ES2808853T3

ES2808853T3 - Cadenas ligeras comunes y procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2808853T3
Application number: ES15797972T
Authority: ES
Inventors: Christian Klein; Ekkehard Moessner; Ralf Hosse; Peter Bruenker; Pablo Umana; Christiane Jaeger
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2035-11-17
Also published as: SI3221357T1; WO2016079081A1; HUE049650T2; RU2017121326A3; US20200172633A1; HK1244011A1; PL3221357T3; HRP20201156T1; BR112017010513A2; KR20170087486A; LT3221357T; PT3221357T; CA2968162A1; RU2017121326A; MX2017006626A; US20170253670A1; EP3221357B1; EP3221357A1; US20220213224A1; CN107207609A

Abstract

Una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, en la que el primer resto de unión a antígeno comprende una primera cadena ligera y en la que el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, en la que el antígeno activador de linfocitos T es CD3, en la que el segundo resto de unión a antígeno comprende una segunda cadena ligera y en la que el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en la que el antígeno de célula diana es el receptor 1 de folato (FolR1), en la que la secuencia de aminoácidos de la primera y la segunda cadena ligera es idéntica, en la que la primera y la segunda cadena ligera comprende las CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, en la que el primer resto de unión a antígeno es un Fab y el segundo resto de unión a antígeno es un Fab.

Description

DESCRIPCIÓN

Cadenas ligeras comunes y procedimientos de uso

Listado de secuencias

La solicitud instantánea contiene un listado de secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 10 de noviembre de 2015, se denomina 32398_SL.txt y tiene un tamaño de 537.667 bytes.

Campo de la invención

La presente invención en general se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas para activar linfocitos T. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas, y vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a procedimientos para producir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención, y a procedimientos de uso de estas moléculas de unión a antígeno biespecíficas en el tratamiento de enfermedad.

Antecedentes

La destrucción selectiva de una célula individual o un tipo de célula específico a menudo es deseable en una variedad de entornos clínicos. Por ejemplo, un objetivo principal del tratamiento del cáncer es destruir específicamente las células tumorales, dejando las células y tejidos sanos intactos y sin daños.

Una forma atractiva de lograr esto es induciendo una respuesta inmunitaria contra el tumor, para hacer que las células efectoras inmunitarias tales como los linfocitos citolíticos naturales (NK) o los linfocitos T citotóxicos (CTL) ataquen y destruyan las células tumorales. Los CTL constituyen las células efectoras más potentes del sistema inmunitario; sin embargo, no se pueden activar por el mecanismo efector mediado por el dominio Fc de anticuerpos terapéuticos convencionales.

A este respecto, los anticuerpos biespecíficos diseñados para unirse con un "brazo" a un antígeno de superficie en células diana, y con el segundo "brazo" a un componente invariante activador del complejo receptor de linfocitos T (TCR), se han vuelto de interés en los últimos años. La unión simultánea de un anticuerpo de este tipo a sus dos dianas fuerza una interacción temporal entre la célula diana y el linfocito T, provocando la activación de cualquier linfocito T citotóxico y la posterior lisis de la célula diana. Por tanto, la respuesta inmunitaria se redirige a las células diana y es independiente de la presentación antigénica de péptidos por la célula diana o la especificidad del linfocito T como sería pertinente para la activación restringida para m Hc normal de CTL. En este contexto, es crucial que los CTL solo se activen cuando el anticuerpo biespecífico se une a una célula diana y al CTL, es decir, se imita la sinapsis inmunológica. Son en particular deseables los anticuerpos biespecíficos que no requieren preacondicionamiento o coestimulación de linfocitos para provocar lisis eficaz de células diana.

Se han desarrollado varios formatos de anticuerpos biespecíficos e investigado su idoneidad para inmunoterapia mediada por linfocitos T. De estos, las denominadas moléculas BiTE (captadoras de linfocitos T biespecíficos) se han caracterizado muy bien y ya se han mostrado prometedoras en el ámbito clínico (revisado en Nagorsen y Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)). Las BiTE son moléculas scFv en tándem en las que dos moléculas scFv se fusionan por un conector flexible. Otros formatos biespecíficos que se evalúan para el acoplamiento de linfocitos T incluyen diacuerpos (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) y derivados de los mismos, tales como diacuerpos en tándem (Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)). Un desarrollo más reciente son las moléculas denominadas DART (redirección de afinidad doble), que se basan en el formato de diacuerpos pero presentan un puente disulfuro C terminal para estabilización adicional (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)). Los denominados triomab, que son moléculas de IgG completas híbridas de ratón/rata y que también se están evaluando actualmente en ensayos clínicos, representan un formato de tamaño más grande (revisado en Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)).

La variedad de formatos que se están desarrollando muestra el gran potencial atribuido al redireccionamiento y activación de linfocitos T en inmunoterapia. Sin embargo, la tarea de generar anticuerpos biespecíficos adecuados para esto no es de ninguna manera trivial, sino que implica varios retos que se han de cumplir relacionados con eficacia, toxicidad, aplicabilidad y producibilidad de los anticuerpos.

Las construcciones pequeñas tales como, por ejemplo, las moléculas BiTE (aunque pueden reticular eficazmente células diana y efectoras) tienen una semivida en suero muy corta, lo que requiere que se administren a los pacientes por infusión continua. Por otra parte, los formatos de tipo IgG (aunque tienen el gran beneficio de una semivida larga) experimentan toxicidad asociada con las funciones efectoras naturales inherentes de las moléculas de IgG. Su potencial inmunogénico constituye otro rasgo característico desfavorable de los anticuerpos biespecíficos de tipo IgG, especialmente los formatos no humanos, para un desarrollo terapéutico exitoso. Finalmente, un reto principal en el desarrollo general de anticuerpos biespecíficos ha sido la producción de construcciones de anticuerpos biespecíficos en una cantidad y pureza clínicamente suficientes, debido al emparejamiento incorrecto de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de especificidades diferentes tras la coexpresión, lo que disminuye el rendimiento de la construcción correctamente ensamblada y da como resultado varios productos secundarios no funcionales de los que puede ser difícil separar el anticuerpo biespecífico deseado.

Jackman et al. (JBC 285 (2010), 20850-20859) describen el desarrollo de una estrategia de dos partes para identificar un anticuerpo biespecífico humano terapéutico que inhibe la señalización del receptor de IgE. El documento US 2013/045492 A1 describe un ratón de cadena ligera común. El documento WO 98/50431 A2 describe un procedimiento para preparar anticuerpos multiespecíficos que tienen componentes heteromultiméricos y comunes. El documento WO 2014/151910 A1 describe anticuerpos biespecíficos heterodiméricos. Mezzanzanica et al. (Int J Cancer 41 (1988), 609-615) describen la lisis del carcinoma de ovario humano por linfocitos T citotóxicos dirigida por anticuerpos monoclonales biespecíficos.

Dadas las dificultades y desventajas asociadas con los anticuerpos biespecíficos actualmente disponibles para la inmunoterapia mediada por linfocitos T, sigue existiendo la necesidad de obtener formatos mejorados novedosos de dichas moléculas.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, en la que el primer resto de unión a antígeno comprende una primera cadena ligera y en la que el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, en la que el antígeno activador de linfocitos T es CD3, y el segundo resto de unión a antígeno comprende una segunda cadena ligera y en la que el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en el que el antígeno de célula diana es el receptor 1 de folato (FolR1), en la que la secuencia de aminoácidos de la primera y la segunda cadena ligera es idéntica, en la que la primera y la segunda cadena ligera comprende las CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, en la que el primer resto de unión a antígeno es un Fab y el segundo resto de unión a antígeno es un Fab.

En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, uno de los cuales es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y el otro de los cuales es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en la que la primera y la segunda molécula Fab tienen cadenas ligeras VLCL idénticas.

En un modo de realización, dicha molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.

En un modo de realización, dicha molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, dicha molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T comprende una cadena pesada que comprende las CDR de la cadena pesada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39.

En un modo de realización particular, no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T está presente en la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (es decir, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T proporciona unión monovalente al antígeno activador de linfocitos T).

En algunos modos de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico. En un modo de realización de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. Aún en otro modo de realización de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena ligera de Fab al extremo N de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno.

Aún en otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena ligera de Fab al extremo N de la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En otro modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc.

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización, dicho tercer resto de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una cadena ligera VLCL idéntica al primer y segundo resto de unión a antígeno.

En un modo de realización de este tipo, el primer, segundo y tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab que comprende las CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.

En un modo de realización de este tipo, el primer, segundo y tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab que comprende una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización particular, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno activadora de linfocitos T se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En otro modo de realización particular, el primer y el tercer resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno activadora de linfocitos T se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se pueden fusionar directamente o a través de enlaces peptídicos adecuados. En un modo de realización, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización, el primer y el tercer resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4.

En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otro modo de realización específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización incluso más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende la sustitución aminoacídica S228P. En un modo de realización incluso más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende las sustituciones aminoacídicas L235E y S228P (SPLE). En modos de realización particulares, el dominio Fc es un dominio Fc humano.

En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización específico de este tipo, un residuo aminoacídico del dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y un residuo aminoacídico del dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede colocar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad.

En un modo de realización particular, el dominio Fc presenta una afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. En determinados modos de realización, el dominio Fc se genomanipula para que tenga afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora. En un modo de realización, la una o más sustituciones aminoacídicas en el dominio Fc que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora están en una o más posiciones seleccionadas del grupo de L234, L235 y P329 (numeración de Kabat). En modos de realización particulares, cada subunidad del dominio Fc comprende tres sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora en la que dichas sustituciones aminoacídicas son L234A, L235A y P329G. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgGi, en particular un dominio Fc de IgGi humana. En otros modos de realización, cada subunidad del dominio Fc comprende dos sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora en la que dichas sustituciones aminoacídicas son L235E y P329G. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4, en particular un dominio Fc de IgG4 humana.

En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es FcYRIIa, FcyRI y/o FcYRIIIa humano. En un modo de realización, la función efectora es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

En otros modos de realización, el antígeno de célula diana al que se puede unir la molécula de unión a antígeno biespecífica es un antígeno de célula tumoral.

En otro aspecto se proporciona una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 para su uso en una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. En un modo de realización, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

En otro aspecto se proporciona una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 para su uso en una colección para la producción de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. En un modo de realización, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

En otro aspecto se proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

En otro aspecto se proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención. La invención proporciona además un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la invención, y una célula huésped que comprende el polinucleótido aislado o el vector de expresión de la invención. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula eucariota, en particular una célula de mamífero.

En otro aspecto se proporciona un procedimiento de producción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y b) recuperar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. La invención también engloba una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T producida por el procedimiento de la invención.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se engloban por la invención procedimientos de uso de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y la composición farmacéutica de la invención. En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o una composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento. En un aspecto se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita el mismo. En un modo de realización específico, la enfermedad es cáncer.

En cualquiera de los modos de realización anteriores, el individuo preferentemente es un mamífero, en particular un ser humano.

En otro aspecto se proporciona un procedimiento para identificar una cadena pesada variable para su uso en una molécula de unión a antígeno biespecífica que es específica para un antígeno de activación de linfocitos T y un antígeno de célula diana, que comprende la etapa de cribado de una colección combinatoria que comprende cadenas pesadas variables con una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34. En un aspecto, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. En un aspecto, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-I ilustran configuraciones ejemplares de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T (TCB) divulgadas en el presente documento. Todas las construcciones, excepto el formato kappalambda en (Fig. 11) tienen mutaciones P329G LALA y comprenden fragmentos Fc de botón en ojal con modificaciones de botón en ojal. (Fig. 1A) Ilustración de la "TCB FolR1 2+1, invertido (cadena ligera común)". La proteína de unión a FolR1 se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. Estas construcciones no se cruzan y tienen tres veces la misma cadena ligera VLCL. (Fig. 1B) Ilustración de la "TCB FolR1 1 1, cabeza a cola (cadena ligera común)". Estas construcciones no se cruzan y tienen dos veces la misma cadena ligera VLCL. (Fig. 1C) Ilustración de la "TCB FolR1 1+1, clásico (cadena ligera común)". Estas construcciones no se cruzan y tienen dos veces la misma cadena ligera VLCL. (Fig. 1D) Ilustración de la "TCB FolR1 2+1, clásico (cadena ligera común)". La proteína de unión a CD3 se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. Estas construcciones no se cruzan y tienen tres veces la misma cadena ligera VLCL. (Fig. 1E) Ilustración de la "TCB FolR1 2+1 crossfab, clásico". Estas construcciones comprenden una cadena Ck-VH para la proteína de unión a CD3 en lugar de la cadena CH1-VH convencional. La proteína de unión a CD3 se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. (Fig. 1F) Ilustración de la "TCB FolR1 2+1 crossfab, invertido". Estas construcciones comprenden una cadena Ck-VH para la proteína de unión a CD3 en lugar de la cadena CH1-VH convencional. La proteína de unión a FolR1 se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón. (Fig. 1G) Ilustración de la "TCB FolR1 1+1 crossfab, cabeza a cola". Estas construcciones comprenden una cadena Ck-VH para la proteína de unión a CD3 en lugar de la cadena CH1-VH convencional. (Fig. 1H) Ilustración de la "TCB FolR1 1 1 crossfab, clásico". Estas construcciones comprenden una cadena Ck-VH para la proteína de unión a CD3 en lugar de la cadena CH1-VH convencional. La figura 1I ilustra el formato de anticuerpo CD3/FolR1 kappa-lambda. Estas construcciones comprenden una cadena ligera común cruzada VLCH1 y una cadena VHCL cruzada específica para CD3 y una cadena VHCL cruzada específica para FolR1.

Las figuras 2A-C representan gráficos que resumen la unión de proteínas de unión a IgG FolR1 a las células HeLa. La unión de las proteínas de unión a FolR1 recién generadas a FolR1 expresado en células HeLa se determinó por citometría de flujo. Los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo secundario anti-humano marcado con fluorescencia.

Las figuras 3A-B representan gráficos que resumen la especificidad de proteínas de unión a FolR1 por FolR1. La unión de las IgG FolR1 a las células HEK transfectadas de forma transitoria con FolR1 o FolR2 se analizó por citometría de flujo para identificar clones que se unen específicamente a FolR1 y no a FolR2. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo secundario anti-humano marcado con fluorescencia.

Las figuras 4A-B representan gráficos que resumen la reactividad cruzada de proteínas de unión a FolR1 contra cyFolR1. La reactividad cruzada de los anticuerpos anti-FolR1 contra FolR1 de macaco se abordó en células HEK transfectadas de forma transitoria con cyFolR1 por citometría de flujo. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo secundario anti-humano marcado con fluorescencia.

La figura 5 representa un gráfico que ilustra la internalización de las TCB FolR1 después de la unión. La internalización de las cuatro TCB FolR1 después de la unión a FolR1 se sometió a prueba en células HeLa. Las TCB FolR1 restantes en la superficie se detectaron con un anticuerpo secundario anti-humano marcado con fluorescencia después de los puntos temporales de incubación indicados a 37 °C. Se calculó el porcentaje de internalización.

Las figuras 6A-E representan gráficos que resumen la unión de las IgG FolR1 a células con diferentes niveles de expresión de FolR1. La unión de las IgG 9D11, 16D5 y Mov19 a células tumorales con diferentes niveles de expresión de FolR1 se analizó por citometría de flujo. La IgG DP47 se incluyó como control de isotipo y MKN-45 se incluyó como línea celular negativa para FolR1. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo secundario anti-humano marcado con fluorescencia.

Las figuras 7A-L representan gráficos que resumen la destrucción mediada por linfocitos T de células HT-29 y SKOV3. Las TCB FolR1 se usaron para someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales HT-29 y SKOV3 y la regulación por incremento del marcador de activación en linfocitos T tras la destrucción. (Figs. 7A-D) La destrucción mediada por linfocitos T de células HT-29 y SKOV3 en presencia de TCB FolR1 9D11 y t Cb FolR1 16d 5 se midió por liberación de LDH después de 24 h y 48 h. La TCB DP47 se incluyó como control negativo. Después de 48 h de incubación, la regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD8 y linfocitos T CD4 tras la destrucción de células tumorales SKOV3 (Fig. 7E-H) o HT-29 (Fig. 7I-L) se evaluó por citometría de flujo.

La figura 8 representa un gráfico que muestra la ausencia de unión anti-FolR1 a los eritrocitos. Los eritrocitos se seleccionaron como población positiva para CD235a y la unión de IgG 9D11, IgG 16D5, IgG Mov19 e IgG DP47 a esta población se determinó por citometría de flujo. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo secundario anti humano marcado con fluorescencia.

Las figuras 9A-D representan gráficos que resumen la regulación por incremento del marcador de activación en sangre completa. La regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 de linfocitos T CD4 y linfocitos T CD824 h después de la adición de TCB FolRI 9D11, TCB FolRI 16D5, TCB FolRI Mov19 y TCB DP47 se analizó por citometría de flujo.

Figura 10 Unión de variantes aglucosiladas de TCB 9D11 a células HeLa. La unión de variantes aglucosiladas de TCB FolR1 9D11 a células HeLa se comparó con la unión de la TCB 9D11 original en células HeLa. Los anticuerpos se detectaron con un anticuerpo secundario anti-humano marcado con fluorescencia y la unión se determinó por citometría de flujo.

Las figuras 11A-F representan gráficos que resumen la destrucción mediada por linfocitos T con variantes aglucosiladas de TCB FolR1 9D11 de células tumorales. Se usaron variantes aglucosiladas de TCB FolR1 9D11 para someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales (Fig. 11A-D) SKOV3, MKN-45 (como control negativo de FolR1) y (Fig. 11E-F) HT-29 en comparación con la destrucción con la TCB FolR1 9D11 original. Como valor de lectura se usó la liberación de LDH después de 24 h y 48 h.

Las figuras 12A-X representan gráficos que resumen la destrucción mediada por linfocitos T de células epiteliales primarias. Se usaron células epiteliales primarias con niveles muy bajos de FolR1 para someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T con Tc B FolR1 16D5 y TCB FolR1 9D11, Tc B DP47 se incluyó como control negativo y las células HT29 se incluyeron como control positivo. (Figs. 12A-H) La liberación de LDH de células del pigmento retiniano humano (HRP), corticales renales humanas (HRC), bronquiales humanas (HB) y de células HT29 se determinó después de 24 h y 48 h. La regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 tras la destrucción de (Figs. 12I-L) HRP, (Figs. 12M-P) HRC, (Figs. 12Q-T) HB y (Figs. 12U-X) HT29 se determinó después de 48 h por citometría de flujo.

Las figuras 13A-C muestran una comparación de diferentes formatos de TCB con 16D5. Se compararon cuatro formatos de TCB diferentes que contienen la proteína de unión a FolR1 16D5 en cuanto a la unión a células HeLa (Fig. 13A), la destrucción mediada por linfocitos T de las células SKOV3 después de 24 h y 48 h (Fig. 14B) y la regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD848 h después de la destrucción (Fig. 14C).

Las figuras 14A-C representan una comparación de diferentes formatos de TCB con 9D11. Se compararon tres formatos de TCB diferentes que contienen la proteína de unión a FolR1 9D11 en cuanto a la unión a células HeLa (A), la destrucción mediada por linfocitos T de las células SKOV3 después de 24 h y 48 h (B) y la regulación por incremento de los marcadores de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD848 h después de la destrucción (C).

La figura 15 representa un perfil farmacocinético de TCB FolR1 en ratones NOG para tres dosis diferentes.

La figura 16 ilustra un protocolo experimental para el estudio de eficacia con TCB FolR1.

Las figuras 17A-B representan curvas de crecimiento tumoral. (Fig. 17A) Valores medios y SEM de los volúmenes tumorales en los diferentes grupos de tratamiento. (Fig. 17B) Crecimiento tumoral de ratones individuales en todos los grupos de tratamiento. TG1 (inhibición del crecimiento tumoral) proporciona el porcentaje del volumen tumoral medio en comparación con el grupo de vehículo.

La figura 18 muestra los pesos de los tumores al finalizar el estudio.

Las figuras 19A-B muestran el análisis FACS de linfocitos T infiltrantes de tumor el día 32 del estudio. (Fig. 19A) Se tiñeron suspensiones de células individuales tumorales con anticuerpo anti-CD3/CD4/CD8 humano y se analizaron por citometría de flujo. (Fig. 19B) Valores medios y SEM de recuentos de linfocitos T por mg de tejido tumoral en diferentes grupos de tratamiento.

Las figuras 20A-B muestran el análisis FACS para la activación/desgranulación de linfocitos T y la secreción de citocinas el día 32 del estudio. Los linfocitos T infiltrantes de tumor CD4+ (Fig. 20A) y CD8+ (Fig. 20B) se tiñeron para citocinas, marcadores de activación y desgranulación. Se muestran los valores medios y la SEM de los recuentos de linfocitos T por mg de tejido tumoral en diferentes grupos de tratamiento.

Las figuras 21A-B muestran el porcentaje de lisis tumoral. Las células SKOV3 se incubaron con PBMC en presencia de TCB DP47 o TCB FolR1 kappa lambda. Después de 24 h (Fig. 21 A) y 48 h (Fig. 21B) se determinó la destrucción de células tumorales midiendo la liberación de LDH.

Las figuras 22A-D muestran la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4. Las células SKOV3 se incubaron con PBMC en presencia de TCB DP47 o TCB FolR1 kappa lambda. Después de 48 h, se midió la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 (Fig. 22A-B) y linfocitos T CD8 (Fig. 22C-D) por citometría de flujo.

Las figuras 23A-B muestran el porcentaje de lisis tumoral. Destrucción por linfocitos T de células SKov-3 (expresión media de FolRI) inducida por TCB 36F2, TCB Mov19 y TCB 21A5 después de 24 h (Fig. 23A) y 48 h (Fig. 23B) de incubación (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos).

Las figuras 24A-C muestran la destrucción por linfocitos T inducida por TCB 36F2, TCB 16D5, TCB 16D5 clásica, TCB 16D5 1 1 y TCB 16D5 HT de células tumorales humanas HeLa (expresión alta de FolR1) (Fig. 24A), Skov-3 (expresión media de FolR1) (Fig. 24B) y HT-29 (expresión baja de FolR1) (Fig. 24C) (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos, tiempo de incubación 24 h). La TCB DP47 se incluyó como control de unión negativa.

Las figuras 25A-C muestran la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T humanos CD8+ (Fig. 25A, B) y CD4+ (Fig. 25C) después de la destrucción mediada por linfocitos T de células HeLa (expresión alta de FolR1) (Fig. 25A), células SKov-3 (expresión media de FolR1) (Fig. 25B) y células HT-29 (expresión baja de FolR1) (Fig. 25C) (E:T = 10:1, 48 h de incubación) inducida por TCB 36f2, TCB 16d 5 y TCB DP47 (control de unión negativa).

Las figuras 26A-F muestran la destrucción por linfocitos T inducida por TCB 36F2, TCB 16D5 y TCB DP47 de células epiteliales corticales renales humanas (Fig. 26A, B), células epiteliales de pigmento retiniano humanas (Fig. 26C, D) y células HT-29 (Fig. 26E, F) después de 24 h (Fig. 26A, C, E) y 48 h (Fig. 26B, D, F) de incubación (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos).

La figura 27 representa una tabla que resume la cuantificación de los sitios de unión a FolR1 en diversas líneas celulares normales y cancerosas.

Las figuras 28A-B muestran la unión de TCB 16D5 y sus correspondientes variantes de desamidación de CD3 TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA y de TCB 9D11 y sus variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA a CD3 humano expresado en células Jurkat.

Las figuras 29A-B muestran la destrucción por linfocitos T de células tumorales humanas SKov-3 (expresión media de FolR1) inducida por TCB 16D5 y sus correspondientes variantes de desamidación de CD3 TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA (Fig. 29A) y por TCB 9D11 y sus variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA (Fig. 29B) (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos, tiempo de incubación 24 h). La TCB DP47 se incluyó como control de unión negativa.

Las figuras 30A-B muestran la destrucción por linfocitos T de células tumorales humanas HT-29 (expresión baja de FolR1) inducida por TCB 16D5 y sus correspondientes variantes de desamidación de CD3 TCB 16d 5 N100A y TCB 16D5 S100aA (Fig. 30A) y por Tc B 9D11 y sus variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA (Fig. 30B) (E:T = 10:1, PBMC efectores humanos, tiempo de incubación 24 h). La TCB DP47 se incluyó como control de unión negativa.

La figura 31 muestra una alineación de secuencias de los dominios VH de las 3 proteínas de unión específicas de MUC1 identificadas. Los tres clones son derivados de la línea germinal IGHV3-23 (SEQ ID NO: 136). El clon 58D6 (SEQ ID NO: 60) y el clon 110A5 (SEQ ID NO: 64) se originan en una colección que solo se aleatorizó en CDR3, mientras que el clon 106D2 (SEQ ID NO: 62) se identificó en una colección aleatorizada en las 3 CDR. Las posiciones en CDR1 y 2 que se desvían de la secuencia de la línea germinal se imprimen en cursiva.

Las figuras 32A-B muestran resultados de caracterización de proteínas de unión CLC. (Fig. 32A) Análisis por SPR. Análisis cinéticos basados en SPR de 3 clones que se unen específicamente a MUC1. Las líneas suaves representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. (Fig. 32B) Resumen de parámetros cinéticos y termodinámicos.

La figura 33 representa un diagrama esquemático de la construcción de TCB generada. La construcción TCB CLC consiste en 3 cadenas de inmunoglobulina diferentes: 1) una cadena pesada de IgG que alberga las "mutaciones de ojal" en la parte Fc y que contiene el dominio VH específico de la diana; 2) una cadena de Ig que consiste en el dominio VH específico de la diana y un dominio CH1, seguido del dominio VH específico de CD3 y un dominio CH1, seguido de la parte Fc que contiene las mutaciones de "botón"; y 3) la cadena ligera común que se une tanto a las secuencias específicas de MUC1 como a las específicas de CD3.

Las figuras 34A-B representan la purificación y caracterización analítica de las TCB específicas de MUC1 producidas (Fig. 34A y Fig. 34B). El procedimiento de purificación implicó una etapa de afinidad (proteína A) seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare). El producto final se analizó y caracterizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño (columna Superdex 200) y por electroforesis capilar.

La figura 35 representa el análisis por SPR de las proteínas de unión específicas de MUC1 en el formato de TCB. Se muestra la unión de 2 TCB específicas de MUC1 a diferentes concentraciones (véase el texto) a MUC1 o a un antígeno no relacionado. Las líneas suaves representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.

Las figuras 36A-G representan anticuerpos bivalentes y trivalentes biespecíficos que comprenden solo los fragmentos Fab (específicos de CD3 y BCMA) con o sin una parte Fc como se especifica: (A) Fab BCMA-Fc-Fab CD3; (B) Fab BCMA-Fc-Fab CD3-Fab BCMA; (C) Fab BCMA-Fc-Fab BCMA-Fab CD3; (D) Fc-Fab CD3-Fab BCMA; (E) Fc-Fab BCMA-Fab CD3; (F) Fab CD3-Fab BCMA-Fab BCMA; (G) Fab CD3-Fab BCMA. Preferentemente, las LC de Fab CD3 y Fab BCMA son idénticas (LC común) para evitar el emparejamiento erróneo de LC y reducir los productos secundarios. El Fab CD3 y Fab BCMA están vinculados entre sí con conectores flexibles.

La figura 37 representa la ausencia de unión del anticuerpo IgG BCMA al receptor TACI detectada por resonancia de plasmón superficial (SPR). La curva 1 corresponde a la señal en el canal de referencia, la curva 2 al canal donde se produce la unión (canal de unión) y la curva 2-1 es la señal restada (canal de unión - canal de referencia), lo que significa que esta es la señal debida al acontecimiento de unión. El ensayo de unión por SPR demostró claramente que la IgG pSCHLI372 no se unía al receptor TACI humano.

Las figuras 38A-C muestran la producción y purificación de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA. Gráficos CE-SDS (no reducido (superior) y reducido (inferior)) de las preparaciones de proteína final después de las etapas de purificación por cromatografía de afinidad por proteína A (PA) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) aplicadas a (A) pSCHLI333-TCB CLC, (B) pSCHLI372-TCB CLC, (C) pSCHLI373-TCB CLC. Las tres moléculas son de formato molecular como se describe en la figura 36B.

Las figuras 39A-B muestran la unión de los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA en células H929 positivas para BCMA con alto nivel de expresión por citometría de flujo. La mediana de la intensidad de fluorescencia de los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA se representaron en función de las concentraciones de anticuerpos (0,12 a 500 nM); (A) pSCHLI372-TCB CLC y pSCHLI373-TCB CLC en células H929 (A) y células MKN45 (B). DP47-TCB es una TCB de control negativo que no se unió a BCMA a concentraciones inferiores a 100 nM (véase el ejemplo 7).

Las figuras 40A-B muestran la unión de los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA en linfocitos T Jurkat positivos para CD3 medida por citometría de flujo. Mediana de la intensidad de fluorescencia para los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (pSCHLI372-TCB CLC y pSCHLI373-TCB CLC) que se unen a linfocitos T Jurkat y representada en función de la concentración de anticuerpos. No se une a las células MKN45 negativas para BCMa y negativas para CD3 a concentraciones inferiores a 100 nM.

La figura 41 muestra la activación de linfocitos T mediada por anticuerpos TCB CLC anti-BCMA en presencia de células H929 detectada por citometría de flujo. Nivel de expresión del marcador de activación temprana CD69 y del marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD4+ y CD8+ después de 48 horas de incubación. Los anticuerpos pSCHLI372-TCB CLC y pSCHLI373-TCB CLC indujeron una regulación por incremento de los marcadores de activación CD69 y CD25 de manera específica y dependiente de la concentración en presencia de células diana positivas para BCMA. Proporción E:T usada como 10 PBMC:1 célula H929; las células se incubaron durante 48 h antes de la medición de la regulación por incremento de CD69 y CD25. DP47-TCB, que es una TCB de control negativo, no indujo la activación de linfocitos T. Los resultados representativos son de dos experimentos independientes.

Las figuras 42A-B muestran que los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA inducen la destrucción redirigida por linfocitos T de células de mieloma H929 positivas para BCMA con alto nivel de expresión, como se detecta mediante el ensayo colorimétrico de liberación de LDH. Los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA pSCHLI372-TCB CLC (A, B) y pSCHLI373-TCB CLC (A) indujeron una destrucción dependiente de la concentración de células de mieloma H929 positivas para BCMA con alto nivel de expresión, medida por la liberación de LDH. DP47-TCB, que es una TCB de control negativo que no se une a BCMA sino solo a CD3, no indujo la destrucción de células H929. Proporción E:T usada como 10 PBMC:1 célula H929; las células se incubaron durante 24 h antes de medir la liberación de LDH. Los resultados representativos son de tres experimentos independientes.

La figura 43 muestra que los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA inducen la destrucción redirigida por linfocitos T de células de mieloma U266 positivas para BCMA con nivel de expresión medio/bajo, como se detecta mediante el ensayo colorimétrico de liberación de LDH. Los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA pSCHLI372-TCB CLC y pSCHLI373-TCB CLC indujeron una destrucción dependiente de la concentración de células de mieloma U266 positivas para BCMA con nivel de expresión medio/bajo, medida por la liberación de LDH. DP47-TCB, que es una TCB de control negativo que no se une a BCMA sino solo a CD3, no indujo la destrucción de células H929. Proporción E:T usada como 10 PBMC:1 célula U266; las células se incubaron durante 24 h antes de medir la liberación de LDH. Los resultados representativos son de dos experimentos independientes.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Los términos se usan en el presente documento como se usan en general en la técnica, a menos que se defina de otro modo a continuación.

Como se usa en el presente documento, el término "molécula de unión a antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Ejemplos de moléculas de unión a antígeno son inmunoglobulinas y derivados, por ejemplo, fragmentos, de las mismas.

El término "biespecífica" quiere decir que la molécula de unión a antígeno se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula de unión a antígeno biespecífica comprende dos sitios de unión a antígeno, cada uno de los cuales es específico para un determinante antigénico diferente. En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente a dos determinantes antigénicos, en particular dos determinantes antigénicos expresados en dos células distintas.

El término "valente" como se usa en el presente documento indica la presencia de un número especificado de sitios de unión a antígeno en una molécula de unión a antígeno. Como tal, el término "unión monovalente a un antígeno" indica la presencia de un (y no más de un) sitio de unión a antígeno específico para el antígeno en la molécula de unión a antígeno.

Un "sitio de unión a antígeno" se refiere al sitio, es decir, uno o más residuos aminoacídicos, de una molécula de unión a antígeno que proporciona interacción con el antígeno. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende residuos aminoacídicos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Una molécula de inmunoglobulina natural típicamente tiene dos sitios de unión a antígeno, una molécula Fab típicamente tiene un único sitio de unión a antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "resto de unión a antígeno" se refiere a una molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un modo de realización, un resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que se une (por ejemplo, un segundo resto de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. En otro modo de realización, un resto de unión a antígeno puede activar la señalización a través de su antígeno diana, por ejemplo, un antígeno del complejo receptor de linfocitos T. Los restos de unión a antígeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, como se define adicionalmente en el presente documento. Los restos de unión a antígeno particulares incluyen un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno pueden comprender regiones constantes de anticuerpo, como se define adicionalmente en el presente documento y es conocido en la técnica. Las regiones constantes de la cadena pesada útiles incluyen cualquiera de los cinco isotipos: a, 6, £, y o p. Las regiones constantes de la cadena ligera útiles incluyen cualquiera de los dos isotipos: k y A.

Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo de resto de unión a antígeno-antígeno. Se pueden encontrar determinantes antigénicos útiles, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células afectadas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (ECM). Las proteínas denominadas antígenos en el presente documento (por ejemplo, MCSP, FAP, CEA, EGFR, CD33, CD3) pueden ser cualquier forma natural de las proteínas de cualquier fuente de vertebrados, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando se hace referencia a una proteína específica en el presente documento, el término engloba la proteína no procesada "de longitud completa", así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. Las proteínas humanas ejemplares útiles como antígenos incluyen, pero no se limitan a, el receptor 1 de folato (FolRI), receptor alfa de folato (FRA); proteína de unión a folato (FBP); FolRI humano (UniProt n.°: P15328); FolRI murino (UniProt n.°: P35846); FolRI de macaco (UniProt n.°: G7pR14), mucina-1 (MUC1) y antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA), y CD3, en particular la subunidad épsilon de CD3 (véase UniProt n.° P07766 (versión 130), NCBI RefSeq n.° NP_000724.1 para la secuencia humana; o UniProt n.° Q95LI5 (versión 49), NCBI GenBank n.° BAB71849.1 para la secuencia de macaco cangrejero [Macaca fascicularis]).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se une a un epítopo de un antígeno activador de linfocitos T o un antígeno de célula diana que se conserva entre el antígeno activador de linfocitos T o el antígeno de célula diana de diferentes especies.

Por "unión específica" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un resto de unión a antígeno de unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR) (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). En un modo de realización, el grado de unión de un resto de unión a antígeno a una proteína no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 % de la unión del resto de unión a antígeno al antígeno medida, por ejemplo, mediante SPR. En determinados modos de realización, un resto de unión a antígeno que se une al antígeno, o una molécula de unión a antígeno que comprende ese resto de unión a antígeno, tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un receptor) y su compañero de unión (por ejemplo, un ligando). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, un resto de unión a antígeno y un antígeno, o un receptor y su ligando). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (SPR).

"Unión reducida", por ejemplo, unión reducida a un receptor de Fc, se refiere a una disminución en la afinidad para la interacción respectiva, como se mide, por ejemplo, por SPR. Por claridad, el término incluye también la reducción de la afinidad hasta cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la supresión completa de la interacción. A la inversa, "unión incrementada" se refiere a un incremento en la afinidad de unión para la interacción respectiva.

Un "antígeno activador de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico expresado en la superficie de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, que puede inducir la activación de linfocitos T tras la interacción con una molécula de unión a antígeno. Específicamente, la interacción de una molécula de unión a antígeno con un antígeno activador de linfocitos T puede inducir la activación de linfocitos T desencadenando la cascada de señalización del complejo receptor de linfocitos T. En un modo de realización particular, el antígeno activador de linfocitos T es CD3.

"Activación de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a una o más respuestas celulares de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionadas de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención pueden inducir la activación de linfocitos T. Los ensayos adecuados para medir la activación de linfocitos T son conocidos en la técnica descrita en el presente documento.

Un "antígeno de célula diana" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de una célula diana, por ejemplo, una célula en un tumor tal como una célula cancerosa o una célula del estroma tumoral. Como se usa en el presente documento, los términos "primero" y "segundo" con respecto a los restos de unión a antígeno, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando hay más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no pretende conferir una orientación u orden específico de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T a menos que así se establezca explícitamente.

El término "BCMA", como se usa en el presente documento, se refiere a la diana de maduración de linfocitos B humanos, también conocido como BCMA; TR_17HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), que es un miembro de la superfamilia de receptores de necrosis tumoral que se expresa preferentemente en células plasmáticas diferenciadas. El dominio extracelular de BCMA consiste, de acuerdo con UniProt, en los aminoácidos 1-54 (o 5-51). El término "anticuerpo contra BCMA, anticuerpo anti-BCMA", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a BCMa .

El término "CD3s o CD3", como se usa en el presente documento, se refiere a CD3s humano descrito en UniProt P07766 (CD3_E HUMAN). El término "anticuerpo contra CD3, anticuerpo anti-CD3" se refiere a un anticuerpo que se une a CD3s.

Una "molécula Fab" se refiere a una proteína que consiste en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada (la "cadena pesada de Fab") y el dominio VL y Cl de la cadena ligera (la "cadena ligera de Fab") de una inmunoglobulina. El término "moléculas Fab que tienen cadenas ligeras VLCL idénticas", como se usa en el mismo, se refiere a proteínas de unión que comparten una cadena ligera, pero que aún tienen especificidades separadas. Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención comprenden al menos dos moléculas Fab que tienen cadenas ligeras VLCL idénticas. Las cadenas pesadas correspondientes se remodelan y confieren unión específica a un antígeno biespecífico activador de linfocitos T y un antígeno de célula diana, respectivamente.

Por "fusionado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, una molécula Fab y una subunidad de dominio Fc) se unen por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.

El término "cadena ligera común", como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena ligera que, dentro de una molécula biespecífica o multiespecífica, se empareja con más de una cadena pesada o fragmento de la misma para formar al menos un primer y un segundo sitio de unión a antígeno, por ejemplo, un Fab, cada uno específico para un antígeno diferente. Por ejemplo, la cadena ligera común se empareja con una primera cadena pesada o fragmento de la misma dentro de una molécula de unión a antígeno para formar un primer sitio de unión específico para un antígeno tumoral, y otra copia de la cadena ligera común se empareja con una segunda cadena pesada o fragmento de la misma dentro de una molécula de unión a antígeno para formar un segundo sitio de unión específico para un antígeno activador de linfocitos T, por ejemplo, CD3.

El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al extremo C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio variable pesado o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados regiones constantes de la cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al extremo C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio variable ligero o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio constante ligero (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 6 (IgD), £ (IgE), y (IgG) o p (IgM), algunos de los cuales se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, Y1 (IgG1), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), a1 (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), basados en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, unidos por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv) y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, etal., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para obtener un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. Uu . n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden elaborar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria de parte o la totalidad de un antígeno. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). En particular, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH).

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles definidos estructuralmente ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos aminoacídicos de los bucles hipervariables y/o de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), siendo las últimas las de variabilidad de secuencia más alta y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) y Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987) han descrito esta región particular, donde las definiciones incluyen residuos aminoacídicos superpuestos o subconjuntos de los mismos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y se usa en el presente documento. Los residuos aminoacídicos apropiados que engloban las CDR, como se define en cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla A como comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria los residuos que comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA A. Definiciones de CDR1

1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla A está de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).

2 "AbM" con una "b" minúscula como se usa en la tabla A se refiere a las CDR definidas por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.

Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para secuencias de región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en una región variable de anticuerpo están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Las secuencias polipeptídicas del listado de secuencias no se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, está dentro de la habilidad del experto en la técnica convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de Kabat.

La "región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y f R4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

La "clase" de un anticuerpo o inmunoglobulina se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, ó, £, y y H, respectivamente.

El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente para que se extienda desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxiterminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante está de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991. Una "subunidad" de un dominio Fc, como se usa en el presente documento, se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que se pueden autoasociar de manera estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH2 de IgG y uno CH3 de IgG.

Una "modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de una subunidad del dominio Fc que reduce o evita la asociación de un polipéptido que comprende la subunidad del dominio Fc con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la asociación, como se usa en el presente documento, en particular incluye modificaciones separadas realizadas en cada una de las dos subunidades del dominio Fc que se desean asociar (es decir, la primera y la segunda subunidad del dominio Fc), en la que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de las dos subunidades del dominio Fc. Por ejemplo, una modificación que promueve la asociación puede alterar la estructura o carga de una o ambas subunidades del dominio Fc para hacer que su asociación sea estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. Por tanto, se produce (hetero)dimerización entre un polipéptido que comprende la primera subunidad del dominio Fc y un polipéptido que comprende la segunda subunidad del dominio Fc, que podría no ser idéntico en el sentido de que otros componentes fusionados a cada una de las subunidades (por ejemplo, restos de unión a antígeno) no son iguales. En algunos modos de realización, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica en el dominio Fc, específicamente una sustitución aminoacídica. En un modo de realización particular, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc.

El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques.

El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación se puede realizar para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión reducida a un receptor de Fc o asociación incrementada con otro péptido. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Mutaciones aminoacídicas particulares son sustituciones aminoacídicas. Con el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de una región Fc, son en particular preferentes las sustituciones aminoacídicas no conservadoras, es decir, el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones aminoacídicas incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida al sitio, PCR, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de genomanipulación, tales como modificación química. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación aminoacídica. Por ejemplo, una sustitución de prolina en la posición 329 del dominio Fc por glicina se puede indicar como 329G, G329, G329, P329G o Pro329Gly.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o de manera intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones del polipéptido posteriores a la expresión, incluyendo, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química. Un polipéptido de la invención puede ser de un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan desplegados.

Por un polipéptido "aislado" o una variante o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar de su entorno natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para el propósito de la invención, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derecho de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Se establecen todos los parámetros de comparación de secuencias por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que, si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

El término "polinucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterógenas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de la presente invención, así como formas de hebras positivas y negativas y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.

Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos de la secuencia de referencia se pueden delecionar o sustituir por otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta un 5 % de los nucleótidos totales de la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como una cuestión práctica, si cualquier secuencia polinucleotídica particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de la presente invención, se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, ALIGN-2).

El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados modos de realización, el casete de expresión de la invención comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.

El término "vector" o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula diana. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión de la presente invención comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que está codificada por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión de la invención comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado.

Un "receptor de Fc activador" es un receptor de Fc que, después del acoplamiento por un dominio Fc de un anticuerpo, provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula portadora del receptor para que realice funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores humanos incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de células diana recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células diana son células a las que se unen específicamente anticuerpos o derivados de los mismos que comprenden una región Fc, en general por medio de la parte proteica que es N terminal a la región Fc. Como se usa en el presente documento, el término "ADCC reducida" se define como una reducción en el número de células diana que se lisan en un tiempo dado, a una concentración de anticuerpo dada en el medio circundante a las células diana, por el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o bien un incremento en la concentración de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, requerido para lograr la lisis de un número dado de células diana en un tiempo dado, por el mecanismo de ADCC. La reducción en la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos de producción, purificación, formulación y almacenamiento estándar (que son conocidos por los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado. Por ejemplo, la reducción en ADCC mediada por un anticuerpo que comprende en su dominio Fc una sustitución aminoacídica que reduce la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo sin esta sustitución aminoacídica en el dominio Fc. Los ensayos adecuados para medir la ADCC son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 2006/082515 o la solicitud de patente PCT n.° PCT/EP2012/055393).

Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo que se está tratando, y se puede realizar para profilaxis o bien durante la evolución de la enfermedad clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del cuadro clínico y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

Descripción detallada de los modos de realización

La presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas diseñadas para la activación y redireccionamiento de linfocitos T, que combinan buena eficacia y producibilidad con procedimientos para preparar y hacer uso de las mismas. En particular, la presente invención se refiere a moléculas biespecíficas en las que al menos dos restos de unión tienen cadenas ligeras idénticas y, en algunos modos de realización, cadenas pesadas remodeladas correspondientes que confieren la unión específica a un antígeno biespecífico activador de linfocitos T y un antígeno de célula diana, respectivamente. El uso de este llamado principio de "cadena ligera común", es decir, la combinación de dos proteínas de unión que comparten una cadena ligera, pero que aún tienen especificidades separadas, evita el emparejamiento erróneo de las cadenas ligeras. Por tanto, existen menos productos secundarios durante la producción, lo que facilita la preparación homogénea de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T.

La presente invención se refiere en particular a una cadena ligera infrecuente predefinida que contribuye significativamente a la unión a antígeno y al emparejamiento heteromultimérico con diferentes compañeros de unión, por ejemplo, cadenas pesadas y fragmentos de las mismas. Esta cadena ligera común es, por tanto, adecuada para su uso en una colección a partir de la cual se pueden preparar nuevas moléculas de unión a antígeno biespecíficas o multiespecíficas. De forma ventajosa, la cadena ligera común usada en relación con las moléculas de unión a antígeno y los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden usar para formar una molécula de unión a antígeno útil para la activación de linfocitos T. Un experto en la técnica puede admitir la eficacia ventajosa de tener dicha cadena ligera que pueda funcionar tanto en restos de unión a antígeno activador de linfocitos T como en restos de unión a antígeno diana. Esto permite la producción eficaz de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que comprenden el componente de activación de linfocitos T y un componente de unión a antígeno diana. En un modo de realización particular, la cadena ligera común es un dominio de cadena ligera constante lambda. En un modo de realización particular, la cadena ligera común es una cadena ligera lambda humana o humanizada. En un modo de realización particular, la cadena ligera común es de la familia de cadena ligera lambda 7 humana infrecuente. El uso de una cadena ligera de familia lambda, en particular, de la familia lambda 7 infrecuente fue un enfoque poco común y cabía esperar que disminuyera la probabilidad de identificar compañeros de unión de cadena pesada adecuados para crear moléculas de unión a antígeno específicas para una variedad de dianas. Por tanto, antes del trabajo del autor de la invención divulgado en el presente documento, no se sabía que una cadena ligera lambda 7 con propiedades adecuadas se podría desarrollar para una variedad de antígenos diana diferentes no relacionados, tales como, por ejemplo, FolR1, MUC1 y BCMA. Tampoco se sabía que se podría desarrollar una cadena ligera lambda para generar proteínas de unión estables, funcionales y de alta afinidad para mejorar la producción de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T con especificidad para CD3 y especificidad para un antígeno diana, donde los antígenos diana no están relacionados, por ejemplo, FolR1, MUC1 y BCMA. En un modo de realización, dicha cadena ligera común se puede usar para construir una colección de cadenas ligeras comunes (CLC) que se base en una proteína de unión a CD3 específica, no un anticuerpo de la línea germinal, para generar específicamente proteínas de unión de CD3 que contribuyan a la proteína de unión, como se describe a continuación. La ventaja de este enfoque es que permite mantener la proteína de unión a CD3 previamente identificada y validada, de modo que simplemente haya que identificar una nueva proteína de unión a antígeno diana para el resto de unión a antígeno diana de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T en base a la cadena pesada. Esto permite un enfoque modular para generar diferentes moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T con cadenas idénticas o altamente homólogas. Mientras que la cadena ligera es idéntica dentro de una molécula de unión a antígeno activadora de linfocitos T dada, las cadenas ligeras de diferentes moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T pueden ser idénticas o altamente homólogas. Por "altamente homólogas" se entiende que las cadenas ligeras de diferentes moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T producidas mediante este enfoque modular comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica. Preferentemente, las cadenas ligeras altamente homólogas de la invención tienen regiones de la cadena ligera variables idénticas y difieren solo en su región constante. Por ejemplo, en algunos modos de realización, la variabilidad de aminoácidos está confinada a la región del conector. En algunos modos de realización, la cadena ligera común comprende un dominio de cadena ligera constante kappa.

Además de las ventajas anteriores, el rendimiento de moléculas heteromultiméricas correctamente emparejadas usando este enfoque se potencia, como se explica anteriormente, porque la cadena ligera usada dentro de los restos de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T es idéntica. Dicho de otra manera, el uso de una cadena ligera común facilita la producción de estas moléculas, ya que se elimina cualquier emparejamiento erróneo de una cadena ligera con la cadena pesada incorrecta. Por tanto, se facilita el aislamiento de una especie de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T altamente pura. En un modo de realización particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T usa Fab como componentes básicos. En comparación con otros formatos, el uso de fragmentos Fab como componentes básicos a diferencia de, por ejemplo, el uso de fragmentos scFv da como resultado una mayor estabilidad térmica y la ausencia de agregación de scFv y de formación de scFv intermolecular.

Antes del trabajo de los autores de la invención descrito en el presente documento, no se sabía que se pudiera generar una cadena ligera común que no solo sirviera como cadena ligera común en una molécula biespecífica o multiespecífica, sino que también respaldara la propiedad funcional de activación de linfocitos T de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. Además, antes del trabajo de los autores de la invención descrito en el presente documento, no se sabía que se pudiera generar una cadena ligera común que contribuya significativamente a las propiedades de unión a antígeno del resto de unión a antígeno dentro de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. Una estrategia bien establecida es identificar cadenas pesadas o fragmentos de las mismas que contribuyan a la mayoría de las propiedades de unión, tal como la fuerza y la especificidad. De acuerdo con la presente invención, la cadena ligera común contribuye significativamente a las propiedades de unión. En consecuencia, en un primer aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, en la que el primer resto de unión a antígeno comprende una primera cadena ligera y en la que el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, en la que el segundo resto de unión a antígeno comprende una segunda cadena ligera y en la que el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en la que la secuencia de aminoácidos de la primera y la segunda cadena ligera es idéntica. En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno es un Fab. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es un Fab. En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, uno de los cuales es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y el otro de los cuales es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en la que la primera y la segunda molécula Fab tienen cadenas ligeras idénticas (región de cadena ligera variable y cadena ligera constante, VLCL). En un modo de realización, la cadena ligera (VLCL) comprende las CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34. En un modo de realización, dicha cadena ligera (VLCL) idéntica comprende SEQ ID NO: 35.

Formatos de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T

Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se pueden fusionar entre sí en una variedad de configuraciones. Las configuraciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, las representadas en las figuras 1A-D.

En algunos modos de realización, dicha molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable. A continuación, se describen modos de realización ejemplares de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc. Todas estas moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T comprenden al menos dos fragmentos Fab que tienen cadenas ligeras (VLCL) idénticas y que tienen cadenas pesadas (VHCL) diferentes que confieren las especificidades para dos antígenos diferentes, es decir, un fragmento Fab se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y el otro fragmento Fab se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana.

En algunos modos de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico. En un modo de realización de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. Aún en otro modo de realización de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena ligera de Fab al extremo N de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno. Aún en otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena ligera de Fab al extremo N de la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización particular de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno que comprenden cadenas ligeras (VLCL) idénticas, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización alternativo de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno que comprenden cadenas ligeras (VLCL) idénticas, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc.

Aún en otro modo de realización de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena ligera de Fab al extremo N de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno que comprenden cadenas ligeras (VLCL) idénticas, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo N de la cadena ligera de Fab al extremo C de la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En otros modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización particular de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno que comprenden cadenas ligeras (VLCL) idénticas, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En particular en estos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T. En otros modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana.

Los restos de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc o entre sí directamente o a través de un conector peptídico, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente 2-20 aminoácidos. Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los conectores peptídicos no inmunogénicos adecuados incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n (SEQ ID NO: 41), (SG4)n (SEQ ID NO: 42), (G4S)n (SEQ ID NO: 41) o G4(SG4)n (SEQ ID NO: 43), siendo "n", en general, un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4. Un conector peptídico adecuado en particular para fusionar las cadenas ligeras de Fab del primer y el segundo resto de unión a antígeno entre sí es (G4S)2 (SEQ ID NO: 44). Adicionalmente, los conectores pueden comprender (una porción de) una región bisagra de inmunoglobulina. En particular, cuando un resto de unión a antígeno se fusiona al extremo N de una subunidad del dominio Fc, se puede fusionar por medio de una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, con o sin un conector peptídico adicional.

Una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T con un único resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana es útil, en particular en casos donde se espera internalización del antígeno de célula diana después de la unión de un resto de unión a antígeno de alta afinidad. En dichos casos, la presencia de más de un resto de unión a antígeno específico para el antígeno de célula diana puede potenciar la internalización del antígeno de célula diana, reduciendo de este modo su disponibilidad.

En muchos otros casos, sin embargo, será ventajoso tener una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dos o más restos de unión a antígeno específicos para un antígeno de célula diana, por ejemplo, para optimizar la dirección al sitio diana o para permitir la reticulación de antígenos de células diana.

En consecuencia, en determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención comprende además un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente al mismo antígeno de célula diana que el primer o segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, y el segundo y tercer resto de unión a antígeno se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización preferente, el primer, segundo y tercer resto de unión a antígeno comprenden cadenas ligeras (VLCL) idénticas.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización, el primer y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer, un segundo y un tercer resto de unión a antígeno (fragmento Fab), un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en la que el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. Preferentemente, en dicho modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, y el segundo y tercer resto de unión a antígeno se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana, en el que el primer, segundo y tercer resto de unión a antígeno son fragmentos Fab que comprenden cadenas ligeras (VLCL) idénticas.

En un modo de realización, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en una molécula de inmunoglobulina que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, fusionada al extremo N de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente por medio de un conector peptídico. Preferentemente, en dicho modo de realización, la molécula de inmunoglobulina que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y la molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T comprenden cadenas ligeras (VLCL) idénticas.

El primer y el tercer resto de unión a antígeno (o el segundo y el tercer resto de unión a antígeno, respectivamente) se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un modo de realización particular, el primer y el tercer resto de unión a antígeno (o el segundo y el tercer resto de unión a antígeno, respectivamente) se fusionan cada uno al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina.

En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana. En un modo de realización, el primer y el tercer resto de unión a antígeno (o el segundo y el tercer resto de unión a antígeno, respectivamente) y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada.

Dominio Fc

El dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada unidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc se pueden asociar de manera estable entre sí. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención comprende no más de un dominio Fc.

En un modo de realización de acuerdo con la invención, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otro modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio in vivo en el brazo Fab de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). En otro modo de realización particular, el dominio Fc es humano.

Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de acuerdo con la invención comprenden diferentes restos de unión a antígeno, fusionados a una o a la otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto, las dos subunidades del dominio Fc están comprendidas típicamente en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T en producción recombinante, será ventajoso, por tanto, introducir en el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la invención comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana está en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación llamada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.

La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una cavidad correspondiente ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).

En consecuencia, en un modo de realización particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se reemplaza un residuo aminoacídico por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo aminoacídico por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede colocar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad.

La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.

En un modo de realización específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de tirosina en la posición 407 por un residuo de valina (Y407V). En un modo de realización, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de serina (T366S) y se reemplaza el residuo de leucina en la posición 368 por un residuo de alanina (L368A).

Aún en otro modo de realización, en la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 por un residuo de cisteína (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno activador de linfocitos T se fusiona (opcionalmente por medio del resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno de célula diana) a la primera subunidad del dominio Fc (que comprende la modificación de "botón"). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la fusión del resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno activador de linfocitos T a la subunidad que contiene un botón del dominio Fc minimizará (además) la generación de moléculas de unión a antígeno que comprenden dos restos de unión a antígeno que se pueden unir a un antígeno activador de linfocitos T (impedimento estérico de dos polipéptidos que contienen botón).

En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable, pero la heterodimerización es electrostáticamente favorable.

Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora

El dominio Fc confiere a la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida en suero larga que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a la dirección indeseable de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T hacia células que expresan receptores de Fc en lugar de a las células portadoras de antígenos preferentes. Además, la coactivación de las rutas de señalización del receptor de Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas lo que, en combinación con las propiedades activadoras de linfocitos T y la semivida larga de la molécula de unión a antígeno, da como resultado una activación excesiva de receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. La activación de células inmunitarias (portadoras del receptor de Fc) distintas de linfocitos T incluso puede reducir la eficacia de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T debido a la destrucción potencial de linfocitos T, por ejemplo, por linfocitos NK.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de acuerdo con la invención presenta una afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con el dominio Fc de IgG1 natural. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural). En un modo de realización, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o induce función efectora. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un modo de realización, la función efectora es una o más seleccionada del grupo de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un modo de realización particular, la función efectora es ADCC. En un modo de realización, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar al receptor de Fc neonatal (FcRn) en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular más de aproximadamente un 80 %, más en particular más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión de un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgGi natural) por FcRn.

En determinados modos de realización, el dominio Fc se genomanipula para que tenga afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora. Típicamente, la misma o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor de Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc en comparación con una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un modo de realización, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). La unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc por dicho receptor, se logra cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención que comprenden dicho dominio Fc, pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados modos de realización, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se genomanipula para que tenga función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos reducida, unión a linfocitos NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa que induce apoptosis reducida, reticulación de anticuerpos unidos a diana reducida, maduración de células dendríticas reducida o activación de linfocitos T reducida. En un modo de realización, la función efectora reducida es una o más seleccionadas del grupo de CDC reducida, ADCC reducida, ADCP reducida y secreción de citocinas reducida. En un modo de realización particular, la función efectora reducida es ADCC reducida. En un modo de realización, la ADCC reducida es menor de un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc no genomanipulado).

En un modo de realización, la mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de E233, L234, L235, N297, P331 y P329. En un modo de realización más específico, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de L234, L235 y P329. En algunos modos de realización, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y una sustitución aminoacídica adicional en una posición seleccionada de E233, L234, L235, N297 y P331. En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica adicional es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235. En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA"). En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas suprime casi completamente la unión al receptor de Fcy de un dominio Fc de IgG1 humana, como se describe en la solicitud de patente PCT n.° PCT/EP2012/055393. El documento PCT/EP2012/055393 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como unión al receptor de Fc o funciones efectoras.

Los anticuerpos IgG4 presentan una afinidad de unión reducida por receptores de Fc y funciones efectoras reducidas en comparación con anticuerpos IgGi. Por tanto, en algunos modos de realización, el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un modo de realización, el dominio Fc de IgG1 comprende sustituciones aminoacídicas en la posición S228, específicamente la sustitución aminoacídica S228P. Para reducir más su afinidad de unión por un receptor de Fc y/o su función efectora, en un modo de realización, el dominio Fc de IgG1 comprende una sustitución aminoacídica en la posición L235, específicamente la sustitución aminoacídica L235E. En otro modo de realización, el dominio Fc de IgG1 comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329, específicamente la sustitución aminoacídica P329G. En un modo de realización particular, el dominio Fc de IgG1 comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y P329G. Dichos mutantes del dominio Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor de Fcy se describen en la solicitud de patente PCT n.° WO2012130831.

En un modo de realización particular, el dominio Fc que presenta afinidad de unión por un receptor de Fc reducida y/o una función efectora reducida en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural es un dominio Fc de IgG1 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y opcionalmente P329G, o un dominio Fc de IgG1 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y opcionalmente P329G.

En determinados modos de realización se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc comprende una mutación aminoacídica en la posición N297, en particular, una sustitución aminoacídica que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D).

Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la solicitud de patente PCT n.° WO2012130831, los dominios Fc con unión a receptor de Fc y/o función efectora reducidas también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 del dominio Fc (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.

La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un ensayo de unión de este tipo adecuado se describe en el presente documento. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de dominios Fc o moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos que comprenden un dominio Fc por los receptores de Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor de FcYlIIa.

La función efectora de un dominio Fc, o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de e E. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radiactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTITM para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

En algunos modos de realización, se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que se genomanipula el dominio Fc para que tenga una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye una CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede unir a C1q y, por tanto, tener actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Restos de unión a antígeno

La molécula de unión a antígeno de la invención es biespecífica, es decir, comprende al menos dos restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a dos determinantes antigénicos distintos. De acuerdo con un modo de realización de la invención, los restos de unión a antígeno son moléculas Fab (es decir, dominios de unión a antígeno compuestos de una cadena pesada y una ligera, cada una de las cuales comprende una región variable y una constante), en los que la cadena ligera (VLCL) de al menos dos moléculas Fab comprende secuencias idénticas. En un modo de realización, dicha cadena ligera VLCL de las moléculas Fab que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana y un antígeno activador de linfocitos T, respectivamente, comprende las CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.

En un modo de realización, dicha cadena ligera VLCL de las moléculas Fab que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana y un antígeno activador de linfocitos T, respectivamente, comprende la SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, dichas moléculas Fab son humanas. En otro modo de realización, dichas moléculas Fab son humanizadas. Aún en otro modo de realización, dichas moléculas Fab comprenden regiones constantes de la cadena pesada y ligera humanas.

En un modo de realización particular de acuerdo con la invención, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede unir simultáneamente a un antígeno de célula diana, en particular un antígeno de célula tumoral, y un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede reticular un linfocito T y una célula diana uniéndose simultáneamente a un antígeno de célula diana y un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización incluso más particular, dicha unión simultánea da como resultado la lisis de la célula diana, en particular una célula tumoral. En un modo de realización, dicha unión simultánea da como resultado la activación del linfocito T. En otros modos de realización, dicha unión simultánea da como resultado una respuesta celular de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionada del grupo de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. En un modo de realización, la unión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T al antígeno activador de linfocitos T sin unión simultánea al antígeno de la célula diana no da como resultado la activación del linfocito T.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede redireccionar la actividad citotóxica de un linfocito T hacia una célula diana. En un modo de realización particular, dicho redireccionamiento es independiente de la presentación de antígenos peptídicos mediada por MHC por la célula diana y/o la especificidad del linfocito T.

En particular, un linfocito T de acuerdo con cualquiera de los modos de realización de la invención es un linfocito T citotóxico. En algunos modos de realización, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o CD8+, en particular un linfocito T CD8+.

Resto de unión a antígeno activador de linfocitos T

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención comprende al menos un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T (también denominado en el presente documento "resto de unión a antígeno activador de linfocitos T"). En un modo de realización particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T proporciona unión monovalente al antígeno activador de linfocitos T. El resto de unión a antígeno activador de linfocitos T es una molécula Fab y comprende una cadena ligera VLCL idéntica al resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana.

En un modo de realización particular, el antígeno activador de linfocitos T es CD3, en particular CD3 humano o CD3 de macaco cangrejero, lo más en particular CD3 humano. En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T es reactiva de forma cruzada para (es decir, se une específicamente a) CD3 humano y de macaco cangrejero. En algunos modos de realización, el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad épsilon de CD3 (SEQ ID NO: 56).

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal H2C (descrito en la publicación PCT n.° WO2008/119567) por la unión a un epítopo de CD3. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal V9 (descrito en Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) y la patente de EE. UU. n.° 6.054.297) por la unión a un epítopo de CD3. Aún en otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal FN18 (descrito en Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)) por la unión a un epítopo de CD3. En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal SP34 (descrito en Pessano et al., EMBO J 4, 337-340 (1985)) por la unión a un epítopo de CD3. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T se une al mismo epítopo de CD3 que el anticuerpo monoclonal SP34.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 14, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 15, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 16, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ Id NO: 36, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad.

En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 31, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 35.

Resto de unión a antígeno de célula diana

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención comprende al menos un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana (también denominado en el presente documento "resto de unión a antígeno de célula diana"). En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende dos restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización particular de este tipo, cada uno de estos restos de unión a antígeno se une específicamente al mismo determinante antigénico. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una molécula de inmunoglobulina que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende no más de dos restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana. El resto de unión a antígeno de célula diana es en general una molécula Fab que se une a un determinante antigénico específico y puede dirigir la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral que porta el determinante antigénico. Dicha molécula Fab tiene una cadena ligera VLCL idéntica a la molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización preferente, dicha cadena ligera VLCL de la molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y la molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T comprenden la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34. En un modo de realización preferente, dicha cadena ligera VLCL de la molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y la molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T comprenden una cadena ligera VLCL de SEQ ID NO. 31.

En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno de célula diana comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 31, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad.

En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno de célula diana comprende una secuencia de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 35, o a variantes de la misma que conservan la funcionalidad.

En determinados modos de realización, el resto de unión a antígeno de célula diana se dirige a un antígeno asociado con una afección patológica, tal como un antígeno presentado en una célula tumoral. Los antígenos adecuados son antígenos de superficie celular, por ejemplo, pero sin limitarse a, receptores de superficie celular. En modos de realización particulares, el antígeno es un antígeno humano. En un modo de realización específico, el antígeno de célula diana es el receptor 1 de folato (FolR1).

En un aspecto específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de la SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 267 y SEQ ID NO: 272, incluyendo fragmentos funcionales o variantes de las mismas.

Polinucleótidos

La invención proporciona además polinucleótidos aislados que codifican una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención.

Los polinucleótidos incluyen aquellos que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 267 y SEQ ID NO: 272, incluyendo fragmentos funcionales.

Los polinucleótidos que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se pueden expresar como un único polinucleótido que codifica toda la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o como múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar a través de, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena ligera de un resto de unión a antígeno se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende la porción de la cadena pesada del resto de unión a antígeno, una subunidad del dominio Fc y opcionalmente (parte de) otro resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresen, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar el resto de unión a antígeno. En otro ejemplo, la porción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende una de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) uno o más restos de unión a antígeno se podría codificar por un polinucleótido separado de la porción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende la otra de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) un resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresen, las subunidades del dominio Fc se asociarán para formar el dominio Fc.

En determinados modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario.

Procedimientos recombinantes

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis peptídica en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican la molécula (fragmento) de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aíslan o insertan en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un modo de realización se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de una molécula (fragmento) de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T junto con señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) y Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica la molécula (fragmento) de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (es decir, la región codificante) se clona en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si está presente; sin embargo, cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosoma, finalizadores transcripcionales, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no es parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector de la presente invención puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan de forma postraduccional o cotraduccional en las proteínas finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterógenas, fusionadas o bien no fusionadas a un polinucleótido que codifica la molécula (fragmento) de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención. Las regiones codificantes heterógenas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterógeno. Una asociación funcional es cuando una región codificante de un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal forma que sitúa la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con la misma) se "asocian de forma funcional" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN de transcribirse. Por tanto, una región promotora se asociaría de forma funcional con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor puede efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, se pueden asociar de forma funcional con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula. En el presente documento se divulgan promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción. Es conocida una variedad de regiones de control de la transcripción por los expertos en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero sin limitarse a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, conjuntamente con intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y á-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles por tetraciclinas). De forma similar, es conocida una variedad de elementos de control de la traducción por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión a ribosoma, codones de iniciación y terminación de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular un sitio de entrada a ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros rasgos característicos tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (LTR) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (ITR) víricas adenoasociadas (AAV).

Se pueden asociar regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, si se desea la secreción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, se puede disponer el ADN que codifica una secuencia señal en dirección 5' del ácido nucleico que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención o un fragmento de la misma. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrado en general tienen un péptido señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinados modos de realización se usa el péptido señal natural, por ejemplo, un péptido señal de la cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que conserva la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está funcionalmente asociado con él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterógeno o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir por la secuencia líder del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano o p-glucuronidasa de ratón.

El ADN que codifica una secuencia proteica corta que se podría usar para facilitar la posterior purificación (por ejemplo, una marca de histidina) o ayudar a marcar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede incluir dentro de o en los extremos del polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (fragmento).

En otro modo de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. En determinados modos de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que se puede genomanipular para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención o fragmentos de las mismas. Las células huésped adecuadas para replicación y para sustentar la expresión de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o traducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular cuando no se necesita glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con rutas de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.4l7.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para el cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO-DHFR-(Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20).

Son conocidas en la técnica las tecnologías estándar para expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o bien la ligera de un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo se pueden genomanipular para que expresen también la otra de las cadenas de anticuerpo de modo que el producto expresado sea un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada como una ligera.

En un modo de realización se proporciona un procedimiento de producción de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la invención, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención, en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, y recuperar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped).

Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusionan genéticamente entre sí. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede diseñar de modo que sus componentes se fusionen directamente entre sí o indirectamente a través de una secuencia conectora. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se puede someter a prueba para determinar su eficacia. Ejemplos de secuencias conectoras entre diferentes componentes de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se encuentran en las secuencias proporcionadas en el presente documento. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión si se desea, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.

En determinados modos de realización, el uno o más restos de unión a antígeno de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T comprenden al menos una región variable de anticuerpo que se puede unir a un determinante antigénico. Las regiones variables pueden formar parte de y derivar de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis de péptidos en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprendan cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 concedida a McCafferty).

Se puede usar cualquier especie de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o región variable animal en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, dominios de unión a antígeno o regiones variables no limitantes útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, primate o humano. Si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T está destinada al uso en seres humanos, se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo son de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o totalmente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 concedida a Winter). La humanización se puede lograr mediante diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a, (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo, anticuerpo receptor) con o sin conservación de residuos de la región estructural críticos (por ejemplo, los que son importantes para conservar buenas funciones de afinidad de unión a antígeno o de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de la especificidad (SDR o a-CDR; los residuos críticos para la interacción anticuerpo-antígeno) no humanas en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos completos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana mediante el reemplazo de residuos superficiales. Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); las patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que describe el "rebamizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR). Se pueden producir anticuerpos humanos y regiones variables humanas usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivar de anticuerpos monoclonales humanos preparados por el procedimiento de hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.

51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). También se pueden preparar anticuerpos humanos y regiones variables humanas administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para que produzca anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)). También se pueden generar anticuerpos humanos y regiones variables humanas aislando secuencias de regiones variables de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos (véase, por ejemplo, Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab.

En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno útiles en la presente invención se genomanipulan para que tengan una afinidad de unión potenciada de acuerdo con, por ejemplo, los procedimientos divulgados en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132066. La capacidad de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención de unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Se pueden usar ensayos de competición para identificar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o dominio variable que compite con un anticuerpo de referencia por unirse a un antígeno particular, por ejemplo, un anticuerpo que compite con el anticuerpo V9 por unirse a CD3. En determinados modos de realización, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une mediante el anticuerpo de referencia. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). En un ensayo de competición ejemplar se incuba el antígeno inmovilizado (por ejemplo, CD3) en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno (por ejemplo, anticuerpo V9) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba el antígeno inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba con relación a la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T preparadas como se describe en el presente documento se pueden purificar por técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. Por ejemplo, para la purificación por cromatografía de afinidad de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención, se puede usar una matriz con proteína A o proteína G. Se pueden usar la cromatografía de afinidad con proteína A o G y la cromatografía de exclusión por tamaño secuenciales para aislar una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T esencialmente como se describe en los ejemplos. Se puede determinar la pureza de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T por cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos, incluyendo electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alta presión y similares. Por ejemplo, se demostró que las proteínas de fusión de la cadena pesada expresadas como se describe en los ejemplos estaban intactas y apropiadamente ensambladas como se demostró por SDS-PAGE reductora. Se resolvieron tres bandas aproximadamente a Mr 25.000, Mr 50.000 y Mr 75.000, correspondientes a los pesos moleculares predichos de la proteína de fusión de cadena ligera, cadena pesada y cadena pesada/cadena ligera de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

Ensayos

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de afinidad

La afinidad de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T por un receptor de Fc o un antígeno diana se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos por resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (Ge Healthcare), y receptores o proteínas diana tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, la unión de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T para diferentes receptores o antígenos diana se puede evaluar usando líneas celulares que expresan el receptor o antígeno diana particular, por ejemplo, por citometría de flujo (FACS). Un modo de realización ilustrativo y ejemplar específico para medir la afinidad de unión se describe en lo que sigue y en los ejemplos a continuación.

De acuerdo con un modo de realización, se mide la Kd mediante resonancia de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.

Para analizar la interacción entre la porción Fc y los receptores de Fc, se captura el receptor de Fc recombinante con marca de His por un anticuerpo anti-Penta His (Qiagen) ("Penta His" divulgado como SEQ ID NO: 45) inmovilizado en chips CM5 y se usan las construcciones biespecíficas como analitos. En resumen, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el anticuerpo anti-Penta-His ("Penta His" divulgado como SEQ ID NO: 45) con acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, a 40 pg/ml antes de la inyección a un caudal de 5 pl/min para lograr aproximadamente 6500 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del ligando, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Posteriormente, se captura el receptor de Fc durante 60 s a 4 o 10 nM. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie 1:4 de la construcción biespecífica (intervalo entre 500 nM y 4000 nM) en HBS-EP (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P200,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de 30 pl/min durante 120 s.

Para determinar la afinidad por el antígeno diana, se capturan las construcciones biespecíficas por un anticuerpo específico anti-Fab humano (GE Healthcare) que se inmoviliza en una superficie de chip de sensor CM5 activado como se describe para el anticuerpo anti-Penta-His ("Penta His" divulgado como SEQ ID NO: 45). La cantidad final de proteína acoplada es de aproximadamente 12000 UR. Se capturan las construcciones biespecíficas durante 90 s a 300 nM. Se pasan los antígenos diana a través de las cubetas de lectura durante 180 s a un intervalo de concentración de 250 a 1000 nM con un caudal de 30 pl/min. Se supervisa la disociación durante 180 s.

Se corrigen las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Se usó la respuesta en situación de equilibrio para derivar la constante de disociación Kd por ajuste de curva no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación BIACORE ® T100 versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).

Ensayos de actividad

Se puede medir la actividad biológica de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención por diversos ensayos como se describe en los ejemplos. Las actividades biológicas pueden incluir, por ejemplo, la inducción de proliferación de linfocitos T, la inducción de señalización en linfocitos T, la inducción de expresión de marcadores de activación en linfocitos T, la inducción de secreción de citocinas por linfocitos T, la inducción de lisis de células diana tales como células tumorales y la inducción de regresión tumoral y/o la mejora de la supervivencia.

Composiciones, formulaciones y vías de administración

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Se proporciona además un procedimiento de producción de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención en una forma adecuada para su administración in vivo, comprendiendo el procedimiento (a) obtener una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la invención, y (b) formular la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, con lo que se formula una preparación de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su administración in vivo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T disueltas o dispersadas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son, en general, atóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir, que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y opcionalmente un ingrediente activo adicional será conocida por los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para administración a animales (por ejemplo, seres humanos), se entenderá que las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según se requiere por la Oficina de Normas biológicas de la FDA o las autoridades correspondientes en otros países. Las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizantes de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como se conocerá por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.

La composición puede comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se va a administrar en forma sólida, líquida o aerosol, y si es necesario que sea estéril para dichas vías de administración como inyección. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la presente invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se pueden administrar por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada, bañando células diana directamente, a través de un catéter, a través de un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro procedimiento o cualquier combinación de lo anterior como sería conocido por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990). La administración parenteral, en particular inyección intravenosa, se usa más comúnmente para administrar moléculas polipeptídicas tales como las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención.

Las composiciones parenterales incluyen aquellas diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso. Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. Se puede conseguir fácilmente la esterilidad, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferentes son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. Se debe tamponar adecuadamente el medio líquido si es necesario y volver isotónico el diluyente líquido en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que se debe mantener al mínimo la contaminación por endotoxinas hasta un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano, o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En determinados modos de realización, se puede conseguir una absorción prolongada de una composición inyectable mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.

Además de las composiciones descritas previamente, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T también se pueden formular como preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se pueden formular con materiales hidrófobos o poliméricos adecuados (por ejemplo, como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se pueden fabricar por medio de procedimientos de mezclado, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conservan sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteínica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.

Procedimientos y composiciones terapéuticas

Se puede usar cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento en procedimientos terapéuticos. Se pueden usar moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención como agentes inmunoterápicos, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres.

Para su uso en procedimientos terapéuticos, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de una manera consecuente con una buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los médicos.

En un aspecto, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un modo de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesite el mismo. En determinados modos de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otros modos de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su uso en la inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. En determinados modos de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su uso en un procedimiento de inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para inducir la lisis de una célula diana. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita el mismo. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En un modo de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro modo de realización, el medicamento es para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. Todavía en otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para inducir la lisis de una célula diana. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene dicha enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención. En un modo de realización se administra una composición a dicho individuo, que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención en una forma farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano.

En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. En un aspecto, el procedimiento comprende poner en contacto una célula diana con una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención en presencia de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico. En otro aspecto se proporciona un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo. En un aspecto de este tipo, el procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para inducir la lisis de una célula diana. En un modo de realización, un "individuo" es un ser humano.

En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Los ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en el(los)/la(s): abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroidea), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, aparato genital femenino, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados modos de realización, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello. Un experto en la técnica admite fácilmente que en muchos casos la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede que no proporcione una cura, sino que solo proporcione un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz". El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.

En algunos modos de realización, una cantidad eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se administra a una célula. En otros modos de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se administra a un individuo para el tratamiento de enfermedad.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención (cuando se usa sola o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, la gravedad y evolución de la enfermedad, si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas previas o coincidentes, la anamnesis y respuesta del paciente a la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, y el criterio del médico especialista. El profesional responsable de su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación que incluyen, pero sin limitarse a, administraciones únicas o múltiples durante diversos momentos, administración por inyección intravenosa rápida e infusión intermitente.

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, en general, se prolongaría el tratamiento hasta que se produjera una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ejemplar de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable de los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg peso corporal, etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T). Se puede administrar una dosis inicial de carga mayor, seguida de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La progresión de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se usarán en general en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para su uso para tratar o prevenir un estado de enfermedad, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención, o composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, en especial en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI50 como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.

También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que se conocen bien en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a los datos en animales.

La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar concentraciones plasmáticas de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que sean suficientes para mantener un efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr concentraciones plasmáticas terapéuticamente eficaces administrando múltiples dosis cada día. Las concentraciones en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.

En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.

Una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T descritas en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y la eficacia terapéutica de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivo celular o animales de experimentación. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios en animales para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Son preferentes las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que presentan índices terapéuticos grandes. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con la presente invención presenta un índice terapéutico alto. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuadas para su uso en seres humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Cap. 1, p. 1).

El médico especialista para pacientes tratados con moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad, a disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual.

Otros agentes y tratamientos

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en el tratamiento. Por ejemplo, una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador, un agente citostático, un inhibidor de la adhesión celular, un agente citotóxico, un activador de la apoptosis celular o un agente que incrementa la sensibilidad de las células a los inductores apoptóticos. En un modo de realización particular, el agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico, por ejemplo, un alterador de los microtúbulos, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasas, un intercalador de ADN, un agente alquilante, un tratamiento hormonal, un inhibidor de cinasas, un antagonista de receptores, un activador de la apoptosis de células tumorales o un agente antiangiogénico.

Dichos otros agentes están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T usada, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores analizados anteriormente. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se usan en general en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente como apropiada.

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma composición o en composiciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso se puede producir la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención antes de, simultáneamente a y/o después de la administración del adyuvante y/o agente terapéutico adicional. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T de la invención también se pueden usar en combinación con radioterapia.

Artículos de fabricación

En otro aspecto de la invención se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico de otro modo. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Procedimientos de cribado

En el presente documento se describe la eficacia ventajosa del uso de una cadena ligera única o variantes altamente homólogas de la misma para procedimientos de identificación de regiones variables de la cadena pesada apropiadas para construir moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T. Para construir estas proteínas de unión, la cadena ligera no solo se debe poder emparejar con diversas cadenas pesadas para producir restos de unión de diferente especificidad, sino que también conserva la capacidad de formar un resto de unión que puede activar los linfocitos T a los que se une.

La cadena ligera descrita en el presente documento se puede usar como una cadena ligera común (CLC) para identificar regiones variables de la cadena pesada apropiadas, por ejemplo, cribando una colección de regiones variables de la cadena pesada. Esto permite mantener la proteína de unión a CD3 previamente identificada y validada, de modo que simplemente haya que identificar una nueva proteína de unión a antígeno diana para el resto de unión a antígeno diana de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

En consecuencia, en otro aspecto se proporciona un procedimiento para identificar una cadena pesada variable para su uso en una molécula de unión a antígeno biespecífica que es específica para un antígeno de activación de linfocitos T y un antígeno de célula diana, que comprende la etapa de cribado de una colección combinatoria que comprende cadenas pesadas variables con una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34. En un aspecto, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. En un aspecto, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Este procedimiento se puede usar para desarrollar proteínas de unión estables, funcionales y de alta afinidad para mejorar la producción de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T con, por ejemplo, especificidad para CD3 y una especificidad para antígeno diana, donde los antígenos diana no están relacionados, por ejemplo, FolR1, MUC1 y Bc Ma .

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Procedimientos generales Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., publicación NIH n.° 91-3242.

Secuenciación de ADN

Las secuencias de ADN se determinaron mediante secuenciación estándar de doble hebra en Synergene (Schlieren).

Síntesis génica

Se generaron segmentos de genes deseados, cuando se requirió, por PCR usando moldes apropiados o bien se sintetizaron por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis génica automatizada. En casos donde no estaba disponible ninguna secuencia génica exacta, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos en base a las secuencias de los homólogos más cercanos y se aislaron los genes por RT-PCR del ARN que se origina en el tejido apropiado. Se clonaron los segmentos génicos flanqueados por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares en vectores de clonación/secuenciación estándar. Se purificó el ADN plasmídico de bacterias transformadas y se determinó la concentración por espectroscopia UV. Se confirmó la secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados por secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los respectivos vectores de expresión. Se diseñaron todas las construcciones con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica un péptido líder que dirige las proteínas para su secreción en células eucariotas.

Aislamiento de linfocitos pan T primarios humanos de PBMC

Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucoplaquetarias) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre fresca de donantes humanos sanos. En resumen, la sangre se diluyó con PBS estéril y se colocó cuidadosamente en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, H8889). Después de la centrifugación durante 30 minutos a 450 x g a temperatura ambiente (freno desconectado), se desechó la parte del plasma que se encontraba por encima de la interfase que contenía los PBMC. Los PBMC se transfirieron a nuevos tubos Falcon de 50 ml y los tubos se rellenaron con PBS hasta un volumen total de 50 ml. La mezcla se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 minutos a 400 x g (freno activado). El sobrenadante se desechó y el sedimento de PBMC se lavó dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación a 4 °C durante 10 minutos a 350 x g). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en un medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en la incubadora hasta el inicio del ensayo.

El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realizó usando el kit II de aislamiento de linfocitos pan T (Miltenyi Biotec n.° 130-091-156), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los sedimentos celulares se diluyeron en 40 pl de tampón frío por 10 millones de células (PBS con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM, filtrado estéril) y se incubaron con 10 pl de cóctel de biotina-anticuerpo por 10 millones de células durante 10 min a 4 °C. Se añadieron 30 pl de tampón frío y 20 pl de microesferas magnéticas anti-biotina por 10 millones de células, y la mezcla se incubó durante otros 15 min a 4 °C. Las células se lavaron añadiendo 10-20x el volumen actual y una etapa de centrifugación posterior a 300 x g durante 10 min. Se resuspendieron hasta 100 millones de células en 500 pl de tampón. La separación magnética de linfocitos pan T humanos no marcados se realizó usando columnas LS (Miltenyi Biotec n.° 130-042-401) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La población de linfocitos T resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en un medio AIM-V a 37 °C, CO2 al 5 % en la incubadora hasta el inicio del ensayo (no más de 24 h).

Aislamiento de linfocitos T indiferenciados primarios humanos de PBMC

Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucoplaquetarias) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre fresca de donantes humanos sanos. El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realizó utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T indiferenciados CD8+ de Miltenyi Biotec (n.° 130093-244), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero omitiendo la última etapa de aislamiento de los linfocitos T CD8+ (véase también la descripción para el aislamiento de linfocitos pan T humanos primarios).

Aislamiento de linfocitos pan T murinos de esplenocitos

Se aislaron bazos de ratones C57BL/6, se transfirieron a un tubo en C GentleMACS (Miltenyi Biotech n.° 130-093-237) que contenía tampón MACS (PBS BSA al 0,5 % EDTA 2 mM) y se disociaron con el disociador GentleMACS para obtener suspensiones de células sueltas según las instrucciones del fabricante. La suspensión celular se pasó a través de un filtro de separación previa para eliminar las partículas de tejido no disociadas restantes. Después de la centrifugación a 400 x g durante 4 min a 4 °C, se añadió tampón de lisis ACK para lisar los eritrocitos (incubación durante 5 min a temperatura ambiente). Las células restantes se lavaron con tampón MACS dos veces, se contaron y se usaron para el aislamiento de linfocitos pan T murinos. La selección (magnética) negativa se realizó usando el kit de aislamiento de linfocitos pan T de Miltenyi Biotec (n.° 130-090-861), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La población de linfocitos T resultante se contó automáticamente (ViCell) y se usó inmediatamente para ensayos adicionales.

Aislamiento de PBMC primarios de macaco cangrejero de sangre heparinizada

Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad a partir de sangre fresca de donantes sanos de macaco cangrejero, como sigue: la sangre heparinizada se diluyó 1:3 con PBS estéril, y el medio Lymphoprep (Axon Lab n.° 1114545) se diluyó al 90 % con PBS estéril. Dos volúmenes de la sangre diluida se colocaron en una capa sobre un volumen del gradiente de densidad diluido y la fracción de PBMC se separó mediante centrifugación durante 30 min a 520 x g, sin freno, a temperatura ambiente. La banda de PBMC se transfirió a un tubo Falcon nuevo de 50 ml y se lavó con PBS estéril por centrifugación durante 10 min a 400 x g a 4 °C. Se realizó una centrifugación a baja velocidad para eliminar las plaquetas (15 min a 150 x g, 4 °C), y la población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se usó inmediatamente para ensayos adicionales.

Generación de antígeno ejemplar

El antígeno se expresa en dos versiones diferentes. Para una construcción que no contiene Fc, el dominio extracelular se fusiona con una marca de avidina-His unida a su extremo C. Para un antígeno que contiene Fc, se aplica una fusión de Fc que usa la tecnología de botón en ojal al extremo N de una parte de Fc heterodimérica (Merchant et al.) para tener solo una molécula de la proteína de interés por cada dímero de Fc. Esto se hace para evitar la formación de cualquier estructura dimérica artificial de la proteína de interés. La marca de avidina se une aquí al extremo C de Fc. Esas proteínas se pueden expresar fácilmente de forma transitoria en células de mamíferos como HEK o CHO, purificar mediante cromatografía de proteína A, biotinilar y se pueden unir a microesferas de estreptavidina para la selección de fagos por medio de la marca de avidina biotinilada de acuerdo con procedimientos estándar.

Maduración de la afinidad

La maduración de la afinidad de los fragmentos Fab procedentes de una colección de CLC se debe limitar a la cadena pesada solo, para conservar la cadena ligera de manera inalterada para conservar la afinidad de unión a CD3e. Dado que nuestra colección inicial está aleatorizada solo en la CDR3 de la cadena pesada, nos centramos en la etapa de maduración en las CDR 1 y 2. Para ello, diseñamos cebadores de PCR para cada región estructural que introdujeran la aleatorización en CDR1 y CDR2 por separado. Cada cebador se diseña para que se una a una de las seis regiones estructurales de la cadena pesada y se puede usar de forma genérica para cada clon de anticuerpo que proviene de esa colección de fagos en particular. El proceso de maduración se lleva a cabo como se describe por Knappik (Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86) o por Steidl (S. Steidl et al., Molecular Immunology 46 (2008) 135-144).

Las rondas de selección (panning) de fagos se llevan a cabo como se describe anteriormente, con la diferencia de que se usan concentraciones del antígeno soluble de 2 x 10'8 M y se reducen hasta una concentración final de 2 x 10' 10 M.

Clonación, producción, purificación y caracterización bioquímica de TCB CLC

Se subclonan las secuencias de ADN de la región variable de la cadena pesada y ligera resultantes sin cambio del marco de lectura con la cadena pesada constante o bien la cadena ligera constante preinsertada en el respectivo vector de expresión de mamífero receptor. La expresión del anticuerpo está dirigida por un promotor MPSV y lleva una secuencia señal poliA sintética en el extremo 3' de la CDS. Además, cada vector contiene una secuencia OriP de EBV para la expresión transitoria en células HEK293-EBNA. Como isotipos de anticuerpos se usan IgG1 P329G LALA o IgG4 SPLE PG.

Se produce la TCB CLC cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Se transfectan las células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1:3 ("vector de cadena pesada Fc(ojal)": "vector de cadena pesada Fc(botón)-FabCrossfab": "vector de cadena ligera común").

Para la transfección, se cultivan células HEK293 EBNA en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugan durante 5 min mediante 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclan vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 g de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclan con la solución de ADN/PEI, se transfieren a un matraz de agitación de 500 ml y se incuban durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añaden 160 ml de medio F17 y las células se cultivan durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añade ácido valpórico 1 mM y medio Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recoge el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtra en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añade acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantiene a 4 °C.

La proteína secretada se purifica de los sobrenadantes del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando proteína A. El sobrenadante se carga en una columna HiTrap Protein A HP (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 40 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5. Se retira la proteína no unida lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5. La proteína diana se eluye usando un gradiente en 20 volúmenes de columna desde citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5 hasta citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 2,5. Se neutraliza la solución de proteína añadiendo 1/10 de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8. Se concentra la proteína diana y se filtra antes de su carga en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, solución de cloruro de sodio 140 mM a pH 6,0.

Se determina la concentración de proteína de las muestras de proteínas purificadas midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos.

Se analizan la pureza y el peso molecular de las moléculas por análisis CE-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor. Se usa el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Life Sciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usan 2 pg de muestra para los análisis.

Se analiza el contenido en agregado de las muestras de anticuerpo usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.

Caracterización de TCB CLC en ensayos basados en células

Unión de TCB CLC a células que expresan CD3 y ECD de antígeno tumoral

La unión de TCB CLC se somete a prueba usando células tumorales que expresan el antígeno X de interés y una línea de linfocitos T inmortalizados que expresan CD3e (Jurkat). En resumen, las células se recogen, se cuentan, se comprueba su viabilidad y se resuspenden a 2 x 106 células/ml en tampón FACS (100 pl de PBS, BSA al 0,1 %). Se incuban 100 pl de suspensión celular (que contiene 0,2 x 106 células) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo durante 30 min a 4 °C con concentraciones crecientes de TCB CLC (3 pM - 200 nM), se lava dos veces con PBS con BSA al 0,1 % frío, se reincuba durante otros 30 min a 4 °C con anticuerpo secundario caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento Fcy anti-IgG humana conjugado con PE (Jackson Immuno Research Lab PE n.° 109 116-170), se lava dos veces con PBS con BSA al 0,1 % frío y se analiza de inmediato por FACS usando un FACS Canto II (programa informático FACS Diva) eliminando las células vivas negativas para DAPI. Se obtienen curvas de unión usando GraphPadPrism5.

Ejemplo 1

Purificación de fusiones biotiniladas de Fc con receptor de folato

Para generar nuevos anticuerpos contra FolR1 humano, se generaron los siguientes antígenos y herramientas de cribado como proteínas de fusión de Fc monovalentes (el dominio extracelular (ECD) del antígeno unido a la región bisagra del Fc-botón que se coexpresa con una molécula de Fc-ojal). Los genes antigénicos se sintetizaron (Geneart, Regensburg, Alemania) en base a secuencias obtenidas de GenBank o SwissProt y se insertaron en vectores de expresión para generar proteínas de fusión con Fc-botón con una marca de avidina C terminal para biotinilación in vivo o in vitro. La biotinilación in vivo se logró mediante la coexpresión del gen birA bacteriano que codifica una biotina ligasa bacteriana durante la producción. La expresión de todos los genes se realizó bajo el control de un promotor MPSV quimérico en un plásmido que contiene un elemento oriP para el mantenimiento estable de los plásmidos en líneas celulares que contienen EBNA.

Para la preparación de las moléculas de fusión Fc/antígeno monoméricas biotiniladas, se cotransfectaron células HEK293 EBNA en suspensión en crecimiento exponencial con tres vectores que codifican los dos componentes de la proteína de fusión (cadenas botón en ojal), así como BirA, una enzima necesaria para la reacción de biotinilación. Los vectores correspondientes se usaron en una proporción de 9,5:9,5:1 ("ECD de antígeno-Fc botón-marca de avidina": "Fc ojal": "BirA").

Para la producción de proteínas en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 210 x g y el sobrenadante se reemplazó por medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se resuspendieron en 20 ml de medio CD CHO que contenía 200 pg de ADN vector. Después de la adición de 540 pl de polietilenimina (PEI), la solución se mezcló durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió ácido valproico 1 mM y medio Feed 1 (Lonza) al 7 % al cultivo. El medio de producción también se complementó con biotina 100 pM. Después de 7 días de cultivo, se recogió el sobrenadante celular mediante centrifugación de las células durante 15 min a 210 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm), se complementó con acida de sodio a una concentración final del 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C.

Las proteínas secretadas se purificaron de los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando proteína A, seguida de una cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó sobrenadante en una columna HiTrap Protein A HP (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 40 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. Se retiró la proteína no unida lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. La proteína unida se eluyó usando un gradiente de pH lineal creado en 20 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3,0. A continuación, se lavó la columna con 10 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3,0.

El pH de las fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. Se concentró la proteína y se filtró antes de su carga en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0.

Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la fusión FolR1-Fc se analizaron mediante electroforesis capilar-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGx, Perkin Elmer). Se analizó el contenido en agregado de las muestras usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.

Las proteínas de fusión antígeno-Fc purificadas se analizaron mediante ensayos de resonancia de plasmón superficial usando anticuerpos disponibles comercialmente para confirmar la conformación correcta y natural de los antígenos (datos no mostrados).

Tabla 1: Antígenos producidos para aislamiento, selección y contraselección de anticuerpos contra FolR1 humano

Tabla 2: Resumen del rendimiento y contenido final de monómero de las fusiones FolR-Fc.

Ejemplo 2

Generación de la cadena ligera común con especificidad para CD3e

Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T descritas en el presente documento comprenden al menos un resto de unión a c D3. Este resto se puede generar inmunizando animales de laboratorio, cribando una colección de fagos o usando anticuerpos anti-CD3 conocidos. La cadena ligera común con especificidad para CD3s se generó humanizando la cadena ligera de un anticuerpo murino anti-CD3s original (CH2527). Para la humanización de un anticuerpo de origen no humano, los residuos de CDR del anticuerpo no humano (donante) tienen que trasplantarse a la región estructural de un anticuerpo humano (aceptador). En general, las secuencias de la región estructural aceptadora se seleccionan alineando la secuencia del donante con una colección de secuencias aceptadoras potenciales y eligiendo una que tenga una homología razonable con el donante o que muestre aminoácidos similares en algunas posiciones críticas para la estructura y la actividad. En el presente caso, la búsqueda de la región estructural aceptadora de anticuerpo se realizó alineando la secuencia del dominio VL de ratón del anticuerpo original con una colección de secuencias de la línea germinal humana y eligiendo la secuencia humana que mostró una identidad de secuencia alta. Sorprendentemente, se encontró una buena coincidencia en términos de homología de secuencia de la región estructural en una cadena ligera humana bastante poco frecuente perteneciente a la familia 7 de dominios V del tipo lambda, más precisamente, hVL_7_46 (nomenclatura IMGT, n.° acceso GenBank Z73674). Esta cadena ligera humana poco frecuente se eligió posteriormente como región estructural aceptadora para la humanización de la cadena ligera de CH2527. Las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del dominio variable de la cadena ligera de ratón se injertaron en esta región estructural aceptadora. Dado que la región estructural 4 no es parte de la región variable del gen V de la línea germinal, la alineación para esta región (elemento J) se realizó individualmente. Por tanto, se eligió la secuencia IGLJ3-02 para la humanización de esta cadena ligera. Se generaron trece variantes humanizadas (CH2527-VL7_46-1 a VL7_46-10, VL7_46-12 a VL7 46-14). Estas variantes difieren en los residuos de la región estructural (y combinaciones de los mismos) que se retromutaron a la secuencia del dominio V murino o en los residuos CDR (definición de Kabat) que se podían mantener idénticos a la secuencia de la línea germinal humana. Los siguientes residuos de región estructural fuera de las CDR se retromutaron a los residuos murinos en la variante del dominio VL humanizado final VL7_46-13 (residuos murinos enumerados): V36, E38, F44, G46, G49 y G57, respectivamente. El elemento J humano IGLJ3-02 era 100 % idéntico al elemento J del anticuerpo murino original.

Ejemplo 3

Evaluación por SPR de variantes humanizadas con especificidad para CD3e

Las variantes de VL humanizadas se evaluaron como quimera en un formato clásico 2+1 (figura 1D), es decir, los dominios V de la cadena ligera humanizada se emparejaron con dominios V de la cadena pesada murina. La evaluación por SPR se realizó en un instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Más precisamente, las variantes se capturaron directamente del sobrenadante de cultivo en un chip sensor GLM derivatizado anti-Fab (anticuerpo caprino anti-IgG humana, específico del fragmento F(ab')2, Jackson ImmunoResearch) en orientación vertical. Los siguientes analitos posteriormente se inyectaron horizontalmente como concentraciones únicas para evaluar la unión a CD3s humano y de macaco: huCD3s(-1-26)-Fc(botón)-avi (ID807) 3 pM y cyCD3s-(-1-26)-Fc(botón)-avi-Fc(ojal) (ID873) 2,5 pM, respectivamente. Las respuestas de unión se compararon cualitativamente con la unión de la construcción de control murina y se calificaron con (unión comparable observada), /-(unión reducida observada) y -(no se observó unión). El anticuerpo de captura se regeneró después de cada ciclo de captura de ligando y unión de analito y la construcción murina se reinyectó al final del estudio para confirmar la actividad de la superficie de captura. Los resultados se resumen en la tabla 3.

Tabla 3 Evaluación cualitativa de unión basada en SPR para las variantes de la cadena ligera humanizada combinadas con la cadena pesada murina de CH2527. Solo la variante de cadena ligera humanizada que se eligió finalmente, CH2527-VL7_46-13, resaltada en negrita, presentó una unión comparable a CD3s humano y de macaco.

Ejemplo 4

Propiedades de la cadena ligera común humanizada con especificidad para CD3e

La variante del dominio V de la cadena ligera que se eligió como la molécula inicial humanizada es VL7_46-13. Se determinó el grado de humanidad, es decir, la homología de secuencia del dominio V humanizado con la secuencia del dominio V de la línea germinal humana. Para VL7_46-13, la identidad de secuencia global con el homólogo de la línea germinal humana más cercano es de un 65 % antes de la humanización y de un 80 % después de ella. Omitiendo las regiones CDR, la identidad de secuencia es de un 92 % con respecto al homólogo de la línea germinal humana más cercano. Como se puede ver en la tabla 3, VL7_46-13 es la única variante VL humanizada de un panel de 13 variantes que mostró una unión comparable al anticuerpo murino original y también conservó su reactividad cruzada con el CD3s de macaco. Este resultado indica que no era trivial humanizar el dominio VL murino sin perder afinidad de unión por CD3e, lo que requería varias retromutaciones a los residuos de la región estructural murina (en particular G46) mientras se conservaba G24 en CDR1. Además, este resultado muestra que el dominio VL desempeña un papel fundamental en el reconocimiento de la diana. Es importante destacar que el dominio VL humanizado VL7_46-13 basado en una línea germinal humana poco frecuente perteneciente a la familia 7 de dominios V de tipo lambda y que conserva la afinidad y especificidad por CD3e, también es adecuado para su uso como una cadena ligera común en colecciones de anticuerpos de presentación en fagos del formato Fab y permite la selección exitosa de especificidades novedosas, lo que facilita enormemente la generación y producción de moléculas biespecíficas que se unen a CD3e y, por ejemplo, a una diana tumoral y que comparten la misma cadena ligera "común".

Ejemplo 5

Generación de una colección de anticuerpos de presentación en fagos usando una cadena ligera común de la línea germinal humana derivada de HVK1-39

Varios enfoques para generar anticuerpos biespecíficos que se asemejan a la IgG humana de longitud completa utilizan modificaciones en la región Fc que inducen la heterodimerización de dos cadenas pesadas distintas. Dichos ejemplos incluyen tecnologías de botón en ojal (Merchant et al., Nat Biotechnol. 1998 Jul; 16(7):677-81), SEED (Davis et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Abr; 23(4): 195-202) y conducción electrostática (Gunasekaran et al., J Biol Chem.

2010 Jun 18; 285(25): 19637-46). Aunque estos enfoques permiten la heterodimerización eficaz de dos cadenas pesadas distintas, el emparejamiento apropiado de cadenas ligeras y pesadas relacionadas sigue siendo un problema. El uso de una cadena ligera (LC) común puede resolver este problema (Merchant et al., Nat Biotech 16, 677-681 (1998)).

Aquí describimos la generación de una colección de anticuerpos para la presentación en un fago M13. Esencialmente, diseñamos una colección de múltiples regiones estructurales para la cadena pesada con una cadena ligera constante (o "común"). Esta colección está diseñada para generar anticuerpos multiespecíficos sin necesidad de usar tecnologías sofisticadas para evitar el emparejamiento erróneo de la cadena ligera.

El uso de una cadena ligera común permite facilitar la producción de estas moléculas, ya que ya no se produce un emparejamiento erróneo y se facilita el aislamiento de un anticuerpo biespecífico altamente puro. En comparación con otros formatos, el uso de fragmentos Fab como componentes básicos a diferencia de, por ejemplo, el uso de fragmentos scFv da como resultado una mayor estabilidad térmica y la ausencia de agregación de scFv y de formación de scFv intermolecular.

Generación de la colección

A continuación, se describe la generación de una colección de anticuerpos para la presentación en el fago M13. Esencialmente, diseñamos una colección de múltiples regiones estructurales para la cadena pesada con una cadena ligera constante (o "común").

Usamos estas cadenas pesadas en la colección (números de acceso GenBank entre paréntesis):

IGHV1-46*01 (X92343) (SEQ ID NO: 104),

IGHV1-69*06 (L22583), (SEQ ID NO: 105)

IGHV3-15*01 (X92216), (SEQ ID NO: 106)

IGHV3-23*01 (M99660), (SEQ ID NO: 107)

IGHV4-59*01 (AB019438), (SEQ ID NO: 108)

IGHV5-51*01 (M99686), (SEQ ID NO: 109)

Todas las cadenas pesadas usan IGHJ2 como elemento J, excepto IGHV1-69*06 que usa la secuencia IGHJ6. El diseño de la aleatorización incluyó la CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3. Para CDR-H1 y CDR-H2 se eligió una estrategia de aleatorización "suave", y los oligonucleótidos de aleatorización fueron tales que el codón para el aminoácido de la secuencia de la línea germinal estaba presente al 50 %. Todos los demás aminoácidos, excepto la cisteína, sumaban el 50 % restante. En CDR-H3, donde no hay aminoácidos en la línea germinal debido a la presencia del elemento D genético, se diseñaron oligonucleótidos que permiten el uso de insertos aleatorizados entre el elemento V y el elemento J de 4 a 9 aminoácidos de longitud. Los oligonucleótidos contenidos en su parte aleatorizada, por ejemplo, los tres aminoácidos G/Y/S, están presentes al 15 % cada uno, mientras que los aminoácidos A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E están presentes al 4,6 % cada uno.

Procedimientos ejemplares para la generación de colecciones de anticuerpos se describen en Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413; Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093.

La cadena ligera se deriva de la secuencia humana hVK1-39, y se usa de forma no modificada y no aleatorizada. Esto garantizará que se pueda usar la misma cadena ligera para otros proyectos sin modificaciones adicionales.

Selección de la colección ejemplar:

Las selecciones con todas las colecciones de maduración de la afinidad se llevan a cabo en solución de acuerdo con el siguiente procedimiento usando un dominio extracelular monomérico y biotinilado de un antígeno X diana.

1. 1012 partículas de fagómidos de cada colección se unen a antígeno soluble biotinilado 100 nM durante 0,5 h en un volumen total de 1 ml. 2. El antígeno biotinilado se captura y las partículas de fagos unidas específicamente se aíslan mediante la adición de ~5 x 107 microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina durante 10 min. 3. Las microesferas se lavan usando 5-10 x 1 ml de PBS/Tween20 y 5-10 x 1 ml de PBS. 4. La elución de las partículas de fagos se realiza por adición de 1 ml de TEA (trietilamina) 100 mM durante 10 min y neutralización mediante adición de 500 pl de Tris/HCl 1 M, pH 7,4 y 5. En rondas de selección posteriores se aplica la reinfección de las bacterias E. coli TG1 en crecimiento exponencial, la infección con el fago auxiliar VCSM13 y la posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagómidos. Las selecciones se llevan a cabo en 3-5 rondas usando concentraciones de antígeno constantes o decrecientes (de 10'7 M a 2 x 10'9 M). En la ronda 2, la captura de los complejos antígeno-fago se realizó usando placas de neutravidina en lugar de microsesferas de estreptavidina. Todas las reacciones de unión se complementan con seroalbúmina bovina 100 nM o con leche desnatada en polvo para competir por los clones no deseados que surgen de la simple unión adhesiva de los anticuerpos al soporte plástico.

Las selecciones se llevan a cabo en tres o cuatro rondas usando concentraciones decrecientes del antígeno comenzando a partir de 100 nM y bajando hasta 5 nM en la ronda de selección final. Las proteínas de unión específicas se definen como señales aprox. 5 veces mayores que el fondo y se identifican mediante ELISA. Las proteínas de unión específicas se identifican mediante ELISA como sigue: Se recubren 100 pl de antígeno biotinilado 10 nM por pocillo en placas de neutravidina. Se añaden sobrenadantes bacterianos que contienen Fab y se detectan los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Los clones positivos en ELISA se expresan bacterianamente como fragmentos Fab solubles en formato de 96 pocillos y los sobrenadantes se someten a un experimento de cribado cinético mediante análisis SPR usando ProteOn XPR36 (BioRad). Se identifican los clones que expresan Fab con las constantes de afinidad más altas y se secuencian los fagómidos correspondientes. Para una caracterización adicional, las secuencias de Fab se amplifican mediante PCR a partir del fagómido y se clonan por medio de sitios de restricción apropiados en vectores de expresión de IgG1 humana para la producción en mamíferos.

Generación de una colección de anticuerpos de presentación en fagos usando una cadena ligera común específica para CD3e humanizada

Aquí se describe la generación de una colección de anticuerpos para la presentación en el fago M13. Esencialmente, diseñamos una colección de múltiples regiones estructurales para la cadena pesada con una cadena ligera constante (o "común"). Esta colección se diseñó para la generación de anticuerpos biespecíficos de linfocitos T inactivos que contienen Fc, pero que se unen a FcgR, del isotipo IgG1 P329G LALA o IgG4 SPLE PG en los que uno o dos Fab reconocen un antígeno de superficie tumoral expresado en una célula tumoral mientras que el brazo Fab restante del anticuerpo reconoce CD3e en un linfocito T.

Generación de la colección

A continuación, se describe la generación de una colección de anticuerpos para la presentación en el fago M13. Esencialmente, diseñamos una colección de múltiples regiones estructurales para la cadena pesada con una cadena ligera constante (o "común"). Esta colección está diseñada únicamente para la generación de anticuerpos biespecíficos de linfocitos T inactivos que contienen Fc, pero que se unen a FcgR, del isotipo IgG1 P329G LALA o IgG4 SPLE PG.

La diversidad se introdujo mediante aleatorización de oligonucleótidos solo en la CDR3 de las diferentes cadenas pesadas. Los procedimientos para la generación de colecciones de anticuerpos son bien conocidos en la técnica y se describen en Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413; o en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093.

Usamos estas cadenas pesadas en la colección:

IGHV1-46*01 (X92343), (SEQ ID NO: 104)

IGHV1-69*06 (L22583), (SEQ ID NO: 105)

IGHV3-15*01 (X92216), (SEQ ID NO: 106)

IGHV3-23*01 (M99660), (SEQ ID NO: 107)

IGHV4-59*01 (AB019438), (SEQ ID NO: 108)

IGHV5-51*01 (M99686), (SEQ ID NO: 109)

Usamos la cadena ligera derivada del anticuerpo humanizado CH2527 específico para CD3s de macaco y humano en la colección: (VL7_46-13; SEQ ID NO: 112). Esta cadena ligera no se aleatorizó y se usó sin modificaciones adicionales para garantizar la compatibilidad con diferentes proteínas de unión biespecíficas.

Todas las cadenas pesadas usan IGHJ2 como elemento J, excepto IGHV1-69*06 que usa la secuencia IGHJ6. El diseño de la aleatorización se centró solo en la CDR-H3, y se diseñaron oligonucleótidos de PCR que permiten el uso de insertos aleatorios entre el elemento V y el elemento J de 4 a 9 aminoácidos de longitud.

Ejemplo 6

Selección de fragmentos de anticuerpo de colecciones de cadenas ligeras comunes (que comprenden cadenas ligeras con especificidad para CD3e) contra FolRI

Los anticuerpos 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8, 19H3, 20G6 y 20H7 que comprenden la cadena ligera común VL7_46-13 con especificidad para CD3s se obtuvieron mediante selecciones de presentación en fagos contra diferentes especies (humana, de macaco y murina) de FolR1. Los clones 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 21D1, 16F12, 19H3, 20G6 y 20H7 se seleccionaron de una subcolección en la que la cadena ligera común estaba emparejada con un repertorio de cadenas pesadas basado en la línea germinal humana VH1_46. En esta subcolección, la CDR3 de VH1_46 se había aleatorizado en base a 6 longitudes diferentes de CDR3. Los clones 16D5, 15E12, 21A5 y 21G8 se seleccionaron de una subcolección en la que la cadena ligera común estaba emparejada con un repertorio de cadenas pesadas basado en la línea germinal humana VH3_15. En esta subcolección, la CDR3 de VH3_15 se había aleatorizado en base a 6 longitudes diferentes de CDR3. Para obtener anticuerpos de reactividad cruzada de especie (o reactivos para FolR1 murino), las diferentes especies de FolR1 se alternaron (o se mantuvieron constantes) de diferentes maneras en 3 rondas de bioselección (biopanning): 16A3 y 15A1 (FolR1 humano - de macaco - humano); 18D3 (FolR1 de macaco - humano - murino); 19E5 y 19A4 (3 rondas contra FolR1 murino); 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8 (FolR1 humano - de macaco -humano); 19H3, 20G6 y 20H7 (3 rondas contra FolR1 murino).

Los FolR1 humano, murino y de macaco como antígenos para las selecciones de presentación en fagos, así como los cribados basados en ELISA y SPR, se expresaron de forma transitoria como fusión Fc monomérica N terminal en células HEK EBNA y se biotinilaron específicamente en el sitio in vivo por medio de la coexpresión de la biotina ligasa BirA en la secuencia de reconocimiento de la marca de avidina localizada en el extremo C de la porción Fc que lleva la cadena del receptor (cadena de botón Fc). Para evaluar la especificidad para FolR1, se generaron dos receptores relacionados, FolR2 y FolR3 humanos de la misma manera.

Se realizaron rondas de selección (biopanning) en solución de acuerdo con el siguiente patrón:

1. Eliminación previa de ~1012 partículas de fagómidos en placas maxisorp recubiertas con 10 pg/ml de una IgG humana no relacionada para agotar las colecciones de anticuerpos que reconocen la porción Fc del antígeno.

2. Incubación de las partículas de fagómidos que no se unen a Fc con FolR1 biotinilado humano, de macaco o murino 100 nM durante 0,5 h en presencia de una construcción de botón en ojal Fc no biotinilada no relacionada 100 nM para una disminución adicional de las proteínas de unión a Fc en un volumen total de 1 ml.

3. Captura del FolR1 biotinilado y del fago específicamente unido mediante transferencia a 4 pocillos de una placa de microvaloración prerrecubierta con neutravidina durante 10 min (en las rondas 1 y 3).

4. Lavado de los pocillos respectivos con 5 x PBS/Tween20 y 5 x PBS.

5. Elución de las partículas de fagos por adición de 250 pl de TEA (trietilamina) 100 mM por pocillo durante 10 min y neutralización por adición de 500 pl de Tris/HCl 1 M pH 7,4 a los eluidos agrupados de 4 pocillos.

6. Eliminación posterior de los eluidos neutralizados por incubación en una placa de microvaloración prerrecubierta con neutravidina con FolR2 o FolR3 capturado con biotina 100 nM para la eliminación final de las proteínas de unión a Fc e inespecíficas.

7. Reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica con el sobrenadante de partículas de fagos eluidas, infección con el fago auxiliar VCSM13, incubación en un agitador a 30 °C durante la noche y posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagómidos que se va a usar en la siguiente ronda de selección.

Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas usando concentraciones de antígenos constantes de 100 nM. En la ronda 2, para evitar el enriquecimiento en neutravidina de las proteínas de unión, se realizó la captura de complejos antígeno:fago por adición de 5,4 x 107 microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Las proteínas de unión específicas se identificaron mediante ELISA como sigue: Se recubrieron 100 pl de FolR1 biotinilado humano, de macaco o murino 25 nM y 10 pg/ml de IgG humana sobre placas de neutravidina y placas maxisorp, respectivamente. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Los clones que presentan señales en FolR1 humano y son negativos en IgG humana se incluyeron en la preselección para realizar análisis adicionales y también se sometieron a prueba de manera similar contra las dos especies restantes de FolR1. Se expresaron bacterianamente en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificaron por afinidad y se caracterizaron adicionalmente por análisis SPR usando el biosensor ProteOn XPR36 de BioRad.

Las afinidades (Kd) de los clones seleccionados se midieron por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C con FolR1 biotinilado humano, de macaco y murino, así como FolR2 y FolR3 humanos (controles negativos) inmovilizados en chips NLC por captura con neutravidina. Inmovilización de antígenos (ligando): los antígenos recombinantes se diluyeron con PBST (fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4, Tween 20 al 0,005 %) a 10 pg/ml y, a continuación, se inyectaron a 30 pl/minuto en orientación vertical.

Inyección de analitos: para las mediciones de cinética con dosis única, se cambió la dirección de inyección a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución 1:2 de Fab purificado (intervalos de concentración variables) a lo largo de canales 1-5 separados, con tiempos de asociación de 200 s y tiempos de disociación de 600 s. Se inyectó el tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" como referencia. Se calcularon las constantes de velocidad de asociación (kas) y las constantes de velocidad de disociación (kdis) usando un modelo de Langmuir sencillo de unión uno a uno en el programa informático ProteOn Manager v3.1 ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de disociación en equilibrio (KD) como la proporción kdis/kas. La tabla 4 enumera las constantes de disociación en equilibrio (Kd) de los clones seleccionados específicos para FolR1.

Tabla 4: Constantes de disociación en equilibrio (KD) para anticuerpos anti-FolR1 (formato Fab) seleccionados por presentación en fagos de subcolecciones de cadenas ligeras comunes que comprenden VL7_46-13, una cadena ligera humanizada específica para CD3s. Kd en nM.

Ejemplo 7

Selección de fragmentos de anticuerpo de colecciones genéricas de múltiples regiones estructurales para FolRI

Los anticuerpos 11F8, 36F2, 9D11, 5D9, 6B6 y 14E4 se obtuvieron mediante selecciones de presentación en fagos basadas en subcolecciones genéricas de múltiples regiones estructurales contra diferentes especies (humana, de macaco y murina) de FolR1. En estas subcolecciones de múltiples regiones estructurales, diferentes dominios VL con CDR3 aleatorizada (3 longitudes diferentes) se emparejan con diferentes dominios VH con CDR3 aleatorizada (6 longitudes diferentes). Los clones seleccionados son de los siguientes emparejamientos VL/VH: 11F8 (Vk_1_5/VH_1_69), 36F2 (Vk_3_20/VH_1_46), 9D11 (Vk2D_28/VH1_46), 5D9 (Vk3_20/VH1_46), 6B6 (Vk3_20/VH1_46) y 14E4 (Vk3_20/VH3_23). Para obtener anticuerpos de reactividad cruzada de especie (o reactivos para FolR1 murino), las diferentes especies de FolR1 se alternaron (o se mantuvieron constantes) de diferentes maneras en 3 o 4 rondas de bioselección (biopanning): 11F8 (FolR1 de macaco - murino - humano); 36F2 (FolR1 humano - murino - de macaco - murino); 9D11 (FolR1 de macaco - humano - macaco); 5D9 (FolR1 humano - de macaco - humano); 6B6 (FolR1 humano - de macaco - humano) y 14E4 (3 rondas contra FolR1 murino).

4. Lavado de los pocillos respectivos con 5 x PBS/Tween20 y 5 x PBS.

Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas usando concentraciones de antígenos constantes de 100 nM. En las rondas 2 y 4, para evitar el enriquecimiento en neutravidina de las proteínas de unión, se realizó la captura de complejos antígeno:fago por adición de 5,4 x 107 microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Las proteínas de unión específicas se identificaron mediante ELISA como sigue: Se recubrieron 100 pl de FolR1 biotinilado humano, de macaco o murino 25 nM y 10 pg/ml de IgG humana sobre placas de neutravidina y placas maxisorp, respectivamente. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Los clones que presentan señales en FolR1 humano y son negativos en IgG humana se incluyeron en la preselección para realizar análisis adicionales y también se sometieron a prueba de manera similar contra las dos especies restantes de FolR1. Se expresaron bacterianamente en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificaron por afinidad y se caracterizaron adicionalmente por análisis SPR usando el biosensor ProteOn XPR36 de BioRad.

Las afinidades (Kd) de los clones seleccionados se midieron por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C con FolR1 biotinilado humano, de macaco y murino, así como FolR2 y FolR3 humanos (controles negativos) inmovilizados en chips NLC por captura con neutravidina. Inmovilización de antígenos (ligando): los antígenos recombinantes se diluyeron con PBST (fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4, Tween 20 al 0,005 %) a 10 pg/ml y, a continuación, se inyectaron a 30 pl/minuto en orientación vertical. Inyección de analitos: para las mediciones de cinética con dosis única, se cambió la dirección de inyección a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución 1:2 de Fab purificado (intervalos de concentración variables) a lo largo de canales 1 -5 separados, con tiempos de asociación de 150 o 200 s y tiempos de disociación de 200 o 600 s, respectivamente. Se inyectó el tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" como referencia. Se calcularon las constantes de velocidad de asociación (kas) y las constantes de velocidad de disociación (kdis) usando un modelo de Langmuir sencillo de unión uno a uno en el programa informático ProteOn Manager v3.1 ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. La tabla 5 enumera las constantes de disociación en equilibrio (Kd) de los clones seleccionados específicos para FolR1.

Tabla 5: Constantes de disociación en equilibrio (Kd) para anticuerpos anti-FolR1 (formato Fab) seleccionados por presentación en fagos de subcolecciones genéricas de múltiples regiones estructurales. Kd en nM.

Ejemplo 8

Producción y purificación de proteínas de unión a FolRI novedosas en formatos biespecíficos de linfocitos T e IgG

Para identificar las proteínas de unión a FolRI que pueden inducir la destrucción dependiente de linfocitos T de las células diana seleccionadas, los anticuerpos aislados de una colección de Fab o cadenas ligeras comunes se convirtieron al formato IgG1 humano correspondiente. En resumen, se amplificaron las cadenas pesada variable y ligera variable de proteínas de unión a FolR1 únicas de la presentación en fagos mediante reacciones de PCR estándar usando los clones de Fab como molde. Los productos de PCR se purificaron e insertaron (mediante clonación basada en endonucleasas de restricción y ligasas o bien mediante "recombinación" usando el kit InFusion de Invitrogen) en vectores de expresión adecuados en los que se fusionan a la cadena pesada constante humana o cadena ligera constante humana apropiada. Los casetes de expresión en estos vectores consisten en un promotor MPSV quimérico y un sitio de poliadenilación sintético. Además, los plásmidos contienen la región oriP del virus de Epstein-Barr para el mantenimiento estable de los plásmidos en células HEK293 que albergan el antígeno nuclear de EBV (EBNA). Después de la transfección mediada por PEI, los anticuerpos se produjeron de forma transitoria en células HEK293 EBNA y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A estándar seguida de cromatografía de exclusión por tamaño como se describe:

Transfección y producción transitorias

Todos los anticuerpos (biespecíficos) (si no se obtuvieron a partir de una fuente comercial) usados en el presente documento se produjeron de forma transitoria en células HEK 293 EBNA usando un procedimiento de transfección mediada por p E i para los vectores requeridos como se describe a continuación. Las células HEK293 EBNA se cultivan en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se siembran 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección (para escalas alternativas, todas las cantidades se ajustaron en consecuencia). Para la transfección, las células se centrifugan durante 5 min mediante 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclan vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclan con la solución de ADN/PEI, se transfieren a un matraz de agitación de 500 ml y se incuban durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añaden 160 ml de medio FI7 y las células se cultivan durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añade ácido valpórico 1 mM y medio Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recoge el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtra en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añade acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantiene a 4 °C. Después de la producción, se obtuvieron los sobrenadantes y se filtraron los sobrenadantes que contenían anticuerpos a través de filtros estériles de 0,22 pm y se almacenaron a 4 °C hasta su purificación.

Purificación de anticuerpos

Todas las moléculas se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una columna HiTrap PA FF (GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 5 ml) equilibrada con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón A (fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5). Después de lavar con 10 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (citrato de sodio 20 mM, pH 3, NaCl 100 mM, glicina 100 mM) en 12 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se agruparon y el pH de la solución se ajustó suavemente a pH 6,0 (usando Na2HPO40,5 M, pH 8,0). Las muestras se concentraron a 2 ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) y posteriormente se aplicaron a una columna de calidad preparativa HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, Tween-20 al 0,01 %. El contenido agregado de las fracciones eluidas se analizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se aplicaron 30 pl de cada fracción a una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7, a 25 °C. Se combinaron las fracciones que contenían menos de un 2 % de oligómeros y se concentraron a una concentración final de 1-1,5 mg/ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius). Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Las proteínas purificadas se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C. En base a los resultados de caracterización in vitro, las proteínas de unión seleccionadas se convirtieron a un formato biespecífico de linfocitos T. En estas moléculas, los restos de unión a FolR1:CD3 están dispuestos en un orden 2:1 con los Fab de FolR1 localizados en el extremo N. Para los clones aislados de la colección de Fab estándar, la parte de unión a CD3 se generó como un CrossFab (entrecruzamiento CH1 Ck), mientras que para los clones de la colección de cadenas ligeras comunes no fue necesario ningún entrecruzamiento. Estas moléculas biespecíficas se produjeron y purificaron de forma análoga a las IgG.

Tabla 6: Rendimiento y contenido de monómero de proteínas de unión a FolRI novedosas en formato IgG y TCB, respectivamente.

CLC: Cadena ligera común

Ejemplo 9

Formatos biespecíficos de linfocitos T 2+1 y 1+1

Se prepararon cuatro formatos biespecíficos de linfocitos T diferentes para una proteína de unión de la colección de cadenas ligeras comunes (16D5) y tres formatos para una proteína de unión de la colección de Fab (9D11) para comparar sus propiedades de destrucción in vitro.

El formato estándar es el formato invertido 2+1 como ya se describió (restos de unión a FolR1:CD3 dispuestos en un orden 2:1 con los Fab de FolR1 localizados en el extremo N). En el formato clásico 2+1, los restos de unión a FolR1:CD3 están dispuestos en un orden 2:1 con el Fab de CD3 localizado en el extremo N. También se prepararon dos formatos monovalentes. El formato 1+1 cabeza a cola tiene los restos de unión a FolR1:CD3 dispuestos en un orden 1:1 en el mismo brazo de la molécula con el Fab de FolR1 localizado en el extremo N. En el formato 1 1 clásico, los restos de unión a FolR1:CD3 están presentes una vez, cada uno en un brazo de la molécula. Para el clon 9D11 aislado de la colección de Fab estándar, la parte de unión a CD3 se generó como un CrossFab (entrecruzamiento C HIC k), mientras que para el clon 16D5 de la colección de cadenas ligeras comunes no fue necesario ningún entrecruzamiento. Estas moléculas biespecíficas se produjeron y purificaron de forma análoga al formato biespecífico de linfocitos T invertido estándar.

Tabla 7: Resumen del rendimiento y contenido final de monómero de los diferentes formatos biespecíficos de linfocitos T.

Ejemplo 10

Caracterización bioquímica de proteínas de unión a FolRI por resonancia de plasmón superficial

La unión de las proteínas de unión a FolRI como IgG o en el formato biespecífico de linfocitos T a diferentes receptores de folato recombinantes (FolR1, 2 y 3 humano, FolR1 murino y FolR1 de macaco; todos como fusiones Fc) se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (He PES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo / Alemania).

Inyecciones únicas

Primero, las IgG anti-FolR1 se analizaron mediante inyecciones únicas (tabla 1) para caracterizar su reactividad cruzada (con FolR1 humano, murino y de macaco) y especificidad (para FolR1 humano, FolR2 humano, FolR3 humano). Las fusiones Fc monoméricas biotiniladas recombinantes de los receptores de folato 1 humano, de macaco y murino (FolR1-Fc) o los receptores de folato 2 y 3 humano (FolR2-Fc, FolR3-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo / Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300-400 UR. Las IgG se inyectaron durante 60 segundos a una concentración de 500 nM. Las IgG que se unieron a huFolR2 y huFolR3 se rechazaron por falta de especificidad. La mayoría de las proteínas de unión solo tienen reactividad cruzada entre FolR1 humano y de macaco, mientras que la reactividad cruzada adicional para FolR1 murino estuvo la mayor parte del tiempo vinculada a la pérdida de especificidad.

Tabla 8: Reactividad cruzada y especificidad de 25 nuevas proteínas de unión al receptor 1 de folato (como IgG), así como de dos IgG de control (Mov19 y Farletuzumab). significa unión, - significa que no hay unión, /- significa una unión débil.

Avidez por el receptor 1 de folato

La avidez de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FoIRI y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 9).

Las fusiones Fc monoméricas biotiniladas recombinantes del receptor 1 de folato humano, de macaco y murino (FolR1-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo / Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300-400 UR. Las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se pasaron a un intervalo de concentración de 2,1 a 500 nM con un caudal de 30 pl/minuto a través de las cubetas de lectura durante 180 segundos. Se supervisó la disociación durante 600 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia inmovilizada con fusión Fc del receptor de IL2 biotinilada recombinante. Para el análisis de la interacción de IgG 19H3 y el receptor 1 de folato murino, se añadió folato (Sigma F7876) en el tampón de migración HBS-EP a una concentración de 2,3 pM. Las curvas de unión resultantes de la unión bivalente de las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T se aproximaron a una unión de Langmuir 1:1 y se ajustaron a ese modelo (que no es correcto, pero da una idea de la avidez). Las constantes de avidez aparente para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad del ajuste utilizando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 9: Unión bivalente (avidez con Kd aparente) de proteínas de unión a FolR1 seleccionadas como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano y de macaco.

1. Afinidad por el receptor 1 de folato

La afinidad de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 10).

Para la medición de afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 6000-7000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 a 20 nM con un caudal de 10 pl/min durante 20 o 40 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (6,17 a 500 nM o 12,35 a 3000 nM) de fusión de Fc con el receptor 1 de folato humano o de macaco en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 120 o 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 240 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 2,1 o pH 1,5. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 10: Unión monovalente (afinidad) de proteínas de unión a FolR1 seleccionadas como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano y de macaco.

2. Afinidad por CD3

La afinidad de la interacción entre las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FoIRI y CD3só-Fc humano recombinante se determinó como se describe a continuación (tabla 11).

Para la medición de afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 9000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 a 20 nM con un caudal de 10 pl/min durante 40 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (6,17 a 500 nM) de la fusión CD3só-Fc humano en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 240 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 2,1. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 11: Unión monovalente (afinidad) de moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) para FolR1 seleccionadas en CD3-Fc humano.

La parte de unión a CD3 es idéntica para todas las construcciones y la afinidad es similar para las moléculas biespecíficas de linfocitos T medidas (intervalo de Kd entre 60 y 90 nM).

Ejemplo 11

Moléculas biespecíficas de linfocitos T de unión simultánea al receptor 1 de folato y a CD3

La unión simultánea de las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 al receptor 1 de folato recombinante y a CD3só-Fc humano recombinante se determinó mediante resonancia de plasmón superficial como se describe a continuación. Las fusiones Fc monoméricas biotiniladas recombinantes del receptor 1 de folato humano, de macaco y murino (FolR1-Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo / Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300-400 Ur . Las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se inyectaron durante 60 s a 500 nM con un caudal de 30 pl/minutos a través de las cubetas de lectura, seguido de una inyección de huCDsó-Fc durante 60 s a 500 nM. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia inmovilizada con fusión Fc del receptor de IL2 biotinilada recombinante. Las cuatro moléculas biespecíficas de linfocitos T sometidas a prueba (TCB 16D5, TCB 21A5, TCB 51C7 y TCB 45D2) se pudieron unir simultáneamente al receptor 1 de folato y a CD3 humano como se esperaba.

Ejemplo 12 Agrupación de epítopos

Para la agrupación de epítopos, las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T ant¡-FolR1 se inmovilizaron directamente en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare), con una respuesta final de alrededor de 700 UR. A continuación, se capturó huFolR1-Fc 500 nM durante 60 s, seguido de 500 nM de las diferentes proteínas de unión durante 30 s. La superficie se regeneró con dos inyecciones de glicina 10 mM a pH 2 durante 30 s cada una. Se evalúa si las diferentes proteínas de unión se pueden unir a huFolR1 capturado en proteínas de unión inmovilizadas (tabla 12).

Tabla 12: Caracterización de epítopos de proteínas de unión a FolR1 seleccionadas como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano. significa unión, - significa que no hay unión, /- significa una unión débil

En base a estos resultados y a datos adicionales con unión simultánea a huFolR1 inmovilizado, las proteínas de unión se separaron en tres grupos. No está claro si 9D11 tiene un epítopo separado, ya que desplaza a todas las demás proteínas de unión. 16D5 y 21A5 parecen estar en el mismo grupo y Mov19, Farletuzumab (Coney et al., Cancer Res.

1991 Nov 15; 51(22): 6125-32; Kalli et al., Curr Opin Investig Drugs. 2007 Dic; 8(12): 1067-73) y 36F2 en otro (tabla 13). Sin embargo, 36F2 se une a un epítopo diferente que Mov19 y Farletuzumab, ya que se une a FolR1 humano, de macaco y murino.

Tabla 13: Agrupación de epítopos de proteínas de unión a FolR1 seleccionadas como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano

Ejemplo 13 Selección de proteínas de unión

Las proteínas de unión a FolR1 en los formatos IgG se cribaron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) y mediante ensayo in vitro en células para seleccionar los mejores candidatos.

Las IgG anti-FolR1 se analizaron mediante SPR para caracterizar su reactividad cruzada (con FolR1 humano, murino y de macaco) y especificidad (para FolR1 humano, FolR2 humano, FolR3 humano). La unión inespecífica a FolR2 y 3 humanos se consideró un factor de exclusión. La unión y la especificidad para FolR1 humano se confirmó en las células. Algunas proteínas de unión no se unieron a las células que expresaban FolR1 aunque reconocieron el FolR1 humano recombinante en SPR. Se determinó la temperatura de agregación, pero no fue un factor de exclusión, ya que las proteínas de unión seleccionadas eran todas estables. Las proteínas de unión seleccionadas se sometieron a prueba en un ELISA de polirreactividad para verificar la unión no específica, lo que dio lugar a la exclusión de cuatro proteínas de unión. Este procedimiento dio como resultado una selección inicial de tres proteínas de unión: 36F2 (colección Fab), 9D11 (colección Fab) y 16D5 (cadena ligera común). 36F2 se disoció rápidamente de huFolR1 y, por lo tanto, inicialmente no se favoreció.

Ejemplo 14

Unión específica de proteínas de unión a FolR1 recientemente generadas a células tumorales positivas para FolR1 humano

Se generaron nuevas proteínas de unión a FolR1 por medio de presentación en fagos usando una colección de Fab o una colección de cadenas ligeras comunes usando la cadena ligera de CD3. Las proteínas de unión identificadas se convirtieron a un formato IgG1 humano y se abordó la unión a células HeLa de alta expresión de FolR1. Como molécula de referencia se incluyó la proteína de unión a FolRI humano Moví 9. La mayoría de las proteínas de unión sometidas a prueba en este ensayo mostraron una unión a FolRí de intermedia a buena con algunos clones uniéndose igual de bien que Mov19 (véase la figura 2). Los clones 16A3, 18D3, 15H7, 15B6, 21D1, 14E4 y 16F12 se excluyeron porque la unión a FolR1 en las células no se pudo confirmar por citometría de flujo. En una siguiente etapa, se sometió a prueba la especificidad de los clones seleccionados para FolR1 humano excluyendo la unión al FolR2 humano estrechamente relacionado. Las células HEK se transfectaron de forma transitoria con FolR1 humano o FolR2 humano para abordar la especificidad. Los clones 36F2 y 9D11 derivados de la colección Fab y los clones 16D5 y 21A5 derivados de la colección CLC se unieron específicamente a FolR1 humano y no a FolR2 humano (véanse las figuras 3A-B). Todos los demás clones sometidos a prueba mostraron al menos algo de unión a FolR2 humano (véanse las figuras 3A-B). Por lo tanto, estos clones se excluyeron de la caracterización adicional. En paralelo, la reactividad cruzada de los clones de FolR1 a FolR1 de macaco se abordó realizando estudios de unión a células HEK transfectadas de forma transitoria con FolR1 de macaco. Todos los clones sometidos a prueba se pudieron unir a FolR1 de macaco y los cuatro clones específicos seleccionados de FolR1 humano 36F2, 9D11, 16D5 y 21A5 se unieron comparativamente bien a FolR1 humano y de macaco (figura 4). Posteriormente, tres proteínas de unión de reactividad cruzada con macaco específicas de FolR1 humano se convirtieron al formato TCB y se sometieron a prueba para determinar la inducción de la destrucción por linfocitos T y la activación de linfocitos T. Estos clones fueron 9D11 de la colección Fab y 16D5 y 21A5 de la colección CLC. Como molécula de referencia se incluyó TCB FolR1 Mov19 en todos los estudios. Estos TCB FolR1 se usaron a continuación para comparar la inducción de internalización después de unirse a FolR1 en células HeLa. Los tres clones sometidos a prueba se internalizan tras la unión a FolR1 de manera comparable a la internalización tras la unión de TCB FolR1 Mov19 (figura 5). TCB FolR121A5 se suspendió debido a signos de polirreactividad.

Ejemplo 15

Destrucción mediada por linfocitos T de células diana tumorales que expresan FolRI inducida por anticuerpos TCB FolR1

Las TCB FolR1 se usaron para determinar la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales que expresan FolR1. Se usó un panel de posibles líneas celulares diana para determinar los sitios de unión a FolR1 mediante análisis Qifikit.

El panel de células tumorales usado contiene células tumorales con expresión alta, intermedia y baja de FolR1 y una línea celular negativa para FolR1.

Tabla 14: Sitios de unión a FolR1 en células tumorales

La unión de las tres TCB FolR1 diferentes (que contienen las proteínas de unión 9D11, 16D5 y Mov19) a este panel de líneas celulares tumorales se determinó, lo que demuestra que las TCB FolR1 se unen específicamente a las células tumorales que expresan FolR1 y no a una línea celular tumoral negativa para FolR1. La cantidad de construcción unida es proporcional al nivel de expresión de FolR1 y todavía existe una buena unión de las construcciones a la línea celular de baja expresión de FolR1 HT-29 detectable. Además, no existe unión del control negativo TCB DP47 a ninguna de las líneas celulares usadas (figuras 6A-E).

La línea celular de expresión intermedia SKOV3 y la línea celular de expresión baja HT-29 se usaron adicionalmente para someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T y la activación de linfocitos T usando TCB 16D5 y TCB 9D11; TCB DP47 se incluyó como control negativo. Ambas líneas celulares se destruyeron ya en presencia de niveles muy bajos de TCB 16D5 y TCB 9D11 y no existió diferencia en la actividad entre ambas TCB aunque TCB 9D11 se une más fuertemente a FolR1 que TCB 16D5. La destrucción global de células SKOV3 fue mayor en comparación con HT-29, que refleja los niveles de expresión más altos de FolR1 en células SKOV3 (figuras 7A-D). En línea con esto, se detectó una fuerte regulación por incremento del marcador de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. La activación de los linfocitos T fue muy similar en presencia de células SKOV3 y células HT-29. El control negativo TCB DP47 no induce ninguna destrucción a las concentraciones usadas y no existió una regulación por incremento significativa de CD25 y CD69 en los linfocitos T.

Tabla 15: Valores de CE50 de destrucción de células tumorales y activación de linfocitos T con células SKOV3

Tabla 16: Valores de CE50 de destrucción de células tumorales y activación de linfocitos T con células HT-29

Ejemplo 16

Unión a eritrocitos y activación de linfocitos T en sangre completa

Para demostrar que no existe activación espontánea en ausencia de células tumorales que expresan FolR1, analizamos si existe unión de los clones de FolR1 a eritrocitos que potencialmente podrían expresar FolR1. No pudimos observar ninguna unión específica de IgG 9D11, IgG 16D5 e IgG Mov19 a los eritrocitos, incluyendo IgG DP47 de control negativo (figura 8).

Para excluir cualquier unión inespecífica adicional a los glóbulos sanguíneos o la activación inespecífica por medio de TCB FolR1, se añadieron TCB 9D11, TCB 16D5 y TCB Mov19 a la sangre completa y se analizó la regulación por incremento de CD25 y CD69 en los linfocitos T c D4+ y los linfocitos T CD8+ por citometría de flujo. La TCB DP47 se incluyó como control negativo. No se pudo observar activación de los linfocitos T con ninguna de las construcciones sometidas a prueba al analizar la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ (figura 9).

Ejemplo 17

Eliminación del sitio de N-glucosilación en la cadena ligera de 9D11

Durante el análisis de las diferentes proteínas de unión a FolR1 para identificar posibles puntos calientes de secuencia, se identificó un supuesto sitio de N-glucosilación al final de la c Dr L3 del clon 9D11. Normalmente, el motivo consenso para la N-glucosilación se define como N-X-S/T-X (donde X no es P). La secuencia de CDR L3 (MQASIMNRT (SEQ ID NO: 46)) coincide perfectamente con este motivo consenso que tiene la secuencia N-R-T. Dado que la glucosilación podría no ser completamente reproducible entre diferentes lotes de producción, esto podría tener un impacto en la unión a FolR1, si la glucosilación en CDR L3 contribuye a la unión al antígeno. Para evaluar si este sitio de N-glucosilación es importante para la unión a FolR1, o si se podría reemplazar sin afectar a la unión, se generaron diferentes variantes de la cadena ligera de 9D11 en las que el sitio de N-glucosilación se intercambió por mutagénesis específica de sitio.

1. Transfección y producción transitorias

Las cuatro moléculas biespecíficas de linfocitos T se produjeron de forma transitoria en células EBK HEK293 usando un procedimiento de transfección mediado por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Las células HEK293 EBNA se cultivaron en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección (para escalas alternativas, todas las cantidades se ajustaron en consecuencia). Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 min a 210 x g y el sobrenadante se reemplazó por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcló con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió ácido valpórico 1 mM y medio Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recogió el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añadió acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C. Después de la producción, se obtuvieron los sobrenadantes y se filtraron los sobrenadantes que contenían anticuerpos a través de filtros estériles de 0,22 pm y se almacenaron a 4 °C hasta su purificación.

2. Purificación de anticuerpos

Todas las moléculas se purificaron en dos etapas usando procedimientos estándar, tales como cromatografía de afinidad con proteína A (Ákta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una columna HiTrap PA HP (GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 5 ml) equilibrada con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón A (fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %, pH 7,5). Después de lavar con 10 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (citrato de sodio 20 mM, pH 2,5, NaCl 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %) en 20 Vc . Las fracciones que contenían la proteína de interés se agruparon y el pH de la solución se ajustó suavemente a pH 6,0 (usando Tris 2 M, pH 8,0). Las muestras se concentraron a 1 ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) y posteriormente se aplicaron a una columna Superdex™ 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, Tween-20 al 0,01 %. El contenido agregado de las fracciones eluidas se analizó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Por lo tanto, se aplicaron 30 pl de cada fracción a una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7, a 25 °C. Se combinaron las fracciones que contenían menos de un 2 % de oligómeros y se concentraron a una concentración final de 1-1,5 mg/ml usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius). Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Las proteínas purificadas se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.

3. Temperatura de agregación

La estabilidad de las cuatro construcciones se sometió a prueba en un Optim 1000 (Avacta, PALL Corporation) mediante un gradiente de calentamiento de 25 °C a 80 °C a 0,1 °C/min. Se registra la temperatura al inicio de la agregación.

Tabla 34: Rendimiento, contenido de monómero y temperatura de agregación de cuatro mutantes inactivados en el sitio de N-glucosilación de la proteína de unión 9D11 en el formato biespecífico de linfocitos T 2+1 invertido. Los cuatro mutantes se comportaron de manera similar a la proteína de unión 9D11 natural

Se generaron las siguientes variantes: N100S (N95S); N100Q (N95Q), T102A (T97A) y T102N (T97N) (la numeración de Kabat se indica entre paréntesis) y se convirtieron al formato biespecífico de linfocitos T. Después de la producción transitoria en células HEK293 EBNA y la purificación, se analizaron las diferentes variantes para determinar la actividad de unión a la diana y destrucción celular en comparación con el clon 9D11 original.

Tabla 17: Cebadores usados para la eliminación del sitio de N-glucosilación en CDR L3 de 9D11 (las secuencias se muestran a continuación)

Ejemplo 18

Unión y destrucción mediada por linfocitos T con variantes aglucosiladas de 9D11

Debido a un sitio de glucosilación en las CDR, se produjeron cuatro variantes de 9D11 diferentes con una mutación que elimina el sitio de glucosilación (ejemplo 17). Estas cuatro variantes se sometieron a prueba en comparación con el 9D11 original en cuanto a la unión a FolR1 en células HeLa (figura 10) y la inducción de la destrucción de células tumorales en SKOV3 y HT-29 (figuras 11A-B, E-F). Ninguna de las variantes mostró diferencias en cuando a la unión o inducción de la destrucción de células tumorales. En paralelo, se abordó la destrucción inespecífica de las líneas celulares MKN-45 negativas para FolR1 (figuras 11C-D). Además, no se pudieron observar diferencias entre las variantes y la proteína de unión original. Ninguna de las construcciones indujo destrucción inespecífica en las células tumorales negativas para FolR1.

Ejemplo 19

Expresión de FolRI en células epiteliales primarias

FolR1 se expresa a niveles bajos en las células epiteliales primarias. Aquí queríamos someter a prueba si estos niveles son suficientes para inducir la destrucción mediada por linfocitos T en presencia de las TCB FolR1. Para ello, usamos células epiteliales bronquiales humanas primarias, células epiteliales del plexo coroideo humana primarias, células epiteliales corticales renales humanas primarias y células epiteliales de pigmento retiniano humanas primarias. Como control positivo se incluyeron células HT-29 o células SKOV3 positivas para FolR1. En primer lugar, verificamos la expresión de FolR1 en las células primarias usadas y determinamos la cantidad de sitios de unión a FolR1 en estas células. Las células epiteliales bronquiales, las células epiteliales corticales renales y las células epiteliales de pigmento retiniano expresan niveles muy bajos pero significativos de FolR1 en comparación con los niveles expresados en células tumorales. Las células epiteliales del plexo coroideo no expresan niveles significativos de FolR1.

Tabla 18: Sitios de unión a FolR1 en células epiteliales primarias

Las células epiteliales primarias que demostraron expresión de FolR1 en la superficie se usaron para abordar la cuestión de si estas células se pueden destruir por linfocitos T en presencia de las TCB FolR1. No se pudieron medir niveles significativos de destrucción, pero se detectó inducción de la activación de los linfocitos T en presencia de células epiteliales de pigmento retiniano, células epiteliales bronquiales y células corticales renales, dando como resultado una regulación por incremento de CD25 y CD69. La activación más fuerte se observa con las células epiteliales de pigmento retiniano, dando como resultado una regulación por incremento de CD25 y CD69 tanto en linfocitos T c D4+ como en linfocitos T CD8+. En presencia de células epiteliales bronquiales se induce una menor activación de linfocitos T con regulación por incremento de CD69 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+, pero con una regulación por incremento muy baja de CD25 solo en linfocitos T CD4+ pero no en linfocitos T CD8+. La activación más baja de linfocitos T se obtiene en presencia de células epiteliales renales, sin regulación por incremento de CD25 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ y observando regulación por incremento de CD69 solo en linfocitos T CD8+ (figuras 12A-X).

Ejemplo 20

Comparación de diferentes formatos de TCB que contienen proteína de unión 16D5 o 9D11

Para determinar si el formato TCB 2+1 invertido es el formato más activo con la proteína de unión a FolR1 seleccionada, se produjeron diferentes formatos que contenían 16D5 o 9D11 y se compararon en cuanto a la unión a células diana, la destrucción mediada por linfocitos T y la activación de linfocitos T. La proteína de unión 16D5 se sometió a prueba en los formatos TCB 2+1 invertido (Fig. 1A), TCB 2+1 clásico (Fig. 1D), TCB 1 1 clásico (Fig. 1C) y TCB 1 1 cabeza a cola (Fig. 1B); la proteína de unión 9D11 se sometió a prueba en los formatos TCB 2+1 invertido (Fig. 1A), TCB 1+1 clásico (Fig. 1C) y TCB 1 1 cabeza a cola (Fig. 1B).

Todas las construcciones se sometieron a prueba para determinar la unión a FolR1 en células HeLa. Las moléculas bivalentes para la unión a FolR1 se unen más fuertemente en comparación con las construcciones monovalentes debido a la avidez. La diferencia entre las construcciones bivalentes y las monovalentes es más pronunciada para 16D5. El motivo podría ser que, debido a la menor afinidad de 16D5, el efecto de avidez para esta proteína de unión es más fuerte. Entre las dos TCB 1 1 no existe una diferencia significativa en cuando a la unión, pero existe diferencia entre las dos construcciones 2+1. La construcción 2+1 invertida se une más fuertemente a FolR1 que la construcción 2+1 clásica. Esto indica que, en la construcción 2+1 clásica la unión a FolRI está influenciada por la presencia de Fab CD3, mientras que en la construcción invertida la unión está menos influenciada.

Al someter a prueba la destrucción mediada por linfocitos T con estas construcciones, podríamos demostrar que la unión más fuerte de la TCB 2+1 invertida se traduce en una destrucción de células tumorales más fuerte y una activación de linfocitos T más fuerte en comparación con la TCB 2+1 clásica. La construcción TCB FolR1 16D52+1 clásica es solo ligeramente más activa que la respectiva construcción 1 1 cabeza a cola. La construcción 1 1 cabeza a cola es significativamente más activa que la construcción 1 1 clásica. Esto no refleja la situación observada en la unión y se podría deber a una mejor reticulación con la construcción cabeza a cola. La destrucción global de las células tumorales y la activación de linfocitos T son comparables con todas las construcciones sometidas a prueba, observándose diferencias en la potencia solo en términos de valores de CE50. En general, se puede concluir que, independientemente de la proteína de unión usada, el formato TCB FolR1 2+1 invertido es el formato preferente para inducir la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T y la activación de linfocitos T (véanse las Fig. 13A-C y Fig. 14A-C).

Tabla 19: Valores de CE50 de unión a células diana y destrucción mediada por linfocitos T con diferentes formatos de TCB

Tabla 20: Valores de CE50 de activación de linfocitos T en presencia de células SKOV3 con diferentes formatos de TCB

Ejemplo 21

Líneas celulares tumorales y células primarias

Se obtuvieron células HeLa (CCL-2) de ATCC y se cultivaron en DMEM con FCS al 10 % y glutamina 2 mM, se obtuvieron células SKOV3 (Ht B-77) de ATCC y se cultivaron en RPMI con FCS al 10 % y glutamina 2 mM, se obtuvieron células OVCAR5 de NCI y se cultivaron en RPMI con FCS al 10 % y glutamina 2 mM, se obtuvieron células HT-29 (ACC-299) de DSMZ y se cultivaron en medio McCoy 5A con FCS al 10 % y glutamina 2 mM, se obtuvieron células MKN-45 (ACC-409) de DSMZ y se cultivaron en RPMI con FCS al 10 % y glutamina 2 mM.

Todas las células epiteliales primarias sometidas a prueba se obtuvieron de ScienCell Research Laboratories. Se cultivaron células de epitelio bronquial humano (HBEpiC, n.° cat. 3210) en medio para células epiteliales bronquiales (BEpiCM, n.° cat. 3211, ScienCell). Se cultivaron células epiteliales del colon humano (HCoEpiC, n.° cat. 2950) en medio para células epiteliales del colon (CoEpiCM, n.° cat. 2951, ScienCell). Se cultivaron células epiteliales de pigmento retiniano humanas (HRPEpiC, n.° cat. 6540) en medio de células epiteliales (EpiCM, n.° cat.4101, ScienCell). Se cultivaron células epiteliales corticales renales humanas (HRCEpiC, n.° cat. 4110) en medio de células epiteliales (EpiCM, n.° cat. 4101, ScienCell). Se cultivaron células epiteliales del plexo coroideo humanas (HCPEpiC, n.° cat.

1310) en medio de células epiteliales (EpiCM, n.° cat. 4101, ScienCell).

Ejemplo 22

Unión a células diana por citometría de flujo

Las células diana como se indica se recogieron con tampón de disociación celular, se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón FACS. La tinción de anticuerpos se realizó en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Por lo tanto, se sembraron 200.000 células por pocillo. La placa se centrifugó durante 4 min a 400 g y se retiró el sobrenadante. Los anticuerpos de prueba se diluyeron en tampón FACS y se añadieron 20 pl de la solución de anticuerpo a las células durante 30 min a 4 °C. Para eliminar el anticuerpo no unido, las células se lavaron dos veces con tampón FACS antes de la adición del anticuerpo secundario diluido (anticuerpo caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento Fcy anti-IgG humana conjugado con FITC, Jackson ImmunoResearch n.° 109-096 098 o anticuerpo caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento Fcy anti-IgG humana conjugado con PE, Jackson ImmunoResearch n.° 109-116-170). Después de 30 min de incubación a 4 °C, el anticuerpo secundario no unido se eliminó por lavado. Antes de la medición, las células se resuspendieron en 200 pl de tampón FACS y se analizaron por citometría de flujo usando Canto II de BD o Fortessa de BD.

Ejemplo 23 Internalización

Se recogieron las células y se determinó la viabilidad. Las células se resuspendieron en medio frío reciente a 2 millones de células por ml y la suspensión celular se transfirió a un tubo Falcon de 15 ml para cada anticuerpo. Los anticuerpos que debían someterse a prueba para determinar la internalización se añadieron a las células a una concentración final de 20 pg por ml. Los tubos se incubaron durante 45 min en la cámara fría en un agitador. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS frío para eliminar los anticuerpos no unidos. Se transfirieron 0,2 millones de células por pocillo a la placa FACS como punto temporal cero. Las células marcadas se resuspendieron en medio tibio y se incubaron a 37 °C. En los puntos temporales indicados, se transfirieron 0,2 millones de células por pocillo en PBS frío, se lavaron en la placa FACS. Para detectar las construcciones que permanecen en la superficie, las células se tiñeron con anticuerpo secundario anti-Fc humano marcado con PE. Por lo tanto, se añadieron 20 pl por pocillo del anticuerpo diluido y la placa se incubó durante 30 min a 4 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos y se fijaron con PFA al 1 % para evitar cualquier internalización adicional. La fluorescencia se midió usando FACS Canto II de BD.

Ejemplo 24

Análisis QIFIKIT®

QIFIKIT® contiene una serie de microesferas de 10 pm de diámetro y recubiertas con cantidades diferentes, pero bien definidas de moléculas Mab de ratón (anti-CD5 humano de alta afinidad, Clon CRIS-1, isotipo IgG2a). Las microesferas imitan células con diferentes densidades de antígeno que se han marcado con un Mab de ratón primario de isotipo IgG. En resumen, las células se marcaron con anticuerpo monoclonal primario de ratón dirigido contra el antígeno de interés. En un pocillo de prueba separado, las células se marcaron con anticuerpo monoclonal de ratón irrelevante (control de isotipo). A continuación, las células, las microesferas de configuración y las microesferas de calibración se marcaron con un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con fluoresceína incluido en el kit. El anticuerpo primario usado para marcar las células se tiene que usar a concentración saturante. El anticuerpo primario puede ser de cualquier isotipo de IgG de ratón. En estas condiciones, el número de moléculas de anticuerpo primario unidas corresponde al número de sitios antigénicos presentes en la superficie celular. El anticuerpo secundario también se usa a concentración saturante. En consecuencia, la fluorescencia se correlaciona con el número de moléculas de anticuerpo primario unidas en las células y en las microesferas.

Ejemplo 25

Destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T y activación de linfocitos T

Las células diana se recogieron con tripsina/EDTA, se contaron y se verificó su viabilidad. Las células se resuspendieron en su medio respectivo a una concentración final de 300.000 células por ml. A continuación, se transfirieron 100 pl de la suspensión de células diana a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano. La placa se incubó durante la noche a 37 °C en la incubadora para permitir la adherencia de las células a la placa. Al día siguiente, se aislaron PBMC de sangre completa de donantes sanos. La sangre se diluyó 2:1 con PBS y se superpuso en 15 ml de Histopaque-1077 (n.° 10771, Sigma-Aldrich) en tubos Leucosep y se centrifugó durante 30 min a 450 x g sin interrupción. Después de la centrifugación, la banda que contenía las células se recogió con una pipeta de 10 ml y se transfirió a tubos de 50 ml. Los tubos se llenaron con PBS hasta 50 ml y se centrifugaron (400 x g, 10 min, temperatura ambiente). El sobrenadante se eliminó y el sedimento se resuspendió en PBS. Después de la centrifugación (300 x g, 10 min, temperatura ambiente), se descartaron los sobrenadantes, se agruparon 2 tubos y se repitió la etapa de lavado (esta vez con centrifugación a 350 x g, 10 min, temperatura ambiente). Posteriormente, las células se resuspendieron y los sedimentos se agruparon en 50 ml de PBS para el recuento celular. Después de contarlas, las células se centrifugaron (350 x g, 10 min, temperatura ambiente) y se resuspendieron a 6 millones de células por ml en RPMI con FCS al 2 % y glutamina 2 nM. Se retiró el medio de las células diana sembradas y se añadieron los anticuerpos de prueba diluidos en RPMI con FCS al 2 % y glutamina 2 nM. Se transfirieron 300.000 células de la solución de células efectoras a cada pocillo, dando como resultado una proporción E:T de 10:1. Para determinar la liberación máxima, las células diana se lisaron con Triton X-100. La liberación de LDH se determinó después de 24 h y 48 h usando el kit de detección de citotoxicidad (n.° 1644793, Roche Applied Science). La regulación por incremento del marcador de activación en los linfocitos T después de la destrucción de las células tumorales se midió por citometría de flujo. En resumen, se recogieron los PBMC, se transfirieron a una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se tiñeron con anticuerpos CD4 PE-Cy7 (n.° 3557852, BD Bioscience), CD8 FITC (n.° 555634, BD Bioscience), CD25 APC (n.° 555434, BD Bioscience), Cd 69 PE (n.° 310906, BioLegend) diluidos en tampón FACS. Después de 30 min de incubación a 4 °C, las células se lavaron dos veces con tampón FACS. Antes de medir la fluorescencia usando Canto II de BD, las células se resuspendieron en 200 pl de tampón FACS.

Ejemplo 26

Activación de linfocitos T en sangre completa

Se añadieron 280 pl de sangre fresca a una placa de pocillos profundos cónicos de 96 pocillos. A continuación, se añadieron a la sangre 20 pl de las TCB diluidas y se mezclaron bien agitando la placa. Después de 24 h de incubación a 37 °C en una incubadora, la sangre se mezcló y se transfirieron 35 pl a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. A continuación, se añadieron 20 pl de la mezcla de tinción de anticuerpos que consistía en CD4 PE-Cy7 (n.° 3557852, BD Bioscience), CD8 FITC (n.° 555634, BD Bioscience), CD25 APC (n.° 555434, BD Bioscience), CD69 PE (n.° 310906, BioLegend) y CD45 V500 (n.° 560777, BD Horizon) y se incubaron durante 15 min en oscuridad a temperatura ambiente. Antes de la medición, se añadieron 200 pl de solución de lisis FACS de BD recién preparada (n.° 349202, BD FCAS) a la sangre. Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente, las células se sometieron a medición con Fortessa de BD.

Ejemplo 27

Estudio SDPK (farmacocinética de dosis única) de TCB FolR1 humanizada (clon 16D5) en ratones NOD/Shiscid/IL-2RYnull (NOG) inmunodeficientes

Ratones NOD/Shi-scid/IL-2RYnuN (NOG) hembra de 6-7 semanas de edad al inicio del experimento (adquiridos a Taconic, Dinamarca) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz y 12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Las autoridades gubernamentales locales revisaron y aprobaron el protocolo del estudio experimental (P 2011/128). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de manera regular.

Los ratones recibieron una inyección i.v. con 10/1/0,1 pg de TCB FolR1 por ratón, mientras que a 3 ratones por grupo y punto temporal se les extrajo una muestra de sangre. Todos los ratones recibieron una inyección i.v. con un volumen total de 200 pl de la solución apropiada. Para obtener la cantidad apropiada de TCB FolR1 por 200 pl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. Se recogieron muestras de suero 5 min, 1 h, 3 h, 8 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 168 h después de la inyección de tratamiento.

La figura 15 muestra que la TCB FolR1 16D5 muestra propiedades farmacocinéticas similares a IgG típicas y proporcionales a la dosis en ratones NOG con aclaramiento lento.

Tabla 21

Ejemplo 28

Eficacia in vivo de TCB FolRI (clon 16D5) después de la transferencia de PBMC humanos en ratones NOG portadores de Skov3

La TCB FolRI se sometió a prueba en la línea celular de carcinoma de ovario humano Skov3, inyectada s.c. en ratones NOG con PBMC injertados.

Las células de carcinoma de ovario Skov3 se obtuvieron de ATCC (HTB-77). La línea celular tumoral se cultivó en RPMI que contenía FCS al 10 % (Gibco) a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. Se usó el pase 35 para el trasplante, a una viabilidad >95 %. Se inyectaron s.c. 5 x 106 células por animal en el flanco derecho de los animales en un total de 100 pl de medio de cultivo celular RPMI (Gibco).

Ratones NOD/Shi-scid/IL-2RYnull (NOG) hembra de 6-7 semanas de edad al inicio del experimento (adquiridos a Taconic, Dinamarca) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz y 12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). Las autoridades gubernamentales locales revisaron y aprobaron el protocolo del estudio experimental (P 2011/128). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de manera regular.

De acuerdo con el protocolo (figura 16), los ratones recibieron una inyección s.c. el día 0 de estudio con 5 x 106 células Skov3. El día 21 de estudio, los PBMC humanos de un donante sano se aislaron mediante el procedimiento de Ficoll y se inyectaron 10 x 106 células i.p. en los ratones portadores de tumor. Dos días después, los ratones se aleatorizaron y se distribuyeron por igual en cinco grupos de tratamiento (n = 12), seguido de inyección i.v. con 10/1/0,1 pg de TCB FolR1 por ratón o 10 pg de DP47 por ratón como TCB de control una vez por semana durante tres semanas. Los ratones recibieron una inyección i.v. de 200 pl de la solución apropiada.

Los ratones del grupo de vehículo recibieron una inyección con PBS. Para obtener la cantidad apropiada de TCB por 200 pl, las soluciones madre se diluyeron con PBS cuando fue necesario. El crecimiento del tumor se midió una vez por semana usando un calibrador (figura 17) y el volumen del tumor se calculó como sigue:

Tv: (W2/2) x L (W: Anchura, L: Longitud)

La inyección semanal de TCB FolR1 dio como resultado un efecto antitumoral dependiente de la dosis. Mientras que una dosis de 10 pg/ratón y 1 pg/ratón indujeron la reducción del volumen tumoral, 0,1 pg/ratón indujo una estasis tumoral (figura 17, tabla 22). La reducción máxima del volumen tumoral se logró a una dosis de 10 pg/ratón en comparación con una TCB de control DP47 no dirigida.

Tabla 22

Para las lecturas de PD, se sacrificaron tres ratones por grupo de tratamiento el día 32 de estudio, se extirparon los tumores y se prepararon suspensiones de células individuales a través de una digestión enzimática con Colagenasa V, Dispasa II y DNasa para el posterior análisis FACS (figuras 19 y 20). Las células individuales se usaron directamente para la tinción de antígenos extracelulares y marcadores de activación o se reestimularon usando 5 ng/ml de PMA y 500 ng/ml de ionomicina en presencia de un inhibidor del transporte de proteínas monensina durante 5 h en medio de cultivo normal. Después de la reestimulación, las células se tiñeron para antígenos de superficie, seguido de una etapa de fijación y permeabilización. Las muestras fijadas se tiñeron intracelularmente para TNF-a, IFN-y, IL-10 e IL-2 y se analizaron por citometría de flujo. Se usó el mismo procedimiento para la desgranulación de las células, pero se añadió un anticuerpo anti-CD107a durante el período de reestimulación y las muestras fijadas se tiñeron para el contenido intracelular de perforina y granzima B. El análisis FACS reveló un número estadísticamente mayor de linfocitos T CD4+ y CD8+ infiltrantes en el tejido tumoral tras el tratamiento con TCB FolR1 en comparación con el vehículo y la TCB de control no dirigida. Además, se detectaron números mayores de linfocitos T CD4+ y CD8+ que producían TNF-a, IFN-p e IL-2, así como positivos para perforina/granzima B en tumores tratados con TCB FolR1. Los linfocitos T infiltrantes de tumor tratados con TCB FolRI también mostraron mayores tasas de desgranulación en comparación con los grupos de control.

Al finalizar el estudio el día 38, todos los animales fueron sacrificados; se extirparon los tumores y se pesaron (figura 18). El peso de los tumores tratados con 10 y 1 pg de TCB FolRI por ratón mostró una diferencia estadísticamente significativa en comparación con los grupos de control.

Tabla 23

Ejemplo 29

Generación de un anticuerpo biespecífico FolR1/CD3-kappa-lambda

Para generar un anticuerpo biespecífico (monovalente para cada antígeno) que se pueda unir simultáneamente a CD3 humano y al receptor de folato humano alfa (FolR1) sin usar ningún enfoque de heterodimerización (por ejemplo, tecnología de botón en ojal), se aplicó una combinación de una colección de cadenas ligeras comunes con la llamada tecnología CrossMab: la región variable de la proteína de unión a CD3 humanizada (CH2527_VL7 46/13) se fusionó con el dominio CH1 de un anticuerpo humano anti-IgG1 estándar para formar la molécula cruzada VLVH (fusionada con Fc) que es común para ambas especificidades. Para generar los equivalentes cruzados (VHCL), se fusionó un dominio de la cadena pesada variable específico para CD3 (CH2527_VH_23/12) a una cadena ligera A humana constante, mientras que un dominio de la cadena pesada variable específico para FolR1 humano (clon 16D5, aislado de la colección de cadenas ligeras comunes) se fusionó con una cadena ligera k humana constante. Esto permite la purificación del anticuerpo biespecífico deseado mediante la aplicación de etapas de purificación posteriores con las columnas KappaSelect y LambdaFabSelect (GE Healthcare) para eliminar los anticuerpos homodiméricos no deseados.

Todos los vectores de expresión de anticuerpos se generaron usando una tecnología de ADN recombinante estándar como se describe en Sambrook, J. etal., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los genes o fragmentos de genes se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o bien se generaron a partir de oligonucleótidos sintéticos en Geneart AG (Regensburg, Alemania) mediante síntesis génica automatizada. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR o subclonados se confirmaron mediante secuenciación del ADN (Synergene GmbH, Suiza). El ADN plasmídico se transformó y amplificó en cepas huésped de E. coli adecuadas para la preparación de ADN plasmídico de calidad para la transfección usando kits Maxiprep (Qiagen) estándar. Para la producción de las moléculas biespecíficas, se transfectaron células HEK293 EBNA con plásmidos que codificaban los genes respectivos usando un procedimiento estándar basado en polietilenimina (PEI). La proporción de plásmido usada de los tres vectores de expresión fue 1:1:1. Las células transfectadas se cultivaron durante 7 días antes de que se recogieran los sobrenadantes para su purificación. Los anticuerpos biespecíficos FolR1/CD3-kappa-lambda se produjeron y purificaron como sigue.

1. Transfección y producción transitorias

El anticuerpo biespecífico kappa-lambda se produjo de forma transitoria en células EBK HEK293 usando un procedimiento de transfección mediado por PEI para los vectores requeridos como se describe a continuación. Las células HEK293 EBNA se cultivaron en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección (para escalas alternativas, todas las cantidades se ajustaron en consecuencia). Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 min mediante 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcla con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió ácido valpórico 1 mM y medio Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recogió el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añadió acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C.

2. Purificación

El anticuerpo biespecífico kappa-lambda se purificó en tres etapas, usando una etapa de afinidad específica para las cadenas ligeras kappa, seguida de una etapa de afinidad específica para las cadenas ligeras lambda y finalmente una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño para la eliminación de agregados. El sobrenadante obtenido de la producción transitoria se ajustó a pH 8,0 (usando TRIS 2 M, pH 8,0) y se aplicó a una matriz de afinidad Capture Select kappa, o HiTrap KappaSelect, GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 1 ml, equilibrada con 5 volúmenes de columna (VC) de tampón A (Tris 50 mM, glicina 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0). Después de lavar con 15 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (Tris 50 mM, glicina 100 mM, NaCl 150 mM, pH 2,0) en 25 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se agruparon y el pH de la solución se ajustó a pH 8,0 (usando Tris 2 M, pH 8,0). Las fracciones agrupadas neutralizadas se aplicaron a una matriz de afinidad lambda Capture Select (ahora: HiTrap LambdaFabSelect, GE Healthcare, volumen de columna (VC) = 1 ml) equilibrada con 5 volúmenes de columna (VC) de tampón A (Tris 50 mM, glicina 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0). Después de lavar con 15 VC de tampón A, la proteína se eluyó usando un gradiente de pH para tampón B (Tris 50 mM, glicina 100 mM, NaCl 150 mM, pH 2,0) en 25 VC. Las fracciones que contenían la proteína de interés se agruparon y el pH de la solución se ajustó a pH 8,0 (usando Tris 2 M, pH 8,0). Esta solución se concentró usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) y posteriormente se aplicaron a una columna Superdex™ 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM, Tween-20 al 0,01 %. Las fracciones agrupadas después de la cromatografía de exclusión por tamaño se concentraron nuevamente usando ultraconcentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius).

Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones se analizaron mediante electroforesis capilar-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor siguiendo las instrucciones del fabricante (instrumento Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Solo se pudieron purificar pequeñas cantidades de proteína con un rendimiento final de 0,17 mg/l.

Ejemplo 30

Destrucción mediada por linfocitos T con anticuerpo biespecífico FolR1/CD3-kappa-lambda

La actividad de TCB FolR1 kappa lambda se sometió a prueba en células SKOV3 en presencia de PBMC recién aislados. Como control negativo se incluyó TCB DP47. La destrucción mediada por linfocitos T de células SKOV3 se determinó después de 24 h y 48 h por liberación de LDH. Después de 48 h, se recogieron los linfocitos T y se midió la regulación por incremento de CD69 y CD25 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 por citometría de flujo.

La construcción FolR1 kappa lambda induce la destrucción de células SKOV3 de manera dependiente de la concentración, que va acompañada de una regulación por incremento de CD69 y CD25 tanto en linfocitos T CD4 como en linfocitos T CD8.

Las células SKOV3 se incubaron con PBMC en presencia de TCB DP47 o TCB FolR1 kappa lambda. Después de 24 h y 48 h, la destrucción de las células tumorales se determinó midiendo la liberación de LDh (Fig. 21). Las células SKOV3 se incubaron con PBMC en presencia de TCB DP47 o TCB FolR1 kappa lambda. Después de 48 h, se midió la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 por citometría de flujo (Fig. 22).

Ejemplo 31

Caracterización bioquímica de proteínas de unión a FolR1 16D5 y 36F2 por resonancia de plasmón superficial

La unión de 16D5 anti-FolR1 en diferentes formatos biespecíficos de linfocitos T monovalentes o bivalentes y de 36F2 anti-FolR1 como IgG o como linfocitos T biespecíficos para el receptor 1 de folato humano, de macaco y murino recombinante (todos como fusiones Fc) se evaluó por resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0. 01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, GE Healthcare).

1. Moléculas sometidas a prueba

Las moléculas usadas para la determinación de afinidad y avidez se describen en la tabla 24. Tabla 24: Nombre y descripción de las 6 construcciones usadas en el análisis por SPR

2. A videz p o r e l recep to r 1 de folato

La avidez de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FoIRI y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 25).

Las fusiones Fc monoméricas biotiniladas recombinantes del receptor 1 de folato humano, de macaco y murino (FolR1 -Fc) se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, GE Healthcare). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 300-400 UR. Las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 se pasaron a un intervalo de concentración de 3,7 a 900 nM con un caudal de 30 pl/minuto a través de las cubetas de lectura durante 180 segundos. Se supervisó la disociación durante 240 o 600 segundos. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 30 s de glicina-HCl 10 mM, pH 2. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia inmovilizada con fusión Fc de CD 134 murino biotinilada recombinante. Las curvas de unión resultantes de la unión bivalente de las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T se aproximaron a una unión de Langmuir 1:1 (aunque es una unión 1:2) y se ajustaron con ese modelo para obtener una Kd aparente que representa la avidez de la unión bivalente. Las constantes de avidez aparente para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad del ajuste utilizando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare). Para el formato biespecífico 1 1 de linfocitos T, la interacción es 1:1 real y la Kd representa la afinidad, ya que solo hay una proteína de unión a FolR1 en esta construcción.

Tabla 25: Unión bivalente (avidez con Kd aparente) de 16D5 y 36F2 anti-FolR1 como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano, de macaco y murino.

3. A fin id ad p o r el recep to r 1 de folato

La afinidad de la interacción entre las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FolR1 y los receptores de folato recombinantes se determinó como se describe a continuación (tabla 26).

Para la medición de afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 12000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo específico anti-Fab humano (kit de captura de Fab, GE Healthcare) en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron las IgG o las moléculas biespecíficas de linfocitos T anti-FoIRI a 20 nM con un caudal de 10 pl/min durante 40 segundos, la cubeta de lectura de referencia se dejó sin captura. Se pasaron series de dilución (12,3 a 3000 nM) de fusión Fc con el receptor 1 de folato humano, de macaco y murino en todas las cubetas de lectura a 30 pl/min durante 240 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 300 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH 1,5. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Las constantes de afinidad para las interacciones se derivaron de las constantes de velocidad ajustando a una unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabla 26: Unión monovalente (afinidad) de 16D5 y 36F2 anti-FolR1 como IgG o como moléculas biespecíficas de linfocitos T (TCB) en FolR1 humano, de macaco y murino.

La afinidad (unión monovalente) por Fc-FolR1 humano y de macaco de TCB 36F2 es similar y alrededor de 1000 nM para ambos, mientras que la afinidad por Fc-FolR1 murino es ligeramente mejor y de alrededor de 300 nM. La 36F2 se puede usar en modelos murinos y de primates, no existiendo necesidad de un sustituto. La avidez (Kd aparente) de TCB 36F2 por FolR1 humano es aproximadamente 30 veces menor que la afinidad de la TCB 16D5 por FolR1 humano. En el formato bivalente, TCB 36F2 está en el intervalo nanomolar bajo, mientras que TCB 16D5 está en el intervalo picomolar bajo (diferencia de 1000 veces).

FolR1 se expresa en células tumorales sobreexpresadas, a niveles intermitentes y altos, en la superficie de las células cancerosas en un espectro de neoplasias malignas epiteliales, incluyendo los cánceres de ovario, mama, riñón, colorrectal, pulmón y otros cánceres sólidos, y también se expresa en la superficie apical de un subconjunto limitado de células epiteliales polarizadas en tejido normal. Estas células normales no tumorales expresan FolR1 solo a niveles bajos e incluyen, por ejemplo, células epiteliales bronquiolares en la superficie alveolar, borde luminal cortical renal de células tubulares, epitelio del pigmento retiniano (membrana basolateral) y plexo coroideo.

La TCB 16D5 se une a células de tejidos normales que expresan bajas cantidades de FolR1, lo que da como resultado su destrucción mediada por linfocitos T. Esto podría explicar, al menos en parte, la limitada tolerancia observada a 10 pg/kg en macacos cangrejeros. Los autores de la invención querían determinar si la disminución de la afinidad de la molécula biespecífica de linfocitos T podría incrementar la diferenciación entre los tejidos de alta y baja densidad de la diana y, de este modo, disminuir la toxicidad mediante el uso de la unión bivalente y la avidez. Las proteínas de unión de baja afinidad normalmente no se seleccionan como candidatos adecuados para un análisis posterior porque la baja afinidad se asocia a menudo con baja potencia y eficacia. No obstante, la proteína de unión a FolR1 de baja afinidad 36F2 se desarrolló en varios formatos y se caracterizó por sus propiedades biológicas. Para la 36F2 usada en el formato biespecífico bivalente de linfocitos T, el efecto de la avidez (diferencia entre la unión monovalente y bivalente) es de alrededor de 250 veces (1000 nM frente a 4 nM). A baja densidad de la diana, la afinidad definió la interacción y con 1000 nM dio lugar a una baja potencia de la TCB. Sin embargo, a alta densidad de la diana, la avidez de la molécula entra en juego y con 4 nM dio lugar a una alta actividad de la TCB (véase el ejemplo 32).

En un enfoque alternativo, los autores de la invención generaron formatos monovalentes de 16D5 y una variante de baja afinidad de 16D5 (afinidad de aproximadamente 10-40 nM) en un formato bivalente. La proteína de unión 16D5 usada en un formato monovalente (1+1) tiene una afinidad de aproximadamente 50 nM. La diferenciación entre tejidos de alta y baja densidad de la diana se puede lograr mejor aprovechando el efecto de avidez.

Ejemplo 32

Destrucción por linfocitos T de células SKov-3 inducida por TCB 36F2, TCB Mov19 y TCB 21A5

La destrucción por linfocitos T mediada por TCB 36F2, TCB Mov19 y TCB 21A5 se evaluó en células SKov-3 (expresión media de FolR1). Se usaron PBMC humanos como células efectoras y se detectó la destrucción tras 24 h y 48 h de incubación con los anticuerpos biespecíficos. En resumen, se recogieron células diana con tripsina/EDTA, se lavaron y se sembraron a una densidad de 25.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo plano. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucoplaquetarias) obtenidas de donantes humanos sanos. Se diluyó la sangre recién obtenida con PBS estéril y se colocó en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), se desechó el plasma por encima de la interfase que contenía los PBMC y se transfirieron los PBMC a un nuevo tubo Falcon llenado posteriormente con 50 ml de PBS. Se centrifugó la mezcla (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación 350 x g, 10 minutos). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en un medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en incubadora celular hasta su uso posterior (no más de 24 h). Para el ensayo de destrucción, se añadió el anticuerpo a las concentraciones indicadas (intervalo de 0,005 pM - 5 nM por triplicado). Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células tumorales después de 24 h y 48 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 % por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica.

Los resultados muestran que la destrucción inducida por 36F2 se reduce fuertemente en comparación con TCB Mov19 y TCB 21A5 (figuras 23A-B). Los valores de CE50 relacionados con los ensayos de destrucción, calculados usando GraphPadPrism6 se resumen en la tabla 27.

Tabla 27: Valores de CE50 (pM) para la destrucción mediada por linfocitos T de células SKov-3 que expresan FolR1 inducida por TCB 36F2, Tc B Mov19 y TCB 21A5.

* la curva no alcanzó la saturación, el valor es hipotético

Ejemplo 33

Destrucción por linfocitos T inducida por TCB 36F2 y TCB 16D5 en diferentes formatos biespecíficos de linfocitos T monovalentes y bivalentes

Se evaluó la destrucción por linfocitos T mediada por anticuerpos TCB 36F2, TCB 16D5, TCB 16D5 clásico, TCB 16D5 1+1 y TCB 16D5 HT de células tumorales humanas HeLa (expresión alta de FolR1, aproximadamente 2 millones de tumorales después de 24 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 % por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica.

Los resultados muestran que la destrucción específica de diana de las tres líneas celulares diana que expresan FoIR1 inducida por TCB 36F2 es mucho más débil en comparación con la destrucción inducida por TCB 16D5 (figuras 24A-C, tabla 29). La destrucción específica de diana inducida por las TCB 16D5 monovalentes (16D5 HT y 16D5 1 1) es peor en comparación con las t Cb 16D5 bivalentes (TCB 16D5 y TCB 16D5 clásico). Los valores de CE50 relacionados con los ensayos de destrucción, calculados usando GraphPadPrism6 se resumen en la tabla 28. Es importante destacar que estos datos muestran que el uso de la proteína de unión a FolR1 36F2 en el formato bivalente TCB 2+1 amplía la ventana terapéutica en comparación con la TCB FolR1 16D5 (Fig. 24A-C). Mientras que la reducción de potencia entre la TCB FolR1 16D5 y 36F2 es de aproximadamente 45 veces para las células HeLa (expresión alta de FolR1, véase la tabla 28: TCB 16D5 de 0,8 frente a TCB 36F2 de 36,0) y de aproximadamente 297 veces para las células Skov3 (expresión FolR1 media, véase la tabla 28: TCB 16D5 de 0,6 frente a TCB 36F2 de 178,4), esta reducción es de casi 7000 veces para HT29 con baja expresión de FolR1 (véase la tabla 28: TCB 16D5 de 5,7 frente a TCB 36F2 de 39573). Por tanto, la TCB FolR1 36F2 diferencia entre las células de alta y baja expresión, lo que es de especial importancia para reducir la toxicidad, ya que las células de algunos tejidos normales no tumorales expresan niveles muy bajos de FolR1 (aproximadamente menos de 1000 copias por célula). De acuerdo con esta observación, los resultados discutidos en el ejemplo 35 a continuación muestran que TCB 36F2 no induce la destrucción por linfocitos T de las células primarias (figuras 26A-D), mientras que se puede observar una cierta destrucción para TCB 16D5 en células HRCEpiC y HRPEpiC después de 48 h de incubación (figuras 26B y C). Esta importante característica de TCB 36F2 permite la dosificación para el tratamiento de tumores positivos para FolR1, de modo que media en la destrucción potente de los tejidos tumorales con expresión alta o media de FolR1, pero no de tejidos normales con expresión baja (parcialmente polarizada). De forma destacable, esta característica parece estar mediada por la avidez de TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 invertido, ya que no se observó al usar los formatos 1+1 monovalentes que llevan la misma proteína de unión 36F2 de baja afinidad. Dicho de otra manera, TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 comprende restos de unión a FolR1 de afinidad relativamente baja, pero posee un efecto de avidez que permite la diferenciación entre células que expresan niveles altos y bajos de FolR1. Debido a que las células tumorales expresan FolR1 a niveles altos o intermedios, esta TCB se une selectivamente a las células tumorales y a las células normales no cancerosas que expresan FolR1 a niveles bajos o no lo hacen en absoluto.

Además de las características ventajosas anteriores, la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 invertido también tiene la ventaja de que no requiere reticulación química u otro enfoque híbrido. Esto hace que sea adecuado para la fabricación de un medicamento para tratar a pacientes, por ejemplo, pacientes que tienen tumores cancerosos positivos para FolR1. La TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 invertido se puede producir usando procedimientos CHO estándar con bajos niveles de agregados. Además, la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 comprende secuencias humanas y humanizadas que hacen que sea superior a moléculas que emplean polipéptidos de rata y ratón que son altamente inmunogénicos cuando se administran a seres humanos. Además, la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 se genomanipuló para eliminar la unión a FcgR y, como tal, no causa reacciones de reticulación e infusión de FcgR, potenciando aún más su seguridad cuando se administra a pacientes.

Como lo demuestran los resultados descritos anteriormente, su geometría de cabeza a cola hace que la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 invertido sea una molécula altamente potente que induce la destrucción absoluta de las células diana. Su bivalencia potencia la avidez y la potencia, pero también permite la diferenciación entre células con alta y baja expresión. Su preferencia por células diana con niveles altos o medios de expresión debido a su avidez reduce la toxicidad resultante de la destrucción mediada por linfocitos T de células normales que expresan FolR1 a niveles bajos.

Una ventaja adicional de la TCB 36F2 en el formato bivalente 2+1 y otros modos de realización divulgados en el presente documento es que su desarrollo clínico no requiere el uso de moléculas sustitutas, ya que se unen al FolR1 humano, de macaco y murino. Como tal, las moléculas divulgadas en el presente documento reconocen un epítopo diferente que los anticuerpos contra FolR1 descritos previamente que no reconocen FolR1 de ninguna de las tres especies.

Tabla 28: Valores de CE50 (pM) para destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales que expresan FolR1 inducida por TCB 36F2 y TCB 16D5 en diferentes formatos biespecíficos de linfocitos T monovalentes y bivalentes después de 24 h de incubación.

* la curva no alcanzó la saturación, es solo un valor hipotético

La tabla 29 muestra una comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 y TCB 36F2 en las diferentes líneas celulares sometidas a prueba. A partir de los valores de CE50 obtenidos, se calculó el delta (CE50 de TCB 16D5 menos CE50 de TCB 36f2) y la diferencia en número de veces (CE50 de TCB 16D5 dividido por CE50 de TCB 36F2).

Tabla 29: Comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 y TCB 36F2.

* la curva no alcanzó la saturación, es solo un valor hipotético

Los valores de CE50 calculados muestran claramente que la diferencia entre TCB 36F2 y TCB 16D5 aumenta cuanto menor es la expresión de FolR1 en las células diana.

Los mismos cálculos que se hicieron para la comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 y TCB 36F2 se realizaron para TCB 16D5 y las dos Tc B 16D5 monovalentes (TCB 16D5 HT y 16D51 1). Las tablas 30 y 31 muestran las comparaciones de los valores de CE50 de TCB 16D5 frente a TCB 16D5 HT (tabla 30) y TCB 16D5 frente a TCB 16D5 1 1 (tabla 31), así como los deltas (CE50 de TCB 16D5 menos CE50 de TCB 16D5 Ht /1 1) correspondientes y las diferencias en número de veces (CE50 de TCB 16D5 dividido por CE50 de TCB 16D5 HT/1 1).

Tabla 30: Comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 (2+1 invertido) y TCB 16D5 HT.

Tabla 31: Comparación de los valores CE50 de TCB 16D5 y TCB 16D5 1+1.

* la curva no alcanzó la saturación, es solo un valor hipotético

La comparación de los valores de CE50 de TCB 16D5 y TCB 36F2 (tabla 29) muestra que la diferencia en los valores de CE50 aumenta cuanto menor es la expresión de FolR1 en las células diana. Este efecto no se puede ver en la comparación de TCB 16D5 y las TCB 16d 5 monovalentes (tabla 29 y tabla 30). Para TCB 16D51 1 (tabla 31) también existe un ligero incremento en la diferencia entre la CE50 de TCB 16D5 y de TCB 16D5 1+1 con la disminución de la expresión de FolR1, pero no tan pronunciado como se puede observar en la comparación de TCB 16D5 frente a TCB 36F2.

Ejemplo 34

Regulación por incremento de CD25 y CD69 en células efectoras CD8+ y CD4+ después de la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales que expresan FolR1 inducida por el anticuerpo TCB 36F2 y TCB 16D5

La activación de linfocitos T CD8+ y CD4+ después de la destrucción mediada por linfocitos T de células tumorales HeLa, SKov-3 y HT-29 que expresan FolR1 mediada por TCB 36F2 y TCB 16D5 se evaluó mediante análisis FACS usando anticuerpos que reconocen los marcadores de activación de linfocitos T CD25 (marcador de activación tardía) y CD69 (marcador de activación temprana). La TCB DP47 se incluyó como control de unión negativa. El anticuerpo y las condiciones del ensayo de destrucción fueron esencialmente como se describe anteriormente (ejemplo 32), usando el mismo intervalo de concentraciones de anticuerpo (0,01 nM - 100 nM por triplicado), proporción E:T 10:1 y un tiempo de incubación de 48 h.

Después de la incubación, se transfirieron PBMC a una placa de 96 pocillos de fondo redondo, se centrifugaron a 400 x g durante 4 min y se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 0,1 %. Se realizó la tinción de superficie para CD8 (anti-CD8 humano PE, BD n.° 555635), CD4 (anti-CD4 humano Brilliant Violet 421 ™, Biolegend n.° 300532), CD69 (anti-CD69 humano FITC, BD n.° 555530) y CD25 (anti-CD25 humano APC, BD n.° 555434) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 %. Después de la centrifugación, las muestras se resuspendieron en 200 pl/pocillo de PBS con BSA al 0,1 % para la medición de FACS. Se analizaron las muestras en FACS Canto II de BD.

La TCB 36F2 indujo una regulación por incremento específica de diana de los marcadores de activación (CD25, CD69) en linfocitos T CD8+ y CD4+ después de destruir las células HeLa (figura 25A) y SKov-3 (figura 25B). En comparación con TCB 16D5, la regulación por incremento de CD25 y CD69 en linfocitos T c D8+ y CD4+ inducida por 36F2 es mucho más débil.

En HT-29 (expresión baja de FolR1), solo se puede ver una regulación por incremento de los marcadores de activación a la concentración más alta de TCB 36F2. Por el contrario, con TCB 16D5, la regulación por incremento de CD25 y CD69 se puede observar ya a concentraciones de anticuerpos mucho más bajas (figura 25C).

Como se observa también en el experimento de lisis tumoral, el análisis de los marcadores de activación (CD25 y CD69) en linfocitos T (CD4+ y CD8+) después de la destrucción muestra claramente que la diferencia entre TCB 16D5 y TCB 36F2 se hace mayor cuanto menor es el nivel de expresión de FolR1 en las celdas diana.

Ejemplo 35

Destrucción por linfocitos T de células primarias inducida por TCB 36F2 y TCB 16D5

La destrucción por linfocitos T mediada por TCB 36F2 y TCB 16D5 se evaluó en células primarias (células epiteliales corticales renales humanas (HRCEpiC) (ScienCell Research Laboratories; n.° cat. 4110) y células epiteliales de pigmento retiniano humanas (HRPEpiC) (ScienCell Research Laboratories; n.° cat. 6540)). Las células HT-29 (expresión baja de FolR1) se incluyeron como línea celular de control. TCB DP47 sirvió como control sin unión. Se usaron PBMC humanos como células efectoras y se detectó la destrucción tras 24 h y 48 h de incubación con los anticuerpos biespecíficos. En resumen, se recogieron células diana con tripsina/EDTA, se lavaron y se sembraron a una densidad de 25.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo plano. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucoplaquetarias) obtenidas de donantes humanos sanos. Se diluyó la sangre recién obtenida con PBS estéril y se colocó en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), se desechó el plasma por encima de la interfase que contenía los PBMC y se transfirieron los PBMC a un nuevo tubo Falcon llenado posteriormente con 50 ml de PBS. Se centrifugó la mezcla (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación 350 x g, 10 minutos). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en un medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en incubadora celular hasta su uso posterior (no más de 24 h). Para el ensayo de destrucción, se añadió el anticuerpo a las concentraciones indicadas (intervalo de 0,01 pM - 10 nM por triplicado). Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células tumorales después de 24 h y 48 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 % por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica.

Los resultados muestran que TCB 36F2 no induce la destrucción por linfocitos T de las células primarias (figuras 26A-D), mientras que se puede observar una cierta destrucción para TCB 16D5 en células HRCEpiC y HRPEpiC después de 48 h de incubación (figuras 26B y D). Como se describe anteriormente, se observó una gran diferencia en la destrucción por linfocitos T de células HT-29 entre TCB 16D5 y TCB 36F2 (Fig. 26E, F).

Ejemplo 36

Preparación de TCB DP47 GS

(2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertido = "TCB no dirigida")

La "TCB no dirigida" se usó como control en los experimentos anteriores. El anticuerpo biespecífico capta a CD3e pero no se une a ningún otro antígeno y, por lo tanto, no puede reticular los linfocitos T con ninguna célula diana (y posteriormente no puede inducir ninguna destrucción). Por lo tanto, se usó como control negativo en los ensayos para supervisar cualquier activación inespecífica de linfocitos T. Esta TCB no dirigida se preparó como se describe en el documento WO2014/131712. En resumen, se han subclonado las secuencias de A d N de la región variable de la cadena pesada y ligera sin cambio del marco de lectura con la cadena pesada constante o bien la cadena ligera constante preinsertada en el respectivo vector de expresión de mamífero receptor. La expresión del anticuerpo estaba dirigida por un promotor MPSV y lleva una secuencia señal poliA sintética en el extremo 3' de la CDS. Además, cada vector contiene una secuencia OriP de EBV.

Se produjo la molécula cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:2:1: 1 ("vector de cadena pesada Fc(ojal): "vector de cadena ligera": "vector de cadena ligera Crossfab": "vector de cadena pesada Fc(botón)-FabCrossfab").

Para la transfección, se cultivaron células HEK293 EBNA en suspensión sin suero en medio de cultivo CD CHO. Para la producción en un matraz de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 min mediante 210 x g, el sobrenadante se reemplaza por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se mezclaron en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 g de ADN. Después de la adición de 540 pl, la solución de PEI se mezcló con una agitadora vorticial durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se mezclaron con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió ácido valpórico 1 mM y medio Feed 1 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recogió el sobrenadante para la purificación mediante centrifugación durante 15 min a 210 x g, la solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm) y se añadió acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C.

La proteína secretada se purificó de los sobrenadantes del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando proteína A. El sobrenadante se cargó en una columna HiTrap Protein A HP (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 40 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5. Se retiró la proteína no unida lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5.

La proteína diana se eluyó usando un gradiente en 20 volúmenes de columna desde citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5 hasta citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 2,5. Se neutralizó la solución de proteína añadiendo 1/10 de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8. Se concentró la proteína diana y se filtró antes de su carga en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, solución de cloruro de sodio 140 mM a pH 6,0.

Se determinó la concentración de proteína de las muestras de proteínas purificadas midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos.

Se analizaron la pureza y el peso molecular de las moléculas por análisis CE-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor. Se usó el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper lifescience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usan 2 pg de muestra para los análisis.

Se analizó el contenido en agregado de las muestras de anticuerpo usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.

Tabla 32: Resumen de producción y purificación de TCB DP47 GS

Tabla 33: Análisis CE-SDS de TCB DP47 GS

Ejemplo 37

Unión de TCB 16D5 y TCB 9D11 y sus correspondientes variantes de desamidación de CD3 N100A y S100aA a células Jurkat que expresan CD3

La unión de TCB 16D5 y las variantes de desamidación de CD3 correspondientes TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA y de TCB 9D11 y las variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA a Cd 3 humano se evaluaron en una línea de linfocitos T inmortalizados que expresan CD3 (Jurkat). En resumen, las células se recogieron, se contaron, se comprobó su viabilidad y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en tampón FACS (100 pl de PBS, BSA al 0,1 %). Se incubaron 100 pl de suspensión celular (que contenía 0,2 x 106 células) en placas de 96 pocillos de fondo redondo durante 30 min a 4 °C con diferentes concentraciones de los anticuerpos biespecíficos (686 pM - 500 nM). Después de dos etapas de lavado con PBS frío con BSA al 0,1 %, las muestras se volvieron a incubar durante otros 30 min a 4 °C con un anticuerpo secundario caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento Fcy anti-IgG humana conjugado con PE (Jackson Immuno Research Lab PE n.° 109-116-170). Después de lavar las muestras dos veces con PBS frío con BSA al 0,1 %, se analizaron inmediatamente mediante FACS usando un FACS Canto II (programa informático FACS Diva). Se obtuvieron curvas de unión usando GraphPadPrism6 (Fig. 28A-B).

Los resultados muestran una unión a CD3 reducida de las variantes de desamidación N100A y S100aA en comparación con los anticuerpos originales TCB 16D5 (Fig. 28A) y TCB 9D11 (Fig. 28B).

Ejemplo 38

Destrucción por linfocitos T de células SKov-3 y HT-29 inducida por TCB 16D5 y TCB 9D11 y sus variantes de desamidación de CD3 N100A y S100aA

La destrucción por linfocitos T mediada por TCB 16D5 y las variantes de desamidación de CD3 correspondientes TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA y de TCB 9D11 y las variantes de desamidación TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA se evaluó en células SKov-3 (expresión media de FolR1) y HT-29 (expresión baja de FolR1). Se usaron PBMC humanos como células efectoras y se detectó la destrucción tras 24 h de incubación con los anticuerpos biespecíficos. En resumen, se recogieron células diana con tripsina/EDTA, se lavaron y se sembraron a una densidad de 25.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo plano. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) se prepararon mediante centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones enriquecidas de linfocitos (capas leucoplaquetarias) obtenidas de donantes humanos sanos. Se diluyó la sangre recién obtenida con PBS estéril y se colocó en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), se desechó el plasma por encima de la interfase que contenía los PBMC y se transfirieron los PBMC a un nuevo tubo Falcon llenado posteriormente con 50 ml de PBS. Se centrifugó la mezcla (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación 350 x g, 10 minutos). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en un medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en incubadora celular hasta su uso posterior (no más de 24 h). Para el ensayo de destrucción, se añadió el anticuerpo a las concentraciones indicadas (intervalo de 0,01 pM - 10 nM por triplicado). Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células tumorales después de 24 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 % por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11644793001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica.

Los resultados muestran que, en las células SKov-3, la destrucción inducida por las variantes de desamidación de CD3 TCB 16D5 N100A y TCB 16D5 S100aA es comparable a la inducida por TCB 16D5 (Fig. 29A). Lo mismo sucede para TCB 9D11 y sus variantes TCB 9D11 N100A y TCB 9D11 S100aA (Fig. 29B). En las células HT-29 de baja expresión de FolR1, la variante S100aA muestra una eficacia de destrucción reducida, como es el caso para TCB 16D5 (Fig. 30A), así como para TCB 9D11 (Fig. 30B). Los valores de CE50 relacionados con los ensayos de destrucción, calculados usando GraphPadPrism6 se dan en la tabla 35.

Tabla 35: Valores de CE50 (pM) para destrucción mediada por linfocitos T de células SKov-3 y HT-29 que expresan FolR1 inducida por TCB 16D5 y TCB 9D11 y sus variantes de desamidación N100A y A100aA.

* no determinado

Ejemplo 39

Generación de construcciones biespecíficas de linfocitos T contra mucina-1 que contienen una cadena ligera común

Síntesis génica

Los segmentos de genes deseados se sintetizaron en Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR mediante síntesis génica automatizada.

Producción y purificación de antígeno MUC1

Para la generación de anticuerpos de cadena ligera común (CLC) contra el dominio "proteína de esperma de erizo de mar, enterocinasa y agrina" (SEA) de la mucina-1 (MUC1) humana, se sintetizó un fragmento de ADN que codifica el dominio SEA (Uniprot P15941, aminoácidos 1041-1151). Para evitar la autoproteólisis del SEA entre las posiciones G1097 y S1098, un proceso descrito anteriormente por Ligtenber et al. (1992). Cell-associated episialin is a complex containing two proteins derived from a common precursor. J Biol Chem 267, 6171-7. Parry et al., Identification of MUC1 Proteolytic Cleavage Sites in Vivo. Biochem Biophys Res Commun 283, 715-20, se insertaron cuatro residuos de glicina adicionales entre G1097 y S1098. Esta inserción da como resultado el alivio de la tensión conformacional y mantiene intacta la proteína. El fragmento de ADN se insertó en pETXX, un vector de expresión bacteriana inducible. El plásmido resultante expresa el dominio SEA con una marca de avidina C terminal y una marca His6 (SEQ ID NO: 47). Mientras que la marca de avidina se usó para la biotinilación in vivo mediada por BirA, la marca His6 (SEQ ID NO: 47) se usó para la purificación.

Se inoculó un cultivo de 500 ml con la cepa bacteriana BL21 D3, se transformó con el plásmido correspondiente y un plásmido que expresa BirA, y se indujo con IPTG 1 mM a una DO600 de 0,8. A continuación, los cultivos se incubaron a 25 °C durante la noche y se recogieron por centrifugación. El sedimento bacteriano se resuspendió con 25 ml de reactivo de extracción de proteínas BugBuster® (Millipore) y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente como se describe en el protocolo. Después de centrifugar durante 20 min a 16000 x g, el sobrenadante se filtró y se cargó en una columna IMAC (His gravitrap, GE Healthcare). La columna se lavó con 40 ml de tampón de lavado (NaCl 500 mM, imidazol 20 mM, NaH2PO420 mM, pH 7,4). Después de la elución de la columna (NaCl 500 mM, imidazol 500 mM, NaH2PO420 mM pH 7,4) el eluido se volvió a tamponar usando columnas PD10 (GE Healthcare).

Selección de prote ínas de unión al dom inio SEA anti-M UC1 hum ana de las colecciones Fab CLC

Las selecciones contra el dominio SEA de MUC1 humana se llevaron a cabo usando MUC1 biotinilada derivada de E. coli e in vivo. Los antígenos se biotinilaron enzimáticamente mediante la coexpresión de la biotina ligasa BirA por medio de una marca de avidina C terminal. Se realizaron rondas de selección (panning) en solución de acuerdo con el siguiente patrón: 1. unión de las partículas de fagómidos de las colecciones CLC a proteína de antígeno biotinilado 100 nM durante 0,5 h en un volumen total de 1 ml; 2. captura del antígeno biotinilado y del fago específicamente unido mediante la adición de 5,4 x 107 microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina durante 10 min; 3. lavado de las microesferas usando 5 x 1 ml de PBS/Tween20 y 5 x 1 ml de PBS; 4. elución de partículas de fagos mediante la adición de 1 ml de trietilamina (TEA) 100 mM durante 10 min y neutralización mediante la adición de 500 pl de Tris/HCl 1 M, pH 7,4; 5. reinfección de células de E. co liTG1 en fase logarítmica con las partículas de fagos en el sobrenadante, infección con el fago auxiliar VCSM13 y posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagómidos para su uso en rondas de selección posteriores. Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas usando concentraciones de antígeno constantes o decrecientes (de 10-7 M a 2 * 10-9 M). En la ronda 2, la captura de los complejos antígeno-fago se realizó usando placas de neutravidina en lugar de microsesferas de estreptavidina. Las proteínas de unión específicas se identificaron mediante ELISA como sigue: Se recubrieron 100 |jl de antígeno biotinilado 50 nM por pocillo en placas de neutravidina. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Los dominios VH de los clones que presentaban señales significativas por encima del fondo se incluyeron en la preselección para la secuenciación (58D6 VH, 106D2 VH, 110A5 VH) y análisis adicionales. Todos los clones derivan de la secuencia de la línea germinal IGHV3-23 (Fig. 31). Cabe destacar que el clon 58D6 y el clon 110A5 se originan en una colección que se aleatorizó solo en CDR3, mientras que el clon 106D2 se identificó en una colección aleatorizada en las 3 CDR. Las posiciones en CDR1 y 2 que se desvían de la secuencia de la línea germinal se imprimen en cursiva. Todas las variantes de VH se expresaron en combinación con la misma cadena ligera común (VL de cadena ligera común).

Purificación de Fab

Los Fab de cultivos bacterianos (secuencia de proteínas de dominios de cadenas pesadas variables para 58D6 VH, 106D2 VH, 110A5 VH, todos los clones expresaron el mismo dominio variable de CLC enumerado como SEQ ID NO: 31) se purificaron para el análisis exacto de los parámetros cinéticos. Para cada clon se inoculó un cultivo de 500 ml con bacterias que albergaban el fagómido correspondiente y se indujo con IPTG 1 mM a una DO600 de 0,9. A continuación, los cultivos se incubaron a 25 °C durante la noche y se recogieron por centrifugación. Después de la incubación del sedimento resuspendido durante 20 min en 25 ml de tampón PPB (Tris-HCl 30 mM, pH 8, e Dt A 1 mM, sacarosa al 20 %), las bacterias se centrifugaron de nuevo y se recogió el sobrenadante. Esta etapa de incubación se repitió una vez con 25 ml de una solución de MgSO45 mM. Los sobrenadantes de ambas etapas de incubación se combinaron, filtraron y cargaron en una columna IMAC (His gravitrap, GE Healthcare). Posteriormente, la columna se lavó con 40 ml de tampón de lavado (NaCl 500 mM, imidazol 20 mM, NaH2PO420 mM, pH 7,4). Después de la elución (NaCl 500 mM, imidazol 500 mM, NaH2PO420 mM, pH 7,4), el eluido se volvió a tamponar usando columnas PD10 (GE Healthcare). Los parámetros cinéticos de los Fab purificados se estudiaron a continuación por análisis SPR (Proteon XPR36, Biorad) en una fila de dilución que variaba de 100 nM a 6,25 nM.

D eterm inación de afin idad p o r SPR usando e l b iosensor ProteO n X P R 36 de B ioR ad

Se midió la afinidad (Kd) de los clones de Fab seleccionados mediante resonancia de plasmón superficial usando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C con antígeno MUC1 biotinilado inmovilizado en chips NLC mediante captura con neutravidina. Inmovilización de antígenos recombinantes (ligando): se diluyeron los antígenos con PBST (fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4, Tween 20 al 0,005 %) a 10 pg/ml; a continuación, se inyectaron a 30 pl/minuto a tiempos de contacto variables para lograr niveles de inmovilización de 200 unidades de respuesta (UR) en orientación vertical. Inyección de analitos: para las mediciones de cinética con dosis única, se cambió la dirección de inyección a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución 1:2 de Fab purificado (intervalos de concentración variables entre 100 y 6,25 nM) a 50 pl/min a lo largo de canales 1-5 separados, con tiempos de asociación de 250 o 300 s y tiempos de disociación de 300 s. Se inyectó el tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" como referencia. Se calcularon las constantes de velocidad de asociación (kas) y las constantes de velocidad de disociación (kdis) usando un modelo de Langmuir sencillo de unión uno a uno en el programa informático ProteOn Manager v3.1 ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. La regeneración se realizó en orientación horizontal usando glicina 10 mM, pH 1,5 a un caudal de 100 pl/min durante un tiempo de contacto de 30 s. Tres clones se unieron específicamente a MUC1 (Fig. 32A), pero no al blanco "en línea", lo que demuestra la especificidad de estas proteínas de unión. Los datos cinéticos y termodinámicos de todas las mediciones se resumen en la figura 32B.

Clonación, expresión y caracterización de los basados en MUC1

Todos los Fab que demostraron unión específica a MUC1 por SPR se convirtieron al formato biespecífico de linfocitos T (TCB). Para ello, los fragmentos de ADN amplificados por PCR de los dominios VH de la cadena pesada y ligera se insertaron en la región estructural en ambas cadenas de Ig que contienen Fc necesarias para la generación de un TCB (Fig. 33). La expresión de la cadena de anticuerpo está dirigida por un promotor MPSV y la transcripción se termina por una secuencia señal sintética de poliA localizada en dirección 3' de la CDS. Además del casete de expresión, cada vector contiene una secuencia oriP de EBV para la replicación autónoma en líneas celulares que expresan EBV-EBNA. Las construcciones de ADN resultantes se coexpresaron en combinación con el CLC (clon 58D6; clon 110A5) y se purificaron del sobrenadante de cultivo celular derivado de mamíferos (clon 58D6; clon 110A5). Un resumen de los datos analíticos para dos clones de anticuerpos biespecíficos se muestra en la figura 34A y B. A nális is de unión de las TCB específicas p ara M UC1 usando e l b io sen sor ProteO n X P R 36 de B ioR ad

La unión de las TCB específicas para MUC1 producidas se midió por resonancia de plasmón superficial usando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C. El antígeno MUC1 biotinilado y un antígeno biotinilado no relacionado se inmovilizaron en chips NLC mediante captura con neutravidina. La inmovilización de los antígenos se realizó como se describe anteriormente. Para las mediciones de cinética con dosis única, se cambió la dirección de inyección a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución 1:2 de las construcciones purificadas (intervalos de concentración variables entre 30 y 1,88 nM o entre 100 y 6,25 nM) a 50 pl/min a lo largo de canales 1 5 separados, con tiempos de asociación de 120 s y tiempos de disociación de hasta 600 s. Se inyectó el tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" como referencia.

La regeneración se realizó en orientación horizontal usando glicina 10 mM, pH 1,5 a un caudal de 100 pl/min durante un tiempo de contacto de 30 s. Tres clones se unieron específicamente a MUC1 (Fig. 35), pero no al blanco "en línea", lo que demuestra la especificidad de estas proteínas de unión. Debido al efecto de avidez del formato bivalente de TCB, se observó una unión muy fuerte a MUC1. Por el contrario, no se detectó unión al antígeno no relacionado, lo que indica la unión específica de las construcciones de TCB.

Ejemplo 40

Generación de anticuerpos anti-BCMA

1.1: Producción de antígenos y reactivos instrumentales

1.1.1: Dominio extracelular de BCMA humano recombinante, soluble

Los dominios extracelulares de BCMA humano, de macaco y murino que se usaron como antígenos para las selecciones de presentación en fagos se expresaron de forma transitoria como fusión Fc monomérica N terminal en células HEK EBNA y se biotinilaron específicamente en el sitio in vivo por medio de la coexpresión de la biotina ligasa BirA en la secuencia de reconocimiento de la marca de avidina localizada en el extremo C de la porción Fc que lleva la cadena del receptor (cadena de botón Fc). Los dominios extracelulares de BCMA humano, de macaco y murino comprendían metionina-4 a asparagina-53, metionina-4 a asparagina-52 y alanina-2 a treonina-49, respectivamente. Estos se fusionaron en el extremo N a la bisagra de una IgG1 humana que permitía la heterodimerización con una porción Fc de IgG1 humana no fusionada (cadena de ojal) mediante tecnología de botón en ojal.

Para recuperar el dominio extracelular de BCMA se usaron los siguientes cebadores: AAGCTTGGATCCATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCC-3 (SEQ ID NO: 48) que incorpora un sitio BamH1 (negrita, subrayado) y cebador inverso 5-G A ATT CGCGGCCGCTC ATCCTTTCACTGAATTGGTCAC ACTTGC ATT AC-3 (SEQ |D NQ 4g)

cebador 5-ACGT TAG ATCTC C AC TCAGTCCTGCATCTTGTTCCAGTTAAC-3 (SEQ ID NO: 50) y cebador inverso 5 - AACGTTGC GGC C GCT AGTTTCAC A A ACC C C AGG-3 (SEQ ID NO: 51) GAATTCAAGCTTGCCACCATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCCV3 (SEQ ,D NO 52) que ¡nduye un sitio de restricción Hindlll (negrita, subrayado) y secuencia consenso de Kozak y cebador inverso 5-GAATTCTCTAGA H ACCTAGCAGAAATTGATTTCTCTA rCTCCG J’AGC-3 (SEQ )D NO 53) La síntesis génica también se puede usar para obtener el dominio extracelular de BCMA.

1.2: Células que expresan BCMA como herramientas

1.2.1: Línea celular de mieloma humano que expresa BCMA en su superficie

La expresión de BCMA se evaluó en cuatro líneas celulares de mieloma humano (NCI-H929, RPMI-8226, U266B1 y L-363) por citometría de flujo. Las células NCI-H929 ((H929) ATCC® CRL-9068™) se cultivaron en un medio que contenía un 80-90 % de RPMi 1640 con un 10-20 % de FCS inactivado por calor y podían contener L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y mercaptoetanol 50 pM. Las células RPMI-8226 ((RPMl) ATCC® CCL-155™) se cultivaron en un medio que contenía un 90 % de RPMl 1640 y un 10 % de FCS inactivado por calor. Las células u 266B1 ((U266) ATCC® TIB-196™) se cultivaron en un medio RPMI-1640 modificado para que contuviera L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 4500 mg/l de glucosa y 1500 mg/l de bicarbonato de sodio y un 15 % de FCS inactivado por calor. La línea celular L-363 (Leibniz Institute DSMZ - Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares; DSMZ n.° ACC 49) se cultivó en un medio que contenía un 85 % de RPMI 1640 y un 15 % de FCS inactivado por calor. En resumen, las células se recogieron, se lavaron, se contaron para determinar su viabilidad, se resuspendieron a 50.000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con anticuerpo anti-BCMA humano (Abeam, n.° ab54834, IgG1 de ratón) a 10 pg/ml durante 30 min a 4 °C (para evitar la internalización). Se usó una IgG1 de ratón como control de isotipo (BD Biosciences, n.° 554121). A continuación, las células se centrifugaron (5 min a 350 x g), se lavaron dos veces y se incubaron con el anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con FITC durante 30 min a 4 °C. Al final del tiempo de incubación, las células se centrifugaron (5 min a 350 x g), se lavaron dos veces con tampón FACS, se resuspendieron en 100 pl de tampón FACS y se analizaron en un dispositivo Canto II que ejecuta el programa informático FACS Diva. La cuantificación relativa del número de receptores de BCMA en la membrana superficial de las líneas celulares de mieloma H929, U266B1, RPMI-8226 y L-363 se evaluó mediante análisis QIFIKIT (Dako, n.° K0078, siguiendo las instrucciones del fabricante). Las células H929 expresaron BCMA humano con la densidad más alta, hasta 3,8 a 27 veces mayor que otras líneas celulares de mieloma. H929 se considera una línea celular de mieloma con alta expresión de BCMA en comparación con U266 que son células de mieloma con expresión media/baja de BCMA y RPMI-8226 y L363 que son células de mieloma con baja expresión de BCMA. La tabla 36 resume el número relativo de receptores de BCMA en la superficie celular de líneas celulares de mieloma múltiple humano.

Tabla 36: Cuantificación del número de receptores de BCMA en la superficie celular de líneas celulares de mieloma humano NCI-H929, U266B1, RPMI-8226 y L-363

1.3: Obtención de proteínas de unión a BCMA de una colección recombinante in vitro

1.3.1: Construcción de colecciones Fab de cadenas ligeras comunes

Las colecciones de anticuerpos en el formato Fab se construyen sobre la base de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-CD3 que se generó. La diversidad solo se introdujo en la cadena pesada. Se usaron seis regiones estructurales de cadena pesada diferentes: VH1-46, VH1-69, VH3-15, VH3-23, VH4-59 y VH5-1. Las CDR 1, 2 y 3 se aleatorizaron y cada colección de cadenas pesadas se combinó con la cadena ligera no aleatorizada. Las colecciones se generaron como se describe por Nissim et al., EMBO J. 1994 Feb 1; 13(3):692-8, y Silacci et al., Proteomics. 2005 Jun; 5(9):2340-50.

1.3.2: Selección de clones Fab anti-BCMA

Los Fab anti-BCMA se establecieron mediante presentación en fagos a partir de colecciones Fab sintéticas que consisten en un VL constante y seis secuencias de VH humanas diferentes

Tabla 37: Clones anti-BCMA y sus respectivos emparejamientos VL/VH

Se realizaron rondas de selección (biopanning) en solución de acuerdo con el siguiente patrón: 1) eliminación previa de ~1012 partículas de fagómidos por grupo de colecciones en inmunotubos recubiertos con 10 pg/ml de una IgG humana no relacionada para agotar las colecciones de anticuerpos que reconocen la porción Fc de los antígenos; 2) incubación de las partículas de fagómidos que no se unen a Fc con BCMA biotinilado 100 nM durante 0,5 h en presencia de una construcción de botón en ojal Fc no biotinilada no relacionada 100 nM para una disminución adicional de las proteínas de unión a Fc en un volumen total de 2 ml; 3) captura de BCMA biotinilado y del fago específicamente unido dividiendo y transfiriendo la reacción de selección a 16 pocillos en una placa de microvaloración prerrecubierta con neutravidina o estreptavidina durante 20 min en un agitador; 4) lavado de los pocillos respectivos 10-30 veces con PBS/Tween20 y 10-30 veces con PBS usando un lavador de placas; 5) etapa de lavado competitivo opcional mediante la adición de ApRIL murino 230 nM para desplazar los clones Fab que reconocen el sitio de unión del ligando natural, seleccionando así los anticuerpos de fagos no competidores de APRIL; 6) elución de partículas de fagos por adición de 125 pl de TEA (trietilamina) 100 mM por pocillo durante 5-10 min y neutralización por adición de un volumen igual de Tris/HCl 1 M pH 7,4; 7) reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica con las partículas de fagos eluidas, infección con el fago auxiliar VCSM13, incubación en un agitador a 30 °C durante la noche y posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagómidos para su uso en la siguiente ronda de selección.

Las selecciones se llevaron a cabo en 3 a 5 rondas usando concentraciones de antígenos constantes de 100 nM. Además de las rondas de selección durante las que solo se usó BCMA humano como antígeno, se llevaron a cabo rondas de selección adicionales durante las que también se usaron BCMA de macaco o murino de forma alterna con BCMA humano para seleccionar anticuerpos de reactividad cruzada. Además, como alternativa a la captura basada en placas con estreptavidina, la captura de complejos antígeno:fago se realizó por adición de 5,4 x 107 microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina a la reacción de selección, seguida de etapas de lavado usando los respectivos imanes en las condiciones descritas anteriormente.

Las proteínas de unión específicas se identificaron mediante cribado por resonancia de plasmón superficial de sobrenadantes de cultivo bacteriano que contienen Fab usando el biosensor ProteOn XPR36 de BioRad. En resumen, después de la infección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica con las partículas de fagos eluidas, se sembraron unidades formadoras de colonias (ufc) individuales y se recogieron para la inoculación de 1 ml de cultivos de expresión en placas de 96 pocillos profundos. Se capturaron los Fab de los sobrenadantes en un chip ProteOn GLM que se derivatizó con 8.000-10.000 UR de un anticuerpo policlonal caprino específico de fragmento F(ab')2 anti-IgG humano (Jackson ImmunoResearch, n.° 109-005-006) en orientación vertical. Posteriormente, se inyectaron BCMA humano, de macaco y murino, así como una construcción Fc de botón en ojal no relacionada como analitos en orientación horizontal. Los clones que presentaron respuestas de unión significativas a BCMA y no se unieron a la porción Fc de los antígenos se expresaron bacterianamente en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificaron por afinidad y se caracterizaron cinéticamente mediante análisis SPR usando un protocolo de cinética con dosis única en un biosensor ProteOn XPR36 de BioRad.

Ejemplo 41

Ensayos de unión a BCMA: resonancia de plasmón superficial

Evaluación de la unión de anticuerpos anti-BCMA a BCMA recombinante por resonancia de plasmón superficial (SPR) como sigue. Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo / Alemania). Se determinó la avidez de la interacción entre los anticuerpos anti-BCMA y el Fc(kih) de BCMA recombinante (humano, de macaco y murino) (tablas 38-40). Los Fc(kih) de BCMA humano, de macaco y murino recombinantes biotinilados se acoplaron directamente en un chip SA siguiendo las instrucciones (Biacore, Friburgo / Alemania). El nivel de inmovilización varió de aproximadamente 80 a 120 UR. Los anticuerpos anti-BCMA se pasaron a un intervalo de concentración de 4 veces (1,95 a 500 nM) con un caudal de 30 pl/minuto a través de las cubetas de lectura durante 120 segundos. Se supervisó la disociación durante 180 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Aquí, los anticuerpos anti-BCMA se hicieron pasar sobre una superficie vacía previamente activada y desactivada como se describe en el kit de acoplamiento de amina estándar. Las constantes cinéticas aparentes se derivaron usando el programa informático de evaluación de Biacore T200 (v1.0, Biacore AB, Uppsala / Suecia) para ajustar las ecuaciones de velocidad para la unión de Langmuir 1:1 por integración numérica, a pesar de la bivalencia de la interacción para propósitos de comparación.

Tabla 38. Valores de avidez solo para propósitos de comparación (Experimento 1)

Tabla 39. Valores de avidez solo para propósitos de comparación (Experimento 2)

Tabla 40. Valores de avidez solo para propósitos de comparación (Experimento 3)

También se determinó la afinidad de la interacción entre los anticuerpos anti-BCMA o los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA y el Fc(kih) de BCMA humano recombinante. El anticuerpo anti-Fab humano (GE Healthcare) se acopló directamente en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (Biacore, Friburgo / Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 6500 Ur . El anticuerpo anti-BCMA o el anticuerpo TCB CLC anti-BCMA se capturó durante 90 segundos a 25 nM. El Fc(kih) de BCMA humano recombinante se pasó a un intervalo de concentración de 4 veces (1,95 a 500 nM) con un caudal de 30 pl/minuto a través de las cubetas de lectura durante 120 o 180 segundos. Se supervisó la disociación durante 120 o 400 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Aquí, el BCMA recombinante se pasó sobre una superficie con anticuerpo anti-Fab humano inmovilizado, pero en el que se había inyectado HBS-EP en lugar de anticuerpo anti-BCMA o anticuerpo TCB CLC anti-BCMA. Las constantes cinéticas se derivaron usando el programa informático de evaluación Biacore T200 (v 1.0, Biacore AB, Uppsala/Suecia), para ajustar las ecuaciones de velocidad para la unión de Langmuir 1: 1 por integración numérica (tabla 41).

Tabla 41. Constantes de afinidad determinadas por ecuaciones de tasa de ajuste para la unión de Langmuir 1:1

Ejemplo 42

Generación de anticuerpo IgG bivalente anti-BCMA con la cadena ligera común

Para verificar la hipótesis de que el uso de la cadena ligera común se podría aplicar a cualquier anticuerpo contra BCMA, se generó el anticuerpo bivalente anti-BCMA 83A10-CLC sustituyendo la cadena ligera natural del anticuerpo bivalente anti-BCMA 83A10, descrito previamente en el documento w O/2014/122143, por la cadena ligera común (CD3 LC (CLC)). El anticuerpo anti-BCMA que comprende dos cadenas pesadas de 83A10 y dos cadenas ligeras comunes se produjo usando las técnicas generales para la generación de anticuerpos IgG bivalentes como se describe en la sección Material y procedimientos generales. La afinidad del anticuerpo IgG 83A10-CLC por BCMA humano se midió mediante SPR con procedimientos similares a los descritos en el ejemplo 41. La tabla 42 representa la unión de Fc(kih) de BCMA humano recombinante al anticuerpo IgG anti-BCMA 83A10-CLC.

Tabla 42. Constantes de afinidad determinadas por ecuaciones de tasa de ajuste para la unión de Langmuir 1:1: unión de Fc(kih) de BCMA recombinante a anticuerpo anti-BCMA 83A10-CLC

Ejemplo 43

Prueba de especificidad de anticuerpos IgG anti-BCMA contra huTACI-R y huBAFF-R

Como miembros de la superfamilia TNF-TNF-R, los receptores de TACI y BAFF están relacionados con el receptor de BCMA con una homología en el dominio extracelular de un 22 % y un 18,5 % respectivamente. Por lo tanto, se realizaron experimentos de unión de resonancia de plasmón superficial (SPR) para examinar la especificidad de los anticuerpos IgG anti-BCMA. Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %). Fc fusionado a huBCMA, huBAFF-R y huTACI-R se inmovilizaron químicamente con un alto nivel de inmovilización (~5000 UR) en diferentes canales de flujo de un chip sensor Biacore CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Inicialmente, se inyectaron soluciones altamente concentradas (3 pM, disueltas en HBS-EP) de IgG anti-BCMA pSCHLI372, así como de IgG a-huTACI-R o IgG a-huBAFF-R como controles positivos (tiempo de asociación: 80 s; tiempo de disociación: 600 s, caudal: 30 pl/min) para verificar si se produce la unión. Un acontecimiento de unión positiva de la IgG a-huTACI-R a huTACI-R, así como de IgG a-huBAFF-R a huBAFF-R y de anticuerpos IgG anti-BCMA a huBCMA indicaron que todos los receptores aún se reconocían después de la inmovilización. Para la unión de anticuerpos IgG anti-BCMA con constantes de velocidad cinética rápida a huBAFF-R y/o huTACI-R, se realizó un examen cuidadoso del parámetro cinético con bajos niveles de inmovilización (300 UR) en un nuevo chip sensor CM5. Se inyectan diluciones de anticuerpos IgG anti-BCMA a concentraciones de 3000 a 93,75 nM (dilución 1:2 en HBS-EP) (tiempo de asociación: 80 s; tiempo de disociación: 300 s, caudal: 30 pl/min), y las muestras se analizaron por duplicado. La regeneración también se realizó cuando fue aplicable, es decir, sin disociación rápida y completa. La evaluación cinética de la interacción entre los anticuerpos IgG anti-BCMA y huBAFF-R o huTACI-R se realizó mediante el ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1 que incluye un término para el transporte masivo (evaluación Biacore T200, versión 1.0). También se realizó un análisis en situación de equilibrio. Como se muestra en la figura 37, la curva 1 corresponde a la señal en el canal de referencia, la curva 2 al canal donde se produce la unión (canal de unión) y la curva 2-1 es la señal restada (canal de unión - canal de referencia), lo que significa que esta es la señal debida al acontecimiento de unión. Como se muestra en la figura 37, el ensayo de unión por SPR demostró claramente que la IgG pSCHLI372 no se unía al receptor de TACI humano. Como control positivo para la unión se usó otra IgG anti-BCMA que se unía ligeramente al receptor de TACI pero con una velocidad de activación y desactivación muy rápida (datos no mostrados).

Ejemplo 44

Producción y purificación de anticuerpos que contienen Fc TCB CLC anti-BCMA (2+1)

Para la producción de los anticuerpos biespecíficos, se expresaron anticuerpos biespecíficos por cotransfección transitoria basada en polímeros de los respectivos vectores de expresión de mamífero en células HEK293-EBNA, que se cultivaron en suspensión. Un día antes de la transfección, se sembraron las células HEK293-EBNA a 1,5 millones de células viables/ml en medio Ex-Cell complementado con L-glutamina 6 mM. Por cada ml de volumen de producción final, se centrifugaron 2,0 millones de células viables (5 minutos a 210 x g). Se aspiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en 100 pl de medio CD CHO. Se preparó el ADN por cada ml de volumen de producción final mezclando 1 pg de ADN (proporción de producción de anticuerpos biespecíficos: cadena pesada:cadena pesada modificada:cadena ligera:cadena ligera modificada = 1: 1:2:1; Proporción de anticuerpos estándar: cadena pesada:cadena ligera = 1:1) en 100 pl de medio CD CHO. Después de la adición de 0,27 pl de solución PEI (1 mg/ml), la mezcla se mezcló con una agitadora vorticial durante 15 segundos y se dejó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de 10 minutos, se pusieron juntas las células resuspendidas y la mezcla ADN/PEI y a continuación se transfirieron a un recipiente apropiado que se dispuso en un dispositivo de agitación (37 °C, CO2 al 5 %). Después de un tiempo de incubación de 3 horas, se añadieron 800 pl de medio Ex-Cell, complementado con L-glutamina 6 mM, ácido valproico 1,25 mM y Pepsoy al 12,5 % (50 g/l), por cada ml de volumen de producción final. Después de 24 horas, se añadieron 70 pl de solución Feed por cada ml de volumen de producción final. Después de 7 días o cuando la viabilidad celular fue igual o menor que un 70 %, se separaron las células del sobrenadante por centrifugación y filtración estéril. Los anticuerpos se purificaron por una etapa de afinidad y una cromatografía de exclusión por tamaño como etapa de pulido.

Para la etapa de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna con proteína A (HiTrap Protein A FF, 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 6 VC de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. Después de una etapa de lavado con el mismo tampón, se eluyó el anticuerpo de la columna por una etapa de elución con fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3,0. Se neutralizaron de inmediato las fracciones con el anticuerpo deseado por adición de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0 (1:10), se agruparon y se concentraron por centrifugación. Se filtró de forma estéril el concentrado y se procesó adicionalmente por cromatografía de exclusión por tamaño.

Para la etapa de exclusión por tamaño, se inyectó la proteína concentrada en una columna XK16/60 HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare), e histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0 con o sin Tween20 como tampón de formulación. Las fracciones que contenían los monómeros se agruparon, se concentraron por centrifugación y se filtraron de forma estéril en un vial estéril.

Se realizó la determinación de la concentración de anticuerpo por medición de la absorbancia a 280 nm, usando el valor teórico de la absorbancia de una solución al 0,1 % del anticuerpo. Este valor se basó en la secuencia de aminoácidos y se calculó por el programa informático GPMAW (Lighthouse data). Se determinó la pureza y el contenido de monómero de la preparación de proteína final por CE-SDS (sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Life Sciences)) resp. HPLC (columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh)) en un tampón de fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, acida de sodio al 0,02 % (p/v), pH 6,7. Las figuras 38A-C representan los gráficos CE-SDS (no reducido (paneles superiores) y reducido (paneles inferiores)) de las preparaciones de proteína final después de las etapas de purificación por cromatografía de afinidad por proteína A (PA) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de (Fig. 38A) pSCHLI333-TCB CLC, (Fig. 38B) pSCHLI372-TCB c LC, (Fig. 38C) pSCHLI373-TCB CLC. Las etapas de purificación por cromatografía de afinidad PA y SEC aplicados al anticuerpo pSCHLI333-TCB CLC dieron como resultado una pureza del 89,2 % y un 100 % de contenido de monómero (Fig. 38A), una pureza del 88,5 % y un 100 % del contenido de monómero para el anticuerpo pSCHLI372-TCB CLC (Fig. 38B), y una pureza del 91,8 % y un 100 % de contenido de monómero para el anticuerpo pSCHLI372-TCB CLC (Fig. 38c ). La tabla 43 resume las propiedades de los anticuerpos pSCHLI333-TCB CLC, pScHLI372-TCB CLC y pSCHLI373-TCB CLC después de las etapas de purificación por cromatografía de afinidad PA y SEC. En todos los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA se alcanzó de manera consistente >88 % de pureza y un 100 % de contenido de monómero. Los resultados globales demuestran claramente que se pudieron lograr ventajas en los rasgos característicos de producción/purificación usando una cadena ligera común (CLC) para los anticuerpos TCB y que solo se requirieron dos etapas de purificación (es decir, cromatografía de afinidad PA y SEC) para lograr ya preparaciones de proteínas de alta calidad con propiedades de desarrollabilidad muy buenas.

Tabla 43: Perfil de producción/purificación de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA después de las etapas de purificación por cromatografía de afinidad con proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño

Ejemplo 44

Unión de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA a líneas celulares de mieloma múltiple positivas para BCMA

Los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373) se analizaron por citometría de flujo para determinar la unión al BCMA humano en células h 929 con alta expresión de BCMA. Se usó MKN45 (línea celular de adenocarcinoma gástrico humano que no expresa BCMA) como control negativo. En resumen, las células cultivadas se recogen, se cuentan y se evalúa la viabilidad celular usando ViCell. A continuación, se ajustan las células viables a 2 x 106 células por ml en tampón de tinción FACS que contenía BSA (BD Biosciences). Además, se obtuvo una parte alícuota de 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con 30 pl de los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA o el correspondiente control de TCB durante 30 min a 4 °C. Se valoraron todos los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (y controles de TCB) y se analizaron en un intervalo de concentración final entre 0,12 y 500 nM. A continuación, se centrifugaron las células (5 min, 350 x g), se lavaron con 120 pl/pocillo de tampón de tinción FACS (BD Biosciences), se resuspendieron y se incubaron durante 30 min adicionales a 4 °C con anticuerpo caprino AffiniPure de fragmento F(ab')2 específico del fragmento Fc anti-IgG humana conjugado con PE conjugado con fluorocromo (Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170). A continuación, las células se lavaron dos veces con tampón de tinción (BD Biosciences), se fijaron con 100 pl de tampón de fijación BD por pocillo (BD Biosciences, n.° 554655) a 4 °C durante 20 min, se resuspendieron en 120 pl de tampón FACS y se analizaron usando FACS Canto II de BD como se representa en las figuras 39A-B, la intensidad de fluorescencia media de los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA se representó en función de las concentraciones de anticuerpos; (Fig. 39A) pSCHLI372-TCB CLC y pSCHLI373-TCB CLC en células H929; (Fig. 39B) pSCHLI372-TCB CLC y pSCHLI373-TCB CLC en células MKN45. Los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373) no se unieron a las células MKN45 negativas para BCMA y negativas para CD3 a concentraciones inferiores a 100 nM. Cuando fue aplicable, se calcularon las CE50 usando Prism GraphPad (LaJolla, CA, EE. UU.) y los valores de CE50 que indicaban la concentración de anticuerpo requerida para alcanzar un 50 % de la unión máxima para la unión de anticuerpos TCB anti-BCMA/anti-CD3 a células H929 se resumen en la tabla 44.

Tabla 44: Valores de CE50 para la unión de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA a células H929

Ejemplo 45

Unión de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA a la línea de linfocitos T Jurkat positivos para CD3 (citometría de flujo)

Los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373) también se analizaron por citometría de flujo para determinar sus propiedades de unión a c D3 humano expresado en linfocitos T Jurkat de leucemia humana (ATCC TIB-152). Los linfocitos T Jurkat se cultivaron en RPMI complementado con FCS inactivado por calor al 10 %. En resumen, se recogieron células cultivadas, se contaron y se evaluó la viabilidad celular usando ViCell. A continuación, se ajustaron las células viables a 2 x 106 células por ml en tampón de tinción FACS (BD Biosciences) que contenía BSA al 0,1 %. Además, se obtuvo una parte alícuota de 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadieron 30 pl de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA o del control TCB correspondiente a los pocillos que contenían células para obtener concentraciones finales de 0,12 nM a 500 nM. Los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA y la IgG de control se usaron con la misma molaridad. Después de la incubación durante 30 min a 4 °C, las células se centrifugaron (5 min, 350 x g), se lavaron dos veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS que contenía BSA (BD Biosciences), a continuación las células se fijaron usando 100 pl de tampón de fijación BD por pocillo (Biosciences, n.° 554655) a 4 °C durante 20 min, se resuspendieron en 120 pl de tampón FACS y se analizaron usando FACS Canto II de BD. Se evaluó la unión de los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA a los linfocitos T y se determinó la mediana de la intensidad de fluorescencia activada en linfocitos T Jurkat que expresan CD3 y se trazó en histogramas o diagramas de puntos. Las figuras 40A-B muestran la mediana de la intensidad de fluorescencia para los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373) que se unen a los linfocitos T Jurkat (Fig. 40A) o las células MKN45 (Fig. 40B) y se representan en función de la concentración de anticuerpos. No se alcanzaron los valores de CE50 y la unión máxima de los anticuerpos TCB anti-BCMA/anti-CD3 a los linfocitos T Jurkat positivos para CD3. El anticuerpo de control de isotipo no se unió a los linfocitos T Jurkat y los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373) no se unieron a las células MKN45 negativas para BCMA y negativas para CD3 a concentraciones inferiores a 100 nM.

Ejemplo 46

Activación de linfocitos T humanos tras la unión de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA a linfocitos T positivos para CD3 y líneas celulares de mieloma múltiple positivas para BCMA

Los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (pSCHLI372, pSCHLI373) se analizaron por citometría de flujo para determinar su capacidad de inducir la activación de linfocitos T mediante la evaluación de la expresión superficial del marcador de activación temprana CD69 o el marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD4+ y CD8+ en presencia o ausencia de células de mieloma múltiple humanas que expresan BCMA. En resumen, las células H929 positivas para BCMA se recogieron con tampón de disociación celular, se contaron y se comprobó su viabilidad. Las células se ajustaron a 0,3 x 106 células (viables) por ml en medio RPMI-1640 modificado, se pipetearon 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (como se indica). Se añadieron 50 pl de los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (diluidos) a los pocillos que contenían células para obtener una concentración final de 0,012 pM - 100 nM. Las células efectoras de p Bm C humanos se aislaron de sangre fresca de un donante sano y se ajustaron a 6 x 106 células (viables) por ml en medio RPMI-1640 modificado. Se añadieron 50 pl de esta suspensión celular por pocillo de la placa de ensayo para obtener una proporción E:T final de PBMC respecto a células tumorales de mieloma de 10:1. Para analizar si los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA pudieron activar linfocitos T específicamente en presencia de células diana que expresan BCMA humano, se incluyeron los pocillos que contenían de 3 a 10 nM de las moléculas de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA respectivas, así como PBMC, pero sin células diana. Después de 48 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, las células se centrifugaron (5 min, 350 x g) y se lavaron dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 %. La tinción de superficie para CD4 (IgG1,K de ratón; clon RPA-T4), CD8 (IgG1,K de ratón; clon HIT8a; BD n.° 555635), CD69 (IgG1 de ratón; clon L78; BD n.° 340560) y CD25 (IgG1,K de ratón; clon M-A251; BD n.° 555434) se realizó a 4 °C durante 30 min, de acuerdo con las sugerencias del proveedor. Las células se lavaron dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 % y se fijaron durante 15 min a 4 °C, usando 100 pl/pocillo de tampón de fijación (BD n.° 554655). Después de la centrifugación, las muestras se resuspendieron en 200 pl/pocillo de PBS con BSA al 0,1 % y se analizaron usando una máquina FACS Canto II (programa informático FACS Diva). La figura 41 representa el nivel de expresión del marcador de activación temprana CD69 y del marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD4+ y CD8+ después de 48 horas de incubación (resultados representativos de dos experimentos independientes). Los anticuerpos pSCHLI372-TCB CLC y pSCHLI373-TCB CLC indujeron una regulación por incremento de los marcadores de activación CD69 y CD25 de manera específica y dependiente de la concentración en presencia de células diana positivas para BCMA. No se observó activación de los linfocitos T CD4+ y CD8+ cuando los PBMC humanos se trataron con el anticuerpo de control TCB DP47, lo que sugiere que a pesar de la unión a CD3 en los linfocitos T, la activación de los linfocitos T no se produce cuando el anticuerpo TCB no se une a células diana positivas para BCMA.

Ejemplo 47

Citotoxicidad de linfocitos T redirigida de células de mieloma H929 con alta expresión de BCMA inducida por anticuerpos biespecíficos de linfocitos T anti-BCMA/anti-CD3 (ensayo colorimétrico de liberación de LDH)

También se analizaron anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (pSCHLI372, pSCHLI373) para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células de mieloma múltiple con expresión alta de BCMA tras la reticulación de la construcción por medio de la unión de los restos de unión a antígeno a BCMA en células. En resumen, células diana de mieloma múltiple H929 que expresan BCMA humano se recogieron con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en RPMI complementado con suero fetal bovino al 10 % (Invitrogen). Se sembraron aproximadamente 30000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la respectiva dilución de la construcción para obtener una concentración final deseada (por triplicado); variando las concentraciones finales de 0,12 pM a 100 nM. Para una comparación apropiada, se ajustaron todas las construcciones de TCB y controles a la misma molaridad. Se añadieron linfocitos T totales humanos (efectores) en los pocillos para obtener una proporción E:T final de 5:1. Cuando se usaron PBMC humanos como células efectoras, se usó una proporción E:T final de 10:1. Se representaron los grupos de control negativo por células efectoras o diana solo. Como control positivo para la activación de linfocitos pan T humanos, se usó 1 pg/ml de PHA-M (Sigma n.° L8902). Para la normalización, se determinó la lisis máxima de las células diana de mieloma múltiple H929 (= 100 %) por incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %, que indujo la muerte celular. Se representó la lisis mínima (= 0 %) por células diana coincubadas solo con células efectoras, es decir, sin ningún anticuerpo biespecífico de linfocitos T.

Después de 20-24 h o 48 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió la liberación de LDH de las células diana de mieloma múltiple apoptóticas/necróticas en el sobrenadante con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se representó el porcentaje de liberación de LDH frente a las concentraciones de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA en curvas de respuesta a la concentración.

Se midieron los valores de CE50 usando el programa informático Prism (GraphPad) y se determinaron como la concentración de anticuerpo TCB que da como resultado un 50 % de liberación de LDH máxima. Como se muestra en las figuras 42A-B, los anticuerpos TCB CLC anti-BCMA, pSCHLI372-TCB CLC (Fig. 42A, B) y pSCHLI373-TCB CLC (Fig. 42B) indujeron una destrucción dependiente de la concentración de células de mieloma H929 positivas para BCMA según se midió por liberación de LDH. La destrucción de células H929 fue específica, puesto que el anticuerpo de control TCB DP47 que no se une a las células diana positivas para BCMA no indujo la liberación de LDH, incluso en la mayor concentración sometida a prueba de 100 nM. La tabla 45 resume los valores de CE50 para la destrucción por linfocitos T redirigida de células H929 positivas para BCMA inducida por anticuerpos TCB CLC anti-BCMA.

Tabla 45: Valores de CE50 para la destrucción por linfocitos T redirigida de células H929 inducida por anticuerpos TCB CLC anti-BCMA

Ejemplo 48

Citotoxicidad de linfocitos T redirigida de células de mieloma U266 con expresión media/baja de BCMA inducida por anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (ensayo de liberación de LDH)

Se analizaron anticuerpos TCB CLC anti-BCMA (pSCHLI372, pSCHLI373) para determinar su capacidad para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células de mieloma múltiple con expresión media/baja de BCMA tras la reticulación de la construcción por medio de la unión de los restos de unión a antígeno a BCMA en células. En resumen, células diana de mieloma múltiple U266 con expresión media/baja de BCMA humano se recogieron con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en RPMI complementado con suero fetal bovino al 10 % (Invitrogen). Se siembran aproximadamente 30000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la respectiva dilución de la construcción para obtener una concentración final deseada (por triplicado); variando las concentraciones finales de 0,12 pM a 100 nM. Para una comparación apropiada, se ajustaron todas las construcciones de TCB y controles a la misma molaridad. Se añadieron linfocitos T totales humanos (efectores) en los pocilios para obtener una proporción E:T final de 5:1. Cuando se usaron PBMC humanos como células efectoras, se usó una proporción E:T final de 10:1. Se representaron los grupos de control negativo por células efectoras o diana solo. Como control positivo para la activación de linfocitos T humanos, se usó 1 pg/ml de PHA-M (Sigma n.° L8902). Para la normalización, se determinó la lisis máxima de las células diana de mieloma múltiple (= 100 %) por incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %, que indujo la muerte celular. Se representó la lisis mínima (= 0 %) por células diana coincubadas solo con células efectoras, es decir, sin ningún anticuerpo biespecífico de linfocitos T. Después de 20-24 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió la liberación de LDH de las células diana de mieloma múltiple apoptóticas/necróticas en el sobrenadante con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se representó el porcentaje de liberación de LDH frente a las concentraciones de anticuerpos TCB CLC anti-BCMA en curvas de respuesta a la concentración. Se midieron los valores de CE50 usando el programa informático Prism (GraphPad) y se determinaron como la concentración de anticuerpo TCB que da como resultado un 50 % de liberación de LDH máxima. La tabla 46 resume los valores de CE50 para la destrucción por linfocitos T redirigida de células U266 positivas para BCMA inducida por anticuerpos TCB CLC anti-BCMA.

Tabla 46: Valores de CE50 para la destrucción por linfocitos T redirigida de células U266 inducida por anticuerpos TCB CLC anti-BCMA

Secuencias de aminoácidos de modos de realización ejemplares

1) Proteínas de unión a FolR útiles en formato de cadena ligera común, cadena pesada variable

2) Proteína de unión a CD3, cadena ligera común (CLC)

3) Proteína de unión a CD3, cadena pesada

4) Proteínas de unión a MUC1 útiles en formato de cadena ligera común, cadena pesada variable

) Proteínas de unión a BCMA útiles en formato de cadena ligera común, cadena pesada variable

) DP47 no dirigido

7) Secuencias diana ejemplares

8) Secuencias de nucleótidos de modos de realización ejemplares

) Secuencias de nucleótidos y proteínas de cadena ligera común adicionales

0) Secuencias de ADN CD3 humanizado CH2527 (CDR/VH/VL)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, en la que el primer resto de unión a antígeno comprende una primera cadena ligera y en la que el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, en la que el antígeno activador de linfocitos T es CD3, en la que el segundo resto de unión a antígeno comprende una segunda cadena ligera y en la que el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en la que el antígeno de célula diana es el receptor 1 de folato (FolR1), en la que la secuencia de aminoácidos de la primera y la segunda cadena ligera es idéntica, en la que la primera y la segunda cadena ligera comprende las Cd R de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y Se Q ID No : 34, en la que el primer resto de unión a antígeno es un Fab y el segundo resto de unión a antígeno es un Fab.

2. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 1, que comprende además un tercer resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana.

3. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 1, que comprende además un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.

4. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la primera y segunda cadena ligera comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

5. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 4, en la que la primera y segunda cadena ligera comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

6. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T comprende una cadena pesada que comprende las CDR de la cadena pesada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39.

7. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 2, en la que el primer, segundo y tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab que comprende una cadena ligera VLCL idéntica.

8. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 2 o 7, en la que el primer, segundo y tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab que comprende las CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.

9. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 2 o 7, en la que el primer, segundo y tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

10. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 7 a 9, en la que el primer y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno.

11. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en la que el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, específicamente un dominio Fc de IgG1 o IgG4.

12. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en la que el dominio Fc es un dominio Fc humano.

13. Un polinucleótido aislado que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Un vector, en particular, un vector de expresión, que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 13.

15. Una célula huésped que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 13 o el vector de la reivindicación 14.

16. Un procedimiento de producción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 15 en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y b) recuperar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

17. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17 para su uso como medicamento.

19. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17 para su uso en el tratamiento del cáncer.