JPH11507535A

JPH11507535A - 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類

Info

Publication number: JPH11507535A
Application number: JP9502046A
Authority: JP
Inventors: ゴールドスタイン，ニール，アイ．; ジョージオ，ニコラス，エー．; ジョーンズ，スティーブン，タラーン; サルダンハ，ヨーゼ，ウィリアム
Original assignee: ImClone Systems Inc
Current assignee: ImClone LLC
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-07-06
Also published as: JP2009062375A; JP2006246896A; EP0831880A1; WO1996040210A1; EP0831880A4; AU6267896A; CA2222231A1

Abstract

(57)【要約】腫瘍治療のための抗ＥＧＦレセプター抗体２２５およびそれらのフラグメントのキメラ化およびヒューマナイズ化物。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類本出願は１９９５年６月７日出願の特許願第０８／４８２，９８２号の一部継続出願である１９９５年１２月１５日出願の特許願第０８／５７３，２８９号の更なる一部継続出願であり、これら両方の開示を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。発明の分野本発明はある種の腫瘍細胞の成長を抑制するのに有用な抗体類および抗体フラグメント類に関する。発明の背景最近の研究によって、ヒト悪性疾患の病因および進行における成長因子レセプター・チロシンキナーゼ類の重要な役割が解明されるに至っている。これら生体レセプターはそれらを発現する細胞膜中のトランスメンブラン・ドメインによりアンカーされている。細胞外ドメインが成長因子に結合するのである。成長因子が細胞外ドメインに結合すると、シグナルが細胞内キナーゼ・ドメインに伝達される。このシグナル伝達が、細胞の増殖および分化をもたらす事象に寄与する。表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプター・ファミリーのメンバーは、重要な成長因子レセプター・チロシンキナーゼ類である。ＥＧＦレセプター・ファミリーで発見された第１のメンバーは、見掛け分子量約１６５ｋＤを有する糖蛋白質であった。この糖蛋白質は、メンデルソーン[Mendelsohn]らの米国特許第４，９４３，５３３号に記述されており、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）として知られているものである。ＥＧＦＲリガンドがＥＧＦレセプターに結合すると細胞の成長につながる。ＥＧＦおよびトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）はＥＧＦＲの２つの公知のリガンドである。多くのレセプター・チロシンキナーゼ類がヒト腫瘍中に異常に多数発見されている。たとえば、上皮起源の多くの腫瘍がそれらの細胞膜上に高レベルのＥＧＦレセプターを発現する。ＥＧＦレセプターを発現する腫瘍の例としては、膠芽腫、ならびに肺、胸、頭および首、ならびに膀胱の癌などがある。腫瘍細胞膜上のＥＧＦレセプターの増幅および／または過発現が予知の難しさに関係する。腫瘍抗原に対する抗体、特にモノクローナル抗体が可能性のある抗癌剤として追究されている。それら抗体は多くのメカニズムを通して腫瘍の成長を抑制する。たとえば、抗体は抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）により免疫学的に腫瘍の成長を抑制する。あるいは、抗体が成長因子のレセプターへの結合に競合することもある。そのような競合がレセプターを発現する腫瘍の成長を抑制する。別のアプローチでは、毒素を腫瘍抗原に対する抗体に接合させる。抗体部分がその接合体を腫瘍に向かわせ、腫瘍が毒素部分で殺される。たとえば、米国特許第４，９４３，５３３号は、ＥＧＦレセプターに結合する２２５と呼ばれるマウスモノクローナル抗体について記述している。この特許はカリフォルニア大学に譲渡され、イムクローン・システムズ社[ImCIoneSystems Incorporated]に排他的実施権を供与されている。この２２５抗体は、培養ＥＧＦＲ発現腫瘍系の成長の抑制、ならびにヌードマウスに異種移植されて成長するこれら腫瘍のｉｎｖｉｖｏでの成長を抑制することができる。しかしながら、第一相臨床試験では、ヒトに３００mgまでのマウス２２５抗体を投与しても臨床的応答は観察されなかった。ディブジ[Divgi]ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８３，９７−１０４（１９９１）参照。マスイ[Masui]ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４４，５５９２−５５９８（１９８６）参照。さらに最近では、２２５にドキソルビシンまたはシス−プラチンを混成した治療体系が、マウスに十分に樹立されたヒト異種移植モデルのいくつかに対して治療の相乗効果を示している。バサルガ[Basalga]ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８５，１３２７−１３３３（１９９３）。マウスモノクローナル抗体をヒトの治療に使用することの不都合な点は、マウスＩｇ配列の存在によるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の可能性があることである。この不都合は、マウス（またはその他の非ヒト哺乳類）抗体の全不変部をヒトの不変部と置き換えることによって低減させることができる。マウス抗体の不変部をヒトの配列で置き換えることは通常キメラ化（キメライゼーション）と呼ばれている。このキメラ化プロセスはまた、マウス抗体の超可変部または相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変部を、対応するヒト配列で置き換えることによってより効果的に行うことができる。ＣＤＲ以外の可変部は、また可変フレームワーク領域（ＦＲ）としても知られている。不変部および非ＣＤＲ可変部をヒトの配列と置き換えることは、通常ヒューマナイズ化（ヒューマナイゼーション）と呼ばれている。このヒューマナイズ化抗体は、より多くのマウス配列がヒト配列で置き換えられることによって、免疫抗原性が少なくなる（すなわち、ＨＡＭＡ応答の出現が少ない）。不都合なことに、ヒト配列に置き換えるマウス抗体の領域が多くなればなるほど、そのコストと作業はともに増加する。抗体の免疫原性を減らす別の方法は、抗体フラグメントを使用することである。たとえば、アバウド−ピラク[Aboud-Pirak]ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，８０，１６０５−１６１１（１９８８）による論文では、１０８．４と呼ばれる抗ＥＧＦレセプター抗体を、抗体フラグメントの抗腫瘍効果と比較している。この腫瘍モデルはヌードマウスにおけるＫＢ細胞の異種移植をベースとしたものである。ＫＢ細胞はヒト口腔類表皮癌から得られ、高レベルのＥＧＦレセプターを発現する。アバウド−ピラク[Aboud-Pirak]らは、抗体および二価Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントはともにｉｎｖｉｖｏでの腫瘍成長を遅らせたが、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントは効果が少なかったことを見出している。この抗体の一価Ｆａｂフラグメントは細胞関連のレセプターへの結合能力は保存されていたが、腫瘍成長を遅らせることはなかった。したがって、効果的かつ安価に生産でき、ヒトに対する免疫原性が少ないかまたは全くなく、腫瘍細胞上に多数発現されるレセプターへの結合能力があり、それら成長因子のレセプターに対する結合を遮断する能力を有する改良された抗腫瘍剤に対する必要性が切望されている。本発明の一目的は、モノクローナル抗体、抗体フラグメントおよび単鎖抗体の有利な特性を併せ持つそうした新しい抗腫瘍剤の発見にある。発明の概要これらおよびその他の目的は、当分野の通常の技術者には明らかとなるように、抗体の不変部および可変軽鎖が欠失したポリペプチドを提供することにより達成されたが、このポリペプチドはＮＹＧＶＨ（配列番号：１）、ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲ（配列番号：２）、またはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳ（配列番号：３）のアミノ酸配列を有するものである。このポリペプチドは腫瘍成長を抑制する分子などのエフェクター分子に接合させることができる。本発明はさらにそれらポリペプチド類をコードするＤＮＡにも関する。本発明はまた、ＮＹＧＶＨ、ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲ、またはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳのアミノ酸配列で構成されたポリペプチド類も含む。本発明はまた、ヒト抗体の不変部と、ドキソルビシン、タキソール、またはシスージアミンジクロロ白金（シスプラチン）などの細胞毒素剤に接合されたモノクローナル抗体２２５の可変部を有する分子も含む。本発明はさらに抗体の可変軽鎖の不変部が欠失したポリペプチド（このポリペプチドはアミノ酸配列ＮＹＧＶＨ、ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲ、またはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳを有する）の有効量をヒトに投与することを特徴とするヒトにおける腫瘍細胞の成長を顕著に抑制する方法も包含する。別の観点から見た場合、本発明はアミノ酸配列ＮＹＧＶＨ、ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲ、またはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳで構成されたポリペプチドの有効量をヒトに投与することを特徴とするヒトにおける腫瘍細胞の成長を著しく抑制する方法に関する。本発明はさらに、ヒトにおけるＥＧＦレセプターを発現する腫瘍細胞の成長を顕著に抑制する方法も含む。この方法は、ヒト抗体の不変部とモノクローナル抗体２２５の可変部を有する分子の有効量を、化学療法剤などの細胞毒性分子の存在下および非存在（特に非存在下）の両方において、ヒトに投与することを特徴とする。図の説明図１は、ヌードマウスに樹立されたＡ４３１腫瘍の異種移植片の成長に対する２２５の効果を示す。実験動物の脇腹に１０⁷個の細胞を注射した。腫瘍が平均容積２−３００mm³に到達した時点で、ＰＢＳまたは１mg／検体の２２５を、週２回５週間投与する治療を開始した。腫瘍の容積および緩解指数（ＲｅｍｉｓｓｉｏｎＩｎｄｅｘ：ＲＩ）は“実施例”部分での説明のようにして決定した。図２は、ヌードマウスに樹立されたＡ４３１腫瘍の異種移植片の成長に対する２２５およびキメラ化２２５（Ｃ２２５）の効果を示す。実験動物には１mg／マウスのＰＢＳを、週２回５週間与えた。Ａ：平均腫瘍容積；Ｂ：緩解指数。３７日目におけるＰＢＳ対照群における明らかな腫瘍の退行は、対照群１０匹中の３匹の死亡と、それに伴う合計腫瘍容積の減少によるものである。図３は、ヌードマウスに樹立されたＡ４３１腫瘍の異種移植片の成長に対するＣ２２５の効果を示す。実験動物には１mgのＣ２２５またはＰＢＳを、週２回５週間与えた。Ｃ２２５群の平均腫瘍容積は対照に比べて統計的に有意な生物学的効果を示した（本文参照）。Ａ：平均腫瘍容積（星印は対照との統計的有意差を示す）、Ｂ：緩解指数。図４は、ヌードマウスに樹立されたＡ４３１異種移植片の成長に対するＣ２２５の容量応答性である。実験動物には、材料と方法の項に説明するように、ＰＢＳ、１、０．５、または０．２５mg／動物を週２回、５週間与えた。１mg／用量のＣ２２５で治療した動物は、対照に比べて統計的に有意な生物学的効果を示した（本文参照）。Ａ：平均腫瘍容積（星印は対照との統計的有意差を指す）、Ｂ：緩解指数。２５０μｇ用量グループの４７日目のＲＩの低下は、明らかに腫瘍がなかった動物における腫瘍の再発によるものである（このケースでは、Ｃ２２５の効果は一時的なものであった）。図５は、Ｃ２２５ならびにモノクローナル抗体２２５の重鎖ＣＤＲ−１と重鎖ＣＤＲ−２によるＡ４３１細胞の抑制を示す。図６は、Ａ４３１細胞のＣ２２５−ドキソルビシン接合体の濃度を関数としたｉｎ、ｖｉｖｏにおける抑制を示す。図７は、ヒト前立腺癌細胞に対するＥＧＦＲ発現のＦＡＣＳ分析である。ＬＮＣａＰ（アンドロゲン依存性ヒト前立腺癌）、ＤＵ１４５およびＰＣ−３（アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌）、ならびにＡ４３１（ヒト類表皮癌）細胞を増殖フラスコからＥＤＴＡにより取り出し、Ｃ２２５で染色したもの。データは抗原発現の間接的尺度であるＭＦＩ（平均蛍光強度）で示した。この図に示されている結果は少なくとも５回の実験の結果を表わしている。図８は、Ｃ２２５によるＥＧＦＲのＥＧＦ誘発リン酸化の抑制を示す。ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、およびＰＣ−３単層を、Ｃ２２５の存在下または非存在下でＥＧＦで刺激した。細胞を溶離し、ＳＤＳＰＡＧＥに付し、ブロッティングし、そしてＰＴｙｒに対するマウスモノクローナル抗体（レークプラシドのＵＢＩ製）を用いてスクリーニングした。レーンＡ：添加なし（ＥＧＦＲリン酸化の基底レベル）；レーンＢ：Ｃ２２５の非存在下、室温で１５分間１０ng／mlのＥＧＦによりＥＧＦＲを刺激；レーンＣ：１０μｇ／mｌのＣ２２５の存在下でＥＧＦによりＥＧＦＲを刺激したもの。図９は、樹立されたＤＵ１４５異種移植片のＣ２２５による成長抑制を示す。マトリゲルに加えたＤＵ１４５細胞１００万個をヌードマウス（オス、nu／nu）に接種した。腫瘍が平均容積約１００mm³（２０日目）に到達した後、動物を無作為抽出し（１群当たり１０匹）、ＰＢＳ（対照）またはＣ２２５（０．５mg／用量、１０ｘ）のいずれかで処理した。動物を３５日間治療し、さらに３週間追跡した。腫瘍のない、または小さな腫瘍を抱えたマウスについてはさらに３ヵ月間維持した。有意性（図３Ａに星印で示されている）はスチューデントのＴ検定により判定し、ｐ値＜０．５で有意性があると認められた。Ａ：平均腫瘍容積；Ｂ：ＰＢＳ群における腫瘍の成長特性；Ｃ：Ｃ２２５処理群における腫瘍の成長特性。図１０は、腫瘍の消失および生存に関するＣ２２５の効果である。本検討中における腫瘍の完全な消失は緩解指数（ＲＩ）で規定した。本研究中の動物の死亡は治療の失敗と見なし、本分析に含めた。Ａ：緩解指数；Ｂ：生存曲線。図１０の白丸および黒丸は図９と同じ意味である。図１１は、キメラＣ２２５および再形成ヒトＨ２２５抗体のカッパー（κ）軽鎖の発現用に使用したｐＫＮ１００哺乳類発現ベクターの概略図である。図１２は、キメラＣ２２５および再形成ヒトＨ２２５抗体の重鎖の発現用に使用したｐＧ１Ｄ１０５哺乳類発現ベクターの概略図である。図１３は、Ｍ２２５抗体のカッパー軽鎖可変部のＤＮＡ配列（配列番号：４）およびペプチド配列（配列番号：５）である。この情報を得たＰＣＲクローン類は縮重プライマーＭＫＶ４（配列番号：６）（７）を使用して増幅して得た。図１４は、Ｍ２２５抗体の重鎖可変部のＤＮＡ配列（配列番号：７）およびペプチド配列（配列番号：８）である。この情報を得たＰＣＲクローン類は縮重プライマーＭＨＶ６（配列番号：９）（７）を使用して増幅して得た。図１５は、Ｃ２２５抗体のカッパー軽鎖可変部のＤＮＡ配列（配列番号：１０）およびペプチド配列（配列番号：１１）である。図１６は、Ｃ２２５抗体の重鎖可変部のＤＮＡ配列（配列番号：１２）およびペプチド配列（配列番号：１３）である。図１７は、Ｌ７’ＣＬ抗体（２８）のカッパー軽鎖からの修飾リーダー配列を持つＣ２２５抗体のカッパー軽鎖可変部のＤＮＡ配列（配列番号：１４）およびペプチド配列（配列番号：１５）である。図１８は、Ａ４３１細胞表面に発現された上皮成長因子レセプターに対するキメラＣ２２５および再形成ヒトＨ２２５（２２５ＲＫ_A／２２５ＲＨ_A）の結合親和力を測定するための細胞ＥＬＩＳＡの結果の典型的な例である。図１９は、再形成ヒトＨ２２５抗体のカッパー軽鎖可変部の第１バージョン（２２５ＲＫ_A）のＤＮＡ配列（配列番号：１６）およびペプチド配列（配列番号：１７）である。図２０は、再形成ヒトＨ２２５抗体の重鎖可変部の第１バージョン（２２５ＲＨ_A）のＤＮＡ配列（配列番号：１８）およびペプチド配列（配列番号：１９）である。図２１は、再形成ヒトＨ２２５抗体のカッパー軽鎖可変部の２つのバージョン（２２５ＲＫ_Aおよび２２５ＲＫ_B）のアミノ酸配列（配列番号：２０）、（配列番号：２１）、（配列番号：２２）、（配列番号：２３）である。残基はカバット[Kabat]ら（２０）にしたがって番号付けした。再形成ヒト・フレームワーク中に保存されているマウス・フレームワーク残基は太字で示した。図２２は、再形成ヒトＨ２２５抗体の重鎖可変部の５つのバージョン（２２５ＲＨ_A、２２５ＲＨ_B、２２５ＲＨ_C、２２５ＲＨ_D、２２５ＲＨ_E）のアミノ酸配列（配列番号：２４）、（配列番号：２５）、（配列番号：２６）、（配列番号：２７）、（配列番号：２８）、（配列番号：２９）、（配列番号：３０）である。残基はカバット[Kabat]ら（２０）にしたがって番号付けした。再形成ヒト・フレームワーク中に保存されているマウス・フレームワーク残基は太字で示した。発明の詳細な説明本発明はその一面において、抗体の不変部と可変軽鎖が欠失したポリペプチドに関し、当該ポリペプチドはモノクローナル抗体２２５の第１および第２重鎖の相補性決定領域を含む。これらの相補性決定領域は以下のアミノ酸配列を有する：ＣＤＲ−１：ＮＹＧＶＨ（配列番号：１）ＣＤＲ−２：ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲ（配列番号：２）上記の第１および第２相補性決定領域を含有するペプチドは当分野で公知の方法により得ることができる。たとえば、このポリペプチド類はそのポリペプチドをコードするＤＮＡを適当な宿主中にて発現させ、単離することができる。このＤＮＡは当分野で周知の方法により４つのヌクレオチド類の全部または一部から化学的に合成することができる。そうした方法としては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，２８１−２８５（１９８５）のカルーサーズ[Caruthers]記述の方法がある。このＤＮＡはまたマウスモノクローナル抗体２２５からも得ることができ、これについてはメンデルソーンらの米国特許第４，９４３，５３３号に記述されている。この抗体はメリーランド州ベセスダの米国基準株保存機関（ＡＴＣＣ）に、１９９５年６月７日に寄託されている（寄託番号１１９３５）。抗体の可変重鎖領域を得る方法は当分野では公知である。そうした方法としてはたとえば、ボス [Boss]（セルテック社[Celltech]）およびカビリー[Cabilly]（ジェネンテック社[Genentech]）による米国特許に記載されているものがある。それぞれ、米国特許第４，８１６，３９７号および第４，８１６，５６７号参照。本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、さまざまなクローニングおよび発現ベクターで広範な種類の宿主細胞に挿入して複製およびリコンビナント蛋白質を発現させるために使用することができる。宿主は原核生物でも真核生物でもよい。このポリペプチドは、ＮＹＧＶＨ、ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲ、またはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳのいずれかを含む。あるいはこのポリペプチドは、ＮＹＧＶＨ配列と、ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲまたはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳの配列のいずれかとを含むものでもよい。このポリペプチドはまたエフェクター分子に接合することもできる。エフェクター分子はたとえば、腫瘍成長を抑制したり、ポリペプチドが腫瘍細胞などの細胞に入らせたり、ポリペプチドを細胞中の適切な場所に向かわせるなど、種々の有用な機能を果たす分子である。エフェクター分子としては、たとえば細胞毒性分子を挙げることができる。細胞毒性分子は蛋白質、あるいは非蛋白質有機化学療法剤とすることができる。好適な化学療法剤の例としては、たとえば、ドキソルビシン、タキソール、およびシスプラチンなどがある。本発明のポリペプチドへの接合に好適なその他いくつかのエフェクター分子の例としては、シグナル導入インヒビター類、ラス（ｒａｓ）・インヒビター類、および細胞サイクル・インヒビター類がある。シグナル導入インヒビター類の例としては、ケルセチン[quercetin]（グラジエリ[Grazieri]ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，７１４，４１５（１９８１））；ラベンダスチンＡ [lavendustin A]（オノダ[Onoda]ら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５２，１２５２（１９８９））；およびハービマイシンＡ[herbimycin A]（ウシャラ[Ushara]ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，４１，８３１（１９８８））などの蛋白質チロシンキナーゼ・インヒビターがある。ラス・インヒビター類としては、ジェームス[J ames]ら、Ｓｉｅｎｃｅ，２６０，１９３７（１９９３）記述のベンゾジアゼピン・ペプチド擬似体などのラス・ファルネシレーション・インヒビター類があり、これは下記の式を有する：（式中、ＲはＨまたはＣＨ₃であり、Ｘはメチオニン、セリン、ロイシン、またはそれらのエステルまたはアミド誘導体である。）蛋白質および非蛋白質の化学療法剤を当分野で公知の方法によりポリペプチドに接合することができる。そうした方法としては、たとえば、ドキソルビシンの接合にはグリーンフィールド[Greenfield]ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５０，６６００−６６０７（１９９０）の記述の方法、ならびにプラチナ化合物の接合にはアーノン[Arnon]ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３０３，７９−９０（１９９１）およびキセレバ[Kiseleva]ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ＵＳＳＲ），２５，５０８−５１４（１９９１）などの方法がある。本発明はさらにヒト抗体の不変部、ならびにモノクローナル抗体２２５の超可変部を有する修飾抗体を含む。これらの修飾抗体は任意に細胞毒素剤などのエフェクター分子に接合されてもよい。超可変部以外の可変部はまたヒト抗体の可変部から導くこともできる。そうした抗体はヒューマナイズ化されたもの（humani zed）と呼ばれる。ヒューマナイズ化抗体を作る方法は当分野では公知である。方法としてはたとえば、ウインター[Winter]による米国特許第５，２２５，５３９号に記述されている。２２５抗体のヒューマナイズ化の最も完全な方法はＣＤＲ移植である。実施例ＩＶに記述されているように、抗原への結合に直接関与するマウス抗体の補体決定領域またはＣＤＲがヒト可変部に移植され、“再形成ヒド”可変部を作り出す。これら完全にヒューマナイズ化された可変部が次にヒト不変部に結合され、“ すべてがヒューマナイズ化された”完全な抗体を作り出す。抗原にうまく結合する完全にヒューマナイズ化された抗体を作り出すためには、再形成ヒト可変部を注意深く設計することが必要である。２２５抗体ＣＤＲが移植されるヒト可変部は注意深く選定しなければならず、通常はヒト可変部のフレームワーク領域（ＦＲ）内の重要な位置にいくつかのアミノ酸の変化を創出することが必要である。設計された再形成ヒトＨ２２５可変部は、選択したヒトカッパー軽鎖可変部のＦＲ中に１以下のアミノ酸変更と、選択したヒト重鎖可変部のＦＲ中に１２のアミノ酸変更を含む。これら再形成ヒトＨ２２５重鎖およびカッパー軽鎖可変部遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、それぞれヒトγ１およびヒトκ不変部遺伝子をコードするＤＮＡ配列に結合される。この再形成ヒトＨ２２５抗体は次に哺乳類細胞に発現し、Ａ４３１細胞表面上に発現されるヒトＥＧＦレセプターへの結合をマウスＭ２２５抗体、ならびにキメラＣ２２５抗体と比較して試験する。抗体の超可変部外の可変部もまたモノクローナル抗体２２５から誘導される。その場合、全可変部がマウスモノクローナル抗体２２５から誘導されるが、この抗体はキメラ化抗体、すなわちＣ２２５と呼はれる。キメラ化抗体を作り出す方法は当分野では公知である。そうした方法にはたとえば、ボス[Boss]（セルテック社[Celltech]）およびカビリー[Cabilly]（ジェネンテック社[Genentech]）の米国特許に記述されているものがある。それぞれ米国特許第４，８１６，３９７号および第４，８１６，５６７号参照。これら修飾抗体の不変部はヒトクラスのいずれか、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥとすることができる。上記クラスのサブクラス、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４もすべて好適であるが、この中ではＩｇＧ１が好ましい。ポリペプチドへの接合に関して上に挙げたエフェクター分子はいずれもまた本発明のキメラ化またはヒューマナイズ化抗体に接合することができる。ドキソルビシン、タキソールおよびシスプラチンが好ましい。本発明のポリペプチドおよび抗体は有効量をヒトに投与した場合に腫瘍細胞の成長を顕著に抑制する。最適用量は多くのパラメータ、たとえば年齢、性別、体重、治療する症状の程度、投与する活性成分、および投与方法などを考慮して医師が決定することができる。一般的にはＥＧＦレセプターを飽和させることができるポリペプチドおよび抗体の血清濃度が望ましい。約０．１nM以上の濃度で通常十分である。たとえば、１００mg／ｍ²のＣ２２５用量は約８日分の約２０nM の血清濃度となる。大まかなガイドラインとして、毎週１０−３００mg／ｍ²の量の抗体用量が与えられる。血清レベルをＥＧＦレセプターを飽和させる濃度以上に保つためには相当する用量の抗体フラグメントをより頻繁な間隔で使用しなければならない。投与に好適なルートは、経静脈、皮下、および筋肉内投与である。経静脈投与が好ましい。本発明のペプチドおよび抗体は薬学的に許容される追加の成分とともに投与することができる。そうした成分としてはたとえば、前述のような免疫系刺激剤および化学療法剤などがある。本発明のキメラ化およびヒューマナイズ化抗体は驚くべきことに、マウス２２５抗体とは異なり、たとえシスプラチン、ドキソルビシン、タキソールおよびそれらの誘導体などの化学療法剤を含むその他の抗腫瘍剤が存在しない場合であっても、ヒトにおける腫瘍成長を顕著に抑制することが突き止められた。顕著な抑制とは、少なくとも２０％、好ましくは３０％、そしてさらに好ましくは５０％の腫瘍縮退を意味する。最良のケースでは、腫瘍の９０％、そして１００％もの縮退が達成される。あるいは、顕著な抑制とはＲＩが０．３以上、好ましくは０．４以上、そしてさらに好ましくは０．５以上を意味するとしてもよい。腫瘍成長の顕著な抑制および／またはＲＩの増加は多くの形で現れる。たとえば、寿命の延長および／またはそれまで激しく進行していた腫瘍成長の安定化といったことである。患者に化学療法剤の治療を継続するには副作用が激しすぎるといったケースでは、Ｃ２２５を化学療法剤に置き換えることができ、それらに匹敵する結果を得ることができる。たとえば、実施例ＩＩＩ−１に示されている結果は、２２５とＣ２２５のｉｎｖｉｔｒｏの抑制特性は同程度であるものの、これら抗体のｉｎｖｉｖｏの効果は著しく異なることを示している。抗体のアイソタイプは２２５とＣ２２５の間に見られる差には重要な役割を果たしていない（たとえば、マウスＩｇＧ１対ヒトＩｇＧ１）。最近の報告書では、２２５もＣ２２５いずれも補体介在の溶離を誘発することは全くなく、これら抗体のＡＤＣＣ反応性は種特異性と思われると報告している。ナラムラ[Naramura]ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３７，３４３−３４９（１９９３）。したがって、Ａ４３１異種移植の抑制が免疫応答によって仲介されたものであったならば、２２５はＡＤＣＣに関与するマウスエフェクター細胞を活性化する能力があることから、抗体としてもっと作用したはずである。しかし実際はそうはなっていない。加えて、２２５またはＣ２２５による治療に対する同一群の個々の動物には応答の様子に差異が見られる。Ｃ２２５単独の場合には１mg用量で完全な腫瘍減退を誘発させるのに非常に効果的であるのに対し、この用量レベルの２２５ではごく僅かの効果しか示していない。実施例ＩＩＩ−１の実験２および３においては各検討の最後の時点では約４０％の動物に腫瘍がなかった。それらグループで応答した動物は通常治療プロトコルの開始時点では小さな腫瘍であったが、ここでもまた最初の腫瘍負荷がＣ２２５の生物学的効果に一定の役割を果たすことが示されている。特筆すべきは、２２５またはＣ２２５のいすれかで治療した動物はすべての検討においてＰＢＳ対照群と比べて大きな生存特性を示したことである。実施例ＩＩＩ−２に示されているように、前立腺癌はまたＣ２２５による抗ＥＧＦＲ免疫治療の介在に適当な標的である。転移性前立腺癌細胞はＴＧＦ−αならびにＥＧＦＲをともに発現するため、末期の前立腺癌は特に好適な標的となる。実施例ＩＩＩ−２はバイオヒト前立腺癌細胞のＥＧＦＲの活性化およびヌードマウスにおける前立腺異種移植の成長に対するＣ２２５の生物学的効果を説明するものである。ｉｎｖｉｔｒｏ実験は、ヒト前立腺癌細胞３系統に対するＥＧＦＲの発現レベル、ならびにレセプターの機能活性化を遮断するＣ２２５の効果を判別できるように設計された。図７は、ＬＮＣａＰ（アンドロゲン依存性）およびＰＣ−３ならびにＤＵ１４５（アンドロゲン非依存性細胞）に見られるＡ４３１細胞でのＥＧＦＲ発現レベルを比較したＦＡＣＳ分析の結果を示している。ＰＣ−３（ＭＦＩ＝１３５）およびＤＵ−１４５（ＭＦＩ＝１２４）細胞は両方とも、Ａ４３１細胞（ＭＦＩ＝７１５）よりもレセプターの発現が約７倍少なかった。ＭＦＩは抗原密度の間接的な指標であることから、ＰＣ−３およびＤＵ１４５細胞はともにそれぞれ約１０⁵レセプターを発現したと考えられる。一方ＬＮＣａＰ細胞は非常に低い表面レセプターの発現（ＭＦＩ＝１２）であった。上記のように、Ａ４３１細胞によって発現されるＥＧＦＲは細胞外添加のリガンド（ＥＧＦ）によって刺激されるが、Ｃ２２５はレセプターの活性化を排除することができる。図８は前立腺系における同様の検討結果を示している。ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３およびＤＵ１４５に対するＥＧＦの添加はＥＧＦＲのリン酸化を誘発し、これはＣ２２５によって極めて効果的に遮断された。これらのデータはＣ２２５がリガンドにより活性化されるＥＧＦＲシグナル経路を効果的に抑制し、またｉｎｖｉｖｏにおける成長に必要なＥＧＦＲ活性化に対して抗腫瘍活性を有することを示している。ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍成長を抑制するＣ２２５の能力を、無胸腺ヌードマウスに樹立されたＤＵ１４５異種移植について試験した。ＤＵ１４５細胞をマトリゲルと組み合わせて１動物当たり１０⁶細胞個接種した。動物の１００％が２０日以内に腫瘍を発現した。予備実験において１ｍｇ（１０ｘ）の用量レベルで顕著な腫瘍抑制を誘発することが示された。これらの検討では、Ｃ２２５は０．５mg（１０ｘ）用量レベルで注射された。図９に示すように、樹立されたＤＵ１４５異種移植の成長を顕著に抑制するのに効果的なのはＣ２２５だけであった（ｐ＜０．５）。全体的な治療効果は３４日目までには明らかとなり、３６日目までには対照群と比べて有意となった（図９Ａ）。擬似物注入群におけるすべての腫瘍は本検討全期間を通じて成長した（図９Ｂ）が、抗体の抗腫瘍効果は本検討期間を通じて認められた（図９Ｃ）。ＰＢＳ処理動物における自然緩解はこのモデルではまったく見られなかったが、Ｃ２２５処理動物の６０％は６０日目までは腫瘍がなく（図１０Ａ）、さらに抗体注入の終了後９０日間でも腫瘍なしの状態が継続した。加えて、Ｃ２２５群で消えなかった腫瘍は治療停止後も極めてゆっくり成長した（５５日目；図９Ｃ）が、このことはこの抗体の長期持続効果を示唆したものである。治療期間中には生存曲線に顕著な差は見られなかった（図１０Ｂ）。実施例ＩＩＩ−２はＣ２２５が明らがに、樹立されたＥＧＦＲ−陽性ＤＵ１４５異種移植の成長を抑制する能力があり、治療動物において長期的な腫瘍緩解を高率で誘発することができることを示している。これらの結果はｉｎｖｉｔｒｏデータでは予測できなかったことである。ＤＵ１４５細胞と同様のレベルでＥＧＦＲを発現するすべての細胞系がＣ２２５に対してｉｎｖｉｖｏで応答したわけではない。たとえば、ＫＢ細胞（ヒト類表皮癌）は１細胞当たり約２×１０⁵のＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦによるレセプターの活性化はＣ２２５によりｉｎｖｉｔｒｏで遮断された。しかしながらＫＢ異種移植片は、樹立されたＡ４３１腫瘍を持つ動物の１００％において完全な緩解を誘発させることができるレベルである１mg用量（×１０）のＣ２２５を含む治療には応答しなかった。驚くべきことに実施例ＩＩＩ−２に示されているように、ＤＵ１４５腫瘍細胞を接種したマウスに対する０．５mg用量（×１０）のＣ２２５単独治療では、すべての治療動物において顕著な腫瘍退行をもたらした。マウスの６０％が治療終了後に完全な緩解を示した。Ｃ２２５によるレセプター活性化の遮断はまた、ヒトにおける転移性前立腺癌の治療、特に癌の末期段階における臨床的効果を持つ可能性がある。実施例実施例Ｉ材料実施例Ｉ−１細胞系および培地Ａ４３１細胞を通常通り、ダルベッコの改変イーグル培地および１０％胎児ウシ血清、２mM Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を添加したハムのＦ−１２培地の１：１混合物中で増殖させた。アンドロゲン非依存性および依存性のヒト前立腺癌細胞系（ＤＵ１４５、ＰＣ −３およびＬＮａＰ）を、ＡＴＣＣ（メリーランド州ロックビル）から入手し、１０％胎児ウシ血清（インターゲン、ニューヨーク州パーチェス）および２mM Ｌ−グルタミン（シグマ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ミズーリ州セントルイスのシグマ社）中で通常通り維持した。マイコプラズマの存在を確認するために定期的に細胞をチェックした。実施例Ｉ−２Ｍ２２５およびＣ２２５の調製と精製２２５抗体をプリスタン・プライム処理したＢａ１ｂ／ｃマウス中で腹水として増殖させた。腹水液体はＨＰＬＣ（ＡＢＸおよびプロテインＧ）により精製し、ＳＤＳＰＡＧＥにより＞９５％の純度を有すると判定された。ヒト臨床用グレードＣ２２５を血清を含まない独自の培地中で一ロット３００リットル単位で増殖させた。分離後、濃縮肉汁を一連のクロマトグラフィ・カラムを通して精製し、無菌条件下で小瓶に詰めた。純度はＳＤＳＰＡＧＥにより＞９９％と判定された。実施例Ｉ−３ドキソルビシン−Ｃ２２５接合体の調製Ｃ２２５ドキソルビシン接合体（Ｃ２２５−ＤＯＸ）をグリーンフィールド[G reenfield]ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃh，５０，６６００−６６０７（１９９０）記述の方法の変法を用いて調製した。即ち、ドキソルビシンを架橋剤ＰＤＰＨ（３−［２−ピリジルチオ］プロピオニルヒドラジド）（ピアース・ケミカル社[Pierece Chemical Co.]）と反応させ、ドキソルビシン１３−［３−（２ −ピリジルジチオール）プロピオニル］ヒドラゾンヒドロクロリドのアシルヒドラゾン誘導体を形成させた。Ｃ２２５をＮ−サクシンイミジル３−（ピリジルジチオ）プロピオネート試薬でチオール化し、ドキソルビシンヒドラゾンと反応させて、ヒドラジドならびにジスルフィド結合を含有する接合体を形成させた。この複合体を中性pHでゲルろ過により精製した。このＣ２２５−ドキソルビシン接合体は中性からアルカリｐＨ（pH７−８）において安定であり、４℃で保存した。この接合体はpH６で容易に加水分解され、活性ドキソルビシンを放出した。実施例Ｉ−４抗体２２５のキメラ化実施例Ｉ−４ＡＨおよびＬ鎖ｃＤＮＡｓのクローニング２２５マウスハイブリドーマ細胞系を含む培地を組織培養フラスコ中で１リットルに増やした。全細胞ＲＮＡを、２−メルカプトエタノールを含むグアニジンイソチオシアネートで洗浄した溶液を溶離し、その溶液をダウンス・ホモジナイザーでせん断して細胞ＤＮＡを分解し、調製液を１０mlの塩化セシウム緩衝剤の上に広げて調製した。２４，０００rpmで１６時間遠心分離後、ペレットをトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中に再懸濁させ、エタノールで沈降させた。ポリＡ（＋）ｍＲＮＡ画分を、オリゴｄＴセルロースに結合させ溶離させることにより単離した。ｃＤＮＡライブラリを、ポリＡ（＋）ｍＲＮＡをテンプレートとし、オリゴｄＴをプライマーとして使用して調製した。第２ストランドは、ＲＮアーゼＨとＤＮＡポリメラーゼＩを使用したニック翻訳により合成した。２本鎖ＤＮＡは２mlセファロースＧ７５カラムを通過させて、オリゴｄＴおよび微量混入物を取り除いた。精製したＤＮＡを下記配列のポリリンカーに連結させた：５’−ＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡ−３’ （配列番号：３１）ただしこの配列は、クローニングベクターへの連結のためのＥｃｏＲＩ４塩基接着性末端、ならびにｃＤＮＡｓの次の操作のためのＸｈｏＩおよびＸｂａＩの制限部位をコードする。連結されたｃＤＮＡは次に５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動によりサイズ選別を行った。適当なサイズの画分（Ｈ鎖用には〜１５００bp、およびＬ鎖ｃＤＮＡ用には〜９００bp）をゲル切片がら電気的に溶離し、ＥｃｏＲＩ消化ラムダｇｔ１０ファージＤＮＡに連結した。ライブラリはｉｎｖｉｔｒｏで連結産物をパッケージし、リコンビナントファージを大腸菌株Ｃ６００ＨＦＬ株上に広げることにより作成した。ＨおよびＬのｃＤＮＡを含むファージをマウス・カッパーおよびガンマ不変部の放射標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ファージ・フィルタ・リフトにより同定した。同定されたファージを制限マップ化した。最長ｃＤＮＡ挿入を有する単離物を、プラスミドベクター（重（Ｈ）鎖可変（Ｖ）領域用にはＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント、および軽（Ｌ）鎖可変（Ｖ）領域にはＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩフラグメント）中にサブクローニングし、ＤＮＡを配列した。このサブクローニングされたフラグメントは完全なＶ領域と関連マウス不変（Ｃ）領域の小部分を含んでいる。合計８つのＬ鎖ｃＤＮＡが配列決定されたが、これらは４つの異なるｍＲＮＡｓを表わすものである。同一のＶ領域と正しいガンマ１Ｃ領域の部分をコードする３つの全長Ｈ鎖ｃＤＮＡｓが配列決定された。ガンマ２ａ配列を含むその他３つの単離物もまた同定されたが、これらについてはそれ以上調べなかった。正しいＬ鎖ｃＤＮＡを同定するために、マウス２２５抗体のサンプルを先ずＳＤＳ還元ゲル電気泳動によりＨおよびＬ鎖を分離し、膜へブロッティングした後、自動エドマン分解によって配列決定した。Ｌ鎖用に得られた配列はｃＤＮＡの１つと適合した。この単離物をＪ５に再配列したが、ＶｋＴ２と９１％相同性があることが判明した。Ｈ鎖Ｖ領域はＶＨ１０１サブグループＶＩＩ−１と９６％の相同性のあることが判明した。実施例Ｉ−４ＢｃＤＮＡの適合化と発現ベクターの構築Ｖ領域は、それぞれの本体をＶ／Ｃ結合部に最も近いユニークな制限部位とＶ領域の境界そのものの間の配列をコードする合成ＤＮＡデュプレックスに連結することにより発現に適するようにした。これに第２の短いイントロン配列を連結したが、これは連結された後Ｖ領域に対する機能的スプライス・ドナー部位を回復させた。Ｌ鎖のイントロンの末端はＢａｍＨＩ部位であり、Ｈ鎖イントロンの末端はＨｉｎｄＩＩＩ部位である。次いで適合Ｖ領域をにＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ＸｂａＩ部位はｃＤＮＡクローニングに使われた当初のリンカー中にあったもの）として単離し、一方適合Ｈ鎖Ｖ領域はＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離した。ヒトカッパーおよびヒトガンマ１不変部を含む発現ベクターｐｄＨＬ２を適合Ｌ鎖Ｖ領域の挿入に使用した。次に得られたプラスミドｐｄＨＬ２−Ｖｋ（２２５）をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、適合Ｌ鎖Ｖ領域の挿入に使用した。得られたプラスミドｐｄＨＬ２−Ｖｋ（２２５）は次にＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、適合Ｈ鎖Ｖ領域の挿入に使用した。最終的なベクターを制限マッピングによりｐｄＨＬ２−ｃｈ２２５であると同定した。実施例Ｉ−４Ｃトランスフェクト・ハイブリドーマ細胞中へのキメラ２２５の発現ｐｄＨＬ２−ｃｈ２２５プラスミドをプロトプラスト融合によりハイブリドーマＳｐ２／０Ａｇ１４細胞中に導入した。プラスミドに寄生しているバクテリアを増殖させて６００nmで０．５の最適密度とし、その時点で増殖を停止させ、がつプラスミド複製数を増幅させるためにクロラムフェニコールを添加した。翌日このバクテリアをリゾチームで処理し、細胞壁を取り除き、得られたプロトプラストをポリエチレングリコール１５００によりハイブリドーマ細胞に融合させた。融合後、この細胞を抗体中で増殖させて生存バクテリアを殺し、９６穴プレート上に塗布した。選択培地（メトトレキセート（ＭＴＸ）を０．１μＭ含有）を２４−４８時間後に添加し、発現プラスミド上に存在するマーカー遺伝子（デヒドロフォレート・レダクターゼ）の発現を利用して、トランスフェクトされた細胞だけを増殖させた。２週間後、いくつかのＭＴＸ耐性クローンを得、これらの抗体発現を試験した。培養上清を、捕捉試薬として抗ヒトＩｇ（Ｆｃ特異性）抗体で被覆したウェルに加えた。検出系はＨＲＰ接合ヤギ抗ヒトカッパー抗体とした。クローンのほとんどがヒト抗体決定成分を分泌することが突き止められたが、最も高い生産能力を持つ３つをさらに１μＭおよび次に５μＭのメトトレキセートで増殖に適するようにした。ＳｄＥＲ６およびＳｄＥＲ１４と命名されたこれら系統の２つは高レベルのＭＴＸでよく増殖を続け、限界希釈によりサブクローニングした。サブクローンの生産性を、増殖培地中１mｌ当たり２×１０⁵細胞個の細胞接種によりテストし、蓄積された抗体を７日目に測定することにより試験した。第１のサブクローニングがらの最も高い生産能力の２つの系統はＳｄＥＲ６．２５とＳｄＥＲ１４．１０であった。これらを再びサブクローニングし、最終の３つの候補系統をＳｄＥＲ６．２５．８、ＳｄＥＲ６．２５．４９、およびＳｄＥＲ１４．１０．１と命名した。クローンＳｄＥＲ６．２５．８を抗体の発現を根拠として選択した。実施例Ｉ−５ＳｄＥＲ６．２５．８から発現されたＣ２２５の分析クローンＳｄＥＲ６．２５．８から産生された抗体について、抗体の性質を特性付けするために検討した。Ｃ２２５抗体を発現するトランスフェクト細胞クローンからの培養上清をテストして、異なるレベルのＥＧＦレセプターを発現するヒト腫瘍細胞への結合能力を試験した。Ａ４３１上皮癌細胞（高発現）は強度に染色されたが、Ｍ２４黒色腫細胞（１／１０の少ないレセプターを発現）は中程度に染色された。ＥＧＦレセプターを発現しない神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２は染色されなかった。実施例Ｉ−６Ｃ２２５抗体のキメラ化の効果見掛けのＫｄは、ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ法によって、それぞれＣ２２５については０．１および０．２０１nM、２２５については１．１７および０．８０８ nMと判明した（表１）。これらの結果は表１に示す既発表のＣ２２５のデータ（Ｋｄ＝０．３９nM）ならびに２２５のデータ（Ｋｄ＝０．７９nM、Ｋｄ＝１nM）と同程度であった。これらの抗体は培養Ａ４３１細胞の増殖を同じ程度に抑制することが判明した（表２）。さらに２２５およびＣ２２５はＡ４３１細胞中でＥＧＦＲのＥＧＦ誘発リン酸化を遮断する能力を有した。これらの結果は２２５のキメラ化が抗体の生物学的特性には影響を与えず、ＥＧＦＲに対するＣ２２５の相対的な結合親和性を増加させたことを示している。実施例ＩＩ方法および検定実施例ＩＩ−１ＥＬＩＳＡによる相対親和力の測定抗体の相対結合親和性は、すでにロッカー[LoKker]ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，８９３−８９８（１９９１）に記述されているＥＬＩＳＡプロトコルを使用して判定した。即ち、Ａ４３１細胞（１穴当たり１０⁴または１０⁵個）を９６穴マイクロ滴定プレート中で一晩３７℃で増殖させる。細胞を３．７％中性緩衝ホルマリンにより室温で１０分間固定する。ＰＢＳで３回洗浄後、穴をハンタスの平衡塩溶液中に入れた１％ウシ胎児血清により、室温で２時間遮断する。Ｃ２２５または２２５を種々の濃度（５０nMからスタートする連続稀釈液）で穴に加える。３７℃時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳで十分に洗浄し、ヤギ抗ヒト抗体（ミズーリ州セントルイスのシグマ社；１：１０００）を用いて３７℃で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、クロモゲンＴＭＢ（メリーランド州ゲイサーバーグのカークガード＆ペリー社[KirKegaard and Perry]）を暗所で３０分間添加する。呈色反応を１Ｎ硫酸により停止させ、プレートをＥＬＩＳＡリーダーで４５０nmで読み取る。相対結合親和性は１／２最大ＯＤを与える濃度とした。実施例ＩＩ−２表面プラスモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用した２２５およびＣ２２５の親和定数Ｍ２２５およびＣ２２５の見掛けの結合親和力をまた、ＩｎＡｃｏｒｅ^TM（ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア・バイオセンサー社[Pharmacia Biosensor]；製造者の使用注意書き３０１およびオシャネシ[O'Shannessy]ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１２，４５７−４６８（１９９３））を使用して求めた。即ち、製造者の説明のように溶解性リコンビナントＥＧＦＲをアミノ基を通じて、センサ・チップ上に固定化する。２２５とＣ２２５のＥＧＦＲに対するリアルタイムの結合パラメータを種々の抗体濃度で確立し、見掛けのＫｄをＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ^TM２．０ソフトウェアを使用した非線形フィッティングにより得た結合速度定数から計算した。実施例ＩＩ−３ｉｎｖｉｔｒｏでの２２５およびＣ２２５による細胞増殖抑制２２５およびＣ２２５のｉｎｖｉｔｒｏの抑制活性を、Ａ４３１細胞（３００−５００／ウェル）を完全増殖培地中、９６穴マイクロ滴定プレートに塗布して測定した。種々の濃度のＣ２２５または２２５を添加（４複製数／１濃度）した後、プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、２４時間３Ｈ−チミジンを用いてパルスを印加した。細胞を採取し、フィルタ・マット上に集め、ウォーレス・マイクロベータ[Wallace Microbeta]シンチレーション・カウンターで計測し、抑制パーセントを求めた。抑制パーセントは、抗体処理細胞の３Ｈチミジン取り込み量と、抗体の存在なしで増殖させた細胞の３Ｈチミジン取り込み量を比較した場合の減少度と定義した。実施例１１−４実験動物での検討無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ；６−８週齢、雌）をチャールス・リバー研究所[Charles River Laboratories]から入手した。動物（１処置群当たり１０匹）の右脇腹に、０．５mlのハンクス平衡塩類溶液に加えた１０⁷個のＡ４３１細胞を接種した。腫瘍が目に見える程度（約７−１２日）、および平均容積が１５０〜３００mm³に到達するまで観察した。その時点で抗体治療を開始した。治療は１週間に２回の腹腔内注射（０．５mlのＰＢＳ中に種々の濃度で）を５週間にわたり行なった。Ｕ１動物にはＰＢＳの注射をした。腫瘍を１週間２回測定し、その容積を次の式を使用して計算した：π／６×大径×（小径）²。最後の抗体治療（治療開始後８週間目）の時点で、Ｕ１および極端に大きな腫瘍の試験動物を安楽死させ、その後少なくとも３週間動物を継続観察した。腫瘍のない動物および小さな腫瘍の動物についてはさらに２−３ヵ月継続した。それぞれの検討における腫瘍成長の統計的分析はスチューデントの両側(two-tailed)Ｔ検定を使用して行なった。抗体は腫瘍成長抑制効果を示したのに加え、多くの動物では完全な緩解（すなわち、腫瘍なし）となった。この生物学的効果は緩解指数ＲＩ、すなわち腫瘍なしのマウスの数／治療群の合計動物数、として定量的に表わした。試験終了は大きな腫瘍の動物については安楽死の時点、その他の動物については２〜３ヵ月後とした。治療中に死んだ動物は分析から除外した。たとえば、８匹の生存動物中完全緩解が１匹の場合はＲＩ＝０．１２５となる。実施例ＩＩＩＣ２２５の生物学的活性実施例ＩＩＩ−１ヌードマウスのＡ４３１異種移植の成長を抑制する抗体能力試験動物には脇腹にＡ４３１細胞を接種した。１５０〜３００mm³の腫瘍が７〜１０日目までに現われた。（表３の実験１−４を参照）次に実験動物を無作為抽出し、ＰＢＳまたは２２５（実験１）の注射、ＰＢＳ、２２５、またはＣ２２５の注射（実験２）；およびＰＢＳまたはＣ２２５（実験３と４）を注射した。実験１−３において、実験動物は１mgの抗体（０．５ml ＰＢＳ中）を週２回、５週間にわたって投与され、１匹当たりの抗体合計用量は１０mgであった。実験４においては、実験動物は１、０．５、および０．２５mg／１回注射で、それぞれ合計用量が１０、５および２．５mgの３つのいずれかの用量を投与された。腫瘍は週２回、全治療期間にわたり測定した。腫瘍のない動物および小さい腫瘍の動物については、大きい腫瘍の動物を屠殺後２〜３ヵ月間継続モニタした。図１はヌードマウスにおけるＡ４３１腫瘍の成長に対する２２５の効果を示す（実験１）。実験群およびＵ１群の平均腫瘍容積は同程度であったが（図１Ａ）、ただ１匹だけ完全な腫瘍緩解が観察された（緩解指数（ＲＩ）０．１７：図１Ｂおよび表３）。２２５とＣ２２５の比較を図２（表３の実験２）に示す。グループ間には平均腫瘍サイズに有意差はなかったが、Ｃ２２５で治療した動物はＲＩが０．４４（すなわち、４／９完全緩解）であったのに対し、２２５の場合はＲＩが０．１１であった（図２Ｂおよび表３）。ＰＢＳＵ１群の３７日目の明らかな腫瘍退縮（図２Ａ）はこの時点での３／１０動物の死亡のためであり、それに伴う全腫瘍容積の減少によるものである。Ｃ２２５については同程度のＲＩが実験３で見られた（図３Ｂ；ＲＩ＝０．４）。加えて、Ｃ２２５による腫瘍成長の抑制もまた、ＰＢＳ処理マウスの異種移植の成長と比較した場合に有意であった（図３Ａ；３２日目以降ｐ＜０．０２）。Ｃ２２５を受けた多くの動物が１mg／１回注射レベルで腫瘍の退縮を示したことから、最低生物学的有効量が求められた。図４は用量応答実験の結果を示す（実験４）。１mg／１回注射を受けたすべての動物は完全な緩解となり、抗体注射を終了後１００日以上腫瘍のない状態となった（図４ＡおよびＢ；表３）。これらの結果は、ｐ値が３３日目のｐ＜０．００６から、５９日目にｐ＜０．０１３９へと変化し、極めて顕著であった。Ｃ２２５は実験３において顕著な腫瘍退縮を示した（図３）が、実験２および３において、Ｃ２２５の１mg用量を投与された動物の約４０％が完全緩解した。実験３および４における１mg 用量の効果がＵ１に対比して平均腫瘍容積を著しく低減させたのは、小さい腫瘍のマウスをこれらの実験の治療プロトコルの開始時点で使用したことによるものであろう（１５２mm³［実験４］および１８５mm³［実験３］対２６７mm³［実験２］）。これらのデータはＣ２２５の臨床効果が腫瘍負荷に関連することがあることを示唆している。実験４の０．５mg用量においては、腫瘍成長の全体的な抑制はＰＢＳおよび０．５mg群の両方の動物の腫瘍容積が大きく変化しているため、統計的に有意ではなかった。しかしながら、ＲＩは０．５mg群については高く（ＲＩ＝０．６３；図４Ｂおよび表２）、抗体が個々の実験動物に高い腫瘍応答を誘発したことを示している。興味深いことに、実験４の０．５mg用量群は実験３の１mg用量群よりもＲＩが高かった。この結果はおそらく腫瘍負荷の影響に帰することができるであろう。０．５mg用量群の腫瘍の開始時点における平均容量は１６０mm³であったが、個々の動物で腫瘍の大きさには大きな変動があった。小さな腫瘍（＜１００mm³）を持った多くの実験動物はＣ２２５の生物効果に最も敏感であった。０．２５mg用量において、平均腫瘍成長はＰＢＳＵ１よりも大きいように見えた。これは治療開始時点で大きな腫瘍（７６０および１０４０mm³）を持った２匹の動物を含めたためであり、このため実験４の経過における平均腫瘍容積が増加した。総体的には、これらのグループ間には顕著な差異は見られなかったが、０．２５mg用量群の１匹（１／８）は検討の終了時点で腫瘍がなかったことが特記される（ＲＩ＝０．１３）。４７日目にＲＩの低下が見られた。この時点で、明らかに完全緩解していたマウス１匹に腫瘍が再発した。この唯一のケースにおいて、Ｃ２２５が一時的な生物効果を示しただけであった。この動物は表３には含めなかった。１mg用量群と同様に、０．５および０．２５mg群の腫瘍のない動物は、ＰＢＳ対照マウスを屠殺後最低２〜３ヵ月は腫瘍のない状態が維持された。 * スキャッチャートの結果はＫｄ、ＳＰＲの結果は見かけのＫｄ、ＥＬＩＳＡの結果は見かけの親和性としてＫｄの相対測定値で表す。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲのデータ生成については材料と方法の項を参照のこと。表２に示す結果は、ｉｎｖｉｔｒｏでＡ４３１の成長を抑制する２２５およびＣ２２５の能力を試験した典型的な実験を示したものである。詳細は上記の通りである。抑制パーセントは、抗体が存在しない場合の細胞増殖の３−Ｈチミジン取り込み量に対する抗体処理サンプル（４複製数／濃度）の取り込み量の減少と規定される。表３は樹立Ａ４３１腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスにおいてＰＢＳ、２２５、またはＣ２２５を週２回、５週間治療後の完全な腫瘍緩解を比較したものである。実験４以外の実験動物は０．５ml ＰＢＳ中１mgの抗体で腹腔内ルートで治療したが、実験４はマウスに１、０．５、または０．２５mg／１回の注射を行った用量応答実験である。この表は大きい腫瘍を抱えた実験動物（ＰＢＳ対照試験群）を安楽死させた時点のＲＩを示したものである。完全な緩解または小さい腫瘍を示した動物はすべて２〜３ヵ月さらに治療を継続した。実験動物の総数の差は、この実験におけるこれら処理群中のマウスの死亡によるものである。＊腫瘍のない動物／全生存動物数。示した動物数が違う理由は各種治療法を５週間行った間に死亡したマウスがあるためで、これらは統計分析には含めなかった。＊＊緩解指数（ＲＩ）は、ＰＢＳ対照マウスと大腫瘍を有する試験動物とを安楽死させた日に於ける、腫瘍なしのマウス数の割合と定義する。用量レベル０．２５mgにおける完全緩解はその後腫瘍の再発を示した（日数４７）。実施例ＩＩＩ−２ヌードマウスに樹立したヒト前立腺癌異種移植の成長抑制実施例ＩＩＩ−２ＡＣ２２５のＤＵ１４５、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰへの結合のＦＡＣＳ分析ＤＵ１４５、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞に対するＥＧＦレセプターの相対的発現レベルをＦＡＣＳ分析により測定した。細胞を完全培地中でほぼコンフルエンシーになるまで増殖させ、非酵素的会離緩衝液（シグマ社）を使用してフラスコから取り出し、１００ｕｌの冷Ｈ−ＢＳＡ（１％ＢＳＡを含むハンクス平衡塩溶液）中に１試験管当たり５−１０×１０⁵個再懸濁させた。試験管に１０μ ｇのＣ２２５または無関係の骨髄腫由来ヒトＩｇＧ１（カリフォルニア州バーリンゲームのタゴ社[Tago]）を加え、氷上６０分間インキュベートした。冷Ｈ−ＢＳＡで洗浄後、ＦＩＴＣ（カリフォルニア州バーリンゲームのタゴ社[Tago]）に接合したヤギ抗ヒトＩｇＧを加え、さらに３０分間氷上で保った。細胞を冷Ｈ− ＢＳＡで２回洗浄し、１mlのＨ−ＢＳＡに再懸濁させ、コールター・エピックス・エリート細胞ソーター（フロリダ州ハイアレアのコールター社[Coulter]）を使用して分析した。基底蛍光強度はＦＩＴＣ標識二次抗体だけを使用して決定し、非特異性蛍光は無関係のアイソタイプコントロールにより規定した。データは、抗原密度の間接的な尺度である平均蛍光強度ＭＦＩで示した。ＭＦＩは平均チャンネル蛍光に各サンプルの陽性細胞のパーセントを乗じたものである。実施例ＩＩＩ−２ＢＰＣ−３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞のリン酸化検定ＰＣ−３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞に対してリン酸化検定を行ない、これらの細胞により発現されたＥＧＦレセプターが機能を有するが、またＣ２２５で抑制されたかを判定した。この検定およびウエスタン・ブロット分析はジル [Gill]ら、Ｎａｔｕｒｅ，２９３，３０５−３０７（１９８１）の記載に従って行なった。即ち、ＤＵ１４５、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞を完全培地中で９０％コンフルエンシーになるまで増殖させ、次いで実験２４時間前にＤＭＥＭ− ０．５％ウシ血清中で栄養素欠乏状態にした。細胞をＣ２２５の存在下または非存在下で室温で１５分間ＥＧＦで刺激した。次に単層を１mMのバナジウム酸ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を溶離し、ＳＤＳＰＡＧＥにかけ、次いでウエスタン・ブロット分析を行なった。リン酸化のパターンはブロットをホスホチロシンに対するモノクローナル抗体（ニューヨーク州レークプラシドのＵＢＩ社）によりプローブし、次いでＥＣＬ法（アマーシャム社 [Amersham]）を使用して検出することにより判定した。実施例ＩＩＩ−２Ｃ動物実験無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ；６−８週齢、雄；マサチューセッツ州ウイルミントンのチャールス・リバー研究所[Charles River Laboratories]の右脇腹に、０．２mlのマトリゲルを混合した０．２mlのハンクス平衡塩類溶液に加えた１０⁶個のＤＵ１４５を接種した。腫瘍が目に見える程度（投与後約１４〜２０日）、および平均容積が１００mm³に到達するまでマウスを観察した。動物の体重を測定し、無作為に治療群に分けた（１群１０匹）。週２回０．５mgのＣ２２５の腹腔内注射を５週間にわたり投与する抗体治療を開始した。対照動物にはＰＢＳを注射した。予備検討において、ポリクローナルのＤＵ１４５吸収ヒトＩｇＧで処理した動物とＰＢＳで処理した動物の間には、ＤＵ１４５異種移植の成長には顕著な差がないことが確認された。腫瘍を週２回測定し、その容積は次記の式を用いて計算した：π／６×大径×（小径）²。最終抗体注射（治療開始後８週間目）の時点で対照動物を安楽死させ、、その後動物を少なくとも３週間継続観察した。腫瘍のない動物および小さな腫瘍を持った動物についてはさらに２〜３ヵ月継続した。各検討における腫瘍成長の統計的分析は、シグマスタット（カリフォルニア州サン・ラファエルのジャンデル社[Jandel]）のコンピュータ・プログラムを使用して、スチューデントの両側Ｔ検定により判定した。ｐ値が＜０．０５の場合、有意であるとみなした。実施例ＩＩＩ−３２２５のＣＤＲ領域を含むペプチドの生物活性本実施例は、２２５−ＣＤＲ配列を使用して構築したペプチト類がＥＧＦレセプターを発現する細胞系統に対して生物活性を有することを示すものである。下記の配列の６つの一連のペプチドを製作した：重鎖ＣＤＲ−１ＮＹＧＶＨＣＤＲ−２ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＣＤＲ−３ＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷ（配列番号：３２）軽鎖ＣＤＲ−１ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号：３３）ＣＤＲ−２ＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号：３４）ＣＤＲ−３ＱＱＮＮＷＰ（配列番号：３５）これらのペプチドを濃度１mg／mlでＰＢＳ中に溶解させた。Ａ４３１細胞を９６穴プレート中に１ウェル当たり１，０００細胞個入れた。ペプチドは種々の濃度で加えた。キメラＣ２２５抗体および無関係のアイソタイプ適合免疫グロブリンをそれぞれ陽性および陰性Ｕ１として使用した。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、一晩³Ｈ−チミジンでパルスをかけた。細胞を採取し、液体シンチレーション・カウンターにより計測した。抑制パーセントは、抗体またはペプチド処理細胞の３−Ｈチミジン取り込み量を、抗体またはペプチドの存在なしで増殖した細胞の３−Ｈチミジン取り込み量と比較した場合の減少度と定義した。図５から明らかなように、Ａ４３１細胞はＣ２２５、ならびにモノクローナル抗体２２５の重鎖ＣＤＲ−１および重鎖ＣＤＲ−２により抑制された。対照的に、アイソタイプ適合の無関係抗体およびＵ１ペプチドはＡ４３１細胞を抑制しなかった。これらの結果は、重鎖ＣＤＲ−１と−２はＥＧＦＲに対するリガンドの結合に干渉することによってＡ４３１細胞の増殖を抑制することができることを示している。実施例ＩＩＩ−４Ｃ２２５−ドキソルビシン接合体（Ｃ２２５−ＤＯＸ）の生物活性Ｃ２２５−ＤＯＸの生物活性をＥＧＦＲ発現細胞系Ａ４３１、ＫＢおよびＭＤＡ−４６８、ならびにＥＧＦＲ非発現細胞系発現Ｍｏｌｔ−４およびＳＫ−ＭＥＬ−２８を使用してｉｎｖｉｔｒｏで評価した。ＥＧＦレセプターの発現は、Ｃ２２５およびＣ２２５−ＤＯＸ接合体を使用したＦＡＣＳ分析により検証した。検定は７２時間のインキュベーション期間で、［³Ｈ］−チミジンおよびＷＳＴ−１の検出値を使用して実施した。ＥＧＦＲｃ発現細胞系、すなわちＡ４３１、ＫＢおよびＭＤＡ−４６８細胞のすべての検定において、Ｃ２２５−ＤＯＸは、無治療またはｈＩｇＧ１Ｕ１類の治療に比べて細胞増殖の高い抑制を示した。ドキソルビシン単独またはＣ２２５とドキソルビシンの混合物と、等モル濃度のＣ２２５−ＤＯＸの比較では、Ｃ２２５−ＤＯＸ接合体を使用した場合が４〜５倍高い抑制を示した。Ｃ２２５−ＤＯＸによる増殖の抑制はまた高用量のＥＧＦＲｃ非発現細胞系でも見られた。ＥＧＦＲｃ陰性細胞系におけるＣ２２５−ＤＯＸ抑制はＥＧＦＲｃ−陽性細胞系より５〜１５倍低く、ドキソルビシン単独の等モル濃度で見られた抑制と同程度であった。４３１細胞に対するＣ２２５−ＤＯＸの活性に関する代表的な結果を表６に示す。実施例ＩＶＭ２２５のヒューマナイズ化実施例ＩＶ−１略号ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；ウシ胎児血清（ＦＣＳ）；リボ核酸（ＲＮＡ）；メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）；デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）；二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ−ＤＮＡ）；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；酵素結合免疫吸収検定（ＥＬＩＳＡ）；時間（ｈｒ）；分（ｍｉｎ）；秒（ｓｅｃ）；ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）；ポリアデニレーション（ｐｏｌｙ（Ａ）⁺）；免疫グロブリン（ＩｇＧ）；モノクローナル抗体（ｍＡｂ）；相補性決定領域（ＣＤＲ）；フレームワーク領域（ＦＲ）；トリス−ホウ酸緩衝液（ＴＢＥ）；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；室温（ＲＴ）；ナノメートル（ｎｍ）；上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）。実施例ＩＶ−２材料培地組成物およびその他すべての組織培養材料は、ＪＲＨバイオサイエンシーズ社[JRH Biosciences]（米国）から購入したＦＣＳ以外は、ライフ・テクノロジーズ社[Life Technologies]（英国）から入手した。ＲＮＡ単離用キットはストラットジーン社[Stratgene]（米国）から入手し、第一ストランドｃＤＮＡ合成キットはファルマシア社[Pharmacia]（英国）から購入した。ＰＣＲ反応用のーゼを含め、パーキンエルマー社[Perkin Elmer]（米国）から購入した。ＴＡクル社[Amarsham International]（英国）から購入した。アガロース（ウルトラピュア[UltraPure]^TM）はライフ・テクノロジーズ社（英国）から入手した。ウィザード[Wizard]^TMＰＣＲプレップスＤＮＡ精製キット、マジック[Magic]^TMＤＮＡクリーンアップシステムおよびＸＬ１ブルー・コンピテント細胞はプロメガ社 [Promega]（米国）から購入した。その他すべての分子生物製品はニューイングランド・バイオラボ社[New England Biolabs]（米国）から購入した。ナンクーイムノプレートマキシソープ[Nunc-Immuno Plate MaxiSorp]^TM免疫プレートはライフ・テクノロジーズ社（英国）から入手した。Ｆｃγフラグメント特異性ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体およびヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合物はともに、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社[Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.]（米国）から購入した。ＴＭＢ基質Ａおよび基質Ｂはカーケガード・ペリー社[Kirkegaard-Pery]（米国）から入手した。ＥＬＩＳＡ用のその他すべての製品はシグマ社（英国）から入手ウェア・パッケージはバイオ・ラッド社[Bio-Rad]（英国）から購入した。分子モデル化パッケージＱＵＡＮＴＡはポリジェン社[Polygen Corporation]（米国）から入手した、またＩＲＩＳ４Ｄワークステーションはシリコン・グラフィックス社[Silicon Graphics]（米国）から購入した。実施例ＩＶ−３マウス可変部遺伝子のＰＣＲクローニングと配列決定１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、５０ユニット／ml ペニシリン、５０μｇ／mlストレプトマイシンおよび５８０μｇ／ml Ｌ−グルタミンを添加したＤＭＥＭを使用してマウスＭ２２５ハイブリドーマ細胞系を懸濁状態で増殖させた。約１０⁸ の生存可能細胞を採取し、一方ハイブリドーマ細胞からの上澄みをＥＬＩＳＡにより検定し、それら細胞がマウス抗体を産生していることを確認した。製造者の指示に従ってＲＮＡ単離キットを使用して１０⁸個の紬胞から全ＲＮＡを単離した。このキットはチョムチンスキー[Chomczynski]およびサッチー[Sacchi]（６）に記載のようにグアニジンチオシアネートフェノール−クロロホルム１段階抽出法を利用するものである。同じく製造者の指示通りに第一ストランドｃＤＮＡ合成キットを用いて、キットに供給されているＮｏｔＩ−（ｄＴ）₁₈プライマーを使用してＭ２２５ハイブリドーマｍＲＮＡの１本鎖コピーを作った。３３μｌの最終反応容量中、約５μｇの全ＲＮＡを使用した。次いで、反応完了混合物を氷冷する前に、５分間９０℃に加熱してＲＮＡ−ｃＤＮＡデュプレックスを変性させ、逆転写酵素を不活性化した。マウス可変部遺伝子をＰＣＲ増幅するために、ジョーンズ[Jones]およびベンディッグ[Bendig]（７）に記載の方法を踏襲した。基本的には、Ｍ２２５抗体のマウス可変部遺伝子をＰＣＲクローンするために、２シリーズの縮重プライマー、すなわち１シリーズはマウスカッパー軽鎖遺伝子（すなわち、ＭＫＶ１−１１；表４）のリーダー配列にアニールするように設計されたものと、１シリーズはマウス重鎖遺伝子（すなわち、ＭＨＶ１−１２；表５）のリーダー配列にアニールするように設計されたものを、マウスカッパー軽鎖不変部遺伝子（ＭＫＣ；表４）の５’末端およびマウスγ１重鎖不変部遺伝子（ＭＨＣＧ１；表５）の５’ 末端にそれぞれアニールするように設計されたプライマーとともに使用した。ＭＫＶとＭＨＶ縮重プライマーにはそれぞれの不変部プライマーとを用いた別々の反応を準備した。ＰＣＲ反応試験管をパーキンエルマー４８０ＤＮＡサーマル・サイクラーに入れ、９４℃で１分間、５０℃で１分間および７０℃で１分間、合計２５サイクルかけた（９４℃で１．５分間の最初の溶融後）。最後のサイクル終了時に、反応を４℃に冷却する前に最終的なエクステンション・ステップを７２℃ で１０分間行なった。アニーリング（５０℃）とエクステンション・ステップ（７２℃）の間以外は長めのランプ時間２．５分とし、サイクルの各ステップの間に３０秒間のランプ時間を設けた。各ＰＣＲ反応がらの２０μｌアリコートをアガロースゲルに流し、どれが正しいサイズのＰＣＲ産物を産生したかを調べた。全長可変ドメイン遺伝子を増幅させたと思われるＰＣＲ反応を繰り返し、独立したＰＣＲクローンを産生させ、それによりＰＣＲエラーの影響を少なくするようにした。正しいサイズのｐＣＲ^TMＩＩベクター中に直接クローニングし、製造者の指示に記述されているようにしてＩＮＶαＦ’コンピテント細胞に形質転換した。正しいサイズで挿入されたプラスミドを含むコロニーを、グッソー[Gussow]およびクラクソン[Clack son]（８）の方法に基づき、表６に記述されているｐＣＲ^TMＩＩ順およびｐＣＲ^TM ＩＩ逆オリゴヌクレオチド・プライマーを用いてコロニーをＰＣＲスクリーニングすることによって同定した。同定された推定陽性クローンは、最終的にレドストン[Redston]およびカーン[Kern]（９）の方法に基づいたシーケナー実施例ＩＶ−４キメラ遺伝子の構築クローニングしたマウスリーダー可変部遺伝子は、ＰＣＲプライマーを用いて５’および３’末端の両方で修飾し、可変および不変部遺伝子の正しいＲＮＡスプライシングのための免疫グロブリン鎖（１０）とスプライスドナー部位のそれぞれをコードするｍＲＮＡの効率的な真核翻訳のための発現ベクター、即ちＫｏｚａｋ配列への挿入に好適な制限酵素部位を製作した。マウスの両可変部遺伝子の５’末端にはＨｉｎｄＩＩＩ部位が付加されるが、別の制限部位がマウス可変部遺伝子の３’末端に付加される。すなわちＶ_H遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位が、またＶ_K遺伝子の３’末端にＸｂａＩ部位が付けられる。ＰＣＲ反応はケトルボロー[Kettleborough]ら（１１）のキメラ遺伝子構築法に基づいて、重鎖用にプライマーＣ２２５Ｖ_H５’およびＣ２２５Ｖ_H３’を、またカッパー軽鎖用にＣ２２５Ｖ_K５’とＣ２２５Ｖ_K３’を使用して行なった（表７）。最初の９４℃での９０秒間の溶融ステップに続き、混合物を９４℃で２時間および７２℃で４時間の２５サイクルでＰＣＲ増幅した。一般的な３段階サイクルに対してこの２段階ＰＣＲサイクルが可能であるが、これはそれぞれのプライマーがテンプレートＤＮＡを２４塩基に対してアニールするように設計されており、これにより７２℃という比較的高温でアニールできるからである。各ステップと最後のサイクルの終了の間には３０秒間のランプ時間をおき、ＰＣＲ反応は４℃に冷却する前に最終エクステンション・ステップを７２℃で１０分間行なって完了した。ＰＣＲ産物はウィザード^TMＰＣＲプレップスＤＮＡ精製キットを製造者の指示に従って使用してカラム精製し、プラスミドｐＵＣ１９のような適当な制限酵素で消化し、１％アガロース／ＴＢＥ緩衝液（pH８．８）ゲル上で分離した。重鎖およびカッパー軽鎖可変部遺伝子をアガロースゲルから切り取り、ウィザードのＰＣＲプレップスＤＮＡ精製キットを使用して精製した。ｐＵＣ１９もまたアガロースゲルから切り取り、マジック^TMＤＮＡクリーンアップシステムを製造者の指示に従って使用して精製した。次に重鎖およびカッパー軽鎖可変部遺伝子を別々に精製ｐＵＣ１９に連結し、それぞれｐＵＣ−Ｃ２２５Ｖ_HおよびｐＵＣ−Ｃ２２５Ｖ_Kプラスミドを産生させ、ＸＬ１ブルー・コンピテント細胞中に形質転換した。適切なプラスミドを含むと思われる陽性コロニーを、オリゴヌクレオチドプライマーＲＳＰおよびＵＰ（表６）を使用したＰＣＲスクリーニングにより同定し、最終的にｄｓ−ＤＮＡを配列して、配列修飾の導入を確認し、またＰＣＲ反応の結果として望ましくない変化がＤＮＡ配列に起きていないことを確認した。カッパー軽鎖可変部の５’末端のシグナルペプチド配列を修飾するために、ケトルボロー[Kettleborough]ら（１１）のプロトコルに従ってＰＣＲ突然変異誘発を利用した。ＰＣＲプライマーＣ２２５Ｖ_K５’ｓｐおよびＣ２２５Ｖ_K３’ｓｐ（表７）をｐＵＣ−Ｃ２２５Ｖ_KテンプレートＤＮＡに使用し、改変２段階ＰＣＲ増幅プロトコルを使用して修飾遺伝子（Ｃ２２５Ｖ_Kｓｐ）を作った。このＰＣＲ産物を次に、精製ＰＣＲ産物とｐＵＣ−Ｃ２２５Ｃ＊ＫをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化する前にカラム精製した。このＰＣＲフラグメントとプラスミドＤＮＡを次にアガロースゲル精製し、一緒に連結およびクローニングしてプラスミドｐＵＣ−Ｃ２２５Ｖ_Kｓｐを作製した。前記のように、推定陽性形質転換個体をＰＣＲスクリーニング（ＲＳＰおよびＣＰプライマーを使用）により同定し、次いでｄｓ−ＤＮＡ配列決定を行ない、修飾シグナルペプチドの存在とＰＣＲエラーのないことを確認した。この適合マウスカッパー軽鎖および重鎖リーダー可変部遺伝子を次に、マウスＶ_Hの場合にはＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして、またマウスＶ_K の場合にはＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとして、哺乳類細胞中にキメラ軽鎖および重鎖を発現するように設計されたベクター中に挿入した。これらベクターはＨＣＭＶエンハンサーとプロモーターを含み、免疫グロブリン鎖、免疫グロブリン可変部遺伝子の挿入のためのＭＣＳ、適当なヒトカッパー軽鎖および重鎖不変部のｃＤＮＡクローン、免疫グロブリン鎖ｍＲＮＡをポリアデニレート化するための合成ポリ（Ａ⁺）配列、免疫グロブリン鎖の転写を終了させるように設計された人工配列、ｄｈｆｒまたはｎｅｏなど形質転換した安定細胞系を選択するための遺伝子、ならびにＣＯＳ細胞への一時的なＤＮＡ複製のためのＳＶ４０複製オリジンを進めるためのＨＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターを含む。ヒトカッパー軽鎖哺乳類発現ベクターはｐＫＮ１００（図１１）と呼ばれ、またヒトガンマ１重鎖哺乳類発現ベクターはｐＧ１Ｄ１０５（図１２）と呼ばれる。推定陽性のコロニーについては、キメラカッパー軽鎖ベクターに対してはプライマーＨＣＭＶｉおよびＮｅｗ．Ｈｕｋを使用し、またキメラ重鎖ベクターに対してはプライマーＨＣＭＶｉおよびＨｕＣガンマ１を使用してＰＣＲスクリーニングし（表６）、発現ベクター構築物中の正しい挿入の存在を確認するために制限分析を行なった。Ｍ２２５抗体のマウス可変部遺伝子を含む新しい構築物はそれぞれｐＫＮ１００−Ｃ２２５Ｃ_K（またはｐＫＮ１００−Ｃ２２５Ｖ_Kｓｐ）およびｐＧ１Ｄ１０５−Ｃ２２５Ｖ_Hと呼ばれる。実施例ＩＶ−５マウスＭ２２５抗体可変部の分子モデル化Ｈ２２５抗体のＣＤＲ移植可変部の設計の補助として、マウスＭ２２５抗体の可変部分子モデルを作った。免疫グロブリンのようによく特性付けされた蛋白質ファミリーの構造モデル化については、相同によるモデル化の確立された方法を使用して行われる。これをＵＮＩＸオペレーティングシステムで作動するＩＲＩＳ４Ｄワークステーションで、分子モデル化パッケージＱＵＡＮＴＡならびにブルックヘブンの解明蛋白質構造結晶データベース（１２）を使用して行なった。Ｍ２２５可変部のＦＲは、類似の構造的に解明されている免疫グロブリン可変部のＦＲに基づいてモデル化する。同一のアミノ酸側鎖はそれらの元々の配向を維持するが、適合しない側鎖はオリジナルのマウスＭ２２５抗体のｃｈｉ角を保つために最大オーバーラップ法を使用して置換する。Ｍ２２５可変部のほとんどのＣＤＲは構造レベルのＣＤＲに相当する超可変ループの標準型構造をベースとしてモデル化する。しかしながら、重鎖可変部のＣＤＲ３などの場合には、標準型構造は不明であるため、ＣＤＲループは構造的に解明された蛋白質中に存在する類似のループ構造をベースとしてモデル化する。最後に、望ましくない原子接触をなくし、ファン・デア・ワールスおよび静電作用を最適化するために、ＱＵＡＮＴＡで実施されているようなＣＨＡＲＭｍポテンシャル（１７）を利用してエネルギーを最小化する。Ｍ２２５抗体の軽鎖可変部のＦＲはマウスモノクローナル抗体ＨｙＨｅｌ−１０のＦａｂフラグメント（１８）からのＦＲに基づいてモデル化する。重鎖可変部のＦＲはマウスモノクローナル抗体Ｄ１．３のＦａｂフラグメント（１９）のＦＲに基ついてモデル化する。マウスＭ２２５抗体とモデルとした可変部の間の異なるアミノ酸の側鎖をまず置換する。次に、ＦａｂＨｙＨｅｌ−１０抗体の軽鎖を、カバットら（２０）が規定しているように、残基３５−３９、４３−４７、８４−８８および９８−１０２を適合させることによってＤ１．３の軽鎖の上に重ねる。この目的は、２つの異種可変部、すなわちＨｙＨｅｌ−１０をベースとするカッパー軽鎖可変部とＤ１．３をベースとする重鎖可変部を互いに正しい配向にすることにある。ｍＡｂＭ２２５の軽鎖可変部のＣＤＲ１（Ｌ１）は、チョシーア[Chothia]ら（１４）が提唱するように、標準型残基位置３３の通常のロイシンの代わりにイソロイシンが存在する以外は、Ｌ１標準型グループ２に適合する。しかしながら、この置換はこの超可変ループに標準型ループ構造を割り当てることに関して大きなメリットを得るには保存度が高すぎると考えられる。マウスＦａｂＨｙＨｅｌ−１０のＬ１ループはアミノ酸の長さが同一で、Ｍ２２５ｍＡｂのＬ１ループと同じく位置３３のロイシンを有する同じ標準型グループに適合する。したがってこの超可変ループをＭ２２５カッパー軽鎖可変部のＬ１ループをモデル化するのに使用する。同様に、Ｍ２２５ｍＡｂのＣＤＲ２（Ｌ２）およびＣＤＲ３（Ｌ３）はともにそれぞれの標準型グループ１ループ構造に適合する。加えて、ＨｙＨｅｌ−１０Ｆａｂフラグメントの対応超可変ループ構造はともにグループ１である。したがって、Ｍ２２５カッパー軽鎖可変部のＬ２およびＬ３ループはＦａｂＨｙＨｅｌ−１０のＬ２およびＬ３をモデルとする。同様に、ｍＡｂＭ２２５の重鎖可変部のＣＤＲ１（Ｈ１）およびＣＤＲ２（Ｈ２）超可変ループはともに、チョシーアら（１４）が規定するようにそれぞれの標準型グループ１ループ構造に適合する。そのうえ、マウスＤ１．３Ｆａｂフラグメントの対応Ｈ１およびＨ２超可変ループもまたそれぞれの標準型グループ１ループ構造に適合する。したがって、軽鎖の場合と同じように、これらの超可変ループはベースとするモデルの重鎖可変部のＨ１およびＨ２ループをモデルとする。ループ構造をＭ２２５の重鎮可変部のＣＤＲ３（Ｈ３）超可変ループへの適合を同定するために、同一長さのループと類似のアミノ酸配列をブルックヘブン・データベースで検索する。この分析によりマウスＦａｂ２６／９（２１）のＨ３ループはＭ２２５ｍＡｂのＨ３ループと極めて近く、したがってこのマウスＭ２２５可変部モデルの超可変ループのベースとして使用した。モデル全体の明らかな立体的衝突を調節するために、ＱＵＡＮＴＡで行われているように、望ましくない原子接触をなくし、またファン・デア・ワールスおよび静電作用を最適化するために最終的にエネルギー最小化を行う。実施例ＩＶ−６再形成ヒトＨ２２５抗体変異体の設計Ｈ２２５抗体のＣＤＲ移植可変部を設計する第１のステップは、ヒューマナイズ可変部のベースとなるヒト軽鎖および重鎖可変部の選定である。このプロセスの助けとするために、Ｍ２２５抗体の軽鎖および重鎖可変部をカバットら（２０）が規定するように、まずヒトカッパー軽鎖可変部の４つのサブグループのコンセンサス配列ならびにヒト重鎖可変部の３つのサブグループのコンセンサス配列を比較する。マウスＭ２２５軽鎖可変部はヒトカッパー軽鎖サブグループＩのコンセンサス配列と、全体的には６１．６８％の同一性およびＦＲだけでは６５．００％の同一性で、またサブグループＩＩＩのコンセンサス配列とは、全体的には６１．６８％の同一性とＦＲだけでは６８．７５％の同一性を有し、ともに最も良く類似している。マウスＭ２２５重鎖可変部はヒト重鎖サブグループＩＩのコンセンサス配列と、全体的には５２．１０％、ＦＲだけでは５７．４７％の同一性を持ち、最も良く類似している。この分析は、ヒト可変部のどのサブグループが、ＣＤＲ移植のテンプレートととするためのヒト可変部の良好なベースとなりうるかを示すために利用されるが、これはこれら人為的に構築するいくつかのサブグループの個々の配列に見られる多様性のために常に適用できるとは限らない。こうした理由によって、マウスＭ２２５可変部を公表されているヒト可変部の個々の配列の全記録例とも比較した。ヒト抗体配列に関しては、マウスＭ２２５軽鎖可変部は、ヒト抗体ＬＳ７’ＣＬ（２２）のヒトカッパー軽鎖可変部の配列と極めて類似している−ただしこれはマウスＬ７’ＣＬ配列とは関係ない。ヒトＬＳ７’ＣＬのカッパー軽鎖可変部はヒトカッパー軽鎖可変部のサブグループＩＩＩのメンバーである。マウスＭ２２５とヒトＬＳ７’ＣＬ軽鎖可変部の全体的な配列同一性は、全体としては６４．４２％、またＦＲだけに関しては７１．２５％と計算される。マウスＭ２２５重鎖可変部はヒト抗体３８Ｐ１’ＣＬ（２３）のヒト重鎖可変部の配列と極めて似ている。意外なことに、ヒト３８Ｐ１’ＣＬの重鎖可変部はヒト重鎖可変部のサブグループＩＩではなくサブグループＩＩＩのメンバーである。マウスＭ２２５とヒト３８Ｐ１’ＣＬ重鎖可変部の全体的な配列同一性は４８．７４％で、ＦＲだけでは５８．６２％の同一性と計算される。これらの比較に基づいて、ヒトＬＳ７’ＣＬ軽鎖可変部が再形成ヒトＭ２２５軽鎖可変部の設計のためのヒトＦＲドナー・テンプレートとして選択され、またヒト３８Ｐ１’ＣＬ重鎖可変部が再形成ヒトＭ２２５重鎖可変部の設計のためのヒトＦＲドナー・テンプレートとして選択された。よく行われているように、Ｍ２２５抗体のヒューマナイズ化のために選択されるヒト軽鎖および重鎖可変部は２つの異なるヒト抗体から得られる。そのような選択プロセスによってＭ２２５可変部と最も高い同一性を示すヒト可変部を使用することができる。さらに、２つの異なるヒト抗体から得られた可変部に基づくＣＤＲ移植抗体の成功例が多くある。最もよく研究されている例は、再形成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体（２４）である。にもかかわらず、そのような戦略ではまたカッパー軽鎖および重鎖可変部の間のドメイン間のパッキング残基の注意深い分析も必要とされる。この領域における間違ったパッキングは、たとえ再形成ヒト抗体のＣＤＲループ構造が同一であるとしても、抗原結合に劇的な影響を与えることがある。したがって、チョシーアら（２５）が規定しているように、Ｖ_K ／Ｖ_H界面に存在するアミノ酸が通常でないか、あるいはめったにない残基であるかどうかをチェックする。もしそのような残基が同定された場合、その検討位置の特定の残基を通常見られるアミノ酸に変える突然変異誘発を検討しなければならない。設計プロセスにおける第２ステップは、カバットら（２０）が規定するように、Ｍ２２５ＣＤＲを選択したヒト軽鎖および重鎖可変部ＦＲへ挿入して単純なＣＤＲ移植を作り出すことである。このような単純なＣＤＲ移植によってヒューマナイズされたマウス抗体は通常抗原に対して殆ど、または全く結合力を示さない。したがって、これらアミノ酸残基が抗原との作用で直接的か、またはＣＤＲループの位置を変化させることによる間接的な作用のいずれかで抗原に対する結合力に悪影響を及ぼしていないかどうかを判定するために、ヒトＦＲのアミノ酸配列を検討することが重要である。抗原に対する良好な結合能を得るために、ヒトのドナーＦＲ中のアミノ酸をそれらに対応するマウスＭ２２５残基に変更するかどうかを決定するのがこの設計プロセスの第３ステップである。これはヒューマナイズ化法における困難かつ決定的に重要なステップであり、またＭ２２５可変部のモデルが設計プロセスに最も有用となるのがこの段階である。このモデルに関して以下の点を議論する。超可変ループのための標準型構造（１３−１６）が保存されていることが極めて重要である。したがってヒューマナイズ化Ｈ２２５可変部にこれら標準型構造の一部分であるマウスＦＲ残基すべてを保存することが決定的に重要なことである。また、Ｍ２２５抗体の配列を他のマウス抗体の類似配列と比較して、アミノ酸配列が通常でないか、めったにないものかどうかを判断することもまた役に立つ。なぜならばそのような配列の場合、抗原結合能にマウス残基が重要な役割を果たすからである。Ｍ２２５可変部のモデルを検討することにより、これらアミノ酸のどれが、または特定位置のその他の残基のいずれが、抗原結合能に影響を及ぼすことができるかまたはできないかを予測することが可能となる。個々のカッパー軽鎖および重鎖可変部のヒトドナー配列を、そのドナー配列が属するヒト可変部サブグループのコンセンサス配列と比較し、特に通常でないアミノ酸を同定することもまた重要なことである。この設計プロセスをたどることにより、ヒト可変部中のある位置のアミノ酸をマウスＭ２２５可変部のその位置にあるアミノ酸へ変更すべきとされるヒトＦＲ中の数多くのアミノ酸が同定される。表８は再形成ヒトＨ２２５カッパー軽鎖可変部の第１バージョン（２２５ＲＫ_A ）をいかに設計するかを説明するものである。再形成ヒトＦＲ中に、ヒトＦＲ中に存在するアミノ酸をオリジナルのマウスＦＲ中に存在するアミノ酸へ変更する必要があると考えられるただ１つの残基がある。この変更はカバットら（２０）が規定しているように、ＦＲ２中の位置４９である。ヒトＬＳ７’ＣＬカッパー軽鎖可変部中にあるチロシンをマウスＭ２２５カッパー軽鎖可変部中にあるようにリシンに変更する。モデルからは、Ｍ２２５中のリシンは重鎖可変部のＣＤＲ３（Ｈ３）に近い位置にあり、それと相互作用をしているように思われる。この残基はまたカッパー軽鎖可変部のＣＤＲ２（Ｌ２）に隣接した位置にあることになり、これはカバットら（２０）が規定しているように、Ｍ２２５カッパー軽鎖可変部が属するマウスカッパー軽鎖サブグループＶメンバーではこの位置にあることはめったにない。こうした理由から、マウスのリシン残基を２２５ＲＫ_A に保存することは賢明なことと考えられる。第２バージョンとして、位置４９のリシンをオリジナルのヒト・チロシンアミノ酸に置き換えることによって、２２５ＲＫ_A中に作られたＦＲ２修飾を逆転させた再形成ヒトカッパー軽鎖（２２５ＲＫ_B）も作成した。したがって、この再形成ヒトカッパー軽鎖のこのバージョンはＦＲ中にマウスの残基は一切含まないことになる。再形成ヒトＨ２２５重鎖可変部の設計に関して、表９は第１バージョン（２２５ＲＨ_A）を示している。そこには、ヒト３８Ｐ１’ＣＬＦＲ中にあるアミノ酸をオリジナルのマウスＭ２２５ＦＲにあるアミノ酸に変更しなければならないものとして、全部で８つの残基が再形成ヒトＦＲ中にある（すなわちＡ２４Ｖ、Ｔ２８Ｓ、Ｆ２９Ｌ、Ｓ３０Ｔ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ｇ、Ｆ６７Ｌ、およびＲ７１Ｋ）。マウス配列のＦＲＩの位置２４、２８、２９および３０にあるアミノ酸残基は、Ｈ１超可変ループ構造に重要ないくつかの標準型残基であることから（１４）、再形成ヒトＨ２２５重鎖可変部に維持された。標準型残基は超可変ループの正しい配向および構造にとって極めて重要なものであることから、それらは再形成可変部に概ね常に保存される。そのうえ残基位置２４−３０はＨ１超可変ループそのものの一部であると考えられ、それらを保存することがこのループの正しいコンフォーメーションおよび配向にとってさらに重要なことと考えられる。同様に、ＦＲ３中の残基位置７１は、チョシーアら（１４）が同定しているように、Ｈ２超可変ループの正しい配向と構造にとって重要な重鎖可変部中のもう１つの位置であり、これはＣＤＲ２の標準型アミノ酸の１つと同様のものである。したがって、マウスＦＲのリシンはこの残基位置でヒトＦＲ中のアルギニンと置換する。ＦＲ２の位置４８と４９、ならびにＦＲ３中の６７において、ヒト３８Ｐ１’ＣＬＶ_H配列中に存在するバリン、セリンおよびフェニルアラニン残基（それぞれ）は、マウスＭ２２５Ｖ_H配列中に存在するロイシン、グリシン、およびロイシン（それぞれ）に変わる。この切断は、これら３つのすべての残基がＨ２ループの下に埋まり、超可変ループのコンフォーメーションに影響を与え、よって抗体結合能に干渉することになるモデルをベースとして行われる。これらは次いで、再形成ヒトＨ２２５重鎖可変部の第１バージョンに保存されているマウス残基となる。再形成ヒトＨ２２５重鎖可変部のバージョンＢ（２２５ＲＨ_B）は、２２５ＲＨ_Aで行われたすべての置換を取り込み、さらに別のマウス残基も含む。ＦＲ２の位置４１においてヒト・スレオニン残基は、マウスサブグループＩＢのこの位置に必ず見られ、かつヒト・サブグループＩＩＩにも極めて一般的に見られるプロリンと置き換えられる。対照的に、スレオニンはヒト・サブグループＩＩＩのこの位置には通常見られず（１１／８７回だけ見られる）、モデルからこの残基はＭ２２５Ｖ_H領域の表面にあるターン部に存在するように見える。これが超可変ループ構造にどのような効果を持つかは不詳であるが、このバージョンの再形成ヒトＨ２２５重鎖可変部がこの点を明らかにすることになろう。再形成ヒトＨ２２５重鎖可変部のバージョンＣ（２２５ＲＨ_C）は、２２５ＲＨ_Aで行われた置換をすべて取り込み、さらにＦＲ３の位置６８および７０にある２つのマウス残基も含む。マウスＭ２２５可変部のモデルから、位置６８のセリンと位置７０のアスパラギンはともに抗原結合部位の表面および端部にあると考えられる。これらアミノ酸のいすれかまたは両方がＥＧＦＲと直接反応する可能性があるため、ヒトＦＲ中の位置６８のスレオニンと位置７０のセリンは対応する２２５ＲＨ_Cのマウス残基に置き換えられる。再形成ヒトＨ２２５重鎖可変部のバージョンＤ（２２５ＲＨ_D）は、単純に２２５ＲＨ_A、２２５ＲＨ_Bおよび２２５ＲＨ_Cで行われたすべてのマウスＦＲ置換を取り込み、これら変化の組み合わせ効果を見るものである。再形成ヒトＨ２２５重鎖可変部のバージョンＥ（２２５ＲＨＥ）は、２２５ＲＨ_Aで行われたすべての置換を取り込み、さらにＦＲ３の位置７８のもう１つの残基変更も組み込んでいる。モデルから、位置７８のマウスアミノ酸（バリン）が、ＣＤＲ１の下に埋もれた位置からＨ１超可変ループのコンフォーメーションに影響を与えることを示すいくつかの証拠が得られる。結果として２２５ＲＨ_Eでは、ヒト残基（ロイシン）はマウスアミノ酸に置き換わる。実施例ＩＶ−７ヒューマナイズ化抗体可変部遺伝子の構築再形成ヒトＨ２２５Ｖ_K領域（２２５ＲＫ_A）の構築物の第１バージョンは、基本的にサトウら（２６）の記述のように行なった。つまり、再形成ヒト可変部遺伝子を合成するための２段階ＰＣＲ増幅プロトコルを使用し、ＦＲ修飾をコードするＰＣＲプライマーをキメラＣ２２５Ｖ_K遺伝子のＤＮＡテンプレートにアニールする。その結果、キメラＣ２２５Ｖ_KのＦＲＤＮＡ配列は、プライマーによって再形成ヒトカッパー軽鎖可変部遺伝子２２５ＲＫ_Aの配列に修飾された。新しく合成された再形成可変部遺伝子をカラム精製後にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、アガロースゲルで精製し、ｐＵＣ１９にサブクローニングした（同じ方法で消化およびアガロースゲル精製して）。新たに構築されたプラスミドｐＵＣ−２２５ＲＫ_Aを次にＸＬ１ブルー・コンピテント細胞に形質転換した。推定陽性クローンはＰＣＲスクリーニングによって同定（プライマーＲＳＰおよびＵＰを使用）し、次いでそれらの一体性とＰＣＲエラーが存在しないことを確認する両方の目的で、最終的にｄｓ−ＤＮＡ配列決定を行った。確認された陽性クローンから個々のクローンを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとして直接ヒトカッパー軽鎖哺乳類発現ベクター（ｐＫＮ１００）中に挿入し、プラスミドｐＫＮ１００−２２５ＲＫ_Aを作製した。このベクター構築物の完全性はＰＣＲスクリーニング（プライマーＨＣＭＶｉおよびＮＥＷ．ＨＵＫを使用して）と制限消化分析により確認した。再形成ヒトＨ２２５ＫＶ_KのバージョンＢ（２２５ＲＫ_B）は、オリゴヌクレオチドプライマー２２５ＲＫ_B．Ｋ４９ＹおよびＡＰＣＲ４０（表１１）を使用して構築した。６５．５μｌの滅菌蒸留／脱イオン水、５μｌの２ng／μｌプラスミドｐＵＣ−２２５ＲＫ_AテンプレートＤＮＡ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液１１、６μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ₂、各２μｌのｄＮＴＰの１０ｍＭストック溶液、２２５ＲＫ_B．Ｋ４９ＹとプライマーＡＰＣＲ４０の２．５μｌアリコリメラーゼを含む１００μｌのＰＣＲ反応混合液を、５０μｌの鉱油でオーバーレイし、ＤＮＡサーマル・サイクラーに充填した。ＰＣＲ反応は、２段階プロトコルを２５サイクル繰り返してＰＣＲ増幅し、このＰＣＲ産物をＭｓｃＩで切断する前にカラム精製した。プラスミドｐＵＣ−２２５ＲＫ_AもまたＭｓｃＩで切断し、消化したＰＣＲ産物およびこのプラスミドフラグメントの両方をアガロースゲル精製した。このＰＣＲ産物を次に、ＸＬ１ブルー・コンピテント細胞に形質転換する前に、ｐＵＣ−２２５ＲＫ_AにクローニングしてｐＵＣ−２２５ＲＫ_B を作り出した。推定陽性形質転換体は、先ずプライマー２２５ＲＫ_B．Ｋ４９ＹおよびＰＣＲスクリーニング検定でＵＰを使用して同定し、次いでｄｓ−ＤＮＡ配列により確認した。選択された個々のクローンは最終的にｐＫＮ１００にサブクローニングし、プラスミドｐＫＮ１００−２２５ＲＫ_Bを産生させ、プライマーＨＣＭＶｉおよびＮＥＷ．ＨＵＫ（表６）を使用したＰＣＲスクリーニング検定と制限分析の両者でその正しい構築物を確認した。再形成ヒトＨ２２５Ｖ_H領域の第１バージョン（２２５ＲＨ_A）の構築もまた、基本的にはサトウら（２６）の記述のように行なった。再形成ヒト２２５ＲＨ_A 遺伝子の場合には、ＰＣＲプライマー（表２）を、再形成ヒトカッパー軽鎖可変部遺伝子の５’の半分を作り出すために先にヒューマナイズされたｍＡｂのＤＮＡテンプレートと、再形成ヒトカッパー軽鎖可変部遺伝子の３’の半分を合成するためにキメラＣ２２５Ｖ_H遺伝子の両方へアニールした。ここでもまた２段階ＰＣＲ増幅プロトコルを使用し、作り出された再形成可変部遺伝子は、アガロースゲル精製したＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＵＣ１９ベクター中にクローニングし、プラスミドｐＵＣ−２２５ＲＨ_Aを作り出した。推定陽性クローンはＰＣＲスクリーニングによって同定（プライマーＲＳＰおよびＵＰを使用）し、次いでそれらのＤＮＡ配列を確認し、ＰＣＲエラーが存在しないことを確認する両方の目的で最終的にｄｓ−ＤＮＡ配列決定を行った。確認された陽性クローンから個々のクローンを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとして直接ヒトγ重鎖哺乳類発現ベクターｐＧ１Ｄ１０５中に挿入し、プラスミドｐＧ１Ｄ１０５−２２５ＲＨ_Aを作り出した。このプラスミドの構築は次にプライマーＨＣＭＶｉおよびγＡＳ（表６）を使用したＰＣＲスクリーニング検定と制限分析の両者によって確認した。再形成ヒトＨ２２５Ｖ_HのバージョンＢ（２２５ＲＨ_B）は、下記のように２段階ＰＣＲ突然変異法により合成した。２つの別々の１００μｌＰＣＲ反応混合物をまず、６５．５μｌの滅菌蒸留／脱イオン水、５μｌの２ng／μｌプラスミド、ｐＵＣ−２２５ＲＨ_AテンプレートＤＮＡ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、６μｌの２５mM ＭｇＣｌ₂、ｄＮＴＰの１０mM保存溶液各２μｌ、ならびに最初のＰＣＲ反応においてはプライマーＡＰＣＲＩＯおよび２２５ＲＨ_B．Ｔ４１Ｐ−ＡＳ、第２のＰＣＲ反応においてはプライマーＡＰＣＲ４０と２２５ＲＨ_B．Ｔ４１Ｐ−Ｓ（表１３）の２．５μｌアリコートラーゼを混合することにより調製した。２つのＰＣＲ反応混合物のそれぞれを５０μｌの鉱油でオーバーレイし、ＤＮＡサーマル・サイクラーに充填し、２段階プロトコルを使用して２５サイクルＰＣＲ増幅した。５０μｌの蒸留／脱イオン水に再懸濁する前に、２つのＰＣＲ産物をアガロースゲル精製してＰＣＲ反応で残っているテンプレートＤＮＡをすべて分離し、それらの濃度を確定した。第２のＰＣＲ反応においては、第１ＰＣＲ反応からの２つのＰＣＲ産物のそれぞれの２０ｐモルのアリコート（８μｌのＡＰＣＲ１０／２２５ＲＨ_B．Ｔ４１Ｐ−ＡＳＰＣＲ産物および１０μｌのＡＰＣＲ４０／２２５ＲＨ_B．Ｔ４１Ｐ− ＳＰＣＲ産物に相当）を、５７．５μｌの滅菌蒸留／脱イオン水、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、６μｌの２５mM ＭｇＣｌ₂、ｄＮＴＰのリメラーゼに加えた。このＰＣＲ反応を鉱油でオーバーレイし、２段階プロトコルを７サイクルだけ行なってＰＣＲ増幅した。次に第３のＰＣＲ反応を、１μｌの第２のＰＣＲ反応の産物、６９．５μｌの滅菌蒸留／脱イオン水、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、６μｌの２５mM ＭｇＣｌ₂、ｄＮＴＰの１０mMストック溶液のそれぞれ２μｌ、ネステッドプライマーＲＳＰとＵＰの２．５μｌアＤＮＡポリメラーゼを包含させて調製した。このＰＣＲ反応に鉱油をオーバーレイし、最後の２５サイクルを２段階プロトコルを使用して増幅した。このＰＣＲ産物を次にカラム精製し、アガロースゲル精製ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ消化ならびにアガロースゲル精製プラスミドｐＵＣ１９にサブクローニングし、そして最終的にＸＬ１ブルー・コンピテント細胞に形質転換した。推定陽性形質転換個体を先述のように最初に同定し、次いで確認した。選定した個々のクローンをｐＧ１Ｄ１０５にサブクローニングし、プラスミドｐＧ１Ｄ１０５−２２５ＲＨ_Bを産生させた。これをプライマーＨＣＭＶｉとγＡＳ（表６）を使用したＰＣＲスクリーニング検定と制限分析により確認した。再形成ヒトＨ２２５Ｖ_HのバージョンＣ（２２５ＲＨ_B）は、２２５ＲＫ_Cと同様の方法で合成した。６５．５μｌの滅菌蒸留／脱イオン水、５μｌの２mg／μ ｌプラスミドｐＵＣ−２２５ＲＨ_AテンプレートＤＮＡ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、６μｌの２５mM ＭｇＣｌ₂、各２μｌのｄＮＴＰの１０mM保存溶液、プライマーＡＰＣＲ４０と２２５ＲＨ_C．Ｔ６８Ｓ／Ｓ７０Ｎ（表１３）の２．５μｌアリコート（それぞれ１０μＭ）、および０．５μｌのを調製した。ＰＣＲ反応を鉱油でオーバーレイし、２段階プロトコルを２５サイクル使用してＰＣＲ増幅し、ＳａＩＩおよびＢａｍＨＩで消化する前にカラム精製した。プラスミドｐＵＣ−２２５ＲＨ_AもまたＳａＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、消化ＰＣＲ産物とプラスミドの両方をアガロースゲル精製した。このＰＣＲ産物を次にｐＵＣ−２２５ＲＨ_Aにクローニングし、ＸＬ１ブルー・コンピテント細胞に形質転換する前にｐＵＣ−２２５ＲＨ_Cを作り出した。推定陽性形質転換個体をまずプライマーＲＳＰとＵＰを使用したＰＣＲスクリーニング検定で同定し、その後ｄｓ−ＤＮＡ配列決定により確認した。選択した個々のクローンを次にｐＧ１Ｄ１０５中にサブクローニングしてプラスミドｐＧ１Ｄ１０５−２２５ＲＨ_Cを産生させた。このベクターの正しい構築は、プライマーＨＣＭＶｉとγＡＳ（表６）を使用したＰＣＲスクリーニング検定と制限分析で最終的に検証した。再形成ヒトＨ２２５Ｖ_HのバージョンＤ（２２５ＲＨ_D）は、Ｈ２２５抗体の再形成ヒト重鎖のバージョンＢおよびＣに変化を取り入れた産物である。思いがけないことに、ｐＵＣ−２２５ＲＨ_BとｐＵＣ−２２５ＲＨ_Cの両方をＳａＩＩとＢａｍＨＩで消化することにより、これらの重鎖可変部遺伝子に作られた変化を融合させることが可能である。ｐＵＣ−２２５ＲＨ_Bからの２．９５ｋｂベクターフラグメントとｐＵＣ−２２５ＲＨ_Cからの約１８０ｂｐの挿入フラグメントを連結する前にアガロースゲル精製し、ＸＬ１ブルー・コンピテント細胞に形質転換した。陽性形質転換個体を同定し、選択した個々のクローンをｐＧ１Ｄ１０５にサブクローニングしてプラスミドｐＧ１Ｄ１０５−２２５ＲＨ_Dを産生させる前に、ｄｓ−ＤＮＡ配列した。このベクターの正しい構築は前述の通りにして最終的に確認した。再形成ヒトＨ２２５Ｖ_HのバージョンＥ（２２５ＲＨ_E）は、２２５ＲＨ_Aの誘導体であり、プライマーＡＰＣＲ４０と２２５ＲＨ_E．Ｌ７８Ｖ（表１３）を使用して２２５ＲＨ_Cと同じ方法で合成した。プラスミドｐＵＣ−２２５ＲＨ_Eから選択した２２５ＲＨ_EクローンをｐＧ１Ｄ１０５にサブクローニングし、ベクターｐＧ１Ｄ１０５−２２５ＲＨ_Eを産生させ、これが正しい構築物であることを通常の方法で検証した。実施例ＩＶ−８ＣＯＳ細胞へのＤＮＡのトランスフェクションケトルボローらの方法（１１）を用いてＣＯＳ細胞へ哺乳類発現ベクターをトランスフェクトした。実施例ＩＶ−９リコンビナント２２５抗体のプロテインＡ精製キメラＣ２２５抗体と種々の再形成ヒトＨ２２５抗体構築物をともにコルビンジャー[Kolbinger]ら記述のプロトコル（２７）に基づいてプロテインＡ精製を行なった。実施例ＩＶ−１０マウス抗体のＥＬＩＳＡ９６穴Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅＭａｘｉＳｏｒｐ^TM免疫プレートの各ウェルを、先ず塗覆用緩衝液（０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、pH９．６）で稀釈した０．５ng／μｌヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異性）抗体の１００μｌアリコートで被覆し、一晩４℃でインキュベートした。ウェルを２００μ ｌ／ウェルのマウス遮断（ブロッキング）緩衝液（ＰＢＳ中２．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）により３７℃で１時間遮断し、その後２００μｌ／ウェルの洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％（ｖ／ｖ）トイーン−２０[Tween-20]）アリコートで３回洗浄した。１００μｌ／ウェルの実験用サンプル（すなわち、Ｍ２２５ハイブリドーマ細胞系から採取した培地を遠心分離して細胞破片を除去したもの）アリコートおよびサンプル−酵素接合緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（pH７．０）、０．１ＭＮａＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）トイーン−２０および０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）に希釈した１：２サンプル稀釈液を免疫プレート上に分配した。さらに、１０００ng／ml濃度から連続的に１：２稀釈した精製マウスＩｇＧ標準液を免疫プレート上に加えた。この免疫プレートを３７℃で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ／ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合体をサンプル−酵素接合体緩衝液で１０００倍に稀釈したものを各ウェルに加えた後、免疫プレートを３７℃で１時間インキュベートし、前記と同様に洗浄した。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質Ａ：ペルオキシダーゼ基質Ｂ（１：１）の１００μ ｌアリコートを各ウェルに加え、１０分間ＲＴの暗所でインキュベートした。各ウェルに５０μｌの１ＮＨ₂ＳＯ₄を加えて反応を停止させた。４５０nmにおける光学密度を最終的にＢｉｏ−Ｒａｄ３５５０マイクロプレート・リーダーとマイクロプレート・マネージャー^TMを組み合わせて使用して確定した。実施例ＩＶ−１１全長ヒトγ１／κ抗体のＥＬＩＳＡによる定量９６穴Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅＭａｘｉＳｏｒｐ^TMイムノプレートの各ウェルを、先ず塗覆用緩衝液（０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、pH ９．６）で稀釈した０．５ng／μｌヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異性）抗体の１００μｌアリコートで被覆し、一晩４℃でインキュベートした。ウェルを２００ μｌ／ウェルのヒト遮断緩衝液（ＰＢＳ中２．０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）によりＲＴで２時間遮断し、その後２００μｌ／ウェルの洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％（ｖ／ｖ）トイーン−２０[Tween-20]）アリコートで３回洗浄した。１００ μｌ／ウェルの実験用サンプルのアリコート（すなわち、採取したＣＯＳ細胞を遠心分離して細胞破片を除去した上澄み）、およびサンプル−酵素接合緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（pH７．０）、０．１ＭＮａＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）トイーン−２０および０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）に希釈した１：２サンプル稀釈液を免疫プレート上に分配した。さらに、標準として使用する１２連続稀釈した精製ヒトγ１／κ抗体を免疫プレート上に加えた。この免疫プレートを３７℃で１時間インキュベートした後、２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌのヤギ抗ヒトカッパ軽鎖／ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合体をサンプル−酵素接合体緩衝液で５０００倍に稀釈したものを各ウェルに加えた後、免疫プレートを３７℃で１時間インキュベートし、前記と同様に洗浄した。その後のプロトコルはマウス抗体ＥＬＩＳＡの場合と同様にした。実施例ＩＶ−１２ＥＧＦＲ抗原結合の検出のためのＡ４３１細胞のＥＬＩＳＡＡ４３１細胞の表面に発現されたＥＧＦＲに対するリコンビナント２２５抗体構築物の相対的結合能を判定するための方法は、イムクローン・システムズ社[I mClone Systems Inc.]の提供する方法に基づいた。Ａ４３１細胞を９６穴平底組織培養プレート上に入れ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地中で３７℃および５％ＣＯ₂で一晩インキュベート。翌日培地を取り除き、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、次いでＰＢＳ中０．２５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド１００μｌ／ウェルで固定した。これを取り除き、プレートを再びＰＢＳで洗浄し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳに入れた１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにより３７℃で２時間遮断した。遮断溶液を取り除き、１００μｌ／ウェルアリコートの実験用サンプル（すなわち、採取ＣＯＳ細胞の上清を遠心分離して細胞破片を除去したもの）およびそれらの１：２サンプル稀釈液（ＰＢＳに入れた１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで稀釈したもの）を組織培養プレート上に塗布した。さらに、標準として使用する、２０μｇ／mlの開始濃度から１：５で連続的に稀釈した精製ヒトγ１／κ 抗体の８０μｌ／ウェルのアリコートもプレートに加えた。この免疫プレートを３７℃で１時間インキュベートした後、２００μｌ／ウェルの０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で３回洗浄した。１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合体をＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで５０００倍に稀釈したものを各ウェルに加えた後、免疫プレートを３７℃で１時間インキュベートし、先ず２００μｌ／ウェルの０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で（３回）、次に蒸留脱イオン水（２回）で洗浄した。その後のプロトコルはマウス抗体ＥＬＩＳＡの場合と同様であった。実施例ＩＶ−１３Ｍ２２５抗体の可変部のクローニングと配列決定ＲＮＡ精製のために細胞を採取する時点でのＭ２２５ハイブリドーマ細胞からの培地中のマウス抗体の存在を、マウス抗体ＥＬＩＳＡを使用して検証した。第一ストランド合成に続き、１本鎖ｃＤＮＡテンプレートを２シリーズの縮重プライマー、すなわち１シリーズはカッパー軽鎖シグナルペプチド／可変部遺伝子特異性のもの（表４）と、２番目のシリーズは重鎖シグナルペプチド／可変部遺伝子特異性のもの（表５）を使用してＰＣＲ増幅した。これらのプライマーを使用してＭ２２５ハイブリドーマ細胞系からＭ２２５抗体のＶ_K遺伝子およびＶ_H遺伝子の両方をＰＣＲクローニングした。プライマーＭＫＶ４（κ軽鎖シグナルペプチドのＤＮＡ配列の５’末端にアニール）およびＭＫＣ（マウスκ不変領域遺伝子の５’末端にアニールするように設計されたもの）を使用して、Ｍ２２５κ軽鎖可変部遺伝子を約４１６bpフラグメントとしてＰＣＲクローニングした。同様にして、プライマーＭＨＶ６（重鎖シグナルペプチドのＤＮＡ配列の５’末端にアニール）およびＭＨＣＧ１（マウスγ１重鎖遺伝子のＣＨ₁ドメインの５’末端にアニールするように設計したもの）を使用して、Ｍ２２５重鎖可変部遺伝子を、約４４６bpフラグメントとしてＰＣＲクローニングした。マウスＭ２２５可変部遺伝子の野生型配列への導入エラーの可能性、すなわちに厳格なプロトコルを使用した。別々の全ＲＮＡ調製およびそれに続く第一ストランドｃＤＮＡ合成反応のそれぞれからの少なくとも２つのＰＣＲ産物をＰＣＲクローニングし、次いでＭ２２５ｍＡｂのκ軽鎖および重鎖可変部遺伝子両方のＤＮＡ鎖について完全にＤＮＡ配列決定を行なった。これら各ＰＣＲ反応からのいくつかの個々のクローンのＤＮＡ配列分析から、マウスＭ２２５抗体Ｖ_KおよびＶ_H遺伝子はそれぞれ図１３および１４に示されているように確定された。Ｍ２２５Ｖ_KおよびＶ_H領域のアミノ酸配列を他のマウス可変部、ならびにカバットのデータベース（２０）に細分されている可変部のサブグループのコンセンサス配列とも比較した。この分析からＭ２２５Ｖ_K領域はマウスκサブグループＶのコンセンサス配列と最も近似しており、このサブグループに対して６２．６２％の同一性と７６．６４％の類似性を有することが判明した。しかしながら、このκ軽鎖可変部はまたマウスκサブグループＩＩＩとも６１．６８％の同一性とコンセンサス配列に対する７６．６４％の類似性という極めて高い適合性を示した。Ｍ２２５κ軽鎖可変部のＦＲだけ（すなわち、ＣＤＲ中のアミノ酸を除く）をマウスサブグループＩＩＩおよびＶと比較した場合、同一性はこの両方のサブグループに対して６６．２５％に上がり、一方類似性はサブグループＩＩＩに対して７８．７５％、そしてサブグループＶに対してはちょうど８０．００％に増加した。Ｍ２２５Ｖ_H領域の同様の分析によって、この領域はカバット・データベース（２０）のマウス重鎖サブグループＩＢのコンセンサス配列に極めて近い適合性を示した。Ｍ２２５のマウス重鎖可変部アミノ酸配列とサブグループＩＢのコンセンサス配列の同一性は７８．１５％と測定され、一方類似性は８４．８７％と計算され、その他のコンセンサス配列はこれらの値にはるか及ばなかった。これらの結果から、このマウスＭ２２５可変部が典型的なマウス可変部であることが確認された。実施例ＩＶ−１４キメラＣ２２５抗体の構築と発現Ｃ２２５Ｖ_KおよびＶ_H遺伝子を構築するために調製された２つのＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして別々にｐＵＣ１９にサブクローニングし、推定陽性形質転換体を同定するためにＰＣＲスクリーニングした。同定されたそれら形質転換体を次にｄｓ−ＤＮＡ配列決定し、それらが合成されていることを確認し、次いでそれぞれの哺乳類発現ベクター中にサブクローニングした。キメラＣ２２５κ軽鎖および重鎖可変部のＤＮＡおよびアミノ酸配列はそれぞれ図１５および１６に示されている。正しい挿入が存在することを確認するためのＰＣＲスクリーニングと制限分析により発現ベクターの完全性が確認された後、これらベクターをＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクトした。７２時間のインキュベーション後、培地を回収し、細胞破片を遠心分離により取り除き、抗体の産生およびＥＧＦＲへの結合をＥＬＩＳＡにより分析した。残念ながら、キメラ抗体はこのＣＯＳ細胞同時トランスフェクションの上清中には検出されなかった。Ｃ２２５Ｖ_Kのリーダー配列の分析により、これはマウスκ軽鎖サブグループＩＩＩおよびＶのその他のκ軽鎖可変部のリーダー配列（２０）と比較して異常であることが判明した。より好適なリーダー配列を見つけ出すために、カバット・データベースを分析し、Ｃ２２５Ｖ_Kアミノ酸配列にマッチし、かつシグナルペプチド配列が既知の個々のκ軽鎖を同定した。この調査によりマウス抗体Ｌ７ ’ＣＬ（２８）が、Ｃ２２５Ｖ_K領域に対して９４．７９％の同一性と９４．７９％の類似性を示し、かつＦＲ１については完全にマッチし、分泌中のシグナルペプチドの切り出しに重要な役割を果たすものであることを見出した。Ｌ７’ＣＬκ軽鎖シグナルペプチドのアミノ酸配列（すなわち、ＭＶＳＴＱＦＬＶＦＬＬＦＷＩＰＡＳＲＧ（配列番号：３６））は、疎水性核などのシグナル配列において重要と考えられるすべての特性を示し、したがってＰＣＲクローニング２２５Ｖ_Kのシグナルペプチドをこの新しい配列で置き換えることを決定した。もう１つ興味深い点は、Ｍ２２５Ｖ_KとＬ７’ＣＬシグナルペプチドの間の差はほとんどすべて、Ｍ２２５Ｖ_K遺伝子が最初にＰＣＲクローニングされたとき、ＭＫＶ４プライマーがシグナルペプチドの最初の１１のアミノ酸にアニールされた５’ 末端（すなわち最初の３３塩基でこれはシグナルペプチドの最初の１１のアミノ酸に相当する）で起きていることであった。したがって、これらの差異はプライマーで誘発されたシグナルペプチドのＤＮＡ配列のエラーであると考えられる。Ｃ２２５Ｖ_KテンプレートのＰＣＲ突然変異誘発では約３９０bpの産物を産生した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩで消化および精製したフラグメントを次に同じように消化およびアガロースゲル精製したプラスミドｐＵＣ−Ｃ２２５Ｖ_K中にサブクローニングし、ＸＬ１ブルー・コンピテント細胞中に形質転換した。推定陽性形質転換体を同定し、次いでｄｓ−ＤＮＡ配列決定した。Ｃ２２５Ｖ_Kｓｐ遺伝子（図１７）をｐＫＮ１００にサブクローニングし、得られた発現ベクター（ｐＫＮ１００−Ｃ２２５Ｖ_Kｓｐ）をＰＣＲ選別および制限消化して、正しい挿入物の存在を確認した。このベクターを最終的にＣＯＳ細胞中にｐＧ１Ｄ１０５−Ｃ２２５Ｖ_Hと同時トランスフェクションし、７２時間のインキュベーション後に培地を回収し、細胞破片を遠心分離で取り除き、ＥＬＩＳＡにより抗体の産生とＥＧＦＲに対する結合を分析した。この場合には、キメラＣ２２５抗体がＣＯＳ細胞の同時トランスフェクションの上清中に濃度約１５０ng／mlで検出され、またこの抗体は細胞ＥＬＩＳＡにおいてＥＧＦＲに結合した。図１８はそうした実験の典型的な例の１つを示している。実施例ＩＶ−１５再形成Ｈ２２５抗体（２２５ＲＫ_K／２２５ＲＨ_A）の構築と発現再形成ヒトＨ２２５κ軽鎖可変部の第１バージョン（２２５ＲＫ_A）の構築では約４１６bpの産物を産生し、これを次にＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＵＣ１９中にサブクローニングした。推定陽性形質転換体はＰＣＲスクリーニング検定とそれに続くｄｓ−ＤＮＡ配列により同定された。２２５ＲＫ_A 遺伝子（図１９）をｐＫＮ１００中にサブクローニングし、得られた発現ベクター（ｐＫＮ１００−２２５ＲＫ_A）をＰＣＲスクリーニングおよび制限消化して正しい挿入物の存在を確認した。同様に再形成ヒトＨ２２５重鎖可変部の第１バージョン（２２５ＲＨ_A）の構築では約４４６bpの産物を産生し、これを次にＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＵＣ１９中にサブクローニングした。ここでも推定陽性形質転換体をＰＣＲスクリーニング検定と、それに続くｄｓ−ＤＮＡ配列により同定した。２２５ＲＨ_A遺伝子（図２０）をｐＧ１Ｄ１０５中にサブクローニングし、得られた発現ベクター（ｐＧ１Ｄ１０５−２２５ＲＨ_A）をＰＣＲスクリーニングおよび制限消化して正しい挿入物の存在を確認した。これらのベクターを次にＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクトし、７２時間のインキュベーション後に培地を回収し、細胞破片を遠心分離で取り除き、ＥＬＩＳＡにより抗体の産生とＥＧＦＲに対する結合を分析した。ＣＯＳ細胞上清中の再形成ヒト抗体の濃度は、Ｃ２２５キメラ抗体の一時的発現に続くものよりは若干高かった（約２００ng／ml）。加えて、ＥＧＦＲに対する高いレベルの結合が細胞ＥＬＩＳＡで示された。図８はそうした実験の典型的な例を示すもので、再形成ヒトＨ２２５抗体（２２５ＲＫ_A／２２５ＲＨ_A）が、キメラＣ２２５抗体の約６５％の相対親和力で、Ａ４３１細胞の表面に発現されたＥＧＦＲに結合していることを示している。構築された２つのバージョンのκ軽鎖再形成ヒトＨ２２５可変部のアミノ酸配列を図２１に示し、一方構築された重鎖再形成ヒトＨ２２５可変部の５つのバージョンのアミノ酸配列を図２２に示した。実施例ＩＶ−１６レファレンス実施例ＩＶ−１７表表４Ｍ２２５カッパ軽鎖可変部遺伝子のクローニングに使用した、縮重した特異的ＰＣＲプライマー表５Ｍ２２５重鎖可変部遺伝子のクローニングに使用した、縮重した特異的ＰＣＲプライマー表６形質転換コロニーのＰＣＲスクリーニングのためのプライマー表７キメラＣ２２５抗体カッパ軽鎖及び重鎖可変部遺伝子を構築し、且つＣ２２５抗体カッパ軽鎖のシグナルペプチド配列を修飾するためのプライマー表８再形成ヒトＨ２２５抗体カッパ軽鎖可変部（225RK_A）の第一バージョンデザインを導くアミノ酸配列アラインメント表９再形成ヒトＨ２２５抗体重鎖可変部（225RH_A）の第一バージョンデザインを導くアミノ酸配列アラインメント表１０再形成ヒト抗体Ｈ２２５カッパ軽鎖可変部遺伝子225RK_A作成用プライマー表１１再形成ヒト抗体Ｈ２２５カッパ軽鎖可変部遺伝子225RK_B作成用プライマー表１２再形成ヒト抗体Ｈ２２５重鎖可変部遺伝子225RH_A作成用プライマー表１３再形成ヒト抗体Ｈ２２５重鎖可変部遺伝子225RH_B、225RH_C、225RH_D、及び225RH_E作成用プライマーａ MKVはマウスカッパ軽鎖可変部遺伝子のリーダー配列にハイブリダイズするプライマーを示す。ｂ MKCはマウスカッパ定常部遺伝子にハイブリダイズするプライマーを示す。ａ MHVはマウス重鎖可変部遺伝子のリーダー配列にハイブリダイズするプライマーを示す。ｂ MHCG はマウス定常部遺伝子にハイブリダイズするプライマーを示す。記号の説明:（*）は不変残基で、カバットサブグループ（カバットら、1991年）内で95％以上の出現を示すカバットコンセンサス配列により定義される（第５及び第６欄における場合）か、又はコチア(Chothia)ら(1989年)により定義されたＣＤＲループ（第８欄）に対する標準型構造の一部として定義される。Fr 及びC DR における（太字）は、ヒトアミノ酸残基が対応マウス残基により置換される位置。Fr における（下線）は位置で、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置。（δ）はヒトFr内の変化の番号。（マウスC225）はキメラC225抗体からのV_L領域アミノ酸配列。（マウス-V）はサブグループV(カバットら、1991年)からのマウスカッパV_L領域コンセンサス配列。（ヒト-III）はサブグル−プV(カバットら、1991年)からのヒトV_L域コンセンサス配列。（ヒトドナ−LS7'CL）はヒトLS7'CL抗体（シルバースタイン(Silberstein)，L.E．ら、1989年）からのアミノ酸配列。（表面又は埋没）は抗体可変部両鎖の残余残基に関連したアミノ酸の位置。(225RK_A)は再形成ヒトmAb H225 V_K領域第一バージョンのアミノ酸配列。（コアパッキングAA/ パッキングAA）はコチアらが(1985年)に定義したV_L/V_Hインターフェースに位置するアミノ酸。（標準型AA）はコチア及びレスク(Lesk)(1 987年)、コチアら(1989年)、トラモンタノ(Tramontano)ら(1990年)、及びコチアら(1992年)がCDRループコンフォメーションに重要であると定義したアミノ酸。記号の説明:（*）は不変残基で、カバットサブグループ（カバットら、1991年）内で95％以上の出現を示すカバットコンセンサス配列により定義される（第５及び第６欄における場合）か、又はコチア(Chothia)ら(1989年)により定義されたＣＤＲループ（第８欄）に対する標準型構造の一部として定義される。Fr及びCD Rにおける（太字）は、ヒトアミノ酸残基が対応マウス残基により置換される位置。Frにおける（下線）は位置で、ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なる位置。（δ）はヒトFr内の変化の番号。（マウスC225）はキメラC225抗体からのV_L 領域アミノ酸配列。(マウス-IB)はサブグループIB(カバットら、1991年)からのマウスカッパV_H領域コンセンサス配列。（ヒト-III）はサブグループIII(カバットら、1991年)からのヒトV_H領域コンセンサス配列。（ヒトドナー38P1）はヒト抗体38P1'CL(シュローダーJr.(Schroeder Jr.)ら、1987年)からのアミノ酸配列。（表面又は埋没）は抗体可変部両鎖の残余残基に関連したアミノ酸の位置。（ 225RH_A）は再形成ヒトmAbH225 V_H領域の第一バージョンのアミノ酸配列。(再形成ヒトmAbH225 V_H領域の第一バージョンのコアパッキング（コアパッキングAA/ パッキングAA）はコチア(Chothia)らが(1985年)に定義したV_L/V_Hインターフェースに位置するアミノ酸。(標準型AA)はコチア及びレスク(1987年)、コチアら(198 9年)、トラモンタノ(Tramontano)ら(1990年)、及びコチアら(1992年)がCDRループコンフォメーションに重要であると定義したアミノ酸。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 ＬＹ 45/00 45/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 7/08 16/46 16/46 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジョーンズ，スティーブン，タラーン英国８エイチエーハートフォードシェアーダブリューディー７，ラドレット, ザクローズ 10 (72)発明者サルダンハ，ヨーゼ，ウィリアム英国１ティーイーミドルセックスイーエヌ１，アンフィールド，リンカーンウェイ 22エー

Claims

【特許請求の範囲】１．抗体の不変部および可変軽鎖が欠失したポリペプチドであって、ＮＹＧＶＨ、ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲ、またはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。２．請求項１に記載のポリペプチドであって、ＮＹＧＶＨで表されるアミノ酸配列およびＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲまたはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。３．ＮＹＧＶＨまたはＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲで表されるアミノ酸配列がらなるポリペプチド。４．ＮＹＧＶＨまたはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳで表されるアミノ酸配列がらなるポリペプチド。５．エフェクター分子に接合されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。６．エフェクター分子が腫瘍の成長を抑制するものである、請求項５に記載のポリペプチド。７．エフェクター分子が細胞毒性を有するものである、請求項５に記載のポリペプチド。８．エフェクター分子がドキソルビシンである、請求項５に記載のポリペプチド。９．エフェクター分子がシスプラチンである、請求項５に記載のポリペプチド。１０．エフェクター分子がタキソールである、請求項５に記載のポリペプチド。１１．エフェクター分子がシグナル導入インヒビターである、請求項５に記載のポリペプチド。１２．エフェクター分子がｒａｓインヒビターである、請求項５に記載のポリペプチド。１３．エフェクター分子が細胞サイクルインヒビターである、請求項５に記載のポリペプチド。１４．抗体の不変部および可変軽鎖が欠失したポリペプチドをコードするＤＮＡであって、当該ポリペプチドがＮＹＧＶＨ、ＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲ、またはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳで表されるアミノ酸配列を含むものであるＤＮＡ。１５．ＮＹＧＶＨで表されるアミノ酸配列およびＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲまたはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳで表されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。１６．エフェクター分子に接合されたものである、請求項１４に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。１７．エフェクター分子が腫瘍の成長を抑制するものである、請求項１６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。１８．ヒト抗体の不変部及びエフェクター分子に接合したモノクローナル抗体２２５の超可変部を有する分子。１９．エフェクター分子が細胞毒性剤である、請求項１８に記載の分子。２０．細胞毒性剤がドキソルビシンである、請求項１９に記載の分子。２１．細胞毒性剤がタキソールである、請求項１９に記載の分子。２２．細胞毒性剤がシスプラチンである、請求項１９に記載の分子。２３．ヒト抗体の不変部と、ヒト抗体のＣＤＲ以外の可変部と、カッパ軽鎖と重鎖を含む可変部と、モノクローナル抗体２２５のＣＤＲとを含む分子。２４．不変部がＩｇＧのアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の分子。２５．ＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項２４に記載の分子。２６．実施例ＩＶに従って再形成した、請求項２３に記載の分子。２７．重鎖が、少なくとも一個のアミノ酸をカバットの番号システムで位置２４、２８、２９、３０、４１、４８、４９、６7、６８、７０、７１、及び７８からなる群から選択されるアミノ酸位置に有し、対応するカバットのアミノ酸位置から選択されるマウスアミノ酸で置換されている、請求項２３に記載の分子。２８．カッパ軽鎖が、カバットの番号システムで位置４９のアミノ酸位置にアミノ酸を有し、対応するカバットのアミノ酸位置がら選択されるマウスアミノ酸で置換されている、請求項２３に記載の分子。２９．カッパ軽鎖可変部が２２５ＲＫ_Aまたは２２５ＲＫ_Bから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の分子。３０．重鎖可変部が２２５ＲＨ_A、２２５ＲＨ_B、２２５ＲＨ_C、２２５ＲＨ_D、または２２５ＲＨ_Eから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の分子。３１．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Aを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Aを有する、請求項２３に記載の分子。３２．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Aを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Bを有する、請求項２３に記載の分子。３３．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Aを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_C有する、請求項２３に記載の分子。３４．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Aを有し、重鎮可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Dを有する、請求項２３に記載の分子。３５．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Aを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Eを有する、請求項２３に記載の分子。３６．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Aを有する、請求項２３に記載の分子。３７．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Bを有する、請求項２３に記載の分子。３８．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Cを有する、請求項２３に記載の分子。３９．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Dを有する、請求項２３に記載の分子。４０．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Eを有する、請求項２３に記載の分子。４１．エフェクター分子に付着したものである、請求項２３に記載の分子。４２．エフェクター分子が細胞毒性剤である、請求項３９に記載の分子。４３．細胞毒性剤がドキソルビシンである、請求項４０に記載の分子。４４．細胞毒性剤がタキソールである、請求項４０に記載の分子。４５．細胞毒性剤がシスプラチンである、請求項４０に記載の分子。４６．請求項１に記載のポリペプチドの有効量をヒトに投与することを特徴とする、ヒトにおける腫瘍の成長を顕著に抑制する方法。４７．請求項３または４に記載のポリペプチドの有効量をヒトに投与することを特徴とする、ヒトにおける腫瘍の成長を顕著に抑制する方法。４８．ヒト抗体の不変部とモノクローナル抗体の可変部とを有する分子の有効量をヒトに投与することを包含する、ヒトにおける腫瘍の成長を顕著に抑制する方法。４９．ヒト抗体の不変部と、ヒト抗体のＣＤＲ以外の可変部と、カッパ軽鎖と重鎖を含む可変部と、モノクローナル抗体２２５のＣＤＲとを有する分子の有効量をヒトに投与することを特徴とする、ヒトにおける腫瘍の成長を顕著に抑制する方法。５０．カッパ軽鎖可変部が２２５ＲＫ_Aまたは２２５ＲＫ_Bから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載の方法。５１．重鎖可変部が２２５ＲＨ_A、２２５ＲＨ_B、２２５ＲＨ_C、２２５ＲＨ_D、または２２５ＲＨ_Eから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載の方法。５２．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Aを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Aを有する、請求項４７に記載の方法。５３．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Aを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Bを有する、請求項４７に記載の方法。５４．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Aを有し、重鎮可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Cを有する、請求項４７に記載の方法。５５．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_A、を有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Dを有する、請求項４７に記載の方法。５６．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Aを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Eを有する、請求項４７に記載の方法。５７．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Aを有する、請求項４７に記載の方法。５８．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Bを有する、請求項４７に記載の方法。５９．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Cを有する、請求項４７に記載の方法。６０．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎮可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Dを有する、請求項４７に記載の方法。６１．カッパ軽鎖可変部がアミノ酸配列２２５ＲＫ_Bを有し、重鎮可変部がアミノ酸配列２２５ＲＨ_Eを有する、請求項４７に記載の方法。６２．更に細胞毒性剤を投与することを特徴とする、請求項４４〜４７のいずれかに記載の方法。６３．細胞毒性剤がドキソルビシンである、請求項６０に記載の方法。６４．細胞毒性剤がタキソールである、請求項６０に記載の方法。６５．細胞毒性剤がシスプラチンである、請求項６０に記載の方法。６６．ポリペプチドがエフェクター分子に接合したものである、請求項４４または４５に記載の方法。６７．分子がエフェクター分子に接合したものである、請求項４６または４７に記載の方法。６８．エフクター分子が細胞毒性を有する、請求項６４に記載の方法。６９．エフクター分子がドキソルビシンである、請求項６４に記載の方法。７０．エフクター分子がシスプラチンである、請求項６４に記載の方法。７１．エフクター分子がタキソールである、請求項６４に記載の方法。７２．エフェクター分子がシグナル導入インヒビターである、請求項６４に記載の方法。７３．エフェクター分子がｒａｓインヒビターである、請求項６４に記載の方法。７４．エフェクター分子が細胞サイクルインヒビターである、請求項６４に記載の方法。７５．エフェクター分子が細胞毒性を有する、請求項６５に記載の方法。７６．エフェクター分子がドキフルビシンである、請求項６５に記載の方法。７７．エフェクター分子がシスプラチンである、請求項６５に記載の方法。７８．エフェクター分子がタキソールである、請求項６５に記載の方法。７９．エフエクター分子がシグナル導入インヒビターである、請求項６５に記載の方法。８０．エフェクター分子がｒａｓインヒビターである、請求項６５に記載の方法。８１．エフェクター分子が細胞サイクルインヒビターである、請求項６５に記載の方法。８２．腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である、請求項４４〜４７のいずれかに記載の方法。８３．前立腺腫瘍細胞が後期前立腺腫瘍細胞である、請求項４４〜４７のいずれかに記載の方法。８４．ヒト抗体の不変部と、ヒト抗体のＣＤＲ以外の可変部と、カッパ軽鎖と重鎖を含む可変部と、モノクローナル抗体２２５のＣＤＲとを有する分子をコードする核酸分子。８５．請求項８４に記載の核酸分子を含むベクター。８６．発現ベクターである、請求項８５に記載のベクター。８７．ベクターが原核細胞中で発現可能である、請求項８６に記載のベクター。８８．ベクターが真核細胞中で発現可能である、請求項８６に記載のベクター。８９．請求項８７に記載の発現ベクターを含む原核細胞。９０．請求項８８に記載の発現ベクターを含む真核細胞。９１．請求項２３に記載の分子と医薬として許容される担体とを含む医薬組成物。