DE69518919T2

DE69518919T2 - Autoantikörper enthaltende zusammensetzung für tumorbehandlung und -vorbeugung

Info

Publication number: DE69518919T2
Application number: DE69518919T
Authority: DE
Inventors: Leonid Iakoubov; Vladimir P. Torchilin
Original assignee: Individual
Current assignee: Oncologic Biopharmaceuticals Corp Dorval Quebec
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1995-06-21
Publication date: 2001-03-29
Anticipated expiration: 2015-06-22
Also published as: EP0764030A1; JPH10505819A; EP0764030A4; JP2007277252A; EP1018518A2; US5993818A; US5780033A; DE69518919D1; WO1996000084A1; ES2150573T3; EP0764030B1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Autoantikörpern für die Tumortherapie und -prophylaxe.
Neoplasie wird häufig durch somatische Mutationen verursacht. Falls sich diese Mutationen mit dem Alter anhäufen, erhöht sich der Druck auf das Immunsystem, das Neoplasie als eine seiner Funktionen kontrolliert. Jedoch entwickeln viele ältere Lebewesen keine Tumore, obwohl die durch Krebs bedingte Sterblichkeit mit dem Alter erhöht ist. Eine Erklärung für diese Immunität ist die Rolle bestimmter natürlicher Antikörper bei einer humoralen Anti- Tumor-Immunität (Chow et al., Int. J. Cancer 27 : 459-469, 1981). Jedoch ist wenig über die antigene Spezifität derartiger Antikörper bekannt.
Ein Typ natürlicher Antikörper, der im Immunsystem vorkommt, ist der Autoantikörper. Diese Autoantikörper wurden wiederholt in signifikant höheren Titern bei älteren Menschen und Labortieren ohne erkennbare Erkrankungen als bei jüngeren Kontrollen gefunden (Whitaker et al., Clin. Res. 14 : 143, 1966; Cammarata et al., JAMA 199 : 115-118, 1967; Siegel et al., Immunology 22 : 457-463, 1972). Hybridome, die natürliche Autoantikörper von Mäusen eines verschiedenen Alters produzieren, wurden beschrieben (Sakharova et al., Zh. Obshch. Biol. 47 : 625-630, 1986).
Das Auftreten von Autoantikörpern bei den älteren Lebewesen dient vermutlich als Marker eines deregulierten Immunsystems und diesen Antikörpern wurden kürzlich Tumorwachstum-verstärkende Eigenschaften zugeschrieben (Ben-Yehuda et al., Cancer Invest. 10 : 525- 531, 1992). In früheren Untersuchungen wurde berichtet, dass erhöhte Spiegel an Serumantikörpern zu einer Entwicklung von autoimmun-systemischen Erkrankungen führen können (Dickson et al., Progress in Immunology, 959-995, New York: Academic Press, 1980) und dass die Unterdrückung von antinukleären Autoantikörpern durch das Immunsuppressivum Cyclophosphamid möglicherweise mit dem Wachstum eines wachsenden lymphoretikulären Neoplasmas korrelieren könnte (Walker et al., Clin. Exp. Immunol. 24 : 210-217, 1976). Hahn et al., Arthrit. Rheumat. 18 : 145-152 (1975) folgerten, dass Cyclophosphamid die Produktion von Neoplasmen wie Lymphoretikulär-Neoplasmen, Karzinomen und Sarkomen verstärkte.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass natürliche antinukleäre Autoantikörper (ANA) wie die von betagten Lebewesen für die Behandlung von Neoplasie sowohl bei bereits bestehenden Tumoren als auch als prophylaktische Maßnahme verwendet werden können. Diese schützende Wirkung wurde für einen natürlichen monoklonalen ANA (2C5) einer älteren BALB/c-Maus gezeigt, der stark die Entwicklung von aggressivem syngenem EL4-T-Zell- Lymphom bei jungen Mäusen hemmte, während Kontroll-Antikörper des gleichen lsotyps keine Wirkung zeigten.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind dadurch charakterisiert, dass sie (1) Autoantikörper sind, (2) an die Oberfläche von EL4-T-Lymphomzellen, S49-T-Lymphome, P3/Ag8.653- Myelome und VERO-Tumorzellen, jedoch nicht an normale T-Zellen binden, (3) antinukleäre Autoantikörper sind, d. h. an ein in Zellnuklei vorkommendes Antigen wie ein Desoxyribonukleoprotein (DNP) binden. Die Autoantikörper kommen in höheren Titern in betagten Säugern vor, können jedoch auch bei jungen Säugern auftreten.
Im allgemeinen betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung für die Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle in einem Säuger, wobei die Zusammensetzung einen Autoantikörper umfasst, der spezifisch an (i) die Oberfläche von EL4-T-Lymphomen, S49-T-Lymphomen, P3/Ag8.653-Myelomen und VERO-Tumorzellen und (ii) an ein Antigen im Nukleus der Tumorzelle und (iii) nicht an die Oberfläche normaler T-Zellen bindet.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Autoantikörper-enthaltenden Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments für die Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle in einem Säuger.
Der Autoantikörper kann im wesentlichen rein sein und kann aus dem Serum eines betagten Säugers wie eines Menschen oder einer Maus isoliert werden oder er kann ein monoklonaler Antikörper sein und mit Hilfe eines Hybridoms einer Zelle aus einem betagten Säuger hergestellt werden.
Die Zusammensetzung oder das Medikament kann für die Behandlung verschiedener menschlicher Tumorzellen verwendet werden, einschließlich einer menschlichen Sarkom-, Myelom-, Karzinom- oder Lymphomzelle, und kann vor Nachweis einer Tumorzelle in dem Säuger verabreicht werden, z. B. prophylaktisch, um das Wachstum von Tumorzellen in dem Säuger nach Verabreichung des Autoantikörpers zu verhindern. Die Zusammensetzung oder das Medikament kann auch nach Nachweis einer Tumorzelle in dem Säuger verabreicht werden, um das weitere Wachstum von Tumorzellen, die in dem Säuger vor Verabreichung des Autoantikörpers bestehen, zu verhindern.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Autoantikörper zur Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle wie EL4, VERO-neoplastische Epithelzelle aus der Niere einer grünen Meerkatze, menschliche Lymphomzelle, menschliche Myelomzelle, menschliche Zelle, menschliche Sarkomzelle oder ähnlichen fähig ist. Dabei wird (a) ein Kandidat-Autoantikörper erhalten, (b) Bindung des Autoantikörpers an die Oberfläche von EL4-T-Lymphomen, S49-T-Lymphomen, P3/Ag8.653-Myelomen und VERO-Tumorzellen getestet, (c) die Bindung des Autoantikörpers an die Oberfläche einer normalen T-Zelle getestet und (d) Bindung des Autoantikörpers an ein Desoxyribonukleoprotein oder ein Antigen im Nukleus der Tumorzelle getestet, wobei der Autoantikörper zur Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle fähig ist, falls er positiv bezüglich der Schritte (b) und (d) und negativ bezüglich des Schritts (c) ist.
Die Zusammensetzung für die Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle in einem Säuger, z. B. einem Menschen, kann einen mit einem bioaktiven Wirkstoff, z. B. einem cytotoxischen Wirkstoff oder einem Cytokin-vernetzten, z. B. kovalent oder nicht-kovalent gebundenen Autoantikörper, umfassen. Cytotoxische Wirkstoffe umfassen in nicht begrenzender Weise: Saponin, Ricin, Ricin A-Kette, Abrin, Abrin A-Kette, Diphtherietoxin, Diphtherietoxin A-Kette, Exotoxin A-Kette, Daunomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Mytomycin C, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid, Colchicin, Cytochalasin B, Bleomycin, Vincristin, Vinblastin und Methotrexat. Cytokine umfassen in nicht begrenzender Weise: Interleukine wie IL-2, Wachstumsfaktoren wie GM-CSF und Interferone wie gamma-Interferon.
Der erfindungsgemäße Autoantikörper kann ein polyklonaler ANA aus einem betagten Säuger oder ein monoklonaler Antikörper wie der antinukleäre Autoantikörper 2C5, hergestellt durch eine Hybridomazelle aus der Hybridomazelllinie mit der ATCC-Zugangsnummer CRL 11667 sein. Der erfindungsgemäße Autoantikörper kann im wesentlichen rein sein.
"Im wesentlichen rein" bedeutet, dass der erfindungsgemäß bereitgestellte Antikörper wenigstens zu 60 Gew.-% frei von den Proteinen und natürlich auftretenden organischen Molekülen ist, mit denen er in der Natur assoziiert ist. Vorzugsweise enthält die Zubereitung wenigstens 75, besser wenigstens 90 und am besten wenigstens 99 Gew.-% Autoantikörper.
Ein im wesentlichen reiner Antikörper kann z. B. durch Extraktion aus einer natürlichen Quelle wie einem Säuger, z. B. aus menschlichem Serum, durch Herstellung einer den Antikörper produzierenden Hybridomzelle, durch Expression einer für einen monoklonalen Antikörper kodierenden rekombinanten Nukleinsäure oder durch chemische Synthese des Proteins erhalten werden. Reinheit kann durch jedes geeignete Standardverfahren gemessen werden, wie Säulenchromatographie, Polyacrylamidgel-Elektrophorese oder HPLC-Analyse.
Der Begriff "Autoantikörper aus einem betagten Säuger" bedeutet hier einen natürlichen Autoantikörper, der direkt aus einem alten Säuger entnommen wurde, d. h. aus einem Säuger, der 60% oder mehr seiner Lebenserwartung überdauert hat. Der Begriff umfasst auch Autoantikörper, die von einer Zelle, die einem alten Säuger entnommen wurde, oder einem Abkömmling dieser Zelle, z. B. durch Herstellung von Hybridomzellen, produziert werden.
Alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe haben die gleiche Bedeutung wie im allgemeinen im Fachgebiet, es sei denn, es ist anders erwähnt. Obwohl Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu den hier beschriebenen sind, bei der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Zusätzlich dienen die Materialien, Verfahren und Beispiele der Veranschaulichung und sind nicht beschränkend aufzufassen.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen deutlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A und 1B sind Fotografien von fünf Mäusen, die eine Hemmung des Tumorwachstums in Gegenwart des monoklonalen ANA 2C5 bzw. ein starkes Tumorwachstum in Gegenwart eines Kontroll-Antikörpers des gleichen lsotyps zeigen.
Fig. 2A und 2B sind graphische Darstellung, die eine flusscytometrische Analyse der Bindung des monoklonalen ANA 2C5 an EL4-T-Zell-Lymphomzellen einer in vitro-Kultur bzw. ein Ausbleiben einer Bindung an Thymocyten von 5 Wochen alten Mäusen zeigen.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die eine flusscytometrische Analyse der Bindung des monoklonalen ANA 2C5 an S49-T-Zell-Lymphomzellen aus einer in vitro-Kultur zeigt.
Die Anmelder zeigten, dass natürliche Autoantikörper wie ANA aus betagten Individuen für die Behandlung bestehender Tumore und als prophylaktisches Mittel für die Vermeidung von Tumoren und ihrer Metastatisierung verwendet werden können. Nachstehend wird die Isolierung und Charakterisierung von ANA aus einer betagten Maus und die Produktion und das Testen monoklonaler ANA aus Mäusen für die Hemmung des Tumorzellwachstums in einem Säuger gezeigt. Die Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und sind nicht begrenzend aufzufassen. Außerdem können die Techniken allgemein für die Isolierung, Charakterisierung und Verwendung von Autoantikörpern aus menschlichem Serum und die Produktion von menschlichen monoklonalen Autoantikörpern angewandt werden.

Autoantikörper

Die Autoantikörper, z. B. ANA, können aus irgendeiner Säugerspezies stammen, einschließlich Maus, Mensch oder ähnlichem, oder sie können Kombinationen davon sein, wie chimäre Antikörper, die eine konstante Region von Mensch und eine variable Region aus Maus oder einer anderen Säugerquelle besitzen. Das wichtige Charakteristikum ist, dass der Autoantikörper spezifisch an die Oberfläche lebender Tumorzellen wie EL4-T-Lymphomzellen, jedoch nicht an normale T-Zellen, oder an ein Protein wie Desoxyribonukleoprotein, das von den abgestorbenen Tumorzellen freigesetzt wird, bindet.

Nachweis von ANA durch indirekte Immunofluoreszenz

ANA kann im Serum von Säugern wie menschlichen Patienten mit indirekter Immunofluoreszenz unter Verwendung von Substrat der Säugerleber wie der Rattenleber oder menschlichen Leber-Zelllinie HEP2 nachgewiesen werden. Bei diesem Verfahren wird menschliches Serum auf einem Cryostat-Schnitt der Rattenleber, der eine Bindung der Immunoglobulin- Moleküle mit antinukleärer Spezifität erlaubt, aufgebracht. Der Objektträger mit den Rattenlebersektionen wird mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und der mit Fluorescein konjugierte anti-Mensch-IgG aus Ziege (Antibodies Inc.) hinzugegeben. Nach nochmaligem Waschen mit PBS wird der mit Fluorescein konjugierte anti-Mensch-IgG der Ziege durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Serumproben werden mit PBS verdünnt und der höchste Titer, der ein positives Ergebnis für ANA zeigt, wird als ein A-Titer verwendet.
Das Immunofluoreszenzmuster entspricht häufig einem bestimmten Antigen, gegen das die Antikörper gerichtet sind. Zum Beispiel deutet ein homogenes Immunofluoreszenzmuster im Zellkern auf das Auftreten von Antikörpern, die gegen DNA oder bestimmte DNA-Bindepro teine wie Histone gerichtet sind, hin. Ein gesprenkeltes Muster ist für Antikörper charakteristisch, die gegen nukleäre Ribonukleoproteine (nRNP) wie Sm-, Ro- und La-Antigene gerichtet sind.

Herstellung von Antikörpern

Nach dem Nachweis und der Isolierung können Autoantikörper wie ANA als monoklonale Autoantikörper durch Bildung eines Hybridoms und Expression in dem Kulturüberstand des Hybridoms oder Produktion durch Asziten erhalten werden. Der Antikörper kann auch ein monoklonales Antikörperfragment sein wie FAB, F(ab&sub2;), Fv, eine rekombinante variable Region oder ähnliches.
ANA aus einem betagten Säuger werden durch Poolen von Seren eines immunen Säugers oder von Säugern wie einer Maus oder einem Menschen hergestellt, gefolgt von Fraktionierung der IgG-Komponente aus dem Plasma oder den Seren. Zelllinien, die monoklonale Antikörper aus Mensch oder Maus produzieren, können durch bekannte Transformations- und Hybridomaverfahren hergestellt werden (vgl. z. B. Methods in Enzymology, Bd. 121, Abschnitte I und II (1986), Hrsg. J. J. Langone und H. V. Vunakis, Academic Press).
Monoklonaler natürlicher ANA 2C5 (2C5) aus nicht-immunisierten, gesunden, betagten Mäusen wurde erhalten und er gehörte zur Subklasse IgG2a (Sakharova et al., Zh. Obshch. Biol. 47 : 625-630, 1986). 2C5 wurde wie folgt erhalten: Milzzellen aus zwei nichtimmunisierten, gesunden, betagten (26 Monate alt, durchschnittliche Lebenserwartung bis zu 30 Monate) weiblichen BALB/c-Mäusen wurden mit der Mäuse-Myelomzelllinie P3X63-Ag8.653 (ATCC Nr. CRL1580) fusioniert. Mehrere Hundert Hybridomklone wurden auf Autoreaktivität in einem Standard-Radioimmuno-Assay mit Homogenaten verschiedener Gewebe (Leber, Niere, Gehirn) getestet. Homogenate dieser Organe wurden mit den Überständen der Hybridomklone inkubiert, dreimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 3% Rinderserumalbumin (PBS-3) gewaschen, mit ¹²&sup5;I-markierten anti-Maus-Antikörpern in PBS-3 inkubiert, dreimal mit PBS-3 gewaschen und in einem Y-Zähler untersucht. Etwa 5% der Hybridome waren in diesem Test und mit allen drei Zielen positiv. Somit sind diese Antikörper nicht Gewebespezifisch und sind deutlich Autoantikörper.
Eine weitere Charakterisierung des Ziels von 2C5 wurde mit einem Test einer indirekten Immunofärbung von Schnitten eines Maus- oder Rattengehirns erhalten. Kryostat-Schnitte wurden mit Aceton fixiert, dreimal 5 Minuten mit PBS-3 gewaschen, 20 Minuten mit Hybridomüberständen inkubiert, gewaschen und mit Meerrettichperoxidase-markierten anti-Maus- Antikörpern inkubiert. Die Färbereaktion erfolgte mit 3,4-Diaminobenzidin in einem Standardverfahren.
Alle in dem Radioimmunotest mit Homogenaten positiv getesteten Hybridomen waren auch in der Immunocytochemieuntersuchung von Maus- oder Rattengehirnschnitten positiv, was eine Reaktivität mit den Zellkernen aller Zellen zeigt. Im Gegensatz dazu war keine antinukleäre Reaktivität mit Homogenat-positiven Hybridomen, die in einem ähnlichen Verfahren aus neugeborenen (4-5 Tage alt) oder erwachsenen (6 Monate alt) nicht-immunisierten gesunden Mäusen erhalten wurden, erkennbar. Homogene, nicht-gesprenkelte Muster der nukleären Färbung zeigten, dass das Ziel des Antikörpers DNA oder an DNA gebundenes Protein ist. Somit ist der Autoantikörper auch ein antinukleärer Autoantikörper (ANA).
Das Hybridom 2C5 wurde für eine weitere Untersuchung gewählt, da es eine starke nukleäre Reaktivität und eine hohe Reaktivität mit der Oberfläche transformierter Tumorzelllinien aus in vitro- oder ex vivo-Kulturen wie EL4-Maus-Thymum, S49-Maus-T-Lymphom, P3 · 63- Ag8.653-Maus-Myelom und VERO-neoplastische Epithelialzelllinie aus der grünen Meerkatze zeigte. Das diesen monoklonalen Antikörper produzierende Hybridom wurde am 22. Juni 1994 bei ATCC in Rockville, Maryland, unter der Zugangsnummer CRL 11667 hinterlegt.
Der monoklonale Antikörper 2C5 und der Kontroll-Antikörper des gleichen Isotyps, UPC10 (Cappel, Durham, NC) wurden aus Aszitenflüssigkeit durch Präzipitation mit 40% Ammoniumsulfat gereinigt oder mit Hilfe von Ionenaustauschchromatographie auf CM-Agarose (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) unter Verwendung von Standardverfahren weiter gereinigt (vgl. z. B. Jiskoot et al., "Two-Step Purification of a Murine Monoclonal Antibody Intended for Therapeutic Application in Man", J. Immunol. Methods 124 : 143-156, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989; und Fischer, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Hrsg. Work und Burdon, Elsevier, 1980).
Die Reinheit des Antikörpers wurde durch HPLC unter Verwendung von Standardverfahren getestet. Die durch Ammoniumsulfat-Präzipitation und AmmoniumsulfatlCM-Agarose-Reinigung erhaltenen Präparationen ergaben ähnliche Ergebnisse bei den in vivo-Experimenten.

Humanisierung von Antikörpern

Da monoklonale Antikörper meist in einer anderen Spezies als Mensch produziert werden, sind sie häufig für Menschen immunogen. Um diese monoklonalen Antikörper für die Behandlung von Menschen erfolgreich verwenden zu können, kann die Schaffung eines chimären Antikörper-Moleküls notwendig sein, wobei der Teil des Polypeptids, der an der Bindung des Liganden beteiligt ist (die variable Region) aus einer Spezies und der Teil, der an der Bereitstellung struktureller Stabilität und anderen biologischen Funktionen beteiligt ist (die konstante Region), aus einem menschlichen Antikörper stammt. Verfahren zur Herstellung chimärer Antikörper, bei denen die variable Domäne aus einem Wirt und die konstante Domäne aus einem zweiten Wirt stammt, sind bekannt; vgl. z. B. Neuberger et al., WO-Veröffentlichung Nr. 86/01533, Priorität vom 3.9.84; Morrison et al., EP-Veröffentlichung Nr. 0 173 494, Priorität vom 27.8.84.
Ein alternatives Verfahren, bei dem ein Antikörper durch Austausch nur der komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) der variablen Region durch die CDRs aus einem Immunoglobulin mit der gewünschten antigenen Spezifität produziert wird, wurde von Winter (GB-Veröffentlichung Nr. 2 188 638, Priorität vom 27.3.86) beschrieben. Monoklonale Antikörper aus Mäusen können mit einer therapeutischen Verwendung beim Menschen durch Herstellung eines Antikörpers mit einem menschlichen Fc-Teil kompatibel gemacht werden (Morrison, S. L. (1985), Science 229 : 1202-1207). Bekannte Verfahren ermöglichen die Konstruktion, Expression und Reinigung eines derartigen hybriden monoklonalen Antikörpers. Systeme für die therapeutische Verabreichung von Immunglobulinen wurden in jüngster Zeit für eine Reihe von infektiösen Erkrankungen angewendet.
Zusätzlich können Antikörper von nicht-menschlichen Säugerwirten hergestellt werden, die xenogenetische menschliche DNA-Segmente enthalten, die für menschliche Ig-Loci für eine Reaktion mit Immunogenen kodieren; vgl. das Verfahren in Kuncherlapati et al., WO 94/02602.
Der Begriff "Antikörper" umfasst hier monoklonale oder polyklonale Antikörper, ganze, vollständige Antikörper oder Antikörperfragmente mit der immunologischen Aktivität des ganzen Antikörpers. Durch den Begriff "Antikörper" umfasst sind auch chimäre Antikörper mit einem variablen und konstanten Bereich aus verschiedenen Wirt-Spezies oder Antikörper, bei denen nur die CDRs ausgetauscht sind.

Menschliche monoklonale Antikörper

Manche menschliche ANA ergeben ein homogenes Muster einer nukleären Färbung und reagieren mit Zellplasmamembranen, ähnlich wie 2C5 (Rekvig, Scand. J. Immunol. 29 : 7-13, 1989). Daher können Hybridome, die vollständig menschlichen Ursprungs sind und menschliche Autoantikörper produzieren, wie ANA, durch Fusion von B-Zellen (wie periphere Blut-B- Zellen) aus einem ANA-positiven gesunden, betagten Lebewesen mit einer menschlichen "Fusionspartner"-Zelllinie wie UC729-6 oder SHFP-1 erhalten werden; vgl. McKnight et al., Human Antibodies and Hybridomas 1 : 77-82 (1990).

Testen von anti-Tumor-Autoantikörpern

Anti-Tumor-Autoantikörper, die im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen, können mit Hilfe der nachstehenden Standardtests charakterisiert werden. Zum einen müssen sie Autoantikörper sein, die mit Hilfe von Standardtests für Autoantikörper wie ELISA mit Standard- Autoantigenen bestimmt werden können. Zum anderen müssen sie an die Oberfläche von EL4-T-Lymphomen, S49-T-Lymphomen, P3/Ag8.653-Myelomen und VERO-Tumorzellen und an Desoxyribonukleoprotein oder ein Antigen im Zellkern der Tumorzelle binden. Des weiteren dürfen sie nicht an normale T-Zellen binden. Diese Bindeeigenschaften können mit Hilfe von Standard-flusscytometrischen Verfahren bzw. einem ELISA-Test wie nachstehend beschrieben bestimmt werden.

Test für die Bindung an die Oberfläche einer Tumorzelle

Die Bindung eines monoklonalen ANA (wie 2C5, vorstehend beschrieben, oder ein monoklonaler ANA aus einem betagten Säuger wie einem Menschen) an Tumorzellen (wie eine Lymphom- oder eine andere Tumorzelle, wobei die Tumorzelle aus einer Maus oder einem Menschen stammt) wurde durch Flusscytometrie mit Hilfe von Standardverfahren überprüft. Dieser Test kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmter ANA an ein Antigen auf der Oberfläche einer Tumorzelle bindet und um zu bestimmen, ob eine bestimmte Tumorzelle mit einem ausgewählten ANA behandelt werden kann.
Die Lebensfähigkeit der Zellen zu Beginn des Verfahrens betrug mehr als 95% und wurde durch einen Standard-Trypanblau-Ausschlusstest bestimmt.
Zellen in einer Einzelzellsuspension (EL4-T-Lymphom, S49-T-Lymphom und P3 · 63- Ag8.653-Myelom) oder in Monolayern (für Nicht-Suspensionszellen wie VERO-Zellen (Epi theltumor der Niere der grünen Meerkatze)) wurden 20 Minuten mit dem monoklonalen Antikörper 2C5 oder dem Kontroll-Myelom-Antikörper UPC10 des gleichen Isotyps inkubiert (5- 10 ug/ml in Kulturmedien mit 10% Rinder-Kälberserum (CM10, HyClone Logan, UT), zweimal mit HBSS (Cellgrow, Herndon, VA) gewaschen, 20 Minuten mit FITC-markierten F(ab)&sub2;- Fragmenten von anti-Maus-Antikörpern aus Ziege (Cappel) (1 : 100 mit CM10 verdünnt) inkubiert, erneut zweimal mit HBSS gewaschen, mit einer 4% Paraformaldehydlösung in PBS fixiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop oder Flusscytometer untersucht. Alle Verfahren wurden bei 20ºC durchgeführt.
Die Zellen wurden mit Hilfe eines FACSCAN-Analysegeräts (Becton Dickinson und Co., Bedford, MA) analysiert, wobei durch Vorwärts- und seitliche Streuung mit Hilfe von "life gating" sortiert wurde, um Verunreinigung und abgestorbene Zellen gemäß den Anleitungen des Herstellers auszuschließen. "Life gating" ist eine Standard-Hardware oder ein Softwareprogramm, das ausschließlich die Analyse von lebenden Zellen ermöglicht. Die Reaktion mit der Oberfläche von gebundenen VERO-Zellen wurde nur mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Ein Trypanblau-Ausschlusstest wurde für den Ausschluss der Reaktivität aufgrund irgendeiner Interaktion mit intrazellulären Antigenen verwendet. Die Reaktion von 2C5 mit Antigenen auf der Zelloberfläche von Suspensionszellen eines EL4-Thymoms, S49-T- Lymphoms und P3/Ag8.653-Myeloms wurde mit dem Mikroskop und mit dem Flusscytometer gezeigt.
Wie in Fig. 2A gezeigt, band der monoklonale Antikörper 2C5 an ein EL4-T-Zell-Lymphom aus einer in vitro-Kultur, jedoch nicht an Thymozyten aus einer 5 Wochen alten C57BL/6- Maus (Fig. 2B). In diesen beiden graphischen Darstellungen ist die relative Fluoreszenz von FITC-markierten anti-Maus F(ab)&sub2;-Fragmenten alleine als ausgezogene Linie, die relative Fluoreszenz des Kontroll-Antikörpers UPC10 mit FITC-markierten anti-Maus F(ab)&sub2;-Fragmenten als in großem Abstand gepunktete Linie und die relative Fluroeszenz von 2C5 mit FITC-markierten anti-Maus F(ab)&sub2;-Fragmenten als in kurzen Abständen gepunktete Linie gezeigt. Somit zeigt Fig. 2A eine erhöhte relative Fluoreszenz nur für die in kurzen Abständen gepunktete Linie und Fig. 2B zeigt keine erhöhte relative Fluoreszenz.
Wie in Fig. 3 gezeigt, band 2C5 im Gegensatz zu dem Kontroll-Antikörper UPC10 auch an S49-T-Lymphom (in kurzen Abständen gepunktete Linie). Der Antikörper 2C5 band auch an P3/Ag8.653-Myelom und an Epithel-Tumorzellen der Niere der grünen Meerkatze. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte 2C5 auch an andere Tumorzellen, einschließlich menschlicher Tumorzellen, binden.

ELISA-Test

Ein Standard-ELISA-Test kann für die Bestimmung, ob ein bestimmter Autoantikörper an nukleäre Antigene und/oder von abgestorbenen Krebszellen freigesetzte Proteine bindet, verwendet werden. Nukleäre Antigene für anti-Tumor-ANA wie 2C5 umfassen Histone, die eine strukturelle Rolle bei der Chromatin-Organisation spielen, und Nicht-Histon-Proteine, die DNA-Transkription und -Replikation regulieren, wie La- und Ku-Antigene.
Die Interaktion des monoklonalen Antikörpers 2C5 mit verschiedenen nukleären Autoantigenen wurde in 96-Loch-Platten getestet, die mit den in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführten nukleären Autoantigenen beschichtet waren, die von Diamedix Corp., Miami, FL, erhalten wurden. Die Beschichtung der ELISA-Platten mit aus abgestorbenen EL4- Lymphomzellen freigesetzten Autoantigenen erfolgte durch einstündige Inkubation mit dem Überstand von den toten Zellen. Für die Herstellung des Überstands wurden 2 · 10&sup6; EL4- Zellen 16 Stunden bei 37ºC und 7% CO&sub2; in 1 ml HBSS kultiviert. Antigen-beschichtete Löcher wurden gewaschen und darin 30 Minuten eine PBS-T-Lösung (Phosphat-gepufferte Salzlösung mit 0,05% v/v Tween® 20) inkubiert. 0,5 mg des getesteten Antikörpers in 100 ml PBS-T wurden in jedes Loch hinzugegeben. Das gebundene Material wurde durch Hinzufügen von Peroxidase-markiertem anti-Maus-Antikörper aus Ziege (Cappel, Durham, NC), gefolgt von Zugabe des Substrats, nachgewiesen. Absorption im sichtbaren Bereich bei 405 nm wurde mit einem Multiscan-Lesegerät (Flow Labs., East Costa Mesa, CA) als Messgröße der relativen Reaktivität in jedem Loch aufgezeichnet. Nur die Reaktionen, die eine Absorption bei 405 nm zeigten, die fünf Standardabweichungen über der Hintergrundabsorption lagen, wurden als positiv bewertet und mit einem "+" gekennzeichnet (Tabelle 1). Tabelle 1 Reaktionen von 2C5 mit intrazellulären Autoantigenen in einem ELISA
Wie in Tabelle 1 gezeigt, band 2C5 nur an den Überstand aus abgestorbenen EL4-Zellen und an DNP (Diamedix Corp.). Der Kontroll-Antikörper UPC10 band nicht an eines der Antigene.

Anti-Tumorwirkung von Autoantikörpern

Tumore

Eine Population von Krebszellen (wie Lymphom, Karzinom, Sarkom oder Myelom) aus einem Säuger (vorzugsweise Mensch oder Maus) kann für das Testen der anti-Tumorwirkung eines Autoantikörpers wie eines ANA aus einem betagten Säuger verwendet werden. Das EL4-T-Zell-Lymphom wurde zum Testen in C57BL-Mäusen gewählt, da es außerordentlich aggressiv ist, d. h. nur etwa 10 Tumorzellen sind ausreichend, um eine Maus zu töten, und es resistent gegenüber herkömmlichen Verfahren der Chemotherapie ist (Tarnovski et al., Cancer Res. 39 : 3964-3967, 1979). Zusätzlich besitzen Mäuse keine natürlichen Antikörper, die mit EL4-Zellen reaktiv sind (Pierotti et al., Int. J. Cancer 18 : 223-229, 1976) und entwickeln keine herkömmlichen Antikörper gegen diesen scheinbar nicht-immunogenen Tumor (Rees et al., Chemotherapy 28 : 283-290, 1982). Somit ist dieser Tumortyp einer der am schwierigsten zu behandelnden und wurde aus diesem Grund zum Testen ausgewählt.

In vitro-Tumorhemmung

Die Wirkung eines bestimmten Autoantikörpers oder ANA auf das Wachstum einer ausgewählten Tumorzelle, z. B. aus einem menschlichen Patienten, wird in vitro mit bekannten Standardverfahren getestet. Zum Beispiel werden Zellen eines menschlichen krebsartigen Tumors aus dem Patienten extrahiert und in vitro durch Standardverfahren in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert. Der Autoantikörper, z. B. ein ANA aus einem betagten Säuger (der ANA ist natürlicher oder monoklonaler Herkunft und der Säuger ist z. B. eine Maus oder ein Mensch) wird in vitro mit den kultivierten menschlichen Tumorzellen in Gegenwart von Effektoren des Immunsystems, z. B. aus Maus oder Mensch, wie Komplement und/oder cytotoxische T-Zellen, z. B. Neutrophile und Makrophagen, in Kontakt gebracht.
Das Wachstum wird z. B. durch Aufzeichnung des Einbaus von Derivaten von markiertem exogenem Thymidin wie Methyl[³H]thymidin, 15 Ci mmol&supmin;¹ (Amersham International, U. K.) in die DNA von behandelten und Kontroll-Tumorzellkulturen bestimmt; vgl. z. B. Curtin et al., Br. J. Cancer 53 : 361-368 (1986). Ein Standard-Cytotoxizitätstest kann für die Bestimmung des Prozentsatzes an toten Zellen in der Kultur verwendet werden. Zum Beispiel kann die selektive Freisetzung von markiertem Chrom (wie Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4;, Amersham, Arlington Heights, IL) aus toten Zellen in das Kulturmedium aufgezeichnet werden.

In vivo-Tumorhemmung

Ein in vivo-Test der Wirkung eines ausgewählten Autoantikörpers auf das Wachstum von menschlichen oder anderen Tumorzellen erfolgt in Menschen oder vorzugsweise in einem immunsupprimierten Tier, z. B. einer nackten Maus, das einen Fremd-Tumor trägt, der sich aus künstlich eingesetzten Tumorzellen, z. B. Tumorzellen aus einem Menschen, einer Maus oder einem anderen Säuger, entwickelt hat. Der Autoantikörper, z. B. ein ANA aus einem betagten Säuger, wird in einem physiologisch verträglichen Träger formuliert, in die Maus, die den Tumor trägt, injiziert und das Wachstum wird aufgezeichnet.
Zum Beispiel kann der nachstehende Test mit einer nackten Maus für das Testen der anti- Tumorwirkung eines ausgewählten ANA auf einen bestimmten menschlichen Tumor verwendet werden. Männliche athymische nackte BALB/c-Mäuse (21-24 g) (Life Sciences, St. Petersburg, FL) werden in einer pathogenfreien, Temperatur-kontrollierten Isolierbehausung gehalten und einer kontrollierten Beleuchtung ausgesetzt (Beleuchtung bei 0700-1900 h). Das Futter kann aus einer Standard-Nahrung bestehen (autoklavierbares Futter für Nager Nr. 5010; Ralston Purina, St. Louis, MO) und Wasser wird ad libitum gegeben.
Der Tumor wird als 2 mm²-Stücke s. c. durch einen Interskapulareinschnitt bilateral in die Flanken (zwei Tumore pro Maus) von 12 betäubten Mäusen xenotransplantiert. Die Mäuse werden wöchentlich gewogen und die Tumore zweimal wöchentlich mit Schiebelehren gemessen. Die Tumoroberflächen werden durch das Produkt der zwei größten senkrechten Tumordurchmesser berechnet. Die Verdopplungszeiten der Tumore werden anhand von semilogarithmischen graphischen Darstellungen der Tumoroberfläche gegenüber den Tagen nach der Implantation berechnet. Bei der Beendigung des Experiments werden die Mäuse durch Zervixluxation getötet und die Tumore und Bauchspeicheldrüsen entnommen. Die Gewebe werden in flüssigen Stickstoff eingefroren und bei -70ºC für den Test gelagert.
Mäuse mit implantierten Tumoren werden vermischt und in zwei Gruppen eingeteilt, wobei jede dreimal wöchentlich i. p. Injektionen von 0,1 ml erhält. Die Kontrollmäuse erhalten eine Salzlösung und die Mäuse in der behandelten Gruppe erhalten den ausgewählten ANA in einer Salzlösung (z. B. 50-1000 ug, vorzugsweise 400-500 ug pro Injektion und Maus).
Der nachstehende Test wurde durchgeführt, um die anti-Tumorwirkung von 2C5 auf das EL4-T-Zell-Lymphom bei Mäusen zu zeigen. Um die natürliche Situation der betagten Mäuse zu simulieren, bei der die neoplastischen Zellen in einem Hintergrund von erhöhten Mengen an ANA im Serum auftreten, wurde jungen Testmäusen 2C5 einen Tag vor Beimpfung (Tag -1) mit den Tumorzellen injiziert. Weitere Injektionen an den Tagen 1, 3 und 5 erfolgten, um eine ausreichende Menge des monoklonalen Antikörpers während der frühen Phase der Tumorentwicklung aufrecht zu erhalten.
Test- und Kontrollmäuse erhielten eine einzige Beimpfung mit kultivierten EL4-Lymphomzellen am Tag 0 (0,02 · 10&sup6; Zellen in 0,5 ml Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) pro Maus). Die in einem physiologisch verträglichen Träger formulierten Antikörper wurden intraperitoneal an den Tagen -1, 1, 3 und 5 injiziert (70 mg gereinigter Antikörper in 0,5 ml HBSS pro Maus und Injektion). Die Mäuse wurden durch Zervixluxation am Tag 15 nach der Injektion von 0,02 · 10&sup6; Tumorzellen und an Tag 13 nach der Injektion von 0,2 · 10&sup6; und 2 · 10&sup6; Tumorzellen getötet. Während der Experimente erhielten die Tiere Standardfutter. Die Tumorgröße und -erscheinung wurden durch Fotografieren aufgezeichnet und die subkutanen Tumore herausgeschnitten und gewogen. Eine statistische Auswertung des relativen Tumorgewichts erfolgte für die Berechnung von "p"-Werten (vgl. z. B. Siegel, Nonparametric Statistics for the Behavioral Sciences, Seiten 152-158, New York, McGraw-Hill Book Company, Inc., 1956).
Der aus Asziten und Serumfreiem Hybridom-Überstand aufgereinigte monoklonale Antikörper 2C5 war bei der Unterdrückung der Entwicklung des syngenen EL4-Lymphoms in C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen, denen ein von dem UPC10-Myelom (Cappel) produzierter Antikörper des gleichen Isotyps injiziert worden war, wirksam. Das Ausmaß des subkutanen Tumorwachstums war wesentlich gehemmt. Weniger als 25% der Testmäuse, denen 20 000 EL4-Lymphomzellen injiziert worden waren, entwickelten subkutan wachsende Tumore nach 15 Tagen, verglichen mit wenigstens 75% bei den Kontrollen (Fig. 1A und 1B und Tabelle 2). Tabelle 2 In vivo-Unterdrückung des Tumorwachstums durch den monoklonalen 2C&sub5;-Antikörper
* Kumulative Daten aus drei Experimenten, jeweils 5-6 Mäuse.
** Kumulative Daten aus vier Experimenten, jeweils 4-6 Mäuse.
Die Hemmung des Tumorwachstums nahm allmählich mit der Menge der injizierten Lymphomzellen, 0,02 · 10&sup6; bis 2 · 10&sup6; Zellen pro Maus (Tabelle 2), ab. Diese Daten zeigen die prophylaktische Wirkung von ANA eines betagten Tiers bei der Kontrolle des Wachstums natürlicher Tumore oder der Entwicklung von Metastasen.
Um die prophylaktische Wirkung eines ausgewählten Autoantikörpers weiter zu zeigen, kann er in einem pharmazeutisch verträglichen Träger an normale Tiere in regelmäßigen Zeitabständen verabreicht werden, um eine relativ konstante Menge des Antikörpers im Blut aufrecht zu erhalten. Die Tiere werden sodann einem bekannten Karzinogen oder einer bestimmten Menge UV-Strahlung, die die Entwicklung von Krebszellen in Kontrolltieren zu einem bekannten Grad auslöst, ausgesetzt. In ähnlicher Weise können bekannte transgene Tiere, die für die Entwicklung von Tumoren gezüchtet wurden, für das Testen der prophylaktischen Wirkung eines Autoantikörpers verwendet werden.
Die vorstehend beschriebenen Bindecharakteristika von 2C5 geben Aufschluss über zwei unterschiedliche mögliche Mechanismen, auf denen die anti-Tumor-Aktivität beruht. Zum einen zeigen die Daten der Flusscytometrie (Fig. 2A und 2B), dass 2C5 an die Oberfläche lebender EL4-T-Lymphomzellen, jedoch nicht normaler T-Zellen bindet. Zusätzlich bindet 2C5 an die Oberfläche einer Vielzahl anderer Tumorzellen wie des S49-T-Lmyphoms, P3X63-Ag.8.653-Myeloms und an VERO-Zellen (Epithel-Tumorzelllinie der Niere der grünen Meerkatze), was zeigt, dass die von dem monoklonalen Antikörper 2C5 erkannte antigene Determinante in der Evolution konserviert blieb (Klinman, J. Immunol. 148 : 1353-1358, 1992).
Verschiedene mögliche Mechanismen für eine Interaktion von Autoantikörpern wie ANA mit der Zelloberfläche wurden beschrieben. Beispiele sind die Expression eines nukleären Antigens auf der Zelloberfläche (Prabhakar et al., J. Clin. Invest. 86 : 1301-1305, 1990; Bachman et al., Exp. Cell Res. 191 : 171-180, 1990), die mögliche Kreuzreaktivität zwischen nukleären und Zelloberflächen-Antigenen (Lafer et al., J. Exp. Med. 153 : 897-909, 1981) und Bindung von ANA an die Zelloberfläche als Teil eines Immunokomplexes (Jacob et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 4669-4673, 1989). Was auch immer der Mechanismus der Interaktion ist, die erhaltenen Daten stützen die Folgerung, dass 2C5, der dem Immuno-aggressiven IgG2a-Isotyp angehört (Scholz et al., Cancer Immunol. Immunother. 33 : 153-157, 1991), die Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität oder/und Komplement-abhängige Lyse von Tumorzellen in vivo vermittelt. Andere Isotypen wie IgG3 sollten ebenfalls funktionieren. Die IgG-Klasse, zu der ein bestimmter Antikörper gehört, kann mit Hilfe von Standardverfahren bestimmt werden.
Zum anderen reagiert 2C5 mit einem von abgestorbenen Tumorzellen in das Kulturmedium freigesetzten Protein in vitro (Tabelle 1). Diese Erkenntnis stützt einen anderen möglichen Mechanismus für die in vivo-Wirkung von 2C5 auf die Tumorentwicklung, der in Konkurrenz zur Komplement-abhängigen Lyse arbeiten kann. Man weiß, dass jeder Tumor zusammen mit einer großen Menge wachsender Zellen etwas tote oder absterbende Zellen enthält (Wyllie, A. H., Anticancer Res. 5 : 131-136, 1985). Aus den toten Zellen freigesetzte intrazelluläre Antigene treten in den Blutkreislauf ein und schaffen hohe lokale Konzentrationen in den Blutgefäßen des Tumors. Autoantikörper im Blut bilden Immunkomplexe mit manchen dieser intrazellulären Antigene und erhöhen dadurch die lokale Konzentration derartiger Komplexe im Gefäßsystem des Tumors. Diese Komplexe sorgen für eine lokale Stimulation der Effektor-Immunzellen wie natürliche Killerzellen, Neutrophile und Makrophagen, die stark eine weitere Entwicklung des Tumors hemmen.

Verwendung

Bestehende Tumore werden in vivo durch die Verabreichung (vorzugsweise durch intravenöse oder subkutane Injektion) eines anti-Tumor-Autoantikörpers, z. B. eines ANA aus Maus oder Mensch, behandelt, der in einem physiologisch verträglichen Träger formuliert ist. Die richtige Dosis für eine therapeutische Verwendung wird durch den behandelnden Arzt fallab hängig bestimmt und ist abhängig von dem jeweiligen Alter und Gewicht des Patienten und der Größe des Tumors. Die Dosis beträgt 1-20 mg/kg Körpergewicht des Patienten, um sicherzustellen, dass die Bindestellen im Blut und auf der Oberfläche der Tumorzellen gesättigt werden. Eine Verabreichung erfolgt, bis der Tumor zerstört ist, oder sie erfolgt zusätzlich zu einer weiteren anti-Tumortherapie oder einem operativen Eingriff, bis der Tumor zerstört oder beseitigt ist.
Sobald ein maligner Tumor lokalisiert wurde, können die Autoantikörper auch vorteilhafterweise für die Vermeidung eines sekundären, metastatischen Wachstums des Tumors verwendet werden. Dabei werden die Antikörper in regelmäßigen Zeitabständen verabreicht, um eine relativ konstante Menge des Antikörpers im Blut bereitzustellen, bis der ursprüngliche Tumor durch die Wirkung des Autoantikörpers zerstört oder durch einen operativen Eingriff oder eine Chemotherapie entfernt wurde. Die Halbwertszeit der Autoantikörper in einem Säuger, z. B. einem Menschen, beträgt im Durchschnitt mehrere Tage. Somit sollte eine neue Dosis Autoantikörper einmal alle 3-7 Tage, in Abhängigkeit von dem spezifischen Antikörper, verabreicht werden. Das spezifische Verabreichungssystem basiert auf Standard- Bluttests, die die Menge des Autoantikörpers im Blut zeigen. Die Dosis pro Injektion beträgt 1-20 mg/kg Körpergewicht des Patienten.
Für eine prophylaktische Verwendung, z. B. vor Auftreten eines wachsenden Tumors, wird die Dosis wiederum durch einen Arzt bestimmt, wäre jedoch etwas niedriger als die erforderliche Dosis bei Auftreten eines Tumors, z. B. 0,1-5,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten, in Abhängigkeit von dem möglichen Risiko des Patienten für Tumore, basierend auf z. B. Erkrankungen in der Familie und DNA-Tests.
Menschliche anti-Tumor-Autoantikörper, die aus Serum eines gesunden betagten Menschen isoliert wurden und direkt oder in Form von menschlichen monoklonalen Antikörpern, die aus Zellen eines betagten Menschen stammen, verabreicht werden, sollten, falls überhaupt welche vorhanden sind, nur geringe toxische Wirkungen aufweisen.

Hinterlegung

Die den monoklonalen Antikörper 2C5 produzierende Hybridomkultur wurde am 22. Juni 1994 bei der ATCC in Rockville, Maryland, unter der Zugangsnummer ATCC CRL 11667 hinterlegt.
Die Kulturhinterlegung wird gemäß den Vorschriften des Budapester Abkommens für die Hinterlegung von Mikroorganismen gelagert und frei verfügbar sein, d. h., sie wird mit all der Sorgfalt gelagert werden, die nötig ist, um die Zellen für einen Zeitraum von wenigstens 5 Jahren nach der letzten Bestellung einer Probe der Hinterlegung lebensfähig und in einem nicht-kontaminierten Zustand zu erhalten, in jedem Fall für wenigstens 30 Jahre nach dem Hinterlegungsdatum oder für die durchsetzbare Dauer eines Patents, das die Offenbarung der Kultur erfordert, zuzüglich 5 Jahre nach der letzten Anforderung einer Probe der Hinterlegung. Der Hinterlegende verpflichtet sich, die Hinterlegung zu ersetzen, falls die Hinterlegungsstelle aufgrund des Zustands der Probe keine Probe bereitstellen kann. Alle Beschränkungen bezüglich der Verfügbarkeit der Kulturhinterlegung für die Öffentlichkeit werden unwiderrufbar bei Erteilung des Patents beseitigt.

Weitere Ausführungsformen

Obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit einer detaillierten Beschreibung offenbart wird, dient die vorstehende Beschreibung der Veranschaulichung und soll den Umfang der Erfindung nicht beschränken, der durch die beigefügten Ansprüche definiert wird.
Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen anti-Tumor-Autoantikörper auch als Stoffe zur Ansteuerung von Tumorzellen verwendet werden und können an bekannte anti-Tumor-bioaktive Wirkstoffe gebunden werden, um die natürliche anti-Tumorwirkung zu verstärken, die die Antikörper selbst besitzen.
Zum Beispiel können die Autoantikörper kovalent mit Cytotoxinen wie Saponin, Ricin, Ricin A-Kette, Abrin, Abrin A-Kette, Diphtherietoxin, Diphtherietoxin A-Kette, Exotoxin A-Kette, Daunomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Mytomycin C, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid, Colchicin, Cytochalasin B, Bleomycin, Vincristin, Vinblastin, und Methotrexat und anderen natürlichen und synthetischen käuflich verfügbaren Cytotoxinen (z. B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), die dem Fachmann bekannt sind, verknüpft werden.
Die Autoantikörper können auch mit Cytokinen wie Interleukinen, z. B. IL-2, Interferonen, z. B. gamma-Interferon, und Wachstumsfaktoren, z. B. GM-CSF (Genzyme, Cambridge, MA) verknüpft werden.
Der bioaktive Stoff kann durch eine spaltbare Bindung mit dem Antikörper verbunden werden, falls das Toxin von der Krebszelle aufgenommen wird, um eine Wirkung zu zeigen. Zum Beispiel ist die spaltbare Bindung bei Antikörper-Cytotoxin- oder Antikörper-Cytokin- Komplexen, die in das Cytoplasma der Zelle aufgenommen werden, enzymatisch labil (wie eine Peptidbindung) oder Hydrolyse-empfindlich durch Enzyme der extrazellulären Matrix. Die Bindung kann pH-labil bei Komplexen sein, die in die Umgebung mit einem niedrigen pH eines Lysosoms phagocytiert werden.
Der Antikörper wird direkt oder indirekt mit dem bioaktiven Stoff durch ein Trägermolekül wie Serumalbumin (insbesondere menschliches Serumalbumin), Polyaminosäuren und Dextran durch bekannte Verfahren verknüpft. Gebräuchliche Bindungen umfassen Disulfide, Imide, Hydrazone, Amide und ähnliches. Viele bioaktive Stoffe können mit dem Antikörper verbunden werden. Die vielen Stoffe können das gleiche Molekül oder ein Gemisch von mit dem Antikörper verbundenen Stoffen sein. Die Anzahl an mit dem Antikörper verbundenen Molekülen kann in Abhängigkeit der Größe des bioaktiven Stoffs unterschiedlich sein.
Der Autoantikörper-Cytotoxin- oder Autoantikörper-Cytokin-Komplex wird an den Säuger für die Hemmung von Tumorzellvermehrung, wie vorstehend für den Antikörper alleine beschrieben, verabreicht.

Claims

1. Zusammensetzung, fähig zur Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle in einem Säuger, wobei die Zusammensetzung einen antinukleären Autoantikörper umfasst, der spezifisch an (i) die Oberfläche von EL4 T-Lymphome, S49 T-Lymphome, P3/Ag8.653- Myelome und VERO-Tumorzellen und (ii) an ein Desoxyribonukleoprotein oder ein Antigen im Nukleus der Tumorzelle bindet und (iii) nicht an die Oberfläche normaler T-Zellen des Säugers bindet.

2. Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle in einem Säuger, wobei die Zusammensetzung einen antinukleären Autoantikörper umfasst, der spezifisch an (i) die Oberfläche von EL4 T-Lymphome, S49 T-Lymphome, P3/Ag8.653-Myelome und VERO- Tumorzellen und (ii) an ein Desoxyribonukleoprotein oder ein Antigen im Nukleus der Tumorzelle bindet und (iii) nicht an die Oberfläche normaler T-Zellen des Säugers bindet.

3. Zusammensetzung oder Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Autoantikörper ein im wesentlichen reiner, aus dem Serum eines betagten Säugers isolierter Autoantikörper ist.

4. Zusammensetzung oder Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei der betagte Säuger ein Mensch ist.

5. Zusammensetzung oder Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei der betagte Säuger eine Maus ist.

6. Zusammensetzung oder Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Tumorzelle eine menschliche Sarkom-, Myelom-, Karzinom- oder Lymphomzelle ist.

7. Zusammensetzung oder Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Autoantikörper ein von einem Hybridom einer Zelle eines betagten Säugers produzierter monoklonaler Antikörper ist.

8. Zusammensetzung oder Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei der betagte Säuger eine Maus ist.

9. Zusammensetzung oder Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei der betagte Säuger ein Mensch ist.

10. Hybridomzelllinie mit der ATCC Zugangsnummer CRL 11667.

11. Monoklonaler Antikörper 2C5, produziert von der Hybridomzelllinie gemäß Anspruch 10.

12. Verfahren zur Bestimmung, ob ein antinukleärer Autoantikörper zur Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle fähig ist, umfassend die Schritte:

(a) Testen der Bindung des Autoantikörpers an die Oberfläche von EL4 T-Lymphome, S49 T-Lymphome, P3/Ag8.653 Myelome und VERO-Tumorzellen;

(b) Testen der Bindung des Autoantikörpers an die Oberfläche einer normalen T-Zelle; und

(c) Testen der Bindung des Autoantikörpers an ein Desoxyribonukleoprotein oder ein Antigen im Nukleus der Tumorzelle, wobei der Autoantikörper zur Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle fähig ist, falls er positiv bezüglich der Schritte (a) und (c) und negativ bezüglich des Schritts (b) ist.

13. Verfahren zur Gewinnung eines antinukleären Autoantikörpers, der das Wachstum einer Tumorzelle hemmt, umfassend:

(a) Herstellung einer Affinitätssäule, umfassend ein nukleäres Antigen als Ligand;

(b) Passagieren von Seren durch die Säule zur Bindung von antinukleären Autoantikörpern;

(c) Freisetzung der gebundenen antinukleären Autoantikörper von der Säule; und sodann

(d) Testen der Bindung des Autoantikörpers an die Oberfläche von EL4 T-Lymphome, S49 T-Lymphome, P3/Ag8.653-Myelome und VERO-Tumorzellen;

(e) Testen der Bindung des Autoantikörpers an die Oberfläche einer normalen Zelle; und

(f) Testen der Bindung des Autoantikörpers an ein Desoxyribonukleoprotein oder ein Antigen im Nukleus der Tumorzelle, wobei der Autoantikörper zur Hemmung des Wachstums einer Tumorzelle fähig ist, falls er positiv bezüglich der Schritte (d) und (f) und negativ bezüglich des Schritts (e) ist.

14. Isolierter antinukleärer Autoantikörper, der das Wachstum einer Tumorzelle hemmt, wobei der Autoantikörper spezifisch an (i) die Oberfläche von EL4 T-Lymphome, S49 T-Lymphome, P3/Ag8.653-Myelome und VERO-Tumorzellen und (ii) an ein Desoxyribonukleoprotein oder ein Antigen im Nukleus der Tumorzelle bindet und (iii) nicht an die Oberfläche normaler T-Zellen des Säugers bindet.

15. Isolierter antinukleärer Autoantikörper gemäß Anspruch 14, wobei der antinukleäre Autoantikörper aus einem betagten Säuger erhalten wird.

16. Isolierter antinukleärer Autoantikörper gemäß Anspruch 14, wobei der antinukleäre Autoantikörper aus einem Hybridom erhalten wird, das mit Zellen aus einem betagten Säuger hergestellt wird.