EA017265B1

EA017265B1 - Применение антитела imc-a12, которое является ингибитором igf-ir, для лечения рака предстательной железы

Info

Publication number: EA017265B1
Application number: EA200870231A
Authority: EA
Inventors: Дейл Людвиг; Стефен Р. Плаймейт
Original assignee: Имклоун Элэлси; Юниверсити Оф Вашингтон
Priority date: 2006-02-03
Filing date: 2007-02-03
Publication date: 2012-11-30
Also published as: JP2009525348A; UA95945C2; EP1984011A4; WO2007092453A3; US7972600B2; ECSP088706A; IL193203A0; EP1984011A2; ZA200807012B; JP5198289B2; AU2007212447A1; CN101484587B; EA200870231A1; WO2007092453A2; NO20083444L; AP2008004569A0; CR10188A; KR101353706B1; US20090175868A1; MX2008009977A

Abstract

Изобретение относится к способу лечения рака предстательной железы с помощью терапии депривацией андрогенов и антагониста рецептора инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR). Хотя уровень ответа рака предстательной железы на терапию депривацией андрогенов (ADT) является высоким, выжившие раковые клетки неизбежно становятся андрогеннезависимыми (AI) и опухолевый рост продолжается. В изобретении ингибируют или задерживают переход от андрогензависимого рака к андрогеннезависимому раку, значительно снижая риск возникновения рецидива и улучшая результат лечения.

Description

Настоящее изобретение относится к способу лечения рака предстательной железы посредством терапии депривацией андрогенов и антагониста рецептора инсулиноподобного фактора роста (ΙΟΕ-ΙΚ). Способ ингибирует или задерживает переход андрогензависимого рака в андрогеннезависимый рак, значительно снижает риск возникновения рецидива и улучшает исход лечения.

Предпосылки изобретения

Рак предстательной железы является наиболее распространенным раком некожного происхождения и является второй наиболее часто встречаемой причиной смертности от рака у мужчин в США. Большинство случаев рака предстательной железы вначале является андрогензависимыми (АО). Клеткам рака предстательной железы вначале необходимы андрогены для продолжения пролиферации. Ответ на абляцию тестостерона посредством терапии депривацией андрогенов (АОТ) или хирургически (орхиэктомия), или медикаментозно (агонисты СпКН или эстрогены) приводит к быстрой индукции апоптоза в чувствительных клетках рака предстательной железы.

Положительный уровень ответа составляет приблизительно 86%, исходя из снижения уровня специфического антигена предстательной железы (Р8А) и стабилизации или снижения объема опухоли. Гибель клеток, как правило, происходит в пределах от первых нескольких суток до недели. Однако за положительным ответом следует период остановки роста, при котором остающиеся клетки обладают тенденцией не погибать. Спустя 18-36 месяцев после гормональной абляции рост возобновляется в 90% случаев. Во всех случаях выжившие раковые клетки становятся андрогеннезависимыми или нечувствительными, и следует андрогеннезависимый (ΑΙ) рост опухоли. Так как АОТ вначале является очень эффективной, то может принести большую пользу терапия, которая может обладать преимуществами АОТ и продлевать или усиливать ее эффекты.

Как представляется, независимость от андрогенов возникает посредством множества механизмов. Мутации в гене рецептора андрогенов редко диагностируют, но их частота увеличивается после воздействия антиандрогена флутамида. Однако эти мутации не возникают у большинства пациентов и не объясняют большинство случаев гормонрезистентного заболевания. Высокие уровни Ьс1-2 наблюдают с большей частотой при запущенном заболевании по сравнению с локализованным заболеванием. Таким образом, способность индуцировать апоптоз снижается при прогрессировании заболевания. Пролиферация клеток, несущих мутации в гене опухолевого супрессора р53, утрата рецепторов ТСГ-β и экспрессия пептидных факторов роста, вероятно, играет роль в развитии гормонрезистентного состояния. Однако эти процессы не объясняют скорость и частоту развития.

Рецептор инсулиноподобного фактора роста (ΙΟΕ-ΙΚ.) представляет собой повсеместно распространенный трансмембранный рецептор тирозинкиназы, который необходим для нормального роста и развития плода и постнатального роста и развития. ΙΟΕ-ΙΚ может стимулировать пролиферацию клеток, дифференцировку клеток, изменения размера клеток и защищать клетки от апоптоза. Его также рассматривали в качестве квазинеобходимого для трансформации клеток (рассмотрено в Айапъ с! а1., Сс11. Мо1. ЫГс 8с1. 57:1050-93 (2000); Ваксгда, Опсодспс 19:5574-81 (2000)). ΙΟΓ-ΙΚ. расположен на поверхности клеток большинства типов клеток и служит в качестве сигнальной молекулы для факторов роста ЮГ-Ι и ΙΟΓ-ΙΙ (вместе обозначаемых в дальнейшем ЮГ). ΙΟΕ-ΙΚ также связывается с инсулином, хотя и с величиной аффинности, на три порядка меньшей по сравнению с его связыванием с ЮГ. ΙΟΕ-ΙΚ представляет собой преформированный гетеротетрамер, содержащий две альфа- и две бета-цепи, ковалентно связанные посредством дисульфидных связей. Субъединицы рецептора синтезируются в виде части одиночной полипептидной цепи 180 кДа, которая затем протеолитически процессируется на альфа- (130 кДа) и бета(95 кДа) субъединицы. Вся альфа-цепь является внеклеточной и содержит участок для связывания лиганда. Бета-цепь содержит трансмембранный домен, тирозинкиназный домен и С-концевой участок, который необходим для дифференцировки и трансформации клеток, но является несущественным для опосредованной митогеном передачи сигнала и защиты от апоптоза.

ЮГ-ΙΒ обладает очень сильным сходством с рецептором инсулина (ΙΡ). в частности, в пределах последовательности бета-цепи (70% гомология). Благодаря этой гомологии в недавних исследованиях показали, что эти рецепторы могут образовывать гибриды, содержащие один димер ΙΡ и один димер ЮГ-ΙΒ (РаиФш с! а1., С1ш. Сапс. Иск. 5:1935-19 (1999)). Образование гибридов происходит как в нормальных, так и трансформированных клетках, и содержание гибрида зависит от концентрации двух гомодимерных рецепторов (ΙΡ и ЮГ-ΙΒ) в клетке. В одном исследовании 39 образцов рака молочной железы, хотя как ΙΒ, так и ЮГ-ΙΒ сверхэкспрессировались во всех образцах опухоли, содержание гибридного рецептора постоянно превышало уровни обоих гоморецепторов приблизительно в 3 раза (РапФш с! а1., С1ш. Сапс.

- 1 017265

Век. 5:1935-44 (1999)). Хотя гибридные рецепторы состоят из пар ΙΒ и ЮЕ-ΙΒ, гибрид связывается селективно с ЮЕ, с аффинностью, сходной с аффинностью ЮЕ-ΙΒ, и только слабо связывается с инсулином (81йй1е аий 8оок, Тйе ЮЕ 8ук1еш. Нитапа Ргекк, р. 199-225. 1999). Эти гибриды, таким образом, могут связываться с ЮЕ и передавать сигналы как в нормальных, так и в трансформированных клетках.

Эндокринная экспрессия ЮЕ-Ι регулируется преимущественно гормоном роста и происходит в печени, но последние данные позволяют предположить, что многие другие типы тканей также способны экспрессировать ЮЕ-Ι. Этот лиганд, таким образом, подвергается эндокринной и паракринной регуляции, а также аутокринной в случае многих типов опухолевых клеток (Уи, Н. апй Войап, 1., 1. №11. Сапсег Ιηκί. 92:1472-89 (2000)).

Рецептор андрогенов (АВ) состоит из 3 функциональных и структурных доменов: Ν-концевого (модуляторного) домена; ДНК-связывающего домена (депозитарный № !п1егрго ΙΡΒ001628), который опосредует специфическое связывание с последовательностями ДНК-мишени (лиганд-чувствительные элементы); и гормонсвязывающего домена. Ν-концевой домен (ΝΤΌ) является уникальным для рецептора андрогенов и охватывает приблизительно первые 530 остатков; высококонсервативный ДНКсвязывающий домен меньше (приблизительно 65 остатков) и занимает центральную часть белка; и лигандсвязывающий домен (ЬВЭ) для гормона расположен на С-конце рецептора. В отсутствие лиганда рецепторы стероидного гормона, как предполагают, слабо связаны с компонентами ядра; связывание гормона значительно усиливает аффинность рецептора. Взаимоотношение между рецептором андрогенов (АВ), андрогеном и раком предстательной железы является комплексным. На распределение АВ между ядром и цитоплазмой влияет андроген и удаление андрогена. Например, иммунореактивность АВ наблюдают только в ядрах клеток ЬиСаР 35, растущих у интактных самцах мышей, однако сильную иммунореактивность наблюдают в цитоплазме и ядрах ЬиСаР 35, растущих у интактных самцах мышей и впоследствии кастрированных.

Сущность изобретения

Изобретение относится к лечению андрогензависимых опухолей, таких как рак предстательной железы. Опухоли предстательной железы, как правило, стимулируются андрогенами, такими как тестостерон, и обладают андрогензависимым (АО) ростом. Таким образом, лечение рака предстательной железы, как правило, включает терапию, при которой происходит прекращение действия андрогена на клетки рака предстательной железы. Однако в значительной доле случаев рака предстательной железы в конечном итоге происходит переход к независимости от андрогенов (ΛΙ). Обнаружено, что введение антагониста ЮЕ-ГВ в сочетании с терапией посредством андрогенной депривации (АОТ) ингибирует или предотвращает переход АО-опухолей в А1-опухоли.

Соответственно, изобретение относится к способу лечения андрогензависимого рака путем проведения андрогенной депривации и введения антагониста ЮЕ4В. В варианте осуществления по изобретению андрогензависимый рак является раком предстательной железы.

Согласно изобретению антагонист ЮЕ4В может представлять собой внеклеточный антагонист или внутриклеточный антагонист, и можно применять более одного антагониста. В более широком смысле, изобретение относится к ингибированию обусловленной ΣΤΟ-Κ. передачи сигнала и модулированию компонента пути таким образом, чтобы ингибировать переход опухолевых клеток от АО к АТ Внеклеточные антагонисты включают в качестве неограничивающих примеров белки или другие биологические молекулы, которые связываются с ЮЕ-Ж или его лигандом (ЮЕ). В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный антагонист ингибирует связывание ЮЕ4В с ЮЕ. В одном из вариантов осуществления связывающийся белок представляет собой антитело, такое как, например, ЕМС-АП. В другом варианте осуществления связывающийся белок является растворимым лигандсвязывающим фрагментом ЮЕ4В. Внутриклеточные антагонисты ЮЕ4В могут представлять собой биологические молекулы, но обычно являются малыми молекулами. В варианте осуществления изобретения антагонист ЮЕ4В является малой молекулой, выбранной из АО1024, NVΡ-ΛЕ\V541 и ВМ8-554417.

Эффективность различных антагонистов в ингибировании обусловленной ЮЕ4В передачи сигнала можно наблюдать, например, путем анализа состояния компонентов пути обусловленной ЮЕ4В передачи сигнала. В одном из вариантов осуществления ингибирование ЮЕ4В наблюдают по снижению фосфорилирования Ак1. В другом варианте осуществления ингибирование обусловленной ЮЕ4В передачи сигнала наблюдают по снижению экспрессии сурвивина или β-пептида тубулина (ТИВВ) .

Антагонист ЮЕ4В по изобретению применяют с любой формой АОТ. В варианте осуществления изобретения АОТ включает орхиэктомию. В другом варианте осуществления изобретения АОТ включает введение аналога рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона. В другом варианте осуществления АОТ включает введение антиандрогена. В другом варианте осуществления вводят ингибитор андрогена надпочечников. Согласно изобретению можно сочетать два или более способа АОТ.

Изобретение далее относится к ингибированию передачи сигнала посредством Ак1. Соответственно, изобретение относится к введению модуляторов передающих сигнал белков, которые активируют Ак1. В одном из вариантов осуществления такой модулятор представляет собой антагонист ЕОЕВ.

- 2 017265

Согласно изобретению антагонист ЮР-ΙΡ вводят в качестве адъюванта для ΆΌΤ. В одном из вариантов осуществления ΆΌΤ и введение антагониста ЮРПК начинают приблизительно в одно и то же время. В другом варианте осуществления сначала начинают ΆΌΤ, и антагонист ЮР-ΙΡ вводят перед тем, как андрогеннезависимый рак станет андрогеннезависимым. Изобретение далее относится к применению противоопухолевых средств совместно с ΆΌΤ и введением антагониста 1СР-1К. В варианте осуществления изобретения антагонист ЮРИК и средство ΆΌΤ применяют вместе в качестве неоадъюванта для хирургического или радиационного лечения рака предстательной железы.

Изобретение также относится к композициям, содержащим антагонист ЮР-ΙΚ. и средство ΆΌΤ в лекарственной форме.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлено исследование, в котором изучали подкожные ксенотрансплантаты ЬиСар35 у мышей 8СШ. Всех мышей кастрировали, когда средний размер опухоли достигал 400 мм³. В контрольной группе мышам производили только кастрацию. В двух других группах вводили три раза в неделю 1МС-А12, начиная через одну или две недели после кастрации.

На фиг. 2 представлены уровни Р8А у кастрированных контрольных мышей и у кастрированных мышей, которых лечили 1МС-А12, начиная через одну (раннее начало) или две (позднее начало) недели после кастрации.

На фиг. 3 представлено распределение рецептора андрогенов (АК) в ответ на стимуляцию ЮР-ΙΚ посредством ЮР и/или ингибирование ЮР-ΙΚ посредством 1МС-А12. Уровни АК в цитоплазме и ядре анализировали вестерн-блоттингом.

На фиг. 4 представлен эффект антагониста ЮР-ΙΚ (1МС-А12) на распределение рецептора андрогенов (АК) в андрогензависимых ксенотрансплантатах опухолей из клеток ЬиСаР35 у интактных мышей (левая колонка) и андрогеннезависимых ксенотрансплантатах опухолей из клеток ЬиСаР35У у кастрированных мышей (правая колонка).

На фиг. 5 представлена корреляция между количественным показателем АК и объемом опухоли. г=0,66, р<0,01. Величины для только кастрированных животных представлены светлыми кругами и величины для кастрированных + А12 при раннем и позднем начале лечения представлены темными кругами. Величины представляют собой среднюю величину для 100 ядер, распределенных в опухоли.

На фиг. 6 представлены изменения экспрессии генов между двумя периодами времени для подкожных обработанных посредством А12 опухолей. Из 3170 уникальных генов на чипе с достаточным количеством данных для тестирования 21 подвергался активации (включая многие регулируемые андрогенами, обозначенные с помощью *) и 41 подвергался подавлению с <10% добротности в позднем периоде времени, когда опухоли начинали рецидивировать, по сравнению с ранним периодом времени.

На фиг. 7А представлена корреляция между показателем количества копий сурвивина и объемом опухоли (г=0,66, р<0,01).

На фиг. 7В представлена корреляция между показателем количества копий бета-пептида 3 тубулина и объемом опухоли (г=0,59, р<0,01). Величины для только кастрированных представлены светлыми кругами и величины для кастрированных + А12 при раннем и позднем начале представлены темными кругами, каждая величина является средней величиной для трех осуществлений РСК.

Подробное описание изобретения

Обнаружено, что ингибиторы ЮР-1К пригодны в терапии для лечения рака предстательной железы. В частности, введение антагониста ЮР-1К в сочетании с терапией депривацией андрогенов (ΛΩΤ) приводит к улучшению результата лечения по сравнению только с АОК

Обнаружено, что андрогены активируют экспрессию рецептора инсулиноподобного фактора ростаI и могут делать рак предстательной железы чувствительным к эффектам ЮР-Ι. Сходным образом, переход к независимости от андрогенов, который наблюдают в клетках рака предстательной железы, может происходить в результате приспособлений клетки, при которых происходит усиление обусловленной рецептором андрогенов передачи сигнала, таких как увеличение уровней АК, которые делают клетку чувствительной к низким уровням циркулирующего андрогена, или мутации в АК, которые дают возможность активации с помощью неандрогенных стероидов. В самом деле, данные говорят о том, что обусловленная ЮР-Ι передача сигнала может действительно опосредовать транслокацию АК в ядро в опухолевых клетках и приводить к активации АК-зависимых генов. Таким образом, предположили, что ЮР-Ι может способствовать превращению андрогензависимого рака предстательной железы в андрогеннезависимый после терапии гормональной абляцией, способствуя обусловленной АК передаче сигнала в отсутствие циркулирующего андрогена. Последние данные для мужчин и для ксенотрансплантатов предстательной железы человека также говорят о том, что существующие в настоящее время способы андрогенной абляции не способны снижать количество андрогенов предстательной железы до уровней, которые более не вызывают активации рецептора андрогенов. Предстательная железа может действительно обладать способностью синтезировать ΌΗΤ из нескольких стероидов-предшественников и, возможно, ацетата.

- 3 017265

Таким образом, отсюда следует, что ингибирование обусловленной ЮЕ-Ι передачи сигнала в дополнение к терапии гормональной абляцией может предотвращать превращение или увеличивать время до превращения рака предстательной железы в андрогеннезависимое заболевание, значительно задерживая возникновение рецидива. Антагонисты ЮЕ-ΙΚ, таким образом, могут представлять собой эффективную адъювантную терапию по отношению к способам андрогенной депривации для лечения недавно диагностированного и местно развивающегося или метастатического гормонзависимого рака предстательной железы.

Применение антагонистов ЮЕ-ΙΚ в сочетании с андрогенной абляцией также обладает способностью блокировать опосредованное ЮЕ возвращение из апоптоза. Механизмы, посредством которых ЮЕΙΚ может предотвращать апоптоз, включают ингибирование киназы гак-гаГ-тар, киназы ΡΙ3, включая тТОК, и опосредованную ГогкНсай передачу сигнала, и 14-3-3. Другой механизм, посредством которого ингибирование ЮЕ-ΙΚ может продлевать эффекты андрогенной абляции, осуществляется посредством поддержания опухоли в состоянии остановки клеточного цикла вслед за началом апоптоза.

В предыдущих исследованиях показано, что антагонисты ЮЕ-ΙΚ могут обладать положительным эффектом при использовании для лечения ксенотрансплантатов как андрогензависимых, так и андрогеннезависимых видов рака предстательной железы. Рост ксенотрансплантатов, хотя и замедленный, нельзя остановить или обратить. В настоящее время обнаружено, что антагонисты ЮЕ-ΙΚ, в частности, пригодны для лечения рака предстательной железы при введении совместно с терапией депривацией андрогенов (ΑΌΤ). Как правило, опухоли предстательной железы переходят к независимости от андрогенов и становятся нечувствительными к ΑΌΤ. Как обнаружено ранее, такие андрогеннечувствительные опухоли обладают тенденцией не давать сильные ответы на антагонисты ЮЕ-ΙΚ. Однако, как представлено в данной работе, время для прогрессии опухолей предстательной железы от ΑΌ до ΑΙ значительно увеличивается при терапии, которая сочетает ΑΌΤ с введением антагониста ЮЕ-ΙΚ. В течение этого более длительного периода опухоли уменьшаются в размере, и снижаются уровни Ρ8Α. Сочетанная терапия снижает высокий риск возникновения рецидива, который наблюдают при применении только ΑΌΤ, и снижает риск развития метастазов рака. Лечение антагонистами ЮЕ-ΙΚ также обладает преимуществами при лечении запущенного рака предстательной железы, при котором потенциально присутствуют или диагностированы метастазы.

В моделях, в которых вводят клетки рака предстательной железы, наблюдают, что транслокация ΑΚ из цитоплазмы в ядро индуцируется не только стимуляцией андрогеном, но также, хотя и в меньшей степени, стимуляцией ЮЕ-ΙΚ. Даже в присутствии андрогена, транслокация ΑΚ в присутствии андрогена и ЮЕ снижается посредством антагониста ЮЕ-ΙΚ.

В предстательной железе после кастрации все еще детектируют низкие уровни андрогенов. Также сообщалось, что экспрессия ЮЕ-ΙΚ, который участвует в передаче сигнала через Дк1. сначала снижается в ответ на кастрацию, но затем усиливается, и далее стимуляция Лк1 этим фактором роста усиливает обусловленную ΑΚ передачу сигнала в ответ на низкие уровни андрогена.

Как показано в данной работе, лечение антагонистом ЮЕ-ΙΚ значительно задерживает восстановление роста опухолей у кастрированных мышей. Более того, существует хорошая корреляция между снижением ΑΚ в ядре и уменьшением объема опухоли. Это позволяет предположить, что ингибирование обусловленной ЮЕ-ΙΚ передачи сигнала играет значительную роль в ингибировании обусловленной ΑΚ прогрессии опухоли. В описанных в данной работе экспериментах обусловленную ЮЕ-ΙΚ передачу сигнала ингибируют с использованием антитела, обозначенного как А12, которое связывается с ЮЕ-ΙΚ. В предыдущих экспериментах с использованием А12 и сходных антител показано, что происходит снижение фосфорилирования (т.е. активации) различных участвующих в передаче сигнала молекул, включая ΕΚΚ и ΜΑΡΚ, в частности ΑΙ/Ι. Эффект ингибирования ЮЕ-ΙΚ обнаружен во множестве типов опухолевых клеток, включая линию опухоли предстательной железы М12 (^и, Ι.Ό. с1 а1. , 2005, С1ш. Сапсег Κβδ. 11:3065-74) и клетки рака молочной железы МСЕ7 (Вигйит, Ό. е1 а1., 2003, Сапсег ^5. 63:8912-21). Таким образом, следует принимать во внимание, что ту же самую или сходную адъювантную активность, наблюдаемую в данной работе для антагониста ЮЕ-ΙΚ, можно наблюдать для средств, которые обладают таким же или сходным эффектом на активацию ΑΙ/Ι.

Показано, что лечение антагонистом ЮЕ-ΙΚ приводит к ингибированию транслокации ΑΚ в ядро. Ингибирование можно наблюдать гистохимически или флуоресцентной микроскопией, а также по снижению уровней экспрессии индуцируемых ΑΚ генов. Два гена, связанные с устойчивостью к кастрации, сурвивин и β-пептид тубулина, регулируются ЮЕ-ΙΚ посредством активации ΑΙ/Ι. Экспрессия генов супрессирована у кастрированных мышей, которых подвергали лечению антагонистом ЮЕ-ΙΚ, по сравнению с теми, которых только кастрировали. Сходные ингибиторные эффекты на транслокацию ΑΚ и экспрессию генов, активированных ΑΙ/Ι можно наблюдать в ответ на специфичный в отношении Α1/1 ингибитор или антагонист другого пути передачи сигнала, в который в значительной степени вовлечена ΑΙ/Ι.

Множество антагонистов ЮЕ-ΙΚ можно применять согласно изобретению. Антагонисты ЮЕ-ΙΚ могут представлять собой внеклеточные антагонисты или внутриклеточные антагонисты. Внеклеточные и внутриклеточные антагонисты ЮЕ-ΙΚ могут являться биологическими молекулами, малыми молекулами или любым другим веществом, которое ингибирует активацию ЮЕ-ΙΚ, например, посредством взаимо

- 4 017265 действия с внеклеточной связывающей областью рецептора (т.е. внеклеточный антагонист), посредством ингибирования фосфорилирования внутриклеточного тирозинкиназного домена ЮЕ-ΙΚ, или ингибированием взаимодействия с активацией любого другого клеточного компонента, вовлеченного в обусловленный ЮЕ-ΙΚ. путь передачи сигнала, таким образом, в конечном итоге ингибируя активацию генов или клеточную пролиферацию.

В варианте осуществления настоящего изобретения внеклеточный антагонист ЮЕ-ΙΚ взаимодействует с областью рецептора, связывающей внеклеточный лиганд, посредством достаточного физического или химического взаимодействия между антагонистом и внеклеточной связывающей областью рецептора таким образом, что блокируется связывание ЮЕ-ΙΚ со своим лигандом (ЮЕ), и ингибируется тирозинкиназная активность рецептора. Специалист в данной области примет во внимание, что примеры таких химических взаимодействий, которые включают ассоциацию или образование связи, известны в данной области и включают образование ковалентной связи, ионной связи, водородной связи и т.п. между антагонистом и внеклеточной связывающей областью. В варианте осуществления изобретения внеклеточный антагонист ЮЕ-ΙΚ является биологической молекулой. Биологические молекулы включают в качестве неограничивающих примеров антитела или фрагменты антител, которые связываются с ЮЕ-ΙΚ. В другом варианте осуществления антагонист ЮЕ-ΙΚ может являться малой молекулой, которая блокирует связывание лиганда с ЮЕ-ΙΚ. В другом варианте осуществления внеклеточный антагонист является веществом, которое блокирует лиганды ЮЕ-ΙΚ или вызывает их деградацию. Один из примеров представляет собой растворимый внеклеточный фрагмент ЮЕ-ΙΚ, который связывается с ЮЕ. Другой пример такого вещества представляет собой ЮЕ-связывающий белок (ЮЕВР), такой как, например, ЮЕВР-1, ЮЕВР-2 и ЮЕВР-3, который может связываться с ЮЕ, таким образом ограничивая активацию рецептора ЮЕ. В другом варианте осуществления изобретения низкомолекулярный ингибитор связывается с лигандсвязывающим доменом ЮЕ-ΙΚ и блокирует с его помощью связывание лиганда ЮЕ-ΙΚ и активацию рецептора.

Несмотря на нежелание вдаваться в теоретические подробности, принято считать, что внеклеточный антагонист ЮЕ-ΙΚ ингибирует все каскады передачи сигнала, инициируемые конформационными изменениям во внеклеточной области ЮЕ-ΙΚ после активации ЮЕ-ΙΚ. Это ингибирование включает ЮЕΙΚ на поверхности, а также те ЮЕ-ΙΚ, которые интернализованы внутри клетки. Например, предполагают, что тирозинкиназы активированного рецептора (ΚΤΚ) могут подвергаться интернализации в эндосому посредством покрытой кларитином ямки, при этом все еще сохраняя активность в передаче сигнала. После интернализации такие рецепторы или возвращаются на поверхность клетки, или подвергаются деградации в эндосоме или лизосоме.

Другой путь ингибирования опосредованной ЮЕ-ΙΚ передачи сигнала представляет собой подавление экспрессии ЮЕ-ΙΚ. В варианте осуществления изобретения антагонист ЮЕ-ΙΚ связывается с рецептором и способствует интернализации и деградации рецептора. В другом варианте осуществления антагонист ЮЕ-ΙΚ снижает экспрессию рецептора.

Биологические молекулы, в контексте настоящего изобретения, включают все аминокислоты, нуклеотиды, липиды и полимеры моносахаридов, которые, как правило, обладают молекулярной массой более 650 Да. Таким образом, биологические молекулы включают, например, олигопептиды, полипептиды, пептиды и белки, олигонуклеотиды и полинуклеотиды, такие как, например, ДНК и РНК, и олигосахариды и полисахариды. Биологические молекулы дополнительно включают производные любых из вышеописанных молекул. Например, производные биологических молекул включают липиды и гликозилированные производные или олигопептиды, полипептиды, пептиды и белки. Производные биологических молекул дополнительно включают липидные производные олигосахаридов и полисахаридов, например липополисахариды. Чаще всего, биологические молекулы являются антителами или их функциональными производными.

Малые молекулы включают органические соединения, такие как гетероциклы, пептиды, сахариды, стероиды и т.п., металлоорганические соединения, соли органических соединений и металлоорганических соединений и неорганические соединения. Атомы в малых молекулах связаны вместе посредством ковалентной и ионной связей; первая является типичной для малых органических соединений, таких как низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназы, и последняя является типичной для малых неорганических соединений. Расположение атомов в малой органической молекуле может представлять собой цепь, например углерод-углеродную цепь или цепь из углерода и гетероатомов, или может представлять собой кольцо, содержащее атомы углерода, например бензольную или полициклическую систему, или сочетание из углерода и гетероатомов, т.е. гетероциклы, такие как пиримидин или хиназолин. Хотя малые молекулы могут обладать любой молекулярной массой, они, как правило, включают молекулы, которые могут в других отношениях рассматриваться как биологические молекулы, за исключением того, что их молекулярная масса не превышает 650 Да. Малые молекулы включают как встречающиеся в природе соединения, такие как гормоны, нейротрансмиттеры, нуклеотиды, аминокислоты, сахара, липиды и их производные, так и соединения, полученные синтетически, или традиционным органическим синтезом, биологически опосредованным синтезом, или их сочетанием. См., например, Оаиекаи, Эгид Όίκοον. Тойау 7(1):47-55 (1аи. 2002); Ьои, Эгид Όίκοον. Тойау, 6(24):1288-1294 (Эес. 2001). Соединения можно

- 5 017265 модифицировать для усиления эффективности, стабильности, фармацевтической совместимости и т.п.

Внутриклеточные антагонисты ΙΟΡ-ΙΒ могут представлять собой биологические молекулы, такие как мутантные субъединицы рецептора, внутриклеточные связывающие белки (например, внутриклеточно экспрессируемые фрагменты антител) и т.п. В предпочтительном варианте осуществления внутриклеточные антагонисты являются малыми молекулами. Низкомолекулярные ингибиторы включают в качестве неограничивающих примеров малые молекулы, которые модифицируют или блокируют АТРсвязывающий домен, субстратсвязывающие области или киназный домен ΙΟΡ-ΙΒ. Низкомолекулярные ингибиторы также включают вещества, которые являются ингибиторами других компонентов пути обусловленной ΙΟΡ-ΙΒ передачи сигнала, включая в качестве неограничивающих примеров путь гакмитоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) и путь киназы фосфатидилинозита-3 (ΡΙ3Κ)-Α1<1.

Для идентификации антагонистов можно осуществлять скрининг низкомолекулярных библиотек на ингибиторную активность с использованием высокопроизводительных биохимических, ферментативных или клеточных анализов. Анализы можно разрабатывать для детектирования способности тестируемого соединения ингибировать связывание ΙΟΡ-ΙΒ с лигандами ΙΟΡ-ΙΒ или субстратом ΙΒ8-1 или ингибировать образование функциональных рецепторов из димеров ΙΟΡ-ΙΒ. Внутриклеточный антагонист ΙΟΡ-ΙΒ может ингибировать тирозинкиназную активность ΙΟΡ-ΙΒ путем связывания с внутриклеточной областью, несущей киназный домен, или ингибированием ее активации, или путем связывания с любым внутриклеточным белком, вовлеченным в путь передачи сигнала от ΙΟΡ-ΙΒ, или ингибированием его активации. Низкомолекулярные антагонисты ΙΟΡ-ΙΒ включают, например, ингибиторы селективной киназы рецептора инсулиноподобного фактора роста-Ι ΝνΡ-ΑΕ\ν541 (Сагс1а-Ес11сссгпа. С. е! а1., 2004, Сапсег Се11. 5:231-9) и ΝνΡ-ΑΌν742 (МйДабек, С. е! а1., 2004, Сапсег Се11. 5:221-30), ΙΝ8Μ-18 Дпктеб Ьсогрог^б), которые избирательно ингибируют ΙΟΡ-ΙΒ и ΗΕΒ2 и тирозинкиназные ингибиторы трифостины АС1024 и АС1034 (Рат/ак, М. е! а1., 1997, Епбосппо1оду. 138:1427-33), которые ингибируют фосфорилирование путем блокирования связывания субстрата и обладают значительно более низким Ιί.'₅₀для ингибирования фосфорилирования ΙΕΟ-ΙΚ по сравнению с фосфорилированием ΙΒ. Пикроподофиллин производное циклолигнана (РРР) представляет собой другой антагонист ΙΟΡ-ΙΒ, который ингибирует фосфорилирование ΙΟΡ-ΙΒ без нарушения активности ΙΒ (С1гш1а, А. е! а1., 2004, Сапсег Век. 64:236-42). Другие низкомолекулярные антагонисты ΙΟΡ-ΙΒ включают производные бензимидазола ВМ8-536924 (кШтап, М. е! а1., 2005, 1. Меб. СИет. 48:5639-43) и ВМ8-554417 (На1икка Р. е! а1., 2006, Сапсег Век. 66:362-71), которые ингибируют ΙΟΡ-ΙΒ и ΙΒ почти в равной степени. Для соединений, которые ингибируют рецепторы в дополнение к ΙΟΡ-ΙΒ, следует указать, что величины ТС₅₀, измеренные ш νίίτο в прямых анализах связывания, могут не отражать величины ТС₅₀, измеренные ех νίνο или ш νίνο (т.е. в интактных клетках или организмах). Например, там, где желательно избегать ингибирования ΙΒ, соединение, которое ингибирует ΙΒ ш νίίτο, может не оказывать значительного влияния на активность рецептора при использовании ш νίνο в концентрации, при которой эффективно ингибируется ΙΟΡ-ΙΒ.

Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, антисмысловые РНК и малые ингибиторные РНК (миРНК) обеспечивают направленную деградацию мРНК, таким образом предотвращая трансляцию белков. Соответственно, можно ингибировать экспрессию тирозинкиназ рецепторов и других белков, играющих ключевую роль в обусловленной ΙΟΡ передаче сигнала. Способность антисмысловых олигонуклеотидов супрессировать экспрессию генов обнаружили более 25 лет назад (2атесшк апб δ^ρ^^ο^ 1978, Ргос. №-Ц1. Асаб. 8ск И8А. 75:280-84). Антисмысловые олигонуклеотиды спариваются с мРНК и пре-мРНК и могут потенциально нарушать несколько стадий процессинга РНК и трансляции матричной РНК, включая сплайсинг, полиаденилирование, экспорт, стабильность и трансляцию белка (8ахаш апб ΚοΕ, 2003, 1. С1ш. ЕтсекЕ 112:481-86). Однако две наиболее мощные и широко используемые антисмысловые стратегии представляют собой деградацию мРНК или пре-мРНК посредством РНКазы Н и изменение сплайсинга путем нацеливания на аберрантные точки сплайсинга. РНКаза Н распознает гетеродуплексы ДНК/РНК и расщепляет РНК приблизительно посередине между 5'- и 3'-концами олигонуклеотида ДНК. Ингибирование ΙΟΡ-ΙΒ с помощью антисмысловых олигонуклеотидов представлено в кгащйЕ №1Е Вю^Иток 18:521-6.

Природные РНК-опосредованные механизмы могут регулировать стабильность мРНК, трансляцию матричной РНК и организацию хроматина (Ме1^ апб ^Ше, 2004, №Шге. 431:338-42). Более того, экзогенно введенная длинная двухцепочечная РНК (дцРНК) является эффективным инструментом для подавления транскрипции генов у множества низших организмов. Однако у млекопитающих длинные дцРНК вызывают реакции, обусловленные высокой токсичностью, которые связаны с эффектами вирусной инфекции и продукцией интерферона ^1Шатк, 1997, Вюсйет. 8ο^ Тгапк. 25:509-13). Чтобы этого избежать, Е1ЬакЫг и сотрудники (Е1ЬакЫг, е! а1., 2001, №Циге. 411:494-98) положили начало использованию миРНК, образованных 19-мерными дуплексами с 5'-фосфатами и 3'-выступающими концами из 2 оснований на каждой цепи, которые при введении в клетки избирательно деградируют мРНК-мишени.

Действие интерферирующей дцРНК у млекопитающих, как правило, включает две ферментативные стадии. Сначала Ищет, фермент РНКаза ΙΙΙ-типа, расщепляет дцРНК на 21-23-мерные сегменты миРНК. Затем РНК-индуцируемый ингибирующий комплекс (ΒΙ8Ο) расплетает дуплекс РНК, спаривается с комплементарной областью смысловой мРНК на одной цепи и инициирует расщепление в участке из 10

- 6 017265 нуклеотидов выше 5'-конца цепи миРНК (Наппоп, 2002, Иа!иге. 418:244-51). В кратком изложении, химически синтезированные миРНК в диапазоне 19-22-мерных молекул не нуждаются в стадии с участием Оюег и могут входить в комплекс Ш8С непосредственно. Следует указать, что любая цепь дуплекса РНК может потенциально входить в комплекс К18С, но композиция олигонуклеотидов может влиять на выбор цепей. Таким образом, для достижения избирательной деградации конкретной мРНК-мишени дуплекс должен способствовать входу в комплекс компонента антисмысловой цепи путем наличия относительно слабого спаривания на своем 5'-конце (Кйуотоуа, 2003, Се11 115:209-16). Экзогенные миРНК можно получить в виде синтезированных олигонуклеотидов или экспрессировать с плазмидных или вирусных векторов (Райййоп апй Наппоп, 2003, Сигг. Θρίη. Мо1. Тйет. 5:217-24). В последнем случае молекулыпредшественники обычно экспрессируются в виде коротких шпилечных РНК (8ЙРНК), содержащих петли из 4-8 нуклеотидов и стебли из 19-30 нуклеотидов; они затем расщепляются с помощью Оюег с образованием функциональных миРНК.

Антитела анти-ЮР-ГК. для применения согласно настоящему изобретению обладают одним или несколькими из следующих свойств.

1) Антитела связываются с внешним доменом ЮР-ΙΚ и ингибируют связывание ЮР-1 или ЮР-11 с ЮР-ΙΚ. Ингибирование можно определять, например, анализом прямого связывания с использованием очищенного или связанного с мембраной рецептора. В данном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению или их фрагменты предпочтительно связываются с ЮР-ΙΚ, по меньшей мере, также сильно, как и природные лиганды ЮР-ΙΚ (ЮР-1 и ЮР-11).

2) Антитела нейтрализуют ЮР-ΙΚ. Связывание лиганда, например ЮР-1 или ЮР-11, с внешним, внеклеточным доменом ЮР-ΙΚ стимулирует аутофосфорилирование бета-субъединицы и фосфорилирование субстратов ΙΙΌ-ΙΚ включал МАРК, Лк! и ΙΚ8-Ι.

Нейтрализация ЮР-ΙΚ включает ингибирование, снижение, инактивацию и/или нарушение одной или нескольких из этих активностей, в норме связанных с передачей сигнала. Нейтрализацию можно определить ш у1уо, ех у1уо или ш νίΙΐΌ с использованием, например, тканей, культивируемых клеток или очищенных клеточных компонентов. Нейтрализация включает ингибирование гетеродимеров ЮР-ΙΚ/ΙΚ, а также гомодимеров ЮР-ΙΚ. Таким образом, нейтрализация ЮР-ΙΚ обладает различными эффектами, включая ингибирование, снижение, инактивацию и/или нарушение роста (пролиферации и дифференцировки), ангиогенез (образования кровеносных сосудов, инвазии и метастазирования) и клеточную подвижность и метастазирование (адгезии клеток и инвазивности).

Одним их способов измерения нейтрализации ЮР-ΙΚ является ингибирование тирозинкиназной активности рецептора. Ингибирование тирозинкиназы можно определить с использованием хорошо известных способов, например измерением уровня аутофосфорилирования рекомбинантного киназного рецептора и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Таким образом, анализы фосфорилирования пригодны для определения нейтрализующих антител в контексте настоящего изобретения. Фосфорилирование можно детектировать, например, в анализе ЕЬ1§А или вестерн-блоттинге с использованием антитела, специфичного к фосфотирозину. Некоторые анализы тирозинкиназной активности описаны в Рапек е! а1., 1997, I. Рйаттасок Ехр. Тйета. 283:1433-44 и Ва!1еу е! а1., 1998, ЬИе 8с1. 62:143-50. Антитела по изобретению вызывают снижение фосфорилирования тирозина в ЮР-ΙΚ по меньшей мере приблизительно на 75%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 85% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90% в клетках, которые реагируют на лиганд.

Другим способом измерения нейтрализации ЮР-ΙΚ является ингибирование фосфорилирования расположенных ниже субстратов ЮР-ΙΚ. Соответственно, можно измерять уровень фосфорилирования МАРК, Лк! или ΙΚ8-Ι. Снижение фосфорилирования субстрата составляет по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 65%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80%.

Кроме того, для определения нейтрализации ЮР-ΙΚ можно использовать способы детекции экспрессии белка, в которых измеряемые белки регулируются тирозинкиназной активностью ЮР-ΙΚ. Примером такого белка, который связан с прогрессированием рака и устойчивостью к лекарственным средствам, является сурвивин, который является членом семейства ингибиторов апоптоза ДАР). Хотя регуляция сурвивина сложна и опосредована более чем одним путем, была показана регуляция, опосредованная Ак! и усиливаемая ЮР-1. См., например, 2йапд е! а1., 2005, Опсодепе, 24:2474-82. Способы анализа экспрессии генов включают иммуногистохимию (ШС) для детекции экспрессии белка, флуоресцентную гибридизацию ш 8Йи (РЧ8Н) для детекции амплификации генов, анализы конкурентного связывания радиолиганда, способы блоттинга на основе твердых матриц, такие как нозерн- и саузерн-блоттинги, полимеразная цепная реакция после обратной транскрипции (ΚΤ-РСЩ и ЕЫ8А. См., например, СтапФк е! а1., 1996, Сапсег, 78:1284-92; 81ιίιηίζιι е! а1., 1994, 1арап I. Сапсег ^8., 85:567-71; 8аи!ет е! а1., 1996, Ат. I. Ра!й., 148:1047-53; Со11ш8, 1995, Сйа 15:289-96; ^^щку е! а1., 1995, С1ш. Сапсег ^8. 1:19-31; Ре1пйе8 е! а1., 1990, Сапсег ^8. 50:3934-39; НоГГтапп е! а1., 1997, Апйсапсет ^8. 17:4419-26; \У|к81гапй е! а1., 1995, Сапсег ^8. 55:3140-48.

- 7 017265

Анализы ех νίνο также можно использовать для определения нейтрализации ЮЕ-ΙΚ. Например, ингибирование рецептора тирозинкиназы можно исследовать в митогенных анализах с использованием линий клеток, стимулированных лигандом рецептора в присутствии и в отсутствие ингибитора. Линия рака молочной железы МСЕ7 (Атепсап Туре СиНите Со11есйоп (АТСС), ВосктШе. ΜΌ) является такой линией клеток, которая экспрессирует ЮЕ-ΙΚ и стимулируется ЮЕ-Ι или ЮЕ-ΙΙ. Другой способ включает тестирование ингибирования роста опухолевых клеток, экспрессирующих ЮЕ-ΙΚ, или клеток, трансфицированных, чтобы экспрессировать ЮЕ-ΙΚ. Ингибирование можно также исследовать с использованием моделей опухолей, например инъецировать мыши опухолевые клетки человека.

Антитела по настоящему изобретению не ограничены каким-либо конкретным механизмом нейтрализации ЮЕ-ΙΚ. Антитела анти-ЮЕ-ΙΚ по настоящему изобретению могут связываться с внешней стороны с клеточным поверхностным рецептором ЮЕ-ΙΚ, блокировать связывание лиганда (например, ЮЕ-Ι или ЮЕ-ΙΙ) и последующую передачу сигнала, опосредованную связанной с рецептором тирозинкиназой, и предотвращать фосфорилирование ЮЕ-ΙΚ и других расположенных ниже белков в каскаде передачи сигнала.

3) Антитела подавляют ЮЕ-ΙΚ. Количество ЮЕ-ΙΚ, присутствующего на поверхности клетки, зависит от продукции, интернализации и деградации белка рецептора. Количество ЮЕ-ΙΚ, присутствующего на поверхности клетки, можно измерять опосредованно, детектированием интернализации рецептора или молекулы, связанной с рецептором. Например, интернализацию рецептора можно измерять контактированием клеток, которые экспрессируют ЮЕ-ΙΚ, с мечеными антителами. Связанные с мембраной антитела затем смывают, собирают и определяют их количество. Интернализованные антитела определяют лизированием клеток и детектированием метки в лизатах.

Другой способ состоит в прямом измерении количества рецептора, присутствующего на клетке, после обработки антителами анти-ЮЕ-ΙΚ или другим веществом, например, при помощи анализа флуоресцентно-активированным клеточным сортингом клеток, окрашенных на поверхностную экспрессию ЮЕΙΚ. Окрашенные клетки инкубируют при 37°С и интенсивность флуоресценции измеряют с течением времени. В качестве контроля часть окрашенной популяции можно инкубировать при 4°С (условия, при которых интернализация рецептора останавливается).

ЮЕ-ΙΚ на клеточной поверхности можно детектировать и измерять с использованием другого антитела, которое специфично к ЮЕ-ΙΚ и которое не блокирует тестируемое антитело или конкурирует с ними за связывание (Вигйит, е! а1., 2003, Сапсег Век. 63:8912-21). Обработка клетки, экспрессирующей ЮЕ-ΙΚ, антителом по изобретению приводит к снижению количества ЮЕ-ΙΚ на клеточной поверхности. В предпочтительном варианте осуществления снижение в ответ на обработку антителом по изобретению составляет по меньшей мере приблизительно 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%. Значительное снижение можно наблюдать уже через 4 ч.

Другое измерение подавления представляет собой снижение общего количества рецепторного белка, присутствующего в клетке, и отражает деградацию внутренних рецепторов. Соответственно, обработка клеток (в частности, раковых клеток) антителами по изобретению приводит к снижению общего клеточного ЮЕ-ΙΚ. В предпочтительном варианте осуществления снижение составляет по меньшей мере приблизительно 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%.

Для лечения человека антитела представляют собой предпочтительно антитела человека, но могут также являться гуманизированными или химерными антителами. Одним из предпочтительных антител человека, которое связывается с ЮЕ-ΙΚ, является А12 (см. \УО 2005016970). Другим предпочтительным антителом человека является 2Е8 (см. XVО 2005016970). Пригодные антитела дополнительно включают антитела анти-ЮЕ-ΙΚ, которые конкурируют с ΙΜί’-Α12 или ΙΜί’-2Ε8 за связывание с ЮЕ-ΙΚ, а также антитела, которые связываются с другими эпитопами (т.е. антитела, которые связываются с другими эпитопами и обладают свойствами, как описано ранее, такими как блокирование лиганда, интернализация рецептора и т.д., но не конкурируют с ГМС-А12 или ГМС-2Е8). Другие неограничивающие примеры нейтрализующих антител анти-ЮЕ-ΙΚ, пригодных согласно изобретению, описаны в Χνηη§ е! а1. (νθ 2003/1000008; И8 2004/0018191) и 8ш§Ь е! а1. (νθ 2003/106621; И8 2003/0235582). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности нескольких упомянутых в данной работе антител представлены в табл. 1.

- 8 017265

Таблица 1

ВЕЕ) ΙΌ N0 вариабельных доменов антител и СЭК (нуклеотид/аминокислота)

Название антитела	УН	СОКН1	СОКН2	сокнз	УЬ	СОВ1Л	СОКЕ2	сокьз
А12	1/2	13/14	15/16	17/18	9/10	25/26	27/28	29/30
2Р8	1/2	13/14	15/16	17/18	5/6	19/20	21/22	23/24
11Р8	37/38	31/32	33/34	35/36	45/46	39/40	41/42	43/44
С225	47/48				49/50

Антитела, которые можно использовать согласно изобретению, включают целые иммуноглобулины, антигенсвязывающие фрагменты иммуноглобулинов, а также антигенсвязывающие белки, которые содержат антигенсвязывающие домены иммуноглобулинов. Антигенсвязывающие фрагменты иммуноглобулинов включают, например, РаЪ, РаЪ' и Р(аЪ')₂. Получены другие типы антител, которые сохраняют специфичность связывания, но обладают другими характеристиками, которые могут оказаться желательными, включая биспецифичность, поливалентность (более двух участков связывания), компактный размер (например, только связывающие домены).

Одноцепочечные антитела содержат два вариабельных домена при отсутствии некоторых или всех константных доменов целых антител, из которых они получены. Таким образом, с их помощью можно решать некоторые проблемы, связанные с использованием целых антител. Например, одноцепочечные антитела обладают тенденцией не принимать участия в некоторых нежелательных взаимодействиях между константными областями тяжелых цепей и другими биологическими молекулами. Кроме того, одноцепочечные антитела обладают значительно меньшим размером по сравнению с целыми антителами и могут обладать лучшей проникающей способностью, чем целые антитела, позволяя одноцепочечным антителам более эффективно локализоваться на участках связывания антигена-мишени и связываться с ними. Более того, относительно малый размер одноцепочечных антител снижает вероятность вызывания ими нежелательного иммунного ответа у реципиента по сравнению с целыми антителами.

Полимерные одноцепочечные антитела, где каждая одиночная цепь обладает одним Ун- и одним У_Е-доменом, ковалентно связанным с первым пептидным линкером, можно ковалентно связать по меньшей мере одним или несколькими пептидными линкерами с образованием поливалентных одноцепочечных антител, которые могут являться моноспецифическими или полиспецифическими. Каждая цепь поливалентного одноцепочечного антитела включает вариабельный фрагмент легкой цепи и вариабельный фрагмент тяжелой цепи и связана пептидным линкером по меньшей мере с одной другой цепью. Пептидный линкер состоит по меньшей мере из 15 аминокислотных остатков. Максимальное количество аминокислотных остатков составляет приблизительно одну сотню.

Два одноцепочечных антитела можно объединить с образованием димерного антитела, также известного как бивалентный димер. Димерные антитела обладают двумя цепями и двумя участками связывания и могут являться моноспецифическими или биспецифическими. Каждая цепь димерного антитела содержит У_н-домен, соединенный с Уц-доменом. Домены связаны с линкерами, которые являются достаточно короткими для предотвращения спаривания между доменами одной цепи, таким образом осуществляя спаривание между комплементарными доменами разных цепей для восстановления двух антигенсвязывающих участков. Сходным образом, три одноцепочечных антитела можно объединить с образованием тримерного антитела, также известного как тривалентный тример. Тримерные антитела конструируют таким образом, что аминокислотный конец У_Е- или У_н-домена непосредственно слит с карбоксильным концом У_Е- или У_н-домена (т.е. без какой-либо линкерной последовательности). Тримерные антитела могут являться моноспецифическими, биспецифическими или триспецифическими. Также получены биспецифические антитела, которые являются бивалентными в отношении каждого антигенсвязывающего участка. Например, в ΖΙιιι (\\0 01/90192) описано антитело с четырьмя связывающими участками, которое в других отношениях обладает структурой и сохраняет эффекторные функции существующего в природе антитела. В ΖΙιιι (\0 2006/020258) описано биспецифическое антитело, которое содержит два димерных антитела и константные области 1д.

Таким образом, антитела по изобретению и их фрагменты включают в качестве неограничивающих примеров природные антитела, бивалентные фрагменты, такие как (РаЪ')₂, моновалентные фрагменты, такие как РаЪ, одноцепочечные антитела, одноцепочечные Ρν (§еРу), однодоменные антитела, поливалентные однонепочечные антитела, димерные антитела, тримерные антитела и т.п., которые специфически связываются с антигенами.

Антагонисты ЮР-ΙΚ проиллюстрированы в данной работе на примере 1МС-А12, моноклонального антитела человека, которое связывается с внеклеточным доменом ЮР и блокирует связывание ЮР. Свойства 1МС-А12 и сходное антитело человека представлены в международной публикации \0 2005/016970.

- 9 017265

Эффекты антагонистов ЮЕ-ΙΚ по изобретению на клетки андрогензависимого рака предстательной железы включают один или несколько из следующего. 1) ЮЕ может опосредовать активацию или транслокацию ЛК в отсутствие андрогена. Антагонисты ЮЕ-ΙΚ по изобретению блокируют опосредованную ЮЕ транслокацию. 2) Антагонисты ЮЕ-ΙΚ опосредуют усиление уничтожения клеток или ингибирование пролиферации опухолевых клеток. 3) Снижается опосредованная АК экспрессия генов, активируемых рецептором андрогенов. Гены, обладающие опосредованной АК экспрессией, включают, например, Р8А и ТМРК882 (трансмембранная сериновая протеаза).

Согласно изобретению антагонист ЮЕ-ΙΚ вводят субъекту, обладающему раком предстательной железы в сочетании с терапией депривацией андрогенов (АЭТ; также называется гормональной терапией). Цель ЛЭТ состоит в снижении уровней мужских гормонов (андрогенов, таких как тестостерон) в организме. Андрогены, продуцируемые в основном в яичках, могут действительно стимулировать рост клеток рака предстательной железы. Снижение уровней андрогена обычно приводит к тому, что рак предстательной железы уменьшается в размере или растет более медленно.

АЭТ применяют в нескольких случаях: в качестве терапии первой линии (начальной) пациентов, не подлежащих хирургическому вмешательству или радиационной терапии, или пациентов, которых невозможно излечить этими видами лечения вследствие того, что рак уже распространился за пределы предстательной железы; после начального лечения, такого как хирургия или радиационная терапия, если рак сохраняется или возвращается в исходное состояние; в качестве дополнения (адъюванта) к радиационной терапии как начальному лечению в определенных группах мужчин с высоким риском рецидивирования рака; и перед хирургическим вмешательством или радиационной терапией (неоадъювантная терапия) в попытке уменьшить размеры рака и сделать другой вид лечения более эффективным. Согласно изобретению антагонист ЮЕ-ΙΚ вводят в сочетании с АЭТ в любой ситуации, где в других случаях можно применять АЭТ. Антагонист ЮЕ-ΙΚ является адъювантом, который усиливает и/или пролонгирует эффект АЭТ.

Существует несколько способов, применяемых в качестве АЭТ. Орхиэктомия включает удаление яичек, в которых продуцируется более 90% андрогенов, преимущественно тестостерона. При удалении этого источника в большинстве случаев рак предстательной железы уменьшается в размере. Хотя она является необратимой и приводит к множеству нежелательных побочных эффектов, как правило, связанных с изменением уровней гормонов в организме, орхиэктомия, вероятно, представляет собой наименее дорогостоящий и простейший способ снижения продукции андрогенов, и ее можно осуществить в виде простой амбулаторной процедуры.

Аналоги рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (ΕΗΚΗ) (также называемые агонистами ΕΗΚΗ) снижают уровни тестостерона также эффективно, как и орхиэктомия, посредством снижения уровня андрогенов, преимущественно тестостерона, вырабатываемых яичками. Аналоги ΕΗΚΗ инъецируют или помещают под кожу в виде небольших имплантатов, и их вводят или ежемесячно или каждые 3, 4, 6 или 12 месяцев. Примеры аналогов ΕΗΚΗ включают леупролид, гозерелин и трипторелин. Возможные побочные эффекты аналогов ΕΗΚΗ сходны с побочными эффектами орхиэктомии, и они в значительной степени возникают вследствие изменений уровней гормонов.

Антиандрогены блокируют способность организма использовать любые андрогены. Даже после орхиэктомии или в ходе лечения аналогами ΕΗΚΗ небольшое количество андрогенов все еще продуцируется надпочечниками. Лекарственные средства этого типа включают флутамид, бикалутамид и нилутамид. Эти лекарственные средства, как правило, принимают ежедневно в виде пилюль.

Лечение антиандрогенами часто сочетают с орхиэктомией или лечением аналогами ΕΗΚΗ. Это сочетание называют комбинированной андрогенной блокадой (САВ). Более того, антиандроген можно добавлять, если лечение орхиэктомией или аналогом ΕΗΚΗ само по себе больше не дает эффекта. В нескольких последних исследованиях сравнивали эффективность антиандрогенов самих по себе с эффективностью агонистов ΕΗΚΗ. Большинство исследований не обнаружили отличий в уровнях выживаемости, но в нескольких исследованиях обнаружено, что антиандрогены незначительно менее эффективны.

Побочные эффекты антиандрогенов у пациентов, которых уже лечили орхиэктомией или агонистами ΕΗΚΗ, как правило, не являются серьезными. Диарея представляет собой основной побочный эффект, хотя также могут встречаться тошнота, проблемы с печенью и усталость. Основное отличие от агонистов ΕΗΚΗ состоит в том, что антиандрогены обладают меньшим количеством связанных с сексуальными функциями побочных эффектов и позволяют поддерживать либидо и потенцию, если применять только их.

Ингибиторы андрогенов надпочечников можно вводить вследствие того, что низкий уровень андрогенов, продуцируемых надпочечниками, может оказаться достаточным для обеспечения непрерывной стимуляции. После андрогенной абляции подмножество клеток рака предстательной железы может становиться гиперчувствительными к андрогенам, и надпочечники являются источником от 5 до 10% периферического тестостерона. Два наиболее общепринятых средства ингибирования продукции андрогенов надпочечниками являются аминоглютетимид и кетоконазол.

- 10 017265

Другие примеры супрессирующих андрогены лекарственных средств включают диэтилстильбестрол (ЭЕ8), мегестрола ацетат, ципротерона ацетат и преднизон. Эстрогены ранее являлись основной альтернативой орхиэктомии для мужчин с запущенным раком предстательной железы, но вследствие их возможных побочных эффектов, которые включают образование тромбов и увеличение молочных желез, эстрогены в значительной степени заменены аналогами ЬНВН и антиандрогенами.

Согласно изобретению курс лечения антагонистом 1ОР-1В проводят начиная до, во время или после начала ΆΌΤ. Курс введения антагонистом 1ОР-1В следует сочетать с ΆΌΤ, но сочетание не обязательно является полным. Например, антагонист 1ОР-1В можно вводить в любое время в течение ремиссии, полученной в результате андрогенной абляции. В варианте осуществления изобретения антагонист 1ОР-1В вводят в пределах 24 месяцев после андрогенной абляции для лечения первичных или метастатических опухолей. В другом варианте осуществления антагонист 1ОР-1В вводят в пределах 18 месяцев после андрогенной абляции. В варианте осуществления изобретения антагонист 1ОР-1В вводят в течение или близко к концу периода гибели клеток, который наблюдают при лечении ΆΌΤ, и он будет предотвращать или задерживать последующую пролиферацию ΑΙ-клеток. В варианте осуществления изобретения введение антагониста 1ОР-1В начинают в пределах двух недель после андрогенной абляции. В другом варианте осуществления введение начинают в пределах одной недели после андрогенной абляции.

Антагонисты 1ОР-1В по изобретению можно вводить с антагонистами, которые нейтрализуют другие рецепторы, вовлеченные в опухолевый рост. Особенный интерес представляют рецепторы, вовлеченные в путь передачи сигнала, включающий Ак1. Например, как предполагают, в передачу сигнала посредством ЕОРВ или НЕВ2 (егЬВ2) вовлечена активация Ак1. Соответственно, антагонисты 1ОР-1В по изобретению можно сочетать с внутриклеточными или внеклеточными антагонистами ЕОРВ или НЕВ2.

Антагонисты ЕОРВ или НЕВ2 включают антигенсвязывающие белки, которые связываются с внеклеточным доменом ЕОРВ или НЕВ2 и блокируют связывание одного или нескольких лигандов и/или нейтрализуют индуцированную лигандом активацию. Антагонисты также включают антитела или другие связывающие белки, которые связываются с лигандом ЕОРВ и ингибируют связывание ЕОРВ с лигандом. Лиганды ЕОРВ включают, например, ЕОР, ТОР-α, амфирегулин, гепаринсвязывающий ЕОР (НВ-ЕОР) и бетацеллулин. Как предполагают, ЕОР и ТОР-α являются основными эндогенными лигандами, которые вызывают ЕОРВ-опосредованную стимуляцию, хотя, как показано, ТОР-α является более мощным в стимуляции ангиогенеза. Антагонисты ЕОРВ также включают вещества, которые ингибируют димеризацию ЕОРВ с другими субъединицами рецептора ЕОРВ (т.е. гомодимеры ЕОРВ) или гетеродимеризацию с другими рецепторами факторов роста (например, НЕВ2). Антагонисты ЕОРВ дополнительно включают биологические молекулы и малые молекулы, такие как синтетические ингибиторы киназ, которые действуют непосредственно на цитоплазматический домен ЕОРВ для ингибирования ЕОРВ-опосредованной передачи сигнала. Эрбитукс® (цетуксимаб; С225) представляет собой пример антитела-антагониста ЕОРВ, которое связывается с ЕОРВ и блокирует связывание лиганда. Эрбитукс® представляет собой химерное антитело 1дО1, обладающее вариабельными доменами мыши из М225 (см., например, АО 96/40210) и константными доменами человека. Антитело анти-ЕОРВ человека, обозначенное 11Р8, описано в Ζΐιιι (АО 2005/090407). Другие антитела анти-ЕОРВ включают ЕМО 72000 (матузумаб), вектибикс™ (панитумумаб; АВХ-ЕОР), ТйегаС1М (нимотузумаб) и Ни-Мах-ЕОРВ (залутумумаб). Примером низкомолекулярного антагониста ЕОРВ является ИРЕССА™ (ΖΌ1939), который представляет собой производное хинозалина, функционирующее в качестве АТР-миметика для ингибирования ЕОРВ. См. патент США № 5616582 Депеса Ышйеб). Другим примером низкомолекулярного антагониста ЕОРВ является ТАРЦЕВА™ (Ο8Ι-774), который представляет собой производное 4-(замещенный фениламино)хиноксалина [6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3 -этинилфенил)амингидрохлорид] в качестве ингибитора ЕОРВ. См. АО 96/30347 (ΡΓί/ег 1пс.); Моуег е! а1., Сапсег Век., 57:4838-48 (1997); Ро11аск е! а1., 1. РйагшасоР, 291:739-48 (1999). ТАРЦЕВА™ может функционировать путем ингибирования фосфорилирования ЕОРВ и расположенных ниже него киназных путей передачи сигнала Р13/Ак! и МАР (митоген-активированный белок), вызывая р27-опосредованную остановку клеточного цикла. См. Н1ба1до е! а1., АЬк!гас! 281, представленный на 37111 Аппиа1 Меейпд оГ А8СО, 8ап Ргапаксо, СА, 12-15 Мау 2001.

Хотя антагонисты можно вводить по отдельности, в определенных случаях желательно сочетать функции двух антагонистов в одной молекуле, такой как биспецифическое антитело или двойной ингибитор. Биспецифические антитела можно сконструировать так, чтобы сочетать специфичность в отношении 1ОР-1В со специфичностью в отношении другого ВТК или другой молекулы на поверхности клетки. Особенно интересны сочетания специфичности в отношении 1ОР-1В со специфичностью в отношении ЕОРВ или специфичностью в отношении НЕВ2. Пример биспецифического антитела, которое связывается с 1ОР-1В и ЕОРВ, представлен в ΖΙπ.ι (АО 2006/020258). Сходным образом, доступны малые молекулы, которые ингибируют 1ОР-1В и второй клеточный компонент, или можно осуществлять скрининг с их участием. Например, как упомянуто выше, 1Ы8М-18 (1п5ше6/ишуег511у оГ СайГогша 8ап Ргап5с15со) ингибирует 1ОР-1В и НЕВ2/пеи.

- 11 017265

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим антагонисты по настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемую соль, гидрат или пролекарство, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут являться отдельными композициями антагониста 1СЕ-1В и средства ЛОТ или одной композицией, содержащей и то и другое.

Композиции по настоящему изобретению могут находиться в твердой или жидкой форме, в растворе или в суспензии. Способы введения включают, например, пероральное, парентеральное (внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное), местное, трансдермальное и путем ингаляции.

Для перорального введения антагонист ЮЕ-ΙΒ можно вводить, например, в жидкой форме с инертным разбавителем или усваиваемым носителем или включать в состав твердой лекарственной формы. Примеры пероральных жидких и твердых лекарственных форм включают, например, растворы, суспензии, сиропы, эмульсии, таблетки, пастилки, капсулы (включая мягкие желатиновые капсулы) и т.п. Пероральные лекарственные формы можно составлять в виде продуктов с замедленным высвобождением с использованием, например, покрытия для задержки распада или для контроля диффузии активного соединения. Там, где это необходимо, композиции могут также содержать солюбилизирующее средство.

Примеры лекарственных форм для инъекций включают стерильные жидкости для инъекций, включая, например, растворы, эмульсии и суспензии. Лекарственные формы для инъекций включают твердые вещества, такие как стерильные порошки, которые заново разводят, растворяют или суспендируют в жидкости перед инъекцией. Стерильные растворы для инъекций получают внесением антагониста ЕСЕΙΒ и/или средства ЛОТ в требуемом количестве в соответствующем растворителе с различными другими перечисленными выше ингредиентами, при необходимости с последующей стерилизацией фильтрованием. Носители, как правило, включают, например, стерильную воду, солевой раствор, инъецируемые органические сложные эфиры, арахисовое масло, растительное масло и т.п. Забуферивающие средства, консерванты и т. п. можно вносить в пригодных для введения формах. Стерильные композиции можно получать нагреванием, облучением, микрофильтрованием и/или добавлением различных антибактериальных и противогрибковых средств, таких как, например, парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимерозал и т.п.

Для местного введения антагонисты 1СЕ-1В и средства ЛОТ по настоящему изобретению можно вводить по отдельности или совместно, например, в форме гелей, кремов, или мазей, или лекарственных веществ в вязком носителе. Типичные носители для такого нанесения включают гидрофобные или гидрофильные основания, масляные или спиртовые жидкости и сухие порошки. Антагонисты 1СЕ-1В и средства ΑΌΤ можно также вносить в гель или матричную основу для нанесения при помощи лейкопластыря, необязательно, обеспечивая контролируемое высвобождение соединения через трансдермальный барьер. Антагонисты 1СЕ-1В и средства ΑΌΤ можно также составлять с помощью известных способов для ректального введения.

Для введения путем ингаляции антагонисты 1СЕ-1В и средства ΑΌΤ по настоящему изобретению можно растворять или суспендировать в подходящем носителе или адсорбировать на нем для использования в распылительном, аэрозольном ингаляторе или ингаляторе с использованием сухих порошков.

Подходящие дозировки может определять врач или квалифицированный медицинский специалист, и они зависят от факторов, таких как природа подлежащего лечению заболевания, способ введения, продолжительность лечения и состояние пациента. Антагонисты 1СЕ-1В и средства ΑΌΤ можно вводить так часто, как это необходимо для того, чтобы получить желаемый терапевтический эффект. Частота введения будет зависеть, например, от природы используемой лекарственной формы. Специалист в данной области может понимать, что дозировки и частота лечения зависят от переносимости конкретным пациентом и от фармакологических и фармакокинетических свойств используемого блокирующего или ингибирующего средства. В идеальном случае, желательно достижение насыщаемой фармакокинетики для используемого средства. Ударная доза для антитела анти-1СЕ-1В может варьировать, например, от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мг/м², предпочтительно от приблизительно 200 до приблизительно 400 мг/м². За этим может следовать несколько дополнительных ежесуточных или еженедельных дозировок, варьирующих, например, от приблизительно 200 до приблизительно 400 мг/м². Примерная дозировка антитела 1СЕ-1В составляет 400 мг/м² для ударной и 250 мг/м² для еженедельной инфузии (для перерасчетов между мг/кг и мг/м² для человека и других млекопитающих, см. Егс1гс1сй. ЕЛ. с1 а1. , 1966, Сапсег СйстоФсг. Вер. 50:219-44). Пациента обследуют на побочные эффекты, и лечение останавливают, если такие побочные эффекты являются серьезными. Эффективные дозировки средств ΑΌΤ хорошо известны в данной области.

Специалист в данной области может также знать, как вести наблюдение за развитием лечения, чтобы определить эффективную дозу. Для рака предстательной железы один из таких способов представляет собой мониторирование уровней Ρ8Α. Другой способ состоит в мониторировании кислой фосфатазы предстательной железы (РАР). Другие способы мониторирования случаев рака предстательной железы включают ультразвук, компьютерную томографию (СТ), магнитно-резонансную томографию (МВ1) и т.п. Образцы тканей можно исследовать на экспрессию и клеточное распределение ΑΒ, а также экспрес

- 12 017265 сию сурвивина и/или ТиВВ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение, сочетающее введение антагонистов ЮРИК с ЛОТ, можно применять с одним или несколькими противоопухолевыми средствами. Например, как указано выше, ЛОТ часто применяют в качестве неоадъюванта радиационной терапии опухолей предстательной железы. Если противоопухолевым средством является облучение, то источник облучения для подлежащего лечению пациента может являться или внешним (радиационная терапия от внешнего источника - ЕВКТ), или внутренним (брахитерапия - ВТ).

Противоопухолевое средство может представлять собой алкилирующее средство или антиметаболит. Примеры алкилирующих средств включают в качестве неограничивающих примеров цисплатин, циклофосфамид, мелфалан и дакарбазин. Примеры антиметаболитов включают в качестве неограничивающих примеров доксорубицин, даунорубицин и паклитаксел, гемцитабин.

Пригодные противоопухолевые средства также включают ингибиторы митоза, такие как таксаны доцетаксел и паклитаксил. Ингибиторы топоизомеразы представляют собой другой класс противоопухолевых средств, которые можно применять в сочетании с антителами по изобретению. Они включают ингибиторы топоизомеразы I или топоизомеразы II. Ингибиторы топоизомеразы I включают иринотекан (СРТ-11), аминокамптотецин, камптотецин, ΌΧ-8951Γ, топотекан. Ингибиторы топоизомеразы II включают этопозид (УР-16) и тенипозид (УМ-26). В качестве противоопухолевых средств в настоящее время оценивают другие вещества в отношении активности и эффективности в ингибировании топоизомеразы. В предпочтительном варианте осуществления ингибитор топоизомеразы представляет собой иринотекан (СРТ-П).

По всему описанию изобретения цитируются различные публикации, тексты ссылок, руководства, технические пособия, патенты и патентные заявки. Идеи и описания этих публикаций, патентов, патентных заявок и других документов приведены в настоящем изобретении в качестве ссылки в полном объеме для более полного описания состояния области, к которой относится настоящее изобретение.

Следует понимать и ожидать, что специалист в данной области может осуществлять вариации описанных здесь принципов изобретения, и подразумевается, что такие модификации должны входить в объем настоящего изобретения.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но не следует полагать, что они каким-либо образом ограничивают объем изобретения. Подробные описания общепринятых способов, таких как способы, используемые в конструировании векторов и плазмид, и экспрессии антител и фрагментов антител, можно получить из многочисленных публикаций, включая 8атЬгоок, 1. е! а1. (1989), Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬота!оту Мапиа1, 2^й ей., Со1й 8ρτίη§ НагЬог ЬаЬота!оту Ртекк; СоНдаи, 1. е! а1. (1994), Сиггеи! Рто!осо1§ ίη Iттиηο1οду, \УПеу & 8ои§, [псогрога1ей; Еииа, 8.1. е! а1. (1991), Сиггеи! Рто!осо1§ ίη Рйаттасо1оду, \Уйеу & 8ои§; ВопГасшо, 1.8. е! а1. (1999), Сиггеи! Рто!осо1§ ίη Се11 Вю1оду, ^УПеу & 8оиз. Все упомянутые здесь ссылки приведены в полном объеме.

Примеры

Антагонист ЮР-ΣΚ. ингибирует возобновление роста опухоли после ЛОТ.

Разработана преклиническая модель с кастрацией при возникновении рецидива рака предстательной железы после кастрации для тестирования эффективности ингибирования обусловленной ЮР-ГК передачи сигнала с использованием моноклонального антитела к ЮР-ΣΚ человека ДМС-А12). Для исследования ксенотрансплантат ЬиСаР 35, андрогенчувствительной линии клеток рака предстательной железы человека, имплантировали подкожно в паховую область самцов мышей 8СШ. ЬиСаР 35 может переходить в андрогеннезависимое состояние, и ее можно использовать для оценки молекулярных изменений, связанных с этим процессом. Вначале происходит снижение уровней Р8А и уменьшение объема опухоли, но после периода в 60-120 суток наблюдают возобновление роста опухолей. ЬиСаР 35 обладает метастатическим потенциалом и вызывает смешанные повреждения костей. ЬиСаР 35, растущая у интактных самцов мышей, является андрогенчувствительной и реагирует на андрогенную абляцию способом, который обычно наблюдают у пациентов.

Клетки ЬиСаР 35 имплантировали подкожно в паховую область самцов мышей 8СШ. Когда опухоли достигали объема приблизительно 400 мм³, мышей кастрировали и разделяли на три группы из 20 животных в каждой. В контрольной группе 1 производили только кастрацию, в группе 2 производили кастрацию и вводили ЕМС-А12 внутрибрюшинно три раза в неделю в течение 14 суток, начиная с 7 суток после кастрации, и в группе 3 вводили ШС-АП в течение 14 суток, начиная с 14 суток после кастрации. После 14 суток введения ЕМС-А12 не осуществляли никакого лечения. Расчет времени введения А12 в течение 2 недель, начиная с 1 или 2 недель после кастрации, производили на основе опубликованных данных для линии клеток ЬиСаР 35, которые указывают, что максимальная степень индуцируемого кастрацией апоптоза происходит в течение четырех суток после кастрации (Согеу, Е. е! а1., 2003, Рто8!а!е 99:392-401). Так как ингибирование обусловленной ЮРИК передачи сигнала может вызывать остановку клеточного цикла и предотвращать вступление клеток в апоптоз, было решено начинать введение А12, когда происходил полный апоптоз после кастрации (Согеу е! а1., 2003; Тсппни!, М. е! а1., 2003, Рго81а!е, 56:115-22).

- 13 017265

Образцы крови собирали еженедельно из глазничного синуса. Сыворотку отделяли и уровни Р8А определяли с использованием 1Мх То1а1 Р8Л Аккау (АЬЬой ЬаЬогаФпек, АЬЬой Рагк, 1Ь). Опухоли измеряли два раза в неделю и объем опухоли оценивали по формуле: объем = Ь х ^2/2. Мышей умерщвляли при достижении опухолями размера 1000 мм³ или тогда, когда потеря массы животными превышала 20% первоначальной массы тела. ВМИ вводили ί.ρ. мышам за 1 ч перед тем, как животных умерщвляли, для определения ίη νίνο степени пролиферации опухолевых клеток.

После кастрации вначале происходила остановка роста опухолей у всех мышей (фиг. 1). У мышей, которым вводили 1МС-А12, объем опухоли снижался в течение периода исследования, и у них отсутствовали случаи связанной с опухолями смерти. В необработанной группе увеличение среднего объема опухоли становилось выраженным к 5 неделе, при этом связанные с опухолями случаи смерти (когда животных умерщвляли) начинались на четвертую неделю и продолжались на протяжении исследования. Следует обратить внимание, что график среднего объема опухолей искусственно занижался для мышей, которые не получали 1МС-А12, так как с каждым случаем смерти происходило удаление большой опухоли из усредненного множества опухолей.

Уровни Р8А отслеживали у мышей с ксенотрансплантатом ЬиСаР 35. Все мыши вначале реагировали на гормональную абляцию, и сходное снижение уровней Р8А наблюдали в первую неделю после кастрации (фиг. 2). У мышей, которым производили только кастрацию, после начального снижения уровни Р8А затем увеличивались в течение периода исследования, начиная приблизительно со второй недели. В то же время уровни Р8А у кастрированных мышей, которым вводили 1МС-А12, не увеличивались, но оставались вблизи нулевой линии.

Это исследование показывает, что блокирование обусловленной 1СР-1К передачи сигнала и экспрессии 1СР-1К после кастрации при помощи антитела к 1СР-1К, 1МС-А12 приводит к значительно большему снижению объема опухоли по сравнению только с кастрацией, р<0,001 и значительно увеличивает время до возобновления ΑΙ-роста опухоли, который определяли по объему опухоли и увеличению уровня Р8А, р<0,001.

У контрольных животных, которым производили только кастрацию, рост опухоли прекращался приблизительно на четыре недели, но затем возобновлялся. Среди животных, которым производили только кастрацию, более половины было умерщвлено по причине роста опухоли к 9 неделям после кастрации, и большая часть животных была умерщвлена к концу 16 недель. В то же время, все животные, которые получали 1МС-А12, оставались живыми после 16 недель.

Представленные результаты ίη νίνο говорят об эффективности ингибирования обусловленной 1СР1К передачи сигнала. Примечательно, что антагонист 1СР-1К вводили в течение 14 суток, и затем введение прекращали. В отдельном исследовании, в котором А12 вводили сходным образом, некоторое возобновление опухолевого роста наблюдали на поздней стадии исследования после введения А12. Двое из 40 животных групп 2 и 3 было умерщвлено в конце исследования по причине увеличения объема опухоли. Поддерживающие дозы антагониста 1СР-1К, возможно, приведут к неопределенно долгому увеличению времени до возобновления опухолевого роста.

Для исследования того, существует ли взаимосвязь между уменьшением объема опухоли у обработанных А12 опухолей и транслокацией ЛК, осуществляли иммуногистохимический анализ ЛК для опухолей из каждой трех групп, как представлено на фиг. 5. Показатель окрашивания ядер на АК определяли для 100 ядер из каждой опухоли. Ядра подсчитывались вслепую двумя индивидуумами, и среднее значение двух показателей рассматривали как показатель для данной ткани. Существует значимая положительная корреляция между объемом опухоли и интенсивностью ядерного АК, г=0,66, р<0,01.

Антагонист 1СР-1К ингибирует транслокацию АК.

Оценивали эффект стимуляции и ингибирования 1СР-1К на локализацию рецептора андрогенов. Клетки ЬиСаР 35 культивировали в присутствии или в отсутствие стимуляции 1СР-1, в присутствии или в отсутствие 1МС-А12 (фиг. 3). Цитоплазматические и ядерные экстракты получали из обработанных клеток и оценивали с помощью РАСЕ. Уровень ЕКК использовали для выравнивания нагрузки на дорожки. В клетках, стимулированных 1СР-1, 1МС-А12 вызывал уменьшение доли наблюдаемого в ядре рецептора андрогенов.

Транслокацию рецептора андрогенов также оценивали иммуногистохимией (фиг. 4). Опухоли из ксенотрансплантата ЬиСаР 35 (АО) пролиферировали в интактных самцах, и опухоли из ксенотрансплантата ЬиСаР 35У (А1) пролиферировали в кастрированных мышах. Тестируемым мышам вводили 1МС-А12. Получали серийные срезы опухолей и окрашивали АК-специфическими антителами. У интактных контрольных мышей в андрогензависимых тканях ЬиСаР 35 АК локализовался преимущественно в ядре. В ткани тестируемых животных, которым вводили 1МС-А12, окрашивание на АК наблюдали в цитоплазме. У кастрированных контрольных мышей в андрогеннезависимых клетках ЬиСаР 35ν АК распределялся между ядром и цитоплазмой. В тканях тестируемых животных, которым вводили 1МС-А12, окрашивание на АК наблюдали преимущественно в цитоплазме.

- 14 017265

В сходном эксперименте локализацию АК исследовали флуоресцентной микроскопией в культуре тканей. Обработка 10^-8 М ΌΗΤ вызывала значительное перераспределение АК из цитоплазмы в ядро. Обработка только с помощью ЮР-Ι вызывала частичное перераспределение АК в ядро, и ^С-АП полностью обращал этот эффект.

Антагонист ЮРИК ингибирует АК-зависимую экспрессию генов.

Сурвивин, который является ингибитором апоптоза, обладает сильной экспрессией в нескольких линиях клеток рака предстательной железы человека. В линиях клеток с интактными рецепторами андрогенов андрогенная стимуляция посредством ΌΗΤ усиливает экспрессию сурвивина. Также наблюдали, что экспрессия сурвивина опосредована Ак!, так как передача сигнала от Ак1. индуцированная ЮР, усиливает экспрессию сурвивина даже в АК-негативных линиях клеток. Эксперимент с генным чипом для детектирования дифференциальной экспрессии сурвивина указывает на то, что экспрессия сурвивина снижается при лечении с помощью ^С-АП.

Специальные микрочипы с кДНК конструировали, как описано ранее |геГ| с использованием клонов, полученных из Ргок!а!е Ехргеккюп Эа1а Ваке (РЕЭВ) , хранилища последовательностей для данных по экспрессирующимся маркерным последовательностям (Ε8Τ) предстательной железы человека, находящихся в публичном доступе (№1коп, Р.8. е! а1., 2002, Ыис1. Ас1йк Кек. 30:218-20). Способы мечения с помощью флуоресцентных красителей Су3 и Су5, гибридизацию с панелям микрочипов и обработку чипов осуществляли, как описано (Τηκ^γ, V. е! а1., 2001, Ргос. №11. Асай. 8с1. И.8.А. 98:5116-21).

Отбирали по три опухоли из каждой экспериментальной группы. Для получения стандарта РНК для сравнения для использования в микрочипах с кДНК равные количества суммарной РНК выделяли и отбирали из линий клеток ЬЫСаР, ЭШ45, РС3 и С\УК221У1 (Атейсап Τуре Си1!ше Со11ес!юп, Мапаккак, VА), выращенных в логарифмической фазе в среде КРМЕ1640 без красителя с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РВ8; Ьйе Τесйио1од^ек, КоскуШе, ΜΌ). Суммарную РНК выделяли из отобранных опухолей и линий клеток с использованием Ю^/о! Цпуйгодеп, 8апЭ1едо, СА). мРНК амплифицировали в одном цикле с использованием набора для амплификации АтЫоп МеккадеАтр™ ΙΙ (АтЫоп Шс, Аикйп, ΤΧ) и качество и количество образца оценивали с помощью агарозного гельэлектрофореза и поглощения при А260. Зонды для гибридизации метили и контроль качества для экспериментов с использованием чипов осуществляли, как описано ранее (Τηκ^γ, V. е! а1., 2001). Различия в экспрессии генов, связанные с обработанными группами, определяли с использованием процедуры 8АМ (Сйи, 6., Хагак1тйаи, В., ПЬкЫгаш, К. & ΠικΙ^ι; V., 2002, 81дп1Г1сапсе апа1ук1к оГ ткгоаггаук (кат) койгаге, 81апГогй Ишуегкйу) с рассматриваемой в качестве значимой (37) частотой ложных обнаружений (РЭК) <10%. Сходства между образцами оценивали посредством неконтролируемой, иерархической кластеризации генов и образцов с использованием программного обеспечения С1ик!ег 3.0 (йе Нооп е! а1., 2004, ВюшГогтайск 20:1453-4) и просматривали с помощью ^ее ^ете (Раде, К.Э., 1996, Сотри!. Арр1. Вюкск 12:357-8).

Сурвивин и ТОВВ также оценивали с помощью РСК с использованием ранее описанных праймеров и способов (Уи, 1. е! а1., 2006, Сйп. Сапсег Кек. 12:6153-60). Очищали стандартный РСК-фрагмент кДНКмишени. Серию разведений стандартов от 10 нг/мкл до 10^-3 пг/мкл использовали для КГ-РСК в реальном времени для получения калибровочных кривых. 1 мкг суммарной РНК из каждой группы отобранных опухолей использовали для синтеза первой цепи кДНК с использованием 8ирегксйр! Р1гк! 8!гапй 8уп!йек1к 8ук!ет Цпуйгодеп). КИРСК в реальном времени осуществляли в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 1 мкл первой цепи кДНК, набора специфических праймеров и Ыдй!сус1ег Рак!8!ай ЭХА Мак!ег Р1ик 8УВК 6гееп, с использованием Косйе Ыдй!сус1ег согласно инструкции производителя (Косйе, ЫиИеу, N1). Продукты КИРСК подвергали анализу кривой плавления посредством программного обеспечения Ыдй!сус1ег ν3.5. Размеры ампликонов подтверждали с помощью агарозного гель-электрофореза. Каждый образец анализировали в двух параллелях.

Кастрация в сочетании с антагонистом ЮРИК связана со снижением экспрессии гена АК до тех пор, пока не произойдет рецидивирование опухоли. Образцы РНК из опухолей, полученные в каждой группе во временные рамки, указанные в табл. 2, анализировали на микрочипах с кДНК. Для группы 1 (только кастрация) не обнаружены гены, которые значительно изменены между периодами времени, при тестировании с помощью двухвыборочного !-критерия в 8АМ (добротность >100%). Кроме того, в неконтролируемой, иерархической кластеризации известных регулируемых андрогенами генов не разделялось два периода времени. Это может быть не удивительно, так как многие из животных в этой группе обладали восстановлением уровня Р8А и увеличением показателей АК в ядре по сравнению с группами 2 и 3 к 40 суткам. В то же время имели место значительные изменения экспрессии генов между двумя периодами времени в обработанных А12 опухолях. Из 3170 уникальных генов на чипе с достаточным количеством данных для тестирования 21 подвергался стимуляции (включая многие регулируемые андрогенами) и 41 подвергался подавлению с <10% добротности в позднем периоде времени, когда опухоли начинали рецидивировать, по сравнению с ранним периодом времени (фиг. 6) Более того, посредством неконтролируемой, иерархической кластеризации известных регулируемых андрогенами генов отчетливо выделяются обработанные с помощью А12 два периода времени в двух отдельных кластерах. Эти

- 15 017265 данные указывают на то, что экспрессия ЛК в ядре связана с транскрипционной активностью ЛК и прогрессированием рака предстательной железы посредством активации АК.

Таблица 2

Чипы с кДНК в каждый момент времени

	Сутки после кастрации
20-60	70-150
Группа 1 (кастрация)	3	3
Группа 2 (кастрация + раннее введение А12)	2	2
Группа 3 (кастрация + позднее введение А12)	1	1

Экспрессия сурвивина и β-тубулина значительно снижалась посредством антагониста ЮР-1К. В исследованиях с помощью микрочипов определили, что экспрессия сурвивина снижалась в опухолях, обработанных антителами А12. Как представлено на фиг. 7А, с помощью Οί-ИТ РСК с РНК, выделенной из опухолей, показана значимая положительная корреляция между количеством копий сурвивина и объемом опухоли, г=0,66, р<0,01. Второй ген, для которого недавно обнаружено участие в индуцированном ЮР-1К образовании опухолей, представляет собой β-тубулин, ТиВВ (О'Соппог, К., 2003, Ногт. Ме1аЬ. Кез. 35:771-7; Се11ег, I. е! а1., 1984, I. Иго1. 132:693-700). Показано, что количество ТИВВ снижено в микрочипах, и, как представлено на фиг. 7В, показано, что в образцах опухолей положительно коррелирует с объемом опухоли, г=0,59, р<0,01, и значительно снижено в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1. Третий ген, количество которого не отличалось с течением времени на микрочипах в группе 1, но снижалось в двух ранних периодах времени в группе животных 2 и 3, представлял собой Р8А. Изменение экспрессии Р8А подтверждено сходным профилем уровней Р8А в сыворотке.

Пролиферация и апоптоз.

Апоптоз определяли анализом мечения концевого разрыва с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (ΤϋΝΕΡ) и окрашиванием пропидием (Р1) с использованием набора Арор-Ийес!; (ВИ Вю8е1епее), как описано ранее (Аи, Ι.Ό. е! а1., 2005, С1т. Сапсег Кез., 11:3065-74). В кратком изложении, 1 х 10⁶ клеток из клеточной суспензии фиксировали 10% формалином в нейтральном буфере ^ВР) с последующей обработкой 70% этиловым спиртом при -20°С в течение 30 мин. После нескольких промывок клетки подвергали пермеабилизации 0,1% Тритоном Х-100 и инкубировали с ТИТР, конъюгированным с Р1ТС, и ферментом терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ТТТ) при 37°С в течение 1 ч, с последующей инкубацией с буфером с Р1/РНКазой (100 мкг/мл Р1, 50 мкг/мл РНКазы) при комнатной температуре в течение 60 мин. Образцы анализировали проточной цитофлуориметрией с использованием ВИ РАСзсап. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Се119иез1РКО. Апоптоз также определяли с использованием анализа ТСЖЕР в фиксированной формалином ткани с использованием набора Арор-Тад (МПИроге Со, МА) согласно инструкциям производителя. Апоптотические клетки определяли на 300 клеток на образец ткани.

Как представлено в табл. 3, пролиферация оказалась значительно выше в группе 1 опухолей по сравнению с группой 2 и 3, р<0,01. В то же время апоптоз при определении окрашиванием с помощью ТИЖЬ оказался выше в группе 1 по сравнению с группами 2 и 3, табл. 3.

Таблица 3

Апоптоз и поглощение ВНИИ

**р<0,001 по сравнению с группой с кастрацией.

- 16 017265

Список последовательностей <110> 1МСЬОЫЕ 3Υ3ΤΕΜ3, 1ЫС.

<120> АНТАГОНИСТЫ 1СЕ-1К В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ <130> 1МСЬОЫ 3.4-048 <140> РСТ/и32007/003164 <141> 2007-02-03 <150> 60/765,072 <151> 2006-02-03 <160> 50 <170> РаЬепЫп Уег. 3.5 <210> 1 <211> 390 <212> ДНК <213> Ното зариепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(390) <400> 1 -

дад С1и 1

дЬс Уа1

сад С1п

сЬд Ьеи

дЕд Уа1 5

сад С1п

ЬсЬ Зег

ддд С1у

дсЬ А1а

дад С1и 10

дЕд Уа1

аад Ьуз

ссЬ Рго

ддд С1у 15

Ьсс Зег

48

Ьсд

дЬд

аад

дЬс

Осс

Где

аад

дсЬ

ЬсЬ

дда

ддс

асе

ЕЕс

аде

ЬаЬ

96

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

ТЬг

РЬе

Зег

Туг

20

25

30

дсЬ

абс

аде

Едд

дЕд

еда

сад

дсс

ссЬ

дда

саа

ддд

си

дад

Едд

аЬд

14 4

А1а

Не

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

дда

ддд

аЬс

сер

аЬс

Ш

ддЕ

аса

дса

аас

Еас

дса

сад

аад

ЬЬс

192

С1у

11е

Рго

11е

РЬе

С1у

ТЬг

А1а

Азп

Туг

А1а

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

сад

ддс

ада

дЕс

асд

аЬЬ

асе

дед

дас

ааа

Ьсс

асд

аде

аса

дсс

Гас

24 0

С1п

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

А1а

Азр

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

7 5

⁸⁰

ард

дад

сЬд

аде

сЬд

ада

Ось

дад

дас

асд

дсс

дЕд

5аЬ

Ьас

ЬдЬ

288

Мер

С1и

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

дед

ада

дед

сса

ЬЬа

еда

и!

Ысд

дад

Едд

Ьсс

асе

саа

дас

сас

Рас

336

А1 а

Агд

А1 а

Рго

Ьеи

Агд

РЬе

Ьеи

С1и

Тгр

Зег

ТЬг

С1п

Азр

Н13

Туг

100

105

110

Гас

бас

Нас

Рас

ард

дас

дЬс

Едд

ддс

ааа

ддд

асе

асд

дЬс

асе

дЕс

384

Туг

Мер

Азр

Уа1

Тгр

С1у

Ьуз

С1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

115

120

125

Оса аде 390

Зег Зег

130 <210> 2 <211> 130 <212> ΡΚΤ <213> Ното зарЬепз

<400> 2

С1и 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

(Ип

Зег

(Иу

А1а

(Ии 10

Уа1

Ьуз

Рго

Иу 15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

ТЬг

РЬе

Зег

Туг

20

25

30

А1а

Не

Зег

Тгр

Уа1

Агд

(Ип

А1а

Рго

С1у

С1п

Иу

Ьеи

С1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

61 у

С1У

Не

Рго

Не

РЬе

(Иу

ТЬг

А1а

Азп

Туг

А1а

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

С1у

Агд

\/а1

ТНг

Не

ТЬг

А1а

Азр

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Мер

(Ии

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Зег

(Ии

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

А1а

Рго

Ьеи

Агд

РЬе

Ьеи

С1и

Тгр

Зег

ТЬг

С1п

Азр

Н1з

Туг

100

105

110

Туг

Мер

Азр

Уа1

Тгр

61у

Ьуз

С1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

115 120 125

Зег Зег

130 <210> 3 <2 11 > 1440 <212> ДНК

<213>	Ното	зар!епз
<220>
<221>	СРЗ
<222>	(1) . .	. (1437)

<400> 3

аЬд МеЬ 1

дда С1у

Удд Тгр

Оса Зег

ЬдЬ Суз 5

аЬс Не

сП Ьеи

ООО РЬе

ска Ьеи 10

дЬа Уа1

дса А1а

асЬ ТЬг

дса А1а

асЬ ТЬг 15

дда С1у

дЬа

саЬ

Оса

дад

дЬс

сад

сЬд

дЬд

сад

ЬсЬ

ддд

дсЬ

дад

дьд

аад

Уа1

Н1з

Зег

(Ии

Уа1

61п

Ьеи

Уа1

(Ип

Зег

С1у

А1а

СИи

Уа1

Ьуз

20

25

30

ссЬ

ддд

Осс

Ьсд

дбд

аад

дЕс

Осс

Оде

аад

дек

ЬсЬ

дда

ддс

асе

т

Рго

С1у

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

Иу

С1у

ТЬг

РЬе

35

40

45

аде

ЬаЬ

дсЬ

аЬс

аде

Одд

дрд

еда

сад

дсс

ссЬ

дда

саа

ддд

сП

Зег

Туг

А1а

Не

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

50

55

60

дад

Одд

ард

дда

ддд

аЬс

сер

аЬс

ддр

аса

дса

аас

Рас

дса

(Ии

Тгр

МеЕ

С1у

61у

Не

Рго

Не

РЬе

С1у

ТЬг

А1а

Азп

Туг

А1а

- 18 017265

70 75 80

сад С1п

аад Ьуз

ЬЬс РЬе

сад С1п

ддс С1у 85

ада Агд

дЬс Уа1

асд ТЬг

аЬЬ 11е

асе ТЬг 90

дед А1а

дас Азр

ааа Ьуз

Ьсс Зег

асд ТЬг 95

аде Зег

288

аса

дсс

Ьас

аЬд

дад

сЬд

аде

сЬд

ада

ЬсЬ

дад

дас

асд

дсс

дЬд

336

ТЬг

А1а

Туг

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

100

105

110

ЬаЬ

Ьас

ЬдЬ

дед

ада

дед

сса

ЬЬа

еда

ЬЬЬ

ЬЬд

дад

Ьдд

Ьсс

асе

саа

384

Туг

Суз

А1 а

Агд

А1а

Рго

Ьеи

Агд

РЬе

Ьеи

С1и

Тгр

Зег

ТЬг

С1п

115

120

125

дас

сас

Ьас

аЬд

дас

дЬс

Ьдд

ддс

ааа

ддд

асе

асд

432

Азр

Низ

Туг

МеЬ

Азр

\7а1

Тгр

С1у

Ьуз

С1у

ТЬг

130

135

140

дЬс

асе

дЬс

Ьса

аде

' дсс

Ьсс

асе

аад

ддс

сса

Ьсд

дЬс

ЬЬС

ссс

сЬд

480

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

145

150

155

160

дса

ссс

Ьсс

аад

аде

асе

ЬсЬ

ддд

ддс

аса

дед

дсс

сЬд

ддс

Ьдс

528

А1а

Рго

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

С1у

ТЬг

А1а

Ьеи

С1у

Суз

1 65

170

175

сЬд

дЬс

аад

дас

Ьас

ЬЬс

ссс

даа

ссд

дЬд

асд

дЬд

Ьсд

Ьдд

аас

Ьса

576

Ьеи

\7а1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

\7а1

Зег

Тгр

Азп

Зег

180

185

190

ддс

дсс

сЬд

асе

аде

ддс

д^д

сас

асе

ЬЬс

ссд

дсЬ

дЬс

сЬа

сад

Ьсс

624

С1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

Юз

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

Зег

195

200

205

Еса

дда

сЬс

Ьас

Ьсс

сЬс

аде

дЬд

асе

дЬд

ссс

Ьсс

аде

672

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

210

215

220

О+д

ддс

асе

сад

асе

Ьас

аЬс

Ьдс

аас

дЬд

ааЬ

сас

аад

ссс

аде

аас

720

Ьеи

С1у

ТЬг

С1п

ТЬг

Туг

Не

Суз

Азп

\7а1

Азп

Н15

Ьуз

Рго

Зег

Азп

225

230

235

240

асе

аад

дЬд

дас

аад

ааа

дЬЬ

дад

ссс

ааа

ЬсЬ

ЬдЬ

дас

ааа.

асЬ

сас

768

ТЬг

Ьуз

\7а1

Азр

Ьуз

Уа1

С1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

Низ

245

250

2 55

аса

Ьдс

сса

ссд

Ьдс

сса

дса

ссЬ

даа

сЬс

сЬд

ддд

дда

ссд

Ьса

дЬс

816

ТЬг

Суз

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

С1у

Рго

Зег

Уа1

260

265

27 0

ЬЬс

сЬс

ЬЬс

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асе

сЬс

аЬд

аЬс

Ьсс

едд

асе

864

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

11е

Зег

Агд

ТЬг

275

280

285

ссЬ

дад

дЬс

аса

Ьдс

дЬд

дас

дЬд

аде

сас

даа

дас

ссЬ

дад

912

Рго

С1и

\7а1

ТЬг

Суз

\7а1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Юз

С1и

Азр

Рго

С1и

290

295

300

дЬс

аад

ЬЬс

аас

Ьдд

Ьас

дЬд

дас

ддс

дЬд

дад

дЬд

саЬ

ааЬ

дсс

аад

960

\/а1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1 у

Уа1

С1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

305

310

315

320

аса

аад

ссд

едд

дад

сад

Ьас

аас

аде

асд

Ьас

едд

д1д

дЬс

аде

1008

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

61и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Зег

- 19 017265

325

330

335

дЬс

сСс

асе

дСс

сСд

сас

сад

дас

Сдд

сЬд

ааЬ

ддс

аад

дад

Ьас

аад

1056

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Низ

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

<31у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

340

345

350

Оде

аад

дСс

Ссс

аас

ааа

дсс

сСс

сса

дсс

ссс

аЬс

дад

ааа

асе

аЬс

1104

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Не

С1и

Ьуз

ТЬг

Не

355

360

365

Ссс

ааа

дсс

ааа

ддд

сад

ссс

еда

даа

сса

сад

дСд

Ьас

асе

сЬд

ссс

1152

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

<31у

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

370

375

380

сса

Ссс

сдд

дад

аСд

асе

аад

аас

сад

дЬс

аде

сЬд

асе

Сдс

сЬд

1200

Рго

Зег

Агд

С1и

МеС

ТЬг

Ьуз

Азп

<31п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

385

390

395

400

дЬс

ааа

ддс

ССс

СаС

ссс

аде

дас

аСс

дсс

дЬд

дад

Ьдд

дад

аде

ааЬ

1248

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

<31 и

Зег

Азп

405

410

415

ддд

сад

ссд

дад

аас

Сас

аад

асе

асд

ссЬ

ссс

дСд

сЬд

дас

Ссс

1296

01 у

С1п

Рго

С1и

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

420

425

4 30

дас

ддс

Ссс

СЬс

ССс

сСс

Сас

аде

аад

сСс

асе

дСд

дас

аад

аде

адд

1344

Азр

С1у

Зег

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

435

440

445

Сдд

сад

ддд

аас

дСс

ССс

Сса

Ьдс

Ьсс

дСд

аЬд

саЬ

дад

дсЬ

сЬд

1392

Тгр

<31п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Н13

<31и

А1а

Ьеи

450

455

460

сас

аас

сас

Сас

асд

сад

аад

аде

сСс

Ьсс

сЬд

СсЬ

ссд

ддЬ

ааа

Ьда

1440

Н1з

Азп

Низ

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

<31у

Ьуз

465 470 475 <210> 4 <211> 479 <212> РКТ <21-3> Ното зарьепз <400> 4

МеЬ 1

С1у

Тгр

Зег

Суз 5

Не

Ьеи

РЬе

Ьеи 10

Уа1

А1а

ТЬг

А1а

ТЬг 15

С1у

Уа1

Низ

Зег

С1и

\7а1

<31п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

20

25

30

Рго

(Ну

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

<31у

<31 у

ТЬг

РЬе

35

40

45

Зег

Туг

А1 а

Не

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

<31п

С1у

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

МеЬ

С1у

Не

Рго

Не

РЬе

С1у

ТЬг

А1а

Азп

Туг

А1а

65

70

75

80

С1п

Ьуз

РЬе

С1п

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

А1а

Азр

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

85

90

95

ТЬг

А1а

Туг

МеС

С1и

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Зег

<31и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

- 20 017265

100 105 110

Туг

Суз 115

АЬа

Агд

АЬа

Рго

Ьеи 12 0

Агд

РЬе

Ьеи

СЬи

Тгр 125

Зег

ТЬг

СЬп

Азр

НЬз

Туг

Мер

Азр

УаЬ

Тгр

СЬу

Ьуз

СЬу

ТЬг

130

135

140

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

АЬа

Зег

ТЬг

Ьуз

СЬу

Рго

Зег

УаЬ

РЬе

Рго

Ьеи

145

150

155

160

АЬа

Рго

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

Зег

СЬу

СЬу-

ТЬг

АЬа

Ьеи

СЬу

Суз

165

170

175

Ьеи

УаЬ

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

СЬи

Рго

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

Тгр

Азп

Зег

.180

185

190

СЬу

АЬа

Ьеи

ТЬг

Зег

СЬу

УаЬ

НЬз

ТЬг

РЬе

Рго

АЬа

УаЬ

Ьеи

СЬп

Зег

195

200

205

Зег

СЬу

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Рго

Зег

210

215

220

Ьеи

СЬу

ТЬг

СЬп

ТЬг

Туг

Ые

Суз

Азп

УаЬ

Азп

НЬз

Ьуз

Рго

Зег

Азп

225

230

235

240

ТЬг

Ьуз

УаЬ

Азр

Ьуз

УаЬ

СЬи

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТЬг

НЬз

245

250

255

ТЬг

Суз

Рго

Суз

Рго

АЬа

Рго

СЬи

Ьеи

СЬу

Рго

Зег

УаЬ

260

265

270

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Мер

Ые

Зег

Агд

ТЬг

275

280

285

Рго

СЬи

УаЬ

ТЬг

Суз

УаЬ

Азр

УаЬ

Зег

НЬз

СЬи

Азр

Рго

СЬи

290

295

300

УаЬ

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

УаЬ

Азр

СЬу

УаЬ

СЬи

УаЬ

НЬз

Азп

АЬа

Ьуз

305

310

315

320

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

СЬи

СЬп

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

УаЬ

Зег

325

330

335

УаЬ

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Ьеи

НЬз

СЬп

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

СЬу

Ьуз

СЬи

Туг

Ьуз

340

345

350

Суз

Ьуз

УаЬ

Зег

Азп

Ьуз

АЬа

Ьеи

Рго

АЬа

Рго

Ые

СЬи

Ьуз

ТЬг

Ые

355

360

365

Зег

Ьуз

АЬа

Ьуз

СЬу

СЬп

Рго

Агд

СЬи

Рго

СЬп

УаЬ

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

370

375

380

Рго

Зег

Агд

СЬи

Мер

ТЬг

Ьуз

Азп

СЬп

УаЬ

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

385

390

395

400

УаЬ

Ьуз

СЬу

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Ые

АЬа

УаЬ

СЬи

Тгр

СЬи

Зег

Азп

405

410

415

СЬу

СЬп

Рго

СЬи

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

420

425

430

Азр

СЬу

Зег

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Азр

Ьуз

Зег

Агд

435

440

445

- 21 017265

Тгр

01η 4 50

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе 455

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ 460

ΗΪ3

С1и

А1а Ьеи

Η13 465

Азп

Ηί3

Туг

ТЬг

С1п 470

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи 475

Зег

Рго

С1у

Ьуз

<210> 5 <211> 327 <212> ДНК <213> Ното зараепз <220>

<221> СЬЗ <222> (1)..(327)

<400> 5	асЬ ТЬг 5	сад С1п	дас Азр	ССЬ Рго	дсЬ А1а
ОСЬ Зег 1	ОСЬ Зег	дад С1и	сЬд Ьеи
аса	дЬс	адд	аЬс	аса	Ьдс	саа	дда	дас
ТЬг	Уа1	Агд	Не 20	ТЬг	Суз	С1п	С1у	Азр 25
аде	Одд	Рас	сад	сад	аад	сса	дда	сад
Зег	Тгр	Туг 35	С1п	С1п	Ьуз	Рго	С1у 40	С1п
ддЬ	ааа	аас	аас	сдд	ссс	Ьса	ддд	аЬс
С1у	Ьуз 50	Азп	Азп	Агд	Рго	Зег 55	С1у	Не
аде	Оса	дда	аас	аса	дсЬ	Ьсс	ЬЬд	асе
Зег 65	Зег	С1у	Азп	ТЬг	А1а 70	Зег	Ьеи	ТЬг
дар	дад	дсЬ	дас	ЬаЬ	Ьас	ЬдЬ	аас	Ьсс
Азр	С1и	А1а	Азр	Туг 85	Туг	Суз	Азп	Зег
сЬд	аЬа	т	ддс	ддс	ддд	асе	аад	сЬд
Ьеи	Не	РЬе	С1у 100	С1у	С1у	ТЬг	Ьуз	Ьеи 105

дЬд Уа1 10	ЬсЬ Зег	дЬд \7а1	дсс А1а	ЬЬд Ьеи	дда С1у 15	сад С1п	48
аде	сЬс	ада	аде	ЬаЬ	ЬаЬ	дса	96
Зег	Ьеи	Агд	Зег	Туг 30	Туг	А1а
дсс	ссЬ	дЬа	сЬЬ	дЬс	аЬс	ЬаЬ	144
А1 а	Рго	Уа1	Ьеи 45	Уа1	Не	Туг
сса	дас	еда	ЬЬс	ЬсЬ	ддс	Ьсс	192
Рго	Азр	Агд 60	РЬе	Зег	С1у	Зег
аЬс	асЬ	ддд	дсЬ	сад	дед	даа	240
Не	ТЬг 75	<31у	А1а	С1п	А1а	С1и 80
сдд	дас	аас	адЬ	даЬ	аас	сдЬ	288
Агд 90 асе ТЬг	Азр дЬс Уа1	Азп сЬс Ьеи	Зег адЬ Зег	Азр	Азп 95	Агд	327

<210> 6 <211> 109 <212> ΡΚΤ <213> Ното зар!епз

<400> 6

Азр

Рго

А1а

Уа1 ' 10

Зег

Уа1

А.1а

Ьеи

С1у 15

С1п

Зег 1

Зег

С1и

Ьеи

ТЬг 5

С1п

ТЬг

\7а1

Агд

Не 20

ТЬг

Суз

С1п

С1у

Азр 25

Зег

Ьеи

Агд

Зег

Туг 30

Туг

А1а

Зег

Тгр

Туг 35

С1п

Ьуз

Рго

С1у 40

С1п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи 45

Уа1

Не

Туг

С1у

Ьуз

Азп

Агд

Рго

Зег

С1у

Не

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

55 60

- 22 017265

Зег 65

Зег

С1у

Азп

ТЬг

А1а ’ 70

Зег

Ье-и

ТЬг

Не

ТЬг 75

<31 у

А1а

С1п

А1а

С1и 80

Азр

С1и

А1а

Азр

Туг

Суз

Азп

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Азр

Азп

Агд

85

90

95

Деи

Не

РЬе

С1у

ТЬг

Дуз

Деи

ТЬг

Уа1

Деи

Зег

100 105 <210> 7 <211> 702 <212> ДНК <213> Ното зариепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(699) <400> 7

аЬд МеЬ 1

дда С1у

Ддд Тгр

Дса Зег

ДдД Суз 5

аЬс Не

сЬЬ Ьеи

ЬДЬ РЬе

сЬа Ьеи 10

дЬа Уа1

дса А1а

асЬ ТЬг

дса А1а

асЬ ТЬг 15

дда С1у

48

дЬа

саД

Дса

ДсД

ЬсЬ

дад

сЬд

ас!

сад

дас

ссЬ

дсЬ

дЬд

ЬсЬ

дЬд

дсс

96

\7а1

Н13

Зег

С1и

Ьеи

ТЬг

С1п

Азр

Рго

А1а

\/а1

Зег

Уа1

А1 а

20

25

30

ДЬд

дда

сад

аса

дЬс

адд

аЬс

аса

Ьдс

саа

дда

дас

аде

сЬс

ада

аде

144

Деи

С1у

С1п

ТЬг

Уа1

Агд

Не

ТЬг

Суз

С1п

<31у

Азр

Зег

Ьеи

Агд

Зег

35

40

45

ДаД

дса

аде

Ьдд

Ьас

сад

аад

сса

дда

сад

дсс

ссЬ

дЬа

сЬЬ

192

Туг

А1а

Зег

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

С1у

<31п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

50

55

60

дДс

аДс

ДаД

ддД

ааа

аас

едд

ссс

Ьса

ддд

аЬс

сса

дас

еда

ЬЬс

240

Уа1

11е

= .7 7-

ст ,,

Т ,70

Азп

Δ ГГ1

Рг о

З^х

СТ ,7

11о

Рго

а с·..

а ντ.

РЬе

хул.

чхх у

хху О

‘ и

ххху

¹ и

65

70

75

80

ДсД

ддс

Дсс

аде

Ьса

дда

аас

аса

дсЬ

Ьсс

ДЬд

асе

аЬс

асЬ

ддд

дсЬ

288

Зег

С1у

Зег

С1у

Азп

ТЬг

А1а

Зег

Ьеи

ТЬг

Не

ТЬг

С1у

А1а

85

90

95

сад

дед

даа

да Д

дад

дсЬ

дас

ЬаЬ

Ьас

ЬдЬ

аас

Ьсс

едд

дас

аас

адЬ

336

С1п

А1а

С1и

Азр

С1и

А1а

Азр

Туг

Суз

Азп

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

100

105

но

даД

аас

сдД

сДд

аЬа

ЬДЬ

ддс

ддд

асе

аад

сЬд

асе

дЬс

сЬс

адЬ

384

Азр

Азп

Агд

Ьеи

Не

РЬе

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Зег

115

120

125

сад

ссс

аад

дсЬ

дсс

ссс

Ьсд

дЬс

ас!

сЬд

ЬЬс

ссд

ссс

Ьсс

ЬсЬ

дад

432

С1п

Рго

Дуз

А1а

Рго

Зег

Уа1

ТЬг

Ьеи

РЬе

Рго

Зег

С1и

130

135

140

дад

сП

саа

дсс

аас

аад

дсс

аса

сЬд

дЬд

ЬдЬ

сЬс

аЬа

адЬ

дас

ЬЬс

480

С1и

Деи

С1п

А1а

Азп

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

νβΐ

Суз

Ьеи

Не

Зег

Азр

РЬе

145

150

155

1 60

Дас

ссд

дда

дсс

дЬд

аса

дЬд

дсс

Ьдд

аад

дса

даЬ

аде

ссс

дЬс

528

Туг

Рго

С1у

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

А1а

Тгр

Ьуз

А1а

Азр

Зег

Рго

Уа1

165

170

175

- 23 017265

аад Ьуз

дед АЬа

дда СЬу

дЬд УаЬ 180

дад СЬи

асе ТЬг

аса ТЬг

ссс Рго 185

Ьсс Зег

ааа Ьуз

саа СЬп

аде Зег

аас Азп 190

аас Азп

аад Ьуз

Ьас

дед

дсс

аде

ЬаЬ

сЬд

аде

сЬд

асд

ссЬ

дад

сад

Ьдд

аад

Ьсс

Туг

АЬа

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Рго

СЬи

СЬп

Тгр

Ьуз

Зег

195

200

205

сас

ада

аде

Ьас

аде

Ьдс

сад

дЬс

асд

саЬ

даа

ддд

аде

асе

дЬд

дад

НЬз

Агд

Зег

Туг

Зег

Суз

С1п

УаЬ

ТЬг

НЬз

СЬи

СЬу

Зег

Ткг

УаЬ

СЬи

210

215

220

аад

аса

дЬд

дсс

ссЬ

дса

даа

Ьдс

ЬсЬ

Ьда

Ьуз

ТЬг

Уа1

А1а

Рго

АЬа

СЬи

Суз

Зег

225 230 <210> 8 <211> 233 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз

<400> 8

Ьеи

РЬе

Ьеи 10

УаЬ

АЬа

ТЬг

А1а

ТЬг 15

СЬу

МеЬ 1

С1у

Тгр

Зег

Суз 5

Не

Уа1

НЬз

Зег

СЬи

Ьеи

ТЬг

СЬп

Азр

Рго

АЬа

УаЬ

Зег

УаЬ

АЬа

20

25

30

Ьеи

С1у

СЬп

ТЬг

УаЬ

Агд

Не

ТЬг

Суз

СЬп

СЬу

Азр

Зег

Ьеи

Агд

Зег

35

40

45

Туг

А1а

Зег

Тгр

Туг

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

АЬа

Рго

УаЬ

Ьеи

50

55

60

УаЬ

Не

Туг

СЬу

Ьуз

Азп

Агд

Рго

Зег

СЬу

1Ье

Рго

Азр

Агд

РЬе

65

70

75

80

Зег

СЬу

Зег

С1у

Азп

ТЬг

АЬа

Зег

Ьеи

ТЬг

Не

'ГЬг

СЬу

АЬа

85

90

95

С1п

АЬа

С1и

Азр

С1и

А1а

Азр

Туг

Суз

Азп

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

100

105

110

Азр

Азп

Агд

Ьеи

Не

РЬе

С1у

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Ьеи

Зег

115

120

125

С1п

Рго

Ьуз

АЬа

А1а

Рго

Зег

УаЬ

ТЬг

Ьеи

РЬе

Рго

Зег

СЬи

130

135

140

С1и

СЬп

А1 а

_л

_т

А¹ а

т

Уа1

Г-т ,г-

т

11 е

пн

Ьуз

о

лЗр

г и с

145

150

155

160

Туг

Рго

СЬу

АЬа

УаЬ

ТЬг

УаЬ

А1а

Тгр

Ьуз

АЬа

Азр

Зег

Рго

УаЬ

165

170

175

Ьуз

АЬа

СЬу

УаЬ

СЬи

ТЬг

Рго

Зег

Ьуз

С1п

Зег

Азп

Ьуз

180

185

190

Туг

А1а

АЬа

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Рго

СЬи

СЬп

Тгр

Ьуз

Зег

195

200

205

НЬз

Агд

Зег

Туг

Зег

Суз

СЬп

УаЬ

ТЬг

НЬз

С1и

СЬу

Зег

ТЬг

УаЬ

СЬи

- 24 017265

210 215 220

Ьуз ТЬг УаЬ АЬа Рго А1а С1и Суз Зег

225 230 <210> 9 <211> 327 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <220>

<221> СЭЗ <222> (1) . . (327) <400> 9

Ь сЬ Зег 1

ЬсЬ Зег

дад СЬи

сЬд Ьеи

асЬ ТНг 5

сад СЬп

дас Азр

ссН Рго

дсЬ АЬа

дЕд УаЬ 10

ЬсЬ Зег

дЕд УаЬ

дсс АЬа

ЕЕд Ьеи

дда СЬу 15

сад СЬп

48

аса

дЬс

адд

аЬс

аса

Идс

саа

дда

дас

аде

сЬс

ада

аде

ЬаЬ

дса

96

ТНг

УаЬ

Агд

Не

ТНг

Суз

С1п

СЬу

Азр

Зег

Ьеи

Агд

Зег

Туг

АЬа

20

25

30

асе

Едд

Нас

сад

аад

сса

дда

сад

дсс

ссЪ

аЫ

сЬЬ

дЬс

аЬс

Нар

144

ТНг

Тгр

Туг

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

АЬа

Рго

Не

Ьеи

Уа 1

Не

Туг

35

40

45

ддЬ

даа

ааЬ

аад

едд

ссс

Оса

ддд

аЬс

сса

дас

еда

Ш

ЬсЬ

ддс

Осс

192

СЬу

СЬи

Азп

Ьуз

Агд

Рго

Зег

СЬу

Не

Рго

Азр

Агд

РНе

Зег

СЬу

Зег

50

55

60

аде

Пса

дда

аас

аса

дсЬ

Ссс

ЬЬд

асе

аНс

асЬ

ддд

дер

сад

дса

даа

240

Зег

СЬу

Азп

ТНг

АЬа

Зег

Ьеи

ТНг

Не

ТНг

СЬу

АЬ а

СЬп

АЬа

СЬи

65

70

75

80

даН

дад

дсЬ

дас

Нас

ЬаЬ

ЬдЬ

ааа

ЬсЬ

едд

даН

ддс

адН

ддЕ

саа

саЬ

288

Азр

СЬи

А1а

Азр

Туг

Суз

Ьуз

Зег

Агд

Азр

СЬу

Зег

СЬу

СЬп

НЬз

85

90

95

сЬд

дрд

ЬЬс

ддс

дда

ддд

асе

аад

сЬд

асе

дЬс

сЬа

ддЕ

327

Ьеи

УаЬ

РНе

СЬу

ТНг

Ьуз

Ьеи

ТНг

УаЬ

Ьеи

СЬу

100 105 <210> 10 <2 11 > 109 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 10

Зег 1

Зег

СЬи

Ьеи

ТНг 5

СЬп

Азр

Рго

АЬа

УаЬ 10

Зег

УаЬ

АЬа

Ьеи

СЬу 15

СЬп

ТНг

УаЬ

Агд

ЬЬе 20

ТНг

Суз

СЬп

СЬу

Азр 25

Зег

Ьеи

Агд

Зег

'Туг 30

Туг

АЬа

ТНг

Тгр

Туг 35

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу 40

СЬп

АЬа

Рго

ЬЬе

Ьеи 45

УаЬ

ЬЬе

Туг

СЬу

СЬи 50

Азп

Ьуз

Агд

Рго

Зег 55

СЬу

ЬЬе

Рго

Азр

Агд 60

РНе

Зег

СЬу

Зег

СЬу

Азп

ТНг

АЬа

Зег

Ьеи

ТНг

ЬЬе

ТНг

СЬу

АЬа

СЬп

АЬа

СЬи

- 25 017265

65

70

75

80

Азр

СЬи

А1а

Азр

Туг

Суз

Ьуз

Зег

Агд

Азр

СЬу

Зег СЬу

СЬп

НЬз

85

90

95

Ьеи

УаЬ

РЬе

С1у

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Ьеи

СЬу

100 105 <210> 11 <2Ы> 702 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <220>

<221> СОЗ <222> (1) . . (699) <400> 11

аЬд МеЬ 1

дда СЬу

Ьдд Тгр

Ьса Зег

ЬдЬ Суз 5

аЬс Не

аЬс 11е

сЬЬ Ьеи

ЬЬЬ РЬе

сЬа Ьеи 10

дЬа УаЬ

дса АЬа

асЬ ТЬг

дса АЬа

асЬ ТЬг 15

дда СЬу

48

дЬа

саЬ

Ьса

ЬсЬ

дад

сЬд

асЬ

сад

дас

ссЬ

дсЬ

дЬд

ЬсЬ

дЬд-

дсс

96

УаЬ

НЬз

Зег

СЬи

Ьеи

ТЬг

СЬп

Азр

Рго

АЬа

УаЬ

Зег

УаЬ

АЬа

20

25

30

Уд

дда

сад

аса

дЬс

адд

аЬс

аса

Ьдс

саа

дда

дас

аде

сЬс

ада

аде

144

Ьеи

СЬу

СЬп

ТЬг

УаЬ

Агд

11е

ТЬг

Суз

СЬп

СЬу

Азр

Зег

Ьеи

Агд

Зег

35

40

45

ЬаЬ

дса

асе

Ьдд

Ьас

сад

аад

сса

дда

сад

дсс

ссЬ

аЬЬ

сЬЬ

192

Туг

А1а

ТЬг

Тгр

Туг

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

АЬа

Рго

Не

Ьеи

50

55

60

дЬс

аЬс

ЬаЬ

ддЬ

даа

ааЬ

аад

едд

ссс

Ьса

ддд

аЬс

сса

дас

еда

ЬЬс

240

УаЬ

Не

Туг

СЬу

СЬи

Азп

Ьуз

Агд

Рго

Зег

СЬу

Не

Рго

Азр

Агд

РЬе

65

' 70

75

80

ЬсЬ

ддс

Ьсс

аде

Ьса

дда

аас

аса

дсЬ

Ьсс

ЬЬд

асе

аЬс

асЬ

ддд

дсЬ

288

Зег

СЬу

Зег

СЬу

Азп

ТЬг

АЬа

Зег

Ьеи

ТЬг

Не

'ТЬг

СЬу

АЬа

85

90

95

сад

дса

даа

даЬ

дад

дсЬ

дас

Ьас

ЬаЬ

ЬдЬ

ЙЗЗ

ЬсЬ

едд

даЬ

ддс

адЬ

336

СЬп

АЬа

СЬи

Азр

СЬи

АЬа

Азр

Туг

Суз

Ьуз

Зег

Агд

Азр

С1у

Зег

100

105

110

ддЬ

саа

саЬ

сЬд

дЬд

ЬЬс

ддс

дда

ддд

асе

аад

сЬд

асе

дЬс

сЬа

ддЬ

384

СЬу

СЬп

Н1з

Ьеи

УаЬ

РЬе

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Ьеи

СЬу

115

120

125

сад

ссс

аад

дсЬ

дсс

ссс

Ьсд

дЬс

асЬ

сЬд

ЬЬс

ссд

ссс

Ьсс

ЬсЬ

дад

432

СЬп

Рго

Ьуз

АЬа

А1а

Рго

Зег

УаЬ

ТЬг

Ьеи

РЬе

Рго

Зег

СЬи

130

135

14 0

дад

сЬЬ

саа

дсс

аас

аад

дсс

аса

сЬд

дЬд

ЬдЬ

сЬс

аЬа

адЬ

дас

ЬЬс

480

СЬи

Ьеи

СЬп

А1а

Азп

Ьуз

АЬа

ТЬг

Ьеи

УаЬ

Суз

Ьеи

Не

Зег

Азр

РЬе

145

150

155

160

Ьас

ссд

дда

дсс

дЬд

аса

дЬд

дсс

Ьдд

аад

дса

даЬ

аде

ссс

дЬс

528

Туг

Рго

СЬу

АЬа

УаЬ

ТЬг

УаЬ

АЬа

Тгр

Ьуз

АЬа

Азр

Зег

Рго

УаЬ

165

170

175

аад

дед

дда

дЬд

дад

асе

аса

ссс

Ьсс

ааа

саа

аде

аас

аад

576

- 26 017265

Ьуз

А1а

С1 у

\7а1 180

С1и

ТЬг

ТНг

Рго 185

Зег

Ьуз

<31 η

Зег

Азп 190

Азп

Ьуз

Гас

дед

дсс

аде

ЬаЬ

сЬд

аде

сЬд

асд

ссЬ

дад

сад

Одд

аад

Осс

624

Туг

А1а

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Рго

(Ми

С1п

Тгр

Ьуз

Зег

195

200

205

сас

ада

аде

Гас

аде

Оде

сад

дЬс

асд

саЬ

даа

ддд

аде

асе

дЬд

дад

672

ΗΪ3

Агд

Зег

Туг

Зег

Суз

С1п

\7а1

ТЬг

Ηί3

(Ми

С1у

Зег

ТЬг

Уа1

<Ми

210

215

220

аад

аса

дЬд

дсс

ссЬ

дса

даа

Оде

ЬсЬ

Ода

702

Ьуз

Тпг

\/'а1

А1а

Рго

А1а

С1и

Суз

Зег

225

230

<210> <2 11 > <21'2> <213>

12 233 ' РКТ Ното зар!епз

<400> 12

Не

Ьеи

РЬе

Ьеи 10

Уа1

А1а

ТЬг

А1а

ТЬг 15

(Му

МеЬ -1

(Му

Тгр

Зег

Суз 5

Не

Л/а1

Н13

Зег

СМи

Ьеи

ТЬг

С1п

Азр

Рго

А1а

Уа1

Зег

Уа1

А1а

20

25

30

Ьеи

С1у

С1п

ТЬг

Уа1

Агд

11е

ТЬг

Суз

С1п

<Му

Азр

Зег

Ьеи

Агд

Зег

3 5

4 0

45

Туг

А1а

ТЬг

Тгр

Туг

СМп

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

Не

Ьеи

50

55

60

Уа1

Не

Туг

Му

СМи

Азп

Ьуз

Агд

Рго

Зег

С1у

Не

Рго

Азр

Агд

РЬе

65

70

75

80

Зег

С1у

Зег

С1у

Азп

ТЬг

А1а

Зег

Ьеи

ТЬг

Не

ТЬг

<31 у

А1а

85

90

95

С1п

А1а

(Ми

Азр

С1и

А1а

Азр

Туг

Суз

Ьуз

Зег

Агд

Азр

Му

Зег

100

105

110

(Му

С1п

Н1з

Ьеи

Уа1

РЬе

С1 у

СМу

(Му

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

СМу

115

120

125

<Мп

Рго

Ьуз

А1а

Рго

Зег

\7а1

ТЬг

Ьеи

РЬе

Рго

Зег

Ми

130

135

140

СМи

Ьеи

С1п

А1а

Азп

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

Уа1

Суз

Ьеи

Не’

Зег

Азр

РЬе

145

150

155

160

Туг

Рго

С1у

А1а

\7а1

ТЬг

Уа1

А1а

Тгр

Ьуз

А1а

Азр

Зег

Рго

Уа1

165

170

175

Ьуз

А1а

С1у

Уа1

СМи

ТЬг

Рго

Зег

Ьуз

С1п

Зег

Азп

Ьуз

180

18 5

190

Туг

А1а

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Рго

С1и

С1п

'Тгр

Ьуз

Зег

195

200

205

Н1з

Агд

Зег

Туг

Зег

Суз

С1п

Уа1

ТЬг

Н1з

С1и

С1у

Зег

'ТЬг

\7а1

(Ми

210

215

220

- 27 017265

Ьуз ТЬг Vа1 А1а Рго А1а С1и Суз Зег

225 230 <210> 13 <211> 15 <212> ДНК <213> Ното зараепз <220>

<221> СОЗ <222> (1),.(15) <400> 13 аде ЬаЬ дсЬ аЬс аде

Зег Туг А1а Не Зег ' 5 <210> 14 <211> 5 <212> РЕТ <213> Ното зар1епз <400> 14

Зег Туг А1а 11е Зег

5 <210> 15 <211> 51 <212> ДНК <213> Ното зараепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(51) <400> 15

ддд С1у 1

аЬс 11е

аНс 11е

сер Рго

аЬс 11е 5

ш РЬе

ддр С1у

аса ТНг

дса А1а

аас Азп 10

Оас Туг

дса А1а

сад С1п

аад Ьуз

РЬе РНе 15

сад С1п

48

ддс

51

С1у

<210>	16
<211>	17
<212>	РКТ
<213>	Ното	заргепз
<400>	16
С1у 11е Не	Рго 11е	РНе С1у ТНг А1а Азп Туг А1а С1п Ьуз	РНе С1п
1		5	10 '	15

С1у <210> 17 <211> 63 <212> ДНК <213> Ното зархепз

- 28 017265 <220> .

<221> СОЗ <222> (1)..(63) <400> 17

дед

сса

Ш

еда

т

ЬЬд

дад

Одд

Рсс

асе

саа дас сас

Рас

48

АЬа

Рго

Ьеи

Агд

РЬе

Ьеи

СЬи

Тгр

Зег

ТЬг

С1п Азр ΗΪ3

Туг

1

5

10

15

Рас

аЬд

дас

дрс

63

Туг

Мер

Азр

УаЬ

20

<210> 18 <211> 21 ' <212> РВТ <213> Ното зарЬепз <400> 18

АЬа Рго Ьеи Агд РЬе Ьеи СЬи Тгр Зег ТЬг СЬп Азр НЬз Туг Туг Туг 1 δ 10 15

Туг Туг МеЬ Азр УаЬ

0 <210> 19 <211> 33 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(33) <400> 19

саа	дда	дас	аде	сРс	ада	адс	РаР	РаР	дса	адс	33
СЬп	СЬу	Азр	Зег	Ьеи	Агд	Зег	Туг	Туг	АЬа	Зег
1				5					ю'

<210>	20
<211>	11
<212>	РВТ
<213>	Ното зарЬепз
<400>	20
СЬп СЬу Азр Зег Ьеи Агд	Зег Туг Туг АЬа Зег
1	5	10

<210>	21 ~
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Ното зарЬепз
<220>
<221>	СОЗ
<222>	(1)-.(21)
<400>	21
ддр ааа аас аас едд	ссс Оса	21
СЬу Ьуз Азп Азп Агд	Рго Зег

- 29 017265

1	5
<210>	22
<211>	7
<212>	РКТ
<213>	Ното зарЬепз
<400>	22 ,
С1у Ьуз Азп Азп Агд	Рго	Зег
1	5
<210>	23
<211 >	33
<212>	ДНК
<213>	Ното зараепз
<220>
<221>	СЬЗ
<222>	(1)..(33)
<400>	23
аас Ьсс едд дас аас	адЬ	даН	аас	сдЬ	сЬд	аЬа
Азп Зег Агд Азр Азп	Зег	Азр	Азп	Агд	Ьеи	Не
1	5					10
<210>	24
<211 >	11
<212>	РКТ
<213>	Ното зарпепз
<400>	24
Азп Зег Агд Азр Азп	Зег	Азр	Азп	Агд	Ьеи	11е
1	5					10
<210>	25
<211 >	33
<212>	ДНК
<21 3>	Ното зараепз
<2 2 0>
<221>	СДЗ
<222>	(1)..(33)
<400>	25
саа дда дас аде сЬс	ада	аде	ЬаЬ	ЬаЬ	дса	асе
С1п С1у Азр Зег Ьеи	Агд	Зег	Туг	Туг	А1а	ТНг
1	5					10
<210 >	2 6

<211 >	11
<212>	РКТ
<213>	Ното зарЬепз
<400>	2 6
С1п С1у Азр 5ег Ьеи	Агд	Зег	Туг	Туг	А1а	ТЬг
1	5					10

<210> 27

- 30 017265 <211> 21 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(21) <400> 27 ддЕ даа ааЕ аад едд ссс Еса

С1у С1и Азп Ьуз Агд Рго Зег

5 <210> 28 <211> 7 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 28

С1у С1и Азп Ьуз Агд Рго Зег <210> 29 ', <211> 33 <212> ДНК' <213> Ното заргепз <220>

<221> СОЗ <222> (1) .. (33) <400> 29 ааа ЕсЕ едд да! ддс адС ддЕ саа саЕ сЕд дЕд

Ьуз Зег Агд Азр С1у Зег С1у С1п Нгз Ьей Да1

5 10 <210> 30 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 30

Ьуз Зег Агд Азр С1у Зег С1у С1п Нгз Ьей Уа1

5 10 <210> 31 <211> 24 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>

<221> СОЗ <222> (1) . . (24) <400> 31 аде адЕ ддЕ даЕ рас Рас Едд адЕ

Зег Зег С1у Азр Туг Туг Тгр Зег .5

- 31 017265 <210> 32 <211> 8 <212> ΡΚΤ <213> Ното зарьепз

<400>	32
Зег Зег С1у	Азр Туг	Туг	Тгр	Зег
1		5
<210>	33
<2 11 >	48
<212>	ДНК
<2 13>	Ното	зархепз
<220>
<221>	СЭЗ
<222>	(1) · .	(48)
<400>	33
Ьас аЬс ЬаЬ	Ьас адЬ	ддд	аде	асе	дас
Туг 11е Туг	Туг Зег	С1у	Зег	ТЬг	Азр
1		5
<210>	34
<211>	16
<2 12>	РКТ
<213>	Ното	зарьепз
<400>	34
Туг 11е Туг	Туг Зег	С1у	Зег	ТЬг	Азр
1		5
<210>	35
<211>	3 3
<212>	ДНК
<213>	Ното	зарьепз
<220>
<221>	СЭЗ
<222>	(1) · .	(33)
<4 00>	35
дЬд Ьсд аЬЬ	ЬЬЬ дда	дЬд	ддд	аса	ЬЬЬ
Уа1 Зег 11е	РЬе С1у	Уа1	С1у	ТЬг	РЬе
1		5
<2 10>	36 .
<2 11 >	11
<212>	РКТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	36
Уа1 Зег 11е	РЬе СТу	Уа1	С1у	ТЬг	РЬе
1		5

Рас аас ссд Ьсс сЬс аад адЬ 48

Туг Азп Рго Зег Ьеи Ьуз Зег

15

Туг Азп Рго Зег Ьеи Ьуз Зег

15

дас	Ьас	33
Азр	Туг
10

Азр Туг <210> 37 <211> 363 <212> ДНК <213> Ното зар!епз

- 32 017265 <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(363) <400> 37

сад

дЕд

сад

сед

сад

дад

Ьсд

ддс

сса

дда

сед

дЕд

аад

ссе

еса

сад

4

8

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

\7а1

Ьуз

Рго

Зег

С1п

1

5

10

15

асе

сед

Осс

сес

асе

еде

асе

дес

есе

ддЕ

ддс

есс

аЬс

аде

ддЕ

9

6

.ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

\7а1

Зег

С1у

Зег

Не

Зег

С1у

20

25

30

дае

бас

Рас

Едд

адр

Едд

аес

еде

сад

ссс

сса

ддд

аад'

ддс

сед

дад

1

44

Азр

Туг

Тгр

Зег

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1 и

35

40

45

Едд

аее

ддд

Рас

аес

еае

еас

аде

ддд

аде

асе

дас

еас

аас

ссд

есс

1

92

Тгр

Не

С1у

Туг

Не

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

сес

аад

аде

еда

дес

асе

аед

есс

де а

дас

асд

есс

аад

аае

сад

еее

2

40

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

Мее

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

РЬе

65

70

75

80

Осс

сед

аад

дес

аас

есе

дЕд

асе

дсс

дса

дас

асд

дсе

дЕд

еае

еас

2

88

Зег

Ьеи

Ьуз

Уа1

Азп

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

85

90

95

еде

дед

ада

дЕд

бед

аее

еее

дда

дЕд

ддд

аса

еее

дас

Ьас

Едд

ддс

3

36

Суз

А1а

Агд

Уа1

Зег

11е

РЬе

С1у

νθΐ

С1у

ТЬг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

100

105

но

сад

ддс

асе

сед

дес

асе

дЬс

еса

аде

3

63

С1п

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

\7а1

Зег

115 120

<2 10> <2 11> <212> <2 1 3>

3 8 121 РКТ Ното зар.1епз

<400> 38.

С1п Уа1 С1п Ьеи С1п С1и Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго ЗегС1п ’ 5 ' 1015

ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз ТЬг Уа1 Зег С1у С1у Зег 11е Зег ЗегС1у

2530

Азр Туг Туг Тгр Зег Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и

4045

Тгр 11е С1у Туг 11е Туг Туг Зег С1у Зег ТЬг Азр Туг Азп Рго Зег 50 5560

Ьеи Ьуз Зег Агд Уа1 ТЬг Мер Зег Уа1 Азр ТЬг Зег Ьуз Азп С1п РЬе

70 75 80

Зег Ьеи Ьуз Уа1 Азп Зег Уа1 ТЬг А1а А1а Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг

9095

Суз А1а Агд Уа1 Зег 11е РЬе С1у Уа1 С1у ТЬг РЬе Азр Туг Тгр С1у

- 33 017265

100

120

115

105

Зег

110 <210> 39 <211> 30 <212> ДНК <213> Ното зараепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(30) <400> 39 адд дсс адО сад адО дОО аде аде Оас 00а

Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг Ьеи

510 <210> 40 <211> 10 <212> РКТ· <213> Ното заргепз <400> 40

Агд А1а Зег С1п Зег \7а1 Зег Зег Туг Ьеи 1510 <210> 41 <211> 21 <212> ДНК <213> Ното зараепз <220>

<221> СЭЗ <2 2 2 > (1) (21) <400> 41 дар дса Осс аас адд дсс асО Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг

5 <210> 42 <211> 7 <212> РКТ <213> Ното зараепз <400> 42

Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг

5

<2 10>	43
<2 11>	24
<212>	ДНК
<213>	Ното	зар1епз
<220>
<221>	СЭЗ
<222>	(1) ·	(24)

<400> 43 ' сас сад ЕаЕ ддЕ аде аса ссЕ сЕс 24

Нгз СТп Туг СТу Зег ТЬг Рго Ьей .

<210> 44 ,<211> 8 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 44

Нгз СТп Туг СТу Зег ТЬг Рго Ьей

5 <210> 45 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)-,.(321) <400> 45

даа С1и 1

аЕЕ 11е

дЕд Да 4

аЕд МеЕ

аса ТЬг 5

сад СТп

ЕсЕ Зег

сса Рго

дсс АТа

асе ТЬг ТО

сЕд Ьей

ЕсЕ Зег

ЕЕд Ьей

ЕсЕ Зег

сса Рго 45

ддд СТу

48

даа

ада

дсс

асе

сЕс

Есс

Еде

адд

дсс

адЕ

сад

адЕ

дЕЕ

аде

Еас

96

С1и

Агд

АТа

ТЬг

Ьей

Зег

Суз

Агд

АТа

Зег

СТп

Зег

ДаТ

Зег

Туг

20

25

30

ЕЕа

дсс

Едд

Еас

саа

сад

ааа

ссЕ

ддс

сад

дсЕ

ссс

адд

сЕс

аЕс

Т44

Ьей

А1а

Тгр

Туг

СТп

Ьуз

Рго

СТу

СТп

АТа

Рго

Агд

Ьей

Не

35

40

45

ЕаЕ

даЕ

дса

Есс

аас

адд

дсс

асЕ

ддс

аЕс

сса

дСс

адд

ЕЕс

адЕ

ддс

192

Туг

Азр

АТа

Зег

Азп

Агд

АТа

ТЬг

СТу

Не

Рго

АТа

Агд

РЬе

Зег

СТу

50

55

60

адЕ

ддд

ЕсЕ

ддд

аса

дас

ЕЕс

асЕ

сЕс

асе

аЕс

аде

сЕа

дад

ссЕ

240

Зег

СТу

Зег

СТу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьей

ТЬг

1Те

Зег

Ьей

СТи

Рго

65

70

75

80

даа

даЕ

ЕЕЕ

дса

дЕд

ЕаЕ

Еас

ЕдЕ

сас

сад

ЕаЕ

дд7

аде

аса

ссЕ

сЕс

288

С1и

Азр

РЬе

АТа

ДаТ

Туг

Суз

Нгз

СТп

Туг

СТу

Зег

ТЬг

Рго

Ьей

85

90

95

асЕ

ЕЕс

ддс

дда

ддд

асе

аад

дед

дад

аЕс

ааа

321

ТЬг

РЬе

СТу

ТЬг

Ьуз

АТа

СТи

Не

Ьуз

100 105 <210> 46 <211> 107 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 46 .

С1и Не \7а1 МеЕ ТЬг С1п Зег Рго АТа ТЬг Ьей Зег Деи Зег Рго С1у

5 10 15

С1и

Агд

АЬа

ТЬг 20

Ьеи

Зег

Суз

Агд

АЬа 25

Зег

СЬп

Зег

УаЬ

Зег 30

Зег

Туг

Ьеи

АЬа

Тгр

Туг

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

АЬа

Рго

Агд

Ьеи

Ые

35

40

45

Туг

Азр

АЬа

Зег

Азп

Агд

АЬа

ТЬг

СЬу

Ые

Рго

АЬа

Агд

РЬе

Зег

СЬу

50

55

60

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ые

Зег

Ьеи

СЬи

Рго

65

7 0

75

80

СЬи

Азр

РЬе

АЬа

УаЬ

Туг

Суз

НЬз

СЬп

Туг

СЬу

Зег

ТЬг

Рго

Ьеи

85

90

95

Ткг

РЬе

СЬу

ТЬг

Ьуз

АЬа

СЬи

Ые

Ьуз

100 105

<210>	47
<2 Ы >	357
<212>	ДНК
<2 13>	Миз	тизсиЬиз
<220>
<221>	СОЗ
<222>	(1) .	..(357)
<400>	47

сад СЬп 1

дрд УаЬ

сад СЬп

сРд Ьеи

аад Ьуз 5

сад СЬп

Сса Зег

дда СЬу

ссР Рго

ддс СЬу 10

сСа Ьеи

дрд УаЬ

сад СЬп

ссс Рго

Сса Зег 15

сад СЬп

48

адс

сРд

Ссс

аСс

асе

Сдс

аса

дрс

СсР

ддр

РСс

Сса

ССа

асР

аас

СаС

96

Зег

Ьеи

Зег

Ые

ТЬг

Суз

ТЬг

УаЬ

Зег

СЬу

РЬе

Зег

Ьеи

ТЬг

Азп

Туг

20

25

30

ддр

дРа

сас

Ьдд

дСС

сдс

сад

РсР

сса

дда

аад

ддр

сЬд

дад

Сдд

сРд

144

СЬу

УаЬ

НЬз

Тгр

УаЬ

Агд

СЬп

Зег

Рго

СЬу

Ьуз

СЬу

Ьеи

СЬи

Тгр

Ьеи

35

40

45

дда

дрд

аСа

Ьдд

адР

ддр

дда

аас

аса

дас

РаР

ааС

аса

ссР

СРс

аса

192

СЬу

УаЬ

Ые

Тгр

Зег

СЬу

Азп

ТЬг

Азр

Туг

Азп

ТЬг

Рго

РЬе

ТЬг .

50

55

60

Рсс

ада

сРд

адс

аСс

аас

аад

дас

ааС

Ссс

аад

адс

саа

др С

СРс

ССР

240

Зег

Агд

Ьеи

Зег

Ые

Азп

Ьуз

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Зег

СЬп

УаЬ

РЬе

65

70

75

80

ааа

аРд

аас

адр

сРд

саа

СсС

аар

дас

аса

дсс

ара

Сар

Рас

СдС

дсс

288

Ьуз

Мер

Азп

Зег

Ьеи

СЬп

Зег

Азп

Азр

ТЬг

АЬа

Ые

Туг

Суз

АЬа

85

90

95

ада

дсс

сРс

асе

Рас

РаР

дар

Рас

дад

ССС

дсЬ

Рас

едд

ддс

саа

ддд

336

Агд

АЬа

Ьеи

ТЬг

Туг

Авр

Туг

СЬи

РЬе

АЬа

Туг

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

100

105

ыо

асР

сРд

дрс

асР

дрс

Сер

дса

357

ТЬг

Ьеи

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

АЬ а

115 <210> 48

- 36 017265 <211> 119 ' <212> РКТ <213> Миз тизсиЬиз <400> 48

31η 1

УаЬ

СЬп

Ьеи

Ьуз 5

СЬп

Зег

СЬу

Рго

СЬу 10

Ьеи

УаЬ

СЬп

Рго

Зег 15

СЬп

Зег

Ьеи

Зег

Не

ТЬг

Суз

ТЬг

УаЬ

Зег

СЬу

РЬе

Зег

Ьеи

ТЬг

Азп

Туг

20

25

30

СЬу

УаЬ

НЬз

Тгр

УаЬ

Агд

СЬп

Зег

Рго-

СЬу

Ьуз

СЬу

Ьеи

СЬи

Тгр

Ьеи

35

40

45

СЬу

УаЬ

11е

Тгр

Зег

СЬу

Азп

ТЬг

Азр

Туг

Азп

ТЬг

Рго

РЬе

ТЬг

50

55

60

Зег

Агд

Ьеи

Зег

Не

Азп

Ьуз

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Зег

С1п

УаЬ

РЬе

65

70

75

8 0

Дуз

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

СЬп

Зег

Азп

Азр

ТЬг

А1а

Не

Туг

Суз

АЬа

85

90

95

Агд

АЬа

Ьеи

ТЬг

Туг

Азр

Туг

СЬи

РЬе

АЬа

Туг

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

100

105

но

ТЬг

Ьеи

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

А1а

115 <2Ь0> 49 <211> 321 <212> ДНК <213> Миз тизсиЬиз <220> ' <221> СДЗ

<222> (1) . .

(321)

<400> 49

дас

аЬс

ЬЬд

сЬд

асЬ

сад

ЬсЬ

сса

дЬс

аЬс

сЬд

ЬсЬ

дЬд

адЬ

сса

дда

48

Азр

Не

Ьеи

ТЬг

СЬп

Зег

Рго

УаЬ

Не

Ьеи

Зег

УаЬ

Зег

Рго

СЬу

1

5

10

15

даа

ада

дЬс

адЬ

ЬЬс

Ьсс

Ьдс

адд

дсс

адЬ

сад

адЬ

аЬЬ

ддс

аса

аас

96

СЬи

Агд

УаЬ

Зег

РЬе

Зег

Суз

Агд

АЬа

Зег

СЬп

Зег

Не

СЬу

ТЬг

Азп

20

25

30

аЬа

сас

Ьдд

ЬаЬ

сад

саа

ада

аса

ааЬ

ддЬ

ЬсЬ

сса

адд

сЬЬ

сЬс

аЬа

14 4

Не

Н13

Тгр

Туг

СЬп

Агд

ТЬг

Азп

СЬу

Зег

Рго

Агд

Ьеи

11е

35

40

4 5

аад

ЬаЬ

дсЬ

ЬсЬ

дад

ЬсЬ

аЬс

ЬсЬ

ддд

аЬс

ссЬ

Ьсс

адд

ЬЬЬ

адЬ

ддс

192

Ьуз

Туг

А1а

Зег

СЬи

Зег

Не

Зег

СЬу

Не

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

адЬ

дда

Ьса

ддд

аса

даЬ

ЬЬЬ

асЬ

сЬЬ

аде

аЬс

аас

адЬ

дЬд

дад

ЬсЬ

240

Зег

Му

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

Не

Азп

Зег

УаЬ

СЬи

Зег

65

70

75

80

даа

даЬ

аЬЬ

дса

даЬ

ЬаЬ

Ьас

ЬдЬ

саа

ааЬ

аас

Ьдд

сса

асе

288

СЬи

Азр

Не

АЬа

Азр

Туг

Суз

СЬп

Азп

Тгр

Рго

ТЬг

85

90

95

асд

ЬЬс

ддЬ

дсЬ

ддд

асе

аад

сЬд

дад

сЬд

ааа

321

ТЬг

РЬе

СЬу

АЬа

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьеи

Ьуз

100 105 <210> 50 <211> 107 <212> ΡΚΤ <213> Миз тизси1из <400> 50

Азр 1

Не

Ьеи

ТЬг СЬп 5

Зег

Рго

УаЬ

1Ье ЬО

Ьеи

Зег

УаЬ

Зег

Рго Ь5

СЬу

СЬи

Агд

Уа.1

Зег

РЬе

Зег

Суз

Агд

АЬа

Зег

СЬп

Зег

ЬЬе

СЬу

ТЬг

Азп

20

25

30

Не

НЬз

Тгр

Туг

СЬп

Агд

ТЬг

Азп

СЬу

Зег

Рго

Агд

Ьеи

ЬЬе

35

40

45

Ьуз

Туг

АЬа

Зег

СЬи

Зег

Не

Зег

СЬу

1Ье

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

СЬу

50

55

60

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

I Ье

Азп

Зег

УаЬ

СЬи

Зег

65

70

75

80

СЬи

Азр

1Ье

АЬа

Азр

Туг

Суз

СЬп

Азп

Аз-п

Азп

Тгр

Рго

ТЬг

85.

90

95

ТЬг

РЬе

СЬу

АЬа

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьеи

Ьуз

100 105

Claims

1. Применение антитела ШС-А12, которое является ингибитором ЮЕ-ΙΚ, для отдельного, совместного или последовательного введения с андрогенной депривацией для лечения рака предстательной железы.

2. Применение антитела ГМС-А12, которое является ингибитором ЮЕ-ΙΚ, для отдельного, совместного или последовательного введения с андрогенной депривацией для ингибирования или предотвращения перехода андрогензависимого рака предстательной железы в андрогеннезависимый рак предстательной железы.

3. Применение по п.1 или 2, где андрогенная депривация включает введение аналога рилизингфактора лютеинизирующего гормона (ΕΗΚΗ).

4. Применение по п.1 или 2, где андрогенная депривация включает проведение лечения антиандрогенами.

5. Применение по п.1 или 2, где андрогенная депривация включает введение ингибитора андрогенов надпочечников.

6. Применение по п.1 или 2, где андрогенная депривация включает орхиэктомию.

7. Применение по п.1 или 2, где дополнительно используют антагонист Ак! в сочетании с ШС-А12.

8. Применение по п.7, где антагонист Ак! является антагонистом ЕОЕК

9. Применение по п.1 или 2, где дополнительно используют противоопухолевое средство в сочетании с ШС-А12.

10. Применение по п.9, где противоопухолевым средством является облучение.

11. Способ лечения рака предстательной железы, включающий введение РМС-А12 и андрогенную депривацию, которые начинают приблизительно в одно и то же время.

12. Способ лечения рака предстательной железы, включающий введение ^С-А12 и андрогенную депривацию, в котором ШС-А12 вводят после депривации андрогенов и перед тем, как рак предстательной железы переходит от андрогензависимого рака к андрогеннезависимому раку.