ES2947230T3

ES2947230T3 - Moléculas biespecíficas para linfocitos T activadas por proteasa

Info

Publication number: ES2947230T3
Application number: ES17711223T
Authority: ES
Inventors: Peter Bruenker; Rebecca Croasdale-Wood; Christian Klein; Juergen Michael Schanzer; Kay-Gunnar Stubenrauch; Pablo Umana; Martina Geiger; Eric Sullivan; Jigar Patel
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2017-03-20
Publication date: 2023-08-03
Anticipated expiration: 2037-03-20
Also published as: DK3433280T5; US20230119537A1; IL260637B2; RU2018136567A; DK3433280T3; IL260637B1; LT3433280T; JP2019514850A; FI3433280T3; PH12018502035A1; UA127308C2; IL260637A; SI3433280T1; PL3433280T3; CL2018002507A1; US20190119383A1; ZA201804973B; US11242390B2; JP7015244B2; US20220275087A1

Abstract

La presente invención se refiere en general a nuevas moléculas biespecíficas de activación de células T activables por proteasa y polipéptidos específicos de idiotipo que actúan como restos de enmascaramiento. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales moléculas biespecíficas y polipéptidos específicos de idiotipo que activan células T activables por proteasa, y vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a métodos para producir moléculas biespecíficas activadoras de células T activables por proteasa y polipéptidos específicos de idiotipo de la invención, y a procedimientos para usar estas moléculas biespecíficas activadoras de células T activables por proteasa y polipéptidos específicos de idiotipo en el tratamiento de enfermedades. . (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas biespecíficas para linfocitos T activadas por proteasa

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a novedosas moléculas de unión a antígeno activables por proteasa que comprenden un resto de unión antiidiotipo que enmascara de forma reversible la unión a antígeno de la molécula. Específicamente, la invención se refiere a moléculas de unión a linfocitos T que tienen un resto de unión antiidiotipo que enmascara el resto de unión a CD3 hasta su escisión por una proteasa. Esto permite que el resto de unión a CD3 sea inaccesible o esté "enmascarado" hasta que esté cerca de un tejido diana, tal como un tumor, por ejemplo, linfocitos T infiltrantes de tumor. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichas moléculas de unión a linfocitos T activadas por proteasa y polipéptidos específicos de idiotipo, y vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a procedimientos para producir las moléculas de unión a linfocitos T activadas por proteasa de la invención, y a procedimientos de uso de las mismas, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad.

Antecedentes

La destrucción selectiva de una célula diana individual o de un tipo de célula diana específica a menudo es deseable en una variedad de entornos clínicos. Por ejemplo, un objetivo principal del tratamiento del cáncer es destruir específicamente las células tumorales, al tiempo que se dejan las células y tejidos sanos intactos y sin daños.

Una forma atractiva de lograr esto es induciendo una respuesta inmunitaria frente al tumor, para hacer que las células efectoras inmunitarias, tales como linfocitos citolíticos naturales (NK) o linfocitos T citotóxicos (CTL), ataquen y destruyan a las células tumorales. A este respecto, los anticuerpos biespecíficos diseñados para unirse con un "brazo" a un antígeno de superficie en células diana, y con el segundo "brazo" a un componente invariante activador del complejo receptor de linfocitos T (TCR), se han vuelto de interés en los últimos años. La unión simultánea de un anticuerpo de este tipo a ambas de sus dianas forzará una interacción temporal entre la célula diana y el linfocito T, provocando la activación de cualquier linfocito T citotóxico y la posterior lisis de la célula diana. De ahí que la respuesta inmunitaria se redirija a las células diana y sea independiente de la presentación de antígenos peptídicos por la célula diana o la especificidad del linfocito T como sería pertinente para la activación restringida para MHC normal de los CTL.

En este contexto, es crucial que los CTL se activen solo cuando están muy cerca de una célula diana, es decir, se imita la sinapsis inmunológica. En particular, son deseables las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T que no requieren preacondicionamiento o coestimulación de los linfocitos para provocar la lisis eficaz de las células diana. Se han desarrollado varios formatos de anticuerpos biespecíficos e investigado su idoneidad para inmunoterapia mediada por linfocitos T. Estos incluyen moléculas BiTE (captador biespecífico de linfocitos T) (Nagorsen y Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)), diacuerpos (Holliger etal., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) y derivados de los mismos, tales como diacuerpos en tándem (Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)), moléculas DART (redireccionamiento con doble afinidad), (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)), y Triomab (Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). El documento WO2016014974 describe anticuerpos anti-CD3 activables y procedimientos de uso de los mismos. Carreno et al. 1991 Hum Immunol 33(4):249-58 (1992) describen la reactividad cruzada entre especies de la cascada anti-OKT3 antiidiotipo.

La tarea de generar moléculas biespecíficas adecuadas para el tratamiento presenta varios desafíos técnicos relacionados con la eficacia, toxicidad, aplicabilidad y producibilidad que se tienen que cumplir. En los casos donde la molécula biespecífica selecciona como diana un antígeno en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, que también se expresa en tejido no diana, se puede producir toxicidad. Por tanto, existe la necesidad de obtener moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T eficaces que desencadenen la activación de linfocitos T completa en presencia de células diana, pero no en presencia de células o tejido normales.

Sumario de la invención

La invención se refiere, en general, a moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T que se activan selectivamente en presencia de una célula diana.

En un aspecto, la invención se refiere a una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende

(a) un primer resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a CD3, en el que el primer resto de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento del mismo;

(b) un segundo resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, en el que el segundo resto de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento del mismo; y

(c) un resto de enmascaramiento fijado covalentemente a la molécula de unión biespecífica para linfocitos T a través de un conector escindible por proteasa, en el que el resto de enmascaramiento se puede unir específicamente al idiotipo del primer o del segundo resto de unión a antígeno, ocultando, de este modo, de forma reversible el primer o segundo resto de unión a antígeno, en el que el resto de enmascaramiento es un scFv antiidiotípico.

En un modo de realización, el resto de enmascaramiento de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa está fijado covalentemente al primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento está fijado covalentemente a la región variable de la cadena pesada del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento está fijado covalentemente a la región variable de la cadena ligera del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento es un scFv antiidiotipo.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende un segundo resto de enmascaramiento que oculta de forma reversible el segundo resto de unión a antígeno.

En un modo de realización, la proteasa que puede escindir el conector escindible por proteasa se expresa por la célula diana. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian las regiones variables o bien las constantes de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones constantes de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab se intercambian. En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a CD3. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización particular, el tercer resto de unión a antígeno es idéntico al segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización particular, el tercer resto de unión a antígeno no es idéntico al segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 o HER1. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1, HER1 o mesotelina. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1, HER1, HER2 o mesotelina.

En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico. En un modo de realización particular, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización particular, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende adicionalmente un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable.

En un modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, específicamente una IgGi o IgG4. En un modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc humano. En un modo de realización, el dominio Fc presenta afinidad de unión reducida por un receptor Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgGi natural. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor Fc y/o la función efectora. En un modo de realización particular, las una o más sustituciones aminoacídicas están en una o más posiciones seleccionadas del grupo de L234, L235 y P329 (numeración de Kabat). En un modo de realización particular, cada subunidad del dominio Fc comprende tres sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor Fc activador y/o la función efectora, en la que dichas sustituciones aminoacídicas son L234A, L235A y P329G. En un modo de realización particular, el receptor Fc es un receptor Fcy. En un modo de realización, la función efectora es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En un modo de realización, la célula diana es una célula humana.

En un modo de realización, el resto de enmascaramiento comprende una región variable de la cadena pesada que comprende al menos una de:

(a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR H) 1 de DYSIH (SEQ ID NO: 20);

(b) una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO: 21); y (c) una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de PYDYDVLDY (SEQ ID NO: 22).

En un modo de realización, el resto de enmascaramiento comprende una región variable de la cadena ligera que comprende al menos una de:

(a) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de RASKSVSTSNYSYIH (SEQ ID NO: 23); (b) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de YVSYLES (SEQ ID NO: 24); y

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHSREFPWT (SEQ ID NO: 25).

En un modo de realización, el resto de enmascaramiento comprende una región variable de la cadena pesada que comprende:

(b) una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO: 21);

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de PYDYDVLDY (SEQ ID NO: 22); y una región variable de la cadena ligera que comprende:

(d) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de RASKSVSTSNYSYIH (SEQ ID NO: 23); (e) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de YVSYLES (SEQ ID NO: 24); y

(f) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHSREFPWT (SEQ ID NO: 25).

(a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR H) 1 de SYGVS (SEQ ID NO: 26);

(b) una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO: 27);

y

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO: 28).

(a) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 29);

(b) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de AATFLAD (SEQ ID NO: 30); y

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHYYSTPYT (SEQ ID NO: 31).

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO: 28); y una región variable de la cadena ligera que comprende:

(d) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 29);

(e) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de AATFLAD (SEQ ID NO: 30); y

(f) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHYYSTPYT (SEQ ID NO: 31).

En un modo de realización, el conector escindible por proteasa comprende al menos una secuencia de reconocimiento de proteasa. En un modo de realización, el conector escindible por proteasa comprende una secuencia de reconocimiento de proteasa. En un modo de realización, la secuencia de reconocimiento de proteasa se selecciona del grupo que consiste en:

(a) RQARVVNG (SEQ ID NO: 36);

(b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP (SEQ ID NO: 37);

(c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG (SEQ ID NO: 38); y

(d) RQARVVNGVPLSLYSG (SEQ ID NO: 39)

(e) PLGLWSQ (SEQ ID NO: 40), en la que X es cualquier aminoácido.

En un modo de realización, el conector escindible por proteasa comprende una secuencia de reconocimiento de proteasa. En un modo de realización, la secuencia de reconocimiento de proteasa se selecciona del grupo que consiste en:

(a) RQARVVNG (SEQ ID NO: 36);

(b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP (SEQ ID NO: 37);

(c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG (SEQ ID NO: 38);

(d) RQARVVNGVPLSLYSG (SEQ ID NO: 39);

(e) PLGLWSQ (SEQ ID NO: 40);

(f) VHMPLGFLGPRQARVVNG (SEQ ID NO: 97);

(g) FVGGTG (SEQ ID NO: 98);

(h) KKAAPVNG (SEQ ID NO: 99);

(i) PMAKKVNG (SEQ ID NO: 100);

(j) QARAKVNG (SEQ ID NO: 101);

(k) VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 102);

(l) QARAK (SEQ ID NO: 103);

(m) VHMPLGFLGPPMAKK (SEQ ID NO: 104);

(n) KKAAP (SEQ ID NO: 105); y

(o) PMAKK (SEQ ID NO: 106), en la que X es cualquier aminoácido.

En un modo de realización, la proteasa que puede escindir el conector escindible por proteasa se selecciona del grupo que consiste en metaloproteinasa, por ejemplo, metaloproteinasa de la matriz (m Mp ) 1-28 y una desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28-30 y 33, serina proteasa, por ejemplo, activador del plasminógeno de tipo urocinasa y matriptasa, cisteína proteasa, aspártico proteasa y catepsina proteasa. En un modo de realización específico, la proteasa es MMP9 o MMP2. En otro modo de realización específico, la proteasa es matriptasa. En un modo de realización, el conector escindible por proteasa comprende la secuencia de reconocimiento de proteasa RQARVVNG (SEQ ID NO: 36).

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el primer resto de unión a antígeno comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el primer resto de unión a antígeno comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y las CDR de la cadena ligera de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el primer resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el primer resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y al menos una CDR de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 153 y al menos una CDR de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 156.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 153 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 156.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a mesotelina y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 109 y al menos una CDR de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112. En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a mesotelina y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107, SEQ ID No : 108 y SEQ ID NO: 109 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a HER1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada de uno cualquiera de los anticuerpos divulgados en el documento WO/2006/082515.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a HER1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 y al menos una CDR de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a HER1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61.

En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. En un modo de realización de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento, el segundo resto de unión a antígeno comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a HER2, en los que el segundo resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161, en los que el tercer resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161.

En un modo de realización particular, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento comprende

(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(b) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y

(c) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(a) al menos una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;

(b) al menos una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72;

(c) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85;

(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73;

(b) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;

(c) una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y

(d) una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74.

(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77;

(b) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82;

(c) una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; y

(d) una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81.

(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76;

(b) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77;

(d) una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.

(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132;

(b) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136;

(c) una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; y

(d) una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137;

(b) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139;

(d) una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138.

En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido específico de idiotipo para ocultar de forma reversible un sitio de unión a antígeno anti-CD3 de una molécula, en el que el polipéptido específico de idiotipo es un scFv antiidiotipo, y en el que el polipéptido específico de idiotipo está fijado covalentemente a la molécula a través de un conector peptídico. En un modo de realización, el conector es un conector escindible por proteasa. En un modo de realización, el conector peptídico comprende al menos un sitio de reconocimiento de proteasa. En un modo de realización, la proteasa se selecciona del grupo que consiste en metaloproteinasa, por ejemplo, metaloproteinasa de la matriz (MMP) 1-28 y una desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28-30 y 33, serina proteasa, por ejemplo, activador del plasminógeno de tipo urocinasa y matriptasa, cisteína proteasa, aspártico proteasa y catepsina proteasa. En un modo de realización específico, la proteasa es MMP9 o MMP2. En otro modo de realización específico, la proteasa es matriptasa. En un modo de realización, el polipéptido específico de idiotipo está fijado covalentemente a la molécula a través de más de un conector. En un modo de realización, el polipéptido específico de idiotipo está fijado covalentemente a la molécula a través de dos conectores.

En un modo de realización, la molécula que comprende el sitio de unión a antígeno anti-CD3 es una molécula biespecífica activadora de linfocitos T. En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende al menos una de:

(b) una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO: 21); y

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de PYDYDVLDY (SEQ ID NO: 22).

En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende al menos una de

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHSREFPWT (SEQ ID NO: 25).

En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende:

(f) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHSREFPWT (SEQ ID NO: 25).

En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende al menos una de:

y

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO: 28).

En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende al menos una de:

(b) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de AATFLAD (SEQ ID NO: 30); y

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHYYSTPYT (SEQ ID NO: 31).

En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende:

(d) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 29); (e) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de AATFLAD (SEQ ID NO: 30); y

(f) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHYYSTPYT (SEQ ID NO: 31).

De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención. La invención proporciona además un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la invención y una célula huésped que comprende el polinucleótido aislado o el vector de expresión de la invención. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula eucariota, en particular una célula de mamífero.

En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de producción de la molécula para linfocitos T activada por proteasa de la invención, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula para linfocitos T activada por proteasa y b) recuperar la molécula para linfocitos T activada por proteasa.

En otro aspecto, se proporciona solo para referencia un procedimiento de producción del polipéptido específico de idiotipo como se describe anteriormente en el presente documento, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula para linfocitos T activada por proteasa y b) recuperar el polipéptido específico de idiotipo.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se engloban procedimientos de uso de la molécula para linfocitos T activada por proteasa y la composición farmacéutica como se describe anteriormente en el presente documento. En un aspecto, la invención proporciona una molécula para linfocitos T activada por proteasa o una composición farmacéutica de la invención para su uso como un medicamento. En un aspecto, se proporciona una molécula para linfocitos T activada por proteasa o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite. En un modo de realización específico, la enfermedad es cáncer.

En un modo de realización específico, la enfermedad es cáncer. En cualquiera de los modos de realización anteriores, el individuo preferentemente es un mamífero, en particular un ser humano.

En otro aspecto, la invención también proporciona una composición que comprende una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa descrita en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se proporciona solo para referencia una composición que comprende un polipéptido específico de idiotipo como se describe anteriormente en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se proporciona una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa como se describe anteriormente en el presente documento, o la composición descrita anteriormente en el presente documento, para su uso como un medicamento.

En otro aspecto, la invención también proporciona una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa como se describe anteriormente en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite. En un modo de realización, la enfermedad es un trastorno proliferativo, en particular, cáncer.

En otro aspecto, la invención también proporciona un anticuerpo frente a CD3 antiidiotipo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para un idiotipo de una molécula de unión a antígeno anti-CD3, en el que el anticuerpo frente a CD3 antiidiotipo o fragmento del mismo, cuando se une a la molécula de unión a antígeno anti-CD3, bloquea específicamente la unión de la molécula de unión a antígeno anti-CD3 a CD3, en el que el anticuerpo frente a CD3 antiidiotipo o fragmento de unión a antígeno del mismo se asocia de forma reversible con la molécula de unión a antígeno anti-CD3 a través de un conector peptídico que comprende un sitio de reconocimiento de proteasa. En un modo de realización, el CD3 es un CD3 de ratón, de mono o humano.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-E representan esquemas de diferentes proteínas de unión a CD3 con restos de enmascaramiento. FIG. 1A: 7859 scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - sitio de matriptasa MK062 - Fc frente a CD3. FIG. 1B: 7860 scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - sitio de matriptasa MK062 - Fc frente a CD3. FIG. 1C: 7857 scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - conector no escindible- Fc frente a CD3. FIG. 1D: ID 7858 scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector no escindible - Fc frente a CD3. FIG. 1E: 7861 Fc frente a CD3 monovalente.

La figura 2 muestra una tabla que resume las afinidades de los restos de enmascaramiento antiidiotípicos por la proteína de unión a CD3 (CH2527).

Las figuras 3A-D muestran el análisis por electroforesis capilar-SDS de las moléculas representadas en las figuras 1A y B. Análisis por electroforesis capilar-SDS en las FIGS. 3A-B de la molécula representada en la FIG. 1A en condiciones no reductoras (FIG. 3A) y reductoras (FIG. 3B). La comparación de la molécula no tratada (I) y tratada (III) muestra la escisión completa del scFv anti-ID después del tratamiento con rh-matriptasa/ST14 durante 48 h a 37 °C. Una muestra (II) no se trató, pero se incubó a 37 °C durante 48 h. Análisis por electroforesis capilar-SDS en las FIGS. 3C-D de la molécula representada en la FIG. 1B en condiciones no reductoras (FIG. 3C) y reductoras (FIG. 3D). La comparación de la molécula no tratada (I) y tratada (III) muestra la escisión completa del scFv anti ID después del tratamiento con rh-matriptasa/ST14 durante 48 h a 37 °C. Una muestra (II) no se trató, pero se incubó a 37 °C durante 48 h.

Las figuras 4A-C muestran el efecto del enmascaramiento antiidiotípico de la unión a CD3. Las FIGS. 4A y B representan los resultados de los ensayos indicadores para Jurkat NFAT para mostrar el efecto de enmascaramiento de scFv frente a CD3 antiidiotípico 4.15.64 (FIG. 4A) o scFv frente a CD3 antiidiotípico 4.32.63 (FIG. 4B). Las IgG frente a CD3 monovalentes se reticularon por medio de un anticuerpo anti-Fc humano (recubierto en una placa de ensayo) antes de que se añadiera Jurkat NFAT (línea celular indicadora de leucemia linfocítica aguda con un promotor NFAT, que expresa CD3e humano). La línea celular indicadora Jurkat-NFAT (Promega) es una línea celular indicadora de leucemia linfocítica aguda humana con un promotor NFAT, que expresa CD3^ehumano. Si la proteína de unión a CD3 se une a CD3^e, la luciferasa se expresa y esto se puede medir en luminiscencia después de la adición del sustrato de One-Glo (Promega). La FIG. 4C muestra una comparación de los valores de CE50 de la unión a CD3e para la proteína de unión a CD3 monovalente enmascarada y no enmascarada.

Las figuras 5A-H representan esquemas de diferentes moléculas biespecíficas para linfocitos T con restos de enmascaramiento. FIG. 5A: scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - sitio de matriptasa MK062 - Fc, 16D5, frente a CD3 7344. FIG. 5B: scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - conector no escindible - Fc, 16D5, frente a CD37676. FIG. 5C: scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - sitio de matriptasa MK062 - Fc, 16D5, frente a CD3 7496. FIG. 5D: scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector no escindible - Fc, 16D5, frente a CD3 7611. FIG. 5E: GA916-D-16D5-02 sf W(1) 6298. TCB 2+1 clásico, 16D5, frente a FolR1 con cadena ligera común. FIG. 5F: GA916-D-16D5 sf W(3a) 61 o0. TCB 2+1 invertido, 16D5, frente a FolR1 con cadena ligera común. FIG. 5G: DP47GS TCB sf CHO W(9a) iD 6182. TCB 2+1 invertido, DP47. FIG. 5H: Fab de CH2527 anti-ID 4.15.64 - sitio de matriptasa MK062 - Fc, 16D5, frente a CD37494.

La figura 6 muestra una primera proporción de plásmidos usada para la transfección por cromatografía de exclusión por tamaño (1 (ojal): 1 (botón):3 (CLC)).

La figura 7 muestra una segunda proporción de plásmidos usada para la transfección por cromatografía de exclusión por tamaño. (1 (ojal):2 (botón):3 (CLC)).

La figura 8 muestra el análisis por EC-SDS de la molécula de TCB representada en la FIG. 5A (ID 7344) (preparación purificada final): carril A = no reducida, carril B = reducida, carril C = patrón de proteína.

La figura 9 muestra el análisis por EC-SDS de la molécula de TCB representada en la FIG. 5B (ID 7676) (preparación purificada final): carril A = no reducida, carril B = reducida, carril C = patrón de proteína.

La figura 10 muestra el análisis por EC-SDS de la molécula de TCB representada en la FIG. 5C (ID 7496) (preparación purificada final): carril A = no reducida, carril B = reducida, carril C = patrón de proteína.

La figura 11 muestra el análisis por EC-SDS de la molécula de TCB representada en la FIG. 5D (ID 7611) (preparación purificada final): carril A = no reducida, carril B = reducida, carril C = patrón de proteína.

Las figuras 12A-D muestran el análisis por electroforesis capilar-SDS de las moléculas representadas en las figuras 5A y C. Las FIGS. 12A y B muestran la electroforesis capilar de las moléculas representadas en las figuras 5A (ID 7344), scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - MK062 - Fc, 16D6, frente a CD3, en condiciones no reductoras (FIG. 12A) y reductoras (FIG. 12B). La comparación de la molécula no tratada (I) y tratada (III) muestra la escisión completa del scFv anti-ID después del tratamiento con rh-matriptasa/ST14 durante 48 h a 37 °C. Una muestra (II) no se trató, pero se incubó a 37 °C durante 48 h. Se usó Mark 12 (Invitrogen) como marcador (IV) de proteína preteñido para la estimación del peso molecular correcto. Las FIGS. 12C y D muestran la electroforesis capilar de la molécula representada en la FlG. 5C (ID 7496) scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - MK062 - Fc, 16D6, frente a CD3 en condiciones no reductoras (FlG. 12C) y reductoras (FlG. 12D). La comparación de la molécula no tratada (I) y tratada (III) muestra la escisión completa del scFv anti-ID después del tratamiento con rh-matriptasa/ST14 durante 48 h a 37 °C. Una muestra (II) no se trató, pero se incubó a 37 °C durante 48 h. Se usó Mark 12 (Invitrogen) como marcador (IV) de proteína preteñido para la estimación del peso molecular correcto.

La figura 13 muestra la cuantificación del nivel de expresión de FolR1 realizada por Qifikit (Dako). Anticuerpo frente a FolR1: n.° LS-C125620-100 (LifeSpan BioSciences Inc); usado a 20 |jg/ml; isotipo IgG1 de ratón: n.° 554121 (BD).

Las figuras 14A y B muestran la activación de linfocitos T por TCB activados por proteasa. La FIG. 14A muestra la destrucción de células Skov3 inducida por moléculas de TCB activado por proteasa a una concentración de 10 nM (TCB con diferentes enmascaramientos para CD3 antiidiotípicos, conector escindible y no escindible, moléculas pretratadas con rh-matriptasa/ST14 purificada) y PBMC humanos después de 48 h de incubación (E:T = 7:1, los efectores son PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C. La FIG. 14B muestra la activación de linfocitos T de PBMC humanos inducida por la unión de TCB activado por proteasa de 10 nM (TCB con diferentes enmascaramientos para CD3 antiidiotípicos, conector escindible y no escindible, moléculas tratadas) en células Skov3 después de 48 h de incubación (E:T = 7:1, los efectores son PBMC humanos). Marcadores de activación de linfocitos T CD25 (paneles de la izquierda) y CD69 (paneles de la derecha). Linfocitos T CD4+ y CD8+ como se indica.

Las figuras 15A y B muestran la activación de linfocitos T por TCB activados por proteasa. La FIG. 15A muestra la destrucción de células Mkn-45 inducida por moléculas de TCB activado por proteasa a una concentración de 100 nM (TCB con diferentes enmascaramientos para CD3 antiidiotípicos, conector escindible y no escindible, moléculas tratadas) y PBMC humanos después de 48 h de incubación (E:T = 7:1, los efectores son PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C. La FIG. 15B muestra la activación de linfocitos T de PBMC humanos inducida por la unión de TCB activado por proteasa de 100 nM (TCB con diferentes enmascaramientos para CD3 antiidiotípicos, conector escindible y no escindible, moléculas tratadas) en células Mkn-45 después de 48 h de incubación (E:T = 7:1, los efectores son PBMC humanos). Marcadores de activación de linfocitos T CD25 (paneles de la izquierda) y CD69 (paneles de la derecha). Linfocitos T CD4+ y CD8+ como se indica.

La figura 16 muestra la destrucción de células HT29 inducida por moléculas de TCB activado por proteasa a una concentración de 10 nM (TCB con diferentes enmascaramientos para CD3 antiidiotípicos, conector escindible y no escindible, moléculas tratadas) y PBMC humanos después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C. Las barras de izquierda a derecha son 7344: scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - MK062 - Fc, 16D6, frente a CD3; 7344: scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - MK062 - Fc, 16D6, frente a CD3_tratado; 7676: scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - no escindible - Fc, 16D6, frente a CD3; 7496: scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - MK062 - Fc, 16D6, frente a CD3; 7496: scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - MK062 - Fc, 16D6, frente a CD3_tratado; 7611: scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector no escindible - Fc, 16D6, frente a CD3; 6298: GA916-D-16D5-02 sf W(1); 6182: DP47GS TCB sf CHO W(9a).

La figura 17 muestra la destrucción de células Skov3 inducida por moléculas de TCB activado por proteasa a una concentración de 10 nM (TCB con diferentes enmascaramientos para CD3 antiidiotípicos, conector escindible y no escindible, moléculas tratadas) y PBMC humanos (de un donante diferente al de los PBMC usados para la FIG.

14A) después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C. Las barras de izquierda a derecha son 7344: scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - MK062 - Fc, 16D6, frente a CD3; 7344: scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - MK062 -Fc, 16D6, frente a CD3_tratado; 7676: scFv de CH2527 anti-ID 4.15.64 - no escindible - Fc, 16D6, frente a CD3; 7496: scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - MK062 - Fc, 16D6, frente a CD3; 7496: scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 -MK062 - Fc, 16D6, frente a CD3_tratado; 7611: scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector no escindible - Fc, 16D6, frente a CD3; 6298: GA916-D-16D5-02 sf W(1); 6182: DP47GS TCB sf CHO W(9a).

Las figuras 18A y B muestran la activación de linfocitos T por TCB activados por proteasa. La FIG. 18A muestra destrucción dependiente de la dosis de células HeLa inducida por moléculas de t Cb activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.15.64 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) y PBMC humanos (aislados de la capa leucocítica) después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C.

La FIG. 18B muestra la activación de linfocitos T dependiente de la dosis de PBMC humanos inducida por la unión de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.15.64 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) en células HeLa después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Marcadores de activación de linfocitos T CD25 (paneles de la izquierda) y CD69 (paneles de la derecha). Linfocitos T CD4+ y CD8+ como se indica.

Las figuras 19A y B muestran la activación de linfocitos T por TCB activados por proteasa. La FIG. 19A muestra destrucción dependiente de la dosis de células HeLa inducida por moléculas de t Cb activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.32.63 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) y PBMC humanos (aislados de la capa leucocítica) después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C. La fig. 19B muestra la activación de linfocitos T dependiente de la dosis de PBMC humanos inducida por la unión de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.32.63 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) en células HeLa después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Marcadores de activación de linfocitos T CD25 (paneles de la izquierda) y CD69 (paneles de la derecha). Linfocitos T CD4+ y CD8+ como se indica.

Las figuras 20A y B muestran la activación de linfocitos T por TCB activados por proteasa. La FIG. 20A muestra destrucción dependiente de la dosis de células Skov3 inducida por moléculas de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.15.64 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) y PBMC humanos (aislados de la capa leucocítica) después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C. La FIG. 20B muestra la activación de linfocitos T dependiente de la dosis de PBMC humanos inducida por la unión de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.15.64 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) en células Skov3 después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Marcadores de activación de linfocitos T CD25 (paneles de la izquierda) y CD69 (paneles de la derecha). Linfocitos T CD4+ y CD8+ como se indica.

Las figuras 21A y B muestran la activación de linfocitos T por TCB activados por proteasa. La FIG. 21A muestra destrucción dependiente de la dosis de células Skov3 inducida por moléculas de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.32.63 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) y PBMC humanos (aislados de la capa leucocítica) después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C. La FIG. 21B muestra la activación de linfocitos T dependiente de la dosis de PBMC humanos inducida por la unión de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.32.63 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) en células Skov3 después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Marcadores de activación de linfocitos T CD25 (paneles de la izquierda) y CD69 (paneles de la derecha). Linfocitos T CD4+ y CD8+ como se indica.

Las figuras 22A y B muestran la activación de linfocitos T por TCB activados por proteasa. La FIG. 22A muestra la activación de linfocitos T dependiente de la dosis de PBMC humanos (donante diferente al de los experimentos descritos anteriormente) inducida por la unión de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.15.64 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) en células HT29 después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Marcadores de activación de linfocitos T CD25 (paneles de la izquierda) y CD69 (paneles de la derecha). Linfocitos T CD4+ y CD8+ como se indica. La FIG. 22B muestra la activación de linfocitos T dependiente de la dosis de PBMC humanos (donante diferente al de la figura 16) inducida por la unión de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.32.63 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) en células HT29 después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Marcadores de activación de linfocitos T CD25 (paneles de la izquierda) y CD69 (paneles de la derecha). Linfocitos T CD4+ y CD8+ como se indica.

La figura 23 muestra la activación de linfocitos T dependiente de la dosis de PBMC humanos (donante diferente al de los experimentos descritos anteriormente) inducida por la unión de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.15.64 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) en células HRCEpiC después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Marcadores de activación de linfocitos T CD25 (paneles de la izquierda) y CD69 (paneles de la derecha). Linfocitos T CD4+ y CD8+ como se indica.

La figura 24 muestra la destrucción de células Ovcar3 inducida por moléculas de TCB activado por proteasa a una concentración de 50 nM (TCB con diferentes enmascaramientos para CD3 antiidiotípicos, conector escindible y no escindible, moléculas tratadas) y PBMC humanos después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 10 min a 37 °C (no completamente escindido).

La figura 25 muestra la destrucción de células Skov3 inducida por 10 nM de moléculas de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.15.64 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) y PBMC humanos (aislados de la capa leucocítica) después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son tres donantes diferentes para PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rhmatriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C.

La figura 26 muestra la destrucción de células Skov3 inducida por 10 nM de moléculas de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.32.63 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) y PBMC humanos (aislados de la capa leucocítica) después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son tres donantes diferentes para PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rhmatriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C.

La figura 27 muestra la destrucción de células HeLa inducida por 100 μM de moléculas de TCB activado por proteasa (TCB con enmascaramiento de 4.32.63 frente a CD3 antiidiotípico, conector escindible y no escindible, molécula tratada) y PBMC humanos (aislados de la capa leucocítica) después de 48 h de incubación (E:T = 10:1, los efectores son tres donantes diferentes para PBMC humanos). Se realizó un pretratamiento con rhmatriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C.

La figura 28 representa un esquema de scFv de GA201 anti-ID - sitio de metaloproteasa de la matriz- Fc de GA201 (GA201-anti-GA201-scFv).

La figura 29 representa un esquema del anticuerpo GA201 anti-HER1.

Las figuras 30A y B muestran el análisis por electroforesis capilar-SDS de la molécula representada en la FIG. 28 en condiciones no reductoras (FIG. 30A) y reductoras (FIG. 30B). La molécula representada en la FIG. 28 se purificó hasta homogeneidad por cromatografía de exclusión por tamaño y con proteína A y se sometió a análisis por electroforesis capilar-SDS.

La figura 31 muestra el análisis por FACS de la unión de GA201-anti-GA201-scFv y GA201 a HER1 expresada en células H322M para confirmar el efecto de enmascaramiento del scFv de GA201 antiidiotípico. Se incubó GA201-anti-GA201-scFv durante la noche con metaloproteinasa de la matriz MMP-2 y la unión a células H322M se comparó con GA201-anti-GA201-scFv no escindido, GA201 y un anticuerpo control de isotipo IgG1. La unión a HER1 en células H322M se detectó con un conjugado F(ab')₂-anticuerpo secundario anti-Fc de IgG humana de cabra-FITC y se analizó por FACS usando el BD FACS Canto II. Se usó la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) para el análisis.

La figura 32 muestra el análisis por resonancia de plasmón superficial de la unión a HER1 de GA201 enmascarado y no enmascarado, antes y después de la escisión por MMP2.

Las figuras 33A-J representan esquemas de diferentes moléculas biespecíficas para linfocitos T con restos de enmascaramiento. FIG. 33A: ID 8364. TCB, 16D5, formato clásico, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - sitio de MMP9-matriptasa MK062 fusionado de forma N terminal a CD3. FIG. 33B: ID 8363. TCB, 16D5, formato clásico, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - sitio de catepsina S/B fusionado de forma N terminal a CD3. FIG. 33C: ID 8365. TCB, 16D5, formato invertido, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - sitio de matriptasa MK062 fusionado de forma N terminal a cadena ligera común. FIG. 33D: ID 8366. TCB, 16D5, formato invertido, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector no escindible fusionado de forma N terminal a cadena ligera común. FIG. 33E: ID 8672. TCB con residuos cargados RG7787 frente a a-mesotelina, formato clásico, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - sitio de MMP9-matriptasa MK062 fusionado de forma N terminal a XFab frente a CD3. FIG. 33F: ID 8673. TCB con residuos cargados RG7787 frente a a-mesotelina, formato clásico, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector no escindible fusionado de forma N terminal a XFab frente a CD3. FIG. 33G: ID 8674. TCB con residuos cargados RG7787 frente a a-mesotelina, formato invertido, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - sitio de MMP9-matriptasa MK062 fusionado de forma N terminal a XFab frente a CD3. FIG. 33H: 8675. TCB con residuos cargados RG7787 frente a amesotelina, formato invertido, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector no escindible fusionado de forma N terminal a XFab frente a CD3. FIG. 33I: ID 8505. TCB con XFab frente a CD3 con residuos cargados RG7787 frente a a-mesotelina, formato invertido. FIG. 33J: ID 8676. TCB con residuos cargados RG7787 frente a amesotelina con XFab frente a CD3, formato clásico.

La figura 34 representa el análisis por EC-SDS del TCB ID 8365 y TCB ID 8366 (preparación purificada final): carril A = patrón de proteína, carril B = proteína almacenada a 4 °C, carril C = proteína pretratada con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems), carril D = proteína incubada durante 72 h a 37 °C y carril E = molécula 3.

Las figuras 35A y B representan el análisis por EC-SDS del TCB representado en la FIG. 33A (ID 8364) y el TCB representado en la FIG. 33B (ID 8363). FIG. 35A: análisis por EC-SDS del TCB 8364 (preparación purificada final): carril A = patrón de proteína, carril B = proteína almacenada a 4 °C, carril C = proteína pretratada con rhmatriptasa/ST14 (R&D Systems), carril D = proteína incubada durante 72 h a 37 °C y carril E = construcción de conector no escindible. FIG. 35B: análisis por EC-SDS del TCB 8363 (preparación purificada final): carril A = patrón de proteína, carril B = proteína almacenada a 4 °C, carril C = proteína pretratada con rh-catepsina B (R&D Systems), carril D = proteína pretratada con rh-catepsina S (R&D Systems), carril E = proteína incubada durante 72 h a 37 °C y carril F = construcción de conector no escindible.

Las figuras 36A y B representan el ensayo de activación para Jurkat NFAT usando células HeLa y Skov-3 como células diana. Cada punto representa el valor medio de los triplicados. La desviación estándar se indica por barras de error. La línea celular indicadora Jurkat-NFAT (Promega) es una línea celular indicadora de leucemia linfocítica aguda humana con un promotor NFAT, que expresa CD3e humano. Si la proteína de unión a CD3 del TCB se une a la diana tumoral y el CD3 (es necesaria la reticulación) se une a CD3e, se puede medir la expresión de luciferasa en luminiscencia después de la adición del sustrato de One-Glo (Promega). Se compararon TCB frente a FolRI (triángulos negros que apuntan hacia abajo) y TCB activado por proteasa pretratado (8364, cuadrados grises rellenos) con scFv 4.32.63 frente a CD3 anti-ID fusionado de forma N terminal y sitio de MMP9-matriptasa MK062. La molécula se trató con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante aproximadamente 20 h a 37 °C. También se muestran el TCB enmascarado (que contiene un conector no escindible de GS, triángulos grises que apuntan hacia arriba) y el control de TCB no seleccionado como diana (triángulo vacío que apunta hacia abajo). La línea punteada muestra la luminiscencia de células diana y de células efectoras sin ningún TCB. La FIG. 36A muestra un ensayo de activación para Jurkat NFAT usando células HeLa como células diana. La FIG. 36B muestra un ensayo de activación para Jurkat NFAT usando células Skov-3 como células diana.

Las figuras 37A-D representan la citotoxicidad de células tumorales mediada por TCB frente a FolR1 y PBMC humanos (efector: diana = 10: 1). Cada punto representa el valor medio de los triplicados. La desviación estándar se indica por barras de error. FIG. 37A: citotoxicidad de células diana HeLa. Comparación de dos formatos diferentes de TCB activados por proteasa, conteniendo ambos un scFv frente a CD3 antiidiotípico enlazado con un conector de matriptasa MK062. FIG. 37B: citotoxicidad de células diana Skov-3. Comparación de dos formatos diferentes de TCB activados por proteasa, conteniendo ambos un scFv frente a CD3 antiidiotípico enlazado con un conector de matriptasa MK062. FIG. 37C: citotoxicidad de células diana HeLa. Comparación de TCB activado por proteasa clásico que contiene un scFv frente a CD3 antiidiotípico y conectores de G^scon diferentes sitios de proteasa. TCB activado por proteasa que contiene el conector de MMP9-matriptasa MK062 (8364, cuadrados grises), TCB frente a FolR1 (triángulos gris claro que apuntan hacia abajo), TCB activado por proteasa que contiene solo matriptasa MK062 (rombo gris claro)/sitio de catepsina (círculos grises) o conector no escindible (triángulos negros que apuntan hacia abajo). FIG. 37D: citotoxicidad de células diana Skov-3. Comparación de TCB activado por proteasa clásico que contiene un scFv frente a CD3 antiidiotípico y conectores de GS con diferentes sitios de proteasa. TCB activado por proteasa que contiene el conector de MMP9-matriptasa MK062 (8364, cuadrados grises), TCB frente a FolR1 (triángulos gris claro que apuntan hacia abajo), TCB activado por proteasa que contiene solo matriptasa MK062 (rombo gris claro)/sitio de catepsina (círculos grises) o conector no escindible (triángulos negros que apuntan hacia abajo).

Las figuras 38A y B representan la cuantificación de CD69 de células positivas para CD8 después de la coincubación de células corticales epiteliales renales humanas primarias (FIG. 38A) o células epiteliales bronquiales humanas (FIG. 38B) con 200 nM de los diferentes TCB y tres donantes diferentes de PBMC humanos. Los linfocitos T se tiñeron después de 48 h de incubación. (E:T = 10:1, los efectores son PBMC humanos). Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia del marcador de activación de linfocitos T CD69 para linfocitos T CD8+. Cada punto representa el valor medio de los triplicados de tres donantes de PBMC humanos diferentes. La desviación estándar se indica en barras de error. Se usó la prueba de la t para datos independientes para el análisis estadístico.

Las figuras 39A y B representan la citotoxicidad de células tumorales mediada por TCB frente a MSLN y PBMC humanos (efector: diana = 10: 1). La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 % 20 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB. Cada punto representa el valor medio de los triplicados. La desviación estándar se indica por barras de error. FIG.39A: citotoxicidad de células diana NCI H596. TCB frente a MSLN activado por proteasa que contiene un scFv frente a CD3 antiidiotípico enlazado con un conector de MMP9-matriptasa MK062. Se comparan el TCB activado por proteasa (8672, círculos gris claro), el TCB frente a MSLN (triángulos gris oscuro que apuntan hacia abajo) y el TCB activado por proteasa que contiene un conector no escindible (8673, triángulos grises que apuntan hacia arriba). FIG. 39B: citotoxicidad de células diana AsPC-1. TCB frente a MSLN activado por proteasa que contiene un scFv frente a CD3 antiidiotípico enlazado con un conector de MMP9-matriptasa MK062. Se comparan el TCB activado por proteasa (8672, círculos gris claro), el TCB frente a MSLN (triángulos gris oscuro que apuntan hacia abajo) y el TCB activado por proteasa que contiene un conector no escindible (8673, triángulos grises que apuntan hacia arriba).

La figura 40 representa un ensayo de activación para Jurkat-NFAT con muestras de tumor primario y TCB frente a FolR1 activados por proteasa. Las células indicadoras Jurkat NFAT se activan después de la coincubación con TCB frente a FolR1 (6298) y TCB frente a FolR1 activado por proteasa que contiene el sitio de escisión de MMP9-matriptasa (8364). Los TCB frente a FolR1 activados por proteasa (8363, 8408) y los TCB de control (8409, 7235) no inducen la expresión de luciferasa. La línea punteada indica la luminiscencia de referencia para células Jurkat NFAT coincubadas con tumor.

Figuras 41A-C: electroforesis capilar de TCB activados por proteasa después de su incubación en suero humano. Las moléculas se incubaron durante 0 o 14 días en suero humano deficitario en IgG a 37 °C en una estufa de incubación humidificada (un 5 % de CO2). Todas las moléculas se purificaron por cromatografía de afinidad (proteína A) y, a continuación, se analizaron por electroforesis capilar. FIG. 41A: análisis por EC-SDS de suero, TCB frente a FolR1 (6298) en suero el día 0 y día 14. FIG. 41B: análisis por EC-SDS de suero, TCB frente a FolR1 activado por proteasa con conector de MMP9-matriptasa (8364) en suero el día 0 y día 14. FIG. 41C: análisis por EC-SDS de suero, TCB frente a FolR1 activado por proteasa con conector de matriptasa (8408) en suero el día 0 y día 14 y la molécula preescindida en suero.

Las figuras 42A-F representan esquemas de diferentes moléculas biespecíficas para linfocitos T con restos de enmascaramiento. FiG. 42A: ID 8955. TCB frente a Herceptarg, formato clásico, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector de MK062-MMP9 fusionado de forma N terminal a VH. FIG. 42B: ID 8957. TCB frente a Herceptarg, formato clásico, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector no escindible fusionado de forma N terminal a VH. FIG.

42C: ID 8959. TCB frente a Herceptarg, formato clásico. FIG. 42D: ID 8997. TCB, 36F2, frente a FolR1, formato clásico, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector de MK062-MMP9 fusionado de forma N terminal a VH. FIG.

42E: ID 8998. TCB, 36F2, frente a FolRI, formato clásico, scFv de CH2527 anti-ID 4.32.63 - conector no escindible fusionado de forma N terminal a VH. FIG. 42F: ID 8996. TCB, 36F2, frente a FolR1, formato clásico.

La figura 43 representa la toxicidad de células epiteliales bronquiales humanas mediada por PBMC humanos y 100 nM o 10 nM de TCB. La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 % 20 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB. Cada punto representa el valor medio de los triplicados. La desviación estándar se indica por barras de error.

La figura 44 representa la citotoxicidad de células diana negativas para FolR1 (Mkn-45) mediada por 100 nM de TCB frente a FolR1 y PBMC humanos. La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 % 20 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB. Cada punto representa el valor medio de los triplicados. La desviación estándar se indica por barras de error.

Descripción detallada

Definiciones

Los términos se usan en el presente documento como se usan, en general, en la técnica, a menos que se defina de otro modo en lo que sigue.

Como se usa en el presente documento, el término "molécula de unión a antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Los ejemplos de moléculas de unión a antígeno son inmunoglobulinas y derivados, por ejemplo, fragmentos, de las mismas.

El término "biespecífica" quiere decir que la molécula de unión a antígeno se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula de unión a antígeno biespecífica comprende dos sitios de unión a antígeno, siendo cada uno específico para un determinante antigénico diferente. En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente a dos determinantes antigénicos, en particular dos determinantes antigénicos expresados en dos células distintas.

El término "valente" como se usa en el presente documento indica la presencia de un número especificado de sitios de unión a antígeno en una molécula de unión a antígeno. Como tal, el término "unión monovalente a un antígeno" indica la presencia de un (y no más de un) sitio de unión a antígeno específico para el antígeno en la molécula de unión a antígeno.

Un "sitio de unión a antígeno" se refiere al sitio, es decir, uno o más residuos de aminoácido, de una molécula de unión a antígeno que proporciona interacción con el antígeno. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende residuos de aminoácido de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Una molécula de inmunoglobulina natural típicamente tiene dos sitios de unión a antígeno, una molécula Fab típicamente tiene un único sitio de unión a antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "resto de unión a antígeno" se refiere a una molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un modo de realización, un resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que está fijado (por ejemplo, un segundo resto de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. En otro modo de realización, un resto de unión a antígeno puede activar la señalización a través de su antígeno diana, por ejemplo un antígeno del complejo receptor de linfocitos T. Los restos de unión a antígeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos como se define además en el presente documento. Los restos de unión a antígeno particulares incluyen un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno pueden comprender regiones constantes de anticuerpo, como se define además en el presente documento y es conocido en la técnica. Las regiones constantes de la cadena pesada útiles incluyen cualquiera de los cinco isotipos: a, 5, £, ^yo |j. Las regiones constantes de la cadena ligera útiles incluyen cualquiera de los dos isotipos: k y A.

Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo de resto de unión a antígeno-antígeno. Los determinantes antigénicos útiles se pueden encontrar, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células afectadas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC). Las proteínas denominadas antígenos en el presente documento (por ejemplo, FolR1, HER1, HER2, CD3, mesotelina) pueden ser cualquier forma natural de las proteínas de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando se hace referencia a una proteína específica en el presente documento, el término engloba la proteína no procesada "de longitud completa" así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. Las proteínas humanas ejemplares útiles como antígenos incluyen, pero no se limitan a: FolR1, HER1 y CD3, en particular, la subunidad épsilon de CD3 (véanse UniProt n.° P07766 (versión 130), RefSeq del NCBI n.° NP_000724.1, SEQ ID NO: 54 para la secuencia humana; o UniProt n.° Q95LI5 (versión 49), GenBank del NCBI n.° BAB71849.1 para la secuencia de macaco cangrejero [Macaca fascicularis]). En determinados modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención se une a un epítopo de CD3 o un antígeno de célula diana que se conserva entre el CD3 o antígeno diana de diferentes especies. En determinados modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención se une a CD3 y FolR I, pero no se une a FolR2 o FolR3. En determinados modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención se une a CD3 y HERI. En determinados modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención se une a CD3 y mesotelina. En determinados modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención se une a CD3 y HER2. Por "unión específica" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un resto de unión a antígeno para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (RPS) (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (20o2)). En un modo de realización, el grado de unión de un resto de unión a antígeno a una proteína no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del resto de unión a antígeno al antígeno como se mide, por ejemplo, por RPS. En determinados modos de realización, un resto de unión a antígeno que se une al antígeno, o una molécula de unión a antígeno que comprende ese resto de unión a antígeno, tiene una constante de disociación (K^d) de < 1 |^j M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un receptor) y su compañero de unión (por ejemplo, un ligando). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, un resto de unión a antígeno y un antígeno, o un receptor y su ligando). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar, en general, por la constante de disociación (K^d), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (RPS).

"Unión reducida", por ejemplo unión reducida a un receptor Fc, se refiere a una disminución en la afinidad para la interacción respectiva, como se mide, por ejemplo, por RPS. Por claridad, el término incluye también la reducción de la afinidad hasta cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la supresión completa de la interacción. A la inversa, "unión incrementada" se refiere a un incremento en la afinidad de unión para la interacción respectiva.

"Activación de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a una o más respuestas celulares de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionadas de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención pueden inducir la activación de linfocitos T. Los ensayos adecuados para medir la activación de linfocitos T son conocidos en la técnica descrita en el presente documento.

Un "antígeno de célula diana" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de una célula diana, por ejemplo, una célula en un tumor tal como una célula cancerosa o una célula del estroma tumoral.

Como se usa en el presente documento, los términos "primero" y "segundo" con respecto a los restos de unión a antígeno, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando existe más de uno de cada tipo de resto. No se pretende que el uso de estos términos confiera un orden u orientación específicos de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, a menos que se indique explícitamente.

Una "molécula Fab" se refiere a una proteína que consiste en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada (la "cadena pesada de Fab") y el dominio VL y C^lde la cadena ligera (la "cadena ligera de Fab") de una inmunoglobulina.

Por "fusionado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, una molécula Fab y una subunidad del dominio Fc) se enlazan por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.

Como se usa en el presente documento, el término "monocatenario" se refiere a una molécula que comprende monómeros de aminoácidos enlazados linealmente por enlaces peptídicos. En determinados modos de realización, uno de los restos de unión a antígeno es una molécula Fab monocatenaria, es decir, una molécula Fab en la que la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab están conectadas por un conector peptídico para formar una única cadena peptídica. En dicho modo de realización particular, el extremo C de la cadena ligera de Fab se conecta al extremo N de la cadena pesada de Fab en la molécula Fab monocatenaria.

Por una molécula Fab "de entrecruzamiento" (también denominada "Crossfab") se quiere decir una molécula Fab en la que las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera y la región constante de la cadena pesada, y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera. Por claridad, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variables de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende la región constante de la cadena pesada se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab de entrecruzamiento. A la inversa, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones constantes de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende la región variable de la cadena pesada se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab de entrecruzamiento.

Al contrario que esto, por una molécula Fab "convencional" se quiere decir una molécula Fab en su formato natural, es decir, que comprende una cadena pesada compuesta por las regiones variable y constante de la cadena pesada (VH-CH1), y una cadena ligera compuesta por las regiones variable y constante de la cadena ligera (VL-CL).

El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 5 (IgD), £ (IgE), y (IgG) o |j (IgM), algunos de los que se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, yⁱ(IgGi ), Y2 (IgG2), Y³(IgG³), Y⁴(IgG⁴), a l (IgAi ) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa ( ^k ) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, enlazados por medio de la región bisagra de inmunoglobulina. El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv) y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')₂que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a una parte o a la totalidad de un antígeno y es complementaria a ella. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). En particular, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH).

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural, en general, tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden, en general, residuos de aminoácido de los bucles hipervariables y/o de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), siendo las últimas las de mayor variabilidad de secuencia y/o estando implicadas en el reconocimiento de antígeno. Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden, en general, los residuos de aminoácido que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) y por Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos de aminoácido cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y usa en el presente documento. Los residuos de aminoácido apropiados que engloban las CDR, como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla 1 a modo de comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA 1. Definiciones de CDR1

Kabat et al., también definieron un sistema de numeración para las secuencias de la región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos de aminoácido específicas en una región variable de anticuerpo son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Las secuencias polipeptídicas del listado de secuencias no se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, está dentro de la habilidad del experto en la técnica convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de Kabat.

"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

La "clase" de un anticuerpo o inmunoglobulina se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, Y y |J, respectivamente.

El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG podrían variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente por extenderse de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos de aminoácido en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991. Una "subunidad" de un dominio Fc como se usa en el presente documento se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que se pueden autoasociar de forma estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH2 de IgG y uno CH3 de IgG.

Una "modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de una subunidad del dominio Fc que reduce o previene la asociación de un polipéptido que comprende la subunidad del dominio Fc con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la asociación como se usa en el presente documento, en particular, incluye modificaciones separadas realizadas en cada una de las dos subunidades del dominio Fc que se desean asociar (es decir, la primera y la segunda subunidad del dominio Fc), en la que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de las dos subunidades del dominio Fc. Por ejemplo, una modificación que promueve la asociación puede alterar la estructura o carga de una o ambas de las subunidades del dominio Fc para hacer que su asociación sea estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. Por tanto, se produce (hetero)dimerización entre un polipéptido que comprende la primera subunidad del dominio Fc y un polipéptido que comprende la segunda subunidad del dominio Fc, que podría ser no idéntico en el sentido de que otros componentes fusionados con cada una de las subunidades (por ejemplo, restos de unión a antígeno) no son los mismos. En algunos modos de realización, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica en el dominio Fc, específicamente una sustitución aminoacídica. En un modo de realización particular, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc.

El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación, o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques.

El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Se puede realizar cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión reducida a un receptor Fc o asociación incrementada con otro péptido. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Las mutaciones aminoacídicas particulares son sustituciones aminoacídicas. Con el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de una región Fc, son en particular preferentes las sustituciones aminoacídicas no conservadoras, es decir, el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones aminoacídicas incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida a sitio, PCR, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de genomanipulación, tales como modificación química. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación aminoacídica. Por ejemplo, se puede indicar una sustitución de prolina en la posición 329 del dominio Fc a glicina como 329G, G329, G329, P329G o Pro329Gly.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) enlazados linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de cualquiera de estos términos, o de forma intercambiable con ellos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones del polipéptido posteriores a la expresión, incluyendo sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química. Un polipéptido de la invención puede ser de un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan desplegados.

Por un polipéptido "aislado" o una variante o derivado del mismo, se pretende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar de su entorno natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para el propósito de la invención, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4,0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

El término "polinucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se pretende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ^aRⁿ in vivo o in vitro de la presente invención, así como formas de hebras positivas y negativas y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.

Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede delecionar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como cuestión práctica, si cualquier secuencia polinucleotídica particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de la presente invención, se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, ALIGN-2).

El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico determinado en una célula destinataria. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados modos de realización, el casete de expresión de la invención comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.

El término "vector" o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia funcionalmente en una célula diana. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión de la presente invención comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que se codifica por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión de la invención comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado.

Un "receptor Fc activador" es un receptor Fc que tras el acoplamiento por un dominio Fc de un anticuerpo provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula portadora del receptor para que realice funciones efectoras. Los receptores Fc activadores humanos incluyen FcYRIIIa (CD16a), F^cyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de células diana recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células diana son células a las que se unen específicamente anticuerpos o derivados de los mismos que comprenden una región Fc, en general, por medio de la parte proteica que es N terminal a la región Fc. Como se usa en el presente documento, el término "ADCC reducida" se define como una reducción en el número de células diana que se lisan en un tiempo dado, a una concentración de anticuerpo dada en el medio circundante a las células diana, por el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o bien un incremento en la concentración de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, requerido para lograr la lisis de un número dado de células diana en un tiempo dado, por el mecanismo de ADCC. La reducción en la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos de producción, purificación, formulación y almacenamiento estándar (que son conocidos para los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado. Por ejemplo, la reducción en ADCC mediada por un anticuerpo que comprende en su dominio Fc una sustitución aminoacídica que reduce la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo sin esta sustitución aminoacídica en el dominio Fc. Los ensayos adecuados para medir la ADCC son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 2006/082515 o la publicación PCT n.° WO 2012/130831).

Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el transcurso de análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para retardar la progresión de una enfermedad. El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

Un "polipéptido específico de idiotipo" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que reconoce el idiotipo de un resto de unión a antígeno, por ejemplo, un resto de unión a antígeno específico para CD3. El polipéptido específico de idiotipo se puede unir específicamente a la región variable del resto de unión a antígeno y, de este modo, reducir o prevenir la unión específica del resto de unión a antígeno a su antígeno afín. Cuando se asocia con una molécula que comprende el resto de unión a antígeno, el polipéptido específico de idiotipo puede funcionar como un resto de enmascaramiento de la molécula. En el presente documento se divulgan específicamente anticuerpos antiidiotipo o fragmentos de anticuerpo de unión antiidiotipo específicos para el idiotipo de moléculas de unión anti-CD3.

"Proteasa" o "enzima proteolítica" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier enzima proteolítica que escinde el conector en un sitio de reconocimiento y que se expresa por una célula diana. Dichas proteasas se podrían secretar por la célula diana o permanecer asociadas con la célula diana, por ejemplo, en la superficie de célula diana. Los ejemplos de proteasas incluyen, pero no se limitan a, metaloproteinasas, por ejemplo, metaloproteinasa de la matriz 1-28 y una desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28-30 y 33, serina proteasas, por ejemplo, activador del plasminógeno de tipo urocinasa y matriptasa, cisteína proteasa, aspártico proteasas y miembros de la familia de las catepsinas.

"Activable por proteasa" como se usa en el presente documento con respecto a la molécula biespecífica activadora de linfocitos T se refiere a una molécula biespecífica activadora de linfocitos T que tiene capacidad reducida o anulada de activar linfocitos T debido a un resto de enmascaramiento que reduce o anula la capacidad de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T de unirse a CD3. Tras la disociación del resto de enmascaramiento por escisión proteolítica, por ejemplo, por escisión proteolítica de un conector que conecta el resto de enmascaramiento a la molécula biespecífica activadora de linfocitos T, se restablece la unión a CD3 y la molécula biespecífica activadora de linfocitos T, de este modo, se activa.

"Ocultamiento reversible" como se usa en el presente documento se refiere a la unión de un resto de enmascaramiento o polipéptido específico de idiotipo a un resto o molécula de unión a antígeno tal como para prevenir la unión del resto o molécula de unión a antígeno a su antígeno, por ejemplo, CD3. Este ocultamiento es reversible en tanto que el polipéptido específico de idiotipo se puede liberar del resto o molécula de unión a antígeno, por ejemplo, por escisión por proteasa, y liberando, de este modo, el resto o molécula de unión a antígeno para que se una a su antígeno.

Descripción detallada

El primer resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a CD3 comprende un idiotipo. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa está fijado covalentemente al primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento está fijado covalentemente a la región variable de la cadena pesada del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento está fijado covalentemente a la región variable de la cadena ligera del primer resto de unión a antígeno. Este enlace covalente está separado de la unión específica, que es preferentemente no covalente, del resto de enmascaramiento al primer sitio de unión a antígeno de idiotipo. El idiotipo del primer resto de unión a antígeno comprende su región variable. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento se une a residuos de aminoácido que entran en contacto con CD3 cuando el primer resto de unión a antígeno se une a CD3. En un modo de realización preferente, el resto de enmascaramiento no es el antígeno afín o fragmentos del mismo del primer resto de unión a antígeno, es decir, el resto de enmascaramiento no es un CD3 o fragmentos del mismo. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento es un anticuerpo antiidiotípico o fragmento del mismo. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento es un scFv antiidiotípico. En los ejemplos se describen en detalle modos de realización ejemplares de restos de enmascaramiento que son scFv antiidiotípicos y moléculas activadoras de linfocitos T activables por proteasa que comprenden dichos restos de enmascaramiento.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3, y que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID ⁿO: 18, SEQ ID NO: 19;

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización específico, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID No : 16 y al menos una Cd R de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En otro modo de realización específico, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización específico, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 y SEQ ⁱD NO: 153 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 156.

En otro modo de realización específico, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158.

En otro modo de realización específico, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a HER1 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61.

En otro modo de realización específico, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a HER1 y comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 32, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

En otro modo de realización específico, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a HER1 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116.

En un modo de realización específico, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a mesotelina y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 109 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112.

En otro modo de realización específico, el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a mesotelina y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.

En un modo de realización, la presente invención proporciona una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3, que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID n O: 18, SEQ ID NO: 19;

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a FolR1 que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y al menos una Cd R de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55,

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a FolR1 que comprende la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3, que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID ⁿO: 18, SEQ ID NO: 19;

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a FolR1 que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 153 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 156.

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a FolR1 que comprende la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158. En un modo de realización, la presente invención proporciona una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a HER1 que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 y al menos una Cd R de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61.

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a HER1 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variables o bien las constantes de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab se intercambian.

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a mesotelina que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 109 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112.

(ii) un segundo resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a mesotelina que comprende la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones constantes de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab se intercambian, y el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional. En otro modo de realización particular, el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan entre sí, opcionalmente a través de un conector peptídico.

En modos de realización particulares, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende además un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable.

En otro modo de realización particular, no está presente más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a CD3 en la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa (es decir, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa proporciona unión monovalente a CD3).

Formatos de moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa

Los componentes de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa se pueden fusionar entre sí en una variedad de configuraciones. Las configuraciones ejemplares se representan en las figuras 1A-E y 5A-H. Otras configuraciones ejemplares se representan en las figuras 33A-K.

En modos de realización particulares, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable. En algunos modos de realización, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o de la segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en los que el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o de la segunda subunidad del dominio Fc. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí. En otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en los que el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc.

En otros modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización particular de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en los que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o de la segunda subunidad del dominio Fc. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí. Los restos de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc o entre sí directamente o a través de un conector peptídico, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente 2-20 aminoácidos. Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los conectores peptídicos no inmunógenos adecuados incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n. "n" es, en general, un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4. Un conector peptídico adecuado en particular para fusionar las cadenas ligeras de Fab del primer y el segundo resto de unión a antígeno entre sí es (G4S)₂. Un conector peptídico ejemplar adecuado para conectar las cadenas pesadas de Fab del primer y el segundo resto de unión a antígeno es EPKSC(D)-(G4S)₂(SEQ ID NO: 105 y 106). Adicionalmente, los conectores pueden comprender (una porción de) una región bisagra de inmunoglobulina. En particular, cuando un resto de unión a antígeno se fusiona al extremo N de una subunidad del dominio Fc, se puede fusionar por medio de una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, con o sin un conector peptídico adicional.

Una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa con un único resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana es útil, en particular, en casos donde se va a esperar la internalización del antígeno de célula diana tras la unión de un resto de unión a antígeno de alta afinidad.

En dichos casos, la presencia de más de un resto de unión a antígeno específico para el antígeno de célula diana puede potenciar la intemalización del antígeno de célula diana, reduciendo de este modo su disponibilidad.

En muchos otros casos, sin embargo, será ventajoso tener una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprenda dos o más restos de unión a antígeno específicos para un antígeno de célula diana (véanse los ejemplos mostrados en la figura 5A-H), por ejemplo, para optimizar la selección como diana al sitio diana o para permitir la reticulación de antígenos de células diana.

En consecuencia, en determinados modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención comprende además un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente al mismo antígeno de célula diana que el segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización particular, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno son idénticos (es decir, comprenden las mismas secuencias de aminoácidos).

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a FolRI, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19; y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a FolR1, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y al menos una Cd R de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19; y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a FolR1, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 y al menos una C^dR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a FolR1, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a HER1, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19; y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a HER1, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID ⁿO: 58 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID n O: 60 y SEQ ID NO: 61.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19; y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a HER1, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a HER1, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a HER2, en los que el segundo resto de unión a antígeno comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 y SEQ ID NO: 144 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 150, y en los que el tercer resto de unión a antígeno comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 147 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 150.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3 y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19; y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a HER2, en los que el segundo resto de unión a antígeno comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 y SEQ ID NO: 144 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 148, SEQ ID ⁿO: 149 y SEQ ID ⁿO: 150, y en los que el tercer resto de unión a antígeno comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 147 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 150.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a mesotelina, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 y SEQ iD NO: 109 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19; y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a mesotelina, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 109 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a mesotelina, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a HER1, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3, y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19; y los segundo y tercer restos de unión a antígeno se pueden unir específicamente a HER1, en los que los segundo y tercer restos de unión a antígeno comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más específico, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

El segundo y el tercer resto de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un modo de realización particular, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana. En un modo de realización, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno y el dominio Fc forman parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa consiste esencialmente en una molécula de inmunoglobulina que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a CD3 en el que el resto de unión a antígeno es una molécula Fab, en particular, una molécula Fab de entrecruzamiento, fusionada al extremo N de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente por medio de un conector peptídico.

En un modo de realización particular, el primer y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa consiste esencialmente en un primer, un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en los que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en los que el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3, que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 44, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 45, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 46, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 17, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 18 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 19, en el que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variables o bien las constantes, en particular las regiones constantes, de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab se intercambian;

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a FolR1 que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 14, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 15, la CDR3 de la cadena pesada de Se Q ID NO: 16, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ Id NO: 17, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ iD NO: 18 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 19.

(i) un primer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, en el que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variables o bien las constantes, en particular, las regiones constantes, de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab se intercambian;

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a FolR1 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a FolR1 que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 151, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 152, la c Dr 3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 153, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 154, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 155 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 156.

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a FolR1 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ Id NO: 157 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158.

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a HER1, que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 56, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 57, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 58, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ I^dNO: 59, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ⁱD NO: 60 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 61.

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a HER1 que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116.

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a HER2, en los que el segundo resto de unión a antígeno comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142, la Cd R2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 143, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 144, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 148, la CDR2 de la cadena ligera de s Eq ID NO: 149 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 150, y en los que el tercer resto de unión a antígeno comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 145, la C^dR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 146, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 148, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 148, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 149 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 150.

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a HER2, en los que el segundo resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161, y en los que el tercer resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161.

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a mesotelina que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 107, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 108, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 109, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 110, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 111 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 112.

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, siendo cada uno una molécula Fab que se puede unir específicamente a mesotelina que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.

La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de acuerdo con cualquiera de los diez modos de realización anteriores puede comprender además (iii) un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable, en la que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en la que el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc.

En algunas de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un péptido conector. Dependiendo de la configuración del primer y el segundo resto de unión a antígeno, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno se puede fusionar en su extremo C al extremo N de la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno, o la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se puede fusionar en su extremo C al extremo N de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno. La fusión de las cadenas ligeras de Fab del primer y el segundo resto de unión a antígeno reduce además el emparejamiento erróneo de cadenas pesadas y ligeras de Fab no emparejadas, y también reduce el número de plásmidos necesarios para la expresión de algunas de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención.

En determinados modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno (es decir, el primer resto de unión a antígeno comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)), y un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). En algunos modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno (VH(1)-CL(1)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno (VL(2)-CL(2)). En determinados modos de realización, los polipéptidos se enlazan covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En modos de realización alternativos, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno (es decir, el primer resto de unión a antígeno comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)), y un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). En algunos modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno (VL(1)-CH1(1)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno (VL(2)-CL(2)). En determinados modos de realización, los polipéptidos se enlazan covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En algunos modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno (es decir, el primer resto de unión a antígeno comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno, que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). En otros modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno (es decir, el primer resto de unión a antígeno comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno, que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(i)-CL(i)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). Todavía en otros modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno (es decir, el primer resto de unión a antígeno comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). En otros modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno (es decir, el primer resto de unión a antígeno comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(2)-CH1(2)-VH(1))-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)).

En algunos de estos modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende además un polipéptido de cadena ligera de Fab de entrecruzamiento del primer resto de unión a antígeno, en el que la región variable de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno (VH(1)-CL(1)), y el polipéptido de cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno (VL(2)-CL(2)). En otros de estos modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende además un polipéptido de cadena ligera de Fab de entrecruzamiento, en el que la región variable de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno (VL(1)-CH1(1)), y el polipéptido de cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno (VL(2)-CL(2)). Todavía en otros de estos modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con el polipéptido de cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno (VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2)), un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con el polipéptido de cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno (VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2)), un polipéptido en el que el polipéptido de cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno (VL(2)-CL(2)-VL(1)-CH1(1)), o un polipéptido en el que el polipéptido de cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno (VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1)).

La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de acuerdo con estos modos de realización puede comprender además (i) un polipéptido con la subunidad del dominio Fc (CH2-CH3(-CH4)), o (ii) un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de un tercer resto de unión a antígeno comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de un tercer resto de unión a antígeno (VL(3)-CL(3)). En determinados modos de realización, los polipéptidos se enlazan covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

De acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores, los componentes de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa (por ejemplo, resto de unión a antígeno, dominio Fc) se pueden fusionar directamente o a través de diversos conectores, en particular, conectores peptídicos que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente 2-20 aminoácidos, que se describen en el presente documento o son conocidos en la técnica. Los conectores peptídicos no inmunogénicos adecuados incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, en los que "n" es, en general, un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4.

Dominio Fc

El dominio Fc de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada subunidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc se pueden asociar de forma estable entre sí. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención comprende no más de un dominio Fc.

En un modo de realización de acuerdo con la invención, el dominio Fc de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otro modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio en el brazo Fab in vivo de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). En otro modo de realización particular, el dominio Fc es humano.

Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización

Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de acuerdo con la invención comprenden diferentes restos de unión a antígeno, fusionados a una u otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto, las dos subunidades del dominio Fc están típicamente comprendidas en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa en la producción recombinante, por tanto, será ventajoso introducir en el dominio Fc de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados. En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de acuerdo con la invención comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación llamada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.

La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en el documento US 5.731.168; el documento US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una cavidad ("ojal") correspondiente en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).

En consecuencia, en un modo de realización particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando, de este modo, una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede situar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y, en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando, de este modo, una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede situar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad.

La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.

En un modo de realización específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de tirosina en la posición 407 por un residuo de valina (Y407V). En un modo de realización, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de serina (T366S) y se reemplaza el residuo de leucina en la posición 368 por un residuo de alanina (L368A).

Aún en otro modo de realización, en la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 por un residuo de cisteína (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando adicionalmente el dímero (Cárter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno que se puede unir a CD3 se fusiona (opcionalmente por medio del resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno de célula diana) a la primera subunidad del dominio Fc (que comprende la modificación de "botón"). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la fusión del resto de unión a antígeno que se puede unir a CD3 a la subunidad que contiene un botón del dominio Fc minimizará (además) la generación de moléculas de unión a antígeno que comprenden dos el restos de unión a antígeno que se pueden unir a CD3 (impedimento estérico de dos polipéptidos que contienen botón).

En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos de aminoácido en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos de aminoácido cargados, de modo que la formación de un homodímero se vuelva electrostáticamente desfavorable, pero la heterodimerización electrostáticamente favorable.

Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor Fc y/o la función efectora

El dominio Fc confiere a la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida sérica prolongada que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, puede, sin embargo, dar lugar a una selección como diana indeseable de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa a células que expresan receptores Fc en lugar de a las células portadoras de antígeno preferentes. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor de Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas lo que, en combinación con las propiedades activadoras de linfocitos T y la larga semivida de la molécula de unión a antígeno, da como resultado una activación en exceso de receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. La activación de células inmunitarias (portadoras del receptor Fc) distintas de los linfocitos T incluso puede reducir la eficacia de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa debido a la destrucción potencial de los linfocitos T, por ejemplo, por los linfocitos NK.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de acuerdo con la invención presenta afinidad de unión reducida por un receptor Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc (o la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor Fc en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende un dominio Fc de IgG1 natural). En un modo de realización, el dominio Fc (o la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor Fc y/o no induce ninguna función efectora. En un modo de realización particular, el receptor Fc es un receptor F^cy. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc humano. En un modo de realización, el receptor Fc es un receptor Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor Fc es un receptor F^cyhumano activador, más específicamente, FcYRIIIa, F^cyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un modo de realización, la función efectora es una o más seleccionada del grupo de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un modo de realización particular, la función efectora es ADCC. En un modo de realización, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar al receptor Fc neonatal (FcRn) en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular, más de aproximadamente un 80 %, más en particular, más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión de un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende un dominio Fc de IgG1 natural) por FcRn.

En determinados modos de realización, el dominio Fc se genomanipula para que tenga afinidad de unión reducida por un receptor Fc y/o función efectora reducida en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc y/o la función efectora. Típicamente, las mismas una o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende un dominio Fc genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular, menos de un 10 %, más en particular, menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor Fc en comparación con una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización particular, el receptor Fc es un receptor F^cy. En algunos modos de realización, el receptor Fc es un receptor Fc humano. En algunos modos de realización, el receptor Fc es un receptor Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor Fc es un receptor F^cyhumano activador, más específicamente, F^cyRIIIa, F^cyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRlIla humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización, también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un modo de realización, no se reduce la afinidad de unión por el receptor Fc neonatal (FcRn). Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc a dicho receptor, cuando el dominio Fc (o la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención que comprenden dicho dominio Fc, pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados modos de realización, el dominio Fc de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa se genomanipula para que tenga una función efectora reducida en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos reducida, unión a linfocitos NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa que induce apoptosis reducida, reticulación de anticuerpos unidos a diana reducida, maduración de células dendríticas reducida o activación de linfocitos T reducida. En un modo de realización, la función efectora reducida es una o más seleccionadas del grupo de CDC reducida, ADCC reducida, ADCP reducida y secreción de citocinas reducida. En un modo de realización particular, la función efectora reducida es ADCC reducida. En un modo de realización, la ADCC reducida es de menos de un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende un dominio Fc no genomanipulado).

En un modo de realización, la mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc a un receptor Fc y/o la función efectora es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de E233, L234, L235, N297, P331 y P329. En un modo de realización más específico, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de L234, L235 y P329. En algunos modos de realización, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgGi, en particular, un dominio Fc de IgGi humana. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y una sustitución aminoacídica adicional en una posición seleccionada de E233, L234, L235, N297 y P331. En un modo de realización más específico, la otra sustitución aminoacídica es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235. En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA"). En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular, un dominio Fc de IgG1 humana. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas suprime casi completamente la unión al receptor Fcy (así como al complemento) de un dominio Fc de IgG1 humana, como se describe en la publicación PCT n.° WO 2012/130831. El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades, tales como unión al receptor Fc o funciones efectoras.

Los anticuerpos IgG4 presentan afinidad de unión reducida por receptores Fc y funciones efectoras reducidas en comparación con anticuerpos IgG1. De ahí que algunos modos de realización el dominio Fc de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención sea un dominio Fc de IgG4, en particular, un dominio Fc de IgG4 humana. En un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en la posición S228, específicamente la sustitución aminoacídica S228P. Para reducir además su afinidad de unión por un receptor Fc y/o su función efectora, en un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición L235, específicamente la sustitución aminoacídica L235E. En otro modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329, específicamente la sustitución aminoacídica P329G. En un modo de realización particular, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y P329G. Dichos mutantes del dominio Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor F^cyse describen en la publicación PCT n.° WO 2012/130831.

En un modo de realización particular, el dominio Fc que presenta afinidad de unión reducida por un receptor Fc y/o función efectora reducida en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural es un dominio Fc de IgG1 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y, opcionalmente, P329G, o un dominio Fc de IgG4 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y, opcionalmente, P329G.

En determinados modos de realización se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc comprende una mutación aminoacídica en la posición N297, en particular, una sustitución aminoacídica que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D).

Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la publicación PCT n.° WO 2012/130831, los dominios Fc con unión al receptor Fc y/o función efectora reducidas también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 del dominio Fc (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios de nucleótidos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.

La unión a receptores Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (RPS) usando instrumentación estándar, tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores Fc, tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un ensayo de unión de este tipo adecuado se describe en el presente documento. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de los dominios Fc o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un dominio Fc para los receptores Fc usando líneas de células conocidas porque expresan receptores Fc particulares, tales como los linfocitos NK humanos que expresan el receptor FcYllla.

La función efectora de un dominio Fc, o una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

En algunos modos de realización, se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que el dominio Fc se genomanipula para que tenga una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye una CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa se puede unir a C1q y de ahí que tenga actividad CDC. Véanse, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Restos de unión a antígeno

La molécula de unión a antígeno de la invención es biespecífica, es decir, comprende al menos dos restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a dos determinantes antigénicos distintos. De acuerdo con la invención, los restos de unión a antígeno son moléculas Fab (es decir, dominios de unión a antígeno compuestos de una cadena pesada y una ligera, comprendiendo cada una una región variable y una constante). En un modo de realización, dichas moléculas Fab son humanas. En otro modo de realización, dichas moléculas Fab son humanizadas. Aún en otro modo de realización, dichas moléculas Fab comprenden regiones constantes de la cadena pesada y ligera humanas.

Al menos uno de los restos de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento. Dicha modificación previene el emparejamiento erróneo de cadenas pesadas y ligeras de diferentes moléculas Fab, mejorando, de este modo, el rendimiento y la pureza de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención en la producción recombinante. En una molécula Fab de entrecruzamiento particular útil para la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, las regiones constantes de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab se intercambian. En otra molécula Fab de entrecruzamiento útil para la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, las regiones variables de la cadena ligera de Fab y de la cadena pesada de Fab se intercambian.

En un modo de realización particular de acuerdo con la invención, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa se puede unir simultáneamente a un antígeno de célula diana, en particular, un antígeno de célula tumoral, y CD3. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa puede reticular un linfocito T y una célula diana por la unión simultánea a un antígeno de célula diana y ^cD3. En un modo de realización incluso más particular, dicha unión simultánea da como resultado la lisis de la célula diana, en particular una célula tumoral. En un modo de realización, dicha unión simultánea da como resultado la activación del linfocito T. En otros modos de realización, dicha unión simultánea da como resultado una respuesta celular de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionada del grupo de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. En un modo de realización, la unión de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa a CD3 sin la unión simultánea al antígeno de célula diana no da como resultado la activación de linfocitos T.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa puede redirigir la actividad citotóxica de un linfocito T a una célula diana. En un modo de realización particular, dicho redireccionamiento es independiente de la presentación de antígenos peptídicos mediada por MHC por la célula diana y/o la especificidad del linfocito T.

En particular, un linfocito T de acuerdo con cualquiera de los modos de realización de la invención es un linfocito T citotóxico. En algunos modos de realización, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o uno CD8+, en particular un linfocito T CD8+.

Resto de unión a CD3

La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención comprende al menos un resto de unión a antígeno que se puede unir a CD3 (también denominado en el presente documento "resto de unión a antígeno CD3" o "primer resto de unión a antígeno"). En un modo de realización particular, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a CD3. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa proporciona una unión monovalente a CD3. La unión a antígeno CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento, es decir, una molécula Fab en la que las regiones variables o bien las constantes de las cadenas pesadas y ligeras de Fab se intercambian. En modos de realización donde existe más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana comprendido en la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, el resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a CD3 es preferentemente una molécula Fab de entrecruzamiento y los restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana son moléculas Fab convencionales.

En un modo de realización particular, CD3 es CD3 humano o CD3 de macaco cangrejero, lo más en particular, CD3 humano. En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno CD3 es reactivo de forma de cruzada para (es decir, se une específicamente a) CD3 humano y de macaco cangrejero. En algunos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a la subunidad épsilon de CD3.

El resto de unión a antígeno CD3 comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID n O: 18, SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno CD3 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 11, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 12, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 13, la CDR1 de la cadena ligera de S^eQ ID NO: 17, la CDR2 de la cadena ligera de S^eQ ID NO: 18 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno CD3 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 44, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 45, la CDR3 de la cadena pesada de ^sE^qID NO: 46, la CDR1 de la cadena ligera de SeQ ID NO: 17, la CDR2 de la cadena ligera de Se Q ID NO: 18 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno CD3 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno CD3 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno CD3 comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 55.

Resto de unión a antígeno de célula diana

La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención comprende al menos un resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno de célula diana (también denominado en el presente documento como "resto de unión a antígeno de célula diana" o "segundo" o "tercer" resto de unión a antígeno). En determinados modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende dos restos de unión a antígeno que se pueden unir a un antígeno de célula diana. En un modo de realización particular de este tipo, cada uno de estos restos de unión a antígeno se une específicamente al mismo determinante antigénico. En un modo de realización incluso más particular, todos estos restos de unión a antígeno son idénticos. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una molécula de inmunoglobulina que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende no más de dos restos de unión a antígeno que se pueden unir a un antígeno de célula diana.

En un modo de realización preferente, el resto de unión a antígeno de célula diana es una molécula Fab, en particular, una molécula Fab convencional que se une a un determinante antigénico específico y puede dirigir la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral que porta el determinante antigénico.

En determinados modos de realización, el resto de unión a antígeno de célula diana se une específicamente a un antígeno de superficie celular. En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno de célula diana se une específicamente a un receptor de folato 1 (FolR1) en la superficie de una célula diana. En otro modo de realización específico de este tipo, el resto de unión a antígeno de célula diana se une específicamente a un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), específicamente, un EGFR humano, por ejemplo, HER1. En otro modo de realización específico de este tipo, el resto de unión a antígeno de célula diana se une específicamente a HER2. En otro modo de realización específico de este tipo, el resto de unión a antígeno de célula diana se une específicamente a mesotelina, específicamente, a mesotelina humana.

En determinados modos de realización, el resto de unión a antígeno de célula diana se dirige a un antígeno asociado con una afección patológica, tal como un antígeno presentado en una célula tumoral o una célula infectada por virus. Los antígenos adecuados son antígenos de superficie celular, por ejemplo, pero sin limitarse a, receptores de superficie celular. En modos de realización particulares, el antígeno es un antígeno humano. En un modo de realización específico, el antígeno de célula diana se selecciona del receptor de folato 1 (FolR1) y del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), específicamente, un EGFR humano, por ejemplo, h ER1. En otro modo de realización específico, el antígeno de célula diana es HER2. En otro modo de realización específico, el antígeno de célula diana es mesotelina.

En algunos modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 56, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 57, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 58, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 59, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ I^dNO: 60 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 61.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende las secuencias de CDR de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo anti-HER1 divulgado en la publicación de solicitud PCT número WO2006/082515.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende al menos una de una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 32, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 33, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID No : 34. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 32, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 33 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID No : 34.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende además un scFv frente a ^cD3 antiidiotípico que comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21, la CDR3 de la cadena pesada de s Eq ID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende además un scFv frente a CD3 antiidiotípico que comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende además un scFv frente a c D3 antiidiotípico que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 41 o 42. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 41 o 42.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende además un scFv frente a HER1 antiidiotípico que comprende al menos una de la ^cDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 49, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 50, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 51, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 52 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 53. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 49, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 50, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 51, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 52 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 53.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende además un conector que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 35.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende además un conector que tiene un sitio de reconocimiento de proteasa que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 o 106. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 o 106. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 36. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 97. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER1 comprende además un conector que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 96. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 96. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 86.

En algunos modos de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER2. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 y SEQ iD NO: 144 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 148, SEQ iD NO: 149 y SEQ ID NO: 150. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146 y SEQ ID No : 147 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 150.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 143, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 144, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 148, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 149 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 150. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 145, la CDR2 de la cadena pesada de Se Q ID NO: 146, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 147, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 148, la CDR2 de la cadena ligera de s Eq ID NO: 149 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 150.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende además un scFv frente a CD3 antiidiotípico que comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21, la CDR3 de la cadena pesada de ^sE^qID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende además un scFv frente a ^cD3 antiidiotípico que comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende además un scFv frente a ^cD3 antiidiotípico que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 41 o 42. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 41 o 42.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende además un scFv frente a h ER2 antiidiotípico que comprende al menos una de la c DR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 49, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 50, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 51, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 52 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 53. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 49, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 50, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 51, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 52 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 53.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende además un conector que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 35.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende además un conector que tiene un sitio de reconocimiento de proteasa que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 o 106. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 o 106. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 36. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 97. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para HER2 comprende además un conector que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 96. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 96. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 86.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 132, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 136, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 81 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 133.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 132, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 136, la secuencia polipeptídica de Se Q ID NO: 81 y la secuencia polipeptídica de Se Q iD NO: 133.

En modos de realización particulares, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para FolR1. En un modo de realización, el FolR1 es un FolR1 humano. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 humano y no se une a FolR2 humano o FolR3 humano. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID ⁿO: 15 y SEQ ID NO: 16 y al menos una C^dR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 14, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 15, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 16, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 17, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ Id NO: 18 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 19.

En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 47 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 55, o variantes de las mismas que retienen la funcionalidad.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 y SEQ iD NO: 153 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 156.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 151, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 152, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 153, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 154, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 155 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 156.

En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 157 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 158, o variantes de las mismas que retienen la funcionalidad.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 y la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 2, y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 2 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende además un scFv frente a ^cD3 antiidiotípico que comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21, la CDR3 de la cadena pesada de s Eq ID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende además un scFv frente a ^cD3 antiidiotípico que comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende además un scFv frente a ^cD3 antiidiotípico que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 41 o 42. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 41 o 42.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para FolR1 comprende además un conector que tiene un sitio de reconocimiento de proteasa que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 o 106. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 o 106. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 36. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 97. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para ForR1 comprende además un conector que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 96. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 96. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 86.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 3 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 72.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 3 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 85.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 3, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 73 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID N^o: 74.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3 y la secuencia polipeptídica de Se Q ID NO: 72.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 85.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 73 y la secuencia polipeptídica de SEQ iD NO: 74.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 137, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 139, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 81 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 138.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 137, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 139, la secuencia polipeptídica de Se Q ID NO: 81 y la secuencia polipeptídica de SEQ iD NO: 138.

En modos de realización particulares, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina. En un modo de realización, la mesotelina es mesotelina humana. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina humana. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 y SEQ ID ⁿO: 109 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 107, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 108, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 109, la CDR1 de la cadena ligera de Se Q ID NO: 110, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 111 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 112.

En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 113 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 114, o variantes de las mismas que retienen la funcionalidad.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina comprende la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina comprende además un scFv frente a CD3 antiidiotípico que comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de Se Q ID NO: 21, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina comprende además un scFv frente a CD3 antiidiotípico que comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de S^eQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de S^eQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina comprende además un scFv frente a CD3 antiidiotípico que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o l0o % idéntica a SEQ ⁱD NO: 41 o 42. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 41 o 42.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina comprende además un conector que tiene un sitio de reconocimiento de proteasa que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 o 106. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 o 106. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 36. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 97. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para mesotelina comprende además un conector que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 96. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95 o 96. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 86.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 77, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 78, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 81 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 82.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 76, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 77, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 78 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 79.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 77, la secuencia polipeptídica de SEQ iD NO: 78, la secuencia polipeptídica de Se Q ID NO: 81 y la secuencia polipeptídica de SEQ iD NO: 82.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 76, la secuencia polipeptídica de SEQ iD NO: 77, la secuencia polipeptídica de S^eQ ID NO: 78 y la secuencia polipeptídica de SEQ iD NO: 79.

En un modo de realización, se proporciona una molécula biespecífica activadora de linfocitos T que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 76, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 77, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 78 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 81.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 77, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 78, una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 81 y una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 84.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 76, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 77, la secuencia polipeptídica de SEQ ID n O: 78 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 81.

En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 77, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 78, la secuencia polipeptídica de SEQ ID n O: 81 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 84.

Resto de enmascaramiento

La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención comprende al menos un resto de enmascaramiento. Otros han tratado de enmascarar la unión de un anticuerpo cubriendo el resto de unión con un fragmento del antígeno reconocido por el resto de unión (por ejemplo, el documento WO2013128194). Este enfoque tiene varias limitaciones. Por ejemplo, usar el antígeno permite menos flexibilidad en la reducción de la afinidad del resto de unión. Esto es así porque la afinidad tiene que ser lo suficientemente alta para enmascararse de forma fiable por el enmascaramiento de antígeno. Además, el antígeno disociado potencialmente se podría unir a e interactuar con su(s) receptor(es) afín/afines in vivo y provocar señales indeseables a la célula que expresa dicho receptor. Por el contrario, el enfoque descrito en el presente documento usa un anticuerpo antiidiotipo o un fragmento del mismo como enmascaramiento. Dos consideraciones contrapuestas para diseñar un resto de enmascaramiento eficaz son 1. la eficacia del enmascaramiento y 2. la reversibilidad del enmascaramiento. Si la afinidad es demasiado baja, el enmascaramiento sería ineficaz. Sin embargo, si la afinidad es demasiado alta, el proceso de enmascaramiento podría no ser fácilmente reversible. No era predecible si un enmascaramiento antiidiotipo de alta afinidad o un enmascaramiento antiidiotipo de baja afinidad funcionarían mejor. Como se describe en el presente documento, los restos de enmascaramiento de mayor afinidad se comportaron mejor, en general, en el enmascaramiento del sitio de unión a antígeno y, al mismo tiempo, se pudieron retirar eficazmente para la activación de la molécula. En un modo de realización, el enmascaramiento antiidiotipo tiene una KD de 1 8 nM. En un modo de realización, el enmascaramiento antiidiotipo tiene una KD de 2 nM a 37 °C. En un modo de realización específico, el resto de enmascaramiento reconoce el idiotipo del primer resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un CD3, por ejemplo, un CD3 humano. En un modo de realización específico, el resto de enmascaramiento reconoce el idiotipo del segundo resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno de célula diana.

En un modo de realización, el resto de enmascaramiento enmascara un resto de unión a CD3 y comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21, la C^dR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 22, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ I^dNO: 23, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento enmascara un resto de unión a CD3 y comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 41. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento enmascara un resto de unión a CD3 y comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 41.

En un modo de realización preferente, el resto de enmascaramiento enmascara un resto de unión a CD3 y comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31. En un modo de realización, el resto de enmascaramiento enmascara un resto de unión a CD3 y comprende una secuencia polipeptídica que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 42. En un modo de realización preferente, el resto de enmascaramiento enmascara un resto de unión a CD3 y comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 42.

En un modo de realización, el resto de enmascaramiento enmascara un resto de unión a HER1 y comprende al menos una de la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 49, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 50, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 51, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 52 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 53. En un modo de realización, el scFv antiidiotípico comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 49, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 50, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 51, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ⁱD NO: 52 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 53.

En un aspecto solo para referencia, la divulgación se refiere a un polipéptido específico de idiotipo para ocultar de forma reversible la unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno. En un modo de realización, la invención se refiere a un polipéptido específico de idiotipo para ocultar de forma reversible un sitio de unión a antígeno anti-CD3 de una molécula, en el que el polipéptido específico de idiotipo es un scFv antiidiotipo, en el que el polipéptido específico de idiotipo está fijado covalentemente a la molécula a través de un conector peptídico. En un modo de realización, el conector es un conector escindible por proteasa. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 96. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7. En un modo de realización, el conector comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 86. En un modo de realización, el conector peptídico comprende al menos un sitio de reconocimiento de proteasa. En un modo de realización, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 o 106. En un modo de realización preferente, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia de reconocimiento de proteasa RQARVVNG (SEQ ID NO: 36). En otro modo de realización, el conector comprende más de un sitio de reconocimiento de proteasa. En un modo de realización preferente, el sitio de reconocimiento de proteasa comprende la secuencia de reconocimiento de proteasa Vh Mp LGFLGPRQARVVNG (SEQ ID NO: 97). En un modo de realización, la proteasa se selecciona del grupo que consiste en metaloproteinasa, por ejemplo, metaloproteinasa de la matriz (MMP) 1-28 y una desintegrina y metaloproteinasa (AD^aM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28 30 y 33, serina proteasa, por ejemplo, activador del plasminógeno de tipo urocinasa y matriptasa, cisteína proteasa, aspártico proteasa y catepsina proteasa. En un modo de realización específico, la proteasa es MMP9 o MMP2. En otro modo de realización específico, la proteasa es matriptasa.

En un modo de realización, la molécula que comprende el sitio de unión a antígeno anti-CD3 es una molécula biespecífica activadora de linfocitos T. En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende al menos una de una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR H) 1 de DYSIH (SEQ ID NO: 20); secuencia de aminoácidos de CDR h 2 de WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO: 21); y una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de PYDYDVLDY (SEQ ID NO: 22). En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende al menos una de una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de RASKSVSTSNYSYIH (SEQ ID NO: 23); una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de YVSYLES (SEQ ID NO: 24); y una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHSREFPWT (SEQ ID NO: 25). En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende: una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR H) 1 de DYSIH (SEQ ID NO: 20); una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO: 21); una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de PYDYDVLDY (SEQ ID NO: 22); y una región variable de la cadena ligera que comprende: una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de RASKSVSTSNYSYIH (SEQ ID NO: 23); una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de YVSYLES (SEQ ID NO: 24); y una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHSREFPWT (SEQ ID NO: 25). En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende al menos una de: una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR H) 1 de SYGVS (SEQ ID NO: 26); una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de IIWGDGSTNYh Sa LIS (Se Q ID NO: 27); y una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO: 28). En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende al menos una de: una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 29); una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de AATFLAD (SEQ ID NO: 30); y una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHYYSTPYT (SEQ ID NO: 31). En un modo de realización particular, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende: una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR H) 1 de SYGVS (SEQ ID NO: 26); una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO: 27); una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO: 28); y una región variable de la cadena ligera que comprende: una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 29); una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de AATFLAD (SEQ ID NO: 30); y una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHYYSTPYT (SEQ ID NO: 31). En un modo de realización, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende al menos una de: una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR H) 1 de SEQ ID NO: 48; una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de SEQ ID NO: 49; y una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de SEQ ID NO: 50. En un modo de realización, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende al menos una de: una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDR L) 1 de SEQ ID NO: 51; una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de SEQ ID NO: 52; y una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de SEQ ID NO: 53. En un modo de realización, el polipéptido específico de idiotipo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDR H) 1 de SEQ ID NO: 48; una secuencia de aminoácidos de CDR h 2 de SEQ ID NO: 49; y una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de SEQ ID NO: 50, y una región variable de la cadena ligera que comprende una una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDR L) 1 de SEQ ID NO: 51; una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de SEQ ID NO: 52; y una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de SEQ ID NO: 53.

Polinucleótidos

La invención proporciona además polinucleótidos aislados que codifican una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa como se describe en el presente documento.

Los polinucleótidos de la invención incluyen aquellos que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a las secuencias expuestas en SEQ ID NO 62-71 o SEQ ID NO. Los polinucleótidos de la invención incluyen además aquellos que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a las secuencias expuestas en SEQ ID NO 117-131. Los polinucleótidos de la invención incluyen además aquellos que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a las secuencias expuestas en SEQ ID NO 162-170.

Los polinucleótidos que codifican moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención se pueden expresar como un polinucleótido único que codifica toda la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa o como polinucleótidos múltiples (por ejemplo, dos o más) que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar a través de, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa funcional. Por ejemplo, la porción de cadena ligera de un resto de unión a antígeno se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende la porción de cadena pesada del resto de unión a antígeno, una subunidad del dominio Fc y opcionalmente (parte de) otro resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresen, los polipéptidos de cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de cadena ligera para formar el resto de unión a antígeno. En otro ejemplo, la porción de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende una de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) uno o más restos de unión a antígeno se podría codificar por un polinucleótido separado de la porción de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende la otra de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) un resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresan, las subunidades del dominio Fc se asociarán para formar el dominio Fc.

En algunos modos de realización, el polinucleótido aislado codifica toda la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento.

En otro modo de realización, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de la región variable. En otro modo de realización, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica como se muestra en SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47 o 55. En otro modo de realización, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica como se muestra en SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47, 55, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85. En otro modo de realización, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica como se muestra en SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47, 55, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 o 141. En otro modo de realización, la invención se dirige además a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 o 71. En otro modo de realización, la invención se dirige además a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 o 131. En otro modo de realización, la invención se dirige además a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 o 170. En otro modo de realización, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ I^dNO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 o 71. En otro modo de realización, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en s Eq ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 o 131. En otro modo de realización, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 o 170. En otro modo de realización, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de la región variable que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 % %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 43, 47 o 55. La invención engloba un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia de la región variable de SEQ ID NO 43, 47 o 55 con sustituciones aminoacídicas conservadoras.

En otro modo de realización, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de la región variable que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 % %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 43, 47, 55, 113, 114, 115 o 116. La invención engloba un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia de la región variable de SEQ ID NO 43, 47, 55, 113, 114, 115 o 116 con sustituciones aminoacídicas conservadoras.

En otro modo de realización, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de la región variable que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 % %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 43, 47, 55, 113, 114, 115, 116, 157, 158, 159, 160 o 161. La invención engloba un polinucleótido aislado que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia de la región variable de SEQ ID NO 43, 47, 55, 113, 114, 115, 116, 157, 158, 159, 160 o 161 con sustituciones aminoacídicas conservadoras.

En determinados modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario.

La divulgación proporciona solo para referencia polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido específico de idiotipo como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, dicho fragmento es un anticuerpo específico antiidiotipo, es decir, que se une a un idiotipo, o fragmento del mismo. En un aspecto, el polipéptido específico de idiotipo es un scFv antiidiotípico.

La divulgación proporciona solo para referencia un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido específico de idiotipo en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia polipeptídica de una o más de SEQ ID NO 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 48, 49, 50, 51, 52 y 53. La divulgación proporciona solo para referencia un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido específico de idiotipo en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia polipeptídica de una o más de SEQ ID NO 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 48, 49, 50, 51, 52 y 53 con sustituciones aminoacídicas conservadoras.

Los polinucleótidos que codifican polipéptidos específicos de idiotipo útiles en la invención se pueden expresar como un polinucleótido único que codifica todo el polipéptido específico de idiotipo o como polinucleótidos múltiples (por ejemplo, dos o más) que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar, por ejemplo, a través de enlaces disulfuro u otros medios para formar un polipéptido específico de idiotipo funcional, por ejemplo, un resto de enmascaramiento. Por ejemplo, en un modo de realización, el polipéptido específico de idiotipo es un scFv antiidiotípico (fragmento variable monocatenario) en el que la porción variable de la cadena ligera del scFv antiidiotípico se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción del scFv antiidiotípico que comprende la porción variable de la cadena pesada del scFv antiidiotípico. Cuando se coexpresan, los polipéptidos de cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de cadena ligera para formar el scFv antiidiotípico. En algunos modos de realización, el polinucleótido aislado codifica el polipéptido específico de idiotipo que es útil en la invención como se describe en el presente documento.

Procedimientos recombinantes

Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis peptídica en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican la molécula (fragmento) biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aíslan e insertan en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un modo de realización, se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de una molécula (fragmento) biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa junto con señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que se clona el polinucleótido que codifica la molécula (fragmento) biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa (es decir, la región codificante) en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, finalizadores de la transcripción, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no es parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una construcción de polinucleótido única, por ejemplo, en un vector único, o en construcciones de polinucleótido separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector de la presente invención puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan pos- o cotraduccionalmente en las proteínas finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o bien no fusionadas a un polinucleótido que codifica la molécula (fragmento) biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención, o variante o derivado de la misma. Las regiones codificantes heterólogas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo. Una asociación funcional es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de modo que coloca la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptidos y un promotor asociado a la misma) se "asocian funcionalmente" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere en la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere en la capacidad de transcripción del molde de ADN. Por tanto, una región promotora se asociaría funcionalmente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor puede efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de finalización de la transcripción, se pueden asociar funcionalmente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula. Los promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se divulgan en el presente documento. Una variedad de regiones de control de la transcripción son conocidas para los expertos en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero sin limitarse a, segmentos de promotor y potenciador de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, conjuntamente con intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y a-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles por tetraciclinas). De forma similar, una variedad de elementos de control de la traducción son conocidos para los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y finalización de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular, un sitio de entrada al ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros rasgos característicos tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (RTL) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (RTI) víricas adenoasociadas (VAA).

Se pueden asociar regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, si se desea la secreción de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, el ADN que codifica una secuencia señal se puede colocar en dirección 5' del ácido nucleico que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención o un fragmento de la misma. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrados, en general, tienen un péptido señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinados modos de realización se usa el péptido señal natural, por ejemplo, un péptido señal de la cadena pesada o la cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está funcionalmente asociado con él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir por la secuencia líder del activador tisular del plasminógeno (TPA) humano o p-glucuronidasa de ratón.

El ADN que codifica una secuencia de proteína corta que se podría usar para facilitar la purificación posterior (por ejemplo, una marca de histidina) o ayudar a marcar la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa se puede incluir dentro o en los extremos del polinucleótido que codifica la molécula (fragmento) biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa.

En otro modo de realización, se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. En determinados modos de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier clase de sistema celular que se puede genomanipular para que genere las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención o fragmentos de las mismas. Las células huésped adecuadas para replicar y para soportar la expresión de moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o transducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contengan vectores para su siembra en fermentadores a gran escala para obtener suficientes cantidades de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular cuando no es necesaria la glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar junto con células de insecto, en particular, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adapten a su cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), linfocitos T R1 (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO dhfr (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo unas pocas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Las tecnologías estándar son conocidas en la técnica por expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o bien la ligera de un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo se pueden genomanipular para expresar también la otra de las cadenas de anticuerpo de modo que el producto expresado es un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada como una ligera.

En un modo de realización, se proporciona un procedimiento de producción de una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de acuerdo con la invención, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, y recuperar la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Los componentes de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa están genéticamente fusionados entre sí. Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa se pueden diseñar de modo que sus componentes se fusionen directamente entre sí o indirectamente a través de una secuencia de conector. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. Los ejemplos de secuencias de conector entre diferentes componentes de moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa se encuentran en las secuencias proporcionadas en el presente documento. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión si se desea, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.

En determinados modos de realización, los uno o más restos de unión a antígeno de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa comprenden al menos una región variable de anticuerpo que se puede unir a un determinante antigénico. Las regiones variables pueden formar parte de y derivarse de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis peptídica en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 concedida a McCafferty).

Se puede usar cualquier especie animal de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o región variable en las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, dominios de unión a antígeno o regiones variables no limitantes útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, primate o humano. Si la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa está destinada a uso humano, se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo sean de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o completamente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 concedida a Winter). La humanización se puede lograr por diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo, anticuerpo receptor) con o sin retención de residuos estructurales críticos (por ejemplo, los que son importantes para retener buenas funciones de afinidad de unión a antígeno o de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de la especificidad (SDR o a-CDR; los residuos críticos para la interacción anticuerpo-antígeno) no humanas en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana por reemplazo de residuos superficiales. Los anticuerpos humanizados y procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci l3 , 1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332, 323 329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791,6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR). Los anticuerpos humanos y regiones variables humanas se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivarse de anticuerpos monoclonales humanos preparados por el procedimiento de hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). También se pueden preparar anticuerpos humanos y regiones variables humanas administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se haya modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). También se pueden generar anticuerpos humanos y regiones variables humanas aislando secuencias de regiones variables de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos (véanse, por ejemplo, Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Los fagos típicamente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab.

En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno útiles en la presente invención se genomanipulan para que tengan una afinidad de unión potenciada de acuerdo con, por ejemplo, los procedimientos divulgados en la pub. de sol. de pat. de EE. UU. n.° 2004/0132066. La capacidad de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o dominio variable que compita con un anticuerpo de referencia por su unión a un antígeno particular, por ejemplo, un anticuerpo que compita con el anticuerpo V9 por su unión a CD3. En determinados modos de realización, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que está unido por el anticuerpo de referencia. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). En un ensayo de competencia ejemplar se incuba el antígeno inmovilizado (por ejemplo, CD3) en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno (por ejemplo, anticuerpo V9, descrito en el documento US 6.054.297) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo por su unión al antígeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba el antígeno inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa preparadas como se describe en el presente documento se pueden purificar por técnicas conocidas en la técnica, tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad, se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se una la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa. Por ejemplo, para la purificación por cromatografía de afinidad de moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención, se puede usar una matriz con proteína A o proteína G. Se pueden usar cromatografía de afinidad con proteína A o G y cromatografía de exclusión por tamaño secuenciales para aislar una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa esencialmente como se describe en los ejemplos. La pureza de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa se puede determinar por cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos que incluyen electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alta presión y similares. Por ejemplo, se demostró que las proteínas de fusión de cadena pesada expresadas como se describe en los ejemplos estaban intactas y apropiadamente ensambladas como se demostró por SDS-PAGE reductora (véanse, por ejemplo, las FIGS. 8-12). Se separaron tres bandas en aproximadamente Mr 25.000, Mr 50.000 y Mr 75.000, correspondientes a los pesos moleculares predichos de la proteína de fusión de cadena ligera, cadena pesada y cadena pesada/cadena ligera de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa.

Ensayos

Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa proporcionadas en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar en cuanto a sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de afinidad

La afinidad de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa por un receptor Fc o un antígeno diana se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos por resonancia de plasmón superficial (RPS), usando instrumentación estándar, tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores o proteínas diana, tal como se puede obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, la unión de moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa para diferentes receptores o antígenos diana se puede evaluar usando líneas celulares que expresen el receptor o antígeno diana particular, por ejemplo, por citometría de flujo (FACS). Se describe un modo de realización ilustrativo y ejemplar específico para medir la afinidad de unión en lo que sigue y en los ejemplos a continuación.

De acuerdo con un modo de realización, K^dse mide por resonancia de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.

Para analizar la interacción entre la porción Fc y los receptores Fc, se captura el receptor Fc recombinante con marca His por un anticuerpo anti-Penta-His (Qiagen) inmovilizado en chips CM5 y se usan las construcciones biespecíficas como analitos. En resumen, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El anticuerpo anti-Penta-His se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, a 40 |jg/ml antes de su inyección a un caudal de 5 |jl/min para lograr aproximadamente 6500 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del ligando, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Posteriormente, se captura el receptor Fc durante 60 s a 4 o 10 nM. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie por cuadruplicado de la construcción biespecífica (intervalo entre 500 nM y 4000 nM) en HBS-EP (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de 30 jl/m in durante 120 s.

Para determinar la afinidad por el antígeno diana, las construcciones biespecíficas se capturan por un anticuerpo específico anti-Fab humano (GE Healthcare) que se inmoviliza en una superficie de chip sensor CM5 activado como se describe para el anticuerpo anti-Penta-His. La cantidad final de proteína acoplada es de aproximadamente 12000 UR. Se capturan las construcciones biespecíficas durante 90 s a 300 nM. Los antígenos diana se hacen pasar a través de las cubetas de lectura durante 180 s a un intervalo de concentraciones de 250 a 1000 nM con un caudal de 30 jl/min. Se sigue la disociación durante 180 s.

Se corrigen las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Se usó la respuesta en situación de equilibrio para derivar la constante de disociación K^dpor ajuste de curva no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación BIACORE ® T100 versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (K^d) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).

Ensayos de actividad

La actividad biológica de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención se puede medir por diversos ensayos como se describe en los ejemplos. Las actividades biológicas pueden incluir, por ejemplo, la inducción de proliferación de linfocitos T, la inducción de señalización en linfocitos T, la inducción de expresión de marcadores de activación en linfocitos T, la inducción de secreción de citocinas por linfocitos T, la inducción de lisis de células diana, tales como células tumorales, y la inducción de remisión tumoral y/o la mejora de la supervivencia.

Composiciones, formulaciones y vías de administración

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa proporcionadas en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa proporcionadas en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Además se proporciona un procedimiento de producción de una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención en una forma adecuada para su administración in vivo, comprendiendo el procedimiento (a) obtener una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de acuerdo con la invención, y (b) formular la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, con lo que se formula una preparación de molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa para su administración in vivo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa disueltas o dispersas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las frases "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que, en general, no son tóxicas para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir, no producen reacciones adversas, alérgicas u otros efectos indeseables cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa y opcionalmente un ingrediente activo adicional será conocida para los expertos en la técnica a la luz de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para su administración en animales (por ejemplo, seres humanos), se entenderá que las preparaciones deben cumplir normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según se requiera por la Oficina de Normas biológicas de la FDA o las autoridades correspondientes en otros países. Las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizantes de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como será conocido para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.

La composición puede comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se va a administrar en forma sólida, líquida o aerosol, y si es necesario que sea estéril para dichas vías de administración como inyección. Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la presente invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se pueden administrar por vía intravenosa, intradérmica, intrarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intrarticular, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada de baño de células diana directamente, por medio de un catéter, por medio de un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro procedimiento o cualquier combinación de los anteriores como será conocido para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990). La administración parenteral, en particular la inyección intravenosa, se usa más comúnmente para administrar moléculas polipeptídicas tales como las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención.

Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intrarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para su inyección, las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa pueden estar en forma pulverulenta para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los demás ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar de forma adecuada si es necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe mantener al mínimo a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; glúcidos, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En modos de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.

Además de las composiciones descritas previamente, las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa también se pueden formular como una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención se pueden fabricar por medio de procedimientos convencionales de mezcla, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que retienen sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.

Composiciones y procedimientos terapéuticos

Cualquiera de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa proporcionadas en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos. Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención se pueden usar como agentes inmunoterápicos, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres.

Para su uso en procedimientos terapéuticos, las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de una manera consecuente con la buena práctica médica. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos.

En un aspecto, se proporcionan moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención para su uso como un medicamento. En otros aspectos, se proporcionan moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización, se proporcionan moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un modo de realización, la invención proporciona una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite. En determinados modos de realización, la invención proporciona una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otros modos de realización, la invención proporciona una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa como se describe en el presente documento para su uso en la inducción de la lisis de una célula diana, en particular, una célula tumoral. En determinados modos de realización, la invención proporciona una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa para su uso en un procedimiento de inducción de la lisis de una célula diana, en particular, una célula tumoral, en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa para inducir la lisis de una célula diana. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesite. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En un modo de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro modo de realización, el medicamento es para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene dicha enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención. En un modo de realización, se administra una composición a dicho individuo, que comprende la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención en una forma farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano. En un modo de realización, un "individuo" es un ser humano.

En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Los ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en: abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojos, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, aparato genital femenino, piel, partes blandas, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados modos de realización, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello. Un experto en la técnica reconoce fácilmente que en muchos casos la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa puede no proporcionar una cura, sino que solo puede proporcionar un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad de molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz". El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.

En algunos modos de realización, se administra a una célula una cantidad eficaz de una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención. En otros modos de realización, se administra a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención para el tratamiento de una enfermedad.

Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención (cuando se usa sola o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas previas o simultáneas, la anamnesis del paciente y la respuesta a la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa, y la discreción del médico especialista. El médico responsable para su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración por inyección intravenosa rápida e infusión pulsada.

La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa se administra adecuadamente al paciente en una sola vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) de molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, en una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento, en general, se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable de los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención se usará, en general, en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para su uso para para tratar o prevenir una afección, las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención, o composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, especialmente en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentraciones en circulación que incluya la CI50 como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.

También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a los datos en animales.

La cantidad de dosificación y el intervalo se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos de moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.

En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.

Una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa descritas en el presente documento proporcionará, en general, un beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y eficacia terapéutica de una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivo celular o animales de experimentación. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios con animales para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Son preferentes las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa que presentan grandes índices terapéuticos. En un modo de realización, la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de acuerdo con la presente invención presenta un alto índice terapéutico. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios con animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuadas para su uso en seres humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, p. 1).

El médico especialista para pacientes tratados con moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención sabría cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal y respuesta del paciente individual.

Otros agentes y tratamientos

Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en tratamiento. Por ejemplo, una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente el que tiene actividades complementarias que no se ven afectadas de forma adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador, un agente citostático, un inhibidor de la adhesión celular, un agente citotóxico, un activador de la apoptosis celular o un agente que incrementa la sensibilidad de las células por los inductores apoptóticos. En un modo de realización particular, el agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico, por ejemplo, un alterador de los microtúbulos, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasas, un intercalador de a Dn , un agente alquilante, un tratamiento hormonal, un inhibidor de cinasas, un antagonista de receptores, un activador de la apoptosis de células tumorales o un agente antiangiogénico.

Dichos otros agentes están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa usada, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores analizados anteriormente. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa se usa, en general, en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente que sea apropiada.

Dichas politerapias señaladas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma composición o en composiciones separadas) y la administración separada, caso en el que, la administración de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención se puede producir antes de, simultáneamente y/o tras la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. Las moléculas biespecíficas activadoras de linfocitos T activables por proteasa de la invención también se pueden usar en combinación con radioterapia.

Artículos de fabricación

En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Ejemplo 1

Síntesis de moléculas de IgG anti-CD3 monovalentes con scFv antiidiotípico

En el presente documento se describen proteínas de unión a CD3 que están enmascaradas con un scFv frente a CD3 antiidiotípico enlazado de forma N terminal. Estas construcciones incluyen un sitio de reconocimiento de proteasa que se reconoce por una proteasa específica de tumor. En presencia de células tumorales que expresan proteasa, el conector que conecta el resto de enmascaramiento se escindirá y, de este modo, se recuperará la unión a CD3 por la proteína de unión a CD3. Se produjeron varias moléculas de IgG anti-CD3 monovalentes con diversos scFv antiidiotípicos y se representan esquemáticamente en las FIGS. 1A-E con su respectivo número de ID. Se prepararon las siguientes moléculas:

N.° de identificación 7859: IgG frente a CD3 monovalente, (scFv antiidiotípico 4.15.64 - sitio de matriptasa MK062 - CD3 - fusionado N terminal a Fab frente a CD3 - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.15.64 fusionado N terminal y conector escindible por proteasa.

N.° de identificación 7860: IgG frente a CD3 monovalente, (scFv antiidiotípico 4.32.63 - sitio de matriptasa MK062 - CD3 - fusionado N terminal a Fab frente a CD3 - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.32.63 fusionado N terminal y conector escindible por proteasa.

N.° de identificación 7857: IgG frente a CD3 monovalente, (scFv antiidiotípico 4.15.64 - conector no escindible -CD3 - fusionado N terminal a Fab frente a CD3 - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.15.64 fusionado N terminal y conector escindible por proteasa.

N.° de identificación 7858: IgG frente a CD3 monovalente, (scFv antiidiotípico 4.32.63 - conector no escindible -CD3 - fusionado N terminal a Fab frente a CD3 - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.32.63 fusionado N terminal y conector escindible por proteasa.

N.° de identificación 7861: IgG frente a CD3 monovalente, (Fab frente a CD3 - Fc inerte) con scFv anti-CD34.15.64 / 4.32.63 fusionado N terminal y conector de proteasa.

Las secuencias de proteínas de unión antiidiotípicas (ID) se obtuvieron por RACE-PCR (amplificación rápida de extremos de ADNc) a partir de ARN de células de hibridoma. Se obtuvieron células de hibridoma por inmunización de ratones con fragmento Fab de CH2527 (VL_7-46(13)NH_3-23(12)). La síntesis de la secuencia de Fv monocatenario (ScFv) se encargó a Invitrogen, incluyendo los sitios de restricción necesarios para la clonación.

Se compararon seis proteínas de unión a CH2527 antiidiotípicas diferentes en cuanto a sus afinidades (FIG. 2, resultado de Biacore-Analytics (AG M. Schraml) a 25 °C/37 °C (Analyt: MAK<CEA/CD3>rH)) y dos de ellas se clonaron como fusiones N terminales en la cadena pesada de Fab - Fc frente a CD3.

Las secuencias de ADN de Fv monocatenario anti-ID se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena VH frente a CD3 preinsertada en el respectivo vector de expresión de mamífero receptor. Se controla la expresión de proteínas por un promotor de MPSV y una secuencia señal de poli A sintética está presente en el extremo 3' de la CDS. Además, cada vector contiene una secuencia OriP del ^vE^b.

Se produjeron las moléculas cotransfectando células HEK₂93-EBNA que estaban cultivadas en suspensión con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina (PEI). Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1:2 ("ojal de Fc (CH2-CH3)": "cadena ligera común (CLC)": "botón de cadena pesada de vector (scFv-VH-CH1-CH2-CH3)").

Para la transfección, se cultivaron células HEK₂93 EBNA en medio de cultivo ExCell libre de suero que contenía L-glutamina 6 mM y 250 mg/l de G418. Para la producción en matraces rotatorios de 600 ml (volumen de trabajo máx. de 400 ml) se sembraron 800 millones de células HEK₂93 EBNA 24 horas antes de la transfección sin G418. Para la transfección, se centrifugaron 800 millones de células durante 5 min a 210 x g y el sobrenadante se reemplazó por 40 ml de medio CD CHO precalentado que contenía L-glutamina 6 mM. Los vectores de expresión se mezclaron con 40 ml de medio CD c Ho que contenía L-glutamina 6 mM hasta una cantidad total de 400 |jg de ADN. Después de la adición de 1080 j l de solución PEI (2,7 jg/ml), se agitó con vórtex la mezcla durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Después de esto, se mezclaron las células con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz rotatorio de 600 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una estufa de incubación con una atmósfera de un 5 % de CO2. Después de la incubación, se añadieron 320 ml de ExCell L-glutamina 6 mM 5 g/l de Pepsoy VPA 1,0 mM 3 g/l de medio de glucosa y las células se cultivaron durante 24 horas antes de su alimentación con Feed 7 al 7 %. Después de 6-7 días de cultivo, se recogió el sobrenadante para su purificación por centrifugación durante 20 - 30 min a 210 x g (centrifugadora Sigma 8K). La solución se filtró de forma estéril (filtro de 0,22 jm ) y se añadió acida de sodio en una concentración final de 0,01 % p/v. La solución se mantuvo a 4 °C hasta su purificación. La proteína secretada se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando cromatografía de afinidad con proteína A, seguida de una o dos etapas cromatográficas de exclusión por tamaño.

Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna HiTrap Protein A FF (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 25 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %, pH 7,5. La proteína no unida se retiró lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %, pH 7,5, y la proteína diana se eluyó en 20 volúmenes de columna (gradiente de un 0 % - 100 %) con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %, pH 2,5. Se neutralizó la solución de proteína añadiendo 1/10 de Tris 2 M, pH 10,5. La proteína diana se concentró con Amicon®Ultra-15 Ultracel 30K (Merck Millipore Ltd.) hasta un volumen de máximo 4 ml antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0, Tween20 al 0,01 %.

Para el análisis después de la cromatografía de exclusión por tamaño, la pureza y el peso molecular de las moléculas en las fracciones únicas se analizaron por SDS-PAGE en ausencia de un agente reductor y tinción con Coomassie (InstantBlue™, Expedeon). Se usó el sistema en gel NuPAGE® Pre-Cast (Bis-Tris al 4-12 %, Invitrogen, o Tris-acetato al 3-8 %, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La concentración de proteína de las muestras de proteína purificada se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nM dividida por el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos.

Se analizaron la pureza y el peso molecular de las moléculas después de la etapa de purificación final por análisis por EC-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor. Se usó el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper lifescience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El contenido de agregados de las moléculas se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en tampón de migración K₂HPO₄25 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), pH 6,7 a 25 °C. La calidad final de todas las moléculas fue buena, con un contenido de monómero > 92 %.

TABLA 2. Resumen de la producción y purificación de moléculas de IgG frente a CD3 monovalentes activadas por proteasa

Ejemplo 2

Escisión y estabilidad de IgG activadas por proteasa

Electroforesis capilar de moléculas de IgG activadas por proteasa. La comparación de la muestra no tratada y la muestra tratada mostró que el scFv anti-ID se escindió completamente después del tratamiento con rhmatriptasa/ST14 (R&D Systems), lo que se indicó por la variación de tamaño en el análisis por SDS-PAGE (FIG.

3). El análisis de las muestras incubadas durante 48 h a 37 °C confirmó la estabilidad de las moléculas en el tampón de formulación (FIG. 3A-D).

Ejemplo 3

Efecto de enmascaramiento de scFv antiidiotípico para IgG frente a CD3

La eficacia de enmascaramiento de la proteína de unión a CD3 por la fusión N terminal de un scFv frente a CD3 antiidiotípico se demostró por un ensayo indicador para Jurkat-NFAT. Las células indicadoras Jurkat-NFAT (una línea celular indicadora de leucemia linfocítica aguda humana con una expresión de luciferasa regulada por el promotor NFAT, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega, n.° CS176501) expresan luciferasa de luciérnaga activa si el promotor NFAt se activa por la unión de CD3e. La intensidad de la señal de luminiscencia tras la adición de sustrato de luciferasa es proporcional a la intensidad de la activación y señalización de CD3. Las moléculas para CD3 monovalentes completamente no enmascaradas sirvieron de control positivo. El tratamiento se realizó con rh-matriptasa/ST14 (R&D Systems) durante 48 h a 37 °C. En paralelo, se recubrieron 8 ug/ml de anticuerpo anti-Fc humana (BioLegends) en 0,025 ul/pocillo de PBS durante 48 h a 4 °C en una placa (plana) de 96 pocillos de paredes blancas y fondo transparente (Greiner Bio-One). Se retiró la PBS por pipeteo antes de añadir las IgG monovalentes en el intervalo de concentraciones indicado de 200 nM - 2,56 μM. Las placas se incubaron durante aproximadamente 30 min a 4 °C. Posteriormente, se obtuvieron las células indicadoras Jurkat-NFAT y se evaluó la viabilidad usando ViCell. Las células se resuspendieron en medio de Jurkat (RPMI1640, 2 g/l de glucosa, 2 g/l de NaHCO₃, FCS al 10 %, HEPES 25 mM, L-glutamina 2 mM, 1 x NEAA, 1 x piruvato de sodio) sin higromicina y se añadieron 100 |jl por pocillo (25.000 células/pocillo) a las IgG frente a CD3 monovalentes reticuladas. Se incubaron las células durante 3 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Las placas se sacaron de la estufa de incubación durante aproximadamente 10 min para adaptarse a la temperatura ambiente antes de la lectura de luminiscencia. Se añadieron 100 jl/pocillo de solución ONE-Glo (volumen por pocillo 1:1 de ONE-Glo y medio de ensayo) a los pocillos y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se detectó luminiscencia usando el lector WALLAC Victor3 ELISA (PerkinElmer2030), 1 s/pocillo como tiempo de detección.

7857 (enmascaramiento de 4.15.64 con conector no escindible) y 7859 (no tratado) muestran unión a CD3^esignificativamente reducida en comparación con la molécula no enmascarada (7861) y pretratada (7859 tratado) (FIG. 4A). 7760 se incluyó como control para mostrar que el enlace N terminal no bloquea la propia unión a CD3.

7858 (enmascaramiento de 4.32.63 con conector no escindible) y 7860 (no tratado) muestran unión a CD3^esignificativamente reducida en comparación con la molécula no enmascarada (7861) y pretratada (7860 tratado) (FIG. 4B). En consonancia con las afinidades de las proteínas de unión a CD3 antiidiotípicas, el enmascaramiento de 4.32.63 es mucho más eficaz que el de 4.15.64. En términos de valores de CE50 (FIG. 4C), la proteína de unión a CD3 enmascarada 4.32.63 se une 54 veces menos que la proteína de unión a CD3 no enmascarada 7861. Para el enmascaramiento de 4.15.64, la unión es solo 16 veces menos que para el 7861. Dependiendo de la diana tumoral y de la proteína de unión a diana, se puede evaluar el mejor enmascaramiento.

Ejemplo 4

Preparación de moléculas biespecíficas para linfocitos T (TCB) anti-FolR1/anti-CD3 con scFv anti-CD3

Se produjeron varias moléculas biespecíficas para linfocitos T (TCB) con diversos scFv antiidiotípicos y se representan esquemáticamente en las FIGS. 5A-H con su respectivo número de ID. Se prepararon las siguientes moléculas:

ID7344: IgG 2+1, 16D5, frente a FolR1, formato clásico (scFv antiidiotípico 4.15.64 - sitio de matriptasa MK062 -CD3 - fusionado N terminal a VH frente a FolR1 - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.15.64 fusionado N terminal y conector de proteasa (FIG. 5A, SEQ ID NO 1, 2 y 3).

ID7496: IgG 2+1, 16D5, frente a FolR1, formato clásico (scFv antiidiotípico 4.32.63 - sitio de matriptasa MK062 CD3 - fusionado N terminal a VH frente a FolRI - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.32.63 fusionado N terminal y conector de proteasa (FIG. 5C, SEQ ID NO 1, 3 y 4).

ID7676: IgG 2+1, 16D5, frente a FolR1, formato clásico (scFv antiidiotípico 4.15.64 - conector de GS no escindible - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a FolR1 - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.15.64 fusionado N terminal y conector de proteasa (FIG. 5B, SEQ ID NO 1, 3 y 6).

ID7611: IgG 2+1, 16D5, frente a FolR1, formato clásico (scFv antiidiotípico 4.32.63 - conector de GS no escindible - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a FolR1 - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.32.63 fusionado N terminal y conector de proteasa (FIG. 5D, SEQ ID NO 1, 3 y 5).

Las secuencias de proteínas de unión antiidiotípicas (ID) se obtuvieron por RACE-PCR (amplificación rápida de extremos de ADNc) a partir de ARN de células de hibridoma. Se obtuvieron células de hibridoma por inmunización de ratones. La síntesis de la secuencia de Fv monocatenario (ScFv) se encargó a Invitrogen, incluyendo los sitios de restricción necesarios para la clonación. Se compararon seis proteínas de unión a CH2527 antiidiotípicas diferentes en cuanto a sus afinidades (FIG. 2, resultado de Biacore-Analytics (AG M. Schraml) a 25 °C/37 °C (Analyt: MAK<CEA/CD3>rH)) y cuatro de ellas se clonaron como fusiones N terminales en la HC de TCB, 16D5, frente a CD3 - FolR1.

Las secuencias de ADN de Fv monocatenario anti-ID se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con la cadena VH frente a CD3 preinsertada en el respectivo vector de expresión de mamífero receptor. Se controla la expresión de proteínas por un promotor de MPSV y una secuencia señal de poli A sintética está presente en el extremo 3' de la secuencia codificante (CDS). Además, cada vector contiene una secuencia OriP del VEB.

Se produjeron las moléculas cotransfectando células HEK₂93-EBNA que estaban cultivadas en suspensión con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina (PEI). Las células se transfectaron con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:3:2 ("ojal de cadena pesada de vector (VH-CH1-CH2-CH3)": "cadena ligera común (^cL^c)": "botón de cadena pesada de vector (scFv-VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)").

Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una columna HiTrap Protein A FF (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 25 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %, pH 7,5. La proteína no unida se retiró lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %, pH 7,5, y la proteína diana se eluyó en 20 volúmenes de columna (gradiente de un 0 % - 100 %) con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, Tween-20 al 0,01 %, pH 2,5.

Se neutralizó la solución de proteína añadiendo 1/10 de Tris 2 M, pH 10,5. La proteína diana se concentró con Amicon®Ultra-15 Ultracel 30K (Merck Millipore Ltd.) hasta un volumen de máximo 4 ml antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0, Tween20 al 0,01 %.

Se analizaron la pureza y el peso molecular de las moléculas después de la etapa de purificación final por análisis por EC-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor. Se usó el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper lifescience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El contenido de agregados de las moléculas se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en tampón de migración K₂HPO₄25 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), pH 6,7 a 25 °C. La calidad final de todas las moléculas fue buena, con un contenido de monómero > 92 %.

TABLA 2. Resumen de la producción y purificación de moléculas de TCB activado por proteasa

Ejemplo 5

Expresión transitoria de TCB activados por proteasa

Las diferentes proporciones de plásmidos usadas para la transfección se compararon por cromatografía de exclusión por tamaño, ya que se sospechaba que la cadena botón se expresaba en menores niveles en comparación con la cadena ojal y la cadena ligera. Como se muestra en la FIG. 6 y 7, usando una proporción de plásmidos de 1 (ojal):2 (botón):3 (CLC) (FIG. 7) en lugar de 1 (ojal):1 (botón):3 (CLC) (FIG. 6) se incrementó el rendimiento de la molécula correcta (pico izquierdo) y disminuyó la cantidad de homodímeros ojal-ojal (pico derecho).

Ejemplo 6

Escisión y estabilidad de TCB activado por proteasa

Los TCB activados por proteasa se analizaron por electroforesis capilar. La comparación de la muestra no tratada y la muestra tratada mostró que el resto scFv antiidiotipo se escindió completamente después del tratamiento con rh-matriptasa/ST14. El análisis de las muestras incubadas durante 48 h a 37 °C confirmó la estabilidad de las moléculas en el tampón de formulación (FIG. 12A-D).

Ejemplo 7

Destrucción de células usando líneas de células diana que expresan diferentes niveles de FolR1

Se evaluó la destrucción de células mediada por linfocitos T inducida por moléculas de TCB activado por proteasa usando líneas de células diana que expresan diferentes niveles de FolRI (FIG. 13). Se usaron PBMc humanos como células efectoras y se detectó la destrucción celular a las 48 h de incubación con las moléculas de TCB activado por proteasa. Se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos a partir de sangre recién extraída o de capas leucocíticas obtenidas de donantes humanos sanos. Para la preparación de sangre roja se usaron tubos Leucosep (GreinerBioOne) de 50 ml. Para las preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucocíticas) se usó la preparación de densidad Histopaque-1077. La sangre/capa leucocítica se diluyó 1:1 con PBS estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción, temperatura ambiente), se descartó el plasma por encima de la interfase que contenía PBMC y los PBMC se transfirieron a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación a 37 °C durante aproximadamente 2 - 3 minutos, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron a 350 x g durante 10 minutos. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 2 % y 1X GlutaMax a 37 °C, un 5 % de CO2, en una estufa de incubación de células hasta su uso posterior. En resumen, las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron a 0,4 x106 células/ml en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1X GlutaMax). Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo redondo. Para el ensayo de destrucción, las moléculas se añadieron a las concentraciones indicadas por triplicado. Se incluyó TCB, 16D5, frente a FolR1 como control positivo y se incluyó una molécula de TCB no seleccionada como diana (que se une a CD3, pero no a un antígeno de célula diana) como control negativo. Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células diana después de 48 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO2 por cuantificación de liberación de LDH en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001). La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 % 1 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB.

Los resultados (FIG. 14A, 15A, 16, 17, 18A, 19A y 20A) muestran que el TCB activado por proteasa con un resto de scFv frente a CD3 antiidiotípico enlazado de forma N terminal por un conector no escindible (n.° 7676 y n.° 7611, FIG. 5B y D, respectivamente) pudo reducir significativamente la lisis celular en células Skov3 y HT29. El n.° 7611 (FIG. 5D) dio lugar a una destrucción reducida en células Hela mientras que el scFv frente a CD3 antiidiotípico 4.15.64 en n.° 7676 (FIG. 5B) fue menos eficaz en la reducción de la lisis celular. Esto está en consonancia con las afinidades del resto N de scFv frente a CD3 antiidiotípico. El resto de scFv de mayor afinidad enmascara más eficazmente.

La potencia comparable de los TCB tratados y no tratados indica la expresión de matriptasa de las células Hela y Skov3. La expresión de matriptasa parece ser menor en células HT29. El tratamiento de Mkn-45, una línea celular negativa para FolR1, muestra solo una destrucción débil con todas las moléculas usadas en el presente documento (FIG. 15A).

Ejemplo 8

Activación de linfocitos T después de la coincubación de líneas de células tumorales con PBMC humanos

Se evaluó la activación de linfocitos T mediada por moléculas de TCB activado por proteasa en células Hela, Skov3 y HT29. Se usaron PBMC humanos como células efectoras y la activación de linfocitos T se detectó a las 48 h de incubación con células diana y los anticuerpos. Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las moléculas se añadieron a las concentraciones indicadas por triplicado. Se incluyó TCB, 16D5, frente a FolR1 como control positivo y se incluyó una molécula de TCB no seleccionada como diana (que se une a CD3, pero no a un antígeno de célula diana) como control negativo. Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. La activación de linfocitos T se evaluó después de 48 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO₂por cuantificación de CD25 y CD69 en linfocitos T positivos para CD4 y positivos para CD8. Los resultados de activación de linfocitos T son consecuentes con los resultados observados en el ejemplo previo que evalúa la destrucción de células diana (ejemplo 7).

Ejemplo 9

Activación de linfocitos T mediada por TCB activados por proteasa y líneas de células diana que expresan bajos niveles de antígeno

Se evaluó la activación de linfocitos T mediada por moléculas de TCB activado por proteasa en células HT29 que solo expresaban bajos niveles de FolR1 (FIG. 13). Se usaron PBMC humanos aislados de la capa leucocítica como células efectoras. Para las preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucocíticas) se usó la preparación de densidad Histopaque-1077. La capa leucocítica se diluyó 1:1 con PBS estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción, temperatura ambiente), se descartó el plasma por encima de la interfase que contenía PBMC y los PBM^cse transfirieron a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación a 37 °C durante aproximadamente 2 - 3 minutos, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron a 350 x g durante 10 minutos. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 2 % y 1X GlutaMax a 37 °C, un 5 % de CO2, en una estufa de incubación de células hasta su uso posterior. En resumen, las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se evaluó la viabilidad y se resuspendieron a 0,4 x106 células/ml en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1X GlutaMax). Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las moléculas se añadieron a las concentraciones indicadas por triplicado. Se incluyó TCB, 16D5, frente a FolR1 como control positivo y se incluyó una molécula de TCB no seleccionada como diana (que se une a CD3, pero no a un antígeno de célula diana) como control negativo. Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. La activación de linfocitos T se evaluó después de 48 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO2 por cuantificación de CD25 y CD69 en linfocitos T positivos para CD4 y positivos para CD8. La potencia del TCB activado por proteasa tratado es comparable a la del TCB, 16D5 (6298). Los TCB, 16D5, (formato invertido) muestran mayor potencia que el formato clásico. Los TCB enmascarados con conector no escindible o sin pretratamiento con matriptasa no inducen la activación de linfocitos T en esta línea celular. Para líneas celulares con niveles de expresión de FolRI bajos o medios, ambos scFv antiidiotípicos son suficientes para enmascarar el Fab frente a CD3 (FIG. 22A y B).

Ejemplo 10

Activación de linfocitos T mediada por TCB activado por proteasa con la línea de células primarias HRCEpiC

Se evaluó la activación de linfocitos T mediada por moléculas de TCB activado por proteasa en células epiteliales corticales renales humanas primarias (ScienceCell) que solo expresaban cantidades muy pequeñas de FolR1 (FIG.

13). Se usaron PBMC humanos aislados de la capa leucocítica como células efectoras. Para las preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucocíticas) se usó la preparación de densidad Histopaque-1077. La capa leucocítica se diluyó 1:1 con PBS estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción a temperatura ambiente), el plasma por encima de la interfase que contenía PBMC se descartó y los PBMC se transfirieron a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación a 37 °C durante aproximadamente 2 - 3 minutos, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron a 350 x g durante 10 minutos. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 2 % y 1X GlutaMax a 37 °C, un 5 % de CO2, en una estufa de incubación de células hasta su uso posterior. En resumen, las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron a 0,4 x106 células/ml en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1X GlutaMax). Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadieron moléculas de TCB activables por proteasa a las concentraciones indicadas por triplicado. Se incluyó TCB, 16D5, frente a FolR1 como control positivo y se incluyó una molécula de TCB no seleccionada como diana (que se une a CD3, pero no a un antígeno de célula diana) como control negativo. Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. La activación de linfocitos T se evaluó después de 48 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO₂por cuantificación de CD25 y CD69 en linfocitos T positivos para CD4 y positivos para CD8. El TCB, 16D5, enmascarado no induce la activación de linfocitos T tras la incubación con células epiteliales corticales renales humanas primarias a pesar de la expresión de FolR1 de bajo nivel a la concentración más alta de 10.000 μM de TCB, lo que demuestra la eficacia del resto de enmascaramiento antiidiotipo. Se puede observar poca activación de linfocitos T para los TCB, 16D5, (formato invertido y clásico) (FIG. 23).

Ejemplo 11

Proteína de unión a CD3 de enmascaramiento de Fab frente a CD3 anti-ID de 16D5 TCB. Destrucción en células Ovcar3

Se evaluó la destrucción de células diana mediada por linfocitos T mediada por moléculas de TCB activado por proteasa en células OVCAR3 (FIG. 24). Se usaron PBMC humanos como células efectoras y se detectó la destrucción celular a las 48 h de incubación con las moléculas. Se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos a partir de sangre recién extraída de un donante sano. Para la preparación se usaron tubos Leucosep (GreinerBioOne) de 50 ml. La sangre se diluyó 1:1 con PBS estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción, temperatura ambiente), se descartó el plasma por encima de la interfase que contenía PBMC y los PBMC se transfirieron a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación a 37 °C durante aproximadamente 2 - 3 minutos, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron a 350 x g durante 10 minutos. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 2 % y 1X GlutaMax a 37 °C, un 5 % de CO2, en una estufa de incubación de células hasta su uso posterior. En resumen, las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron a 0,4 x106 células/ml en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1X GlutaMax). Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo redondo. Para el ensayo de destrucción, las moléculas se añadieron a las concentraciones indicadas por triplicado. Se incluyó TCB, 16D5, frente a FolR1 como control positivo y se incluyó una molécula de TCB no seleccionada como diana (que se une a CD3, pero no a un antígeno de célula diana) como control negativo. Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células diana después de 48 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO2 por cuantificación de liberación de LDH en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11644793001). La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de las células diana y PBMC con Triton X-100 al 1 % 1 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB. El resultado (figura 24) muestra que el TCB activado por proteasa con Fab cruzado de 4.15.64 frente a CD3 antiidiotípico enlazado de forma N terminal por un conector no escindible no enmascara significativamente la proteína de unión a CD3. Además, las células Ovcar3 parecen expresar matriptasa porque la molécula no tratada también induce la destrucción de estas células.

Ejemplo 12

Destrucción en células Skov3 y HeLa con tres donantes de PBMC humanos diferentes

Se evaluó la destrucción de linfocitos T mediada por moléculas de TCB activado por proteasa en dos líneas celulares diferentes que expresaban diferentes niveles de FolR1 (figs. 25-27). Se usaron PBMC humanos como células efectoras y se detectó la destrucción celular a las 48 h de incubación con las moléculas. Se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos a partir de capas leucocíticas obtenidas de donantes humanos sanos. Para las preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucocíticas) se usó la preparación de densidad Histopaque-1077. La sangre/capa leucocítica se diluyó 1:1 con PBS estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción, temperatura ambiente), se descartó el plasma por encima de la interfase que contenía PBMC y los PBMC se transfirieron a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación a 37 °C durante aproximadamente 2 - 3 minutos, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron a 350 x g durante 10 minutos. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y 1X GlutaMax. Los PBMC se resuspendieron en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 %, 1X GlutaMax y DMSO al 10 %. Los PBMC se congelaron durante la noche a -80 °C en cajas Cool Cell antes de que se transfirieran a nitrógeno líquido. 24 h antes del inicio del ensayo, los PBMC se descongelaron y mantuvieron en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y 1X GlutaMax a 37 °C, un 5 % de CO2, en una estufa de incubación de células. El día antes del inicio del ensayo, las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron a 0,4 x106 células/ml en un medio apropiado. Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo plano. El día del inicio del ensayo, se contaron los PBMC y se comprobó su viabilidad. Los PBMC se centrifugaron a 350 g durante 5 min y se resuspendieron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1X GlutaMax). Se retiró el medio de células diana y se añadieron PBMC a las células diana antes de que se añadieran anticuerpos diluidos a las concentraciones indicadas por triplicado. Se incluyó TCB, 16D5, frente a FolR1 como control positivo y se incluyó una molécula de TCB no seleccionada como diana (que se une a CD3, pero no a un antígeno de célula diana) como control negativo. Se añadieron PBMC a las células diana en una proporción E:T de 10:1. Se evaluó la destrucción de células diana después de 48 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO2 por cuantificación de liberación de LDH en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11644793001). La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 % 2 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB.

Los resultados (figuras 25-27) muestran que TCB frente a FolR1 con scFv 4.32.63 enlazado de forma N terminal por un conector no escindible (figura 5D) indujo una destrucción reducida en células Hela a una concentración de 100 μM y en células Skov3 a una concentración de 10 nM. El TCB frente a FolR1 con scFv 4.15.64 enlazado de forma N terminal por un conector no escindible (figura 5B) fue menos eficaz en la reducción de la destrucción en células Skov3 a una concentración de 10 nM. El enmascaramiento más fuerte, es decir, el scFv antiidiotípico 4.32.63 con la mayor afinidad, es más eficaz en el enmascaramiento de la proteína de unión a CD3 que el scFv antiidiotípico débil 4.15.64. La potencia comparable de los TCB tratados y no tratados indica la expresión de proteasa, por ejemplo, matriptasa, por células Hela y Skov3.

Ejemplo 13

Preparación del anticuerpo de unión a HER1 GA201 enmascarado con un scFv de GA201 antiidiotipo

En este ejemplo se prepararon las siguientes moléculas:

1: anticuerpo IgG1 GA201 con fusión N terminal de un scFv de GA201 antiidiotípico y sitio de metaloproteasa de la matriz en conector de glicina serina (SEQ ID NO 32 y 34); y

2: anticuerpo IgG1 de unión a HER1 GA201 (SEQ ID NO 32 y 33).

Las ilustraciones esquemáticas de los mismos se muestran en las FIGS. 28 y 29. La secuencia de proteína de unión antiidiotípica (ID) de GA201 se obtuvo por RT-PCR (retrotranscripción) a partir de ARN de células de hibridoma usando cebadores redundantes que se unen a los extremos de la cadena ligera y pesada variable, respectivamente. Se obtuvieron células de hibridoma por inmunización de ratones. La síntesis de secuencias de ADN de Fv monocatenario (scFv) con sitios de endonucleasas de restricción singulares flanqueantes se encargó a Geneart y se clonó como fusión N terminal en la cadena ligera de GA201.

Se usó un vector de expresión de Roche para la construcción de todos los plásmidos de expresión que codifican la proteína de fusión de scFv de cadena pesada y ligera. El vector se compone de los siguientes elementos:

- un gen de resistencia a higromicina como marcador de selección,

- un origen de replicación, oriP, del virus de Epstein-Barr (VEB),

- un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli

- un gen de betalactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli,

- el potenciador y promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (HCMV),

- la secuencia señal de poliadenilación ("poli A") de 1-inmunoglobulina humana, y

- sitios de restricción para BamHI y XbaI únicos.

Las moléculas se produjeron cotransfectando células 293-F de riñón embrionario humano que estaban cultivadas en suspensión con los vectores de expresión de mamífero usando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, EE. UU.). En resumen, las células FreeStyle™ 293-F en suspensión se cultivaron en medio de expresión de FreeStyle™ 293 a 37 °C/un 8 % de CO₂y las células se sembraron en medio recién preparado a una densidad de 1-2 x 106 células viables/ml el día de la transfección. Se prepararon complejos DNA-293fectin™ en medio Opti-MEM I (Invitrogen, EE. UU.) usando 325 |jl de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 jg de ADN plasmídico de cadena pesada ("cadena pesada de GA201") y ligera ("anti-GA201 VH-VL scFv - conector escindible por MMP - G4S GA201, cadena ligera" o "cadena ligera de GA201") en una proporción molar 1:1 para un volumen de transfección final de 250 ml. Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos se obtuvieron 7 días después de la transfección por centrifugación a 14000 g durante 30 minutos y se filtraron a través de un filtro estéril (0,22 |jm). Los sobrenadantes se almacenaron a -20 °C hasta su purificación.

La proteína secretada se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando cromatografía de afinidad con proteína A, seguida de cromatografía de exclusión por tamaño. En resumen, los sobrenadantes de cultivo celular filtrados de forma estéril se aplicaron a una columna HiTrap ProteinA HP (5 ml) equilibrada con tampón PBS (Na₂HPO₄10 mM, KH2PO₄1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4). Las proteínas no unidas se retiraron mediante lavado con tampón de equilibrio. El anticuerpo y las variantes de anticuerpo se eluyeron con tampón citrato 0,1 M, pH 2,8, y las fracciones que contenían proteína se neutralizaron con 0,1 ml de Tris 1 M, pH 8,5. A continuación, las fracciones de proteína eluidas se agruparon, se concentraron con un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra (PMC: 30 K, Millipore) hasta un volumen de 3 ml y se cargaron en una columna de filtración en gel Superdex200 HiLoad de 120 ml 16/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0. Las fracciones que contenían GA201-anti-GA201-scFv o Ga 201 purificado con menos de un 5 % de agregados de alto peso molecular se agruparon y almacenaron como alícuotas de 1,0 mg/ml a -80 °C.

Para el análisis de proteínas después de la cromatografía de exclusión por tamaño, la pureza y el peso molecular de las moléculas en las fracciones únicas se analizaron por SDS-PAGE en ausencia de un agente reductor y tinción con Coomassie (InstantBlue™, Expedeon). Se usó el sistema en gel NuPAGE® Pre-Cast (Bis-Tris al 4-12 %, Invitrogen, o Tris-acetato al 3-8 %, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La concentración de proteína de las muestras de proteína purificada se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nM dividida por el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos. Se analizaron la pureza y el peso molecular de las moléculas después de la etapa de purificación final por análisis por EC-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor. Se usó el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper lifescience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El contenido de agregados de las moléculas se analizó por SEC de alto rendimiento usando una columna de exclusión por tamaño analítica Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) en tampón de migración KH2PO₄200 mM, KCl 250 mM, pH 7,0, a 25 °C. Se inyectaron 25 jg de proteína en la columna a un caudal de 0,5 ml/min y se eluyeron isocráticamente durante 50 minutos.

La pureza final de todas las moléculas fue > 95 % de contenido de monómero como se detecta por SEC de alto rendimiento. El peso molecular del GA201 enmascarado por scFv antiidiotípico se determinó por análisis por EC-SDS como 216,3 kDa en condiciones no reductoras (figura 1A) y en condiciones reductoras como 58,3 kDa para la cadena pesada de GA201 y 60,3 kDa para la cadena ligera de GA201 enlazada a scFv (figura 30B), respectivamente. El peso molecular en base a la secuencia de aminoácidos se calculó como 49,2 kDa para la cadena pesada y 51,9 kDa para la cadena ligera de GA201 fusionada a scFv, lo que indica glucosilación de ambas cadenas en células HEK₂93.

TABLA 3. Resumen de la producción y purificación de las moléculas de control IgG GA201 (figura 28) y GA201 (figura 29) activadas por proteasa

Ejemplo 14

Efecto de enmascaramiento de un scFv antiidiotípico para IgG GA201

La eficacia de enmascaramiento de la unión a HERI de GA201 por la fusión N terminal de un scFv de GA201 antiidiotípico se demostró por análisis por FACS en células H322M que expresaban HER1 y por análisis de resonancia de plasmón superficial (RPS) en una superficie de chip recubierta con HER1. Para la escisión proteolítica de GA201-anti-GA201-scFv se usó MMP2 humana activa recombinante (Calbiochem). Se incubó 1 mg de scFv antiidiotípico de GA201 fusionado a GA201 por un conector de glicina-serina que contenía un sitio de escisión de MMP con 1,2 |jg de MMP2 durante la noche a 37 °C en PBS.

Para el análisis por FACS de la unión a HERI de GA201-anti-GA201-scFv escindido y no escindido, se usó la línea de carcinoma de pulmón no microcítico H322M. Las células se ajustaron a 1x106/ml y se distribuyeron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las moléculas se añadieron y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron una vez con tampón de FACS (PBS FCS al 2 % acida de sodio al 0,1 %) y se resuspendieron con un conjugado F(ab')₂-anticuerpo secundario anti-Fc de IgG humana de cabra-FITC (ThermoFisher Scientific). Después de otros 20 minutos en hielo, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en tampón de FACS y se analizaron en un BD FACS Canto II. Se midieron 10000 células y se usó la mediana de la señal de fluorescencia para el análisis. Antes de la escisión por MMP-2 de GA201-anti-GA201-scFv, no se pudo medir la unión a FIERI en células H322M, lo que indica un enmascaramiento completo de los dominios de unión a GA201 por el scFv antiidiotípico (fig. 31). La unión de GA201-anti-GA201-scFv no escindido fue comparable a un anticuerpo control de isotipo IgG inespecífico (fig. 31). Por el contrario, la escisión por MMP del scFv antiidiotípico da lugar a la activación de GA201 y la unión a HER1 en células H322M se restableció a niveles similares a los del anticuerpo original no enmascarado GA201 (fig. 31)

Para confirmar los datos de unión por FACS de la unión de GA201 enmascarado después de la escisión por MMP, también se realizó un experimento por RPS como segundo procedimiento analítico usando un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare Biosciences Ab , Uppsala, Suecia). Se inmovilizó HER1 en la superficie de un chip biosensor CM5 usando química de acoplamiento de amina estándar. El dominio extracelular de HER1 se inyectó en acetato de sodio, pH 5,0, a 1 |jg/ml. Las cubetas de lectura de control de referencia se trataron de la misma manera pero solo con tampón vehículo. GA201-anti-GA201-scFv, antes y después de una escisión por MMP durante la noche, y GA201 se diluyeron en 1xPBS, pH 7,4, Tween20 al 0,05 % (Roche Diagnostics GmbH) y se inyectaron a concentraciones crecientes entre 3,125 y 50 nM con un caudal de 30 jl/min. La fase de asociación fue de 3 minutos y el tiempo de disociación fue de 10 minutos. La unión a HER1 se regeneró con una inyección de ácido fosfórico al 0,85 % durante 30 s a un caudal de 5 jl/min. Las constantes de velocidad cinética y las constantes de disociación en equilibrio se calcularon usando el modelo de unión de Langmuir 1:1 dentro del programa informático Biaevaluation. Se determinó un valor de Kd de 1 nM para la unión de HER1 para el anticuerpo no enmascarado original GA201 (fig. 32). Después de una incubación con MMP-2 durante la noche de GA201-anti-GA201-scFv, se midió un valor de K^dde 2 nM con constantes de velocidad ka y kd similares para la asociación y disociación al anticuerpo control no enmascarado, lo que indica un restablecimiento completo de la unión a HER1 por escisión por proteasa (fig. 32). GA201-anti-GA201-scFv no escindido no mostró ninguna unión a HER1 en el análisis por RPS (fig. 32). En resumen, se ha demostrado una pérdida completa de unión a HER1 por la fusión de un scFv antiidiotípico al extremo N del anticuerpo IgG1 GA201 con dos procedimientos analíticos independientes. Además, la unión a HER1 se restableció completamente por la retirada del scFv a través de la escisión por proteasa en el sitio de escisión de MMP en el conector de glicina-serina.

Ejemplo 15

Preparación de moléculas biespecíficas para linfocitos T (TCB) anti-FolR1/anti-CD3 y antimesotelina/anti-Cd 3 con scFv anti-CD3

Se produjeron varias moléculas biespecíficas para linfocitos T (TCB) con diversos scFv antiidiotípicos y se representan esquemáticamente en las FIGS. 33A-J con su respectivo número de ID. Se prepararon las siguientes moléculas:

ID 8364: "IgG 2+1, 16D5, frente a FolR1, formato clásico (scFv antiidiotípico 4.32.63 - sitio de MMP9-matriptasa MK062 - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a FolR1 - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.32.63 fusionado N terminal y conector de proteasa MMP9-MK062" (FIG. 33A, SEQ ID NO 1, 3 y 72).

ID 8363: "IgG 2+1, 16D5, frente a FolR1, formato clásico (scFv antiidiotípico 4.32.63 - sitio de catepsina S/B - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a FolRI - Fc inerte) con scFv anti-CD34.32.63 fusionado N terminal y conector de proteasa catepsina S/B" (FIG. 33B, SEQ ID NO 1, 3 y 85).

ID 8365: "IgG 2+1, 16D5, frente a FolRI, formato invertido, (scFv antiidiotípico 4.32.63 - conector de matriptasa MK062 - CD3- fusionado N terminal a VL frente a CD3 - Fc inerte) con scFv anti-CD34.32.63 fusionado N terminal y conector de matriptasa MK062" (FIG. 33C, SEQ ID NO 1, 3, 73 y 74).

ID 8366: "IgG 2+1, 16D5, frente a FolR1, formato invertido, (scFv antiidiotípico 4.32.63 - conector de GS no escindible - CD3 - fusionado N terminal a VL frente a CD3 - Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.32.63 fusionado N terminal y conector de GS no escindible" (FIG. 33D).

ID 8672: "IgG 2+1 frente a a-mesotelina, formato clásico, variantes cargadas frente a MSLN, CD3 cruzado (scFv antiidiotípico 4.32.63 - MMP9-matriptasa MK062 - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a a-mesotelina - Fc inerte) con scFv anti-CD34.32.63 fusionado N terminal y MMP9-matriptasa MK062" (FIG. 33E, SEQ ID NO 77, 78, 81, 82).

ID 8673: "IgG 2+1 frente a a-mesotelina, formato clásico, variantes cargadas frente a MSLN, CD3 cruzado (scFv antiidiotípico 4.32.63 - conector de GS no escindible - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a a-mesotelina - Fc inerte) con scFv anti-CD34.32.63 fusionado N terminal - conector de GS no escindible" (FIG. 33F).

ID 8674: "IgG 2+1 frente a a-mesotelina, formato invertido, variantes cargadas frente a MSLN, CD3 cruzado (scFv antiidiotípico 4.32.63 - MMP9-matriptasa MK062 - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a CD3 - Fc inerte) con scFv anti-CD34.32.63 fusionado N terminal y MMP9-matriptasa MK062" (FIG. 33G, SEQ ID NO 76, 77, 78, 79).

ID 8675: "IgG 2+1 frente a a-mesotelina, formato invertido, variantes cargadas frente a MSLN, CD3 cruzado (scFv antiidiotípico 4.32.63 - conector de GS no escindible - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a CD3 - Fc inerte) con scFv anti-CD34.32.63 fusionado N terminal y conector de GS no escindible" (FIG. 33H).

ID 8505: "IgG 2+1 frente a a-mesotelina, formato invertido, variantes cargadas frente a MSLN, CD3 (HC frente a a-mesotelina fusionada de forma N terminal a VL frente a CD3 - Fc inerte)" (FIG. 33I).

ID 8676: "IgG 2+1 frente a a-mesotelina, formato clásico, variantes cargadas frente a MSLN, CD3 cruzado (IgG frente a a-mesotelina con CD3 - fusionada N terminal a VH frente a a-mesotelina - Fc inerte)" (FIG. 33J)

Los dominios variables se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con los dominios preinsertados en el respectivo vector de expresión de mamífero receptor. Se controla la expresión de proteínas por un promotor de MPSV y una secuencia señal de poli A sintética está presente en el extremo 3' de la CDS. Además, cada vector contiene una secuencia OriP del VEB.

Las moléculas (excepto 8505, esta molécula se produjo cotransfectando células CHO que estaban cultivadas en suspensión con los vectores de expresión de mamífero. La transfección transitoria se realizó en Evitria AG (Suiza)) se produjeron cotransfectando células HEK₂93-EBNA que estaban cultivadas en suspensión con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina (PEI). Para la transfección, se cultivaron células HEK₂93 EBNA en medio de cultivo ExCell libre de suero que contenía L-glutamina 6 mM y 250 mg/l de G418. Para la producción en matraces rotatorios de 600 ml (volumen de trabajo máx. de 400 ml) se sembraron 800 millones de células HEK₂93 EBNA 24 horas antes de la transfección sin G418. Para la transfección, se centrifugaron 800 millones de células durante 5 min a 210 x g y el sobrenadante se reemplazó por 40 ml de medio CD CHO precalentado que contenía L-glutamina 6 mM. Los vectores de expresión se mezclaron con 40 ml de medio CD CHO que contenía L-glutamina 6 mM hasta una cantidad total de 400 |jg de ADN. Después de la adición de 1080 |jl de solución de PEI (2,7 |jg/ml), la mezcla se agitó en vórtex durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Después de esto, se mezclaron las células con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz rotatorio de 600 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una estufa de incubación con una atmósfera de un 5 % de CO2. Después de la incubación, se añadieron 320 ml de ExCell L-glutamina 6 mM 5 g/l de Pepsoy VPA 1,0 mM 3 g/l de medio de glucosa y las células se cultivaron durante 24 horas antes de su alimentación con Feed 7 al 7 %. Después de 6-7 días, se recogió el sobrenadante de cultivo para su purificación por centrifugación durante 20 -30 min a 210 x g (centrifugadora Sigma 8K). La solución se filtró de forma estéril (filtro de 0,22 jm ) y se añadió acida de sodio en una concentración final de 0,01 % p/v. La solución se mantuvo a 4 °C hasta su purificación.

La proteína secretada se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando cromatografía de afinidad con proteína A, seguida de una o dos etapas cromatográficas de exclusión por tamaño.

Para la cromatografía de afinidad, el sobrenadante se cargó en una Protein A MabSelectSure (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con citrato de sodio 20 mM, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,5. La proteína no unida se retiró lavando con al menos 10 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, fosfato de sodio 20 mM, pH 7,5, y la proteína diana se eluyó en 20 volúmenes de columna (gradiente de un 0 % - 100 %) con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3,0. La solución de proteína se neutralizó añadiendo 1/10 de Na₂HPO₄0,5 M, pH 8,0. La proteína diana se concentró con Amicon®Ultra-15 Ultracel 30K (Merck Millipore Ltd.) hasta un volumen de máximo 4 ml antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, Tween al 0,01 %, pH 6,0.

El contenido de agregados de las moléculas se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en tampón de migración K₂HPO₄25 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), pH 6,7 a 25 °C.

La calidad final de todas las moléculas fue buena, con un contenido de monómero > 95 %.

TABLA 4. Resumen de la producción y purificación de moléculas de TCB activado por proteasa

Ejemplo 16

Control de calidad y estabilidad: análisis por electroforesis capilar-SDS de diferentes moléculas de TCB

Se analizaron la pureza y el peso molecular de las moléculas después de la etapa de purificación final por análisis por EC-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor. Se usó el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper lifescience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Comparación de moléculas no tratadas (almacenadas a 4 °C), moléculas tratadas (tratadas con proteasa recombinante apropiada (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C y molécula incubada durante 72 h a 37 °C (FIGS. 34, 35A y 35B).

La comparación de la molécula no tratada y tratada muestra la escisión completa del scFv anti-ID después del tratamiento con rh-matriptasa/ST14 para el formato invertido que contiene el conector de matriptasa MK062, pero la escisión incompleta del conector de MMP9-matriptasa MK062. El tratamiento con rh-catepsina B y rh-catepsina S también está incompleto. Las condiciones para las enzimas purificadas no han sido óptimas. Las moléculas incubadas a 37 °C durante 72 h migran a la misma altura que las moléculas puras, lo que indica que las moléculas son estables a 37 °C durante el tiempo de duración del ensayo in vitro. Se usó Mark 12 (Invitrogen) como marcador de proteína preteñido para la estimación del peso molecular correcto.

Ejemplo 17

Comparación de diferentes conectores y formatos de TCB frente a FolR1 activados por proteasa

Ensayo de activación para Jurkat NFAT. Ensayo de activación para Jurkat NFAT para la comparación de diferentes formatos y conectores de TCB activado por proteasa. La línea celular indicadora Jurkat-NFAT (Promega) es una línea celular indicadora de leucemia linfocítica aguda humana con un promotor NFAT, que expresa CD3e humano. Si el TCB se une a la diana tumoral y la proteína de unión a CD3 (reticulación) se une al CD3e, la expresión de luciferasa se puede medir en luminiscencia después de la adición del sustrato de One-Glo (Promega). Se sembraron 20.000 células diana en una placa de fondo transparente de paredes blancas de 96 pocillos (Greiner BioOne) en 50 ul/pocillo de medio de Jurkat (RPMI1640, 2 g/l de glucosa, 2 g/l de NaHCO₃, FCS al 10 %, HEPES 25 mM, L-glutamina 2 mM, 1 x NEAA, 1 x piruvato de sodio) sin higromicina. Las placas se incubaron durante aproximadamente 20 horas a 37 °C. Se obtuvieron células indicadoras Jurkat-NFAT y se evaluó la viabilidad usando ViCell. Las células se resuspendieron en medio de Jurkat sin higromicina y se añadieron 50 |jl por pocillo (50.000 células/pocillo). La proporción E:T fue 2,5:1 (en base al número de células sembradas). Los anticuerpos se diluyeron en medio de Jurkat sin higromicina y se añadieron 50 ul/pocillo. Las células se incubaron a 37 °C durante 6 h en una estufa de incubación humidificada antes de que se sacaran de la estufa de incubación durante aproximadamente 10 min para adaptarse a la temperatura ambiente antes de la lectura de luminiscencia. Se añadieron 50 jl/pocillo de solución ONE-Glo a los pocillos y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se detectó luminiscencia usando el lector WALLAC Victor3 ELISA (PerkinElmer2030), 1 s/pocillo como tiempo de detección. La comparación del TCB activado por proteasa pretratado (8364, cuadrados grises rellenos) y TCB frente a FolR1 (triángulos negros que apuntan hacia abajo) mostró que la potencia después de la escisión se recupera completamente. No se detectó luminiscencia para las células incubadas con el TCB enmascarado (que contenía un conector no escindible de GS, triángulos grises que apuntan hacia arriba) y el control de TCB no seleccionado como diana (triángulo vacío que apunta hacia abajo) para ambas líneas celulares en este intervalo de concentraciones. La línea punteada muestra la luminiscencia de células diana y de células efectoras sin ningún TCB (FIGS. 36A y 36B).

Ejemplo 18

Citotoxicidad de células tumorales mediada por diferentes formatos de TCB activado por proteasa

Se evaluó la destrucción de linfocitos T mediada por moléculas de TCB activado por proteasa en líneas celulares que expresaban diferentes niveles de FolR1. Se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos a partir de capas leucocíticas obtenidas de donantes humanos sanos. La capa leucocítica se diluyó 1:1 con PBS estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción, temperatura ambiente), la interfase que contenía PBMC se transfirió a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación durante aproximadamente 2 - 3 minutos a 37 °C, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron durante 10 minutos a 350 x g. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 %, 1X GlutaMax y DMSO al 10 %. Los PBMC se congelaron lentamente en recipientes de congelación celular CoolCell® (BioCision) a -80 °C y, a continuación, se transfirieron a nitrógeno líquido. Un día antes del inicio del ensayo, las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1X GlutaMax). Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante aproximadamente 20 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Aproximadamente 20 h antes del inicio del ensayo, los PBMC se descongelaron en medio RPMI1640 (FCS al 10 %, 1X GlutaMax). Los PBMC se centrifugaron a 350 g durante 7 min. El sedimento se resuspendió en medio recién preparado (RPMI1640, FCS al 10 %, 1X GlutaMax) y se incubó durante un máximo de 24 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. El día del inicio del ensayo, se obtuvieron los PBMC y se centrifugaron a 350 g durante 7 min. El sedimento se resuspendió en medio de ensayo y se añadieron 0,2 millones de PBMC en 100 ul/pocillo (E:T 10:1, en base al número de células diana sembradas) a las células diana. Las moléculas se diluyeron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1X GlutaMax) y se añadieron 50 ul/pocillo a las concentraciones indicadas por triplicado antes de que se incubaran las placas durante aproximadamente 48 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Se evaluó la destrucción de células diana después de 48 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO2 por cuantificación de liberación de LDH en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11644793001). La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 % 20 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB.

Los resultados (FIGS. 37A y 37B) muestran la comparación de dos formatos diferentes de los TCB activados por proteasa, conteniendo ambos el scFv frente a CD3 antiidiotípico 4.32.63 enlazado con un conector de matriptasa MK062. El formato invertido del TCB activado por proteasa (8365, círculos grises) parece ser más potente en la destrucción (células diana HeLa y Skov-3) que el formato clásico del TCB activado por proteasa (8408, triángulos gris oscuro que apuntan hacia arriba). Sin embargo, la molécula invertida que contiene el conector no escindible (8366, cuadrados gris claro) es menos eficaz en el enmascaramiento que la molécula clásica (8409, triángulos gris oscuro que apuntan hacia abajo).

FIG. 37C: citotoxicidad de células diana HeLa. Comparación de TCB activado por proteasa clásico que contiene el scFv frente a CD3 antiidiotípico 4.32.63 y conectores de GS con diferentes sitios de proteasa. El TCB activado por proteasa que contiene el conector de MMP9-matriptasa MK062 (8364, cuadrados grises) alcanza la potencia de TCB frente a FolR1 (triángulos gris claro que apuntan hacia abajo) mientras que el TCB activado por proteasa que contiene solo matriptasa MK062 (rombo gris claro) es menos potente en la destrucción de células HeLa. Las moléculas que contienen el sitio de catepsina (círculos grises) o conector no escindible (triángulos negros que apuntan hacia abajo) son comparables.

FIG. 37D: citotoxicidad de células diana Skov-3. Comparación de TCB activado por proteasa clásico que contiene el scFv frente a CD3 antiidiotípico 4.32.63 y conectores de GS con diferentes sitios de proteasa. El TCB activado por proteasa que contiene el conector de MMP9-matriptasa MK062 (8364, cuadrados grises) casi alcanza la potencia de TCB frente a FolR1 (triángulos gris claro que apuntan hacia abajo), mientras que el TCB activado por proteasa que contiene solo matriptasa MK062 (rombo gris claro) es menos potente en la destrucción de células Skov-3. La molécula que contiene el sitio de catepsina (círculos grises) es menos potente que la molécula que contiene solo el sitio de matriptasa MK062 y la molécula que contiene el conector no escindible (triángulos negros que apuntan hacia abajo) solo induce la destrucción por debajo de un 10 % en el intervalo de concentraciones indicado para células Skov-3.

Ejemplo 19

Activación de linfocitos T después de la coincubación de células corticales epiteliales renales humanas o células epiteliales bronquiales humanas con TCB y PBMC humanos

Se evaluó la activación de linfocitos T mediada por moléculas de TCB activado por proteasa para HRCEpi (células epiteliales corticales renales humanas) y HBEpiC (células epiteliales bronquiales humanas) que solo expresaban pequeñas cantidades de FolR1). Se usaron PBMC humanos como células efectoras y los marcadores de activación de linfocitos T se tiñeron después de 48 h de incubación con las moléculas y células. Se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos a partir de capas leucocíticas obtenidas de donantes humanos sanos. La capa leucocítica se diluyó 1:1 con PBS estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción, temperatura ambiente), la interfase que contenía PBMC se transfirió a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación durante aproximadamente dos minutos a 37 °C, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron durante 10 minutos a 350 x g. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 %, 1 X GlutaMax y DMSO al 10 %. Los ^pB^mC se congelaron lentamente en recipientes de congelación celular CoolCell® (BioCision) a -80 °C y, a continuación, se transfirieron a nitrógeno líquido. Un día antes de que se iniciara el ensayo, las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1 X GlutaMax). Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante aproximadamente 20 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Aproximadamente 20 h antes del inicio del ensayo, los PBMC se descongelaron en medio RPMI1640 (FCS al 10 %, 1 X GlutaMax). Los PBMC se centrifugaron durante 7 min a 350 g. El sedimento se resuspendió en medio recién preparado (RPMI1640, FCS al 10 %, 1 X GlutaMax) y se incubó durante un máximo de 24 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. El día del inicio del ensayo, se obtuvieron los PBMC y se centrifugaron durante 7 min a 350 g. El sedimento se resuspendió en medio de ensayo y se añadieron 0,2 millones de PBMC en 100 ul/pocillo (E:T 10:1, en base al número de células diana sembradas) a las células diana. Las moléculas se diluyeron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1 X GlutaMax) y se añadieron a las concentraciones indicadas por triplicado antes de que se incubaran las placas durante aproximadamente 48 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada.

La activación de linfocitos T se evaluó después de 48 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO₂por cuantificación de CD25 y CD69 en linfocitos T positivos para CD4 y positivos para CD8. Se incluyeron TCB, 16D5, frente a FolR1 (6298) y un TCB no seleccionado como diana (que se une a CD3, pero no a un antígeno de célula diana, 7235) como controles. Cada punto representa el valor medio de los triplicados de tres donantes de PBMC humanos diferentes. La desviación estándar se indica en barras de error. Se usó la prueba de la t para datos independientes para el análisis estadístico. Los resultados muestran un incremento de ^cD69 para células positivas para CD8 para el TCB frente a FolR1 que es significativamente mayor que la mediana de la intensidad de fluorescencia para los TCB activados por proteasa (FIGS. 38A y 38B).

Ejemplo 20

Citotoxicidad de células tumorales mediada por diferentes formatos de TCB frente a mesotelina (MSLN) activado por proteasa

Se evaluó la destrucción de linfocitos T mediada por moléculas de TCB activado por proteasa en líneas celulares que expresaban diferentes niveles de mesotelina (MSLN). Se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos a partir de capas leucocíticas obtenidas de donantes humanos sanos. La capa leucocítica se diluyó 1:1 con PBS estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción, temperatura ambiente), la interfase que contenía PBMC se transfirió a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación durante aproximadamente dos minutos a 37 °C, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron durante 10 minutos a 350 x g. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 %, 1 X GlutaMax y DMSO al 10 %. Los PBMC se congelaron lentamente en recipientes de congelación celular CoolCell® (BioCision) a -80 °C y, a continuación, se transfirieron a nitrógeno líquido. Las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1 X GlutaMax) un día antes de que se iniciara el ensayo. Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante aproximadamente 20 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Los PBMC se descongelaron en medio RPMI1640 (FCS al 10 %, 1 X GlutaMax) aproximadamente 20 h antes del inicio del ensayo. Los PBMC se centrifugaron durante 7 min a 350 g. El sedimento se resuspendió en medio recién preparado (RPMI1640, FCS al 10 %, 1 X GlutaMax) y se incubó durante un máximo de 24 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. El día del inicio del ensayo, se obtuvieron los PBMC y se centrifugaron durante 7 min a 350 g. El sedimento se resuspendió en medio de ensayo y se añadieron 0,2 millones de PBMC en 100 ul/pocillo (E:T 10:1, en base al número de células diana sembradas) a las células diana. Las moléculas se diluyeron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1 X GlutaMax) y se añadieron a las concentraciones indicadas por triplicado antes de que se incubaran las placas durante aproximadamente 48 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Se evaluó la destrucción de células diana después de 48 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO₂por cuantificación de liberación de LDH en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11644793001). La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 % 20 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB.

Los resultados (FIGS. 39A y 39B) muestran la destrucción de células diana mediada por TCB frente a MSLN activado por proteasa (8672) para líneas celulares NCI H596 y AsPC-1. Los TCB activados por proteasa casi alcanzan la potencia de TCB frente a MSLN (8676) para NCI H596 y AsPC-1. La molécula que contiene el conector de GS no escindible (8673) no induce la destrucción en el intervalo de concentraciones indicado para ambas líneas celulares.

Ejemplo 21

Ensayo indicador para Jurkat-NFAT para seguir la expresión diana (TCB frente a FolRI) y la actividad proteasa (TCB frente a FolR1 activado por proteasa) en muestras de tumor primario

La intención de este ensayo era mostrar la expresión del antígeno diana tumoral (FolR1) y la actividad de proteasas específicas de tumor como MMP9, matriptasa o catepsina en muestras de tumores humanos.

La línea celular indicadora Jurkat-NFAT (Promega) es una línea celular indicadora de leucemia linfocítica aguda humana con un promotor NFAT, que expresa CD3^ehumano. La expresión de luciferasa se puede medir si la molécula biespecífica para linfocitos T se une a la diana tumoral y al CD3^e(reticulación). La luminiscencia se mide después de la adición del sustrato de One-Glo (Promega).

Se recibieron muestras de tumor primario de Indivumed GmbH, Alemania. Las muestras se enviaron durante la noche en un medio de transporte. Aproximadamente 24 h después de la cirugía, la muestra se cortó en pequeñas porciones. Se preparó una placa de fondo plano (transparente) de paredes blancas de 96 pocillos añadiendo 18 ul de Matrigel frío (Matrigel (734-1101, CorningNWR). La placa se incubó durante 2 min a 37 °C antes de que se añadieran las porciones de tumor (por triplicado). Se añadieron 33 ul de Matrigel frío por pocillo y la placa se incubó de nuevo durante 2 min a 37 °C. Se añadieron 50 ul de dilución de anticuerpo (en medio de Jurkat sin higromicina, pero que contenía 2X penicilina/estreptomicina) por pocillo y la placa se incubó durante aproximadamente 48 horas a 37 °C, un 5 % de CO2.

Se obtuvieron células indicadoras Jurkat-NFAT y se evaluó la viabilidad usando ViCell. Las células se centrifugaron a 350 x g, 7 min antes se resuspendieron en medio de Jurkat sin higromicina y se añadieron 50 |jl por pocillo (50.000 células/pocillo). La placa se incubó durante 5 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada antes de sacarla para la lectura de luminiscencia. Se transfirieron 80 ul de cada pocillo a una placa de 96 pocillos de paredes blancas. Se añadieron 27 jl/pocillo de solución ONE-Glo a cada pocillo y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se detectó luminiscencia usando el lector WALLAC Victor3 ELISA (PerkinElmer2030), 1 s/pocillo como tiempo de detección. Las células indicadoras Jurkat NFAT se activan después de la coincubación con TCB frente a FolR1 (6298) y TCB frente a FolR1 activado por proteasa que contiene el sitio de escisión de MMP9-matriptasa (8364). Los TCB frente a FolR1 activados por proteasa (8363, 8408) y los TCB de control (8409, 7235) no inducen la expresión de luciferasa. La línea punteada indica la luminiscencia de referencia para células Jurkat NFAT coincubadas con tumor (FIG. 40).

Ejemplo 22

Estabilidad en suero de TCB activados por proteasa

Electroforesis capilar de TCB activados por proteasa después de su incubación en suero humano.

Las moléculas se incubaron durante 0 o 14 días en suero humano deficitario en IgG a 37 °C en una estufa de incubación humidificada (un 5 % de CO₂). Todas las moléculas se purificaron por cromatografía de afinidad (proteína A) y, a continuación, se analizaron por electroforesis capilar.

Se añadieron 100 ug de cada molécula en tampón (tampón histidina (Bichsel) con Tween-20 al 0,01 %) o bien en suero humano (deficitario en IgG, SP1839, TL-15216, 16FSP63814). La concentración de las moléculas fue mayor de 2 mg/ml y la concentración final fue de 0,5 mg/ml. El pretratamiento para una molécula (8408) se realizó con rhmatriptasa (R&D Systems) durante 24 h a 37 °C, un 5 % de CO2 en una estufa de incubación humidificada (de otro modo, el pH del suero podría cambiar). Las muestras del día 0 se congelaron directamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Las muestras del día 14 se incubaron durante 14 días a 37 °C, un 5 % de CO2, en una estufa de incubación humidificada hasta que también se congelaron instantáneamente.

Antes del análisis por EC-SDS, todas las muestras se purificaron por medio de cromatografía de afinidad-HPLC (Agilent Technologies, serie 1200, columna: Upchurch scientific C-130B, material de relleno: Applied Biosystems POROS 20A, 60 |jl, tampón: Tris 10 mM, glicina 50 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0 y pH 2,0, volumen de inyección: 100 jl, caudal 1 ml/min, recogida: basada en picos, neutralización: fosfato de Na 0,5 M, pH 8,0, 10 % en volumen). El TCB activado por proteasa es estable en suero humano deficitario en IgG durante un mínimo de 14 días (FIGS.

41A-C).

Ejemplo 23

Diseño de moléculas biespecíficas para linfocitos T (TCB) anti-Her2/anti-CD3 y anti-FolR1/anti-CD3 con scFv anti-CD3

Se diseñan varias moléculas biespecíficas para linfocitos T (TCB) y se representan esquemáticamente en las FIGS.

42A-F con su respectivo número de ID. Se diseñaron las siguientes moléculas:

ID 8955: "IgG 2+1 frente a Herceptarg, formato clásico, variantes cargadas frente a Herceptarg, CD3 cruzado (scFv antiidiotípico 4.32.63 - MMP9-matriptasa MK062 - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a Herceptarg - Fc inerte) con scFv anti-CD34.32.63 fusionado N terminal y MMP9-matriptasa MK062" (FIG. 42A, SEQ ID NO 81, 132, 133 y 136).

ID 8957: "IgG 2+1 frente a Herceptarg, formato clásico, variantes cargadas frente a Herceptarg, CD3 cruzado (scFv antiidiotípico 4.32.63 - conector de GS no escindible - CD3 - fusionado N terminal a VH frente a Herceptarg - Fc inerte) con scFv anti-CD34.32.63 fusionado N terminal y conector de GS no escindible" (FIG. 42B, SEQ ID NO 81, 132, 133 y 135).

ID 8959: "IgG 2+1 frente a Herceptarg, formato clásico, variantes cargadas frente a Herceptarg, CD3 cruzado (IgG frente a Herceptarg con CD3 - fusionado N terminal a VH frente a Herceptarg - Fc inerte)" (FIG. 42C, SEQ ID NO 81, 132, 133 y 134).

ID 8997: "IgG 2+1, 36F2, frente a FolR1, formato clásico, variantes cargadas, 36F2, frente a FolR1, CD3 cruzado (scFv antiidiotípico 4.32.63 - MMP9-matriptasa MK062 - CD3 - fusionado N terminal a VH, 36F2, frente a FolR1 -Fc inerte) con scFv anti-CD3 4.32.63 fusionado N terminal y MMP9-matriptasa MK062" (FIGS. 42D, SEQ ID NO 81, 137, 138 y 139).

ID 8998: "IgG 2+1, 36F2, frente a FolR1, formato clásico, variantes cargadas, 36F2, frente a FolR1, CD3 cruzado (scFv antiidiotípico 4.32.63 - conector de GS no escindible - CD3 - fusionado N terminal a VH, 36F2, frente a FolR1 - Fc inerte) con scFv anti-CD34.32.63 fusionado N terminal y conector de GS no escindible" (FIGS. 42E, SEQ ID NO 81, 137, 138 y 140).

ID 8996: "IgG 2+1, 36F2, frente a FolR1, formato clásico, variantes cargadas, 36F2, frente a FolR1, CD3 cruzado (IgG, 36F2, frente a FolR1 con CD3 - fusionada N terminal a VH, 36F2, frente a FolR1 - Fc inerte)" (FIG. 42F, SEQ ID NO 81, 137, 138 y 141).

Los dominios variables se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con los dominios preinsertados en el respectivo vector de expresión de mamífero receptor. Se controla la expresión de proteínas por un promotor de MPSV o CMV (para Herceptarg) y una secuencia señal de poli A sintética está presente en el extremo 3' de la CDS. Además, cada vector contiene una secuencia OriP del VEB.

Ejemplo 24

Citotoxicidad de células primarias mediada por TCB frente a FolR1 activado por proteasa

La destrucción de linfocitos T mediada por la molécula de TCB frente a FolRI activado por proteasa se evaluó en líneas de células primarias que expresaban bajos niveles de FolR1 (FIG. 43). Se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos a partir de capas leucocíticas obtenidas de donantes humanos sanos. La capa leucocítica se diluyó 1:1 con p Bs estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción, temperatura ambiente), la interfase que contenía PBMC se transfirió a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación durante aproximadamente 2 - 3 minutos a 37 °C, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron durante 10 minutos a 350 x g. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 %, 1X GlutaMax y DMSO al 10 %. Los p Bm C se congelaron lentamente en recipientes de congelación celular CoolCell® (BioCision) a -80 °C y, a continuación, se transfirieron a nitrógeno líquido. Un día antes del inicio del ensayo, las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1X GlutaMax). Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante aproximadamente 20 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Aproximadamente 20 h antes del inicio del ensayo, los PBMC se descongelaron en medio RPMI1640 (FCS al 10 %, 1X GlutaMax). Los PBMC se centrifugaron a 350 g durante 7 min. El sedimento se resuspendió en medio recién preparado (RPMI1640, FCS al 10 %, 1X GlutaMax) y se incubó durante un máximo de 24 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. El día del inicio del ensayo, se obtuvieron los PBMC y se centrifugaron a 350 g durante 7 min. El sedimento se resuspendió en medio de ensayo y se añadieron 0,2 millones de PBMC en 100 ul/pocillo (E:T 10:1, en base al número de células diana sembradas) a las células diana. Las moléculas se diluyeron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1 X GlutaMax) y se añadieron 50 ul/pocillo a las concentraciones indicadas por triplicado antes de que se incubaran las placas durante aproximadamente 48 h, 72 h o 96 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Se evaluó la destrucción de células diana después de 48 h, 72 h y 96 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO2 por cuantificación de la liberación de LDH en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644793001). La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 % 20 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB.

La toxicidad de células epiteliales bronquiales humanas mediada por PBMC humanos y 100 nM o 10 nM de TCB frente a FolR1 es mayor en comparación con el TCB activado por proteasa.

Ejemplo 25

Citotoxicidad de células diana negativas para FolRI mediada por TCB frente a FolRI activado por proteasa

La destrucción de linfocitos T mediada por la molécula de TCB frente a FolR1 activado por proteasa se evaluó en la línea celular Mkn-45 negativa para FolR1 (FIG. 44). Se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humanos a partir de capas leucocíticas obtenidas de donantes humanos sanos. La capa leucocítica se diluyó 1:1 con PBS estéril y se dispuso en capas sobre un gradiente Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, sin interrupción, temperatura ambiente), la interfase que contenía PBMC se transfirió a un nuevo tubo Falcon que posteriormente se llenó con 50 ml de PBS. La mezcla se centrifugó (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se resuspendió en 2 ml de tampón ACK para la lisis de eritrocitos. Después de la incubación durante aproximadamente 2 - 3 minutos a 37 °C, los tubos se llenaron con PBS estéril hasta 50 ml y se centrifugaron durante 10 minutos a 350 x g. Esta etapa de lavado se repitió una vez antes de la resuspensión de los PBMC en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 %, 1X GlutaMax y DMSO al 10 %. Los PBMC se congelaron lentamente en recipientes de congelación celular CoolCell® (BioCision) a -80 °C y, a continuación, se transfirieron a nitrógeno líquido. Un día antes del inicio del ensayo, las células diana adherentes se obtuvieron con tripsina/EDTA, se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1X GlutaMax). Las células diana se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células/pocillo usando placas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante aproximadamente 20 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Aproximadamente 20 h antes del inicio del ensayo, los PBMC se descongelaron en medio RPMI1640 (FCS al 10 %, 1X GlutaMax). Los PBMC se centrifugaron a 350 g durante 7 min. El sedimento se resuspendió en medio recién preparado (RPMI1640, FCS al 10 %, 1X GlutaMax) y se incubó durante un máximo de 24 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. El día del inicio del ensayo, se obtuvieron los PBMC y se centrifugaron a 350 g durante 7 min. El sedimento se resuspendió en medio de ensayo y se añadieron 0,2 millones de PBMC en 100 ul/pocillo (E:T 10:1, en base al número de células diana sembradas) a las células diana. Las moléculas se diluyeron en medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, 1 X GlutaMax) y se añadieron 50 ul/pocillo a las concentraciones indicadas por triplicado antes de que se incubaran las placas durante aproximadamente 48 h y 72 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Se evaluó la destrucción de células diana después de 48 h, 72 h y 96 h de incubación a 37 °C, un 5 % de CO2 por cuantificación de la liberación de LDH en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11644793001). La lisis máxima de las células diana (= 100 %) se logró por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 % 20 h antes de la lectura de LDH. La lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin ningún TCB. El TCB activado por proteasa no indujo ninguna destrucción de células diana a 100 nM.

Secuencias ejemplares

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Aunque la invención anterior se ha descrito con algo de detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de entendimiento, no se deben interpretar las descripciones y ejemplos como limitantes del alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa que comprende

(c) un resto de enmascaramiento fijado covalentemente a la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa a través de un conector escindible por proteasa, en el que el resto de enmascaramiento se puede unir específicamente al idiotipo del primer o del segundo resto de unión a antígeno, ocultando, de este modo, de forma reversible el primer o el segundo resto de unión a antígeno, en el que el resto de enmascaramiento es un scFv antiidiotípico.

2. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la reivindicación 1, en la que el resto de enmascaramiento está fijado covalentemente al primer resto de unión a antígeno y oculta de forma reversible el primer resto de unión a antígeno.

3. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la reivindicación 1 o 2, en la que el resto de enmascaramiento está fijado covalentemente a la región variable de la cadena pesada del primer resto de unión a antígeno.

4. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana seleccionado del grupo que consiste en FolR1, HER1, HER2 y mesotelina.

5. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico.

6. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable.

7. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la reivindicación 6, en la que el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, específicamente una IgG1 o IgG4.

8. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en la que el dominio Fc presenta afinidad de unión reducida por un receptor Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural.

9. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el resto de enmascaramiento comprende una región variable de la cadena pesada que comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada CDR H1 de SYGVS (SEQ ID NO: 26);

(e) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de AATFLAD (SEQ ID NO: 30); y

(f) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHYYSTPYT (SEQ ID NO: 31).

10. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el conector escindible por proteasa comprende al menos una secuencia de reconocimiento de proteasa.

11. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de la reivindicación 10, en la que el conector escindible por proteasa comprende la secuencia de reconocimiento de proteasa RQARVVNG (SEQ ID NO: 36).

12. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende:

a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada CDR H1 de TYAMN (SEQ ID NO: 44);

b) una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de RIRSKYNNYATYYADSVKG (SEQ ID NO: 45); y c) una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 46); y una región variable de la cadena ligera que comprende:

d) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de GSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 17);

e) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de GTNKRAP (SEQ ID NO: 18); y

f) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 19).

13. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a CD3 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.

14. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el segundo resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a FolR1 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende:

a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada CDR H1 de NAWMS (SEQ ID NO: 14);

b) una secuencia de aminoácidos de CDR H2 de RIKSKTDGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 15); y

c) una secuencia de aminoácidos de CDR H3 de PWEWSWYDY (SEQ ID NO: 16); y una región variable de la cadena ligera que comprende:

d) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (CDR L) 1 de GSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 17); e) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de GTNKRAP (SEQ ID NO: 18); y

f) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 19).

15. Un polipéptido específico de idiotipo para ocultar de forma reversible un sitio de unión a antígeno anti-CD3 de una molécula, en el que el polipéptido específico de idiotipo es un scFv antiidiotipo, en el que el polipéptido específico de idiotipo está fijado covalentemente a la molécula a través de un conector peptídico.

16. El polipéptido específico de idiotipo de la reivindicación 15, en el que el conector es un conector escindible por proteasa.

17. El polipéptido específico de idiotipo de la reivindicación 15 o de la reivindicación 16, en el que el conector peptídico comprende al menos un sitio de reconocimiento de proteasa.

18. El polipéptido específico de idiotipo de la reivindicación 17, en el que el conector escindible por proteasa comprende la secuencia de reconocimiento de proteasa RQARVVNG (SEQ ID NO: 36).

19. El polipéptido específico de idiotipo de una cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18, en el que la molécula es una molécula biespecífica activadora de linfocitos T.

20. El polipéptido específico de idiotipo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende:

(e) una secuencia de aminoácidos de CDR L2 de AATFLAD (SEQ ID NO: 30); y

(f) una secuencia de aminoácidos de CDR L3 de QHYYSTPYT (SEQ ID NO: 31).

21. Una composición farmacéutica que comprende la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el polipéptido específico de idiotipo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, el polipéptido específico de idiotipo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 o la composición farmacéutica de la reivindicación 21 para su uso como un medicamento.

23. La molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en la que el medicamento es para tratar o retrasar la progresión del cáncer, tratar o retrasar la progresión de una enfermedad inmunomediada, o potenciar o estimular una respuesta o función inmunitaria en un individuo.

24. Un polinucleótido aislado que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el polipéptido específico de idiotipo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20.

25. Un vector, en particular, un vector de expresión, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 24.

26. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 24 o el vector de la reivindicación 25.

27. Un procedimiento de producción de una molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa o un polipéptido específico de idiotipo, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 26 en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa o el polipéptido específico de idiotipo y b) recuperar la molécula biespecífica activadora de linfocitos T activable por proteasa o el polipéptido específico de idiotipo.