcatgtagg 42360
acatcacagg tttcacctct gaaccttttc ctgacactaa atatgcaaat cagcatcagc 42420
actgatctgg tgattctttt gttcctaatc catttacttc ctttttcagt cgttgttttc 42480
atttttccat ttgcttttcc tgctttctgc aaaaggaaga tttttccctg tggtcaaaat 42540
tccggacctc aagccctttc ctggcgctca ggtgggtctc aggctgtggc tgctgcagtc 42600
acgcgggaga ggctggtggg actttcttca ctcctcgtca ctcagggccc tccactgtgt 42660
tgcatggaga cttatctgga aatgcaagtt gcgactgaga actgaagggg acaagcttgt 42720
ttggttaaca tgggatgtgg atgtgtttct aattttgttc tgataaactt tcacagagta 42780
actttctgca ctagtcatgt gaggaagagg atgtgaacgt agtcagaata aaaatagaac 42840
aacttgtgtt ataatcttta caggtgaagc tggagaaggt catgaataga gggttctcat 42900
gcacacatcc ctgataacaa gaactaccat aaaattactc tgcacaacca caactttcaa 42960
caaaggctac cacaacaata agagaattaa tattgtgagg atatctgccc tgcaactccc 43020
agtacaatct taaactgatt ccacccttgt tattaattct tctaccccca ggataattgc 43080
ctcagaacag ctcatgtaag tcctctcatt tatcccttaa aacaaccttt accaaccttt 43140
actaacctga cttcctttac ctacctaaat atgcccaggg ataatcccac tggaatgctc 43200
attttcaaat acatattatt tgattttgga gaatttcttt ctgtctgata ttcaggtgtg 43260
acaagctgta gagggtcaca ccactttcct gtgagatgta ggggatgaca atttgggggg 43320
atggctggaa acatccaata tcctcagggt cggccatcag taagcgcagg ctggaagtct 43380
cagaacgagt tgaagttgct taaccacgga attttacctt ctccagatca gctttgatgg 43440
aatcagggcc aaactggtta tcaatgataa tctacctaac attgagtcaa ctgatcacag 43500
ttttaataac ctctattaaa aattcacacc aacacttgga ttagtgtctg atcaaataac 43560
tacaaagtat tttccagcca agtataccat aaaacagacc attacccatg gagaaaaaca 43620
tttaacatga gttctaggtc cttacattgt taaaggtgta aaactgatta tttttaaatt 43680
atgcttttta tttttgctat tgagttgtag aagtttcatt tacattttgg atattaacgc 43740
ttttttcaga tacatgatat attatccaat tctgtgagtt ggaattattt cattgctttg 43800
cagaatattt ttttaatcta gtccaacttg ttcaattctg ctttttttta aatgtgcttt 43860
gaatgtaaaa tccagaaaaa gattgctaat ttttgaggat tgggagtttt acagttgcag 43920
gaatttcatt gaaatattta atgcatttaa agttaatttt tgtgtttatt ctaacctaaa 43980
attcttaatt cttcacatgt gaaaatccag ttttcataac atgctctttg gaagacacca 44040
taatttagcc attgtatgtt gatggttctc atgctgaaaa tcagttcgcc atcaaaatgt 44100
gggtttatat ctaagctctc tatatgcatt tatgctgaaa ccattcggat ttattactct 44160
gtgtttgtaa caaatgttga ggactggaag tgaaatgcct caagctttat tcttgcctta 44220
ttacagatat tagacccaaa tattctaacc ttctactagt gagtataata atagctgtcg 44280
cttttttttt ttttttttga ttcagagttt cactcttgtt gtgtaggctg gagtgcagtg 44340
gtgtgatctc agctcaccgc aacctctgcc tcccgggttc aagcgattct cctgcctcgg 44400
cctcccgagt agctgggatt acaggcatgc accaccacac ccggctaatt ttgtattttc 44460
agtaaagatg gggtttctcc atgttggtca ggctggtcgc gaactccaga cctcaggtga 44520
tcctcccgcc tcagcctccc aaagtgctgg gattacaagc atgagccact gcacccagcc 44580
tcttcatttt ttttttattc atatgttcat tcagcagcca ctatgtcttc ccattgattt 44640
ctttggtttc ctctttacta tctttttctt tttagtaaag ctgttactcc taagggaaga 44700
tgggaggtgg gcctggacag ggatttggtg cattcctctc ttcactcaca gttcttattg 44760
atctctccag tgtctctaga acactggttt tcctggcatt accgctgcag ataatttctc 44820
ttgcaatgta gtgctgatga ggaggtgtgt ctggatgcat ttcagctata gttgctgttt 44880
tgctttccct gacacaaccg tcccaagggg tagaggctgg agcattttgt gatgtgtccc 44940
cagtactgaa gaaaaagcct tcaatagcag gaggaattcc tcaactgtat acactctgag 45000
aatttaaaca ataacttctc tatcacactc aaatttaaac catccaatga atatgtctac 45060
tttaatcgtg tgttaactta aatgatattt ggcagcctct gtcccagaaa agattatcat 45120
ctgctcctgt ttatttccct gcaagtcttt atctctcttc agatttcaga tatcttgttt 45180
gtcttataac atcaaaaatc tgatgaattt aagaaaatgt gctaatttgc agatcagtaa 45240
gctttagtag ttgtgagaat aataacaaat ttttatggga tgcctgcatc tccaagctga 45300
gtagcatctt tatttctaac actcagaaac tagaaacaat gcaaatatca agaagatata 45360
tagataaaga gtaatggcat gctaatttac ggtaatcata gccatcacta gaatcaatac 45420
actgttgatg ctcaatgtgg ttgaatcaca agtagttata atgagtgaga agccacacac 45480
ataaaacaca tactatataa ttcctgtata ataaattctt gaaactcaaa accaaagtat 45540
tcaatatgaa ggattgactc agaatatggc aagggaaaaa aataattggg aaggaggaat 45600
tgtagagtaa cacaaggaaa cttttaagtg taatttattt gtttgttatc tggatggttt 45660
ttggggatgc acaggtgagc acgagtggaa ttacattttg ttgtgtttgt ttttttctga 45720
agagatgtgg tcctactctg tgacccaggc aggactgcag tggtgggatc atagttcaat 45780
gtagcttcca acttctggtc accaacaatc ctcctgcatc tgccatctaa gtagctgaaa 45840
ctacagttgt gtgccaccag gctcagcttg agtacttatt aaatcaaaca ctttatgcaa 45900
tatttaatgt atggcaataa tgtctcattg agagtattac aaataaatga atggataatt 45960
tgttcagtac agattgatgg aaaatagaca ctaacatgag gaatgtctga catttatgaa 46020
catacaactg cataaaatgt gttctcttac attcattagg taaacacaat agtgcataca 46080
catcaaacca tgctttcatt acaggaagga agttctgaaa atgtcactgg gggtgaccca 46140
cgctgtgctg ggcttggttc gggggcagtc aggcccggtg gtgagaagca caggcccaga 46200
tacccaggct tactctgcaa atgtgagctc tggggacatt gtaccaccca tctgtgcttc 46260
tgctggtaat tttccatctg taacgtggaa ataacattga tactacatac cgtgatttct 46320
ccacatatgt aaaaataaaa taagatgatt gctgctaagt ttaaataagg gcagttttca 46380
taggtccatt gtacctcaat aaaattactt taaaataaaa attacaaata cagttgtagg 46440
tttaaagagt ttatcacaga acaaacttat aataagaaac tatattttca aaaattgtat 46500
caatatctct aaactccccc aggacacact cacctgctct gggctctcca ctctcctcag 46560
gattcccacc ccagagcttg ctatatagta ggagacatgc aaacagagcc aaacctctgc 46620
tgatgaaaag cagcccagcc ctgaccctgc agctctggga gaggagcccc agctccagga 46680
ttcccaggtc tttccattta gtcttcaggg ctgagcacag aggactcacc atggagtctg 46740
ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt tgaaaggtga ttcatgggga atgagttgaa 46800
tgtaagtgaa tatgagtgag agaaacagtg gatgtgtgcg gcagtttctg accagggtgt 46860
ctctgtgttt gcaggtgtcc agtgtgaggt gcagctggtg gagtctgggt gaggcttggt 46920
acagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagtagctc 46980
ctggatgcac tgggtctgcc aggctccgga gaaggggctg gagtgggtgg ccgacataaa 47040
gtgtgacgga agtgagaaat actatgtaga ctctgtgaag ggccgattga ccatctccag 47100
agacaatgcc aagaactccc tctatctgca agtgaacagc ctgagagctg aggacatgac 47160
cgtgtattac tgtgtgagag gcacagtgag gggaggtcag tgtgagccca gacacaaacc 47220
tcctgcaggg gcatctggag ccacaagggg gcgctcagga tacacagagg acaggggcag 47280
ccccagggca ggtgcaggtg gaggtcaagg gctgctctcc ttcagggtct gtggcttcct 47340
ctcatctaac agttccgcag ggagcctctt gtatttacag tgatgtgcta ctgaggtttc 47400
taagtttgta aagtttatta ctacaggagg aaccactatc aaacgccctt aaggcaggtg 47460
tcactaatgg agaaaggaaa gtgcacagga ggctgggtga ggctgtggac actgtctgcc 47520
tatgattcaa gtttcacaag cagtgacgga gaaatgggag tttgatggag ctccctaact 47580
accatgtggt ctaaactaag tccaactaag tccctgagct ctgggtgccc atcagggatc 47640
cgccatgtgc ccggcagccg cgtgcctttt tgtctcctct gcgcccaatc actgtctgtg 47700
atgagcttcc aggatgtgtg tgtttggcac aaaccaggtg atggacgtca gacagcagca 47760
gctggtgccc ggatcatggg ctccctaatg ctggaggaat gagaggtgca ttctcaggga 47820
caagacattg ttgatggatt tttatgtaga aaccacgatt ttacttgctt ctctcaggag 47880
acatagaaga agcaaccatg cagtcagcaa ataattataa tttccacaat taccccaaat 47940
ggttaatcct taattctgcg cagggtccca ccgtagagtc acctttctca tgaggaatgg 48000
ttgaatctag aatgagtcca catgattttc atatttttgg cttctgtcca tgttcagaga 48060
gttagagtag agtaagtttg gacctttcca cacactaagc ctcacctccc ccacagaaag 48120
agcagagact tcaactattc ctgagtgtgg ggtaggggct ggtcctgcac acctcagagc 48180
ctgcagagac tgccacgtgc agtgttatag acttgggtgt tttctcattc aggaggggtg 48240
acctccacgg cctccgattt ctgctaagat ataactgtga gtgcagaatt aggacactat 48300
taggctatca tgcctcactt ctattctgaa aatcaccctc tttatagtaa aagaaaacaa 48360
ttcaatgtcc atgcccctga aagtcatttc tttttaattt ggttgcgagt ttaccacata 48420
gtgcctgaat ttattctcag aatctactga attgtttata aatctcacaa attgaacaaa 48480
agtgaattct tcattcttac taaaatgtgt gtatgtagga atttcagtgt gttttccaga 48540
agccatgcac accaaccact gtgtttcatg gtcatttatt ggcctggtga ggccctcaca 48600
gaccccctcc ctcacctgtg ctgtctctgg attctccatc acaactagtg cttcctgctg 48660
gagctggatc cgccagtcct cagtcaaggg agtggatcag ggcataggtc acgagggagc 48720
acaaattcta acccactcct catgagctca gtcaccatct ccagatccac gtccaagaac 48780
caaattttct tttagctgag ttctgtgacc aacaatgcca caaccttgta ttactgtgag 48840
aggaacagaa gagatgtcag tgtgatccca gacacaaact tccctggaga ggggcccagg 48900
accaccaaag agcactcagg cccatgaaaa cagggcccaa gctggagaac gggtttcctg 48960
tcaccctcac ctttcaccat tagatactct acactatgcc tatgctgagg tgtgtgttta 49020
atataattag aaaatggtat ttatatacgt gtataatcat atctagtgta agaatttgta 49080
gtttccacct tatgtgacca ttaaagacaa catctctcac gttattcaag gaccttataa 49140
agtataatac ttttacataa gatttatctc cttttgtgtg tttctccttc tgtctatatt 49200
ctctctctct cttcctccct ctttctctct ctctctccat ctctctctct ctgtctctct 49260
ctcacacaca aatacacaca catgcaatcg gtgacagtat ataggctaat taagaatata 49320
ttcccatatg atttaaaaat aacagtttta caaatatttg cctttaattt ttcaaagaaa 49380
attaaatcca aatgccagtg attttttatg tgacttttaa aatttaaatt gttaatttgt 49440
gttttcatca atgcttgtat gtgtgcttgt gtattctcac agattatgtg gtgccttcac 49500
agaattaaac atgtgaaact ctccacttga atttctgtga ctcaggactg gtgagcaaaa 49560
agttagaagt cactctcctg atccttccct acagctgcag attcctgaag gtaatgacct 49620
cacagtagac caaggccctc aaaggtgacc ttgagttcca gcacatcttg ggaggccaag 49680
cggatgtttg tgaaagaaat agtggctatg tgacagtttc taaccagaat atctctgtgt 49740
tttcaggtat ccagggtgag gcccagctta cagagtctgg gggagacttg gtacactgag 49800
aggggcccct gaggctctcc tgtgcagcct cttggttcac cttcagtatc tatgagattc 49860
actgggtttg ccaggcctca gggaaggggc tggaatgggt tgcagttata tggcgtagtg 49920
aaagtcatca atacaatgca gactatgtta ggggcagact caccacttcc agagacaaca 49980
ccaagtacat gctgtacatg caaatgaaca gcctgagaac ccagaacatg gcagcattta 50040
actgtgcagg aaacatcgtg atgggaagtc cacgtgggct cagagacaga ctgccatgca 50100
ggacacaggg ggtggcttgg ctgaaggggg cactcagcac ccacagaaga caggagcagc 50160
ccagggcagg ggcaggtgga gttcaagggc tgctttcctg tcaggttctg tggcttcttc 50220
tgcatcaaat gcgttctcct gggagcctct ctatatttat ggttctctgc ctaccactga 50280
ggcctctgga ttggaaaaga ttactactag aaaaaaaaat tctcatatac ccctgaagaa 50340
tacatcatta attgaggcag aagatgtcac aggaggccag ggaggctgtg gaaactgtgc 50400
gacgtggatg cacatctgac aacaaagaca tgaaaaatca gggaacactg ataaaacctc 50460
ctaattatgc catggccctc tctaagccta gtaaagccat tgatgccttc ctgggccaaa 50520
cccacccatc aggggatcac tcctgtgtcc cagcagcaga catgccttag aatctccact 50580
gtatgtaatc actgtctggg aggagctccc agggcatgtg tctttgcatt aaccaggtga 50640
tgggtgtcag agaacagcag ctggatgcct ggtctatggg ttccctgatg ttgaagaaat 50700
gggaggtgca gtctcagagc caatacactg tttatgcatt tttatataga aaccatgatt 50760
tttcttgctt ctctcagatg acatagagga tcaagaaaac agtctgtaaa caattgtaat 50820
gtccccattt cttctgaata aatgcattat ttcttaattc tgagtggggg tttgtcagac 50880
catgcccttc tcctaagcaa ttgttcaatc caggctgaaa ccacatgggg atcacatact 50940
ttggtttggt tcaggtgcag aggtcttcag tagagcaaat ttggtccttc ccacacagta 51000
agcctcacct tcctcagaga aagagctgag attgatccaa ctttgtctga ggtgggagct 51060
gcttctccac accttggagc ttgcagagac ccctaaatgc agctttattg agtcaggtgt 51120
gtctccatgt gggggacttc tgctgctagt gatctctgct cagttctaaa tgtgggttca 51180
gaattaggac acttaggtta tcacgcctca aaaattacca tcattgtaga tagaaataat 51240
agtacaatgc caattgttgt cacttgtttc ttattattat tggagtataa gtttgaagag 51300
acaaattgtt accatatatt tgcataaatc taatgtcaga atctcttgaa ttgctcttga 51360
acacttacaa actggttaga agcagattct tatttttttc tatactagtg tattttggga 51420
tgtcaacatt ttgtccagaa catgtgagta ccaataactg tgtgtttcag aaatgactgt 51480
gagattcagt catttctatc gagtgggaaa accagttaac tttgtctttg atatatggat 51540
ggaagcccaa gatagaggct tgtcagtcat tgtttctgtg ccttctccct tgggaatgtc 51600
tgtatttttt tatgctctgt cctgggtcta taccccaatg gttcccctac tccatggcac 51660
ctgcctgtgc ctgtgcatgc ccctgcccac actctccgtg aaacatctgc tttggctcag 51720
gaagaacccc tcctctgcct tttttcctcc tgcccctggt ccacattctt ctccatccac 51780
aggctctcag cagcacctcc catccacact aaccctacat ggggtcatac cttgtccacc 51840
acttcctctc tcttttcttc tgagctttgc cttttattcc aacagcctgt ttccatctca 51900
cctggacttg tgtacaggaa aggatttacc gagcagtctt gggttgtgca aaccctgaac 51960
attcctgaaa aagtgctttc tcaagctagg cccatattca gctcctggga gatgatatct 52020
gcctttttgg catactcctc ctggtagtat tattaaacca cttgattaag ataaggttta 52080
catctgtaaa actacacatt atttaacata cttaactcat tgagtttgga gtaagtatac 52140
atctgcaaag ttatccccat catcaaggtc ataaccatag aaatcacttc caaaacattc 52200
ctcttatctc tcttaatatt gtgattattt tattagttaa aatgtatttt tgtttgtgtt 52260
tgtctgtgtc tctgtgtgtg tagcctgggt gcacgctata ctacctgttt tcataatgac 52320
ttatggtgaa tgcctattag tgctcaagag gccggcgtct gagcactgga ggtcaattgt 52380
gcaggtgtca cacacatctg tgatgggccc aataaacagc cctgggcaca agcactcagg 52440
tgagcttccc tggtggacaa tgcttcacac atgttgtcat gcatcactgc tgggagaact 52500
ggggacaaga gactcctcag ggaaagaaca cctgggagct catgcctgga ttctcagggc 52560
cttctccctg gtgcctttgc tcattttaat tcatattcat tcgctataat aaagctgcac 52620
ccatgagaat aacagctttt cttgtgtcct ttatttgtac tgattaaggg gcctgaggat 52680
ggtcttggga cactcaacac aattacatca gagttggaga atgctagaaa gttcctgatt 52740
gctgacgcat ggctagagga ttttttataa catcaaagga tgagaaagtg cgggataaaa 52800
gacattcaat gcccagatgg ctacagaatc atatggcatg agatggcatg tacactccaa 52860
taaggagcag gaagtgaaag taatccatgg aatttagaaa caacagatac agcttcctag 52920
gagttgttcc ctgaaaaagg aaaagtaaaa ataatgagga acaacccgaa tatgcaattc 52980
atatctgtga tagctaaaat aatagtaaaa agatgcacat ccagccctgc agtgtgccct 53040
gtgagccgag gctgctagac tcccattcac caccaaaggg tacagttgtc cagaaacaac 53100
acacaacaca taagagtgac acagaaggta gcccagagtt tgggctgggg agaggaatcc 53160
actagacaac tataacaagg aggacagcat ggaaagtggc atcattttgt gatatgattg 53220
atatcattaa tttatatcat cggattgtga acaaagttag ccaatggact atgagagtga 53280
ctgacgtagc agcttctctg gcttcgtgtg ctgcagatga gaggagaatg tttgggagga 53340
tgctggaccc acagctcaca acagacatat gacagacgta gctgatccca acctcaagta 53400
ggatgttctt gatgagacag cttccctggt gcactggata tcagatcctg tatagtttca 53460
gaacttgtgt agtttgtgtt gctttggctt tttctctgga tcttttaggt gctaatgaaa 53520
tgagagtgct tcacaaaaaa atggggcaga caaaggggat agttaagggc ctcctccaag 53580
caatgtggat atcataaaat aaatgttaaa aaatgaaaga actaaacaag aaggtgctgg 53640
ggttgacaca aaggacttaa aacagcacta ccaggagttg ggtgcagcaa tgggcatccc 53700
ttcaggtcca tcagcaagtc agagacctaa acaaatattc cctattcatg ttgaattggc 53760
agagtgtaaa aatctagaag acaaaatggc caggaaaaat gtgcgatttt gcatgggtga 53820
aggtctggca agttaatcat cttgaggact gttgaggtcc tgaggtggtc ctgcccttgc 53880
ttgatgccca ggccgtagtc caactcacac gaaattgcca gggaatagac agtagttttt 53940
ttagtagttc ttgttatcag gcataagtgc atttgaattt tctcttcatg gcctttcctg 54000
gcactatttc tcattttttt taacacacat agtttcaact agatttatca ccttcacagg 54060
gtcacagaga agggtggaag aagggaggcc ctggtatggg tctcgaagaa acatggaaaa 54120
gagtggagag ggacaatagc agggtgtaag gaattattga gaccttactc tgcccctccc 54180
aggaggctca ggccagcctt tttctgcatt tgaggttctg ggttataaac gctgtagact 54240
cctcccttca gggcagggtg acaactatgc aaatgcaagt gggggcctcc ccacttaaac 54300
ccagggctcc cctccacagt gagtctccct cactgcccag ctgggatctc agggcttcat 54360
tttctgtcct ccaccatcat ggggtcaacc gccatcctcg ccctcctcct ggctgttctc 54420
caaggtcagt cctgccgagg gcttgaggtc acagaggaga acgggtggaa aggagcccct 54480
gattcaaatt ttgtgtctcc cccacaggag tctgtgccga ggtgcagctg gtgcagtctg 54540
gagcagaggt gaaaaagccc ggggagtctc tgaagatctc ctgtaagggt tctggataca 54600
gctttaccag ctactggatc ggctgggtgc gccagatgcc cgggaaaggc ctggagtgga 54660
tggggatcat ctatcctggt gactctgata ccagatacag cccgtccttc caaggccagg 54720
tcaccatctc agccgacaag tccatcagca ccgcctacct gcagtggagc agcctgaagg 54780
cctcggacac cgccatgtat tactgtgcga gacacacagt gagagaaacc agccccgagc 54840
ccgtctaaaa ccctccacac cgcaggtgca gaatgagctg ctagagactc actccccagg 54900
ggcctctcta ttcatctggg gaggaaacac tggctgtttg tgtcctcagg agcaagaacc 54960
agagaacaat gtgggagggt tcccagcccc taaggcaact gtatagggga cctgaccatg 55020
ggaggtggat tctctgacgg ggctcttgtg tgttctacaa ggttgttcat ggtgtatatt 55080
agatggttaa catcaaaagg ctgcctaaca ggcacctctc caatatgaca gtattttaat 55140
tagtgaaaat tttacacagt tcatcattgc ttgcttgcct tcctccctcc tgtccactct 55200
cactcactcc ttcttttatt ttctacttaa ttttacaaaa tcatttaacc cctttttgaa 55260
ctattaatag gttatctttg tttggtgatt gttttccttt caataatatg tactgaataa 55320
ttcatctttg tgccaattca taagtattct ggtgtaataa agacttcttt cataaaaatt 55380
ggataaatta aaataaagat aaatttttaa aaacatacga tctatcaaaa ctgaaccata 55440
aagaaataaa aactctgggt tgggtgtgtt tgctcattcc tgtaatccca gcactttggg 55500
aggccatggc cggtggatca cctgaggtca ggagttcgat atcggtctgg caaacgtgga 55560
gaaacgctgt ctccactaaa aatacaaaaa ttagctggac atggtggtgc tcgcctgtag 55620
tcccagatac ttgggagcct aaggccagag aagagattga acccgggagg cagaggttga 55680
aataagccga aatctagcca ctgcattcca gactgggcaa cagagtgaga ctccatcccg 55740
aaaaaaaaaa actgaacaga cctatgagta aagagattga gtcagtgatt tttcaaacat 55800
ctcaaatcaa agaaaagtca agaacttcat ggcttcacta ctgaatttta tcaaaaattt 55860
aaaaaaaaac tagaatctct atacaaattt ccaacaaaat aaagaggaaa aaatacatgc 55920
aagcttattt tggaaggtcc tatttccaaa gcaaggaaaa gacactccaa ataaataaaa 55980
ttacaggcta atatccctga ttatctagtt tcaaaaactc tcaagggtgg tgagaaacca 56040
aattcaacag cacattaaca acagaattca ccatgatcag gtgtggttta tctctaggaa 56100
gcaatgaagt ttcaacctgc agaaataaat gtgatatatc aaatgaaaat attgaaggac 56160
taaaaccata tgcaccatat gtccatgtca atagatgcag aaagagcctc tgtcgaaatc 56220
cactacactc taatttttaa aaatctgaac atattatgca taaaacatat atacctcaac 56280
ataataaaga ccacatatca caagcccaca tctaacatca tacacagtga tgaaaatttt 56340
attttcctct aagactagaa actagacaag atgcttcact atcaccaata ttattaaaca 56400
cagcactggg tggtctagac aaaacaggcc agaagaaaaa aatagaagtc atccatatag 56460
taatgaataa atataaaata tatttttaca tattacatgc tcttatttat acaaagcctt 56520
aaacactcca ccaaaaaaga ttgaaactaa tgaagaaatt caataaagtt gcagaatcca 56580
aaatcaaact tacatttcaa gatggcaggt tagaggcatt gctagtattc ctcttccact 56640
tggaaggaca aactgatgtg gagagatgaa catcgcggac ttattttcaa gaagcaatgc 56700
aggaactgaa cagaaacact gaaataatct acaaactttc tgaaaaagca ggaagctgca 56760
gcctacactg tgagtcaggt gaagggctgg gagtccccag catttgaggg agaacagcca 56820
aaaatttcag ccagtggtcc caagttgaaa gtagctctca acaggggtgt gtaatataac 56880
ctagggttgg gacgaactcc cttggccagg gcctgggtag ggaagtgtta aaagtggtct 56940
ctgcaagttt aggagccatg ggtgcaggag ctggtgccct gctttgcagc agacaggaag 57000
gggcatggca tgaaacccat ggctgcagtc tccatgggga cagcctatga ctcctggcat 57060
ttggaggtat tgatcacaga ttgactgaaa ctcatctcac tgctgccagt ggaacaccac 57120
gggagtggat cagcctcacc aagtatgtgg gaactgtgtg gggcctacca ccacctgcca 57180
ctccccaccc cctgcccaaa cttctgtgga ggagaggcag ccatggtccc atctggaaca 57240
tcatcccagt ggcctgagaa ccacccctgt cccccacacc cacaggggct gctgcttgcc 57300
ctgcatacag agactcagag gggaaaccca cctggcccaa ccctcacctt gctttgtgca 57360
gccacctgcc ctggcagctt aacacaaaag acagcatctt ttgggagcta catagccaca 57420
cccactgcct aagaatccat agtagccccc atacctgggc aacacaaggc ttgcaaaaat 57480
cccaccgcta ataatgcagc tggtgctctt ttgcaagcac cacctcttag ctggaggcca 57540
accaactatg cattacagca tctcctagta gactaacact gcatcctgga aggagaaaat 57600
gactgtgcga tctcagttat caccatggcc tgcaccactt tggatgacca ggagatcctg 57660
agtctctcca tgtgaccagt tcattgctac tatacccatc attcaagaaa gccagtacac 57720
aaaggctatc aatatccatg gaatttcaca gagtctcctt cactctcctg cctgccactc 57780
ccatcagacc cggttctgct gttcactgtt gaaaaatatg aggacagttc acatcactgg 57840
atcacttaga gacatttgcc cacaccagcc tgaagtgtgt caacgtcact gggcagctag 57900
acctagagaa gaaacataac tcacagtacc atggctccca ggttctcctc ctcttagggg 57960
aagggagtgc accacattga gggaacacct catgggacaa gagaatctgg atggcaggcc 58020
ttggacacca gatccctcca ctggtgggaa acttcttcta gcagaagtac agttgcagca 58080
ctgggctcag ctgggaaagt cttcagctct ttctcaacag acagccctgt tgcttgtgaa 58140
gaatcttgaa gaagaggaag cctttccccc ttgtacacca ctgtaggcac acttggggtc 58200
tctcccacaa gacctcagca tgggtgcaac tatagacagc ctttctggaa cacatcattg 58260
tgactgcatc ccccagaaac agcactttct ggattcaggc ttgcatgaga cagagagtca 58320
cagttcctct ctatttggca catgaacatt tgtacagatg aaaaaacatg cctgtcttat 58380
ctgaatagcc ggaatactgg gacagcagta tgtctgagag gtggataaat ttcctactga 58440
cttgacaaga gagctgaggt ggttccaacc cttcccaccg ataagacctc agtgggactc 58500
actaaaacct ctttcagcca actctgtcaa ggctgggact taatttaccc acctgcttta 58560
gccacaacta gtttctaccc aaggaaaagt cctccactga tgtgaagctt gagccatcaa 58620
gcaaataaat aaatcactgg ggacaaataa aataaacatg tgcatgccac agaggaatga 58680
gataaggttt aagagacctc taccattcta accccataga agacagtgaa cttgctcaca 58740
gaccgagcag atttctactg caatcaacac ataggaaagc catcatacaa agattctcca 58800
taaccccgga actcttacag agtcttcacc cctctaagga ccaaaaacca aatcaggttg 58860
taattaatta taagcattaa agtctcattc ttaagggaaa aaaatccatt taaaaacaaa 58920
cacaagaaac agtcaaatca aacataaatt caataataat tagaaaatct accaaaatga 58980
gaggaaatga gaaaaataac tggggaaaaa tgagaaaaca gggtgctgtg ccagtgccaa 59040
aaggtcacaa ggtcacacta cctctccagc aataaaccat aacaaaaatg gagtctttga 59100
aatatcagaa aagaaaatca gaatgttgat tgataagcta ctcaagaaga tatcagaaaa 59160
aggcaaaaat cataataaat aaatttataa aactgttgag aatatgaata caaattttta 59220
cagagagata gacatcctaa agagaaacca atcagaactc ctgaaaattt aaaaaaatgc 59280
agggaattgg aaagggaatt acaaaatgcc atggaaagtt tgaaaaatag actagaaaaa 59340
agtagcagaa ataacaatag actagaaaca gtacaaaata aaagtagaag taaaatattc 59400
gaggaaaaag aaaaaggaaa cagttaaaga aaaaagtaga aagaccagac tattattgaa 59460
ataaccaaat cagagaaaaa taaatttaaa aagagccaaa agaagtgaaa aaagtctcca 59520
ggaaatatgg gattatgtaa aacaaacaaa tttaagaata attggtgctc ctgaagaaga 59580
aaaaataata ataagtttgg gaaaacttct ctgaaggaat aattgagaac tacttctctg 59640
gcctgactaa agacctagat atccaaatcc aaaaagttca aggaactcct ggggaattca 59700
ttgcaaaaat accttcacca agcatacagt catcaggcta cctaaagtct acatgaagga 59760
aataattcta agagcagtaa aacgaagaaa cccatcagaa taatggcaga cgtctcagca 59820
gaaacttgac aagcaagaca gattagggtt ctattttcaa actccttaaa cagaaaaact 59880
ttcaaccaag aattcttttt tatcccgcca aactgtttta taaataaaaa agaaataaag 59940
tcattttcag aaaaacaaat gctgagggaa ttcatcacta tcaaaccagc actacaagaa 60000
atgctagaat aagttctaaa ccttgaaaca aaaggccaat atgcacaaaa atggaacctc 60060
ttaaaaatta aaaactcacg gggcctataa aacaataaca caatatcaaa gaataaacaa 60120
aattaggtaa cgacatgaca aagagaatag caactcatat ctaaatattc acattgaatg 60180
taaatcataa aaggcatgga agaaggaatt tcacaaaaat agaaaccagg agtgagcagg 60240
actagctatt tttgatctca gacaaaacag gacttcaaag caaaaacaat ttaaaaagac 60300
atagatgatc actatacaat gataaaagga tcaattcaac aaaaaattac aattacatat 60360
ttatatgcac caaacactgg aggaactaga ttcattaaac aagtactgct agacctaaaa 60420
aactgagaga gttagcaaaa caatcataat gggagatttt agtacaatca tgacagtact 60480
aaacagatct tcgagacaaa aagtcaacag ataaacaatg cacttaaatg actcactgga 60540
acaaatggat gcagcagata tttacagaac attctatcca agatctgcag aatatacatt 60600
cttctaatca gcacatgcaa cattctccaa ggtagagcat atactaggcc acaaaacaag 60660
tctcaataaa tttttaaaac aatgaaatca tatcaagtat cttctcagac cacagcagaa 60720
taaaactaaa aatcatctcg ctaaagaact gtcgaaaatg aacaaataca tagaaattaa 60780
gaaatttgct tctgaataat atctgggtta acagttacat caagatgaaa atttaaaaat 60840
tatcttaatt aaattataat aatgagacaa gttattgaaa cctcaaaaat aaaggaaaag 60900
cagtgataag aggaaagttt atagtgccag ctgcctgcat caaaaagtct gaaagagcac 60960
aaattcacaa cctaatgtca caccttgaga aattggagaa acaagaacaa actaaacata 61020
gagccagaag aagaaaagaa ataacaaaga tcagagcaga actaaatgca atccaaacaa 61080
aaaaaagcaa tgaaacaaac agttggttat ttgaaaaaat aaacaaattc atgggtcatt 61140
agctagatta acaaagaaaa gaatatcaaa gatccaaata agctcagaaa tgaaacgaga 61200
cattacaatc tacaccacta atataaaaaa taatttgaga ctactaagtt caccttcatg 61260
tgcacaatgt agaagactta gaggaaatgg aaaaatttct agaaacatac aacactccta 61320
gattaaataa aaaagaaaca gttactttga atagacaaat aacaaacagt gagattgaat 61380
cagtaattca agaattgcca acaataacaa caatgaaata gggccaggtg aattcacagc 61440
tgaattctat caaaaaattt aaagaagaat tgctgccaat tttgctgcaa ctatttttta 61500
aatttagata aaaaagaatc ctccctaaat tattctatga agctagtata accaagatac 61560
caaaaccagg aaaacacaca cacacagaca cacacacact ctacagatga atttccctga 61620
taaatataga tgcaaaaata gcaaaaaaaa aaatagctag ttgagttcaa cagcacatca 61680
aaaagataat tcctcatgat caagcgtgtt tcatctcaga attgcaggga ttatttgaac 61740
atactcaagt caataaatgt aatacatcac ataaacagaa ttacaaataa aaaccttacg 61800
attgtctcaa tagatgcaga aaaagcattc aacaaaattc agcatttttt aatgataaaa 61860
actgtaaata aatgaggcat agaagaaacc tgcctcaaac taataaaagt tacatatgaa 61920
aaatccacag ctaatatcat gctgaatgtg aaaaagttaa aagcatttac cctgagaaca 61980
caaacaatac aaggatgccc aagttcacca attctattca acatagttct ggaagttcta 62040
gccagagcaa ttagtcagga gaaaaaaaat aagggtatcc aaatttaaaa agagaacgtc 62100
agactatcac tgtttacaga tcaagggatt atatatatta aaaccctaga ctcctccaaa 62160
atactaatag ttttagtaaa tgaattcagt taagtctcag attacaaaat acatgtacac 62220
aaattagtag cacggctata tatcaacaac agcaatgctg agagttaaat caagaactcc 62280
atccctttta cagaagctgc gaaaagatag tatatttacc aatatactta accaaaaggg 62340
taaaagatct caacaaggag aactacacaa cactgctgaa agaaatcata gatgatacaa 62400
acaaatgcaa atgcatcccc tgatcatgga ttgcaagaat cgctattgtg aaaatgacca 62460
taatgcctaa agcaatctac agaatcaatg aaattcttat taaaatacca acattatttt 62520
cttcagaatt caaaaataat aacgctgaaa tttatttgaa accaaaaaaa agccaaaata 62580
cccaaagaaa tcctaataag ataaagaaaa ttggagccat cacattactg aacttcatat 62640
tacaccacaa ggctgcagtt accaaaacaa catggcactg acataatagt aggctcatag 62700
accactggaa caaaatagag aacccagaaa taaagccaca tatgtaaatc caactgatgc 62760
tttgcaaaat gtaccaaatt ttaaattgaa aaatagacac cacatttaac aaatggtaca 62820
agaaaaacta gcaagccaca tgtaaaagaa taaaactgga tttctatctg tcaccatata 62880
aaagaccaac tcaagatgaa tcaggtactg aaatataaga cattaaactc aaaaattcta 62940
gaaaacaata ttggaaaaac acttttagac atcagggtag gcaaagaatt tataactaag 63000
accccaaaag caaatgcagc aaaaacaaaa ctaaatttat ggaacccatt taaactaaag 63060
tgtttcttca cagcacaact aagagtcaat ggagtaaaaa gacaactcac agaacgggag 63120
aaaatatgtg caaacttcac atctgacaaa aaattggtat attcagaatc tacaaaatac 63180
taaaacaagt cgccaagaaa aaacaaacga tcccatttga aagtggacaa gggacataaa 63240
tagatagttc tcagaagaag atatacaaat ggccaacaaa catatgaaaa actgtgtaac 63300
atcactaatc atcaggaaaa tacaaattaa aaccacaatc taataacacc taatcctgca 63360
agaatggcca ctataaaaag tcaaaaaaca aaagggaatg cttatacact gttgatgaaa 63420
atgtaattta gtataaccac tatggaaaac actattgaga tttcttgaaa agcagaaagg 63480
tagatctact attttttttt tcttttttga gatggagtct ctctcagtca cccaggctgg 63540
agtgcagtgg tgcaatctca tctcattgca acctccgcct cccgtgtcaa gtgatgctcc 63600
cacctcagcc tccggagtat ctgggattac aggcacccac catcatgcct ggctaattgt 63660
tttttgaatt tttgtagaga aggggtttcc ccatgttggc caggctggtc tccaactcct 63720
gacctcagct gatcctcccc gctcggcagc ccaaattact gaaattacag gcgtgcagca 63780
tcacacctgg ccagatctac tgtttgatcc agcaatctca ttactggaga gctacccaaa 63840
ggaaataaag tcattatatg aaaaagacgt gtatatgtat gtttatagca gcagaattca 63900
aaattgaaaa tatgtgaaac caatttaaat gcccattggc caatgagttc agaaagaaaa 63960
tgtgacatcg cctgtaatcc cagcatttcg ggaggccgaa gagggcggat cacgaggtca 64020
ggagatcgac accatcctgg ccaacatggt gaaatcccgt ctctactaaa aatacaaaaa 64080
atttgccgga cctgttggcg tgcacctgga gtcccagcta ctcgggaggc tgaggcagga 64140
gaattgcttg aacccgggag gcagaggctg cagtgaaccg agattgcagc actgcactcc 64200
agcctgggtg acagagcaag actctgcctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaaagaaaag 64260
aaaaagaaaa tttgacatat atacatcatg gaatactacc aagccgttaa agggaatggc 64320
ataatgtcct ttgcagcaac ttggatgaag ctggaggtaa tgagtataag tgaagttaca 64380
caggagtaga aaagcaaaaa ctgtgtttgc acacttacaa gtgggagatg ggctatgaac 64440
ttgcaaaggc atacagagtg atataaggga ctttggagac tcagaaggga aagaatagga 64500
tggatactag agagaaaata actacacttt aggtagagtg tacactattc aggtgatgaa 64560
tgtactaaaa tctcagaatt tattgctata taattcctcc atctaacaaa aaaatattta 64620
cccccaaagc tattgaaatt aaacaaaaat caacctacaa aaataagcat cttctgtata 64680
cactaaaaaa tgattattca aaattaaaat caagaaaata aatctaaata caacagctta 64740
aaattcataa aataaatttt accaaaataa atttaacaag gatacaaaat atctgcacat 64800
tgaaaattat aatatattga ttaaaatgta agaaaacaca aataaatgga aggctatctt 64860
gtgttcttgt gttactggaa catacattgt taatatgtcc atcctaacct aagcatttac 64920
agattcaatg caatcccatt caaaatttca aagatatgca tttacataaa ttgaaaaaaa 64980
aaacctctct catttgaatg gctggggtga ttgacccgga ctatcaattt gaaatcagac 65040
tactactcca caatggaggt gagacagagt atgtctggaa tacaggagat ttcttaggac 65100
atctcttagt attactttgc catgggatta agatcaatgg gaaaaaacaa cctaattcag 65160
gcaggaatac aaatggccca gatacttcag aaataaaagt ttgggtcttc acccagatta 65220
aaaatcctga ccagccaagg tacttgctga aggcaaaaca aatacagaat gggtagtgga 65280
agaaggtagt tgtcaatacc aggaatgacc acacgaccag aagtggggac cgtaattgtc 65340
gtgagtatct ccttaagctg ataagcaact tcagcaaagt ctcaggatat tttctccata 65400
tcttgttagg aatatatttc tgcatgtgta taactgtact aagaaaatat cttcattgtg 65460
ccggacacgg tggctcacac ctgtaatccc agcaatttag gaagccaagg tgggtggatt 65520
acctgaggtc tagaggtcga gaccagcttg accagtatgg tgaaacgccg tctctaccaa 65580
aaatacaaaa attagcctgg catggtggca ggtgcctgta atcccaggct tctcagaagg 65640
ctgagacagg agaatagctt gaaccctgaa cccgcgaggc agaggtggca gtgagccaag 65700
attgcaccac tgcactccag cctgggcaac agactgagac tccatctaaa aaacaaacaa 65760
acaaacaaaa atatattaat tgttttcatt gaatttgttt tctttttatc atgtgtcaca 65820
agatttattg acttcctatc agcatttaaa tgttgttaac tatatgtagt ggtatgtatg 65880
taggttaagg attagtgcac tttcagttgt atgaaggata gctgtattat gttaggcata 65940
attatgacct tattattgtc tttatttgga gttcaagcat gattgcagct agatgtgtag 66000
gggtgctaag ttgacaagag gtgggctttt gatgcttgat actaggtgtc aacttgattg 66060
gattaaagga tgcctacgtg gctgggaagt attgtttctt ggtgtgtctc tgggggtttt 66120
gccagaggag gctgacattt gagtcaatgg actggaaatt tgagtttgtc atgttgcatg 66180
atccttttaa agtcttatag aacttagttg actattattt tggtgtagtt catttgtata 66240
aatatttctt tgaagtttaa ttttcttcct ttgcgtttgt ctgtcactgg caacacggta 66300
attgtagcct tttagaaata gcttagaagg ttggcgactc atcatttttt aaaaaagtta 66360
gagaacagtt ggcatgactt ttttaaattc tgagagccat tttttatcta acatataggc 66420
tatcatgaag aatatttata gtgtgcttga gaagcatgcg tattacactg cgcttggttg 66480
gaatgttctg tagatgtcta ttaggtcagt ttgttcaata gtgttgttta agtccatggg 66540
cttcctaaga atttttttat gggtgttcta tacattattg agggtgaggt gttgaagtct 66600
cctcctttct tattgttttc tatttctcac ttcatatctc ttaaactctt gttaatgcgg 66660
ttatatttct atttttataa ctatgtaaaa tagaaataaa ataataattg cttagtaatt 66720
ttaatgggaa aatcacataa taagaaatta tattttccca aatgctgcca tcaccactaa 66780
actcctccag gagtctcaca tctgctctgg gctctgctct ctcctaaggg gtcccacatc 66840
agagtttgct acagaggagg agacaagaaa atagggccct ccctctcctg atgaaaacca 66900
gccctgccct gaccctgcaa ctctgggaga agatctctag tccagaatta ccaggagttt 66960
ggatttgatg atcagctctg tacaaacatg gctcaccata gagttagggc tgagctgggt 67020
ttcccttgtc attattttaa aaggcgaata atggagaact tgagatatgg agtgtgagtg 67080
gatatgagtg aaaaaacagt gattctgtgt ggcaggttct gactcagatg tctctgtgct 67140
tgtaggtgtc tagtgtgggg tgcagatggt ggagtcttgg ggagagttgg cacaagctga 67200
atgtgcctga gactctgccg tgcatcctct gaatccacct tctgtagcta ctagatcagc 67260
tgaatctgcc aggctccagg aaaggggctg cagtgagtag tagatataat gtacgatgga 67320
agtcagacat aatatgcaga ctctgtgaag gtcagattca ccatctccaa agacaatgcc 67380
aagcacaggt tgtatctgca aatgaacagt ctgagagctg agaatatggc tctgtattat 67440
tgagtcaaag gtaccaaatg aagggacatc agtgtgaacc cagacacaaa atttcctgca 67500
gggaggaggg aggaggctgg gctgcagtgg gcactcagca cacacaaaag gcagggacag 67560
ttccaggggc aggtacaggt gcaggtgaag gcaaaggtct actttccttc cagatctgtg 67620
gattcctctg catccaacag ttcgcctggg cctctgtctt tatggatctg cgcctaccac 67680
tgatgtctct gggttagtaa agtttgctac tataggagga aacattgtca tttgtcagaa 67740
aggcgaataa tggagaacaa aagatattga gtgtgagtgg atatgagtga aaaaacagtg 67800
attatgtgtg gcaggttctg accaaaatgt ctctgtgttt gtaagtgtct agtgtgaggt 67860
gcaggtggtg gagtgtaggg gagaggcaag aggcagaaaa gcgcgcagga ggccgggtga 67920
ggctgtagac attgtcagct cactatgcca atctcacaac agtgctggag aaggtgggag 67980
tctgatggag cttcccaaca accctgtggt ctaagctaag tccattaagg ccgctggttc 68040
ctcctggaac atagctgtcc atcaggaatc ccccatgtgc ccagcagcag ccacgcgtta 68100
gcatcttcac tgtgcacagt cattgtttgg gaggagctcc aggatgggtc tctttgtcaa 68160
aaaccgggtg atggtgtcag agagctgtgc cgggtgcctg gtccaggggc tccctgacgt 68220
tggaggtata ggaggtgcgt tctcagggtg ggaacacctt ttatggaaat gtacagaaga 68280
aaacatgatt ttccttggtc ctctcagatg acatggagaa gaaagcgcgc agcttgcaaa 68340
caattgtaat gtccttgtaa tttcctactt tatcccaagt tcattgattc ttgtaaacct 68400
tggtttctgt ccaagtacag agatattgat tagagtgagt ttggttcttt ccacacacta 68460
accctcacct cccccagata aagagcacat tgtccttact ctgagtctga gggaggagct 68520
gttcctgtac aactaagggc ctgcagagac ccccatgtac agctttgcag agtcagatct 68580
ttccacatgt gaggcgacct ccacggccca tgattgctgc tcaggtctaa ttgtggattc 68640
aggattagga catcctttag gctatcacag gtcaatcaga ttctgaaaaa tcactgttat 68700
catagacaga ggtaataatt caatacccac tcccctgaca gcagattctc tttcttattt 68760
ggttgaaagt ttgaagaaaa taagtgacca tttattattc ttattctaac tttagtatcc 68820
actatttgtt ctaggggatt cacaaatttc aaaacactga gctcttcatt ctcatgaaaa 68880
tgtgcatatt tgtgaatttc aacgtgttgt tcagaacctg tgcatgccga catctgtatt 68940
tctcgtgcgt tcttggcctg gcgaagccct cacagaccct ctccctcatc tgtgctgtct 69000
ctgcttctcc atcacaacca gtgcttcctg ctggagctgg atccctcagc tccccaggga 69060
agggactgga gtgaatcagg tgcacaggtc atgagggaga acacaacgca acccacgcct 69120
caagagtcca gtcaccatct ccagatccac atccaaaaca cagtttcttc tacagctgag 69180
ctacctgagc aacgagtaca caaccatgaa tttttacaca aaagatacag caaggggaag 69240
tcattgtgag cccagaaaca aacctccctg cagggaagct caggaactgc gggaggccct 69300
cgggacacca gggggcgctc aggacacaca tcaaggcagg tgcaagagga aaaggtgctg 69360
gagatggggt ttggcatcat catcatattt cactgacacc cgccactgtg tttattctca 69420
tgtacgtgat tctttgtatt attagaaaat ggcgtttatg taaataaata accatatgta 69480
ggtgcatcaa gtcgtcctct cccttttttt tttttttttt tttttggagt cctgctctgt 69540
cacccaggtt ggagtgcagt ggcgcgatct cggttcactc caacctccgc ctcccgagtt 69600
caagcgattc tcctgactca gcctcccgag tagctggaat tacaggtgtg caccaccgcg 69660
cccggctaag ttttgtattt ttagtagaga ccggatttcg ccatattggc caggctggcc 69720
tcaaactcat gatctcagtt gatccgcccg ccttggcctc ccacagtgct gggattacag 69780
gtgtgagcca ccgcgcccgg cccgtcctct ccatcttatg tggaactttt ccattaagac 69840
tctgagtccc tggatttatt tgagaacctc ataaatcatg gtcaattatg tctctttctc 69900
ctctttctcc cttcttcact cctctctagc tcacaaactg aaacacacac agaattttct 69960
aacttcaatt acctgatgtg ttgaagacaa ttgattaaag cgcagctttt ccagttcagc 70020
cactgttcat attgttgtaa gaataagaac gttgtgtttc tcagctgcgt gcttctctaa 70080
gatgagtagc agctttttta aataataccc agaggctgaa agcaatctga ataccaatca 70140
tcagcttaat cagtaaacac aaggtggtaa attcgctcac tggaaaaaca ccgattgtta 70200
caatcaggta aggctggata ctctcaacag caagtgtaaa ttcacaagta tatatgctga 70260
ttaaaataag acaaacaaat acaagtacat acatactgtt ccacttttac aaattctata 70320
aaatgaatgc taatctaaag ttacataaag aaaaccagta gctgactctg gacctggtgt 70380
gaggagggaa gggttaggaa ccagaaattg taggaaatga agaagaaatg ctgaaggtag 70440
tggagttttt tctatgttga tgaaggtaat agttatgtca ctattaatca aatcgtacac 70500
attatgggat gcctattatt tgtgaatttc accctattaa aatattacaa gttaaaacaa 70560
gtataatttt gtagaaaatt agttagacat agatgaataa aatgtatgat aaataaaaaa 70620
agaaaatcac agaacaatag cataaggact tcactcatca aactgaagaa attttaaatt 70680
tctcaacaca gaattaaaga tttaattaga tatacataag aaatcaaaga ctcctggata 70740
tacacacaaa taaaccctaa gtccacctgt atttttaggg aaacgctaga atacaagaaa 70800
ataatgtcat gatttcatta cataacgggg gttaatgaaa ccacatcagg catgtccagc 70860
tgtgtcctgg ggttggttca gggaacgggt gtgtcctgtg gttaggagac gtggcaacaa 70920
gctcacagca tcagttctag ctgacaccat aaaaaggcca agagatcaca attaaaatgt 70980
catgcggatg tcacatctgt gggtgcggca cactccccca tgtgaatacg gaaaggttaa 71040
ctacactctt caggtgtctg ctgagagtag agctgtctct caggaatgtc caaaatggct 71100
caatagagca agaaaggaga ctggctcagg gttcctgtag tgccttggtg gtgtgggcag 71160
agtgagggtt ctcactcaag aaaggagttt gtggcgtttg aacatctaca tggcttcaaa 71220
tagggtaact cctgtgattc ctaactagat tcacctcgtg tgggaaagaa aggagatgat 71280
gaaggaatga gccttaagtt atcagcagtc agacatcaaa acaatagtct gatgacttat 71340
tctatgtagc acctataaaa atcgttccgg gcgcggtggc ccaaacctgt catcccagcc 71400
ttttgggagg ctgaggcggg tggatcatga ggtcaggagt tcaagaccag cctgaccaat 71460
atggtgaaac cccgtctcta ctaaaaatat ttaagaaaaa aaatagttgg gttatggtgg 71520
tgggcgcctg taatcccagc tactcaggag gctgaggcag gagaatagct tgatcccagg 71580
gggcgtaggt tgtagtgagc tgagatcaca ccactgcact gcagcctggg tgacagagca 71640
agactccgtc tcaaaaaaaa aaaaagagta aaaaaatatc agcccaagat gggtggacaa 71700
caaccaggcc tacaaaaaag gagaagactc cttataagaa taagcaaatc ataatgaaaa 71760
ttaggaggaa aacaaggaga gtgaggtgaa aggcatgggg caggggatta gacaagggtc 71820
ctgttccaat gtcttgtgtg gagacttttc actatctaaa atcatccacc tattctgaat 71880
gtcttaggtg aactgtctgc tccaaaacat cagaaccacc agaggatttt tgaggatact 71940
cagtttaata tcttatattt gaggtgcctt acaactgtgt aaaatgctta gttattatca 72000
gtgtaattag agatagggcc tcactgtgtc acacaggttg gggttcagtg gcacaatcat 72060
agctcactgt taccttgaac ttctggccca cataatcctt ctgtctcagc ctcctgagta 72120
gcatggacta gagaggtgca ccaccacaca cagctgattt aaaaaaaatt gtttcataga 72180
aatggggtct ctctatgttg cccaggctgg tcttgaactc ctggtctcac gtgattcccc 72240
ctggttttgt ttctcaaagt ggtggaatta aaggcatgag ccaccgtatc tgctcagaaa 72300
tgattatttt gttgcaaaat actaacccaa gaattgactc cctgaatttt ctctgcagca 72360
ttttggttaa tagtgtctga taagatttat ttcaatagtt tcaacagcag agtgttctcc 72420
tgatgtttcc tccaatagtg ataatttcat ggttgaagat cacaaactac tattaaaaga 72480
tgacataaaa aggcaacctt aaacttttgg tgatggagtg agtataataa aaaattactt 72540
tcaatattgt gtaacacacg cctgcagtag gaggaaggtg agcaatgagg gtaaaatttc 72600
taaacgtatg aatcttccag ctccccagtc atagggcagt aactgatgag tcctgagaga 72660
gggaacgtaa tgccgtagtg cttgtgggat aactcttggc caagagagtt tccatatttt 72720
attaaagtgg ttataatttt taaatttaaa gatgccattt tttcaacata tccagaatat 72780
tgtgagcggg attgattctg tatgatacga gcaatggcga tgccttctgt ttggataata 72840
ttacaaacca ggttaagact gagtggtgta acgatgcacc agaacattat tctagcttcc 72900
atactagatt ttgtttttct ctttgtttgc attagtttca aatttatatg taaggtctct 72960
agaatgtagg agtttatttg aaagtgtctt ttcttgttgg ccattttgat ggggcttcca 73020
ggagatttaa aaacctcctc tgcctgcagc acagtttaaa attctgcgtt acagtagaac 73080
atctgtattt aatcctggtc tttggttgat tgacaagctc taatacatgc aataacttct 73140
gccttctggg ctggttttac atcaggtaga ggaatatata ctaagtgaaa atttgcacta 73200
gtaatatata ttattaataa ccaccacttg tattatttaa gtgttattaa tcaagaatta 73260
atgttaaatc aagggtctca atggcaatat tacctaaggg atatacaaga tattttgcta 73320
atctaggtaa aatagatgtg aacacactct tagtatccag ccatgtctcc tgtctatcac 73380
attattaacc acacagtaaa ttcacttggg acttgttcta attatctaat tagtcactta 73440
cttatctcaa agcctctgga ttattatgtg tgactatttt agcagagagt gaagaaagac 73500
aacccaggct gaccaaacaa tgaggaaaat cacaacctga tgaaaccaga aacctggatg 73560
tgagtggctc caggattgaa taatttgaca gctcatgtgc ccaggctgtt tcttgtctca 73620
gttttccaca ctgatacatc cagaaaggca gcttcacccc ccagaggact cccatcatgc 73680
tgtgacatgg tgacaacatt cccaaagctc acacacatat gttaaatatt ggctggaaaa 73740
ggggcagaga catttctgga attctcttct gaaggaccat gaatgcctca accaaccatc 73800
tcccctgcct ccatgactag aaatgcacca cgtgcccaca cggatattca tccctcatgg 73860
ggataagact ccattgatga ggctgactat tttatcatat aaaattacta aagactgatt 73920
taagggtttc aaaaactaat tgaactctgt tgttctatgt ccaccagaga ttacaaatct 73980
tccaatgatg ccttctttgt tttttgtctg cttgactttg tctcttcaac ttgttctgta 74040
ccccagagaa tctctttcag ctccctcagg tgcattcaat tgttttattt aactgacaat 74100
ttctaaatca gttaaagaca ttacgctaaa gactccatat tcctaggtcc atattccttt 74160
ttccatattc ctaggaaggc attgtgaccc agagtctggg catgaccttg tgagtgttcc 74220
tgaccctcct ccatatgaga tgctggtctg ggtgttcttg cccctttccc tggggtagag 74280
tcctcctgtt ttccccaggt gctccctccc acagctctag tgttctcaat cagtgtcatc 74340
accttccaga tcttctgccc tgccctgcag actaaggctc tgattccata agcaagatag 74400
gggagctgct cctcaataga tctttggtga ggatctctgt tcccatctca attcctgtag 74460
ggtggaacca gtgttcctag gattctggtt tcagtagctt gtccctgcag agtaaattct 74520
tagttctgta gggggattaa gggagttggg tctgaataca ttttagatgt cgaggatctt 74580
gttctctccc agaaagacac ttcgggaaag taagactttg gtaactgtcc cctttcttgg 74640
ggaaagggat tcaagaggat aggttgcttt tgggcatgtg gtcccttaaa atttcacact 74700
aaaaagcgtt tcccacactc aatttcaagc agcccaatat atatttgtat tttttcttgg 74760
aacagacaat attttatatt ccagactctg ccttaggtaa tttcaaaccc tggctttgtt 74820
actctctaca agaaattgct tctccataag cttcagattt gttgtgtgtt ttgaaatttt 74880
atcagaaata ttaaagaaaa ttggcaaaat tccatcctcc atgtttatct gttattgttg 74940
atgcagttgt aaaaaataag aaaaatatat tccttttttc tgtacatttc caagcttagt 75000
agcaaatttt tagtaacacc cagaataata aaaaattcaa atattgttta gctgcttaat 75060
aggaaaacaa attatagtaa atttgtttgc tagaatgcta cccagcattt ataataagta 75120
aacatttgat atacccaact acaaggtaaa atatccattt atgctaacta aaataagcca 75180
aacaaatgag aatatatact gttatttcat ttttataaat tctgaaaaat taaaatgaat 75240
ttgcagcaat gtaaagatca gtagttgcca gggaaatggt agaagaaaga aaggaaaagg 75300
agaaagaata cagaagaaca aaaggaaatg ttaagaattc tcttgtccaa cttgataagg 75360
atgacggtta catcattttt atcaactgta atctttaaat atgtgaaagt ttattatctg 75420
taaactaaac gttataaact ttattacaag caaaaattga aagttagaca agaaggagtg 75480
atagaaagag aaaatgtata ttaaatttca gaaatattta agaatgtatc tgcctgaacc 75540
ctagttctca ccatatcttt aggtgaatgc taaaatgcag caaaatcacg catgttctca 75600
ctacagaaag tgggttctac aaaccacact cggcacattt agctttgtcc tggagttggt 75660
gcagggagtt attggggcca gtgatgagga gcacaggcca agataccagc gattacttat 75720
cccaaacatg agctctaaca tacacactta gtcccttttc cgtgtgtggt ttacttccac 75780
atctgtacat ggagagacca ctgactgaca aaatataatt tatacaaata tgtaaaatta 75840
aatagggtga tcagttcaag gtgtttatca cagcataatt ttacaataag acagcatatt 75900
tcccaaatac catcattgtc accaaactcc ttcaaggcac agtcatctta tctgggcccc 75960
gtcctctcct caggtgtccc accccagagc ttggtatata gtaggagaca tgcaaataag 76020
gccctccctc tgctgatgaa aatgagccca gccctgaccc tgcagctctg ggagaggagc 76080
cccagccgtg agattcccag gagtttccac ttggtgatca gcactgaaca cagaccacca 76140
accatggagt ttgggcttag ctgggttttc cttgttgcta ttttaaaagg taattcatgg 76200
tgtactagag atactgagtg tgaggggaca tgagtggtag aaacagtgga tatgtgtggc 76260
agtttctgac cttggtgttt ctgtgtttgc aggtgtccaa tgtgaggtgc agctggtgga 76320
gtctggggga ggcttggtac agccagggcg gtccctgaga ctctcctgta cagcttctgg 76380
attcaccttt ggtgattatg ctatgagctg gttccgccag gctccaggga aggggctgga 76440
gtgggtaggt ttcattagaa gcaaagctta tggtgggaca acagaatacg ccgcgtctgt 76500
gaaaggcaga ttcaccatct caagagatga ttccaaaagc atcgcctatc tgcaaatgaa 76560
cagcctgaaa accgaggaca cagccgtgta ttactgtact agagacacag tgaggggagg 76620
tcaatgtgag cccagacaca aacctccctg caggggcgca cagagccacc agggggcgct 76680
agggaccgcc tgagtacggg acaggtccca ggagcaggtg cagggggagg tttccttttt 76740
ccttggctgg aaaagtcacc tttatcttcc cagggctcga gccttctagg ctgtgatatt 76800
ttattacttg tatttactgt tcatttatta tcattagttt ttaaattttg gtaattttta 76860
caactctatg gatatatttt taagtgtata ctttcaagaa ataaacattc ctaattattt 76920
gcactgattc tcccagagtt ttattaacat ttgttgacat cagcaactac atagctatag 76980
ggacaaacac ttttaacgat agacagttgt ttaggcctga aaccccgttt atactaaaaa 77040
tttacaaaaa ttagcctggc gtggtgaagg gcgcctgtaa tcccagctac tcgggaggct 77100
gagcaaggag aattgcttga atccgggaag cggaagtcac agtgagtgga gtggactgcc 77160
actacactcc agcctggcga cagagcgaga ctttgtatga aagaaagaaa agaaaaggaa 77220
gaaaggaaga aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa 77280
ggaaaagaga gaaagagaga ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa 77340
ggaaaagaga gaaagaaaga gagaggaagg aaggaaggaa gaaaggaagg aaggaagaaa 77400
agaaggaaag aaagaaaaaa gatatataaa cacgcagacc tatgcatata accataggga 77460
tttatattaa acattacaat aaaataattc taaaaatgtg tcctaaggaa tcaaacataa 77520
tgatgaagta aatataaatg ttagagtaat ttataattga tttgttattt ttaatcgttt 77580
acatgaattt atttctattt gttcatttaa aagtagtata ttggtcattt caagagagct 77640
aacagtaaat ttcagatgtt gttgttacga tatatgataa gaatttgagg tggtgaatga 77700
taattatctt atttctcaat tatcttagtt attccatatt gtattcacaa atcataacat 77760
tgcttcttac cttataaata taaacaacca taatttgtga aattacaata attttcttta 77820
ttttaatttt ttaatttatc ccagatcatt atctttttct tcgcttccag atctcactgg 77880
atcatctcga gggcccatcc tcacccctgt ctcccgaaga cttctggaga ggctgcagga 77940
cgggcagaag gaggagcccc gtgtgagtcc acacgacctg gagcctccct ctccttggat 78000
taggccatct cctcgggatc acagggctct tcattatcct taccccgctg ttgtaccaaa 78060
caagcaacat cacacttcaa ttcatcaggg tttgctttaa ttttctaaat catcgtgaag 78120
gtgataattt taacagtaac gtatcacaac caaataggat aagccctttt ccatggaaca 78180
gggtttctta tcaggatata catgtattat ggattctcaa tttatttgta gatgagatgc 78240
tattatctcc atattgtaga tgattctgct aagtcatctc ttaaaattaa tttttccaaa 78300
gactcaaaca aataaatgat ataattacaa atttcaggtg taatagctga gccaacattg 78360
agattatatt aacatttaga acatgaactt gcaaatattg ttattttcct gtcggctgtc 78420
cccaattgtg attttataca gaatattaga aatttatcct gataaatcag gttaaaatat 78480
tatatcacta gtttattaac ttttataact aataatataa aatgttccac atatttttta 78540
gccatgtttt acttacccgt gatatgtgta tttattaatt tttcatttta agatgccacc 78600
tttatctttc ttatttctgg gattttattc tagtagatag agctgaatgc attttaataa 78660
ttatcataat aatcacattt acattttgca ttttaatttt catatacatt ttattaatat 78720
tttaatttca atataaaata ttttcctaca aatgtcaatt tttgattttt atgagataaa 78780
attaacctat acaaaataca tatattttca atgtacagtt tgagggtttc tggcaaatgt 78840
gcacacattt gtctccagca tctaagttat gatgaggagc aggtccatct ccacaacaag 78900
tgtcctcttc ggtgcttcca gtcagctctc acataaggaa ttttttttca aatttaatat 78960
agatacagag ggtaaatgtt tggatttgtc acgggggatt attgagtgat gctgaggttt 79020
ggaatacaga ttcccaccga cctctccctc ccactctcca gcagtccaca gtgtctatca 79080
ttctcataat tatgtccatg tgtgctcaat gctgaggtct tacttaggag aatatgtggt 79140
attcagtttt ctgctcctac attaatttgt ttaggattaa gggccccagc ttctttcatt 79200
ttactgcaaa ggacatgatt tcattctttt tcatggctgt gtagtattat acattgtaga 79260
tgtaccgcat tttgtatatt cagtctacca atgatgtgca tctggtttga tctatgtcgt 79320
tgccactgtg aatagcacag caatgaacat agatgtggat gtgtcttttt ggtagaatta 79380
tttgcttact tttcagtgta taccccgtgg tgggattgct gtgtaaaatg atatctctgt 79440
tttaagttct ttgagaaatc tccagtctga tttccaaagt ggaaacacca atttatattc 79500
ccctcatcag tgtatgtgtt ctcttttctc cacagtccca gcagcatcca ttgttttttg 79560
actttttagt gataaccatt ctgagtggtg cgtggctgca cacctacagt catctcatct 79620
ttgataaggc tgatgaaaac aagcaatgag gaagggactc cctgttcaat aaatggtgct 79680
gggacaactg gctaggcata tgatgaagat tgaagctgga tatctacttt caacatgtat 79740
aaaattaaca caaaattcat taaagtttta aatgtaagac ctcaaaccat aaaaatcctt 79800
gaagacaacc taggaaatac tcttcttgac atcaggtttg acaaaaaaat gttggctgag 79860
tatccaaaac caattgcaac aaaaagaaaa atagacaagt ggggcctaat taactgagga 79920
gctcctgctc agcaaaacaa acaaagaagc aaacaaaact aacagcacag tactcagaca 79980
acctacagaa tgtggaaaga tattcacaaa cgttccatcc aacaaagccg taatatccag 80040
aatctatagg gaaattaaac aaatcaagaa gcaaaaaata ataataataa taaccccatt 80100
aaaaatgggc tgatatggtt tgctgtgtcc ccacccaaat atcaacttga attgtatctc 80160
ccagaattcc catgtgttgt gagacggacc cagggggagg taattgaacc atgggggcct 80220
gtctttcccg tgctattctc ttggtagtga ataagtctca ccagatctaa tgagacttat 80280
caggggttta tctgatgggt ttatcagggg tttccgcttt tgcttcttcc tctttttctc 80340
ttgccatcac caggtaagga gtgcctttta cctgccaccg tgttttggag gccttcacag 80400
ccatgtggaa ctgtaattcc aattaaacct ctttttgttc ccagttttgg gtgtgtcttt 80460
gttagcagtt tgaaaatgga ctaatgcgtg ggcaaatgac acagacactt ctcaaaggaa 80520
tacatacaag tgaccagcaa atatattttt aaaatgttta acatcactaa tcatcagaga 80580
aatgtaaata gaaaaatgtt ctgatttctg tcactatagg tccattttct tgttttgaat 80640
ttcatataca tggaataaaa tattatagct catttttgta agaagctttt actatctgtg 80700
aggttcattc atgtgatagc atctatcaag gttttgtcaa catatgtata aatatgtatg 80760
tactcataca catatagata tttcatatct gaatcagtcc attgcattaa taaatgacag 80820
attattaaat aaatcagttc attaagtgaa taagtgacaa tatgtatatc tattttcctg 80880
ttgatggaat ttaaatttgt ttccaatata aatatcataa acaaaactgt catacatatc 80940
tttgtacaag ttcttctgtt tatattcaca tatttttatt gataaaatat gttgaaatat 81000
aagtatgcat tatacctttt cagctttatg gagctatcac tgacaaataa aattttctgt 81060
atttaaggta caccaattga tgtattgata ttcttgggga aatgctcata atgatcaagg 81120
taattggcat gcctatcatc tcagagagtt aacattttat gcctttaatt tattgtgtat 81180
gtgtgatgaa atcacctaat atctacttgt ctggcaaaag atatgtttat aatgcaacat 81240
tcattagtat agtcacattg ctgtaggttt gatctccaga actatttcaa cctgtgtatt 81300
agtccattct caccctaatg taaggaacta cctgagactg ggaaatttat ggagaaaagt 81360
ggtttagttg actcacagtt ctgcaggctt aacagcaagt attactagga ggtatcagga 81420
aacttacagt catcacagaa agtgaagggg aagcaaggac cgcttcacat gctggcagga 81480
gagagagaaa gagcaagggg agatgcacca cccttttaaa ccttgagatc ttgtgagaac 81540
tctgtcacaa gaacagcaaa agggaagacc gcccgcatga tccaatcact ccccatcaga 81600
cacctgctac aacacttggg gattaaaatt tgacatgaga tgtgggtgaa aacacagagc 81660
caaaccatat cattccaccc atggtctatc agaaatctca tgtccttctc acattgcaaa 81720
atatcattat gccttctcaa cagtcttcca ggcttaactc atttcagcat tatcacaaaa 81780
atctatagtc taaagtcacc tctgagacaa ggtaaatttc ttccccctat aaacctgtaa 81840
aattaaaaag aagttagtta tttccaagac acaatggaga tgcatgtact gggtaaatgc 81900
tcccattcca aatgggtgtc attggccaca gaaaaggggc tacaggcccc atgcaagtcc 81960
aaacaccagt agggcagcca ttaaatgtta aagctacagc ataatttcct tttaccccaa 82020
gtctcacatc caggacacac tgatacaagg gttgggctcc caaggcctta ggaagctcca 82080
ccctgtggct caacgtggta cagtccccat gactgctttg ataagctggc attgagtttc 82140
tatggcttta caggcacacc atgcaagctg ttggtggatc taccattccg gggtctggag 82200
gaaggtgccc ctcttctcac agatccacta ggcatctagt gcctagtgcc cagtgggtac 82260
tctgtgtggg agatccaaca ccacattttc cttccacact ggcctagtag aggtactcca 82320
ttagggctca gccctgcata agacttctgc ctgaataccc agacattttc atacgtcatc 82380
tgaaatctaa gaggaagctc ccaaacctca actcttgcct tatgtgcacc cgcagactca 82440
acaccacgtg gaagcaacca aagcttaggg cttgcaccct ctgaagcaat ggcctgagct 82500
ggaccttggc ccctttagcc atggctggca ggagagggac agggatgtcc caaggctgca 82560
cagagcagtc gggtcctggg cccggaccat gaaaccattt ttctctactg ggcttctggg 82620
cctgtgacgg gagggaccgc agcaaagatc tctgaaatgc tctcaagatg tttttcccat 82680
cgggttcctc attacttatg caaatttctg cagcccgctt gaatttcttc ccaggaaatg 82740
gattcttctt gtctaccaca tggtcaggct gcaatttttt tcaacctttt atgatctgct 82800
tcccttttaa acataagttc aaatttcaga ccatctctta atgaatgcat atgacttaca 82860
ttttcagaaa cagccagggc aaacattgaa tgctttgcta cttagaaatt ttttctgcta 82920
gataccttaa gtcatctctc cctagttcaa cattgcacag atctctaggg caggggcaaa 82980
atgccactag tccttttgct aaagcatagc aagtgtgagc tttactccag ttcacaagaa 83040
gttcttcatc ttagcatctg agaccacctc agcctggact ttattgtcca tatcactatc 83100
tgcattttgt tcaaaaccat tcagtaagcc tctagaaagt ttcaaacttt tccacagctt 83160
cctgtcttct tgtgagccct ccaagcttta ccagcctctg tccattaccc agttacaaag 83220
tcacttccac agttttaggt atcttaatag cagtgcccac tcctagtgca aattttctgt 83280
attagttgat tctcacactg ctgtaaagaa ctacctgaga ctgggtaatt tatgaagaaa 83340
agagtttagt agactcacag ttcttcaggc taaacaggaa gcattactgg gaggcatcag 83400
gacacacaat gatggccgaa ggtgaagggg attcaaaaat cttctttgca agatggcagg 83460
agagagacag caagggagac gggaggtgcc acacttttaa accatcagat ctcttgagaa 83520
ctttatcagg agaacagcaa agaggaaggc caccccatta cccaatcact ttatattagg 83580
cccttccttc aacatgtagg gattacaatt tggcatgaga tttgagtggg aacacagagc 83640
caaactgtat caacctgcat aactgaaagt tataacctct gaccaacatc acccaatttt 83700
ttcctcctcc cagcccctgg gaactactat tctactttgc ttccaagaac atgaatattt 83760
tagattctac atataaatgt gttcatgcaa catttgactc tctgtgtctc actccactta 83820
gcaaagtgtc ctctatgtgt tgtaaatgtt agaatttcct cgtttttaaa ggcagaataa 83880
tattcacttt taggtaggaa taagccacat tttatctgtt gattcataga tggacattga 83940
cctattttct atatctaggc tattatgaat aatctcacaa taaacatata tttgtcacac 84000
tcactttatt ttctctagat gtatactcag aagtgggtat attctatgtt caattcattg 84060
agtaatcttc atgctgtttt ttcataatgg ctgtactaat ttgcattttg ttccaaacca 84120
tacatggata actttgtacc acatattcag gtctttgttt aagtcttaaa tccattttta 84180
gctgatttat atgtattgtg tgagataagg tcaatttttt ttcttccgca tatggatgcc 84240
cagttttcac agcacttgtt gaagagactg tttcttctct attgtgtgtt cttggcagtt 84300
catcaaagat cagtttattg ggaagaaatt ggtggacttc cagattgtct gtaatgttct 84360
gttggattct atgtctgttt aaatgtcagc attatactgt tttgatttac atagatttga 84420
ttttgaaatt atagaatatg atatattcag ttatatttta cccaaaatta ttttggctat 84480
ttaaagcttt tgtattttta cataaattgg agaacttttt aatatttttg taaaaccatg 84540
ccatggagat tatatattta ttttataggc atataataga tatacctaat ttatgggaac 84600
atgtaatata ttgatgcatt tataaacgtg taaagatcag atcaggattg gtatatctat 84660
cacattaaac gtgtatattt tctttatgct aggcacattt gaacgactct cttctggcca 84720
ttttaacgta tacattagat tatcgttaac tatagtcacc ttactcatct gtcaaacatt 84780
taggttgtat ttctcctata taactgtata tctgtcttca gtaatcatct tctctttatc 84840
ctcttctctc ttgtatccaa ccaggcttct ggtaaacaac aatctactct ctgtcttcag 84900
gaaatccaat gttttagttg tgacataaaa gtaagaagat gcaatatttg tctttctgtg 84960
tttggtttat ttaacttaac attatggctt ccacttccat tcatattgtt gcaaatgaca 85020
agatatcaac atttatggct gaataatatt ctattgccta catcgattat atttttatat 85080
ccatttctcc acctacagac actgaggttg ctttcatatc tgggctattg tgaatagagc 85140
tgcaagaact tggagtgcac atgcctttat gaggcagtga ttttatcttc tttagaacat 85200
actcagaata ggatttgctg agtcatcagt tatttctatt tttcttttat tttggagtct 85260
tcatacaact ttgcacaata gtggaaatac aaacggaaaa accattataa aaagcagttt 85320
cagttttgag gtatgatcca aaaacacaca acatttcatc atgattctca ttgggagtct 85380
ctaatgaatc tggtggaaag gcaggaagtt ttctaacctt gttaagaaaa ttatgagttt 85440
gcaccttttt ctttttgagg ctggaaattg gcatgattca agatgcgtaa tgttagcagg 85500
tttcagaatg atacagcgaa aatcataatg agaaggcaag agagagaata agagaaagac 85560
aggaaaacaa agaaacaaat aaatttcaca agagaagaaa ctgctggatg tcagtgttgg 85620
gttttgttcc tagacatatc tgtactgagt gagaaaccat gaagccaagg gaagagtcta 85680
gaacttgttc aagtgaagca tcagcatatt tctccaaggc acctattgtc accccatcac 85740
aagggtgatg agtttttgaa taccattaaa tatgagttcc tagtaagtaa tcatgtttcc 85800
atgaaattca gttaaaatgc aaagggtgtg tccagatcac tcacgcacaa aaatacaaaa 85860
tttgcctttg catttatggc tgcatagagg taaagtccat tgagacttca gcaggttaca 85920
gagatctgtt aagttttgga ttcccatagg agagtgcctc ttagtgaagg ttggactatt 85980
aattaagtat gtacaaattc cctctatggg agtagtgttc catttgtgtg gaatttttaa 86040
ttccttattg aattgcaaaa caaatcccaa ggactgactc catggagttt tactgtagtg 86100
ttcataaaaa tatttaataa gattccttcc agtgtttcaa ggaaagtttt tctctaaaat 86160
tttttctaat acataaattt tcctgcctaa aattgaaaca ggctgttgtt aaaaagacat 86220
actggaatgg cagctttaat ctattggtga taggaatgag cataatacat gaatctcttt 86280
gagtgttctg cctcatccaa atactgtatg gcaaaggcta gtactggagg taaaatctct 86340
aaatgtattt gttccagcca tcaagtcatg gggcaataac agatacatcc ttgaggcaga 86400
ggaccataat gccacagtgc tagtaggagt acatgtcgcc aagggagttc aagggttcct 86460
taaaattgtg ataattttaa tgtaagaaca ccttattaga gacagggttt cagcatgttg 86520
accaggcttg gtctagaact cttgacctct tgatctgccc gccttggcct cccaaactgc 86580
tgatattaca ggagtgagtc actgtgtcta gccagtccat ttattttctt ctgcacatgg 86640
atacccataa acttatgtgg aagattgtgg gaggttataa cagtgtcata ctttagtatc 86700
agccatacct cacagaatca ttttataata gttcctttca tgggtgtact tcactcagtt 86760
catgcaaaac ctggcaggtg acaggctaaa aacacaaaat accgaagcgt ttaaccaact 86820
gaaagggctg tagccttttg tcaatgaatt atttcaagac acggagaaca catatagatt 86880
ataaataaaa tactttcaca tccccttaaa ggtggaaatt gaggaaattt tacctaaatg 86940
tgtccaaagg gccctgtggc ttggtttctg tctaggtccc aatgataggg ttctcccagg 87000
attttgtggc tgtcttgtta cacttcatca agaattaacc tctgctgttt cctcaaagtg 87060
tttaattgga taatgaattt gtctataaat tgaagagttg aaatacatca aatattaatt 87120
tgtaataatc tggcacaaat tatctaagca aattcaataa ctagatgttt tttcatttat 87180
ttttatttaa aatcaggatc taagcactga tatgctttaa taacatctgt gaccctctca 87240
gcagttttct cttctgagta tatgatctgc tgtggcagtt ttcttagctt caatgttacc 87300
tcttttggca atgactaccg tctttatatt tgccaggaat ctgggataaa ggagtgcttc 87360
taagagttcc ctaacttgcc cattttggtg ggtgttccag aacatatgag atgctctgtt 87420
gttaacaaag catcccaaag ccatgcactg ccctaaaatg tgtttgtttc ctagtttgac 87480
aaattggaag ttctaataaa tacaatcact tctgccatct gggctgattt tacatcagat 87540
agagggctgt attccaaaga aaagcttaca ttagtaatag caattctagt cagaaaccta 87600
gagttttatc attgaggtgc aattcataac aaataatatt aggtcgaggt tctcagtggc 87660
agtgtctaaa tctcttaggt gtacagggtc ttccctgtta acatgaagca tttataagca 87720
cagtcatagt ttccagctat gcttctccct gtctcattat caccacaaac tatggcctca 87780
cctggaactt gggttaattt ccaaataagt aattttttag tgtttatgcc tctagattat 87840
tatgtgagaa agttaacatt cagtagaaag ttaaaaagaa catttgaact gactaaacaa 87900
cacagacaat caagaataaa attcaaagcc tagatgtgag aggctccagg cctggataat 87960
gcaatagttc atgtatgcag gcagtttctt tgcccagttc tacactgata cacccagaat 88020
gtcagcttca tgccagattt gactcctatt atgtagagac atggcaatac attctcaagg 88080
gtcacatgaa ataatatgaa aattggtggg aataggggag gagacaactc tgcaattctc 88140
atctgaagga ccaggaaagc ctggacagac catctcccca gcctccgtga ctgcaccacg 88200
tgcccacatg gacactcatc cctgataggg taagaagact ccattgatgg ggctgagcat 88260
tttatgatag aaattactag agactgacgt ggaggtttca acaactaata tttataacca 88320
aaatttaatt acccccacat tgttaccatt ttcttcagtg aaaaattgct tgccatgatt 88380
aagttttaag tagatttcca atgttcacaa ctgagcttcc aagagagtct tgagaacaaa 88440
aacaatgagg gcagagaaat ctaccttttc tgtattcacc actaaactca agtggactca 88500
gcactgcctt tgatcactgc tacttctctg cagagttcag gtttctactt ctcacaattc 88560
tgacacacat tctacctctc ctcaaatgtt tggcctctgc ttcttgtaag gtcaccctct 88620
gttcttaact tcttctctga gtcattttgt gaggtggtca tgagccatta aatggatatt 88680
ttatattttc ccaacatgaa tcacatgagt ggtcatgaat tatacttctg attatggcag 88740
ttgatttttc ttggcatgtt catgactagt aatatttgaa gccatttcat tcaaatcttc 88800
ggggcttcgt ttttgttgct atgacatttt ttcttctatt gagtctttcc actagtatta 88860
taacatgacc tagtatccag gctcagttgt cattaataat aaccacatat gtcaaaaatc 88920
atgcattctt ttcacagcag acataatttc ctcttttctg cagatgaaga cacactgctg 88980
agctaccccc acttacaaga atatatgcac aattatgata tcttcattta tttgactaat 89040
aagctatatc attctccctt caaattcttt accccccaga agtcctggac aaatttctgc 89100
atctgctcaa acgataaact cagaactaca tggtgagtaa aagtcacctg gttctggata 89160
ttgggtccat ctcttcccct ccaatgtccc agagcacctc agcacacctg tccaggttct 89220
atcaagaaag agtagctcct gcacactgaa ggaaacaatt gagttaagag aggacctgca 89280
gatgatagac aatattgaaa actattaata tgacaaagga ttactaccaa gcatgtgaaa 89340
taagctcaac gggtgcggtg gttcatgtct gtagtaccag caatttggga ggcaagttgc 89400
gcagatcacc tgaggttagg agctcgacac cagcctgacc aacataaaga acaccctgtc 89460
tctactaaaa gtacaaaatt agccgggcat ggtggcatgc gcctgtaatc ccagctactc 89520
gggaggctga ggcaggagca tcacttgaac ctgggaagtg gaggttgcgg tgagctgaga 89580
tggcaccatt gcactccagc ctgggcaaca agagggaaac tccatctcaa aaaaaaaatt 89640
acaaaaaatt agctgagcgt ggtggtgggc gcctgtatac ccagctgcta gggagactga 89700
ggcaggagaa tggcttgaac ccaggaggtg aaggttgcag tgagctgaga ttgcgccatt 89760
gcactccatc ctgggcaaca agagtgaaac tccatctcaa aaaaaaaaaa agagacttgc 89820
aaagggcaaa tagatcatag acagacagat agatagatag acctattagt atacatacat 89880
acatatatat acactaatat tcaggaaaat gcaaattcat aatgagatgt cttttcaccc 89940
ttcatctctg ctagaaagtt tgttatctga aaaacaaata catacataca tacttattaa 90000
aagctggcca ggatgcctag aaagtaaaac tcatagacca ctggtggaaa tgtaaattag 90060
tgcagccatc aagggaaaaa aatagaacta ccatatattc cagcaatcca actgctaagt 90120
atatatctat ttaaatattt aaaagaaaaa actaatattg aagagatacc tgtacaccca 90180
tgtttattgc agcactaatc acaatttcta agatatgaaa tcaacatatg tgtccatcaa 90240
cagatgaatg gatacataaa atgtgatata tttacacaat ggaatattat tcagccttaa 90300
caatgaaatt ctgccgtttg aagcaacatg gatggaatgg gacaccacta tgttgagtga 90360
aatgagtcag acacagaaaa ataaataccg catttctcag cgttacttct agaagtaaat 90420
agtagagtag tggtgatgag atgccaggaa tgagagaagg ctgagataag aagaggtttg 90480
ttaacaaaca cacaattaca ggtagacagg agggatgtgc tctagtgttc tacagcacag 90540
tagggtgact acagttaaca atatattgta cgttttctgt ttacaagaag ccagaagaga 90600
gaattttcta tgctaccaac acaaataaat gttagtgtct gaactgacga atttgctcat 90660
tgttctgatt ttggtcatac caagtggcac acatgtattc aaatatcaca ctgtatccca 90720
taaacataag cagttattat gtgccaaatt tgaaaaatcc tttaattaaa aagaattata 90780
ttggcgtaca ttacaaatga ttcaacacag agacaggaat aaataccatt tttctttgaa 90840
atagttaatt aactaacaat gtagttacat tcatttgcac caaatcgtgt atttgataat 90900
ggtatgcata gacagattta tgcataggat aatatctttt aattttagac tactacttaa 90960
tactataaat ataaataatt ttaaaacaac taagtaaaaa gaataaagct gagaaaatgt 91020
gtgtgtggtg tgtgatgtgt gagctttttc ttgtgcacca ctgtgtcctt ggtggatgtg 91080
tggttcatgt gtttgttttt atttactctg tttggggttc tctttgcttc taggatctgt 91140
agttcagttt ctttcacaaa attgggaaca ttcttcgcta ttatcttttt caaatagttt 91200
ctgtgtattt ataatttctc cttctcagat ttaaaatata cacatactat aattttgata 91260
ttaatgttta gtttctttct tcactctctt ttcgtttgca atttactttg tgaaatttct 91320
agtgacatac taatcacatg gttttattga aaagctgagc cagctctact gaggtgtgtg 91380
ccaaaagatt gctcgatgtt tatacagcat tgcttttgat ttcttatgca tttccatttg 91440
atttattctt agtattttca tatttcagtt ccctatctat gtccacgatt tctttaagag 91500
attcttgcgt gtgaattata gttactttac atatcttgtt taattagata tttataatat 91560
ctgtttcatc tacaaatctc atgctgatca tttgtttatt acaactttgg tacttctcat 91620
taatgtatgt aataattgtt gatagccaca gatactggga tggacagtgg atactggcct 91680
tattatttca ttttatgcat ttctgcctgt atttgaccac actttacctt tgccaggcct 91740
ttactgtgga agtatctgtg aatcttctca gaactatatt tgacattcac ttttgcagtg 91800
gacatcaaag ttgaagtctg ttcttctgtg tccaccagag acttcagttc ctccagtgat 91860
accttgtttt tctttcctgc ttggctttgt ctcttcacct gttccctcct ccagagaatc 91920
atgttcagct ccctcaggtg gattaaaatg ttatttaact gacaattgtg aaattggtgg 91980
aaagcaatag aataaaggga gattttctga cctttcttgg gttcatattg tgaacatgag 92040
tctgggtgtg accttcccaa tgtttctgaa cttcctccag atgagatgtt ggtctgtgtg 92100
ttcttgctct tttccctgct gtggagtcct cttgttttcc ccagttgttc cctcccgcag 92160
ctccaatgtt ctctttttgt gttatcacct tacagatttg ctgactagaa ctgcagatta 92220
aggctctgat taaataagaa ggaggggaga tacttctcaa tggaacttag gtgaagacct 92280
cttttcccat ctcagttcct aagggattgc ccagtgccct aagatactgg tttggtggct 92340
tgcccctcca gaataattct ttgttctcca gtggggatat ggaaggtggg tctgaacact 92400
tttcagaagg gtgggcactt tttctctcct agacagacac aatgggacag aacaattttg 92460
gtgactgtcc ccattttggg gaaaaaggat tcaataggat aggaaaactc ttcagtctgt 92520
ggtcccttag aaattcaccc tacaacacat ttaccacact tgacttcaag aaatccaata 92580
tatatgtgtg ttttcatctt gtaatagcct acattttaca tgccatactc tgcctcagtt 92640
cagctcatac cccagctttg ttactcttta caagaacttg cctctcccta gatttcacat 92700
ttgctgttta tcttaaaact tcaagtatct aaagtattat ttttaaaaaa tggccagttg 92760
tggtggctca cacctgtaat cccaacgctt tgggaggctg aggtatgtgg atcacctgag 92820
gtcaggagtt tgagaccacc ctggccaaca tggtaaaacc tgtctctact aaaaatacaa 92880
aaaaaaaaaa atagcttggc atggtggcag gcacctgtaa tcccagctac tcgggaggct 92940
gatactggag aatagcttga acccacgagg cagagtttgc aagtcgtacc attgcactcc 93000
agcctgggcg acagagtgag actctgtctc aaaaaaaaaa attccaaaat tccagctcct 93060
ctgtttatct atttttgttg atactgttgt tgtaaaacat aagtaaaata tattattcat 93120
ctatgtacat ttccaagctg tgtagaagaa tttttaataa gacccagagt aaaaaaagaa 93180
tgcaaatatg taggggccag ccctacaggg tctgtggatc tttctcccca tgtgcagaga 93240
tgagagatca tagaaataaa ggcacaagac aaagagatag aagaaaaaac agccgggccc 93300
aggggaccac taccaccaag acacagacta gaagtggccc caaatgcctg gctctgctgt 93360
tatttattgg atacaaggca aaaggggaag ggtaaggagt gtgagtcatc tgcaatgatt 93420
gataaggtca tgtgggtcac gtgtccacca gacagagggc acttccctgt ttggcagccg 93480
aggcggagag agagagagga cagcttaggt cattatttct tccattctct tctcagaaag 93540
atcaaagact ttaatacttt cactaattct gctactgcta tctagagggc ggagcaggtg 93600
tacagagtgg aacatgaaag tgaaacagga gtgtgaccgc tgaagcacag catcacagag 93660
agacgtttag gcctctggag ggctgcgggc aggtttgact gatgtcaggc cttccacaag 93720
aggtggtgga gcagagtctt ctctaactcc cccggggaaa gggagactcc ctttccaggt 93780
cttctaagta atgggtgcct tcccaggcac tggcgctacc actagactga ggagccctct 93840
agtggccctg tccgggcgtg acagaggctc acactcctgt cttctggtca cttctcaccg 93900
tgtcccttca gctcctattg ctgtatggcc tggtttttcc taggttataa ttgtagagca 93960
aggattatta taatgttgga ataaagagta atgctacaga ctgatgatta atgatattca 94020
tatataaaca tatctataac ctattactag tacaactatt cttattttac atattctctt 94080
cattacacta gaacagcttg tgccctcagt ctcttgcctc agcacctggg tggcttgccg 94140
cccagacaaa tattgttaag cttcttaata gaaaaacaaa ttatggtaaa tgtgttcact 94200
ggaatactac ccgtcattta taataaatta atgcctgata cacagagcaa caaggtaaaa 94260
tatctaagta tttatgttga gtaaaataag ctaaacaaat aagaatatat actatgtaat 94320
ttcattttta taaattctga taaataaaaa tgcatctgaa gtaaaataat gaagataagt 94380
agttgcctgg ggaaatggta gaagaaggga gggggagagg aggaggaata cagcagaaca 94440
aggggcaaat gttgagaaga attcacttgt ccactttctt gataatgata gcagttacat 94500
catttttatt agttgtacat tttaaatatg tgaagtttat catctttcaa ttaagcctca 94560
taaaatgtct tacaagcaaa caaatggaaa cttagacaag gaaagagtaa tagaaagata 94620
gaaaaaataa gttcaatgtc agaagtacct gaaaattaat gtgcctggat cctagttctc 94680
tccatatttt cagaagagtg ctggagggca gcaaaaccac acatgctctt attacggaaa 94740
gtgggttctg ataaaaacac tagacacatc cagctttgtc ctggagttgg tttaggggga 94800
tgtcagagac agtgatgaag agcacagggc cagataccgg ggttcactca tcccagacat 94860
gagctcctag atgcatacag agccccccca tgtgtgggtt tacttccact tctgtaaatg 94920
gagaaaatat tgtctcctac agaacatagt ttacatgaat atttaaaatg aaatagggtg 94980
attagtgcaa agtgtttatc acagcacaat ttcataataa gacagcatat tttccaaatg 95040
caatcattgc cagcaaactt ctacagggca ccgtcgtctt atctgggtac agcctactcc 95100
tcaagggtcc caccctagag cttgctatat agtaggagat atgcaaatag ggccctccct 95160
ctactgatga aaaccaaccc aaccctgacc ctgcagctct cagagaggtg ccttagccct 95220
ggattccaag gcatttccac ttggtgatca gcactgaaca cagaggactc accatggagt 95280
tggggctgtg ctgggttttc cttgttgcta ttttagaagg tgattcatgg aaaactagag 95340
agatttagtg tgtgtggata tgagtgagag aaacagtgga tatgtgtggc agtttctgac 95400
cttggtgtct ctttgtttgc aggtgtccag tgtgaggtgc agctggtgga gtctggggga 95460
ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc 95520
agtagctata gcatgaactg ggtccgccag gctccaggga aggggctgga gtgggtttca 95580
tacattagta gtagtagtag taccatatac tacgcagact ctgtgaaggg ccgattcacc 95640
atctccagag acaatgccaa gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gagagacgag 95700
gacacggctg tgtattactg tgcgagagac acagtgaggg gaggtcagtg tgagcccaga 95760
cacaaacctc cctgcagggg tccgcaggac caccaggggg cgacaggaca ctgagcacag 95820
ggctgtctcc agggcaggtg caggtgctgc tgagggctgg cttcctgtca tggcctgggg 95880
cggcctcatt gtcaaatttc cccagggaac ttctccagat ttacaatcct gtactaatat 95940
ttgatgtctc taaatgcaac cttttttttc ctttttgtgt ctgttttttt ttttttaaaa 96000
acaggaggac acatcctcac ctccacagaa gccacagtgt cactttgggg gcagaaataa 96060
tcctttcgtg gtcaacaggg tgagagtttt gaggaatccc agggaaacct ggggaatgtt 96120
ttccaattag actcagggca gagacctcca tgggaatctc tgattagaac aggctttgag 96180
ttctgatggg agccaaaaga gaggctcacc cagggtcagg gttcttaaaa cctgatggtt 96240
ttcacagcaa tcccccttca tcttgtgaaa ctgggcacat ctgactcaga ctgattcagt 96300
tgaccctctt tctgctaatc cattttcctt cccagtagac ttgattctca cagatccctt 96360
tcttcttctc tttcctgaaa acagaggatg tgttttctgt agtctaaatt ccaaggctca 96420
ggtctgcagg agctgggtag gctgaggggt cttcctcact cactattgcc tggaaaatcc 96480
tgctgtcttc tgtgcatgga ggcatttgga aaatgaagca ggcattagtc atgaagggaa 96540
taatactagt tttctccaat gggatgttga tgtagagctg atcttatgct tctcacactg 96600
tcacaaagtt tggactctca cctgtgactt tgaggagagc ttgtgatacc ttatcttgtt 96660
ttaatatgaa tagactctcc cttagctcag gaagctggaa cagactccat ttggctcctt 96720
catttgtaag acatcaaggg ctcctcaccc acccccttcc tcaaggactt aacttgttta 96780
agctgactcc cagcatctca aagagtgcga ttaactgata aggtactgtg gcaagctgtg 96840
tccgtagttc ccaggaattt ggccaggtga tggtacccta aagcccctgc atttctgtct 96900
ggcagataac acccagagcc cccacaccta tcatcttgtg atgaatttaa agcccctgca 96960
cctggaactg tttgcctgta accatttgtc ctttcaactt ttttgcctgt tttacttctg 97020
ttagaatgct acagttaggc tccccctccc ctctctaaac caaagtataa aagaaaatct 97080
agcaccttct tcggggctga gagaatttcc agcgttagcc atctctcagt tgccagctaa 97140
taaaggactc ctgaattcat ctcaaagtgc ggcgtttctc tctaactcgc tcggttacaa 97200
caagctgagg atggacactc cattgtgcag tgagctctgg gtgacagtaa tcgtagggtc 97260
tccccgggca gcctaaggtc aatactgctg gccgtcggga aagacaggct ggaattcctg 97320
ggaagacctg catctgccat ctaccacgga gtcctatggt cttctgttac actctctttg 97380
aatcagcacc acctagatta tctaaaacac tctttgtgac ttcatgactg ggaaaaaata 97440
atggcagtct ctactaacac ctgtgttaag ccatgggagc aacacctagg ctagtgtgtg 97500
attgagtagt tgagactgtg gtctagtcaa ggtgacacat aaaattgatt gttgccatta 97560
tgatatttta ttttatattt gacaatataa tcatgctcat attataaata tttctgttac 97620
attatttgtg tcagaggctt tggaaccaga acaacttcat cttgaataag gggtaggaaa 97680
aataagactg agacctgctg ggctacattc ccagtaagct aaggcgttct tagtcacagg 97740
atgagatagg aggtctgcac aagatccagg tcataaagac cttgctaata aagtttacag 97800
taaagaaact ggctgaagcc caccaaaacc aagatggtga caaaagtgac ctctgtttgt 97860
cctcattgct cattatatgc taagtattat gctttaacat tctaaaagac actccccaca 97920
gagccatgac agtttacaaa tgccatagca acatcaggaa gtttccctag aaactaaaga 97980
gtggaggaaa cctcagcttt gggaattgcc cggggaattc atgaataatc cttcttttgt 98040
ttaacgtata atcaagaaat aaccataaaa atggacaacc agcagcccat accacttctc 98100
tgcctatata gtagccattc tttattctct tactttccta ataaacttgc tttcctttta 98160
ttctgtagat ttgccccaat tgggatccct ttccagtaac atttgtgtta ttattggttt 98220
tctaagcaga aaactctgag aggaggtgtc agccgggctt cctgggttga gtagaggctc 98280
agaaagcagt gaaactcact catttcctgc atcaggactt actttggtcc tggatgaata 98340
atattgaaga tatatgctta aaatattcct aacatcacaa tttgtgcatg tgttttcttc 98400
cctaagaaag ctataaacag tgaaaatttt gctgtaagct tccctgtgtc ttctctccct 98460
ctctccattc cccctcccct gaaactaaaa ggaatgtttt aacattatgg gcttttaagt 98520
ctgtatttct gtgaccagca gaccttatct atgctcccaa ttcaaattcc ttgtaaacac 98580
aatttgtaaa atcctgcgag atcctgtctc cttggccacg ccactgcaag gtcataaagt 98640
agatcaaact taagttacaa ttctgatttt cctcaagatc tgagacatgt taattgtctt 98700
tgtttcttgc tcaggtaaca tctctttttg ctctttttta tctctttttg cacttaaatc 98760
taagtttaca ttagtcatgt atctagaatg tagaaatatg tcttaaagtt acttaacttt 98820
ttaaaaaatt tatggggttt ccagaagatg tgagaacctc ctttatttat aaaatagctg 98880
attgcacgtt gctcaataat ttcctcttta atttatctct ctcctgtcac attatactat 98940
gataagcaaa aagaaatgaa ggcataccat caacagttta cttagatatc tcctcagcta 99000
aatttctaag gtataattta ctaattctaa ttttatccaa tttaacataa ttaagataaa 99060
ttatataaca aggtacacat atgttccagt tctaacacca tgtttgtgac agaaataaaa 99120
cagagcttct ctctgtaatg tggtcatctg agccctgagg tgatgggtca cataggtatt 99180
tttatgatat ttaagggttt ggtcaagaac agtgataaca agtctgaaca agactggtca 99240
tacttgaaag gttacaggta aagttactgc tgttatttta tattaacgcc ttattagaat 99300
aaagctcaga ggaagaggcc acatcctagg tcacagtagg aggaggaatg gagctgtgct 99360
ctgctctcca cactactttt cacatcccag gcacaagccc aggttccatg acgcacggca 99420
tctagagggc agttctcagg ggatgatctc agggcacctg cttcctcggg cagggcgctt 99480
ccttctctca attgcagact tgctccttct gcaaggtctg aagtcagcac ttgtattccc 99540
atgattttta caggttctct tccctaatat ggcaaaaatc tttttattaa attttcaatt 99600
ttattttctc tgaagcacac tgcattagca gaaacgaata tatcacattc cttatccgcc 99660
cacacagcca aagattcctg aagacagagc tgatgtgacg tactcatagg tggatctctg 99720
cccctcagag gtggccttgg tcttcaagtt tcagcaattt ctaggaagcc aaagacacct 99780
ccatctactc ctccctgctc gacagctcac ctgagaacag ctttctcatt ggaatgtctt 99840
gtgtttaaga aataaaagtt gctgtttgag gttagggagc ccaggtgcac ctaccagatc 99900
cagcccagga ttggagatac ttttcagaag acaacatcac ctgagacacg accagtccca 99960
ctgtttcact ttcacaattt cagcttcttc agaagaaaat taaaattgtt gagacttgtt 100020
cataagcgtt gtgccatgtc ctttctctgt tttcttgcct gttcattgat gtcatgccag 100080
gtgccacttc tatgtaatag gatcagaatt ctgcctctag taacacatca gaggtgaggt 100140
ttgattgtac ttttggttta tgctccaaaa cgtagattat aaaattcatc accctcattt 100200
ttatgtcaaa agtaatctgc ataatctgga tgtcaatact ttttggaatc tatgaaataa 100260
cagaaattgc aagaaatatt acccactcca aacctggaga gacaggcatg tgcagaatgg 100320
caattgacac ctgcttaact ggagcagaag ctgcagaagc cacaagctgt tgagggcact 100380
tacatggtaa gcactacaga cgtctgaaga cagatgtgga ctcagtaaat gtaacagttc 100440
cagagggtct tatacttcta agttttctgg aatttctttc cagaaacctc aagattctaa 100500
aatgtacatt ccaaagacat ttcctataga tcaaaattgc agatattaat tactgagaaa 100560
cataccacga gccttcttca aaagcttcta caggaaagga cttttccaga accttatcct 100620
atgtgaagga agacaaatct cccactgcag atttctctcc cattcttcca taattgtaga 100680
aatgagtaaa gttagccaat agaggtaaga tataagtaaa taatccaggg atgctgaaaa 100740
caaaaaaggg agtaatcgcc caaaatgagc ttttcccctg gagacgcctg gtcaagatca 100800
taggccagaa gaggaagctg actgtgtctc taggtttcca ctgtcagaac aggcagtgct 100860
tacctgcact gcacaatcca ttctaaccag gatgatggct ctggattaaa ggtgaaagtg 100920
tggcaatgca cagactctat ctgaggagaa cacaggaaaa ctaaaggaca acggcagagg 100980
gtgagacaag aacagtagag caatctgaag cctctgacat catgattttt aagaccaatg 101040
tcttaaacac tccttcattg acctcagctt ctttcatcat gaagcctttg cagtgactct 101100
atctgagaaa aagaaaataa cctcctgcat gcacttctca agtctctgct tgtatcctgt 101160
ttgctttagg tctctagggg aaaaagtcag atacctggac ctagtgtcag tgtaggaggc 101220
acatcctaaa agctacaaac taggaagaag ggaagatggg tgttattgga atagtggata 101280
tggagtgggc tttcttctga aagtatatgc acctgctggt attctcagat gcaacattca 101340
actgcaagag cccattgaag aaacaaggca ctcccaaatc tcctgtaaga ttctgtattc 101400
atttcagata agcccacatg tccccgcatt aactttttct tcagacaagc acatacatct 101460
gaaactgaac agctatgtgg caaaataagc tcaggataga agtaattgtg gactccagct 101520
ctgacaattt gtagatctgc atttttaaaa ttctaactga agactttgct ttattgtaga 101580
ggacagtggt ttacagctcg aattgcacag cctacaggca gatgtccatt tcctctgggc 101640
aaggtttatt tttatttgtt tactgtactt atttgttgac aaacattgat actataaaga 101700
taccctaaca gcgtccacat gaaagaaaaa gaaagagcaa tggacacatc aaccctgaac 101760
atccagtccc aggaatcctt tgaccctgcc ctccttgcaa cccagagata tagattggat 101820
gagccctgct gagcagaaca cacatgtccc caggagaaag acatggaaat gaggcccctc 101880
cctgctaatg aaaagcagct cttcccctct tctcctgcag gtcctggtga ggagccaccc 101940
aatatctgtg cccttcctca gtgtccacac catcgggtct atgatgatct gggcttcact 102000
tgtcatcact ctcaatattg aggttccccg ttaaacagac tgagtgaact gtggctgctc 102060
cacgtggggg ctgttctcag tctgttgctt ctgtgcttgc agaggtcccc tgtgaagtta 102120
attactggag tctctcagag aaatactaca gaccaagaat tctcagactt ttctggaaac 102180
cctgtggatt cactttcact gaaaacagca taagcttggt ccagcaggct tcatgacagg 102240
ggtgggtgta ggtgataaca tcagtaattc aagtggaagt tctcagtggg actctccttg 102300
agtacaaaga agattaacag tcctcagaga cacgcttttc agatgattct ctcttaagat 102360
gattaacctg agagctcagg aaaattccgt ttattactgt gagggacacg gtgaggggac 102420
atctgtgtga gctcagacac aaacctgcct gcagggagac acaaacctcc ctgcatggta 102480
gatgcttctc agaaccacca gggggtgcac aggaaaccag aaggtgctca ggacaccagg 102540
gggtgctcag aaccaccatg actcactcaa gacgccaggg gcgctcagaa ccaccgtggg 102600
gcactcagga caccagggga cattcagagc caccaggggt ggctcaggaa acctaggggg 102660
gtgctcagga caccaggggg actcaggaaa ctagggggta ctcagaacca ccaggtggtg 102720
ctcaggacac cagggagctc tcagaaccat ctgggggcac tgaggaaacc aggggactca 102780
aacactaggg tgtgctctga agcaccagcg gaccctcagg actgcagggg gcgctcagga 102840
cactagggaa cactcagaac caccaggaag cgctcagaac caccaggggg ccctcaggac 102900
atcagagcgt gctgaggacc tccgggggcg ctcaggacct tcagagagtg atcagaacac 102960
cagagggcgc tcagaacacc aggaggtgct caggacagca aggggctctc aggacactag 103020
ggtgtgctca gtaaaccagg ggtccctcac aaccaccagg gggcactcag gacaccaggg 103080
gatgctcagg acaccagggg ccactgagga caccaccgct cccttagcag gcagctccac 103140
atcaggcccc tgggttgggg caggaagggt gttttccttt tggatcttgc cactaaactc 103200
ttgggagttt ttctccttcc tttgtggttt caagaaacat tggtagattc ttctcaggta 103260
taaagctctg ctttcttgta ttatgtaatg tttttggttt cggatgttac cagaattaca 103320
ctgcactgtg agaggattca ttcctcgtgt gtgcaatagt gaatgaaagc tgcaatgtta 103380
ggggtggctt tgaaagctac gttaggggtg gctaagggca gttagcagga aatgatcatc 103440
actatagaag gctactcatt tctttgcaca tttccataaa taattgtagt ttatgcccta 103500
aaaactgcat gctttcttgg ccctttttct taaatgcctc caatccaaga ccagtcatct 103560
aattaagctg tatgtcaaag accaccaatc aagttaagtc tgtttaatga aacactttgt 103620
aaacaaaaaa gtacatctgt gtttgtatag tcagctttaa attttacatt gctttacaaa 103680
tattaatttt gtaaatttag tctcataatt atcgtcagta tttaaaatct taaagtcatg 103740
ctatgttaaa ttaagtaatc ttagctttct cactatgaat tagagttact aagaattaga 103800
atagtaagag catgtaataa gcttttggtg aagtttataa agaaagatga agatacgttt 103860
tttgctttaa aatattttgt tttccagttt acaggacctt tctactggtt ttaagataac 103920
aatcactgtt tacatctaac ccttttttta aacacctgct gtttaagatt ataaaattat 103980
aaaattaaaa acctagttaa aaccagattg atctttgtaa tttaacaaga tgttcagtat 104040
tgttgtttta ataaaaaaaa ataggtaaat acttagctac tagaaaaata atcatctact 104100
taatcataag gttttactta ggtaaacacc taaatttcat gggttataaa catggttaat 104160
aggtgaaaaa ctttaatgga caagtattac agttttcata aatattctag gtaagctatt 104220
taaaaaataa attaggtaaa tgaaataaaa taaaccattt aaataaactt gttctacaat 104280
ttaaaaatct aaagtttaat taaataatat atattatata aatgtttatg cattactaat 104340
tgtttaaaat atatatacta taaggaaaac tttttaaaaa tacatattat aagaaaatat 104400
tttttgaaaa catttgtttt tagaaaaata atttatttaa ttcaaaggtt aattataaaa 104460
tgtcgtaaac atacccagtt agtaagagag gtttaaagaa agttctagac atagagaagt 104520
acttttggta agaaaggtta aaataaaaaa aaattatatg agaaggaatt ttgtaggata 104580
actttttata tataaaagtg actatttatg aaagaataat gtttagaata aaacaagatg 104640
ttcaagtatg ccataaatgg ttcgtgtaag tcaaaataag gtttatagaa agctaactta 104700
ttaaaaaaac ttcatgttat cgagttgact ataattgaaa gggaagaatt tattatagtc 104760
tttataggga tctggctttc atatgaaaat atactaacac actgaagatt ggttagaatg 104820
acaaaattgt cttaaagtat tgatttattc aataaaatta taaggtatta taatttttta 104880
acccaaaatt ttaacttttg ttgcatcttg ccatttttat ttttttccat ttgagaaggc 104940
ttgagaggat ctcaactttt tcatcagctc ctttaacatt gtttcttact tacagcagtt 105000
agcctctgag ttaacttcta actgttgtta gtttctgact gctattattt cctgatgtta 105060
aaatcctcta tcttaaagtt ctaaataaaa tgttttcttt caatataata ttcagtgtcc 105120
ttggcttttc tttaactgtc taaatttttc tatgaaacca aaatcttcac ttgtaaagac 105180
acattcttcc taggtctgat taattcaaat acttttttca ttagagttga cttgcaggtt 105240
atgtacatgg agttccccat agggaaaaac agtcacagtg cagaaggctt tatttttgct 105300
atttggtaac tgggcatgag acaaatttta aatttcattg aaataattcc tatgtaagtg 105360
ttattaagtt tttcaactac ttagtaatac tgagagttta agacaataga aattaatgtt 105420
atgacattca tgtaactatc tgtataactt ttaaagtcct tgtgctgcta ctttactgag 105480
ctttgaatcc taggtctaaa aaggacacac aacactttgg gaggctaagg tgggcaaatc 105540
acctgaggtc agaagttaga gaccagcctg gccaccatga caaaaccccg tctttactaa 105600
aaaatacaaa aattagctgg gcatggtggc aggtgcctgt aatcccagct acttgggagc 105660
ctgaggcaga gagaattgct tgaactcagg gaggtggacg ttgcagtgag cagatattgc 105720
actactgcac tccagcctgg gtgacagagt gagactccat ctcagaaaaa ataaataaat 105780
aaaataaaaa ataaaaagga caccaagtcc agctaaatct taaacaccga cagcaattaa 105840
agccccatct acagacctgg aagaaaatga caagaaaaat tgatcacact ctcaagacac 105900
aagcccagaa attgaaacta cttaaccacc ccagccccag ggactattac agaagaagtg 105960
gctttgtaag attgtaaaag ctaattttga gagatgaaat cagttcagag tttctttata 106020
aattaaacat taatgcaagg ctagcatctg ggcccctgtg ccagattgac cagggtttct 106080
tgaagaatta atccacattt aaatttaaaa aacagataaa actgtataaa agatctatgc 106140
aaattatttt tatggtaaaa gtaattataa tttaatagat ttatttttca gaattgatag 106200
ttttaacttt tctcatgctg ttcttctaag gggttatatt ttagaaaatc aattctactc 106260
tttcaaaaat attttttttc ttttttttag aaatcactga gttttcatgt ggctaaataa 106320
ataacttatt ttacaataat ctgtaatcct attttgtaat atcaagtgtt gtaaactttt 106380
gatatttgac aaagttcaca aaataaaatt ctaaattcag tcatttgaac accctgaaaa 106440
gaaacacatt tagcttattt ggtacagtta aattatacag gaagtaatgt caaatttgca 106500
atggttatta actttggact atatttatat aaatgtggac tatataattt gaatatactt 106560
atgtaaagag tatatgttcc aaaattctat tagattcaag tgatttttat atgtcttagt 106620
atcagtagta cttatgatta taatttaaaa tttttgttta tcacagaaat aaccaaattt 106680
tctcctcaat tctgtcttta accaggggta ttctaaaagg tcggtcattc acaattgttg 106740
ttttactttg attctttatc aggtggctta taataatcta tagaactttg agtagtactc 106800
ttaaatatac aatatacaat tttgacaatt ttataaattg tgccattggt atagagagaa 106860
aaacttccat gagtctcatg agacctgaag catttatgat gattgttaat ctaatatcaa 106920
gcaggacagg atgtaattgc atgaactgaa tgaaaaggag actgaaataa tttttataac 106980
ttattcttta aagcatttgc tatttactta tgttttattg ttcagaatca agaaaacttt 107040
gtcttttaag ctattcacag tttttaacaa ttttaactat actctattga gaaaaattga 107100
aaatataatt tcttcttctc tacataattt ctccaaaatt tggaaactgt aggtattctt 107160
atatcaaaat agttatttgc ataggttcga taaaaatctg ctttcttcca taacagagca 107220
caattagaga caatggtcac tttaccaagg ctttaacttg aatgacatat tttctgattt 107280
actttataaa atgaagagct gtacagctga tataagcccc tttggaaaac tggcatttta 107340
cctttttttt tttttttaac agggccctga gctgtagtaa gtaaataatt ttgctttctg 107400
acaggcccag gaaacccaag ttttcttgga tacttgaaaa aataaaaagt aaaccaatcc 107460
atatagctat ctgatggcac agataaaata ttggctgggc ttgaggcttt taaagatctt 107520
acccttagat tccttataaa aaatagcaaa agcaatgtat gaataaaaca gcctatgtac 107580
aacaaacaac aacaaaaaca aaaacaataa aaagagagct aatatgttaa gtgattattt 107640
ttgctgcatc ttatacaaaa aaatcaggcc aagtataata agcctaaaat ttattttaca 107700
aataaattag tcctattatg attttgtctc caataaaatt ggggaattat agggagaaat 107760
attctttcaa aataaactat agtgcatctg ttattaggtt ctaaccttgt ccacttgttt 107820
ttcaatttac aatattttcc acaatttgga ctcaatttta aaatatttct ttccacaagt 107880
ctccaaaata acattttcag tgattttctt tttaaatatt tttttcctat ttgaaatctc 107940
cagaaggtaa actgtgcttt cttacagcta gtcaacttaa actctaaaat aaaataaaat 108000
caatgatatg gtttgtctct gtgttcccac caaaatctca gtttgtatag taataatttc 108060
cacatgtcaa gggtggaagg aggtgaagat aattgaatca cgggacgtgt tttctccatg 108120
cttttatcct attagtgagt gagttctcac aagacctgat ggttatataa agggcctccc 108180
tcttcacatg acacttctct ctcctgcagc catgtgaaga ggtacgtgtt tgctgccctt 108240
tccatcatga ctgtaagttt cttggggcct ccccagccat gtagatctgt gagacaatta 108300
aacctttttt taaataaatt atccagcatc aggtatgtcc ttatagcagc atgaaaattg 108360
tctaatacca gcaacttaat tatatacaaa aattcctttt ataccctcct actgtgaagg 108420
gaaaataaat cttgagaccc caaaattact aagctaaaga gaagagtcaa tgtggtgtta 108480
caggagatag aaagaaatta tttaggtaga tagttgggat gagagagtct ctggcaaaat 108540
aacttttctt ctaacaaaaa tcagctcaga aataacttct tctctaatta cacacagttc 108600
aaagaaatca cttctaacaa aaagcagact aaataatcag gctgtgaaat atagataagc 108660
aactctgcca cagagagggt gtttctgggt gtaatcacca aacctcacat atataggatg 108720
ggtcccagta aaaacagtga gccttaataa gcacattcct tttcttttct gggagtacac 108780
taagatagaa aagctggaag cttgcacggg gtttgcgacg ccggcacctg tgaggaagta 108840
cctgggacca ggcaagaaaa cccttctggc ctttcttagc acatgcacgg tggaagaaga 108900
taagcagtgt ggaggagatc aagcaaagtg cccgcctgcc caatgaaagc atgaggtggg 108960
gttgccagag actttgctct atgcagatgg cacacattgt cctaactgtt tttgcaccct 109020
atgctgataa gacaccgtct ccccacgagc acatttataa aaatccttac attttactgc 109080
agcacgataa cccatttggg acccctctct gtgacagaca gctttttttt tattttacct 109140
attaaacttg tgctctaacc tcacccttag catgtctgcg accttgatat tcacggccgt 109200
gagacaaaga agttcgggtg gtattccaga caacgaggct gccatactgg aaagtgcttt 109260
gggcaaatct gcctcccctt ctgtttaaag tgattcctct gaggctaacc tgagaccaat 109320
acacagctga ttgcttcctc ttcactatca tttatgtaaa aacgaagatc cactgagtca 109380
gactaaattg tgcattcagt ggtaggctaa taaagtactc aaaagaacgc aacctattgt 109440
ctcttatcta cttctaaact gcagtccgtg cttttgattc gtcctgcctt acaggaaaaa 109500
tccaaagtac attttacata tattgattga tgtctcatgt ctctctaaaa tgtataaaag 109560
caagctgtac ttcaatcgcc ttgggcacat gtctcaggac ttcctgagga tggtcatggg 109620
tgagttccta actttggcaa gataaacgta ttagtctgtt ctcctgctgc taataaaaca 109680
taacaaagac cgggtaattg ataaaggaaa gaggtttaat tgactcacag tttcacatgg 109740
ctggggacac ttcacaatct tgtcagaaaa gcaagcgaca tcttacacgg tggcagacta 109800
gagagagctt gctcagggca actcctcttt acagaaccat cagatctaat gagaagtatt 109860
tactatcatg agaacagcat gggaaagacc tgcccctgtg attcaattat ctctcattgg 109920
gtccttccca tgacacatgg gaactgcagg actagaattc aaggttagat ttggatggcg 109980
acacagacaa accacattag taaacttcct aaattgactg agacctgtct cagatatttg 110040
tcgtttacct aattcatgtt cagccttcag agttccaagg cctatatcag ttttccagga 110100
ttgtttcccc tttttgttgt ttgttatttc ctcctttatt tatatgtttt acttctcttt 110160
tttctcccac tattttctta ttaatggatg tgaaacttca caacatttga aatataggta 110220
acaatgaact ataataacaa cttgggacct atttatctag aaataatccg tcctacccat 110280
gaaagaaaaa aacaaaaaca aaaacagaag cccagaaact tattttgtgg taaaatgctt 110340
cctctgaaat attttggaaa ggaaaaagtt gggaagatat gaaatgaaaa taaaaacttc 110400
tgatgtcaat tcattatgtc atgaggggga aaaaaactaa acgatgatcc acgcaagaaa 110460
ctgattttcc tttcattcct gagaaaatag ccacagacag ataaaatgtt agatatcttc 110520
acagatagct acaatttgtt catctttgaa atacttagtg caggagaacc acttgatatt 110580
ctatttccct atgtgcttct ttttcattac tacatgtaag ttttcatgca attcctcctt 110640
cccctctagc cagcttttcc cctttatata ttgaaagccc taaaaaatgt cttttgggaa 110700
tggcactaac cacgcattgt ttctgtgatt acttttcttc caagcatgcc ataactttga 110760
aaaattaatt ttaatttgat tgagagctct ctcagaaacc tttggttaca ctaggcaaaa 110820
tccaaaatca ggagccaatt attgtaaaaa tcagccatag tacactgtgc gtctgtgtgt 110880
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtacatgtgt gttttaattt ttgtgagctt 110940
tgagccatgt agttctctct gtggagatac tatttggcgt gactttgaat agagaattct 111000
aaaagaaata agaagctcct atgagttctc tgaaagtttc tggactcacc atggatcttg 111060
actgtgtcat tgcatcagac agtcccaggg aacagactct ctggtggttt catagaatct 111120
atgcttgggc tctccctgca gtttactggg tatagtaatg acaaatcact gtttcaagag 111180
acaatttcaa aagcattaga tgctgctgag agaggattgt gaaccagggg actgcccctt 111240
tcttcttgga gagcgacatt gggagaatat gctctgtgag cccaaacagc atcctcccct 111300
gcagggtgag ggcagagttg cagggcaggc ccagaaccca ctccacacag atgtcagccc 111360
tggagctgct gcagaggagt ctgaggagaa aatttttcca gcacctgaat tacacttatt 111420
tcaaaacaaa aatgcaatta aaaagttaaa acaagtaatt aatgtccagg cacagtggct 111480
tacacctata atcccagaaa tttgagaagc tgaggtggga agatttattg aacccaggag 111540
tttgagatca gtctgtgaaa aatagtgagg cttcatcttt atttttgaaa ataaaaataa 111600
aataaaacat aaaaaattta gcaaaaacta cgatgcgtct ttacataccc catcatactt 111660
gaagcattta cctaacccaa tgaggtgatg aggacccaat ttgaaaggag aaaattttag 111720
acttttcata tatcttaata gttggaagat gtagaagaaa tatatttata tcaattaaat 111780
gtgtgcaaat attgacagac acaccatacc aggagttcaa cttgcaaagg gtaaaaccaa 111840
aaaagtttga gattgttaat gtgccatttg aaggtgagat cgttttgagg accatgtcct 111900
gtgagagttt gtttctctat tagaggagtt ctgtactcat aaagttctgg acatgccagg 111960
agacaagtat cagtaaacaa atatcagaac ttgaacttca gcttcccact cttgcattct 112020
ccatgtgtca tctctctact atttctcatt ctagatcagg tctttagcta tgaaatattc 112080
cacctaatta acatgtaaat agattgaagt ccacagagtt aaatatgtat attttctcct 112140
gtttttccca attgttccct cccacagctc caatattctc cactgttacc atcaccttct 112200
agatctgctg ccatgccctg cagattaagg atttgattcc atgacagaga ggaggtgcat 112260
ttcaatggaa ctttggtgag aacctcggtt tttatcccat ttcctctggg gctccaccag 112320
tgcatctgga ataatgggtt cagtggctgg cccctgcagg gtgattcctt agttctgtag 112380
tgaagatgag ggaggtgggt ctgaatgcat ttcagaagta tgggctctcc tctctcagac 112440
agacactttg ggaaaataag atttttctga ctgcacccat tctagaacaa aggaattcaa 112500
ttggataaga atgctgataa aaaaaacctc aaaccaaatt aaatttaaag gagtttaatt 112560
gagcaatgga tgattcatga attgggcagc ccccggaatc acagcagatt gaaagagact 112620
tcagtgcagc catgtggttg aagaagattt atacattttt ttaaattatg tacagaaatc 112680
agaagtgagg tacagaaaca gctggattgg ttacaggctg atgtttgtct tatttaaaca 112740
cagtttgcac actcaagagt gtatgagtgg ttgaggtatg gctgctgaaa ttggccaacg 112800
ctcagctgtt ggtgaggtgc tcaggtacat actcctgagt taggttttca atctcgtcca 112860
cctattcagg taggttaccg tttgtccaca aggactcaaa catagaagta cggagtcctc 112920
ctcaggccat atttaattca ctttatcagt gcccttcagc atatggttcc tgagaatttc 112980
acacggcaac atgtttacca ccctagaatt taagcaatcc aatacatgta ataggctgta 113040
tttcacatgg caacttctgc ctcagtttag ctaacactat ggctttgttt ctctctacaa 113100
gaactcattt ctcccaagat ttccattttc ctgaaaggaa aataaatctt tgggaccccc 113160
atatcactaa gccaaaggga aaagccaagc tgaaaactgt ttggggcaaa cccaccttcc 113220
attctttccc taaaatgata gctgttaagg tgtttacaag ctacatatct ccttcaaaat 113280
ttgaccgcac agaaaatcct tgtagaccaa ggacattgta gaccaagcag agagtcactt 113340
ctctgctcac gtaagtcaaa tgcatatctg attgctccct ttgctctatt gtttcactaa 113400
gccagactaa ggcctatgtg actattcctg taaactgtgc attcagttaa aggctaatcg 113460
gaaactcaaa taatgcaacc atttctctca tacctaccta tgatctggta gctctccccc 113520
caacttcaat ttgtcctgcc tttttgaact aaataaatat accttacata tattaattaa 113580
tgtctcatgt ctccctaaat tgtataaaac caagctgtgt cccaccacac tgggcacgta 113640
tcatcaggac tccctgaggc tgtgtcacag gcatgtcctt agtcctggaa aaatgaactt 113700
cctaaatcta ttgagattag tctcagatac tctttggttt ataagtatgt tttctatctc 113760
ataacttcaa ttatctgaaa tactaaagga aatctgccaa ataacacatt atcttgttta 113820
tctgttattg ttgttgcaaa aataaatata tttatataat ttatgtataa ttgatcatct 113880
ttgtacatta ccaaactgag tagcagattt gttagtaaga cccaatgtaa taaaaaattc 113940
aaatatcaat taacaactta atagaaaaac aaattacgct acatttgttt gccgaaatgc 114000
taccaatttt tataaaaaaa taaacacata taacataaat ggtttaattc tcagtatttc 114060
tattgagaaa aataagccaa atacataagc gaatatacta tattatttca ttcttataaa 114120
ttctaccaaa taaatactag tctaaagaaa tatgaaaaca tcagtagttt ataaagaaat 114180
ggtagaaaaa gggaagggga aaaaacaaat aatataaaag atcaagagga atgctgaggg 114240
gagttgactt gttacctcat tgaaaataga gattattttt tcaaagttta ctattgcaca 114300
tgttaaatat gtgaatttta tcatctgtca gttaaaactc ataaaattta ttacaagtaa 114360
acagccgaca ttttatacaa aaaagggatg ataggaagaa acaaataaat acattaaatg 114420
tcagatacgc caaaaactta tctgcctgac ccctagttgt ctccgtaatt tttggatgaa 114480
aaccagccca cccctgaccc tgctgctctg ggagaggagc cccagccttg ggattcccaa 114540
gtgtttgcat tcagtgatca ggactgaaca cacaggactc accagggagt ttgtgctaag 114600
ctgggttttc cttgttgcta tattaaaatg tgattcatgg agaactagag agattgagtg 114660
tgagttacat gagtgagaga aacagtggat atgtttggca atttctgact tttgtgtctc 114720
tgtgtttgca ggtgtccagt gtgaggatca gctggtggag tctgggggag gcttggtaca 114780
gcctgggggg tccctgagac cctcctgtgc agcctctgga ttcgccttca gtagctatgt 114840
tctgcactgg gttcgccggg ctccagggaa gggtccggag tgggtatcag ctattggtac 114900
tggtggtgat acatactatg cagactccgt gatgggccga ttcaccatct ccagagacaa 114960
cgccaagaag tccttgtatc ttcaaatgaa cagcctgata gctgaggaca tggctgtgta 115020
ttattgtgca agagacacag tgaggggaag tcaatgtgag cccagataca aacttccctg 115080
caggaacgct ggaggaaatc agctgcaggg ggcgctcagg agccactgat cagagtcagc 115140
ccaagaggca ggtgcacaca gaggctgatt tcctgtcagg gtgtgggact tcgtcttttt 115200
accatttctc tagggaacct ctctaagttc agaattctgt gcttaccaat gtcatctcta 115260
catgtttttt aatgattatt ttgagaacct attcttacat gcacaaaatg cagatggatg 115320
cttacagaga tgaaaagtcc tcaaccatgg tcaccaggat cagccttgag gaaactcagg 115380
ggtgcctggt gaatcttctc cagtcagact caggacagaa acctctgtga gattccctga 115440
ctagatcagt cttcaggaat tttgatacca gccaatagag aggctgggcc agggtcagtg 115500
tcatgtagaa cctcacaggt ttcacgtctg acccttctcc ttctcctgac actaaagtat 115560
gcaaatcagt atcagcactg atctgggtcc ccttttgctc ttaaaccatt ctatttcttt 115620
ttatttgttg ttgttcttgc ttttcctcgt acttctcttg ctccctgtaa aatggggagg 115680
tgtttcttgc tgcaaaagcc ccaagcctca agcccattcc ctgcagctca ggcggggctc 115740
aggctgtggc tcctgcagcc acatgggagt ggctgttggg gctttctctt ctcccattgc 115800
tcagcaccct ccagtgtgtt gtgtggagac tatctgggaa cgaatgtgga caacaggagt 115860
gaaggggatg agcttgcgtg gacagaatgg gatgtggatg tgaaatttat cctgtgctgt 115920
acaaacaacc acagattcaa cttcctcacc agtagtatta gaaagagggt gtgaaagttg 115980
tcagaataaa aatggaaaca cttgtgttaa caccctgaca aatggaacta ggaatgacca 116040
tgaagaagtt tctcatgcat atactccaga aaacaagaac taccgtaaat ggattctgct 116100
taaccacagc cttggataga agaaaccaca accttacaaa aatcacttct acaaggatat 116160
cttcccagca actccctgtt taaccctaca gtgatgccac ccttagtcct acaaaaatca 116220
cttctacaag aatatcttcc cagcaactcc ctgtttaacc ctacagtgat gccaccctta 116280
gtcctgattc taggagcaca ggataatcct ctcaaaacga cttatgtaac ccacctcatt 116340
ttcactgtgt aaacctatgg attcacatcc tggagtcact gctgcatttg ttcttaatgg 116400
tcattagccc ctttcacaat atttgaggct gtttttctct gatgtctctt ctaaaataaa 116460
gaatttccaa gtggacagca gtaaagaagc tatttaggaa gatgtaatgg gaaggcatct 116520
ttaacattct gttgaatgtt tccacatggc acttcaatcc cctaaaatac tttgctgtat 116580
cagcatgtga tgaatcggag tataatattg aaggtaaaat gggaaataca tgggcttttg 116640
atgaatcaag tcataggatg agaatgtctg tgtccttgag gaaggagacc atgggttgta 116700
agttctagtg gaggtacctt tggcaaaggg agttcatgag tttctgaacc ttatgctact 116760
tttaatttaa ggacgcaatt tatgatgtat gtttacttaa atctttccag agacatttgt 116820
cagtaaggac agggtagcat ttgtgtaata gtgatgactt agagagttat tttgtaattg 116880
ctcctgtaag gtatgcacat tgctcacttg atacagaagt tcaaatgtca caggtggaaa 116940
aacaggaata aaggtgggca gatcacaagg taaggagatg gagaccatcc tggctaacac 117000
ggtgaaaccc catcgctact aaaaaataca aaaaattagc caggcatggt ggcgggcacc 117060
tgtagtccca gctactcagg aggctgaggc gggagaatag cgtgaacccg ggaggcagag 117120
cttgcagtga gccgagatcg caccactgaa cttcagcctg ggcaacagag ggagactcca 117180
tctcaaaaaa aaaaaaaaaa agaaaacagg aataaagcaa attttatgaa ctgtcatgac 117240
tgtagttttt ggcaaggaca ttatcatgtc aacctgtaaa taaacagaca acaataaaac 117300
atatcaaatc catggggagt ctgacctatg tccctctgtc ttataagcac aaggctttgc 117360
cacatccaaa atattattca ggctccaggg tataaaatgc ttttggactg tggaaggtaa 117420
cagctctccc ctcaggcagg ggtaaggtat ctggggaatg cagagttgtg ttcataagga 117480
agatgtcatt atcgtgtctt ctcctgtgcc tggtagcagg tcctgaaggt gaacgtctca 117540
gatgtcagac atgggtctat cgggttagga taggtacatg tgactgacag ggactgattc 117600
tccatgtaat cacatgccct gtcccaggag cagctgcagg agtcagccct ggacctgaat 117660
agcacacact taccctctgc ctcacctaca ctgttactgg ccactccgtc acaaccagtc 117720
cttactagtg gacctggatc tgccggctct cagggagggg ctgcaatgga taaaatccat 117780
tgctagtggt ggtgggagtc catttgtctt gtggaaaatg gcagcatttc cttattttat 117840
aaggcataat aatgctatgt tgtgtacaca taccacattg tctttatcca tttgcccatt 117900
gacagacact tagtttccat atcttggctg ttgtgaatac agctgcaata atcacaggag 117960
cgcaggtatc ttcacaaggc ggtaatttca tctctttggg tatatttcca taagctgcat 118020
cactggtcat atggtatttc tgttttaatt catttaggag ccaccacact gttttgccta 118080
atggtaatga tgagaataca gaatgtcata gccgctacga agaacagttt tagatttgag 118140
gtataatcca aaagcaaata atgtttgatc agggttctca tatgaggctc taataaataa 118200
gtccagaaag ttttcccatc ttgggcaagg atgagtttgc ccctaattgt ctttgaggaa 118260
gaagattggc agaacgtgag atggagtctg ttggcaggat tcaggattca gtaataacta 118320
gtaatggcac agaaaaatag agagatagag acatacagag aaagagagag agaatatgaa 118380
tctcataaga ggaaaatttg ctaaatatca gcattgggtt ttcagtcata gacacatttg 118440
tatgagccag gaaccatgga gtcaagtgag gagtggagaa tatgttcagt ccaaaaatca 118500
gcatattctc agaggcaccc attgccccat cacacaggtg gagaattttg gaaaccagtg 118560
aagtgcgagt tcacattagg tgattaagct accatgtttc gataaacttt cattaacatg 118620
caaagtactt ccatagataa ctgatgcaca aatatacgag atgccttttt gcgtttatgg 118680
atgtctagag aaaaataagt gagaaaattt ttccaggttg cagagatctg tttaagttgc 118740
agattccata ggagagtgtc tttgaatgaa tactgttcta ttaattaaat aggtcaaaat 118800
tccctctgtt ggagcagcct tccaattata tagatttctt tatagcttct tgagttgtga 118860
aacataaacc caaggattga cttactggaa tatgactgct gtgttgatta aatttctgat 118920
aaggtttctt ccaatgattt gagaatagct ttcctgtttt tttactcaag gaaatgaatt 118980
ttcacaaggt ctcaggacat cacgtttcag gtgctttagt taaagagact cttcttgggg 119040
gcagtcagct ttcttccaac catgagctca tttcttcagc aaaccattcg ctttgtgcct 119100
ctattaagaa ttatgaagct tttgtacttc aatgcactga aaatcatgcc ccttgaatta 119160
aatgttgatt ggcactgaca tgaattggcc actcttgtat atgtgtccta tgttatgggc 119220
tcaacataac agtggactga gaatcgtcca ttagctgcct ctgattgtgg cactgaccag 119280
attgagaatc ctcagagtca tccatgaaaa agagagtcct taggttcatg aggttcttgg 119340
agacattcag gtaagtggag gagagaaaca ggattggggg ctgccagcca tttcaacaag 119400
actgggaaca attatcatct atgtttaaag gtctacatca ttccaaacac cctccaggtt 119460
tctctgagtt cattgtgatg attacattca gctgcttctc cagtgagttt aaatgagcat 119520
gtggcaattc agatgagcct ggctgtgggg tttattatat gtaaatctga actacataaa 119580
caaagagggc atgtctgacc gtatgagggt gcaaaatcct ggagacccca caccccacac 119640
tcttgtgctt tcttttctcc agcaacctcc aggttttttt gtatgagaat tgtaatagat 119700
tatctcatgg ctaagtcatc aagagacgta aactctgaga aatacaagca gaaaattctc 119760
cagatagaag atccagggga agaacatttc tagcacctta tctatgtagg ggaaggcagt 119820
ccatctccat tacagacccc tcacagcagc cttcctttat aaggaaaatg ggtcaaatta 119880
gccaataggg taagaatcct ataatgttcc agccagaaaa gggaaagcat caatttgact 119940
tctggagact ctgtatatag gtcacattcc atagaaagaa gagcactaaa ttattaagat 120000
tcaattgtaa ctacatatga tacttccggg atgcacaaat taaagatgaa agtgtgacaa 120060
tgcacaggct ctgtcagaga aggagaacgt agggaaactg aaagagaatg gcagagagta 120120
agacaaggac agaagagcaa tatgaagcct ctgacatcaa ctctgtaagg acaaggtctt 120180
ggcaactccc gcattgacca cagattctgt taccatgggc catttgcagg gttcctagct 120240
aaggaaaaag aaaaaaaaaa ctgcatgcac ttcccaagtc tccacttgta tcctgttttt 120300
cttagatctc taggacaaaa aaaatggcat aaacctagac ctagtgtcag tgtaggaggt 120360
actttcttta taggcaagac actaggaaga agggaaaatg tgtgttattg gactaggaga 120420
tacagagatg gctttaatct gaatagatct acacccgcag gtattctcga atgcaacatt 120480
caactacaag agcctaatga agaaacacga ccctccccaa acccctgcaa gctcttgtat 120540
tcactgtgtc tccactgatt tagtgcacct ggagcttcag agcactggct ccctcctgtg 120600
tcctagaatc ttttctttgg gtctttctgc agaattcaat aggattagtt aggctaatca 120660
attgtttcaa gagatggtgt tggcagcata tattgtcgct ggaagagtat tctaagccag 120720
gacacaggca ctttatgccg gactaaagac tctggagaaa atgttttgtg agccctgaca 120780
gaaacctcct tgaaaggtaa gggctgggca ggagggggca ctgaggagcc acgcagcaca 120840
cggtccagcc ctagaacagg aggctgggga ggaggtttcc tctcagggcc tcggttttcc 120900
ttcgtcagaa aaaaaaaaat ctaaaataac cgttcaacaa gttgctgata tgccttcaaa 120960
tatcctgcta caatggaaca attcatataa cttcaggcaa tgagaactat tttttaaatt 121020
gggcttctag gattataagt atcttaatag tgaaaatgtg aagaataggt atgattttac 121080
tatttcaatg gatacagaat tgtgggagtc actatattcc tatgaacaaa aaattcagat 121140
ttcagtgtta agtaatgttg cctacattgt gtgagtgacg gggcagtggt ggatccgaga 121200
gtgtggtggg tgcacggaca taatgattca gaaagcaata tggaaagatg agtatctatg 121260
gatacgaact gaaagtatgt aaatacttca caaaatacta ataaacggag ttgaatataa 121320
aacccataat tatccaaaac acaaatttct tggaagttat tttgggaaca tgatttctta 121380
aagaactcca aactcttgtt tcaacttctg actcctcgtt tctgtgatat aagaaaacca 121440
tttccaatta tgcatctcag ggcaattctg taaacccaga gcgtttctgc tgaagatcct 121500
ggggaatcaa gacaccgggc aggtgatgga gacactgtct caggtgcgcc caacgaatct 121560
cagaggaacc tgctggagag tcacgtggaa catctacagt cagtttctca gagtcaacag 121620
tgagctgtgt tggtgcctga ggggaccatg atggggccaa ggcacgtgcc cagtgtcgtg 121680
gacagtgatg gtccagaaat gatctagatg gtcttgacgc taatgaaata tgggttcaga 121740
gtgaggagca taatctgtgg ggacttgttc ttcagtgaaa ggatcctgtc cgcaaacaga 121800
aatggagcag gacatgcatt tcttcaagca ggattagggc ttggaccatc agcatcccac 121860
tcctgtgtgg cagatgggac atctatcttc tttctcaacc tcgatcaggc tttgaggtat 121920
gaaataatct gtctcatgaa tatgcaaata accttagatc tactgaggta aatatggata 121980
catctgggcc ctgaaagcat catccaacaa ccacatccct tctctacaga agcctctgag 122040
aggaaagttc ttcaccatgg actggacctg gagggtcttc tgcttgctgg ctgtagctcc 122100
aggtaaaggg ccaactggtt ccagggctga ggaagggatt ttttccagtt tagaggactg 122160
tcattctcta ctgtgtcctc tccgcaggtg ctcactccca ggtgcagctg gtgcagtctg 122220
gggctgaggt gaagaagcct ggggcctcag tgaaggtttc ctgcaaggca tctggataca 122280
ccttcaccag ctactatatg cactgggtgc gacaggcccc tggacaaggg cttgagtgga 122340
tgggaataat caaccctagt ggtggtagca caagctacgc acagaagttc cagggcagag 122400
tcaccatgac cagggacacg tccacgagca cagtctacat ggagctgagc agcctgagat 122460
ctgaggacac ggccgtgtat tactgtgcga gagacacagt gtgagaaacc acatcctcag 122520
agtgtcagaa accctgaggg aggagtcagc tgtgctgagc tgagaaaatg acaggggtta 122580
ttcagtttaa gactgtttag aaaacgggtt atatatttga gaacaaagaa caatagaaac 122640
acaatctaat tgtaagagaa atattccatt caagagccac cacataagcc aaactgacag 122700
agtgggaaag gccacactca gtaaagttga tacaaacata ccataaaggt gctactatga 122760
acaagttttt gaattagatg aataaatcat ttggagcaag gttatttggt catatgttaa 122820
gagtaagcat gattcttaca aagtgggaaa attgtctttc aaatgtttct gtcacttctt 122880
accataaagt tcattttaga ggttttagga ttacagtgaa attgcacaga aggtgtgaga 122940
attcccatga atccctgccc cgcacggaca ccgcctcctc cactacagcc atcctgcccc 123000
acagtcacaa ataagtcaca atggatgaat ctacaagaac tcttggttct ttctttttct 123060
ggtgatcccc taatataaca agcctaaatt atcttggaac acccaggtat tttcaatggc 123120
tttctagaag tgatattagt cagagggaaa gtgagtgagg ctattactat ttgagcactt 123180
tcttccaaaa tccacaaaat atatgttaat ttggagtttt tctaacttct ggtttacaat 123240
gtcccttccc agagagtaag atttttaagc ttttagtgag gctggaaaaa aaaattttta 123300
aaaaagagaa ataagctttc ctgtattagg ctgacttatc ccagcggcag caacaagcac 123360
agcccagacc caggaaaagt cttaataata ttatctaatg tgctctggag actctttcag 123420
cactccctca acatagggag aagaaaaaca aattttcctt tgtcttatga tatgagttta 123480
tagagtcttg ttctctgtaa ctagtaactt caagtattct gttttatcta agaagcacaa 123540
cgaaggtcat gagaagccta gcaggccaga actacagctg tctaggtacc ggagtgagtg 123600
ttatgagatc aaccagtgca aggctcttta gaacaaaacc tagataacag acatctgggt 123660
tgcatagcaa tggtcatgtg taatcctgag ttatgaacct gttacaattt gattaactgt 123720
ctctgtcctg cctccgtatc cctgcttttg tgcactctaa gcttgcttca agctagccca 123780
ccccattttg ggaagtgtgt ataaaagtca agcgctctct ttgttctgtg cccagtcttt 123840
ggtcattgag tctgctgggt ctgggtgtac tcagtaataa aaatatcctc ctgtatacac 123900
cccaagatct ctctctggtc ctccggattc tgcaacattt caggcagatt cacatctcta 123960
aaaggccagc aagttctggt caatcccata atgaaaatcc tttaatgaga cttggcacac 124020
gtgacaataa gagactcctt gtataatgcc ctagagttgg attagacaca ctgtgagctc 124080
ttgggtggtg gttctgaata aggcagtttg tgcagcaaat gcaaacacat gcatgggatc 124140
caggcaggaa caaaagcttc cctttacaaa gtgggtgggc atctggaggg agccctcaga 124200
ggtgggcagt ggtcgtcctt gctgactgca cattagccag aggcgtgacc ataattggtc 124260
ttgcagggaa agagcaccac tgaggtcata ggttatgaaa atgtttgtca tcctccagtg 124320
agcaagtcca tcctgcttgc ttgtgggtgt caactccatg gtggatacac tctgggagat 124380
gacaagatgc acacaaacct cctctcacta attatccact accacacact caagaccaac 124440
ctttgctcca gaaaggaata cgtgtctgtg gaaatagaca gagcttaagt attttgtaac 124500
ctggtgaaca tactgtgcaa aaccaaacgt ttcaggaaga ttagctcaga aatgtttatc 124560
aagtgactga agggcagtgg cgggtgaggt gatgggacag cctcagggct gcacatgagg 124620
agggctccct cccccatgca ggcttttcct ccaggagctg caccaggaac tcaaggaaga 124680
tcagggagaa ttctgagaac accctgctgt ggagctgcct agagaagaag aataaatgat 124740
gaaaaataca actctgagta atgcatgggt ttttgttcat gaaaactctc tctctgaaag 124800
cttgtgaagg tcttgaaata cccctgatta gctgaagaca aacatttaaa ccctccttcc 124860
acagggagtt caagcaggct ggatgtgtcc ttctatggat gatcttcctc agccccttcc 124920
tcttcccagc tcatccctgg ctctctgtgt aaaaagttct catcagcgga atgtggttga 124980
tgaagtgacg tcttcaattt cctcatcttc tatgtggtca tgttattttc ctcatctgaa 125040
gtttaaaaac tcacctgcat gcagcacatg acaggctaaa atctcttgtg gacaaaacag 125100
taacaaaggc acccaccatg gttgagcacc cgtgttgctg acaacgacca ccaggggtca 125160
acgtcctctt cacaatcctg tgtcagagca gcacttgagt gatttcaata acaacttccc 125220
aggagaatca gctgaaaact acttgtccca ttttccatac agatataacc cctctatttt 125280
cctgaagaaa tagaaagagc tgaatgctga atacactgaa tgtctgctgg ttttgcaagt 125340
ttgtgactat atcactttct aatttctgac ctgtgcagac cactgtacag acttttctca 125400
ctggtgggac caggcttcca gatgtcaaat ataaatgagc ttcttcatat aaaagtcaac 125460
acaagctcct catggtttca gtgctcactg aatggagttg gaaataaaac ccacaattat 125520
ccataacaca aattccttgg aagttatttt gggataatga gttcataacc tgtagaccaa 125580
gagtccaaga gtgtttctat tgaagagcct gggggatcaa gacaccaggc aggtgatgca 125640
gacactgtct aaagagtgcc cagcggctct cagagggacc tactggatac tcacgtggga 125700
catcagcaat cactttctca gagtcaccag tgagctgtgc tggttcctga agggtccagg 125760
atagggccaa ggcacctgct ctgtgtcggg gagagtgatt gttccagaaa tcatagaggt 125820
ggtctctatg cttataaaat ctatgttcac agtgagaagt ctgttctgag agggcttatt 125880
cttcagtgaa aggacctctg cccacaaatg ttcataaatg gagcagggca ttcatttcct 125940
caagcaggat cagggcttga gtcatcagca tctcactctt gcaaggctga tgtgtcgttt 126000
gtcttccctt tcttatcatc gaccaggctt tgagctatga aatgccctgt ctcatcaata 126060
tgcaaataac ctgagatcga ctgaggtaaa tatggatatg tctgtgccct gagagcatca 126120
cccaacaacc acatccctcc tctagagaat cccctgaaag cacagctcct caccatggac 126180
tggacctgga gaatcctctt cttggtggca gcagccacag gtaaggggct cccaagtccc 126240
agtgatgagg aggggattga gtccagtcaa ggtggctttt atccactcct gtgtcccctc 126300
cacagatgcc tactcccaga tgcagctggt gcagtctggg gctgaggtga agaagactgg 126360
gtcctcagtg aaggtttcct gcaaggcttc cggatacacc ttcacctacc gctacctgca 126420
ctgggtgcga caggcccccg gacaagcgct tgagtggatg ggatggatca cacctttcaa 126480
tggtaacacc aactacgcac agaaattcca ggacagagtc accattacca gggacaggtc 126540
tatgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gaggacacag ccatgtatta 126600
ctgtgcaaga tacacagtgt gaaaacccac atcctgagac cgtcagaaac cccaaggagg 126660
aggcagcttc actgaatgag gaggttacag ggcttacgat gtttaaagtt gttcagaaaa 126720
taggctaagc aattgaggaa tatgagtaat agaaatatgt acgcactcta tacaggaaat 126780
atttctaata actgtcaccc tatatgcaaa attcgcagag aggtaaaagc agaaatcagt 126840
caagctgatg caaagttccc cacgtaggct ttgtgcagat gtaagttcta aaatcagata 126900
gataaataat ttggagcaag attgcttgat aacatggcta atgctgaata tgattcctaa 126960
aaactggcca aaatatattc caatttgtct ctgccacctc tcttacataa aatgtattaa 127020
aaagtagttt taagaccaca gcaaaattga acagaaggtg cagagatttc ctatgtgccc 127080
ctgcttcaca catgcacagc cttccccact gtcaccatcc tgccccagag tcatcaataa 127140
gttacaatgg atgaacttac atggatggat tggttctttc ctcttccggc ggtcccttgg 127200
cataccaagt ctaaactatc ttgaagcaca acaggttctt cgagtgggtt cctgggaatg 127260
aagccagtta gaggaaaagt gggtggggct attcctatta ggagtctttt ttagaagact 127320
cataaaatgt atatgttcct atagattctg tgactcctga cttagtatcc cttcccagac 127380
ggtaagcttc ctaaatgttt agaggcagat ccatatctat ggaaagaaag caagttctag 127440
tgaatcccat aaggaatgtc ctttaatgag aagtggagac cttggtcatg aggcacatca 127500
tgtatgattt tctataattc ctttagattc actgtaagct tttgagggtg tttctggatg 127560
aggccctttg tacagaaaat gaaaactcag gcatgagttc caggcacaac caaccaactt 127620
ccttccaaag tgggagggaa tagaagaaac cctctcctgt gtgggcgctg gtccccctcc 127680
attgctggct gcacattagc cagaggcatg agcccaatta gtcttggagg gtgacagccc 127740
cactggggtt gctggctata gaaatgcctg tcctcttcca gctgagtgag tcaacctgct 127800
cgcttgttgg agtcaactgc atggcaggtg cactctggaa gatgacaaga tgcacacaaa 127860
ccttctgtaa agtatcaatt actacacact caaaaccaaa ctgtattcca gagacaggtg 127920
tctgcaggga taaacagaat ttaagcattt tttgaatagg gaagacactg ccaaatgcca 127980
tatgtttcag gaagtttaac tcagaaatgt tgatgacata actcagaaac gtgaggtgac 128040
atgacagctt caggggctgc acatgaggag ggctcacttc cccatgcagg cttttcttcc 128100
aggaactcta ccaggaactc acagaagatg agggagattc tgaaaacatc attctgtggt 128160
gctgcccagg gaggaaaaat aagatatggg aaaaaaaact atataaatta ttagatttgt 128220
taatacaaac tatttctgaa gccttgtgga ggtcctgaca taagccatca ttagctgtga 128280
acaaatatct acaccctcct ttcctgggga gttcagttag gttgcgtctc ttcttttatg 128340
gacagtatcc cccaacccct ttatttcctg cacacctgct gctctccatg ggacgagttc 128400
tcatcagtga aatgtggttg atgtagtgag gtcttcactt ttctcattgt attagtcagg 128460
attatctaga gggagaacta acaggataga ggtctgtatt tgacggggag tttttaagga 128520
ggactgactc acacgatcac aagatgaagt ctcatgatag gccgtctgca agctgaggag 128580
caaggaagcc agtccaagtc ccaaaacctc gaaagtcagg aagacgacgg tgcagccttc 128640
ggtctgtcgc caaaggacag agagcccctg gcaacccgct ggcttaagtc caagagtgaa 128700
aaagctgaag aacttggcgt ctgatgttcg agggcaggaa gcatccagca tgggagaaag 128760
atggaggctg gaagactcaa caagtctagt ctctccaatt tctcctacct gcttcattct 128820
agccatgctg gcagctcatt agatggtgcc cagggaggtt gaggttgggt ctgcctcacc 128880
cagtctactg actcaaatgt taatcttctt tggcaatacc ctcacagaca cactcaggaa 128940
caattctttg catctttcag tgcaatcaag ctgacactca gtattaaaca tcacactcat 129000
cttctgtgtt gtcatgttcc tctcttcatc tgaggttaag gaactcacca gcatgtagca 129060
catcgtagct taatgtctct catggacaaa atagtggcaa ggcacccact agggttaagc 129120
atcctgtgtc gccgacagca accaccacag gaccaagtct ctctaccatc ctgtgtcagg 129180
gcatcgcctc agtgattgta ttggcaactt ccctcgagag tcatcttaaa aacggcttgt 129240
ctcatttccc acgaaggtat agcccatcca ttttctcttc ctagcaaaat ggaaaaggat 129300
gaatacacgg aatgtctcct ggtcttgcaa cttggtgact ttattccttt ctaatttctg 129360
atcaatgcag cccactctac aatttttttt ttcactgaaa tgacccacat tctggatgtt 129420
aaatataatt gaacttcctc atttataatt cagaacaagt acctcagagt ttctgtcctc 129480
atgcaccact ctaaacttac acaagttgtt tatttatttg tttcattttc tggcatctct 129540
actgggggtc ttcatcatac ccattttatg ttatttctac aaatgatttt taaaatttat 129600
aggtacttaa ttaaatattc aggaaacaag agaataaaat gaatgtaaaa taaaataaaa 129660
gtaaataaat taatatttaa aataaagaag ccagcagctg aaagcaagga aaatctatta 129720
tgctgggtca gagagtatgg agaactcata gtacaatatc ttctgcacgt taatcattac 129780
ttctactcaa gttacagggt cctctctctt tatatcagag ctttccctaa catgtgcaat 129840
gaagactgaa cacagattcc tccctcaaga ctgacctagc atctctcact gagcctgagc 129900
tgacaagtca tagatatcac atttgtctaa gaaaataatg acaccctgta aagttaccta 129960
ccagcgatat ggagacaatt tgaataatat aaataaagcc taaacttgat aggtagtcat 130020
ttatccttag aaggattgac tgctgtctct acatgtgttt tttatcacag agaagctact 130080
agtgccacag tccaagttgc tgaatatttt atttcctagc atgagttact acagaatgtg 130140
ttcaacatga aagaatgcag ctgttgttaa gggagaggag atgtgattat ggaacacgag 130200
cagggatcca gcagacattc ctctttcacg tttgcccccc aacagagaca ccagtaaaac 130260
gatgaaatga ttgactttag tctccacagt ctaatgtgag atttatacca gatgttttct 130320
gccactgttt tatagtagaa aatataatct ctaaagaaat tccattttta gagacaatac 130380
catcctccag gaagctgcaa atgcccataa cagagagtat tatagtgcct tgtggccagg 130440
agctacaaca cctgggtttg gaaactaatg gacagaaata tcaggttttc ttgccaaatc 130500
tatgatgaaa atttggagaa tgtttctttc catctccata acaatatgtt gtgatggagt 130560
ggaggtcctg gtacataaga aggtatgtgt tcgcagtggg tacagaatta gacccataaa 130620
atgattgttc tactggggtt cccttgttgt tggaccagct gaccaagaaa gtgttgtaag 130680
aggtgtagta tttagtgaat actgtcatat ttttgaaggt accatatttg aagctaccag 130740
gagaaacaga gatacatcaa tctagcctag ggagactcta tgaatttatt ttatttcctt 130800
caaaatgagg taaaaaattg catcagttga aatgccgatg ataatcaagt gatgaaagac 130860
aacatccact cagtgtttta ggtgtggttt aacccaaaag ttatacaata tgtgagaacc 130920
tgaactctgg agccctggcc atctctcaga agaatctaga aggtagactg acctctccca 130980
cagtgtgatg tccatggaga ctggggatgg ctactgtctc aatcttggga tcccggaata 131040
gtcttaatat gattctgtgt gtatgtggat cattgtgtgt aagtgggagg attccaataa 131100
ctgtgtctgt gtgtttgtga gtgtctatgt ttctgtgtgt gagcttgtgt gtctttgttt 131160
tatattaaaa tgagtaattt agtttctgat cattagactg tgtctttgag ggagtgtgtg 131220
ggagaatgtg catgcctgtg tctgtgagtt agtttgtaaa agggtatgtt atattgaatg 131280
tgtgtgtctg ggtccttcag tatttgagcc tattaattta catgaacatg aattttttga 131340
aggtgtgtaa gtataaaact tttgtaaatg taattgtttg aatgctagtg tgtgcagagc 131400
tatttgagtg tgaatgtgtt acttgtatta cttagtgagt gtgtgcccct atgtgagttt 131460
gtttgggtga gtcattacct atgactctac atatgaaggt gttgagggtg tgtgtgagtc 131520
tgtgagcatg ttttcattac ctatgactct acatatgaag gtgttgaggg tgtgtgtgag 131580
tctgtgagca tgtttatgtg catgtgaaat gttgttatgt atgctttgaa agacttgtct 131640
cttgacctca atatcatttg tctgaaaata ccaggtatgt ttaagccctt agaatctaag 131700
gaatagtttg ttgtttagga taaatcctca ataagattaa caactgattt ctcaccaaaa 131760
atcaggaagg ccaaagctca ctggagtggc atatcaaaag tgctaaaata cactatcaat 131820
caaaaattcc atactagcaa gaacaccttc aaaagtgaag gagaaatcaa gataatagaa 131880
ataaacaaaa gctatggagt ccatcaaaac cacaaattcc taatgagaaa tactaaatag 131940
agtcctgcag gctccaatga aaacagagtg gagaatattt aaaaatctta cacctaaaag 132000
aacaacaaca acaagtatcc cagtaatcac atttgtgtaa tgaaaaccaa tattgtttta 132060
tttttgcctt gagtctcatg ttctattcct tttttaaaaa aaaaatagat ataatagtaa 132120
tgacaaattt gaataatgtg cctataattt atggttataa aattcattat aaatttgaat 132180
aatgtgcata taatttataa tgtatgaata tgtaacaaca caataagtga aaatggatac 132240
agctgtagag aagcagagtt gtatgcacta ttgaactaag gcaatcataa tttaaactac 132300
tctgttataa atctgaatta ccaattgtaa tatccaggtt agctataaaa acttaagtaa 132360
aagtaaaaaa aaaaaaaaat tagcaggaca gctgactaaa cgtgcctgac actcttcaac 132420
cccacatgaa ataaccacag aaatgaataa acagctgaga ctagagaaat tcaacagagt 132480
tagatatcat actaaataat aaagcaaaaa gcttacagct gaagaattta atgaataaaa 132540
taaaaatgca gtttacagat tcaataacag aaaataacga gcaaaaataa gaatttctga 132600
gcttgaagac aagtctttca aaataattcc agcagaccaa aaagaaaaaa aaagagaatg 132660
aaagagagaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaaga 132720
taaaatttta aaaacataga aaccctatag ttttcaaaac acaatttgaa aacaagtttt 132780
tgagttatgg aaaatccagg ggaaaattcc agagggaaaa aaatgaaaat gatgtaggaa 132840
acatatttaa taaaacaaga gcagaaaacg tcccatatca tgggagatag atggttattc 132900
agatccagga aactcaaata ttccaaacag actgaaacta aacagatcct ctctgaagaa 132960
tgctttcctc aaattatcaa aagacaaaga tagagcatga tagagtagga tagtatattc 133020
aaaatattga aataaaaaag tatccagcca ataatataat acctagaaac attattattc 133080
acaaactaac aaatatataa tgtttatcgg actaacatga acaggaaatc catcacctcc 133140
aggctggcct tacaagaaat gctcaagatt cttacatctg gaagagaaaa cataatagcc 133200
acaattatga aaaaatttta aaaaaccata aaacccacta gtaaagccaa tacacaaaaa 133260
agaaaataaa tgaatcaaat cttatcacta caaaaattac aaaactacaa aaataaccaa 133320
taggttaaga ataagaaaca agagatacac aaaacaatga gaaaagaatc aatgaaagtg 133380
aaagaagtaa gacctcttct atctattatt agcttgaaag taagtggatt aaattttaca 133440
tttaaaatac atagactgag ttgaagagaa aagaaaagaa aaaaagaaac aaacaaacaa 133500
aagtgccaac tataggctgc tatgttaagc ccattttgca ttgttataaa gaagtacctg 133560
agtctggaca atttacttta aaaacaaaaa cagtctacaa attcaatgca attcccatca 133620
aaatatcacc atcattcttc acagaactag aattcatatg gaaccaaaaa agacttggat 133680
aggcaaagca agactaagca aaaagaacaa atccggaggc atcacattac ctgaattcaa 133740
actatactat agggccacag tcaccaaaac agcatggtac tggtataaaa ataagcacat 133800
agatcagtgg aaaagaatag agaacccaga aataatgcca aatattatat caatgaatct 133860
ttaacaatgc aaacaaaaac ataaggtggg gtatggagac catattcaac aaatggtgct 133920
gggataattg gcaagccata tgtagaagaa ctatatcctc atctctcacc ttatacaaaa 133980
atcaactcga gatggattaa ggacttaaat ctgagagatg aaaacataaa aattctagaa 134040
gataacatct gaaaaactct tctcaatatt ggcttaagca aagtcttcat aaccaagaac 134100
caaaagcaaa tgcaacaaaa acaatgataa ataggtagga cttgattaaa ctaaaaagtt 134160
tctgcacagc aaaataaaca atcagcagtg taaaaagaca atctatagag tgggagaaaa 134220
tcttcacaat ctatacatcc aacaaaggac taatatctag aatctacgag gaactcaaac 134280
aaattagcca caaccaccaa aaccaccacc aaaaacaatt ccataaaaca ataagctaac 134340
gacataaaca gaccatcctc aaaataagat atacaaatgg caaataaaca tgaaaaaaat 134400
gctcaacatc actaatgatt agggaaatgc aaatcaaaac cacaatggag atgcaagtca 134460
ataccacatt actcctgcaa gaatagtcat aatcaaaaaa taaaaaaata gatgttggtg 134520
atgatgcagt gaaaagggaa cactggcggg aatgtaatct agtacaaaca ccatggaaaa 134580
cagtgtggag attccttaaa gaaaaaaagg agaacaaata tttcatccag gagtcccatt 134640
actgggatct acccagagga agtcaccata caaaaaagat acttgcacat gcacatgaat 134700
gttcacagga gcacaattcg caggtgcaat aatatggaac gggcccaaat gcccatcagt 134760
caatgggtgg ataaagaaat tgtgatacac acacacacac gcacaccatt atatatatat 134820
ataatttttt tttttttttt ttttttttgg ggagacggag tctcgctctg tcgcccaggc 134880
cggactgcgg actgcagtgg cgcaatctcg gctcactgaa agctctgctt cccgggttca 134940
cgccattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta caggcgcccg ccaccgcgcc 135000
cggctaattt tttgtatttt tagtagagac ggggtttcac cttgttagcc aggatggtct 135060
cgatctcctg acctcgtgat ccacccgcct cggcctccca aagtgctggg attacaggcg 135120
tgagccaccg cgcccggcca tatatatata attttatatt ttctatatat acatattttt 135180
tatatatgta catatatacg tgtatatgtg tatatatgta tatatttacc atggaatatt 135240
aagccataaa aaggaacaaa ataatgacag tcacagcaac ctggagggaa ttggagacca 135300
ttattctaag tgaagtagct cagaagtggg aaactaaaca ttatatgttc tcactcatac 135360
gtgggaaata agctatgagg atgcaaaggc ataagaatga tacaatagac tttggggact 135420
tggaatagat gaggggggct gagggataaa agactacaaa ttgggtacag tgtatactgt 135480
tggggtgatg ggtgcgccaa aatctcataa atcatcacca aagaaattac tcatgtaacc 135540
aaaccctacc tcttccccca aaacctatgg aaataaaaat aaaattatgt aaagtaaaat 135600
aaaataaagg tatatttggc tgacagttct gcaggctgta caagaagcat agtactggca 135660
tctgcttctg tcgatggcct caggaagttt tcaattgtgg cagaaggtga aaaaggagca 135720
cgtatgtcaa tggcgataga agagaagaaa aggcagaaaa ttaaggttgt tgggtgggtg 135780
ccatgctcct taaacagcca ggtatcatgt gaacgaatag aatgagaaca cactcattac 135840
cacgtgaagg gcatcaaggc ttttatgaga gatccgtgtt cacgacccaa aaacctccct 135900
ctaggtccta cctccaacac cggagataac attgcaacat gagatctgaa gtgaacaagc 135960
atccaaacta tatcagttac ctacaaaaaa ctcactccaa ttgtaatgat gcacttacgt 136020
tgaatatgaa ggtatggaaa aagttatgta atgcaaataa aaactaactt cacctggagt 136080
agctatactt gtagtggata aaccagactt taagttaaaa gctgtaaaga cagacaaaga 136140
aggacactat gtataaataa agagttcaac ccaggaagaa ggcataagaa ttttaaagat 136200
atatacccaa cgatacagta cccaggtatg cagagcaaat gttatcagat ctaaaaggat 136260
agacaccaat acaataattg ctggcgactt caatccctca ctgaaagcat tgcacagttt 136320
atccaaagag aaaatgaaca gaaaatttca gattaaaatt gcaccagagg ccaggcacaa 136380
taactcacat ctgtaattcc cgcactttgg gaggctaagg caggtggatt ggtagagagc 136440
tcaggagttt gagactagcc tgggtagcat ggcaaaaccc tgtctctaca aaaaaaataa 136500
ataaataaaa aataaaaaac agccagtgtg gtagcatgtg cctaaagatc cagctaccca 136560
ggaggctgag gtgggaaaat caccagaacc cagggagata gaggctccat agagccctga 136620
tggcacccat gcacgccctc ctgggcaaca gagcgagact gtatctcaaa aacaataatt 136680
gcaccacaga ctgaacggac tcaacagaca cttacagaac acttcgccaa acagcagcag 136740
attgcacatt ctttttaaca gcacaatgaa catcctccag aatttaatat atttggacac 136800
aaaaaagtct cgaaattata aaaatatcaa agccatatca agtatcattt ccaaacacaa 136860
tgaaataaac tagaaaccct agaggatgga atatttgaaa caatgcaaat atatgaaaat 136920
taaacaacat gcttctgtgt gaccattgga taaaggaata acttaaaatg aaactttaaa 136980
aatttattga aataaataaa aatagaaata caatatagca aaagctactg gttacagcta 137040
aagcaatatt aagagaaaag tttctagcaa taaacaccta aatcaaaaaa gtagaacgat 137100
ttctcaaaaa ccacccacct atgtgtctta agaactagag aagcaagaac aaacagaatt 137160
cataattgta gaaaaaatag acagtaaata tcagagcaga attttaaaat acagaaaaaa 137220
aattctataa aggatcagca aggccgggcg cggtgactca tgactgtaat cccagctttt 137280
tgggaggccg aggggggcgg atcatgaggt caggtgattg agaccatctt ggccaacatg 137340
gtgaaacccc gtctctacca aaatacaaaa aattagccag gcgtggtggc acacgcctat 137400
attcccagct acttgggagg ctgaggcagg ggaatccctc gaatctggga ggccgaggtt 137460
gcagtgagcc gagatcgcgc cactgtactc cagcctggca acagaacaag actccatctc 137520
caaaaataaa taagtaataa caaaagggat cagcaaaaca gttgttttct tgaaaatgta 137580
aaaaagcaag aaggcattat ctagattaac tacaaatgaa aagagaaaat gcccatatac 137640
atacaatcag aaatgaaaaa agagacatca caatgatacc acaaaaatac aaaagatcat 137700
tagagggtat tatgaacaac tatatgctag agaaaattca agaacctaga ggaaatggat 137760
aaattcatga acacatgcaa actaccaaga ctgaaccaag aagaagtaga aagcctaaac 137820
agaacaatga ataacaggag ataataataa tgaaaagtct cccatcacag aaatgttcag 137880
gacctgatgg tttcacagtt gtgttctact taacttaaaa aaaaatcatg aaaacagatt 137940
attgttaaac tattcaaaaa attgaagaaa aattatttaa ttataatttt aatattattt 138000
ttaaaatttc aacttttatt tcaggtacag ggggtacata tgcaagtttt tttacatggg 138060
catattgtgt gatgctgagg tttggggtat ggatcccctc acccagggag ttagcataat 138120
acccaatagt cagtctttca acccatgcac ctctctctcc ctccccactc cagcagttca 138180
cagtgcctat tgtttccatg gtcatgtcca catgtgctca acctttagca ctcactttca 138240
agtgagaaca tgtgatattt tgtttccttt ttctgtgtta acttgtttac gactatgacc 138300
tccagctgca tccatgttgc tgcaaaggac atgattttgt ttcttttgtg acagagtctc 138360
actctctcac caggcaggag tgcagtgacg cgatctcagc ttactgcaac ctctaagtcc 138420
ctggttcaag tgattctcct gcctcagcct cccgggtagc tgggattaca ggcatgtgcc 138480
actatgccca gctaaatttt gtatttttag cagagagggg gtttcactat attggccagg 138540
atgatcttga tctcctgacc tcatgatctg tctgcctcag cctcccaaag tgctgggatt 138600
ataggtgtga gccaccacac ttttttttat gaatgtgtgg tattttatga ttttatattg 138660
catacatacc attttattca tctaatacat cattgattgg cacctagatt gattccatat 138720
ctttgcggtt gtgaatagtg tggcaagagg catgagtgca tgtgcatttt ttggtagaat 138780
gatttatttt actttggcta tatacctaat gatgggattg ctgggtcaaa cagtagctct 138840
gtttcaagtt ctttgagaat tctctaaact gctttgcaca gtgctgaact aatttacatt 138900
tccaccaccc atgtatgtgt tcccttttct tcacttccca cccagcagct gttttttgtt 138960
taactttttt catattagct attatgactg gtctgagatg gtatttcatt gttgttttta 139020
tttgcatttc tctgataatt aatgatgttg gaaatttttt tcatgtctgt tggccactga 139080
gattgacagg cttacaagtg tcttagtcca gcagttttcg gtaacaggct atccactttc 139140
attttctctt cctcacatgc cccatttctg ggttgtccat cccaaccaac agttactgct 139200
ggagctgaat ccactagccc gcttccatgg gctgtcagga acacattgca agggtgacac 139260
acacgatgat ccatctctgc agagccaact ctccttctcc agagattcat ccaagaaaca 139320
attttgacta tacctgagct ctgtgacatc tgaggacatg gtttgtatta ctgtgcaaga 139380
caaacagtga gaggaagtca atgtgagtcc agacataaac cttcctgctg agaacaatgg 139440
aaagcttttc ttctaagata aggaataaga aaagaatgcc cagtcttaat aattctaatc 139500
agcatattga tgatagtttt aaccatagaa atttgagaaa gaaaaaaata gtaaaaggca 139560
tacaaattga ggggaataag ttaaattgtt tctgtttaca gacaatataa ctttataaat 139620
tccaaaaaaa taaaaaattc tgaaaaaaca gccactgaaa actaacaaac aaatttagta 139680
acattgcagt atacaaaatt tatatggaaa actcagtagt gttactaaaa actaaaaatt 139740
aactatttaa aaatcataag acaatgtcag ttgcatttac aataatatta aataacttac 139800
ttagtggcca tgcacagtag tttacacctg taattcttgt actttgggag gtaggggaga 139860
atcacttgag gctaggagtt tgagaccagc ctgggcaaca cagcaagacc aatatctatt 139920
tctaaaaatc acttagaaaa aatgttggtc aaataagtga aaatctgtgc attgaagact 139980
atatgacatt gatgaaataa ataaatctat atgcaaatat atgggaaact attccatatt 140040
cacagattga agataataat actgttaaca tgtctatact acccaaagca atctacagat 140100
ccaaagcaat ttctatacaa atgacatttt caacaaacta ctttttaaat gataaaattg 140160
aatcacaaaa gaccccagat gtccaaagta accttgaata caaacatcaa agcgggggga 140220
ggtttcctag tacctgaact gcaaatatgc tatgaaacta caataataaa actgcatgct 140280
gctgactttc taaataaact ttaatattct gaattgaagt tatttgacaa tttcttctat 140340
cattttatct ttactaaagt gttgcatgag tgtttatcta gacagataat gtgcaaagag 140400
tcttcctggg tggtaaaatc ccataagcgt ctccaggagc tccgagctct ctctaggctt 140460
ctcagtatgt tcaggttcaa gagacagaaa gaattctctc agcccttcac tgctttttgc 140520
cctcttgacg gtcagaagtc cagaacatgc tttgtgggga cataatagag gggaccaaaa 140580
tagacacttt cagcaaaccc actataacaa gttctgctgc ccatgggcat cttctccagg 140640
tacatgttgg tcgccagacc ctcaggctca cctacaccat gtggaggagg acctctaccc 140700
acactcattt cagcacaact accgtgtagc tcagcatcag taggtcacac tacaatacat 140760
taaacatcac tcagctaatt acttattgag gttttcattt gtccatatgc tatcaatatt 140820
gggcagtttc aaatgacaac ctagaggact taatgatagt taaatttatg tcttctatta 140880
cggaaaaaca tcccttacct aatgacaggt tcagctgttt ttgccaagat ggtgctcttc 140940
cctggcctgc tagtctccta catgagaagc atcaatgaac tgggcagcac cacacacttg 141000
tcaagtgatc actgggaatg atgtcagcta cagaggatgg ggtagggttg ctcataccta 141060
tgctccttac ttctaggaca catcaggtgt ctatggattt agagcatgtc tgcaccctgg 141120
tggactgcac actttaccca gggagaaagg tctctgagtg tgggtggcaa gccacctagg 141180
tgccaaggta agagaccgag ggcacaagct gttccagtat aataaaatat ataaaataag 141240
aatagttata ctagatatag atcatagata tgattatata tgaatatcat taatcattag 141300
tttatagcaa ttactcttta tcccaatgtt attaataatc ctcgctctat aatcataacc 141360
taggaaaaac caagccatac agagatagga gtggaaggga catggtgaga agtgaccaga 141420
agacaagact gcgagccttc tgttatgccc ggacatggcc accagagggc tccttggtct 141480
agcggtaaca ccagcttctg ggaagatgcc cgttgccaag cagaccgtgg tctagcggta 141540
gcgtcagtgt caaggaaaaa cacccgctac ttagcagacc aggacaggga gtctcccttt 141600
ccccagggga gtttagagaa gactctcctc ctccacctct tgtgtagggg atcagtcagg 141660
cccacccgag ttatctggag gcctaatcat ctccctctga tgctgtgctt cagtggtcac 141720
tctcctagtc tgctatcatg ttccatcctg tatacctggc tctgcctttt agataacagt 141780
agcaaaatta gtgacagtac taaaagtctc tgatatgcag aaataatggc gtaagctgtc 141840
tgtctctctc cctctctctc tctctctgcc tcagctgtca ggcaggaaag gacccctgtc 141900
cagtggacac gtgacccact tgaccttacc tatctcattg gagatgactc acactcttta 141960
ccctgcccct tttggtttgt gtccaataaa tatcagtgca gccagacatt cggggccact 142020
accggtctcc atgtcttggt ggtagtggtc ccctgggccc agctgtcttt tatctctttg 142080
tcttgtgtct ttatttctac aatctctcat ctccacacac agggagaaaa acccaccgac 142140
cctgtggggc tcgtccctac atctgagctt ctcaatggag gtctacttct ctatgagact 142200
agcaccttct gtggagtctc atgctgaatg tctccttctt gattatggtc atcggttatg 142260
cagtgctgta attagaaacc cttacagaat aacctacaaa acaagaatga tactaccttc 142320
tacagacatg acaattctac ctaatgtgca caactggacc tattgacatc ttagccagga 142380
gaggatgcag gcataaagca gatgattttc cgattgttcc accctaccgg gttatattga 142440
acagtggaca caggattcaa caggtaccga ttattaatcc agtgaggaaa ttatagaata 142500
gtcccaagtc taggcagaga agagtagctg aagacagtac tttccctgca gctctgagat 142560
tcactaaaat gtccagctct gtccctcact cgtgaatatc acagactaaa ggacaccctt 142620
cccacagcat tggctctcca tgaagatttg aaattgatgc ccaggcctca gggtctgctg 142680
acagagctgt gacagtggga gtggaactca cacagagcaa aacagagtgt gttgcataat 142740
aaggctgtac aacattttca taatggaggg aatctcttgg tcccaggaag atgacaattt 142800
aatatgtctc aggcctgtgg cgctctcttt aggagctttg tgtgtggctt ctttgtatac 142860
tctggctcca ggaactccag tgagggaaga gattcgtcac ctcctgtgcg aagggggctg 142920
aagcgaggaa gacaagtggc ctggcttcca cagaacccat aagctaaaac actccgagtt 142980
cccttgactg caagaaatgc agctgtcatc acggtttcaa gtgccagagt ctttaatgat 143040
tatgtttcaa ctcatgagag tgccaggaaa attccaccag tatgaactac tcaaatatgt 143100
cattttgtaa cattacttca ttgcttgctc tcatatcctc catgtttctg aaaaagcaaa 143160
gtttccatgc tttatcatct gcaccaatga ggccatattt aagctatatt ttcatatgaa 143220
cgtctcttga agattttaaa atagcaacaa atgttgcaac aatatgctta accagaaaaa 143280
aaataaagca aagcagtcta tgttgactca tgtgacattg ataatgtata ttagattata 143340
ttggttgctt attcagttgg tcatgggaga agagccttct ttccagccaa agaatactaa 143400
gaactccctc ttctaatgac gaatttcagc tgatcttgct gagaatattt agcaagaaga 143460
cagaaacaga gactcctaaa gggagctcca gagtcctgag atacatttaa gttttcattt 143520
tcctggaacc cagagattcc ccactgttct acaagacaag accccattct atgaccctgt 143580
ctgaggagag ctcaggggca gtgagctccc cctcacatta ccccttcacc ctatgccctt 143640
ggggctctgt ccatgcaaat aagtcccggg ttcaagaacg aatagaggca gggctgtgag 143700
tgttatgctg tgtgctggct ctgagctggg gtctctagta gcactctcca catccataga 143760
tacatggccc ctccgctact ccttctctgc ctgctggctg ccctctgtgg tgagttactc 143820
atgatttcat acgtggggag acacgggatg aggcaaatgt gtctgtgact cacagatgtt 143880
ctctattctc aggggttcac agtgaggacc accttgtgca atgggaggaa gaagtagtgg 143940
tccccttggt catgctcagc ctcacctatg ccgcctatgc acattcaatt tctgaacatt 144000
ctgtttcctg gatccaccat ctcccatcaa aaggtcttca gtgtgttggt gtgatatggg 144060
ttaagggaaa cactaagccc caaccttcag ggcagagcta gcatctccag aaacacatag 144120
taaaaaacaa gaaaacttac agctgagaag tgtgatggct ggggatgcag gcgtgtatta 144180
ctgtgctcaa ggcactgtga ctcgaatcca gagtgaactc agacacaaac ctgccctgca 144240
ggggttcttg ggaccacaag gggaaggatc aggtcaccag ggtgtactta ggaaccactg 144300
aactgggtca ggcacaggag gtgggggtca gggctcctcc ccagggaagg gcttttaatc 144360
tccatgcctt gtaaacctct gacaagccag gcagacacag acatattttt aagctatgga 144420
aaaagatgta cctttcattt tggaggaaaa agatcataag tgtgaaagca aaacttacca 144480
agggccaggt actggaataa ctgtaatcta cataatcact ctaagaattc taagaattta 144540
caagtgcaat catcctcatt tcataaactc accttaaata agagctttct aactgatccc 144600
atatattctg attttgttta tttcttcaac actttattat cttcaaggca tttcactgat 144660
gtcaatttta gaagaatcat atgcaaacag cctctcgtgg tggttgaaag cccacagcct 144720
cgccagtcct gtggatattt ctggatgttc tcagagtctc cattgtctgt agagaagaat 144780
tgtcccaata gttatttcac ttttgtcttc cacaaagttg gaaagatggg gatcactcag 144840
gggaatcgag atcaacaaac agaaagcctg aacccaccat atacaagata ggatgtattt 144900
ttttaggaat atattaattc ccagaccctc aggctcacat accccatgtg gaggggaaca 144960
cacatccact ccttcactca agccaagctg gccatgcagc tcagcttctg caggctcagg 145020
actgcaagct ctccagtgtg ggagtggagc taatgggagg tgaggccaag tctctgccct 145080
cacagagtct catgatgaag atctgatgaa atatttccac agtaacattt ctttggatat 145140
ataaatgtag aatatatttt gaaataatga atgatgtatc ttctgatgga ttcatgttgg 145200
ggaggcaata gaggaaaaat aaaggtaatt ttaaatttct gctcccagct acagcacttg 145260
attttgattt agtgcatgac tgtttgaaat tttttgatgc agtcaacttc agcagcccag 145320
acctggaagc ccagccaata aatgctccag attgggaaat ttaaactgat gggagctgtt 145380
tcatggagga ggaaaaatgc tgagccagtt gtgcgatcat aactattgac tggataatag 145440
aagcctgtgc cctttctgcc agtacctctg gtccgaaacc tgagctaatc accctcacca 145500
agttgagtaa acattgacac ctatactaag tacaccttca tggtggtgca tgctcatggg 145560
gccatctgga aagaaagagg ccttgtctca tcaggaaata aggacattaa acacccaata 145620
gaaatggtgt taaactacta gaggtgtgtt ctcatccttc tcatcctcca ttatgcattg 145680
ccctgagcac ccaaaagatg actcattggc acctaaagga aatcagactg cagaaaaggc 145740
tgagaagtga gcagtgcagg atgcacacct gctatgagct ttgattccac atctggagtt 145800
tccatagttc aaactccatt atactaaata gacaagaagc atgcctgcga ctggggattt 145860
ggtaaaacag atccagattt attctgaaaa actaatgctt atggattatt cttactctcc 145920
gaggccctgg tctacaattt taaaacattt acatgagggc acacactcca aatgatattc 145980
ccttgcagac tttgtatgac catgtgtcag aatggtcaga aaactgttca gaaagtcaca 146040
tacgagtgtg ttttgtgtgc caaaaatatc tttgagactg aacaaaatct ttgcaacgaa 146100
gaggtacaac acagagaact gtgactcttg gaagattggc aagtggattc actcacatgc 146160
ctgtggccag tggcaactat aaattcctcc tgattgttct agatattgtt tcaagatggg 146220
tagaagcata tctcaccaag tcccaaagag ccacatgact ggctaaggca taattcaagg 146280
aaatcgttgc caggtttgga ctcccatgca ctatacacag tgacaatgat ctttctttta 146340
tttcagagtt tactcaaaag gtaagtcaag cactgcaaat cgaatggaaa ccacagtcat 146400
catggagacc acagtcagca gtaaagaaat aaaagataac accttgaaga agacaatagc 146460
caaactcagg caggaaattg acctgcgttg ggatagattt tttcttattg ccttgttctg 146520
gggcagaacg gtgccctgaa gtgggcttgg gaaaagtctc tttgaaatta tatataggag 146580
gcccttccag acctcttgcc agtaacagca cctttagagc tggtaaaaga gcccagagtt 146640
aaacaatatg tgcagattgg tgcagacctt gctaactgca catcagcttg ctatttccag 146700
gcctgtttat tccacagtga gcctcttcac cccttccatc caagagacaa gatgccacta 146760
cagtcttgta aaagtcaaaa acaagatcag cagctgactg aaaggtggaa cagaccccat 146820
gatgtgctac tgattaacct ttgttcagtt aagttatcca atgtaaagcc atgggtgcat 146880
cgctgttgga gaaaacctgt cccacctcaa tttgacccca gataacagac tacctggtca 146940
cataagccta aggaaaacct gaagttgctg ataaagagga gacaagaaga cagataggta 147000
atacccttct gttaatataa aattcttaat gagttctata gttataagta cattatttct 147060
ccttattaaa actaatcttt tttgctgaat gggtggaaga tggtggcttc cctgcaaaag 147120
aaaacatagt tggttctgta aagagtttgc ccatttcttc cactataggc ctgccctggc 147180
ataatacaag ctcccaacgt aagaatttat gattttccat ccattggaga agccatcttt 147240
tccatctatt ataaaaacag aagacacttc attaatatca ctcccactat aggctatgcc 147300
atatccagtg aggtaggatg gctgacagtg gtgcgaatcc aagtaattgg tcaagcactg 147360
ctatgtgtga agaaacacca cagcatactc tacactgtca ctcatgatat ggaattgttg 147420
cctccttagc aatgtaactg agcccttaat atgtggctgg gatgacaagg caatgccagc 147480
ctgcagagtg gaatctgttc ttccctctgg ggttagctac agcctgtggc actcatggct 147540
ggccctactt tccttacaac tggactaaaa gaagcaactg gatatgacct tatatcccag 147600
gatgtaactg tccaaagtgc attctcttta tgtcaactgg aaaagtgtga aagacagaca 147660
ctactgacat aaacagacat cctagttgtt ctgcccacta gccagctctt ccccccaggt 147720
ggcagtcata gatttagaat tgcaagtaga ggccctggct aagcaaacca ccagtccctt 147780
taacaacacc taccatgcca tcatcattct tactgaagaa acctcacaga tttgacaagt 147840
gacactatga agctatatga ccctaggtat tgcaactaca gccaaaggta acacttgtgt 147900
attaatgaac actgaatgtt gcatatatat acaagattag tcccacaata taactcaagc 147960
tatgcaagca ttagataccc atatttctgc tagagatgga tgccctctct cagaacccca 148020
tgacagcatg gtttagttga cttcctaaca catggaagag tttcatatat agtagagctg 148080
gtattctgtt cattgctatc ttcaattgct atggatttta ttgctatctt gcactttaag 148140
tgagaatgta atactgacct tctcaaaaac tcctaggtcc ttgcaccata atgctccaac 148200
aaacacctac tgtaattccg gagactccag aatatttcca actccagttt aatggattcc 148260
cttccaatac atacaaccta tgccctttct aaagaagtag ccagaatgac tatgacacat 148320
gttttccata gaaacgaaat ggaatttgac agtggggaat gatatacagg cagcttaatt 148380
tcaaaatgca ttttaaactt agtatttgag gttttaatat tattttttat actccctgaa 148440
acctgaaatt tcacacttac attttaattc agacttaata gcaacaaata accagaacac 148500
atgaattgcc tgtaatctct ataccttgca ttgtaagcca catttcaagt gtaaccttac 148560
ttgtcagcac agtatgttta ccacaggcat aattgcttgt cctgactgtc cagaaggcag 148620
ggtggtatta agtatgcggc ctctggagct gggaagtctg gctttgtata ccgtctctgc 148680
cactgctaac tggaggacaa tgggccagtt acttcctgta ccccagtttt ctcatatgta 148740
aagtagggtt gttgtaagaa tgaaattagt taatatttag tacctaacaa ctaataggca 148800
ttacatggta gctattggta ttgctatcgt cagagaacac acaggagtcc attgttattt 148860
ttaccctccc cctccaaaca aaatgtgtaa gacactagac atggtagctc tgtaacgggg 148920
ttcgtcatgt attaaactgt gtacccaaat gatatgtcaa agtcctgaca accagcactt 148980
cagaacacgt ccttatttgg aaatatggta gctggagatg ttattagtga agatgaggtc 149040
ttacttgagc agggcaggcc ctcaatgtgg gaagatgggt gtctttctaa gtacaaggaa 149100
atttggacac agagacagag acatacagtg tgccatatga cagcagaggc aaagatcaga 149160
gtggtgcagc agtaaaccaa tgcatgtccg ggattaccag tcacctccac aagtgaggaa 149220
agggcaagga agaattctcc tgagtctcag agggagtgca gcccagctca cacttgattt 149280
tggacttcta gtctctagaa ctgtgagaga atacagtcct gtcattttta agccacccag 149340
tttgtagtat ttcattttgg cagccctagg atattcatac agaattcttc acccaaaagg 149400
aagcactctt tcacacaaac agtcaaagtc ctggatgaca gacaacctgg agactgcaaa 149460
cctccaagga atcaaaggaa gttctataaa ttctaggggc cccatctttc aaaggctgct 149520
cctcaagtcc acacccacac tttggaagga gaatcctgct cttggacatg ggatccttag 149580
tgagccaact gccaataatc caacatcgtc atgaattaaa gatctctgac atttcctctt 149640
caccaagggg aattctgtca agtagtaagt aaaacccttc ttcagtaatc tccacaccaa 149700
acagttctgc atggcttggg acgcctcagg aaacttataa tcatggcaga agaaaaacgg 149760
gaagcaaggc agtcatacat ggtggcagaa gagaggttaa acttttctgt ctctcttggg 149820
tgtaaagata taatcttgag gcaaacagca gaatcaattt tcttacgcct tgaaatagac 149880
tccacctttc tccctttcac cataaatatt cccttcacat taatctaact ttatgtttgc 149940
atcgaactat gtgccttttt ggaagttccg gaagctaatt tgagacagat agacaaagtc 150000
gggagaccct gatgcagaat tccagaggtg acttcaatgt tgctagttaa caacccaggc 150060
attgcccaga tgatgccagc ccaagatcta ggtggactgg gatgccagag agccgccaga 150120
acaagacgca cagacctggt tctcagccca aatcttgcat gcctttctta ccaacttttc 150180
cttttttaaa cccctgcctt tccttcaaaa ttcaagtggt tgcttgggat gggaatgcgg 150240
tcacttcccc tttaccatta tggttaatac aataatcttt gtaccagatc tctctcttgt 150300
taattggatc ctgcaggtgg cagattccgg accagagtga ggttagaaac tgaatgcaca 150360
tactgggtgg ttcacagaca cggtgttctg tgaagtttat gggtggattc ctggggaagc 150420
ctgcaagcct gttagtgatt agcagaaccg catccagcta ctgggatctg cacgccaggt 150480
gccgtgagcc cctcaccatg ttccctggtc ccagctgccc gcggatggtt cagccttgac 150540
aacgggctcg gtgttctggg tggtgggaga gcaagggggc cccttgggca gcgtgctaca 150600
gggctgtgaa tccaggggcc cacccggtgt tccctgtgga gtcactgagg gaatgagggg 150660
cttctcaggg cacagagctg taacgccttt gtgcagtggt ggctgaatac agtgacactg 150720
ggcgcgtggt gagaagcggg gcaaggtcag ttcactggac cctccgccct gagcctcaga 150780
tgagtcgggg gtccccagac aggcccggcc tctgccctgc ggcggacact ggagcctttg 150840
ctgtggccgc caccgaggag ccttgacctc aaagcagcgg gaacctctct acccacctcg 150900
gaaacctgaa ggcagcggcg gcctctccca gccaggacct cgccggcatc cgggtctcca 150960
ggcccaaccc tgtaccacat aaaggaagtc cccgctgagc taccgggggg acacagcgcc 151020
gttgggtggg cgggcgcggc ggggcgggaa gcaccggggc agctgccaca gagatgcgcg 151080
ggggctgtcg ggaagtgggc ggtccgggag acgcggggct gatgggacgt gggcggtccg 151140
gggacgcgcg ggggatggcg ggacgtcggc gatcggagat gccagggggc agctgggacg 151200
tgggcggtct ggagaggcgc gggggcagct gagatgcagg tggtccggga cgcgcggggg 151260
ctggcgggtt gtgggcggtc cagggatgcg agggggcagc tgggacgtgg gagttccggg 151320
gacgcgtggg gtcgccagga agcggggtct aggacttaga tccgccttct cttcaggcca 151380
tgcagccccg aagctccgaa tcctgggatg actcctgtcc atgttggaag ggaccctgcc 151440
agtcctggca aggttcaaag gccttagggc aagaaatgtt agtagagtcc tggaagacga 151500
tgtgggaacg ggtagcggac accggatggt gatcgttctc ctacaagacc ttgacatgga 151560
tggggagaaa cagagaagaa ccttccaagt ttgtcccact ggacatgccc accacacttt 151620
accagccctt ttctagaagg cctgtgcgta acacatgaaa aagctccgct cgacctttcc 151680
ctgacctttt aaaagaaaac atttgctgca tctaatccgc ctagatataa ggaggttccc 151740
aaatgtatga cagagtcaga aaattacatg tcttgtaagt taccatgtgc ttgtcttttg 151800
ttttccgttt tttttcgttt ttttgttttt tgtttttgag acggagtctc actctgtcgc 151860
ccaggctgga gtgcagtggc aggatcttgg ctcactgcaa cctctgcttc ctgagtttca 151920
acaattgtgc tgcctcagcc tcccgagtag cttggattac aagtgtgcac caccacgcct 151980
ggctaatttt tgtagttttt agtagagatg gggttttgcc acgttggcca ggctggtctt 152040
gaactcctga cctcaggtga gccacccacc ttgcctctca aagtgctggg attacaggtg 152100
tgagccaccg tgcctggccg taagttacca tgtgcttttt aaaaaaatca tagcaaaggg 152160
gtgtcttctg gaaatgacat tttgaaatgg tgttattaga ccacccctgg aagggacaca 152220
gtaaccacac gtccacgttc gttcagtggg tgagaggaca tggaggggag acctgggcag 152280
gaagggaaga gggttccatg ccaggctgct catatttaga agacattttc atatcattgt 152340
cattgttttc ttgtgtgcgt tttattcctc gctattgtat acatcattgg aaattctaag 152400
tattcttttg aaatatctag tctttctaga tgttctgaag tgcctgatgt atgttaaaat 152460
tacaggtggt aaaataataa attttgtaaa tatctttttg ttaaaattca tatgcagtgt 152520
tttattttat tttgatgttg gtggggggtg gggaggatga ccaaatccct gcttgatcaa 152580
cacacattgc gtttgtgctc tggttcaggg gaggagagag gaggagaaag tgcagacttc 152640
caggcctctg tgcgcaccgg gaggagagat taatgatcat ctcttctgtc tgtgtgtttg 152700
ttttatttat ctatggatat cctgtgtata aaggatgaac aagtcctatt tataacatct 152760
aatcttttca ggtgttaagt tgccagtgta tgacggaagc agcgttatta aacgaacgca 152820
gcttgtacat attgtgttaa aattcataaa aagccagtct tctgaaaaga acccttgggc 152880
cctccctccg cagcctccgg cgccagctgc aggaagacct ggccagggga aggtgggtgg 152940
aacaagctgc tgctggctgt ggggaaggcg gtggagccca ggcctccaca ggttccccac 153000
aggctcccca caggctcgcg cggatctggt cgctgggttc cgcacgggcc gcgtgggggc 153060
gcctgctggg agcgaggagg cgccatcctg gctcgcctgc tccaggagga cgctctgggc 153120
ctgcgcagat gcagttctcc aggatgggcg cgggcgctgg gggccgcgct ccttgggctg 153180
ctgcgcctcc actgagccgc ctgggtgtga ggacctcacg ccggcgcctc cgggaaggac 153240
gcggagccgc cgcggccgag cccagggctg cagctgctgc ccgacgcccg cgagaaggcc 153300
cttccgccac cgcccgcggg ttcgaacttg gagcagctgc tgccagctga ggcgccagcg 153360
gcgtcgggag ctcctcagag tcagtgtttt gtgctggatt cggcatgtcc tctgaaaact 153420
cgggaatttg tcactgaaat ggtgacagga ggtgagaagt ttttttagac gttgccttcg 153480
ctgaccgggc gccgggctca ggcctggaat cccagcactt tgggaggccg aggcgggcgg 153540
atcgcttgag ctccggaggt ggagaagctg ccttcgtggt aactgtggtc ttaagttcag 153600
ctgagaacga taaatggctt ttccttgaat tggctgcttt tgtgatttct ctcaggctca 153660
tctttcgtca gttaaaaatc cagtggtagg tgtagcttag agacgggaaa tttttggttt 153720
tgttttggct acacgtaagt cttggaaatt attttctttt acgttccaat gtgagcaaat 153780
ccagaaggat gtcagattaa acaccgaatt taacaaattc agccgggcac ggtggctcac 153840
gcctgtaatc ccagcacttt gagagaccga ggcgggtgga tgatgagttc aggagtttga 153900
gaacagcctg accaacatag tgaaactccg tctctactaa aaaaacaaaa attagccggg 153960
cgtggttgtg cgcgcctgta atcccagcta ctcaggaggc tgaggcagga gaatcgccga 154020
gattgcgcca ctgcactcag cctgggcgac agagcgagac ttcgtctcaa aaaaacaaaa 154080
aaaaaaatca atcattggaa tactgttgtt cattacaatt aatgaacgtt tgatacacgc 154140
ataaacgcac taaattcacg agtacatata agtaaaataa gccaaaaaaa aaaaaactac 154200
atcctgtatg atgacacttt tatacattct acagaataga aactgaagtg acatgaaggt 154260
cgggagttga atggagaaaa ggtgagagaa aagagggagg aaggcgttgc aagagaataa 154320
gagaaaatgt tgagggtaat tgatttgttt tctatcttaa taatggtgat ggttacatca 154380
ataatttcca aattgtacat tttgtgtgtt aattagaatt ttatattatt caagctatta 154440
caaataaata cctgtataaa tttcttaggg acggtgtaag ggagatggat aaatcacata 154500
aaaagtcaga tatttctgaa tgtacaatga ataaccctta gctctatctc tattttttgg 154560
taattctaaa atgcagcagt tttttttaat gtttttatta caagaagggt ttcttcaaac 154620
cacaccaggt atgcgtaact ctgggataaa gttggctaag ggagctgtgg gatccggtgg 154680
agaggagcac aggtcccgat cctggagccc attcttgtca catgtgagct ccaggacaca 154740
tctcatagct ccctcatgct tctgggttta cattcacatc tgtaaatgga ggaccaatgg 154800
gcatctgcct ctaacaatgt attttcgtgt gttaagataa tgtatgctaa atgtttacca 154860
cagcacaatc ttttactaag aaattacatt ttttccaaat attatcattg tcttcaagcc 154920
ccaccaccca ctagaaaact tcatctgctc tgtgccttgc cctgtcctca gacatcctgc 154980
ccaagagact tctatatagt aggagacatg caaatagttc cctccctctg ctgatgaaaa 155040
ccagcccagc cttgaccctg cagctctggg agaggagctc aagtgccagg attcccaggt 155100
gttttcactt ggtgatcaga acttaacaca gaggactcac catgttgttt gggctgagct 155160
gggctttcct tgttactatt ttaagaggtg attcatgaag aactacagat attgtttgtg 155220
agtggatatt agagaaacag tggatatgtg tggcagttgc tgaccaggat ttctctgtgt 155280
ttgcaggtgt gcagtatgag gtgcagctgg tagagtcttt tttttttttt ttttttcact 155340
ttttagcgaa catccatggg ttacaaaata atgggttggc ttttcttcca acactttaca 155400
gacaccatca attttcctct tgcttataag gttttaacca gaagaatgct gtcatcatct 155460
ttcctgttct tttagaaaga atgccccctc aactcatctc cacttgtctg catgtatttc 155520
tatttgtctt tggttttcag cagttttaat aagattcacc taaatgtgtg tgtgtgtgtc 155580
gaggggtgtt atgctattgt tctgtgttct ctgagatgca tggattcacc gtttactctg 155640
tctccatttt tgtgaaaaca attagaaaaa aagtcagtgt gagcctagaa acaagcctcc 155700
ctgaagtggg cactggacca cctgggggcg ctcaggaccc actgagcaca agagccagcc 155760
ccagggcagg tgcagagggg tgttaaggtc tggtttcctg tcagccctgt ggcttcctct 155820
ccataaaaca gtttcctttg tggcacatct ctggattcct tatccttttt ttcctgtgaa 155880
gtctgaagaa gaaacatttg tcgtaacaag agaaaaactt tctcatatgc accaaaggca 155940
gagtcaccta cagtcattta ctcctgtttc tgaatgtcaa taaggtgtca atgcttctga 156000
agttaatcag ctaaatctat aaaaggtgcg gtgtttaact cagcatggca gcccagctca 156060
acagaactcc aagggccagt gagcaagcag gcaggataaa gtgcatgctg ggcattgggg 156120
cagagggagt tagcatccag tgcaagagaa gaaagccccc gtggtggtca ttgtcaggac 156180
tccaagccca cagttccaat tgtaggtgat actgggcaaa ggaagagaga ccccaccaat 156240
ggttagtgtg gatttcgagt ctgatggttc cacactcaca ctccaggtga atatgaaaac 156300
atttattaac tctatttttg aggtgtctgc tgagagcagc acaggcctct caagaaattt 156360
caaactggaa tttcctcagt agacaggaaa ggaggctggc tcagggcttt ataatgattt 156420
ggtggtgggg ttgggggtgc gtttctactc aggagaagga gattgtgtga tttaaacctc 156480
acaggggcat cagataaggg agcttctgtg atttcttact agatttacca catgcagggg 156540
ataaggagga ggaagaataa accttaattc gtcagcaacg aggcaccaaa aataggacct 156600
gacgctttat tctccctagc agcttaagaa aatgagtgaa aaagagagag aagagtccac 156660
tatgtgtgaa aagcaaacag gtctaaagaa aataaaaatt ttattactgt aagcacataa 156720
taaaaagaaa gagaagaatg aatgagacag gcaggggtgc tgaatcaatg tcctgagtgg 156780
ggccttttca ttatccacag ttatcagtta attctgaagg tctcaggtca gcttcctgct 156840
tcaaaatatc acaggccctt acagtatatg tgaaaatcct cggtttgtcg ttcttcacta 156900
aagtagcctt ataattagat gtacttctga atttaatctt cagttgtgtt aaataaaaaa 156960
aaacacaatc tacaatttag gaaagtgaga gtttattttt atcaaggttt acagccatcc 157020
catatgctgg aaagcatagc ttttggtaaa gacgagagaa aggcactccc aggaagaagg 157080
ggttgggcag aagctttatg ctgaagggtt tggctaaaca gacataatca acaggttaca 157140
ggaggggcta ctgatgttca tggaggtggt cctcacacat gcatactgaa caaacatgtc 157200
tgtaacgtat gacccctgtt cacttaccag tggagactta gcatttaaat tcattacagt 157260
caggccctat gtgccaatag cagaagcaga aacacaaagg cactcagggt gcagcctctg 157320
taaacggcca gagccaggcc atggtgagtg gtctctgatc aggagaaagg tcctgatatc 157380
actctagtgt tcaatcaaag ctggggttat ggcttgtgga acaggggtca gttcatcagg 157440
ggatgggctg caattgtctt catagtgctt gtctcagtgc cggtgcttac tgagccgcta 157500
gagaaaacga ataacctatt ggcagttaga agacagttta ccttttaagt gtgggagtga 157560
gtggcagaac ccttgcctga catggcttta ggtcttgttt ataatttgac atcttattgc 157620
cacagagatt ctgttctgtc attcttttgg atctctattt taacattagt gttggtcatt 157680
gttgtgtcta aaccgcaaag gggagtgagt gtaagaggcg cgtctgatct tgtcatggct 157740
gggatctcag tttttaggct tttctggagt cccttagatg aacagatgga ctatttagtc 157800
agttggggca cttaggattt tatttttgtt ttacagttca taaatatgaa ccctagtatt 157860
gacattgtgc atattcactg ctgtgttgtg gttaaaatta cctggtaaga ttcccttcaa 157920
agccgttcaa gagcaatatc ctaccctgat gtttcttcca gtaaatacca ttccctgttt 157980
taatgtcatt agaggctatt gaaaagatgt aggaaaatga tagcttaatc tgtcgatgac 158040
tggagtgggt aagatacagt catcactttc aatgctttgt catgcgtgca tgtaatagga 158100
agaggtgagc tctgggggaa aatctctaaa tgtatgggcc ttccagccac caaatcataa 158160
ggtgatgact gatgtctcac tgagggactt gactataatg ctctagtgct agggagagaa 158220
actttggcca aggaagttca agattttctt aaggtttgga caagtttagt tcaagtatga 158280
caattttctt caacattttc agaagattgt ggatgggaat gatgctgagt tatataagta 158340
attctaatgc cttctgtgtt tagataatat tataaacaag actgtttggg tataatgacc 158400
cactacaata tatatacttt tagttgttac accatttcat tttcctttag gattttactt 158460
tctaagttac atgaatcagg tccctaaaat ataggcgtgc atctaaaatt tattctttgg 158520
tgagaatttt tacgtgttcc agaagatatg agaaacttct ttgcgtgaag agcatcccaa 158580
agtcaggcac tcctgtaaaa catgtactta atccttgtct ttggcttatt gatgagctct 158640
gttgaccaca ataaaacttc tgtcatgcgg gctgacttga catcaggtag aggaacagat 158700
tctgaatgta ctactgaatt gagtgcataa cctccagttt cgttactgat gtatgattca 158760
tcagagatga tactagatca aggatttcaa tcggaatcta atctaaaaga tgtgaataaa 158820
ctttcctaat ttagatagta ttacttgtga gcacactgct agtattccag ccatgtctcc 158880
tgtctgtcac actgaattca cgctaacttt gatctaaaag ttaacacttg ttctaatgtt 158940
caaatatgtt atttttattc taatgtctct agattattat ctgtggctat tttaggcaag 159000
agtgaaggaa agcaaggtta actgactaaa aatgagaaaa agcacaacct aatgtaatgg 159060
aagtcaggac atcagcatct ccaggcttgt ctatttctag agttcatgca accaggggat 159120
ttcttttctc atttttacac aaagaaacac ccaaattgtc catttcatct cccattgact 159180
cttatcatct gtctctgtca gtttgcttag aattttggcc tccagcttaa tccaagttgc 159240
tgcaaaaaca tgatttcatt catttttaca gctgcatggt attccactgt gtataagtac 159300
cacgttttct tttttcagtc tgtaactgat cggcatttag tttcattata tgtctttggt 159360
actgtgaata gcacagtgat acacacgtga gttgatgtgt ctttttgttc caatgattgg 159420
ttttctcttg gacatatacc cagcaatgag attgctgagg ggaatggtag ctctgtttta 159480
aattctttga gaaatctcca gattgatttc atcagtctct tgggccaaat tatatttcca 159540
ccaaaagtgt gtaagtggtc cgttatctct atagccttgc ctgcatctgt taatttctga 159600
tctttcagtg atagcaattc tgacatatgt gagaaagtat atcatttggt tttgattcgc 159660
acttatctga tgactgaata tgctgagcat ttttataggt tagttggcca cttctatgtg 159720
tgtatttgag aagtttctgt gcatgtcctt tctccatttc taatggggtt atttggttta 159780
tgctggtgat taagttccct atgaattacc accttacaca cactaagata atcagcattc 159840
aaaaaagaaa aatgaataga aaaacataac cacttgtagg tatagacata ctgaatttgg 159900
aatggtcatg gcttgcatgt tggtattgaa atgggacagc aactttggaa aatggtcttc 159960
acagaaaacc tcataaatgt agctagtgtc accactcaca gaagtagatg gagaatacaa 160020
ctcaagtgtc catcgactgc cagagggatg aagacgccgc ggtgcgtctg taacccacag 160080
ggatgaagac gccgcggtgc gtctgtgcat ctgtaaccca cagggatgaa gacgccgcgg 160140
tgcgtctgta acccacaggg atgaagacgc cgcggtgcgt ctgtaaccca cagggatgaa 160200
gacgctgtgg tgctttaaaa aggagtgaag cactgacata ggctgcaact cggatgggcc 160260
ttgtaaacat tgggtgagtg aactgaggga gacacggaag tctacatcct gaattgtcct 160320
attgacatga agtatgcaga ggaggaaaat ccctagagac agatcacagg gggtgagtgg 160380
aggggaaatg gagagtgacg cttaatggag ctgaggtttt cttttctgtg atgaaaatgt 160440
tcccaaacca aatactggtg atatttgcac aacattgcaa atgtgtaaag tatcactgac 160500
ccgtacactt aatcgtggct aaaattgtaa attttatgtc atgtgtatct caacacaata 160560
gaaatgagca ccacattttg tttagtgact caacaacaat aacatttagg tttaaattct 160620
ggattcccca acagaaccag tgcttcctgc tggagctgga tccatcagcc cccagggaag 160680
ggatggagtg ggtcaggtgc acaggtcatg aagggagcac aaattctaac ccactcctca 160740
agagtccagt caccacctcc agatctatgt ccaaaaacag ctcttcgtat ggctgagtga 160800
cattagcaac aagcacacag ccatgtttgt ttttttgttt tgttttggtg tgtgtgtgtg 160860
tgtttttgat agagtcttgt gtcacccagg ctggagtgca gtggggcaat caatcttggc 160920
tcactacgag ctccacctcc tgggttcaag tgattctcca gcctcagcct ccaagtagct 160980
tggactgcag gcactcacca ccacacctgg ctaatttttg tatttttagt agagacaggg 161040
tttcactatg ttggccaggc tggtcttgaa ctcctgacct tctgatccac ccgactcggc 161100
ctccaaaagt gctgggatta caggtataag ccactgtgcc cagccacaaa caagtatttt 161160
taagcaaaag acacagtgaa gagacttcag tatgagccca cacacaaacc ttcctgtggg 161220
agtttacaga acagcagtgg gtgctgagga cagaagccag cacccaggaa ccagcaggga 161280
aacccagggg gcatttggca ccgcctgaag gctcaggacc attgtggggc tcagtggtca 161340
ggcaggctca aggttcagcc tcagagcagg tgtagcaggc ggcgaaaggc tctgaagacg 161400
gagtttagtg tcaccttctc atttccacta ctaaacaccc tccagcacat ctattctaat 161460
gtgtatgggt gttcatgtgt ttagagaata ttatttatgt tatgaatcta tagccatctt 161520
gtgggtgcat caagttaacc tcttcaacct atgtggaccc tgttcattag gaataagtcc 161580
ctgtatttga ggacctcaca aattaataat tatgtagaat cactttcttt ttcagtctcc 161640
tttccttcct ctttctttct ttctcactca cacactgaca aacacacggg gtgccataac 161700
attaattacc tgatgtatta aagaatattg attcatttgc aacttgacca gtttagctgt 161760
tgttcatgtt gttgtaagat caggaacatg tttctcagct gtgtactcct ctaagctgag 161820
cagcagcttt atttgaaata cacagaaact gaaaacaatc caaatattaa tcagcacctt 161880
cataagtaaa caaattgtgg aaaagtcgtt tattgggata gtacccacta ctacaatcag 161940
taaatgttgg atacgatcaa cagcatggtt caattcacaa gtacatatga tgagtatagt 162000
gagccaaagc acatacatat gattccgttt tataaactgt acaaagtgaa tactcattgg 162060
aaattacata acaaagatca ctaactgact tctccatagt aagagaagcg aaggtatagg 162120
agggagaaat tgtgagagac aaagagaaaa ttgagaggcg aattgatttg ttttctctgt 162180
gaatggtcat taggtcaatg tttgtcaaat ggtgaacata ttgtgtgaag attatatgtc 162240
tgtattactt cattaaagct attataaata aaagtctaat gtggtagaaa aagatgaaga 162300
gagaaataaa aataatacaa gaaaagtcat gaactcctga atgaattaac ccttagtttt 162360
tctctattac ttataaaaac accaagatac agccaaataa tatcacgata tcattataag 162420
aagagtgttt tgtaaacctc actgggaatt tatagctctt tcctagagtt aattttggga 162480
acagttggat ccaattgtga gaaatgcagg ctggacactg agactggctc ttatgagatg 162540
tgagctcttg tctatgtcac atggtccttc catacttggg ggtttacatt cacatctgta 162600
aatgaaggaa acattgactc tcaaagaaca tatttcatgt gcatgtaaaa gtatgaatgc 162660
tagtgagaat taattactta tgaagtataa tcacccacat ccactcttgg acacagccca 162720
ctctgaggca tctgttacag aactcattat atagtaggag acatgcaaat agggtcctcc 162780
ctctgctgat gaaaaccagc ccagccctga ccctgcagct ctgggagagg agccccagcc 162840
ctgagattcc caggtgtttc cattcggtga tcagcactga acacagagaa cgcaccatgg 162900
agtttggact gagctgggtt ttccttgttg ctattttaaa aggtgattca tggataaata 162960
gagatgttga gtgtgagtga acatgagtga gagaaacagt ggatatgtgt ggcagtgtct 163020
gaccagggtg tctctgtgtt tgcaggtgtc cagtgtgaag tgcagctggt ggagtctggg 163080
ggagtcgtgg tacagcctgg ggggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcacc 163140
tttgatgatt ataccatgca ctgggtccgt caagctccgg ggaagggtct ggagtgggtc 163200
tctcttatta gttgggatgg tggtagcaca tactatgcag actctgtgaa gggccgattc 163260
accatctcca gagacaacag caaaaactcc ctgtatctgc aaatgaacag tctgagaact 163320
gaggacaccg ccttgtatta ctgtgcaaaa gatacacagt gaggggaagt cagcgagagc 163380
ccagacaaaa acctcgctgc aggaagacag gaggggcctg ggctgcagag gccactcaag 163440
acacactgag catagggtta actctgggac aagttgctca ggaaggttaa gagctggttt 163500
cctttcagag tcttcacaat ttctccatct aacagtttcc ccaggaaccc tgtctagatc 163560
tgtgatctgg atctgctgaa actgcctgtg tcaccttcct cacctgtgac tattggggga 163620
gctgattgtg gacactccag tgtgtgggat ttcttggtga cagcaattgt gtcttctgtc 163680
tagccatgtc tagggctgcc catcaggaag gtcaggctgg aatttttgga aagaggcgca 163740
cctgccatcc accaggaaat tttgttgtct tttgttctgc tagaactaaa tcagacacac 163800
caaggttaac tagcactatc ttcctagctt gagaaacttg atggcaggct tgaataacac 163860
ctgtatgaag ccatcagagc aacaactaga ttaatgtctg ctagaattaa atcaggcaca 163920
ccaaggttaa ctagcactat cttcctagct cgagaaactt gatagcaggc ttgaataaca 163980
cttgtatgaa accatcagag caacacctag aatagtgtct gatttaataa ttgagactat 164040
ggtctagcca aggagacaca taaaacatga tttccatggt tggttcatat tttatattta 164100
ttaatagaat ctggctggta ttataaacag ctttgccaaa atatatgtgt tagtgttggt 164160
cttcggagaa gcaaactctg tgactggatt agcttcgtgt acagtttcct tcgtgtacag 164220
tttccctgtc cactcttctg agaggaaatg cagaggtggt ggaaggggtc tggggtagct 164280
gaatgcatat gagggaagtc ggtccctgag tgaaggagaa agggaggagg actgggtgga 164340
actttcctaa acttctttgt tgttctatga aggtccagca aggtcactga atcagagtcg 164400
tgtcacagtt cccatcaggg acccagtgac tcccagcagt ggctctgctc agatcagcgc 164460
agagcttgtt cgtctcctga gagtggagca caggacgtgg ctccaacacc agccatggca 164520
tggaagacag agagcagccc tgggtgcctg ggtcaggtgc attgtgctcc ctgcaggtgg 164580
agggagggaa gtgctgactc agggcccaga gactgtgggt tctatacaga acatacactt 164640
ttacttcatt tctgtggatg acatagaaac aaacatgcag tctgtaaaca atggtgattc 164700
ctacatttgc cccaattgct ttattcctta attctgcaga atgtcctggc acagaattgc 164760
ctttctcatg tggaattgtg tcgtgtgttg tggatgtgtg agccctactt tcattgtttt 164820
cccccatgta cagagctcct aaatagagaa cagctgaccc tccttctaca ctgttgctct 164880
cctccccaca gagagagcac ataattacct gaggctgaat ctgaggtggg atctgtcctc 164940
tgaacctcag agcctgcaga gacccccagc tgcagattca tggagtcagg tgtttgtaca 165000
tgtgggaacc ttgagctgtt cttttgtcag tgaacactcc ttaaaactaa ttgtgggttc 165060
agaattagga cacccattga tctatcacac ctcagctcat tctgccactc agaatctcca 165120
gaaattcagg aaatggttga atgtacattt ttgtgacaaa tttttctcat ttcacttagt 165180
tgtgagtttg gttagcagaa agtgctacca tttatgggtc ccaaactgat gaagctcatt 165240
tgcttcaaca gaagttagga ggctcctaaa acttctcatc agcccttctc tctgcacttc 165300
atgtgaaatt cagttttacc tggaattctg gtgtgttggt ttagccagag ttccccatcc 165360
tccatgtctg attttcctgg gtatctgatc agtttccttg cccttcacca tacctcggtg 165420
acgtctaatc accctggccc aacatcaaga attctggcag gttggtttaa gcaagatttg 165480
ctgtgcccct gatgtttcct ctcagtaatt ttccatcttc cggaccccac cctgctgctt 165540
ggctttaaat cccccatgtt tccattctgc atttggagtt cagctgaatc tctctcctca 165600
ctgcaaaaca ccattgccct gatcccgaca cctaccatga ggaccctgga taaagtcttc 165660
cttactgtgc tggaacaagt gtctttactt gatatttttt ctttaataaa tctaccttta 165720
gtgcttccta aattgctcaa ggaacctcga aaaataagat aagtgcgatt atccatttta 165780
ctgtgtgtgt atgtgtgaat ttcaatttcc atgtgtggtg tccagaagtc ctgagcacaa 165840
acagttttgc ttctctgtcc aattctttgc ttctgaaagc caggagtcat cccaacattg 165900
gtaaattggc gatttgtttt tactatttag tgactgacat atttcactta acctgaagct 165960
tcatgaacac attgatgaaa agtagataga agacttgttt ggaaatgcca gatttagggt 166020
agactttacc acccacgtgt gtctggagat ctccttagga ttccaagaac agggtggttt 166080
ttttccacca caggacaagg atgagaacct ccaagctgtg atgataaagg acaggcaggg 166140
ccatgtgtgg acaaggatgg gctgctgcca cgtccagagt gttctctcct agcaacgccg 166200
ccatctcctt cctcacactg tggtatttgt cagatgggaa acatgcctag aatttatctt 166260
tgacatatgg atggaagccc aggctagagg catttgacag cttatttctg aacctacttc 166320
tttaaggaat gcccagatcc cttgctctgc ttcctggttc ttaacccctt tagctccctt 166380
ccgctcctgc acccatgcac tgcctcttta cggccacttc cccacaccct tcactgtagc 166440
accattttct tgggctcctt ggaaatatca cagctttggt ttaactcaca gatcaggcac 166500
actcatgggc ccctccagag gttctcgatt tccctccctc aggctcctcc ctggggtcct 166560
aacttggcca tctctatcct ctcttctgag cctggccatc cacaatccat cccatctgga 166620
cttgtgtata gcactgggtt aactcagcag gtatgaattg ttcaaaccct gcacattcct 166680
aaaaaataac taaaaaaaaa aaaacttttg ttcatttatt gctgttacct actgtgatga 166740
gatctccgag tccataaaat attgcacctg ataacagtgt ctgtggatgt ctgtagcctt 166800
gggacatgcg gtacaagttt aatcagtgat ttatagtgaa tgtctacttt tgttttgctg 166860
gagagggctg tcgtctgagt attgtggtca gttccccagg tgttccatag tctatgattc 166920
attccccaaa cacagccctg gacaagagag ctcagcggca ctccccttgt tgtcaacact 166980
tcacacaagc catcttacct cacagctgaa caattacaca tgtgtagaag gctccactgt 167040
gagaggacac ctgagagctt gtgcctggat tctccagggc ttcactcctt gtgccttttg 167100
tctttactta ttttaaattg tatcattttt ctgtaataaa ctgttcctgt gaatagaaca 167160
gttatgagtc ctgtgttttt actgattttt cagcctacag gtggcagatg agaactctca 167220
acacagttgt gttagaagaa ggatttccta gagagaccct gactcaatga tgatacatgg 167280
ctgaagcatt gcatggaaaa cgtaagtgtt caggtatgga atggcaaaat ttgatacctg 167340
gggagtgaca gaatactaca gtctattaca gcagctgagc tgaaatcggt ttctggaggt 167400
aaatgggatt tagaaattat aaatccaact cccaaggagc tggctcaatc aatacataat 167460
gaaatgtgaa atgattagaa atagcctaaa tatgcaattt ccatctgtga gagctaagtg 167520
aaaatccagg agagagttgg cagggagagg gatactgcac caacctcaga ttttgaccat 167580
tttcatttag ggctgatggg ctcatgacca ctagagttag caattacact gtgataaaag 167640
ataaaagctt cacaaactct acccacccag aagggggctc aggtggtgaa atagggaggg 167700
taaggcatga aacgactgaa atatgggagg atagtgagat gggttctctc tttttgagtt 167760
ttatcttttg cttctttact aatttttgtt aatctggatt tggagaatga ctagtgtaaa 167820
agtggattct gttttgagtc ccttagaatg gaggagaatg tgtgggccaa tgttgtgccc 167880
agagactact acagaacaat agtagatgaa tgtacatgac ccaaacacaa agctttgtgg 167940
ttgctgatgg gagagctgca ctgccctggc ctactggata acagcttctc caaagtgtat 168000
ttaccctgac aatggagatt gcctttctct tttaagtgaa aaaaatggaa cactacaata 168060
aagtagtggt aatgctgtgt gtgtatgtat aagacattct ggagtgggtt tgtgataatt 168120
gggatatgta tcacttatcc ttttatttgt ataaatttat ggggtgaaag tgccgttttg 168180
ttacatggat atattgttga gggataaaat ctgggctttg agtatagcca tcatctggat 168240
ggtgtatatt gtacccatta agtaacttct catcccacat gccactccca ccctcccaac 168300
cttccaagtc tccaatattt cttattccac actctgtatc catgtgtaca tattatttag 168360
ctctcactta tatatgacat gtggtattca actttattct tctgagttct ttaacttaag 168420
atagtggcct acagtttcat ccatgctact ggaaaataca taatttcatt ccttgtctat 168480
tattgagtag taattaaatg tgtatatgta catacacatg tatagtgtgt gtatgtgtgg 168540
ggatgtgtgt gtacatatat gtatatgtat gaacatatac gactgtttcc tttatctaat 168600
catttactaa tagaaactta gtttggtacc atgtatttgc tattgtgaat agagcagcaa 168660
taaacatata aatgcaggca tctatctgat ataataattt atcttccctt gggtagatac 168720
ccagtagtgg gactgctgaa tgaaatatta gttccaatat taattatttg caaaatctcc 168780
atactgtttt ccatagagct tatagtaatt tacatttcca ctagcagtgt ataagcactc 168840
ctgcttctct gcatccttac tagcatctgt tttttgtttt gttccatttt tctttttgac 168900
tgttttaata gtagcttttc tgactggtat aagatggtat ctcactgtgt ctttaaattg 168960
catttttctg atgattaatg tcattgatta ttttttcata tgctggttga tgattttttt 169020
gtcttttgaa aaataaacat tgtagtaatt tgctcatttt taatgtggtt atttgtgggt 169080
ttttgtgttg cttttgtttc ttgtagtttg taaatattag ctctttgtca gatacagagt 169140
ttaaaaatag tttatcccat tctgtacgct ttcggttaag ttttttgatt atttgttttg 169200
ctgttcagat gctttgcttc ttatttgtat taagtccaaa tggtctattt cggtttttat 169260
tgtttacttt taaggttgta gtcatgaatt ctttgcctag gacaatctcc agaacaatat 169320
ttcctagaat agcatctgca actttcagac tctcaggtct cccagttaag tcttttatcc 169380
atattggctt aattttggat atagtgagag atacgggtcc agttttattc tgctgcaaat 169440
ggctgttcag tttttcctgc acaatttata taacaaggtg acctgttccc agtgtatgct 169500
tcttgtctag tttttcacag tcagtttggc tgcaggcatt tgactttatt tatgaaatgt 169560
ctattctgtt ccactcatct atggctttct gctagattgt tacttgattg ttacttgtgt 169620
ataataatgc tactggtttt tgtatgcttt tttcatttat tctaaaactt tactgaatta 169680
actcatcaat tctaggagta ttttgaaaga atattagttt ttttaagtac aaaatcatat 169740
tatcagcaaa cacaaagagt ttgacttcct cttttccaat ttgagtgcct ttatttcttt 169800
ctcttgccta atttctctgg ctaggatttc aagttccata ttgattaaga gtggtgaaag 169860
tgggcatcct tgacgtgttc tgagtcttag gaggaatact ttcaacatat tcctattcag 169920
tataatgttg tttcggagtt tgaaggtgat ttatggagaa tgagagatgt tgagtgcgag 169980
tggacatgag tgagagaaac agtagatatg tgtggccgtt tctgaccagg gtgtctctgt 170040
gtttgcaggc gtccagcgtg aggcgcagct ggtggagtct gggggaggct tggtacagcc 170100
tgggtgggtc cccgagactc tcatttgcag cttctagatt caccttcagt gacttctgaa 170160
tgcactggat ccgccaggct tctgggaaag ggctggagtg ggttggccgt attagaacca 170220
aacgtaacag ttacacgaca gaatgcgctg catctgtgaa aggcaggttc accatctcaa 170280
gagatgattc aaagaacaca ctgtatctgc aagtgaatac cctgaaaacc gagtacacgg 170340
ccatctatta ctgtactaga gacagtgagg gggaggttaa cgtaggccca tacacaaatc 170400
tccctgcagg ggcgcgcagg gccaactggg ggcgctcggg acccactgag gatgggacag 170460
gtcccagggg cgggtgcagg gggaggtttc ctttctcagc tgcaggaggc gggtttgttt 170520
ttgcaggaat atggagtctt atgaggtttt gatattttac tatggttatt tatcatgatt 170580
ttttaaaatt gggatttgtg ttttagtaat ttttaaattt atatgtaggg gtatttttaa 170640
aaattaagtt ttagggtaca tgtgcacaac gtgcaggttt gttacatatg tatacatgtg 170700
ccatgttggt gtgctgcacc cattaactcg tcacttaaca ttaggtatat ctcctaatgc 170760
tatccctccc ccctcccccc acctcacaac aggccccggt gtgtgttccc cttcctgtgt 170820
ccatgtgttc tcattgttca attcccacct atgagtgaga gcatgcggtg tttagttttt 170880
tgtgattgca atagtttgct gagaatgatg gtttccagct tcatccatgt ccctacaaag 170940
gacatgaact tatcattttt tatggctgca tagtattcca tggtgtatat gtgccacatt 171000
ttcttagtcc agtctatcat tgttggacat ttgggttggt tccaagtttt tgctattgtg 171060
aatagtgcca caataaacat atgtgtgcat gtgtctttat agcagcatga tttataatcc 171120
tttgggtata tacccagtaa tgggattgct gggtcaaatg gttatttcta gttcaagatc 171180
cctgtggaat cgccacactg acttccacaa tggttgaact agtttatagt cccaccaaca 171240
gtgtaaaagt gttccctatt tctccacatc ctctccagca cctgttgttt cctgaccttt 171300
taatgattgc cattctaact ggtgtgagat ggtatctcat tgtggttttg atttgcattt 171360
ctctgtaccc taaaacttaa agaataaaaa aaatccttca aaaataattc ttcctaataa 171420
tatgcactta ttctcctagg ttgtattaac atctgttgat atcttcaact acatagctat 171480
ggcgacatta atttacatct gtagacatat gtgtaaatac acaaacttat gcatacatgt 171540
ctagtctttt atatttaata taataaaatc attataaaat atgtcctaat gaatgaaact 171600
taatgattaa ctaaatataa attatagtaa tccattattc attgcaatga ttctctatag 171660
tttacataaa ttggtatcta tttgtaagct taaatatagt gtattggtca ttttaaaatg 171720
gccaagaaca aatttcaaat gtccctgtca cacaaacaca cacaataagg atttgaggat 171780
ttgagttgat atatatgtca attagctaga ttcagttatt ccatattgca ttcataaatc 171840
ataacatagc tttgcactct ataaatacat agtcaaaatt tctcaatttt caatgaaatt 171900
ttaattatac attttttaat ccgtcctagg tcatgatttt tttctccctg tcaggatatg 171960
attagattgt cctgagaaac tcattcagcc tcctgcctcc tgaaggcttc aaaggcttca 172020
ggaagtaagc tcctggatgg gcagaagcag gcaaatcttt catgtgcaca ggacctggag 172080
catctctctt tggattaagc cccctcctca ggattacagg gctcttcatt tttctcaaca 172140
ggctgttgta ccagataagc acaaaaactt aatttcatta tgctttgctt tttttaaaaa 172200
aaaaaaatga aggtaataat tttaacaata aacatattac aacctgctac acatgagacc 172260
cttcttgtgc ttcgaccttt cttctcagga gtttatatgt attacatata ttcagttttt 172320
ttctgagttg gaatgcttat tacagattat tccccttatt acagattact cttttaattt 172380
atctcttaga atgatttttc gagagcccct gcctgcccgc gcctggtgga atggagcaga 172440
gcctgggctg agccaggcgc gcaggggcct ccgcacgtgc cgcgccggta gcagacgcca 172500
agcgggcgga cagtgagcgt gagaggccgg ctcggagtgg ccgccggagc agtgccgggg 172560
atggaagaac agcccatctt caccaccgga gcacaggtct tccagattga ccccaacacc 172620
aaaaagcact ggatgcctgc gagcaacagg cggccaccgt ttcttacttc tatgatgtca 172680
caaggaacat ctatgggatc gtcagtgtgg acggagccaa ggtgaccata aacagcacaa 172740
tcacaccgaa tatgaccttc accaatgtgt cacagacgtc tgggcagtgg gccgacagca 172800
gagccaacac ggtgtttggt ttggggtttt cctctgagca gcagctgaca aagttttcag 172860
agaaattcca ggaggtggag gaagcggcca agacagccaa agacaagacc caggagaaca 172920
tggagccctc gagtaataat cccgagaatc cgggcatgga gccccatctt ctactccggc 172980
atccagtgtc aacgggacgg acgatgaaag gcctctcagg ccgctgcagc tgacacgcac 173040
ctgcagtctg ggaaccacaa gctgaaggcg gcctcgacgc aaagagctgc ccacgggaag 173100
aggtgggaga tggagctgca gacccggcgg gagagcgacg cccggctgcc cacggcgctg 173160
caggagtcgg tggccagcgt ggagcagagg aagaggccgt gagatccaca gagaggagaa 173220
gaacacgcag ctgaagagga agatagagga gctggaggcg gagctccgag aaaacgagaa 173280
agagtggaag tccccaaaag caaagtaaaa ctactcctca gctcaggtga gtgcaactgt 173340
gtctctgaga agatggaggc ggcagagaga ggatcaaacc ctggaagaca aagtgcgttc 173400
cctgaagaga gacactgagg agagcaaatc cagacagcgc cacctggggg tggaggtgaa 173460
gagtttcccg gaggtgctgg accggaagat ccacaacctg cctgacttcc gcccaggcct 173520
tgcatactgt gcaccaataa ctagggctgg ccgaggccca ggcccctcct gtgagtccca 173580
agcgtgtgtg cgagaccaga tggcgctagg acgttccctg tgtgcgttgc ttctgtaaat 173640
gcaggcgcag tttcttgtat ttccaaacca actgtgccgt ctactcaccc cttcccagaa 173700
tagaaatctc ttgtccaggc acagtgtctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggtc 173760
gaagcgcggg aggatcacga ggtcaggaga ccgagagcat cttggccaac atggtgaaac 173820
cctccctgtc tgtactaaaa aaccaaaaat tagccaggct tggtggcaag cacctgtagt 173880
cccacctact tgggaggctg gtgcagggga atcgcttgaa ccaggagaga gagtttgctg 173940
tgagccgaga tcgcaccact gtcctccagc ctgggcaaca gagcgagact ccatctccaa 174000
aaaaaaaaaa aaaaaaggaa aagaaaattt cctctcgctt ctctggcctt gtgaggttgt 174060
ggacaactgg aagattttga ctcaggaatc cagaactagg tctaccttca acatttacac 174120
agtcaggcca gggatgttta tatttttcat aagggctgtt gaaaccatat gaactgaaaa 174180
aaagcacttt ctaatccaaa tattgatatt ctttacacca ggtcatcggg ctccttttat 174240
cgaatagcat tcagggtatt tgaatgtcca tcaggcgcca ggcccagggg gcacagggag 174300
aacaacattc ctctccgtca ataacgagag gctttaaaac aactgtttag tggagactta 174360
tcgagatgcc aaacaggttt ctggtgggta cattttctgg cctggggatc acctgcatcc 174420
acgatattgc cctctgcccc ccagtttgta tggttgcgac aatgttcctt ttcttggttt 174480
taatttctga gcggatgatt gtggtgcggg aacagcacac agtgagggtg cctagcacaa 174540
tgcctggtgc aaagtaggtt ttttataaac gtttgtgcgg ctcacacctg taatcccagc 174600
aatttgggag gctgaagcag gcggatcacc tggggtcggg agttcgagac cagcctgacc 174660
aacatggaga aacctcatct ttactaaaaa tatgaaaaaa aaaatagccg ggagtggtgc 174720
atgcctttaa tctcagctac tcgggaggct gaggcaggag aatcacttga taccgggagg 174780
cagaggttgc agtgagtgga gatcgtgcca ttgcactcca gcctgggcaa caaaagtgaa 174840
attccgtctc aaaaaaattt ttttctaaag ccccactcaa aaccagggta ttattagcag 174900
tgtaatagtt gggccacagt tgaaaataca ttcaattcag ttcatgtgct ctcaaatatc 174960
ctttttcctt ttaaagttgt tctcagttgt aatattactc aaaatattag taatttatac 175020
taatgacaca ggttacaata ttgtatacat aatttagtga catttgattg gaaaaaatac 175080
atgttcccca tgtcttgagt attttttcct tctctataaa atgtatgctt ataattattt 175140
aagtttcaga tgctagcatt atctttttga tatctgggat ttaattttag taggtatact 175200
ggaatgcctt ttattaattc atataataat gttcatattt tagataggat tttaatatta 175260
attttactat ttactgaatt tcaaactttt ctactttttt tgtttttatg agataaaatt 175320
cacacataag aaaaaatgca tagatctgaa atgtgtcact agagagtttc tggcaaatgt 175380
gaataccttt gtccccagca cctaaggtag cctgaagagc aagtctctcc ccaaaacatg 175440
cgtctttttc tatgcctgtg gtcaaatcct gcatggggaa aggtttcgat ttctgacact 175500
atagatgtat tttattctgc tttgaacttt atataaatgg aatcaaacat tatagacttt 175560
ttttggtaag gggctacttt tctatttttg aggttaattc atgctagcta atgtataaaa 175620
ttagatcaac atattgtcgt ttattcaatt catagacaga ctgtgatatg aaccaccaaa 175680
attttcatgt acatggagag agagagagag aaagagagga agcagagata ttttatatct 175740
gagtcagtcc attaagtaaa taaatgacaa tattttcatt tatttttatg tcagtggact 175800
ttaaatttgt gtccagttta tgaatattat atgcagagct gttacaaata tcttagtgta 175860
agttttctga tgttctattt ttattgagaa aatatgaagt atgtatttct ttattctaag 175920
agtaagttta atttttttca gtggtattga ggcataattg aaatattttt ataatatata 175980
tgtttaaggt gcaccaattg atgttttgat attgtattag tccattctaa cactgctata 176040
aagaaatgcc tgaggctgag gtgggcggat cacgaggtca ggagatcgag accatcctgg 176100
ctaacacggt gaaaccccgt ctctactaaa aaaaccaaaa gttaactggg cgtggtggca 176160
ggtgcctgta gtcccagtac tccggaggct gaggcaggag aatggcgtga acctgggagg 176220
tggagctttc agtgagctga gattgcacca ctgcactcca ctccagcctg ggcgacagag 176280
cgaaactctg tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagct 176340
tgacactgag taatttggaa aaaaaaaaag atgtaagatg tttaattgac ttgtgagaac 176400
tcaactcatg cattgtcatg aaaacagcac caggagtcag ttctaaacca ttcatgaagg 176460
acccacgcca tgacccagtc acctccaacc aggtcacact tccacaattg aggattataa 176520
tacgacgtga gatttggggt aggacacaga tccaaagcat atcagatata cattgtaaaa 176580
tgctcatcat agtcaaggta atttgcatat ccatcttctc acagagctac cgtttaattt 176640
tttttaaatg tagagcttgt gtgtgtatgt gtgtctgata acaacaccta agacctactc 176700
ttagcaaaaa tcacttttac aatatagtat taaatacagg aacattgctg tgcattagat 176760
ctccagaaat gattcagctt gcacaactga aactctgtgc cctttgaccg atatcaccca 176820
atttccctct cctcccaggt cgtgggaccc agtactctac tcgctgctat caagaacttg 176880
gatattttag atcctacatg cagatgacat cgtgaagcat ttgtctttcg gcatctggct 176940
tattccactt agcaccatgt cctctagctc catccgtgtt gttgcaaatg tcagaatttc 177000
cttttttttt ttgaaagcca aatgaaattc agtttatata tatacatttt ctttatacag 177060
tcatcaatct atggtcatta aattctttca caaatctaca ctattataaa taatcttgca 177120
attaacatgt atttgacatc ataattttat ttcctttgac gatataacaa gaagtgggat 177180
caccaggtca tatgatagct ttatttttca atttattgac taaccaatct taccatacga 177240
tataaggata ccctcttcac cacattcttg ccaacatttg ttatcttttg tcttgctgat 177300
aataaccatt ttaagtggtg tgaggtgata tctcattggg ctttttattt gaattcccct 177360
gataattagg aatgttgagt acctttttag gatctgtttt tcatctgtgg gtcttctgaa 177420
aaaaaatcta accaggtttt tgccctctgt attaggtcag ttgatatttg ctgttgagtt 177480
gtatggttaa tttatatatt tgggtggaac ttcttgttag atatataatt gcacatagtt 177540
ttttttactg tgcttgcttt tggtattaaa ttcaaataat ttctgaatca atgacgaata 177600
tttttccatg ttgtctatga tttatggttt caggttatgt tcatttttag ttgatttttg 177660
tatatggtgt tagagaaggt ctagtttcat ttcatttttt ttttgcacat gcatgaccat 177720
tttctacacc attgattgag gagactgtcc tttcttcact gtgtgttctt ggcatacaaa 177780
attaggaaga cacataatta aaaaagaaaa catcagatga atattcctgg tgaacataga 177840
cctaaaagtt ctgagcaaaa tactagcaaa tagaatccag aagcacttta aaatgtgata 177900
catcatgatc aagtaggctt tacccctgga aggcaagttt cattcaacat ccaaaaatca 177960
gtaactgatt cactatgtaa gcaaaataaa agcgaaaaac atagattatc tcaatagatg 178020
ctgagaaagc ttttaatagc atccaacatc cactcataat aaaaaccctc aacagactag 178080
gcatcagaaa aatatacctc gaaattataa gagctatcta tgacaaacca cagtcaacat 178140
catactgaat aagcaaaagt tcaaacccct tgagaattga aaaaagacaa ggatgccgtc 178200
tcaccactcc tattgaacat agtattagaa atcctagtcc gaggaaccag gcaataacaa 178260
aaataaaagg cagctgatat ggtttggatt tgtgtcccca cccaaatagc atgtcgaatt 178320
gtaaccacca atgttggagg tggcgtctgg tgaaggatga ttagatcatg gggatgtgtt 178380
ttcctctctc atgctgttct cctgacagag ctctcaggag atctggtttc aaagtgtgtg 178440
gtacctctcc cttatctctt cctcctgctg cagccatgta agacatgatg tttcccattc 178500
tgtcatgatt gtcaggttcc ccaggcctcc ccagccatgc ttcctgtaca gcctgcagaa 178560
ccatgaatta aattaaatta aagaattaaa tatctttata aattactcac tcctgtgtgt 178620
ttctttgtag tgtgagaatg gactaatgca gcatccaaat gggaaaagaa tgcaatgtat 178680
ctgtccaaac tgatgataaa attctatacc tataaaattc taaagactct gacaaaataa 178740
ttcaagagag ataaacaact ttggtaaagt ctcaggatac aaaaatcaat gtacaaaagt 178800
ctccagcatt tctatatccc aaccacatcc aagctgagag tgaaatcaag aacacaatcc 178860
tgtcccactt acaatgctca caaaaaatga agtgcctgaa aatacaggta aaaaacaagg 178920
tgaaagaact gtataaggag aactaccaaa cacagcagaa agaaatcaca aatgacagaa 178980
ataaatgtga aaacatttca tactcatgga ttggaagaat tgatattgta aaaattgtca 179040
tactgcccaa agcaatttac agattcaatg ctatttacat aaaactctca ccagcattct 179100
tcagataaat agaaaaaaaa ttctaaaatt tatatggaat aaaaaaaaga ccctgaatag 179160
ccacagcaat cctaagcaaa aagaacaatg ccagaggcat catggtactg aatttaaact 179220
acaccataaa gtcatggtaa caaaaacagc ttggtactgg taaaagggca gacatgcaga 179280
aaaagtggaa caaaagagaa agcagaaata aagctgcatg cttgcaacca tctgatattt 179340
gataaggctg acaaaacaag caatggggaa aaaactctat tcaataaatg gattctggca 179400
gatatgcaga atgcaagagt gaaggaggtt gggcagcttc tacctagatt tcagaagatg 179460
tgcatggaga accctatatg ccaaggaaga agcctgctgc aggagtggag ccaccacaga 179520
cagtgtctat taggacaata ccaaagatgg ggaaagatgg ggtcggaacc cccattcaga 179580
gtccccacta gggcacttca tagtaaagct gtgggaatgt ggccacaacc ctcaagatcc 179640
cagaatggta gagtcaaagg cagcttgtcc tctcagcctg gaaaaccttc tggcacttga 179700
ctctaacctg tgaaagcagc accatgggct gtgcccagct acagggatga tattcctgag 179760
gtttttggga ccccctttgt cctagtgtgc cctggtggaa gtacataaag tcaagagaga 179820
ctattttgta gctttaagat ttaatatctg ccttactagg ctttaggtgt gtctagagca 179880
tgttggcagt tcctttggcc aatttattcc ttttgtattg acaatattta cccaattcct 179940
gtggcactat tgcaccttgg aagtaaacaa ctgtttaaaa cttttttttt ttttttttga 180000
gacggagtct tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg cgcgatctcg gctcaccgca 180060
acccctgtct cctggcttca ctgcctcagc ctcccgagta gctgggatta caggcgctca 180120
tcaccacgcc cgactaattt ttgtattttt agtagagaca gggtttcact gtattagcca 180180
ggatggtctt gatctcctga cttcgtgatc cacccgcctc ggcctcccaa agtgctggga 180240
ttacaggcgt gagctgccac gcccagcctg tttaaaacat tttgcaagct catagctgca 180300
gagaaattgc cttaagactc agaggagact ttggtatttt cagtcggagg ttgaccaagt 180360
gaagagtttg gtcactatta aaaaaactat taaaaaaaag atgactttgc aatctaagaa 180420
ggacatgaga tcaggacaca agagtaaaat ggtatagttt agatgatggt ccctgctaaa 180480
tctcaaggtg aaatgtgatt cacagcattt gcggtggggc cgactgggag gttttgagac 180540
atggggaaag atccttcagg aatggcttgg tatccacccc atggtaatta gtgaattatt 180600
tctgtattat ctactgtgag atctgatttt caaaataatc tagcaaccat cctccccttt 180660
catgtcctcc ctctcaccat gtaacacagc ctgtttcccc tttgccttcc accatgactg 180720
taagctttct gaggccatca catgatgcag atgctgatgc catgcttctc acttagcctg 180780
cagaactatc agccaaataa gccaaataga ctagtacact gtccaaagca atatacagat 180840
tcaatgcaat ttctattaag taaccaatat aattgattac atattttaaa aaaccataaa 180900
atttatatgg aatcaaaaaa gagcttgaac atcaaaagca accctaagga aaagtaacaa 180960
agctggaagc accacattgc cggacttcaa attatactac acagatataa taagaatgac 181020
atcatcgtag tgacaaaaaa taaaaattga tgtaacacaa cagacagccc agaaataaag 181080
ccaaatatct acgaccacct gttatttgac aaaactgaca aaaaatatac actggagaaa 181140
caacccttta ttcaataagt ggtgcttgga aaattgggca gccacacaaa gaagaataaa 181200
accagacttc tatctcacaa tagacaaaaa ttaagtgaat atggattcaa cacttaaaaa 181260
tataaactga atctacaaaa atacttgaag aaaatgcaaa aaaaaagttc tctggacatt 181320
ggcctaggca aataaaacat gactaagatt tcaaaagcaa atgcaatgaa aacacagaca 181380
aacaggactt aagtaaaaat cttctgcaca gaaaaagaaa taatcaacat ggtgagtaaa 181440
caacctgcag gatggtagaa ggtatcatct cacctcagtt aacatggctc atattaaaca 181500
cacacacaca cacacacaca cacacacaaa caaaacacta accaatgctc gtaaggatac 181560
agagaaaaga aaactcttat gcattgttga ggagaatgta aactagtaca gtcactatgg 181620
agagcagtgt ggaggtacct caaaaaacta caaatagaac taccgtatga tccagcaatt 181680
ccactactgc aaatttatcc aaaggaatga aaatcattgt atcagagaat tctgcacccc 181740
agtgtatgtg gcaggacctt tcacaatagc caagatatgg aatcaacaca ggtgttgaac 181800
acaagagaat aatggttaaa gatgatgtgg tgcatataca tgacgaagta ctcatcagcc 181860
ataagaaatg aaatcatgtt atttgtggca atgaggatgg aactggagga cattatgtta 181920
aatgaactaa gccagggaca gaaagtaata caccttgttt tctcactcat aggtggatac 181980
ttaaaaaaaa atggtctcct agaagtaaag aatagaacag aggataccag acgctgggaa 182040
gggtagggta aaggacgaga taggcagaga tttgttaaat aatacaaaat tagagctagg 182100
gaggaggaat agattataat gatctttacc actgtaggat gatacggtta acaataatat 182160
gtagttttaa atagttagaa gaaggatact gagtgttcct aacaaaaaga aatggtttga 182220
gatgatggat gtgctaatta ccctaatctg acccctatgc attatatgta tcaaaacatc 182280
actatgtacc tcatgaatag ttacaattat tgtctattaa aattatattt taaaataaca 182340
caaaattcat tggcagtgac ataaatggag gctctgggat aggtgtgggg ataaagggag 182400
gctctgggat acattacagg cctaacatgt cagtgggcag aggagcttcc attagctttt 182460
tctatttgta gcactgagta gatgtgacat ttctcaaagt ttgccctaca atagagacct 182520
gagttccagg gaggtcttgc aggcagctgt gcagatggaa gaagcaggag tagagggttg 182580
ctggcccatt caacaatagt aggatgatta ttgtgcatgt agagaagtca acattgtttt 182640
aagtagttgc atcactggat gacatgaaaa acaaatccag tggaaatcct taaatattat 182700
tggtagtgaa actgttttgg gtgaggaaat gttcactgaa gttaagtgag ccagtaaagc 182760
tgttaagaac tataaaaaca ttggattgga ttcagctttg tctgaattta atgtgattat 182820
tactggctca ggcaggggtc acaaatcaag atggataggt ggtaccaacc agaaaaagcc 182880
atggaccaga aagattcaca gctgaattta ttcggatgta taaagaagag ttgctaccaa 182940
tcctagtgaa actattcccc aaaaattagg ataagggact cctccctaaa ttattctgtg 183000
agaccagcat tattctgata acaaaacctg gcagagacta aaaaaaaaga taactttggg 183060
ccaatattca tgatgcaaaa atgctcaatg aaatactagc aaactgacca cagcagcaca 183120
tcaaaaagct aatccaccat gatcaagtag actttgttcc taggatgcaa ggttggttca 183180
tatacgcaaa tcagtaagtg tgattcgtct cataaacaga actaaaaaca aaaccatgct 183240
atcaatggac atagaaaagg tattcaatga aatttaacat tgtttcatat ccaaaaccct 183300
caactaggca tgaagaaaca tacctcaaaa taataaccat ctatcatgaa cccacagcca 183360
aaatcatact gaatgggcaa aagctggaag cagttttccc tgaaaactgg aacaagaaaa 183420
gcattcccac tctaaccact cctgttcatc atagtcatgg aggtcccagc cagagcgtgc 183480
aggcaagaga aagaaaagca tcagaaccgg aagagaggat gtcaaaccat ctctgtagat 183540
gaaatgatca taatcccgag tctgtagttt ggtgattgac attaatttgg aaaaattgtc 183600
agtcatcatt gctttaaata tttcttctta acctttctct gttccttctc tttcccatgt 183660
aataccctaa taattgtctc acaattcttg gataagctgt tctggtttct tatgggtgtg 183720
tatttgtgta cttgtatgtt tgtgtgtgta tttgtgtgtt tactttttaa aaaaaatatt 183780
tctccatttt cagtttggga cattgctact gagatatttt taatttcaga tttttttcct 183840
cagccatgct gcgtctacat ataagtccat tgaaagcatt gcttaattct gttacaatat 183900
tcttgatatc tacatttttt tgctttttaa gagtttgcat atttcgactt gcataacaca 183960
actgttcctg gatgccctct gcttaactca tcacagccct tagcatatga gttatagcgg 184020
ggtcttaaat tccttgtttg gtaattccaa cttacatgac gtagctgagt ctcattctaa 184080
tgcttgttct gtctcattac actgtgatat ttttctttta gtatgtctcg tgattttttt 184140
agccagaaat tatgtaccag gtaaaagaaa ctgctgtaaa gaggccttta gcgatgtcat 184200
tgtaagatgt ggagagaaat gtgttccata atcctacggc catggcttac tctagcaagc 184260
ttaggccttt gaaaataaac ccttacatga aagtgaaaac ataagtctta gatttggaga 184320
atttgcttgc aaatcaaata tttggaaaat gacttttatc acaaatgtac aaattacctt 184380
acaattgaac aacaacaaaa ccacacaaat taattttaaa atgggcaaag atctgaatag 184440
aaatcgcatc taaaaataaa tataaagaga tcaacttcat tttcattagg tatatgcatg 184500
tttaatattc aaaaaatact actatcttat gaggatgggt aaaatacaca atatagataa 184560
taccaaatgg tgatgaggaa gttgaaaaac aggaacattc actctttgct ggtggtaatg 184620
ctgaaatggc acatagacat gtacagttaa taatttagtg tatattacaa aacagctaga 184680
agagaagatt tagaattgtt aacacaaaga aataatcaat gatggagatg aaagatatac 184740
cagttatcca gatttaatca ctgcatataa taatctttta tcaaaatata taccccataa 184800
agattttgaa ctcatgtatc tatataaatt aggtattaaa aaacagcaat gcaggggaat 184860
ccagctaatt gcacattccc tgaatgtacc ctttcttgtc aaaaaggagt tccagagact 184920
cttgaaaacg tagtgcagtt catgtgagaa atagaggttc agaaatgcct cattataccc 184980
tcctcccttt ggaattcaag cacaactaac cagtattttt cattaaaaca gatcttaaga 185040
ctcagaaaac agattctttg cagcagtaag ataccaaatt ctaacctgac tcaagaatag 185100
gatcacatga cagagagcag accttgaaaa gaatcaaaga cttttaccct aaaatatatt 185160
tatttgacat attttaaaat caccctgcac agttatcttt tgagagagaa atttacgttc 185220
tgtagcgaat ctccttccct ttccaggtct agttgttaga ttagctgaga gtctagcatc 185280
ttttaaatgt catagtagaa aacatttgct atctactgcc tctaacggtg gccacataag 185340
agaattcatc tacataataa gaatcttgtt ctccaaaacc cgttatccta acctatgtag 185400
ggaaaagaga gatcagactg ttactctatg tagaaaagga agacgtaaga aactccattt 185460
tgatctgtac cctgaagaat tgttttgcct tgagatgctg ttaatctgta acttttgccc 185520
caaccttgtg ctcacagaaa catatgttgt atggaatcaa agtttaaggg atctagggct 185580
gtgcaggatg tgccttgtta acaatatgtt tacaggcagt atgcttggta aaagtcatca 185640
ccattctcca ttcttgatta accaagggta acaatgcagt gcagaaagcc acagggacct 185700
ctgcccaggg aagccgggta ttgtccaaca tttctcccca ctgagacagc ctaagatatg 185760
gcctcgtggg atggaaaaga cctgaccgtc ccccagcctg acaaccgtga agggtctatg 185820
ctgaggagga ttagtaaaag aggaaggcct ctgtctcctg catgtccctg ggaatggaat 185880
gtctcggtat aaaacccaat tgtacatttg ttctattctg agataggaga aaaccaccct 185940
gtggctggag gtgagacatg ttggcagcaa tgctcctctg ttactcttta ctacactgag 186000
atgttagggt ggagagaagc ataaatctgg cctatgtgca catccagcga tagtaccttc 186060
ccttgaactt atttgtgaca cagattcctt tgctcacacg ttttcttgct gcccttctcc 186120
ccactatcac cctgttctgc cacattcccc ttgctgagat agtgaaaata ataatcaata 186180
aatactgagg gaactcagag accggtgccg gtgtgggtcc tccgtatgct gagcaacggt 186240
cccctgtgcc tactgttctt tctctatact tggtctctgt gtcttatttc ttttctcagt 186300
ctctcatccc acctgacgag aaatacccac agttgtggag ggggtgggcc ccttcaaaca 186360
cagaaacgtt tttctactga tttcagctct ttaaataaaa agttaagtct ttcaatcaga 186420
aaatctttga attcacctgt aagctgtaat cccctcccca cactgcctca cttgtagctc 186480
ttttatcttt atgaaacaaa tcgacacatg tctcatatgt attgactgat gtctttctct 186540
ctaagacatt aaatttaagc tgcaatcaag ccactttggg cacacgttct caagatcttc 186600
tggggctgtg tcacagggca tggtcctcac atttggctcg aataaatcta aatattttgc 186660
aaagttgact ttttcattaa tagttcttac agaacctact ctgtgctctt tgttacaagc 186720
ataaaatcaa tatagtatta gttataatag tattgggtat accacatatt ggcaatttct 186780
tatgaagtta ggcatagact aacaatggga tcaagtgtaa atgttttaat gtatttatgc 186840
aagttatttt gatatttatg ttctgcagat acttctatca gatttattat atcagctaat 186900
tatttgtttt atgattgggt gcatttttta tagatgataa caccatatct tttctaggcc 186960
tttattggag aaaattgtgt gaaactactc aggactacat gtgaaagtcc ttattggagt 187020
ggctgacaga attgaagtac atttcctctg tagccaccag acacccagat tcctccagta 187080
acaccttaat tttgtttcct gcttggcttt ggtcttcagt cttgtgctat ccagagagac 187140
tctgtcttac aaatccccca ggtcattcta aagccacatg gaccggacaa ttgtcaatgt 187200
ggtgggaagg gtcgcactga acggtcactc tctgtccttc tgagggagcc atactgcagg 187260
cagacatggc agtcctggct caggttgtgt ccttccaagt atccctgccc tcctgcaggt 187320
gtgatgctga tccatgcatc ttcctcccat tcctgggtag agggtctcct tgttttttcc 187380
cagatcttct tccagcagcc actatgtctt cccactgatg tcttcagctt cctcttttct 187440
gcccttccca gcaggatgag gcttttattc ctgaagaaag agagaggagg tgggagatga 187500
ggctgttatt cctgagagaa tgaacagggc tttggagctt ttctttcttc tatcccagtt 187560
tctatgagtt cctccagtac cagtaacaca aaggtgttac tggctttgcc cctgcatgtt 187620
aattctctag caatgtagtg gtgacagtgg aggtgggtct ggatgcattt cagctgcagt 187680
tgctgttttt ctttccagca cagaaccaac ttgggagcta cagggcaaga gctttttgta 187740
atgtgtcctc aatcctggga gaaaagtttt caatagcaat aggaatctct cagttgtatg 187800
ttctctgaga atttaaacaa taacttattt attatactca attttaaaca atgtaataaa 187860
tatgtctaat ttaatcttgc attagcttat gtgacatttg ctggccattg ccccagataa 187920
ggccattttc tcttcctgtt tatccctgca agtgactgac ttttgcaaga tgtaaggttt 187980
cttgtttgcc ctataacatc aataatctga aatattaaag aaaatgtgct aatttgcaga 188040
tcagtaaggt tagttgtttc tgtaaaaata tatatgtttt tttgagatgg agtcttgctc 188100
tgtcaccatg ctggagtgca gtcgtgtgaa cttggctcac tgcaacctcc gcccccttgg 188160
ttcaagcgat tctcctgcat cagcctccat agtagctggg actacaggag tcttggcctc 188220
caaaagtgct gggatttctg gcataagcca tcacacccag ccaaaaataa tatattttaa 188280
ggggtgcata catctccagg ctgagtagga gctttatttg tagtactcag taactggaat 188340
taacacaact attaaggagc attataaata aatagtaagg gtgcactcat taactggaat 188400
actgttcctc attagaatca acacatcctt tagttcatgt cctttgcagg gacatggatg 188460
aagctggaaa ccatcatagt cagaaaacta tcacagggac aggaaaccaa acaccgcatg 188520
ttctcactca taagtgggat cttaacagtg agaacacatg gacacaggga ggggaatgtc 188580
acacaccagg gcctgtcggg gtggggagca aggggaggga cagcattagg agaaatacct 188640
aatgtagatg acaggttgat gagtgcagca aaccagcatg gcacatgtat atctatgtaa 188700
caaacctgca tgttctccac atgcatctca gaacttaaag tataatttta aaaacacatt 188760
atttatatag aaccaaatta ctggctcaca agtaattata ctgtgcaaaa aaccacacaa 188820
atgaaattga gactataaga tttcacttga acaaaatctt gaaaaataga tctaaagtaa 188880
caaagatgac tgactcaata tggtgagagg aaaatgactg ggaggcagga atgagaggaa 188940
cacagggaaa cttttaagtg taattcattg gtatcttgat tgttatttgg gatgcacagg 189000
tgagcacatg tgtaattaca tttttttcct ttggagacat tttcttgctt tgtcatccag 189060
gctggagctc cgtggtgaca tcatagctct ctgcagcctc agaccctggg tctccagcaa 189120
tcctcctccc tctgccctat ctagctggga ctacagctgt gcaccaccat gctcggcttc 189180
agtgtgtatt caaccagaca ctttaattat gcagtattta ttacgtggca ataatgcctc 189240
aataagggta ttgcaaataa gtggatggat aatttgttca attaagattg atggaaatat 189300
agacacttac atgacaaatg tatgacaatc aagaaaataa aactgtagga aacatacttt 189360
actttttgtt aggtaatcgc aacagtgcat acacatcaca ccatgttctc attacagaga 189420
aaaggttctg caaacctcac ttggtgtgac ctcctgtatg ctgggcttgg ctcagggaga 189480
agtcaggacc agtggtgaga agcacaggcc cagataacca gactcactct gaccaaatgt 189540
gagtgctggg gacattgtac aatccatctg tgttttgctg atattttttc atctgtaacg 189600
tggaaataac attgatacta cataccatgg tttctgtgca tatggaaaaa taaaagatga 189660
ttggtgcaaa ctttaaatac acacagttta tgtagatcaa ttgtacctca ataaaactgt 189720
tttaaaataa aaattacaaa actataagtt ttataggttt taagggttta tcatagaaca 189780
aacttacaat aagaaacaag aatttccaaa tgctatcaat atcacaaatc tcccccagga 189840
cgctctgaca tgctctgagc cccactctct cctcaggcgt cccatcccag agcttggcat 189900
gtagtaggag acatgcaaat agagccctcc ctctgcttat gaaaaccagc ccagccctga 189960
ccctgcagct gtgggagagg agccccagcc ctgggatttt caggtgcttt cattttgtga 190020
tcaggactga acacagagga ttcaccatgg agtcatggct gagctgggtt tttcttgccg 190080
ctattttaaa aggtaattca ttgagaacta ttgaaattga gtgtgagtgg ataagagtga 190140
gataaacagt ggatacgtgt ggcagtttct gaccagggtt tctttgtgtt tgcaggtgtc 190200
cagtgtgagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tccagcctgg ggggtccctg 190260
agactctcct gtgcagcctc aggattctcc tttagtagct atggcatgag ctgggtccgc 190320
caggctccag ggaaggggct ggagtgagtg gcacatatct ggaatgatgg aagtcagaaa 190380
tactatgcag actctgtgaa gggccgattc acaatctccg agacaattct aagagcatgc 190440
tctatctgca aatggacagt ctgaaagcta aggacacggc catgtattac tgtaccagac 190500
acagtgagag gaagtccgtg tgagcccaga cacaaacctc cctgcagggg cacgcggggc 190560
caccagaggg tgcccaggat cccctgaaga cagggacagc ccaaaggcag gtgcagatgg 190620
atgtcaagag ggtctgtggc ttcgtctaca tctaactgtt tcctggtgag cctctgtata 190680
tttatttttc tgtgcccact aatgaggttg gtaagtttaa acactttttt ttttgagatg 190740
aagtctcgtg cttgtgcccc aggctggagt gcaatggcat gatctcagct cactgcaaca 190800
tccgcctcat gaattcaagc gattttcctg cctcagcctc ccaagtagct gggattccag 190860
acaactgcca ccacgcccgg ctaatttttg tatttttagt agagacaggc tttcaccatg 190920
ttggccaggc tagtctcgaa ctcctgacct caggagaccc tcccaccttg ggctcccaaa 190980
gtgctgggat tacaggcatg agccactgtg cctagccaaa aaagacttca ttattatagg 191040
aggaaaaatt ctcatctgca agtgtcactg atggaagcag aaaaaatgcc caggaagtca 191100
ggtgaggctg tagacactgt caacccagga tgcaaatctc accacaagtg caggagaaag 191160
ggcagggggt tgatggatca tcctaactaa cgtatggttt aagctgagcc cagcaagacc 191220
ctcagtgcct ccctaaccac agttgccctt cagggataac ccatgtgctc aacagcagcc 191280
acaccttagt atctccactg tgcagtcatt gtctaggaca agctcccagg atgtggggct 191340
ttggcacaaa ccaggtcatg gatgtcagag aggggcagct gggtgtctgg tccataggct 191400
ccctgatgtt ggagggttga gaggtgcatt ctctgggcca acatatactc tagggatatt 191460
tacttcagaa cacataattt tatttgttgg tttatggtta atggggtatt catcccttca 191520
atcatttgtc ctttgattta caaaaacatt ccaatttcac tttggaagta attttattat 191580
gtgcaattaa gtcattattg attatagtca cactattttg ctactaaata gtaggtgtta 191640
ttcattcttt ctaactctgt attttgtacc cattaaccat atccacctgt tctctggccc 191700
ccactagcct cccagactcc agttaccatc cttctaccat ccgtgttcct gagtttaatt 191760
ctgttgattt ttagagcaca cacataagta agaacctgca atgctttttt tttcagtgcc 191820
tggtcttttt cacttaacat agtgacctcc agttccatcc atgttgttgc aaatgactgg 191880
atctcatgga atacctaatt ttattcggtt ctttcatatg acatagagaa gcaagcatgc 191940
agtctacaaa caactgtaat tttcacattt accccaaatg aattattact tatttctgtg 192000
cagggtccag gcacatagta gcctttctct tgagggactg ttaaatttag agtgagatca 192060
cttgtttctc atattatatg attcctgtcc atgtgcagag atcttaagta atctgcttct 192120
ttctgcacac taactctgac cttctcgaca aaaagagtag agattttcat gtttcctgag 192180
tctggggtag gagttagtcc tacacaactc agagcctgca gagacctccc agtgcagttt 192240
tatagacaca ggtgctttct catggggggt gagacctcca cttcctgtga ttgctgctca 192300
gatctaactg tgatttcaga tttaggacac cattaggctc tcaaaccatt tctattctaa 192360
aaatcagcct catcatagaa aatggaaata attcaatatc catttccctg accgtatttc 192420
atccttgttt ttaatttggt gcaagtttat tacatatttg cctgaatcta acttcagaat 192480
caactgaatt ggtctagaaa tctcaaaaat tgaacagaag tgggttttat tatttttacc 192540
aaaatgtgtg taggtagggt ttccaatgta tcatccagaa cttgtgcatg ctaacaactg 192600
tttttctcag tcaattatca gcctggtgaa gcccttgcaa accccctcac tcacctgtgc 192660
tgcctctgga ttctctgtca caatcagtgc ttcctgtagg cactggatgg aaagcacagg 192720
agtgggtcag gtgcatacgt gatgagtgga ggatgaattc cagcccactt atcatgaatt 192780
cagacaagcc cacatgttcc cacatgcact atatcttcag acaagcagat gtgtctgcac 192840
atgaattctt ctttcagaca aacacgtctg tcccctcatg gactcttgcc acacacaagc 192900
acacgtggct tcttgtggac tgtactttca gacaagcaca cattgtttca tgtggacatc 192960
ttcctcccac aaatgcattt tcccctgagt agactcttct cccacaagcc catatgtcct 193020
cacatggaca tttctcacag gcaaacaccc atttccccat gtagtccctt ccctcagaca 193080
agcacacgta ttcccaggta gactcttccc ttagacaagc acagctgttc ccatatgaac 193140
ccttccatat gacaagcaca catgttccca tgtgaactcc cgtataacaa gcacacatat 193200
ttcctcacgg gctcatcact cagataggtc tgcatgtcca catgtggact ctactctcag 193260
acaagcccac aggtcctcac atggactctt ctctcaaaca cccgttctcc attgtagact 193320
cttcccttag acaagcacgc attttcccat gtgaactctt ctgcatggga agcacacata 193380
ttcccacagg gactcttctc tgaaacaccc attctccatt gtagactctt cccttagaca 193440
agcacgcatt ttcccatgtg aactcttccg catggaaagc acacatattc ccacagggat 193500
tcttcactaa gacaagcatg attgtctcca ctgtgaccct tccctcagag aagtacactt 193560
gtctacatat ggactcttct ctcagacaag caaacatgtc cccacgtgga ctctttcttc 193620
tgacaagcac acgtgtcccc atgttgttat aatcattttc tcacctctgt ctcacaaagt 193680
tgccctgtcc tccaagaata attttgacct ctcacttctc attcacacta tggtgattgg 193740
tgcgcagcat tttcacccaa gagaaatgca ggcagctctc agaatttatt gtgatggagg 193800
caggaagaca aacacaaaga taaaacttgt cgctaccttg ctgggctgtg ttctgtgcag 193860
agtctctgaa ggctgccctg gggctgtgtc ctaagctgta tctctctgat tccactagga 193920
gaatgcacat agagaaattc aagctgaatg gtgtcctgat ccctgcctca ttctgctatt 193980
cttccctatt cctcagaaat tcacccaaca ttgccctctg tcttgtattg tctacattct 194040
cacagactct ctcatagaac ttcagcttca atggtcagag ccctggtcac ttcttcccaa 194100
ctctccgcac atgccaagtg cacattagag actcaataat gaggctcacc aggggcagta 194160
gtagtttcat ctatcacagt ggagatgaaa atccatgatt taaaataggt ttctaaaaaa 194220
gaaaatatgt ctcacatcaa acacaaatga gagaatgcaa cggcataatt cattttcagg 194280
tttttcatat gtaaatctcc taaagtacat aatttagttt ttagtgtggt tcctgatcca 194340
tgaatccttt tgccttcttc attatctttc attcaaacaa acagagacca tacccactgt 194400
tcacagtgta gcctcatgga gaacatcttc accagtcagc ccagtcagtg agtgaggcct 194460
ttaaatcctt catgctaatt caaatttctg gctttattct tagtagaccc caggttttcg 194520
gggatgttgg gttgtgccag cactcctaaa taagggagat agaaattatt tcctcaggca 194580
tcctcttgca acatttggac aattgcccat agtttgatta ttgaggtgtg atgcatcaaa 194640
ataatgttag ttcaatcttc tctcaaccag tcattgaaca ttgaaatttt gtaattattt 194700
atttggatat ctctgaagtt tacctcttga atatttaggt catattataa atagtttaag 194760
ctgcctacta ggtaaaatga tctgctgcag aattttgact tccttgctgt gcatttttgc 194820
atttaaattg aagtttctat tactcgtgtg tctagaatgt aaaaatacgt cttacatttt 194880
ctcgaatttt tcatttcact ggagtttcca gaagatgaga aaacctccct tgtgtataaa 194940
atacctggta acacattgct caatagtttc gttgctgaga ccagctcagt cgggagaccc 195000
taacccagcg gtgctagagg aattaaagac acacacagaa atatagaggt gtgaagtggg 195060
aaatcagggg tctcacagcc ttcagagctg agagccctga agaaagattt acccacgtat 195120
ttattaacag caagccagcc attaatattg tttctataga tattaaatta actaaaagta 195180
tcccttatgg gaaatgaagg gatggaccga attaaagggg gtgggtctgg ctagttatct 195240
gcagcaggaa catgccctaa ggcacagatc actcatgcta ttgtttgtgg tttaagaacg 195300
cctttaagcg gttttctgcc ctgggggggc caggtgttcc ttgccctcat tccggtaaac 195360
ccacaacctt ccagcgtggg cattatggcc atcatgaaca tgtcacagtg ctgcagatat 195420
tttgtttgtg gccagttttg gggccagttt atggccagat tttggggggc ctgttcccaa 195480
catttcctct ttaatttttt tctcctctca tattgtactg ttataagcaa tgagatatca 195540
ggacacatca tcaacacttt gctaagaaat atcttcagct aaattcccag agtatcatat 195600
actaatccta attttaacta aggtaacata attaagatac attctataac aagtcacaca 195660
tattatccag tatccagtaa catgtttgtg acagaaacaa agcaggtgct tcctctgcaa 195720
agggtcatct gaggtctgag ttgagggtca cacaggtatt tttctggttt acaagggtgg 195780
gaacgacaac agtaataacg actctgaaca gcactggccc ttccttgaaa ggttgcaggt 195840
aaagctactg ctgctatatc aaattaacac cttactagaa taaagcccag agggagggtc 195900
cacatgctag gtcacagagt gaggagaaat ggagctgtgc tctgctctcc acactaccta 195960
caagatccca gacacacgcc caggttccac tgatgcaagg catctacagt gcagttctaa 196020
ggcacctgct tcctggggca gggagcatcc tcctgtcaat tgcgcacctg ctccttctgc 196080
aagctattaa gtgagcactt ctattgccat gaattataca tgttctctct cttaacatgt 196140
atattgaaca tgcttactta cattgcattt tatttttctc tgaaatacac tggatgagca 196200
gaagaaaata aatcacaccc ctgatgcttt ccacacatac aaagattcct gaaggcagag 196260
ctgactgata tcctcaccag tagaccactg cctttcagag atgatcttgg tattcaagtt 196320
ccagcaattc ttgaagttaa agggcacctc tatctcctct ccactgcttt gcacctcacc 196380
tgatatcagc tttctcatta gaatgccttg tgtttaagga atgagagttc ctgtcacagg 196440
tgcaaaggcc caggttctcc cactggctcc agtccagggc tagggacacc tgtaagacca 196500
tgatatcatc tgatacataa cctttacatc ataagcttta cataaccttt acatacataa 196560
catcacacat agcattcatg atacacacat cagatcacct ttacatgctc taacatgtaa 196620
agattaggaa agtcatcaag ctcattctta tgtcaaaaaa catctgcaca atttgaacat 196680
caacaatttt tgaaatctat caaggaattg aaattgcaag ggaaattacc cattccaaat 196740
actgaagata cagacatgtc caggatcaga gttgacactg gctgaactgg aaaagaactt 196800
gaagaaagca cgagttggtg agagcacaca catggtaaat gctatgaaag cctaaacggc 196860
agatgtggac tagggtgaga ttcctgggga cctacactcc atagtcttct gaactttcct 196920
tcaaaatctt ccagattctc aggtatacaa tccaaataat ttttttatgg gtctgaattg 196980
gggaggatta attactgaga aatgtaccaa gagccttcta aaaaaaaaaa atcctatagg 197040
aaatgagatt ttccagaacc tggaggaacc tacagttccc taaagacaga cactgaggag 197100
aataaatctc gacagcgccg cctggaggtg gaggtgaaga gcttcctgga ggagctggac 197160
cggaagatcc acgacctgaa tgactcccgc ccaggcctcc caagctgggc accgacaact 197220
agggctggtg gaggcccggg atccccaccg tgagtcccaa gcatgtgtgc gagaccagat 197280
ggcgctagga cgttccctgt gtgcgttgct tctgtaaatg cagacgcagt ttgtcgtgtt 197340
tccaaaccag ttgtgctgtc cactcgctcc tttccagagt agaaatctcc tctccgccgg 197400
gcgcggtggc tcacgcctgt aatcccagca ttttgggagg tcgaggcggg cggatcacga 197460
gatcaggaga tcgagaccat cctggctaac acggtgaaac cctgtctcta ctaaaaatac 197520
aaaaaattag ccaggcgtgg tggcaggtgc ctacagtccc agctactccg aggctatggc 197580
agtagaatcg cttgaacccg ggaggcggag gttgcagtga gccgagatca ttccactgca 197640
ctccagcctg ggcgacagaa caagattctg tctcattaaa aaaaaaaaaa aataggcttc 197700
aggaagtagc tcctagatgg gcagaatcgg tttaaccctc tgtgtccaca ggatctggag 197760
cctctctctc cttagattag gccacctcct caggattaca gggctcttca gttttctcaa 197820
catgctgttg ttgccccaaa taaacacaaa agcactttat tttcttatgc ttacctttaa 197880
tttttcaaaa caacataaag gtgataattt taacaataaa catattacaa cctactatac 197940
atgataccct tcctgtagtt cgaggtttat tctcaggaat ttatatgtat tacttatttt 198000
caattgcttt ctgatatggg atgtcaatgc cactttacta cagtctttat tcttttaagt 198060
tatctctaaa atctctaaaa attaatcttt ccaaagcacc actcaaaacc agtgtattat 198120
tagaacttgt gggtgtaatc gttggaccaa tattaagaat aaattcttaa tggactaact 198180
cagatataaa atttctgtcc ttcctctctc tctacatata tacataacga ctttgaggtt 198240
tcagttgaat cagtccattc attgaatgta tgacaatagg ttgatctaat tgtatacgtt 198300
aaatagcatg aagaaacctc aacaatagca aaagtagccc cttaccaaaa acagctctat 198360
tatgttagat tccacttatg agaagttcaa aagagaaaaa catggatctg tattgtcaga 198420
aatctaaaca tttccccaca caggagctga ccacaggcac aggaagacct gtgttggggg 198480
atggactgct cttcagtcta ccttaggtgc cggggacaag agtattcacg tttggcagaa 198540
actctctagt gagaaattcc agatctatgc atttcctctt atatgtaaat tttctcataa 198600
aaacaaaaaa taatgtataa aataatttaa aattcagaac ataataaaaa tgacattaca 198660
tgcctatcca aaacattcag taatgaacat tattatatga attaataaaa tccattcaaa 198720
tatacctact gaaattaact tctggaaaat aaaaagacaa gggtaacatc cgtaacttaa 198780
aaattaataa gcatatattt catagagaag aaaaaggtag tcaagacata tgtggaatgt 198840
gtattctttt ttccaatcaa atgtcattaa actatttaaa caatttttta acctgtgtca 198900
taagtataga ttactaatat ttgtctgata ttacaactgt gaacaagttt taaagaaaaa 198960
aggatatttg acagcatgtg aactaaattg aatttattct taatattgag tccaacgatt 199020
acacccacaa gttctaataa taccctggtt ttgagtggtg ctttggaaaa attaattttt 199080
agagatttta gagataactt aaaagaataa agaatgtaat aaagtgacat tgacatccca 199140
tacataacaa catattgatc tattttttgt tgatggactt taaatttgtt tctagtttat 199200
gaatattata agcaaagctg ttacaaatac cttagtgtaa gttttcctat gttgtctcat 199260
ttttattgcg aaaacatgac gtatgcattt ctttcttgta agagtaattt taactttttt 199320
cagtttcatt gaggtatatt tgaaaaaatt ttttaaaagt atatggttga ggaacaatgc 199380
accacttgat gctttgtctt aggccattct cacattgcta taaagaaatg cctgagacta 199440
atttgaaaaa aagaaaaaga tgtttaattg gctcatgatt ctgcaggctc tataggaaat 199500
gtagttgttt attcttctgg ggagactcag gaaagttaga atcatggcag aagacaaaga 199560
ggagcagggc aatcacatgg ccagagcagg agccacagga ggcgtgcggt gggggggtgc 199620
ggggcgggtc tacacaccgt tagacaccag atcttgtgag aactcacgca ctgtcatgag 199680
aacagcagca ggagttgttg ctaaaccatt catgaaagac gtaccccatg acccagtcat 199740
gtcccaacag gtcctacttt caggaatgag gattataata taacatgaga tttgggtcaa 199800
gatacggatc caaaccatat cagatacaca ttgtaaaatg atcatcgtag tcaaggtaat 199860
ttgtgtgtat atcatctcac agagctacaa ttttattttt ttaagtttac tgcatgtgtg 199920
tgtgtgtctg atgagaacaa ctaaaatcta ccctgttagc aaaaatcgtt tttacagtaa 199980
agtattaact ataggaacat 200000
<210> 109
<211> 700
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (46)..(46)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 109
aggttctggg ttataaacnc tgtagactcc tcccttcagg gcaggntgac caactatgca 60
aatgcaagtg ggggcctccc cacttaaacc cagggctccc ctccacagtg agtctccctc 120
actgcccagc tgggatctca gggcttcatt ttctgtcctc caccatcatg gggtcaaccg 180
ccatcctcgc cctcctcctg gctgttctcc aaggtcagtc ctgccgaggg cttgaggtca 240
cagaggagaa cgggtggaaa ggagcccctg attcaaattt tgtgtctccc ccacaggagt 300
ctgttccgag gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct 360
gaagatctcc tgtaagggtt ctggatacag ctttaccagc tactggatcg gctgggtgcg 420
ccagatgccc gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac 480
cagatacagc ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac 540
cgcctacctg cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag 600
acacacagtg agagaaacca gccccgagcc cgtctaaaac cctccacacc gcaggtgcag 660
aatgagctgc tagagactca ctccccaggg gcctctctat 700
<210> 110
<211> 688
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
245 250 255
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
260 265 270
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
275 280 285
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
325 330 335
Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
340 345 350
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
355 360 365
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
370 375 380
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
385 390 395 400
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
405 410 415
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
420 425 430
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
435 440 445
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
450 455 460
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
465 470 475 480
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
485 490 495
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
500 505 510
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
515 520 525
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
530 535 540
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
545 550 555 560
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
565 570 575
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
580 585 590
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
595 600 605
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
610 615 620
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
625 630 635 640
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
645 650 655
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
660 665 670
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680 685
<210> 111
<211> 449
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 112
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 112
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 113
<211> 689
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 113
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Arg Gln Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Leu Phe Gly Tyr Trp Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
385 390 395 400
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
405 410 415
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
500 505 510
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
515 520 525
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
530 535 540
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
565 570 575
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
580 585 590
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
595 600 605
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
610 615 620
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
645 650 655
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
660 665 670
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
Lys
<210> 114
<211> 450
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Arg Gln Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Leu Phe Gly Tyr Trp Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 115
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 115
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 116
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 116
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 117
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 117
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 118
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический пептид
<400> 118
Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 119
<211> 215
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 119
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 120
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 120
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 121
<211> 688
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 121
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
225 230 235 240
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
245 250 255
Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala
275 280 285
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
290 295 300
Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser
325 330 335
Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
340 345 350
Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
355 360 365
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
370 375 380
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
385 390 395 400
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
405 410 415
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
420 425 430
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
435 440 445
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr
450 455 460
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
465 470 475 480
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
485 490 495
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
500 505 510
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
515 520 525
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
530 535 540
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
545 550 555 560
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
565 570 575
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
580 585 590
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
595 600 605
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
610 615 620
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
625 630 635 640
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
645 650 655
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
660 665 670
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680 685
<210> 122
<211> 445
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 122
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 123
<211> 455
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 123
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 124
<211> 215
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 124
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 125
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 125
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 126
<211> 1425
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 126
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgcagctgc tggaatctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggatctct gagactgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcacc tacgccatga actgggtgcg ccaggcccct 180
ggcaaaggcc tggaatgggt gtcccggatc agaagcaagt acaacaacta cgccacctac 240
tacgccgaca gcgtgaaggg ccggttcacc atcagccggg acgacagcaa gaacaccctg 300
tacctgcaga tgaacagcct gcgggccgag gacaccgccg tgtactattg tgtgcggcac 360
ggcaacttcg gcaacagcta tgtgtcttgg tttgcctact ggggccaggg caccctcgtg 420
accgtgtcat ctgctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 480
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 600
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 660
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720
aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 780
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 900
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1200
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1320
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 1425
<210> 127
<211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 127
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt cctaggtcaa cccaaggctg cccccagcgt gaccctgttc 420
ccccccagca gcgaggaact gcaggccaac aaggccaccc tggtctgcct gatcagcgac 480
ttctacccag gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 540
gtggagacca ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 600
agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac aggtcctaca gctgccaggt gacccacgag 660
ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gctga 705
<210> 128
<211> 432
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 128
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgcagctgc tggaatctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggatctct gagactgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcacc tacgccatga actgggtgcg ccaggcccct 180
ggcaaaggcc tggaatgggt gtcccggatc agaagcaagt acaacaacta cgccacctac 240
tacgccgaca gcgtgaaggg ccggttcacc atcagccggg acgacagcaa gaacaccctg 300
tacctgcaga tgaacagcct gcgggccgag gacaccgccg tgtactattg tgtgcggcac 360
ggcaacttcg gcaacagcta tgtgtcttgg tttgcctact ggggccaggg caccctcgtg 420
accgtgtcat ct 432
<210> 129
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид»
<400> 129
acctacgcca tgaac 15
<210> 130
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид»
<400> 130
cggatcagaa gcaagtacaa caactacgcc acctactacg ccgacagcgt gaagggc 57
<210> 131
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид»
<400> 131
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct ac 42
<210> 132
<211> 384
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 132
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattctcag 60
gccgtcgtga cccaggaacc cagcctgaca gtgtctcctg gcggcaccgt gaccctgaca 120
tgtggcagtt ctacaggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggaaaag 180
cccggccagg ccttcagagg actgatcggc ggcaccaaca agagagcccc tggcacccct 240
gccagattca gcggatctct gctgggagga aaggccgccc tgacactgtc tggcgcccag 300
ccagaagatg aggccgagta ctactgcgcc ctgtggtaca gcaacctgtg ggtgttcggc 360
ggaggcacca agctgacagt ccta 384
<210> 133
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид»
<400> 133
ggcagttcta caggcgccgt gaccaccagc aactacgcca ac 42
<210> 134
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид»
<400> 134
ggcaccaaca agagagcccc t 21
<210> 135
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид»
<400> 135
gccctgtggt acagcaacct gtgggtg 27
<210> 136
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = описание искусственной последовательности:
синтетический полипептид
<400> 136
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 137
<400> 137
000
<210> 138
<400> 138
000
<210> 139
<400> 139
000
<210> 140
<400> 140
000
<210> 141
<400> 141
000
<210> 142
<400> 142
000
<210> 143
<400> 143
000
<210> 144
<400> 144
000
<210> 145
<400> 145
000
<210> 146
<400> 146
000
<210> 147
<400> 147
000
<210> 148
<400> 148
000
<210> 149
<400> 149
000
<210> 150
<400> 150
000
<210> 151
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 151
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacgctggtg ttactccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 152
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 152
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacatcggtg ttgttacttt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 153
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 153
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacactggtg gttcttctgc tttcgactat tggggtcaag gcaccctcgt aacggtttct 360
tct 363
<210> 154
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (47)..(47)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 154
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgnttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgaa 300
tggcgtcgtt acacttcttt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 155
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 155
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtggt 300
tggatccgtt gggaacattt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 156
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 156
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacctgttct ctacttcttt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 157
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 157
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgag gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacatcggta tcgttccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 158
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 158
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 159
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (53)..(53)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 159
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc ccngcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaacc gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttactt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 160
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 160
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
tacgttggtg tttctccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 161
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (47)..(47)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (177)..(177)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 161
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgnttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcntac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaacttc 300
actgttctgc gtgttccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 162
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 162
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat gggcttggtt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 163
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 163
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaacc gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccttgggaat gggcttactt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 164
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 164
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcactggt 300
tggtctcgtt ggggttacat ggactattgg ggccaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 165
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 165
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgaa 300
tggatccgtt actaccattt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 166
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 166
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcgttggt 300
tggtaccgtt ggggttacat ggactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
<210> 167
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 167
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtaaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagctgtt 300
ttctaccgtg cttggtactc tttcgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 168
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 168
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataccagcc caccaccaac gtttggccag 300
ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 169
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 169
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300
ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttct 357
<210> 170
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 170
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatacca acgaacatta ttatacgttc 300
ggccagggga ccaaagtgga aatcaaa 327
<210> 171
<211> 351
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 171
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc t 351
<210> 172
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 172
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 173
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 173
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgagc 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 174
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 174
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgcag 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 175
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 175
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cgggcttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 176
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 176
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cggaattttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336
<210> 177
<211> 348
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 177
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctcttac 300
atcgacatgg actattgggg tcaaggcacc ctcgtaacgg tttcttct 348
<210> 178
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 178
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggataact ggagcccaac gttcggccag 300
gggaccaaag tggaaatcaa a 321
<210> 179
<211> 348
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 179
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctcttac 300
gttgacatgg actattgggg tcaaggcacc ctcgtaacgg tttcttct 348
<210> 180
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 180
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctacc tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggatattt ggagcccaac gttcggccag 300
gggaccaaag tggaaatcaa a 321
<210> 181
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 181
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagactct 300
tcttacgttg aatggtacgc tttcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360
agt 363
<210> 182
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 182
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gactccactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagccaacca gcagcccaat tacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaa 324
<210> 183
<211> 684
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 183
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagcgctag taccaagggc cccagcgtgt tccccctggc acccagcagc 420
aagagcacat ctggcggaac agccgctctg ggctgtctgg tgaaagacta cttccccgag 480
cccgtgaccg tgtcttggaa ctctggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac ctttccagcc 540
gtgctgcaga gcagcggcct gtactccctg tcctccgtgg tcaccgtgcc ctctagctcc 600
ctgggaacac agacatatat ctgtaatgtc aatcacaagc cttccaacac caaagtcgat 660
aagaaagtcg agcccaagag ctgc 684
<210> 184
<211> 696
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 184
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagcgctag tgtggccgct ccctccgtgt ttatctttcc cccatccgat 420
gaacagctga aaagcggcac cgcctccgtc gtgtgtctgc tgaacaattt ttaccctagg 480
gaagctaaag tgcagtggaa agtggataac gcactgcagt ccggcaactc ccaggaatct 540
gtgacagaac aggactccaa ggacagcacc tactccctgt cctccaccct gacactgtct 600
aaggctgatt atgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgt 696
<210> 185
<211> 36
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 185
gcaggcaagc attatgcagc ggacttttgg tcaagg 36
<210> 186
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 186
caggcaagca ttatgagccg gacttttggt caagg 35
<210> 187
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 187
cattatgaac cgggcttttg gtcaaggcac caaggtc 37
<210> 188
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический праймер»
<400> 188
cattatgaac cggaattttg gtcaaggcac caaggtc 37
<210> 189
<211> 2067
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 189
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020
agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 190
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 190
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 191
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 191
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtcctaggt caacccaagg ctgcccccag cgtgaccctg 360
ttccccccca gcagcgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatcagc 420
gacttctacc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg acagcagccc cgtgaaggcc 480
ggcgtggaga ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca agtacgccgc cagcagctac 540
ctgagcctga cccccgagca gtggaagagc cacaggtcct acagctgcca ggtgacccac 600
gagggcagca ccgtggagaa aaccgtggcc cccaccgagt gcagc 645
<210> 192
<211> 2067
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 192
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt catctgctag cacaaagggc cctagcgtgt tccctctggc ccccagcagc 420
aagagcacaa gcggcggaac agccgccctg ggctgcctcg tgaaggacta cttccccgag 480
cccgtgacag tgtcttggaa cagcggagcc ctgacaagcg gcgtgcacac cttccctgcc 540
gtgctgcaga gcagcggcct gtactccctg agcagcgtgg tcaccgtgcc tagcagcagc 600
ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aaccacaagc ccagcaacac caaagtggac 660
aagaaggtgg agcccaagag ctgtgatggc ggaggagggt ccggaggcgg aggatccgag 720
gtgcaattgg ttgaatctgg tggtggtctg gtaaaaccgg gcggttccct gcgtctgagc 780
tgcgcggctt ccggattcac cttctccaac gcgtggatga gctgggttcg ccaggccccg 840
ggcaaaggcc tcgagtgggt tggtcgtatc aagtctaaaa ctgacggtgg caccacggat 900
tacgcggctc cagttaaagg tcgttttacc atttcccgcg acgatagcaa aaacactctg 960
tatctgcaga tgaactctct gaaaactgaa gacaccgcag tctactactg tactaccccg 1020
tgggaatggt cttggtacga ttattggggc cagggcacgc tggttacggt gtctagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 193
<211> 1365
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 193
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt catctgctag caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660
aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 720
gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 780
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 840
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 900
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 960
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc 1020
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1080
ccatgccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc 1140
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1200
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1260
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1320
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa 1365
<210> 194
<211> 681
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 194
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 195
<211> 2070
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 195
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagcaca 360
aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480
ggcgccctga caagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
tctctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaaa gtggacaaga aggtggagcc caagagctgt 660
gatggcggag gagggtccgg aggcggagga tccgaggtgc agctgctgga atctggcggc 720
ggactggtgc agcctggcgg atctctgaga ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc 780
agcacctacg ccatgaactg ggtgcgccag gcccctggca aaggcctgga atgggtgtcc 840
cggatcagaa gcaagtacaa caactacgcc acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg 900
ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg 960
gccgaggaca ccgccgtgta ctattgtgtg cggcacggca acttcggcaa cagctatgtg 1020
tcttggtttg cctactgggg ccagggcacc ctcgtgaccg tgtcaagcgc tagtgtggcc 1080
gctccctccg tgtttatctt tcccccatcc gatgaacagc tgaaaagcgg caccgcctcc 1140
gtcgtgtgtc tgctgaacaa tttttaccct agggaagcta aagtgcagtg gaaagtggat 1200
aacgcactgc agtccggcaa ctcccaggaa tctgtgacag aacaggactc caaggacagc 1260
acctactccc tgtcctccac cctgacactg tctaaggctg attatgagaa acacaaagtc 1320
tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 1380
ggagagtgtg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccctgaagc tgctggcggc 1440
ccttctgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 1500
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 1560
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1620
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1680
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1740
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1800
ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1860
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1920
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1980
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 2040
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2070
<210> 196
<211> 1341
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 196
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 197
<211> 657
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 197
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 198
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 198
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtgctgagc agcgcttcca ccaaaggccc ttccgtgttt 360
cctctggctc ctagctccaa gtccacctct ggaggcaccg ctgctctcgg atgcctcgtg 420
aaggattatt ttcctgagcc tgtgacagtg tcctggaata gcggagcact gacctctgga 480
gtgcatactt tccccgctgt gctgcagtcc tctggactgt acagcctgag cagcgtggtg 540
acagtgccca gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc 600
agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa cccaagtctt gt 642
<210> 199
<211> 1377
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 199
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt catctgctag cgtggccgct ccctccgtgt ttatctttcc cccatccgat 420
gaacagctga aaagcggcac cgcctccgtc gtgtgtctgc tgaacaattt ttaccctagg 480
gaagctaaag tgcagtggaa agtggataac gcactgcagt ccggcaactc ccaggaatct 540
gtgacagaac aggactccaa ggacagcacc tactccctgt cctccaccct gacactgtct 600
aaggctgatt atgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgtgaca agacccacac ctgtccccct 720
tgtcctgccc ctgaagctgc tggcggccct tctgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag 780
gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac 840
gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 900
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 960
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1020
ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1080
tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg 1140
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1200
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1260
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1320
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1377
<210> 200
<211> 2067
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 200
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcgcc 1020
agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 201
<211> 2067
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 201
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020
gcctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 202
<211> 1323
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 202
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtgctgagc agcgctagca ccaagggccc atcggtcttc 360
cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480
gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540
accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 600
agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 660
ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960
gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1020
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320
aaa 1323
<210> 203
<211> 681
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 203
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcgtgg ccgctccctc cgtgttcatc ttcccacctt ccgacgagca gctgaagtcc 420
ggcaccgctt ctgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag 480
tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aacagccagg aatccgtgac cgagcaggac 540
tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 600
aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc caccagggcc tgtctagccc cgtgaccaag 660
tctttcaacc ggggcgagtg c 681
<210> 204
<211> 693
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 204
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc acctacgcca tgaactgggt gcgacaggct 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcccgg atcagatcca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg actccgtgaa gggccggttc accatctctc gggacgactc caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaactc ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt catctgctag ccccaaggct gcccccagcg tgaccctgtt tccccccagc 420
agcgaggaac tgcaggccaa caaggccacc ctggtctgcc tgatcagcga cttctaccca 480
ggcgccgtga ccgtggcctg gaaggccgac agcagccccg tgaaggccgg cgtggagacc 540
accaccccca gcaagcagag caacaacaag tacgccgcca gcagctacct gagcctgacc 600
cccgagcagt ggaagagcca caggtcctac agctgccagg tgacccacga gggcagcacc 660
gtggagaaaa ccgtggcccc caccgagtgc agc 693
<210> 205
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 205
cagaccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcagcag 120
aagccaggcc aggctcccag aggactgatc ggcggcacca acgccagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgtg 240
cagcctgaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtccta 327
<210> 206
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 206
cagaccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcagcag 120
aagccaggcc aggctcccag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgtg 240
cagcctgaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acgccaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtccta 327
<210> 207
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 207
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggacgg atcaagagca agaccgatgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctgggagt ggtcttggta cgactattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcctct 360
gctagc 366
<210> 208
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 208
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgtcccgg atcaagagca agaccgatgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctgggagt ggtcttggta cgactattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcctct 360
gctagc 366
<210> 209
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 209
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggatct atcaagagca agaccgacgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctgggagt ggtcttggta cgactattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcctct 360
gctagc 366
<210> 210
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 210
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggacgg atcaagagca agaccgatgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctacgagt ggtcttggta cgactactgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcatct 360
gctagc 366
<210> 211
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 211
gaggtgcaat tggtggaaag cggaggcggc ctcgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aacgcctgga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgggacgg atcaagagca agaccgatgg cggcaccacc 180
gactatgccg cccctgtgaa gggccggttc accatcagca gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccacc 300
ccctgggagt actcttggta cgactactgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcatct 360
gctagc 366
<210> 212
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 212
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
actatcgttg tttctccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
gctagc 366
<210> 213
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 213
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300
ttcatcggtt ctgttgctat ggactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
gctagc 366
<210> 214
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 214
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtctg 300
acttactcta tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagc 357
<210> 215
<211> 342
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 215
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcact gcagattcca 300
aacacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgta cg 342
<210> 216
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 216
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatacgct 300
tacgctctgg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc tagc 354
<210> 217
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 217
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagcatggca gcagcagcac gttcggccag 300
gggaccaaag tggaaatcaa acgtacg 327
<210> 218
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 218
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttctctgctg gtcgtctgat ggactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360
gctagc 366
<210> 219
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 219
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcact gcagacccca 300
ccaattacct ttggtcaagg caccaaggtc gaaattaaac gtacg 345
<210> 220
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 220
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
tacaacgctt tcgactattg gggtcacggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagc 357
<210> 221
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 221
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcatg gcatagccca 300
acttttggtc aaggcaccaa ggtcgaaatt aaacgtacg 339
<210> 222
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 222
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgct 300
acttacacta tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagc 357
<210> 223
<211> 342
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 223
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcact gcagacccca 300
attacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgta cg 342
<210> 224
<211> 1344
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 224
caggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc ggctacttca tgaactgggt caagcagagc 120
cacggcaaga gcctggaatg gatcggcaga atccacccct acgacggcga caccttctac 180
aaccagaact tcaaggacaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcaa caccgcccac 240
atggaactgc tgagcctgac cagcgaggac ttcgccgtgt actactgcac cagatacgac 300
ggcagccggg ccatggatta ttggggccag ggcaccaccg tgacagtgtc cagcgctagc 360
accaagggcc cctccgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcaca 420
gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480
agcggagccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag ttctggcctg 540
tatagcctga gcagcgtggt caccgtgcct tctagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660
tgcgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtgc accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctctc gtgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct cgtgagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 225
<211> 2073
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 225
caggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc ggctacttca tgaactgggt caagcagagc 120
cacggcaaga gcctggaatg gatcggcaga atccacccct acgacggcga caccttctac 180
aaccagaact tcaaggacaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcaa caccgcccac 240
atggaactgc tgagcctgac cagcgaggac ttcgccgtgt actactgcac cagatacgac 300
ggcagccggg ccatggatta ttggggccag ggcaccaccg tgacagtgtc cagcgctagc 360
acaaagggcc ccagcgtgtt ccctctggcc cctagcagca agagcacatc tggcggaaca 420
gccgccctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcccgagc ctgtgaccgt gtcctggaac 480
tctggcgccc tgacaagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg 540
tactctctga gcagcgtggt caccgtgcct agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaagtggaca agaaggtgga gcccaagagc 660
tgtgatggcg gaggagggtc cggaggcgga ggatccgaag tgcagctggt ggaaagcggc 720
ggaggcctgg tgcagcctaa gggctctctg aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc 780
ttcaacacct acgccatgaa ctgggtgcgc caggcccctg gcaaaggcct ggaatgggtg 840
gcccggatca gaagcaagta caacaattac gccacctact acgccgacag cgtgaaggac 900
cggttcacca tcagccggga cgacagccag agcatcctgt acctgcagat gaacaacctg 960
aaaaccgagg acaccgccat gtactactgc gtgcggcacg gcaacttcgg caacagctat 1020
gtgtcttggt ttgcctactg gggccagggc accctcgtga cagtgtctgc tgctagcgtg 1080
gccgctccct ccgtgtttat ctttccccca tccgatgaac agctgaaaag cggcaccgcc 1140
tccgtcgtgt gtctgctgaa caatttttac cctagggaag ctaaagtgca gtggaaagtg 1200
gataacgcac tgcagtccgg caactcccag gaatctgtga cagaacagga ctccaaggac 1260
agcacctact ccctgtcctc caccctgaca ctgtctaagg ctgattatga gaaacacaaa 1320
gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 1380
aggggagagt gtgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga agctgctggc 1440
ggcccttctg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1500
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 1560
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1620
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1680
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1740
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atgccgggat 1800
gagctgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1860
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1920
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1980
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 2040
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 2073
<210> 226
<211> 654
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 226
gacatcgagc tgacccagag ccctgcctct ctggccgtgt ctctgggaca gagagccatc 60
atcagctgca aggccagcca gagcgtgtcc tttgccggca cctctctgat gcactggtat 120
caccagaagc ccggccagca gcccaagctg ctgatctaca gagccagcaa cctggaagcc 180
ggcgtgccca caagattttc cggcagcggc agcaagaccg acttcaccct gaacatccac 240
cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc agagcagaga gtacccctac 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 227
<211> 209
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 227
Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala
1 5 10 15
Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln
20 25 30
Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln
35 40 45
Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His
50 55 60
Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr
65 70 75 80
Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val
85 90 95
Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys
100 105 110
Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys
115 120 125
Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys
130 135 140
Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr
145 150 155 160
Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser
165 170 175
Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro
180 185 190
Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala
195 200 205
Met
<210> 228
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 228
Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met
1 5 10 15
Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His
20 25 30
Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr
35 40 45
Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp
50 55 60
Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln
65 70 75 80
Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln
85 90 95
Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu
100 105 110
Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His
115 120 125
Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val
130 135 140
Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys
165 170 175
Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe
180 185 190
Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala
195 200 205
Ala Ala Met His Val Asn
210
<210> 229
<211> 220
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 229
Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys
1 5 10 15
His His Lys Thr Gln Pro Ser Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys
20 25 30
Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu
35 40 45
Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys
50 55 60
Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Ser Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Arg Gln Val Asn
85 90 95
Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu
100 105 110
Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys
115 120 125
Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys
130 135 140
Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro
145 150 155 160
Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Phe Lys Val Ser Asn
165 170 175
Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala
180 185 190
Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met
195 200 205
Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg Gly Ile Ile Asp Ser
210 215 220
<210> 230
<211> 208
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 230
Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His
1 5 10 15
His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Asn Leu His Asp Gln Cys Ser
20 25 30
Pro Trp Lys Thr Asn Ser Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala
35 40 45
His Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly
50 55 60
Thr Met Thr Ser Glu Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu
65 70 75 80
Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln
85 90 95
Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Gln Trp Trp Glu Asp Cys Gln Ser Ser Phe Thr Cys Lys Ser
115 120 125
Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Ser Ser Gly His Asn Glu Cys Pro
130 135 140
Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe Thr Phe Tyr Phe Pro Thr Ser Ala
145 150 155 160
Ala Leu Cys Glu Glu Ile Trp Ser His Ser Tyr Lys Leu Ser Asn Tyr
165 170 175
Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln
180 185 190
Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Glu Ala Met Ser
195 200 205
<210> 231
<211> 213
<212> БЕЛОК
<213> Macaca fascicularis
<400> 231
Glu Ala Gln Thr Arg Thr Ala Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val
1 5 10 15
Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys
20 25 30
Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr
35 40 45
Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe
50 55 60
Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe
65 70 75 80
Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp
85 90 95
Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val
100 105 110
Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr
115 120 125
Ser Tyr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly
130 135 140
Phe Asn Lys Cys Pro Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr Tyr Ser Tyr
165 170 175
Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp
180 185 190
Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr
195 200 205
Ala Ala Ala Met Ser
210
<210> 232
<400> 232
000
<210> 233
<400> 233
000
<210> 234
<400> 234
000
<210> 235
<400> 235
000
<210> 236
<400> 236
000
<210> 237
<400> 237
000
<210> 238
<400> 238
000
<210> 239
<400> 239
000
<210> 240
<400> 240
000
<210> 241
<400> 241
000
<210> 242
<400> 242
000
<210> 243
<400> 243
000
<210> 244
<400> 244
000
<210> 245
<400> 245
000
<210> 246
<211> 2076
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 246
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300
ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttctgct 360
agcacaaagg gccccagcgt gttccctctg gcccctagca gcaagagcac atctggcgga 420
acagccgccc tgggctgcct cgtgaaggac tactttcccg agcctgtgac cgtgtcctgg 480
aactctggcg ccctgacaag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtactctc tgagcagcgt ggtcaccgtg cctagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaagtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgtgatg gcggaggagg gtccggaggc ggaggatccg aggtgcagct gctggaatct 720
ggcggcggac tggtgcagcc tggcggatct ctgagactga gctgtgccgc cagcggcttc 780
accttcagca cctacgccat gaactgggtg cgccaggccc ctggcaaagg cctggaatgg 840
gtgtcccgga tcagaagcaa gtacaacaac tacgccacct actacgccga cagcgtgaag 900
ggccggttca ccatcagccg ggacgacagc aagaacaccc tgtacctgca gatgaacagc 960
ctgcgggccg aggacaccgc cgtgtactat tgtgtgcggc acggcaactt cggcaacagc 1020
tatgtgtctt ggtttgccta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtgtc aagcgctagt 1080
gtggccgctc cctccgtgtt tatctttccc ccatccgatg aacagctgaa aagcggcacc 1140
gcctccgtcg tgtgtctgct gaacaatttt taccctaggg aagctaaagt gcagtggaaa 1200
gtggataacg cactgcagtc cggcaactcc caggaatctg tgacagaaca ggactccaag 1260
gacagcacct actccctgtc ctccaccctg acactgtcta aggctgatta tgagaaacac 1320
aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 1380
aacaggggag agtgtgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaagctgct 1440
ggcggccctt ctgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 1500
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 1560
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1620
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1680
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcg gcgcccccat cgagaaaacc 1740
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg 1800
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1860
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1920
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1980
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 2040
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 2076
<210> 247
<211> 1347
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 247
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300
ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttctgct 360
agcaccaagg gcccctccgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420
acagccgctc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480
aacagcggag ccctgacctc cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagttctggc 540
ctgtatagcc tgagcagcgt ggtcaccgtg ccttctagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct ctcgtgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctcgtgagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 248
<400> 248
000
<210> 249
<400> 249
000
<210> 250
<400> 250
000
<210> 251
<400> 251
000
<210> 252
<400> 252
000
<210> 253
<400> 253
000
<210> 254
<400> 254
000
<210> 255
<400> 255
000
<210> 256
<400> 256
000
<210> 257
<400> 257
000
<210> 258
<400> 258
000
<210> 259
<400> 259
000
<210> 260
<400> 260
000
<210> 261
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 261
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgaggg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 262
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 262
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactcaggg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
<210> 263
<211> 375
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 263
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcgccag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagc 375
<210> 264
<211> 375
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 264
gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180
tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300
cacggcaact tcggcaacgc ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360
gtgaccgtgt caagc 375
<210> 265
<211> 2067
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 265
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcgcc 1020
agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 266
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 266
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 267
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 267
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtcctaggt caacccaagg ctgcccccag cgtgaccctg 360
ttccccccca gcagcgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatcagc 420
gacttctacc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg acagcagccc cgtgaaggcc 480
ggcgtggaga ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca agtacgccgc cagcagctac 540
ctgagcctga cccccgagca gtggaagagc cacaggtcct acagctgcca ggtgacccac 600
gagggcagca ccgtggagaa aaccgtggcc cccaccgagt gcagc 645
<210> 268
<211> 2067
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 268
gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180
gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240
ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300
ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360
gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480
tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720
tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840
tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900
aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960
agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020
gcctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080
agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200
aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260
ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320
atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380
agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067
<210> 269
<211> 2070
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 269
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagcaca 360
aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480
ggcgccctga caagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
tctctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaaa gtggacaaga aggtggagcc caagagctgt 660
gatggcggag gagggtccgg aggcggagga tccgaggtgc agctgctgga atctggcggc 720
ggactggtgc agcctggcgg atctctgaga ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc 780
agcacctacg ccatgaactg ggtgcgccag gcccctggca aaggcctgga atgggtgtcc 840
cggatcagaa gcaagtacaa caactacgcc acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg 900
ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg 960
gccgaggaca ccgccgtgta ctattgtgtg cggcacggca acttcggcgc cagctatgtg 1020
tcttggtttg cctactgggg ccagggcacc ctcgtgaccg tgtcaagcgc tagtgtggcc 1080
gctccctccg tgtttatctt tcccccatcc gatgaacagc tgaaaagcgg caccgcctcc 1140
gtcgtgtgtc tgctgaacaa tttttaccct agggaagcta aagtgcagtg gaaagtggat 1200
aacgcactgc agtccggcaa ctcccaggaa tctgtgacag aacaggactc caaggacagc 1260
acctactccc tgtcctccac cctgacactg tctaaggctg attatgagaa acacaaagtc 1320
tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 1380
ggagagtgtg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccctgaagc tgctggcggc 1440
ccttctgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 1500
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 1560
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1620
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1680
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1740
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1800
ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1860
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1920
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1980
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 2040
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2070
<210> 270
<211> 1341
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 270
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 271
<211> 657
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 271
gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60
atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120
tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180
tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240
agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgcag 300
cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 272
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 272
caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60
acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120
aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180
cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240
cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300
ggcggaggca ccaagctgac agtgctgagc agcgcttcca ccaaaggccc ttccgtgttt 360
cctctggctc ctagctccaa gtccacctct ggaggcaccg ctgctctcgg atgcctcgtg 420
aaggattatt ttcctgagcc tgtgacagtg tcctggaata gcggagcact gacctctgga 480
gtgcatactt tccccgctgt gctgcagtcc tctggactgt acagcctgag cagcgtggtg 540
acagtgccca gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc 600
agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa cccaagtctt gt 642
<210> 273
<211> 2070
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<221> источник
<223> /примечание = «Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид»
<400> 273
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120
ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180
gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240
atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300
ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc tgctagcaca 360
aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420
gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480
ggcgccctga caagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540
tctctgagca gcgtggtcac cgtgcctagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaaa gtggacaaga aggtggagcc caagagctgt 660
gatggcggag gagggtccgg aggcggagga tccgaggtgc agctgctgga atctggcggc 720
ggactggtgc agcctggcgg atctctgaga ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc 780
agcacctacg ccatgaactg ggtgcgccag gcccctggca aaggcctgga atgggtgtcc 840
cggatcagaa gcaagtacaa caactacgcc acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg 900
ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg 960
gccgaggaca ccgccgtgta ctattgtgtg cggcacggca acttcggcaa cgcctatgtg 1020
tcttggtttg cctactgggg ccagggcacc ctcgtgaccg tgtcaagcgc tagtgtggcc 1080
gctccctccg tgtttatctt tcccccatcc gatgaacagc tgaaaagcgg caccgcctcc 1140
gtcgtgtgtc tgctgaacaa tttttaccct agggaagcta aagtgcagtg gaaagtggat 1200
aacgcactgc agtccggcaa ctcccaggaa tctgtgacag aacaggactc caaggacagc 1260
acctactccc tgtcctccac cctgacactg tctaaggctg attatgagaa acacaaagtc 1320
tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 1380
ggagagtgtg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccctgaagc tgctggcggc 1440
ccttctgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 1500
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 1560
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1620
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1680
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1740
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1800
ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1860
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1920
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1980
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 2040
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2070
<---

Claims (47)

1. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включающая первую и вторую антигенсвязывающие части молекулы, в которой первая антигенсвязывающая часть молекулы включает первую легкую цепь, причем первая антигенсвязывающая часть молекулы способна специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки, где активирующим Т-клетки антигеном является CD3, и в которой вторая антигенсвязывающая часть молекулы включает вторую легкую цепь, причем вторая антигенсвязывающая часть молекулы способна специфически связываться с антигеном целевых клеток, где антигеном целевых клеток является фолатный рецептор 1 (FolR1), в которой аминокислотные последовательности первой и второй легких цепей идентичны, причем первая и вторая легкие цепи включают CDRs легкой цепи SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34, первой антигенсвязывающей частью является Fab и второй антигенсвязывающей частью является Fab, а общая легкая цепь спарена с рандомизированным набором тяжелой цепи на основе зародышевой линии VH1_46 или VH3_15 человека.
2. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 1, дополнительно включающая третью антигенсвязывающую часть молекулы, способную специфически связываться с антигеном целевых клеток.
3. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 1, дополнительно включающая домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц, способных стабильно ассоциировать.
4. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-3, в которой первая и вторая легкие цепи включают константный домен легкой цепи каппа.
5. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-3, в которой первая и вторая легкие цепи включают константный домен легкой цепи лямбда.
6. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 5, в которой первая и вторая легкие цепи являются легкой цепью человека лямбда или гуманизированной легкой цепью лямбда.
7. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 6, в которой первая и вторая легкие цепи являются легкой цепью человека лямбда 7 или гуманизированной легкой цепью лямбда 7.
8. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-3 и 5-7, в которой первая и вторая легкие цепи включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
9. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 8, в которой первая и вторая легкие цепи включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
10. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-9, включающая не более одной антигенсвязывающей части молекулы, способной специфически связываться с антигеном, активирующим Т-клетки.
11. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-9, в которой первая и вторая антигенсвязывающие части молекулы слиты друг с другом необязательно через пептидный линкер.
12. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-9, в которой вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой антигенсвязывающей части молекулы.
13. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-9, в которой первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй антигенсвязывающей части молекулы.
14. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-9, в которой вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc.
15. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-9, в которой первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc.
16. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-9, в которой каждая из первой и второй антигенсвязывающих частей молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc.
17. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 2, в которой каждая из первой, второй и третьей антигенсвязывающих частей молекулы является молекулой Fab, включающей идентичную легкую цепь VLCL.
18. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 2 или 17, в которой каждая первая, вторая или третья антигенсвязывающая часть молекулы является молекулой Fab, включающей CDR легкой цепи SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34.
19. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 2 или 17, в которой каждая первая, вторая или третья антигенсвязывающая часть молекулы является молекулой Fab, включающей легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
20. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 2 или 17-19, в которой третья антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc.
21. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 2 или 17-19, в которой каждая вторая или третья антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc, и первая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй антигенсвязывающей части молекулы.
22. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 21, в которой вторая и третья антигенсвязывающие части молекулы и домен Fc являются частью молекулы иммуноглобулина, в частности иммуноглобулина класса IgG.
23. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 2 или 17-19, в которой каждая первая или третья антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc, и вторая антигенсвязывающая часть молекулы слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой антигенсвязывающей части молекулы.
24. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 23, в которой первая и третья антигенсвязывающие части молекулы и домен Fc являются частью молекулы иммуноглобулина, особенно иммуноглобулина класса IgG.
25. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 3-24, в которой домен Fc является доменом Fc IgG, особенно IgG1 или IgG4.
26. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 3-21, в которой домен Fc является доменом Fc человека.
27. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 3-19, в которой домен Fc включает модификацию, индуцирующую ассоциацию первой и второй субъединиц домена Fc.
28. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 27, в которой в домене СН3 первой субъединицы домена Fc аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, тем самым формируя выступ в домене СН3 первой субъединицы, который помещается в полость в домене СН3 второй субъединицы, и в домене СН3 второй субъединицы домена Fc аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим меньший объем боковой цепи, тем самым формируя полость в домене СН3 второй субъединицы, в которую помещается выступ второго домена СН3 первой субъединицы.
29. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 3-28, в которой домен Fc проявляет пониженное связывающее сродство с рецептором Fc и/или пониженную эффекторную функцию по сравнению с доменом нативного Fc IgG1.
30. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 3-28, в которой домен Fc включает одну или несколько аминокислотных замен, которые снижают связывание с рецептором Fc и/или эффекторную функцию.
31. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 30, в которой одна или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких положениях выбраны из группы, включающей L234, L235 и Р329.
32. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 30, в которой каждая субъединица домена Fc включает три аминокислотных замещения, которые снижают связывание с активирующим рецептором Fc и/или эффекторную функцию, причем указанными аминокислотными замещениями являются L234A, L235A и P329G.
33. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 29-32, в которой рецептором Fc является рецептор Fcγ.
34. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 29-33, в которой эффекторной функцией является антителозависимая клеточно-обусловленная цитотоксичность (ADCC).
35. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из предыдущих пунктов, в которых первая и вторая легкие цепи являются гуманизированными легкими цепями.
36. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из предыдущих пунктов, в которых первая и вторая легкие цепи могут быть применены более чем в двух антигенсвязывающих частях молекулы, обладающих разной антигенной специфичностью.
37. Выделенный полинуклеотид, кодирующий активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по любому из пп. 1-35.
38. Полипептид для лечения рака, кодируемый выделенным полинуклеотидом по п. 37.
39. Вектор для обеспечения экспрессии антигенсвязывающей молекулы по пп. 1-36, особенно экспрессирующий вектор, включающий выделенный полинуклеотид по п. 37.
40. Клетка-хозяин для получения антигенсвязывающей молекулы по пп. 1-36, включающая выделенный полинуклеотид по п. 37 или вектор по п. 39.
41. Способ получения активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по любому из пп. 1-36, включающий стадии: а) культивирования клеток-хозяев по п. 40 в условиях, пригодных для экспрессии активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, и б) выделения активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы.
42. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, получаемая способом по п. 41.
43. Фармацевтическая композиция для лечения FolR1-положительного рака, включающая активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по любому из пп. 1-36 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
44. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-36 или фармацевтическая композиция по п. 43 для применения в качестве лекарственного средства для лечения FolR1-положительного рака.
45. Активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-36 или фармацевтическая композиция по п. 43 для применения в лечении FolR1-положительного рака у индивидуума, нуждающегося в этом.
46. Применение активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы по любому из пп. 1-36 для получения лекарственного средства для лечения FolR1-положительного рака у индивидуума, нуждающегося в этом.
47. Способ лечения FolR1-положительного рака у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, включающей активирующую Т-клетки биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по любому из пп. 1-36 в фармацевтически приемлемой форме.
RU2017121326A 2014-11-20 2015-11-17 Общие легкие цепи и способы их применения RU2747011C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14194097.3 2014-11-20
EP14194097 2014-11-20
PCT/EP2015/076745 WO2016079081A1 (en) 2014-11-20 2015-11-17 Common light chains and methods of use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017121326A RU2017121326A (ru) 2018-12-20
RU2017121326A3 RU2017121326A3 (ru) 2019-06-14
RU2747011C2 true RU2747011C2 (ru) 2021-04-23

Family

ID=51951675

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017121326A RU2747011C2 (ru) 2014-11-20 2015-11-17 Общие легкие цепи и способы их применения

Country Status (20)

Country Link
US (3) US20170253670A1 (ru)
EP (2) EP3221357B1 (ru)
JP (2) JP7164949B2 (ru)
KR (1) KR20170087486A (ru)
CN (1) CN107207609B (ru)
BR (1) BR112017010513A2 (ru)
CA (1) CA2968162A1 (ru)
DK (1) DK3221357T3 (ru)
ES (1) ES2808853T3 (ru)
HK (1) HK1244011A1 (ru)
HR (1) HRP20201156T1 (ru)
HU (1) HUE049650T2 (ru)
LT (1) LT3221357T (ru)
MX (1) MX2017006626A (ru)
PL (1) PL3221357T3 (ru)
PT (1) PT3221357T (ru)
RS (1) RS60615B1 (ru)
RU (1) RU2747011C2 (ru)
SI (1) SI3221357T1 (ru)
WO (1) WO2016079081A1 (ru)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
RU2605390C2 (ru) 2011-08-23 2016-12-20 Рош Гликарт Аг Биспецифические антитела, специфичные к антигенам, активирующим т-клетки, и опухолевому антигену, и способы их применения
CA2879768A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
JP6499087B2 (ja) 2013-02-26 2019-04-10 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
HUE047925T2 (hu) 2013-02-26 2020-05-28 Roche Glycart Ag Bispecifikus, T-sejt-aktiváló, CD3- és CEA-specifikus antigénkötõ molekulák
KR20160044060A (ko) * 2013-10-11 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체
CA2951599A1 (en) 2014-08-04 2016-02-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
MX2017006610A (es) 2014-11-20 2017-09-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de moleculas de union a antigeno biespecificas activadoras de celulas t y antagonistas de union de eje de pd-1.
SG10201914069SA (en) 2015-05-18 2020-03-30 Tcr2 Therapeutics Inc Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
PE20180484A1 (es) 2015-10-02 2018-03-07 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
KR20180085740A (ko) 2015-12-09 2018-07-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-약물 항체의 형성을 감소시키기 위한 ii형 항-cd20 항체
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
AU2017214692B2 (en) 2016-02-06 2021-11-04 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
US20170233484A1 (en) 2016-02-17 2017-08-17 Seattle Genetics, Inc. Bcma antibodies and use of same to treat cancer and immunological disorders
CN109153728A (zh) 2016-03-21 2019-01-04 埃尔斯塔治疗公司 多特异性和多功能分子及其用途
PL3433280T3 (pl) 2016-03-22 2023-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste cząsteczki limfocytów T aktywowane przez proteazy
CA3012422A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease-activated t cell bispecific molecules
BR112018076767A2 (pt) * 2016-06-21 2019-04-02 Teneobio, Inc. anticorpos de ligação a cd3
AU2017306432A1 (en) 2016-08-02 2019-03-21 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
JP7033328B2 (ja) * 2016-08-16 2022-03-10 エピムアブ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 一価の非対称タンデムＦａｂ二重特異性抗体
WO2018052503A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Teneobio, Inc. Cd3 binding antibodies
JP7022123B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に対する二重特異性抗体
EP3445787B1 (en) 2016-10-07 2020-12-02 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for t-cell receptors reprogramming using fusion proteins
AU2017363311A1 (en) 2016-11-22 2019-06-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
PL3583120T3 (pl) 2017-02-17 2023-01-09 Denali Therapeutics Inc. Konstruowane polipeptydy wiążące receptory transferyny
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
CN117567624A (zh) 2017-06-20 2024-02-20 特纳奥尼股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
WO2019126401A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Surrozen, Inc. Anti-lrp5/6 antibodies and methods of use
WO2019126398A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Surrozen, Inc. Wnt surrogate molecules and uses thereof
KR20200104342A (ko) 2017-12-22 2020-09-03 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd22에 결합하는 중쇄 항체
AU2019218959A1 (en) 2018-02-08 2020-09-03 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
US20210009711A1 (en) 2018-03-14 2021-01-14 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US20210179734A1 (en) * 2018-04-17 2021-06-17 Invenra Inc. Trivalent trispecific antibody constructs
CA3102441C (en) * 2018-06-08 2023-06-13 Crystal Bioscience Inc. Transgenic animal for producing diversified antibodies that have the same light chain i
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
KR20210034032A (ko) 2018-07-19 2021-03-29 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 이중특이적 항-BCMA x 항-CD3 항체 및 이의 용도
WO2020132356A1 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Surrozen, Inc. Antigen binding formats for receptor complexes
JP2022521750A (ja) 2019-02-21 2022-04-12 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
AU2020224680A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
WO2020172571A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
CN114127111A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
AU2020226904A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
AU2020291938A1 (en) 2019-06-14 2022-01-20 Teneobio, Inc. Multispecific heavy chain antibodies binding to CD22 and CD3
CN110229232B (zh) * 2019-06-19 2020-05-19 北京智仁美博生物科技有限公司 双特异性抗体及其用途
CN110551222B (zh) * 2019-08-27 2023-06-06 重庆市畜牧科学院 一种新型双功能抗体及其用途
CA3165846A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Denali Therapeutics Inc. Progranulin variants
CN110982839A (zh) * 2019-12-25 2020-04-10 上海药明生物技术有限公司 对蛋白在细胞水平进行生物素标记的方法
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
EP4106819A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 Silverback Therapeutics, Inc. Nectin-4 antibody conjugates and uses thereof
JP2023523011A (ja) 2020-04-24 2023-06-01 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔ細胞関連のがん細胞に結合する多機能性分子およびその使用
IL297601A (en) 2020-04-29 2022-12-01 Teneobio Inc Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
WO2021255155A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cd19
KR20230047361A (ko) 2020-07-01 2023-04-07 아르스 파마슈티컬스 인크. 항-asgr1 항체 접합체 및 이의 용도
AU2021331075A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
EP4204096A2 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
KR20230074487A (ko) 2020-08-26 2023-05-30 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Trbc1 또는 trbc2를 검출하는 방법
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014051433A1 (en) * 2012-09-27 2014-04-03 Merus B.V. BISPECIFIC IgG ANTIBODIES AS T CELL ENGAGERS
WO2014131712A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2014151910A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2388385B1 (fr) 1977-04-18 1982-01-08 Hitachi Metals Ltd Piece d'ornement fixee par des aimants permanents
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
ATE419355T1 (de) 1992-02-06 2009-01-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU751659B2 (en) * 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
PT1034298E (pt) 1997-12-05 2012-02-03 Scripps Research Inst Humanização de anticorpo murino
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
PL1871805T3 (pl) 2005-02-07 2020-03-31 Roche Glycart Ag Cząsteczki wiążące antygen, które wiążą egfr, wektory kodujące te cząsteczki oraz ich zastosowania
WO2008119567A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
CA2709847C (en) 2008-01-07 2018-07-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
US20130045492A1 (en) * 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
CA2844538C (en) * 2011-08-23 2020-09-22 Roche Glycart Ag Bispecific antigen binding molecules
TWI679212B (zh) * 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
SG11201407644UA (en) * 2012-06-05 2014-12-30 Regeneron Pharma Methods for making fully human bispecific antibodies using a common light chain
CA2879768A1 (en) * 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
US10968276B2 (en) * 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10077315B2 (en) 2013-02-05 2018-09-18 Engmab Sàrl Bispecific antibodies against CD3 and BCMA

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014051433A1 (en) * 2012-09-27 2014-04-03 Merus B.V. BISPECIFIC IgG ANTIBODIES AS T CELL ENGAGERS
WO2014131712A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2014151910A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KLEIN C. et al. "Progress in overcoming the chain association issue in bispecific heterodimeric IgG antibodies." MAbs. Taylor & Francis, 2012, 4(6): 653-663. *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2017006626A (es) 2017-08-21
US20170253670A1 (en) 2017-09-07
US20200172633A1 (en) 2020-06-04
ES2808853T3 (es) 2021-03-02
JP7164949B2 (ja) 2022-11-02
WO2016079081A1 (en) 2016-05-26
JP2021129564A (ja) 2021-09-09
EP3221357A1 (en) 2017-09-27
SI3221357T1 (sl) 2020-09-30
RS60615B1 (sr) 2020-08-31
RU2017121326A3 (ru) 2019-06-14
BR112017010513A2 (pt) 2018-04-03
PT3221357T (pt) 2020-07-28
DK3221357T3 (da) 2020-08-10
HK1244011A1 (zh) 2018-07-27
RU2017121326A (ru) 2018-12-20
PL3221357T3 (pl) 2020-11-02
JP2018504092A (ja) 2018-02-15
EP3221357B1 (en) 2020-06-03
HUE049650T2 (hu) 2020-11-30
KR20170087486A (ko) 2017-07-28
CA2968162A1 (en) 2016-05-26
LT3221357T (lt) 2020-08-25
EP3747905A1 (en) 2020-12-09
CN107207609B (zh) 2022-07-19
HRP20201156T1 (hr) 2020-11-13
CN107207609A (zh) 2017-09-26
US20220213224A1 (en) 2022-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2747011C2 (ru) Общие легкие цепи и способы их применения
US20230340160A1 (en) Bispecific t cell activating antigen binding molecules
AU2020264337B2 (en) Antigen binding molecules comprising a TNF family ligand trimer
AU2017202437B2 (en) Novel immunoconjugates
RU2761115C1 (ru) Биспецифические антитела, специфические в отношении костимуляторного tnf-рецептора
KR102282761B1 (ko) 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
AU2021254602A1 (en) Humanized anti-MUC1* antibodies
KR20180054877A (ko) 공자극 tnf 수용체에 대해 4가를 갖는 이중특이적 항체
CN109071652B (zh) 包含tnf家族配体三聚体和生腱蛋白结合模块的抗原结合分子
KR20150122203A (ko) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
CN109311973A (zh) 含有c端融合的tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
CN111954680B (zh) IL2Rβ/共同γ链抗体
KR20170081188A (ko) Folr1 및 cd3에 대한 t 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
KR20150122761A (ko) Ｔ 세포 활성화 항원 결합 분자
KR20140091031A (ko) 저밀도 지단백질-관련 단백질 6 (lrp6) - 반감기 연장제 구축물
KR20150041626A (ko) 아시알로당단백질 수용체 항체 및 이의 용도
KR20130125809A (ko) 혈관형성 유도인자를 길항하는 융합단백질 및 그 용도
KR20220139926A (ko) 인공 시냅스
TW202241943A (zh) Tau特異性抗體基因療法組合物、方法及其用途
KR20230059789A (ko) 항-가변 muc1* 항체 및 이의 용도