DE3783277T2 - Monoklonaler antikoerper gegen humanes lungenkarzinom. - Google Patents

Monoklonaler antikoerper gegen humanes lungenkarzinom.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoclonalen Antikörper gegen menschliches Lungencarcinom, der zur pathologischen und serologischen Diagnose von Lungenkrebs nützlich ist.
  • Kürzlich wurden monoclonale Antikörper beschrieben, die befähigt sind, mit verschiedenen menschlichen Krebsarten, einschließlich Lungenkrebs, spezifisch zu reagieren, vgl. z.B. Cancer Res. 42 (1982), 150; Cancer Res. 42 (1982), 3187; J. Surgical Res. 30 (1981), 403; Transplantation Proced. XIII (4) (1981), 1942; J. Immunol. 131, (1), (1983), 497; Abstracts of Papers, Japan Society of Immunology, S. 212 (Abstract Nr. 107), (1983); Cancer Res. 46 (1986), 4438, und Cancer Res. 47 (1987), 1267. Darüberhinaus sind monoclonale Antikörper bekannt, die für mehr als einen Lungenkrebstyp spezifisch sind, vgl. z.B. EP-A-0156578, worin monoclonale Antikörper beschrieben werden, die befähigt sind, mit Lungen-Plattenepithelcarcinom-Gewebe, Lungen-Adenocarcinom-Gewebe und fetalen Lungenzellen zu reagieren, und EP-A-0232871 (veröffentlicht nach dem Prioritätstag der vorliegenden Erfindung), worin monoclonale Antikörper beschrieben werden, die befähigt sind, mit Lungen-Plattenepithelcarcinom, Lungen- Adenocarcinom und großzelligem Lungencarcinom, nicht aber mit kleinzelligem Lungencarcinom zu reagieren. Die relativen Reaktivitäten sind jedoch in keinem Fall angegeben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt dagegen monoclonale Antikörper bereit, die mit kleinzelligem Carcinom nicht reaktiv sind, die jedoch befähigt sind, gleichermaßen mit den drei Gewebetypen des menschlichen Lungenkrebses zu reagieren, d.h. dem Plattenepithelcarcinom, dem Adenocarcinom und dem großzelligen Carcinom. Solche Antikörper sind für die Diagnose von Lungenkrebs besonders nützlich.
  • Erfindungsgemäß wurde ein monoclonaler Antikörper gegen menschlichen Lungenkrebs produziert, der befähigt ist, mit menschlichem Plattenepithelcarcinom, Lungen-Adenocarcinom und großzelligem Lungencarcinom mit hoher Frequenz zu reagieren, der jedoch nicht-reaktiv ist mit menschlichem kleinzelligem Lungencarcinom und normalen menschlichen Lungenzellen. Der betreffende Antikörper ist befähigt, Glycoproteine all Antigen zu erkennen, und zählt zur IgM-Klasse. Daher ist der Antikörper zum Nachweis von Lungen-Plattenepithelcarcinom, Lungen- Adenocarcinom und großzelligem Lungencarcinom nützlich und kann für die pathologische, serologische und Pleuraerguß-Diagnose solcher Erebstypen verwendet werden. Der Antikörper wird durch die nachstehend beschriebene Hybridomzellinie SLC-454 produziert, die unter dem Budapester Vertrag bei der "European Collection of Animal Cell Cultures", Großbritannien, am 3. Juli 1986 unter der ECACC-Hinterlegungsnummer 86070306 hinterlegt worden ist.
  • Nachstehend wird ein ausführliches Protokoll zur Produktion der erfindungsgemäßen Antikörper wiedergegeben:
    • (1) Immunisierung und Herstellung von Antikörper-produzierenden Zellen
  • Mäuse im Alter von 3 bis 10 Wochen, vorzugsweise 8 Wochen, werden mit menschlichen Lungen-Plattenepithelcarcinom- Zellen, -Gewebeproben oder Membranfraktionen immunisiert, um die Erzeugung von Antikörper-produzierenden Zellen in der Milz, in den Lymphknoten und im peripheren Blut von immunisierten Mäusen zu induzieren. Vorzugsweise sollten Mäuse verwendet werden, die infolge einer Vorbehandlung mit normalen menschlichen Lungenzellen immunologisch tolerant gemacht worden sind. Die Immunisierung wird im allgemeinen durchgeführt, indem menschliche Lungen-Plattenepithelcarcinom-Zellen (10&sup6; bis 10&sup7; Zellen pro Tier), menschliches Lungen-Plattenepithelcarcinom-Gewebe oder aus einem solchen Gewebe stammende Kernbranbruchstücke (10 bis 500 ug pro Tier) zusammen mit einem geeigneten Adjuvans (z.B. vollständigem Freundschem Adjuvans oder Aluminiumhydroxidgel plus B. pertussis-Impfstoff) den Tieren subcutan, intravenös oder intraperitoneal verabreicht wird. Danach wird die Antigenverabreichung ohne ein Adjuvans zwei- bis fünfmal in ein- bis zweiwöchigen Abständen wiederholt. Drei bis sieben Tage nach jeder Immunisierung werden Blutproben aus dem Venengeflecht des Augenhintergrundes genommen und das Serum jeder Probe beispielsweise mit dem nachstehend dargestellten Enzym-Immuntest-Verfahren ["Enzyme- linked Immunosorbent Assay" (ELISA), veröffentlicht von Igaku Shoin, Tokyo, 1976] daraufhin getestet, ob es mit menschlichem Lungen-Plattenepithelcarcinom reagiert.
  • Die normalen menschlichen Gewebe und die Tumorgewebe, die zur Vorbehandlung und Immunisierung verwendet werden, können aus Autopsien oder Operationen erhalten werden. Die Gewebeproben werden sofort eingefroren und bei -80ºC gelagert. Zum Erhalt einer Suspension von Bruchstücken dieser Gewebeproben werden sie bei 4ºC in PBS, enthaltend 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, aufgetaut. Nach Zerkleinerung werden die Gewebezellen mit einer Ultra-Dispergierapparatur (LK-21; Yamato, Tokyo, Japan) aufgebrochen und mit einem Teflon-Glas- Homogenisator (Teflon ist ein eingetragenes Warenzeichen) homogenisiert. Das Homogenisat wird bei 100 000 x g zentrifugiert und anschließend das Pellet mit 1 mg Protein in 1 ml PBS resuspendiert und bei -80ºC gelagert.
    • Enzym-Immuntest (EIA)-Verfahren
  • Suspensionen, umfassend Membranbruchstücke von normalen oder Tumor-Zellen oder -Geweben, die 10 bis 1 000 ug Protein pro ml enthalten, werden zuerst in Vertiefungen einer EIA- Platte mit 96 Vertiefungen (Produkt von Flow Laboratories) verteilt (100 bis 200 ul pro Vertiefung). Nachdem die Suspensionen in den Vertiefungen über Nacht bis zu zwei Nächte bei 4ºC stehen gelassen wurden, wird der Uberstand aus jeder Vertiefung entfernt und jede Vertiefung mit entionisiertem Wasser oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; 1,83 g Dinatriumphosphat, 0,21 g Monokaliumphosphat und 7,65 g Natriumchlorid pro Liter destilliertem Wasser, pH 7,2) gründlich gewaschen. Anschließend wird 1% BSA(Rinderserumalbumin)- PBS in die Vertiefungen verteilt (100 bis 200 ul pro Vertiefung), wodurch die auf der Platte verbliebenen Proteinbindungsstellen blockiert werden, indem man die Kultur über Nacht bis zu zwei Nächte bei 4ºC stehen läßt. Nach Abgießen der BSA-PBS werden die Vertiefungen gründlich mit entionisiertem Wasser oder PBS gewaschen. Sodann werden Proben (Maus- Seren, Hybridomkultur-Überstände oder grob gereinigte monoclonale Antikörper; jeweils als der erste Antikörper) mit BSA- PBS verdünnt und die Verdünnungen in die Vertiefungen verteilt (100 ul pro Verteifung), anschließend werden sie über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Nachdem die Vertiefungen einmal mit entionisiertem Wasser und sodann sechsmal mit 2 M NaCl-Lösung gewaschen wurden, wird eine 100-fache Verdünnung des Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin-IgG-Peroxidasekonjugats (hergestellt von DAKO und vertrieben von Kyowa Medex; verwendet als der zweite Antikörper) in die Vertiefungen verteilt (100 ul pro Vertiefung). Sodann wird die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
  • Nach gründlichem Waschen mit PBS wird eine ABTS-Substratlösung [hergestellt durch Lösen von 550 mg des Diammoniumsalzes der 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) in 1 Liter 0,1 M Citratpuffer (pH 4,2) und unmittelbar vor Verwendung Zugabe von Wasserstoffperoxid bis zu einer Konzentration von 1 ul/ml] hinzugefügt und die entwickelte Farbe mittels der Absorbanz OD415nm gemessen. Diejenigen Mäuse, deren Proben mit den Lungen-Plattenepithelcarcinom-Zellen, -Geweben oder Membranpräparaten stark reagieren, werden als die mit menschlichem Lungen-Plattenepithelcarcinom immunisierten Mäuse, d.h. als Quelle für die Lieferung von Antikörper-produzierenden Zellen zur Hybridomherstellung verwendet.
  • Wenn bei Durchführung des Enzym-Immuntests Zellen als solche als Antigen verwendet werden, werden die Zielzellen auf einer Falcon 3072-Platte gezüchtet, sodann wird 0,25% Glutaraldehyd-PBS hinzugefügt und die Platte nach ein- bis zweistündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur gründlich mit PBS gewaschen. Sodann werden 100 bis 200 ul 1% BSA-PBS pro Vertiefung hinzugefügt und die Platte nach zweistündigem Stehenlassen mit entionisiertem Wasser oder PBS gründlich gewaschen und einer Antikörpertiter-Bestimmung unterworfen, die auf die gleiche Art und Weise wie bei Verwendung einer gewöhnlichen, mit Antigen beschichteten Platte durchgeführt wird.
  • Zur Durchführung der Zellfusion werden menschliche Lungen-Plattenepithelcarcinom-Zellen, -Gewebeproben oder Membranpräparate den immunisierten Mäusen in einer Dosis von 2 bis 5 x 10&sup6; Zellen pro Tier oder 20 bis 400 ug pro Tier drei bis vier Tage vor der Fusionsbehandlung intraperitoneal verabreicht. Die Milz wird entfernt, in MEM (Produkt von Nissui Pharmaceuticals) in Stücke geschnitten, mit einer Pinzette zerkleinert und fünf Minuten bei 1 200 UpM zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Sediment ein bis zwei Minuten mit Tris-Ammoniumchlorid-Puffer (pH 7,65) behandelt, um vorliegende Erythrocyten zu entfernen. Die Erythrocyten-freien Zellen werden sodann dreimal mit MEM gewaschen und sind danach gebrauchsfertig für das Fusionsverfahren zur Erzeugung von Hybridomen.
    • (2) Herstellung von Myelomzellen
  • Eine von der Maus stammende, bestehende Myelomzellinie wird verwendet. Beispiele solcher Zellinien, die verwendet werden können, umfassen die 8-Azaguanin-resistenten Maus (von Balb/c stammenden)-Myelomzellinien P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology-1], P3-NSI/ 1- Ag4.1 (NS-1) [European J. Immunology 6 (1976), 511-519], SP2/0-Ag14 (SP-2) [Nature 276 (1978), 269-270], P3-X63-Ag8 653 (653) [J. Immunology 123 (1979), 1548-1550] und P3-X63-Ag8 (X63) [Nature 256 (1975), 495-497]. Diese Zellinien werden in 8-Azaguanin-Medium gezüchtet [normales Medium, hergestellt, indem RPMI-1640-Medium mit Glutamin (1,5 mM), 2-Mercaptoethanol (5 x 10&supmin;&sup5; M), Gentamycin (10 ug/ml), und fetalem Kälberserum (FCS; hergestellt von CSL) (10%) versetzt und außerdem mit 8-Azaguanin (15 ug/ml) angereichert wird). Die Zellinie für die Zellfusion sollte drei bis vier Tage vor der Fusion auf normales Medium überführt werden, um zur Zeit der Zellfusion eine Zellzahl von nicht weniger als 2 x 10&sup7; sicherzustellen.
    • (3) Zellfusion
  • Die wie in (1) erhaltenen immunisierten Splenocyten und die in (2) erhaltenen Myelomzellen werden mit MEM oder PBS gewaschen und in einem Zellzahlverhältnis von Splenocyten : Myelomzellen im Bereich von 5:1 bis 10:1 gemischt, sodann wird das Gemisch zentrifugiert (1200 UpM, 5 minuten). Der Überstand wird verworfen und das Zellsediment aufgebrochen. Unter Rühren wird bei 37ºC ein Gemisch aus 2 g Polyethylenglycol 1000 (PEG- 1000), 2 ml MEM und 0,7 ml Dimethylsulfoxid in einer Menge 0,2 bis 1 ml pro 10³ Splenocyten hinzugefügt, sodann wird nach mehreren Zugaben von 1 bis 2 ml MEM in Abständen von 1 bis 2 Minuten MEM bis zum Erhalt eines Volumens von insgesamt 50 ml zugefügt. Nach Zentrifugation (900 UpM, 5 Minuten) wird der Überstand verworfen und das Zellsediment vorsichtig aufgebrochen. Die Zellen werden mit 100 ml normalem Medium (RPMI-1640 mit 10% FCS) versetzt und im Medium durch leichtes Rühren suspendiert.
  • Die erhaltene Suspension wird in Portionen zu je 1 ml in die Vertiefungen einer Inkubationsplatte mit 24 Vertiefungen verteilt. Die Inkubation wird 24 Stunden bei 37ºC in einem 5% CO&sub2;-Inkubator durchgeführt. HAT-Medium [normales Medium, angereichert mit Hypoxanthin (10&supmin;&sup4; M), Thymidin (1,5 x 10&supmin;&sup5; M) und Aminopterin (4 x 10&supmin;&sup7; M)) wird zur Inkubationsplatte zugefügt (1 ml pro Vertiefung) und die Inkubation weitere 24 Stunden durchgeführt. Danach wird zwei Tage lang im Abstand von 24 Stunden 1 ml des Kulturüberstandes verworfen und das gleiche Volumen frisches HAT-Medium hinzugefügt. Die Inkubation im CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC wird 10 bis 14 Tage fortgesetzt.
  • In denjenigen Vertiefungen, in denen gewachsene fusionierte koloniebildende Zellen gefunden werden, wird 1 ml des Überstandes verworfen und das gleiche Volumen HT-Medium (HAT- Medium minus Aminopterin) zugefügt, sodann wird zwei Tage lang im Abstand von 2 Stunden das Medium durch frische Portionen HT-Medium ersetzt.
  • Nach drei bis vier Tagen Züchtung in HT-Medium wird eine Portion Kulturüberstand abgenommen und mit dem vorstehend erwähnten Enzym-Immuntest-Verfahren auf Antikörpertiter gegen menschliches Lungencarcinom getestet. Gleichzeitig werden auch die Reaktivitäten mit normalen menschlichen Zellen oder Geweben und Membranpräparaten davon u.a. durch ein ähnliches Verfahren bestimmt und diejenigen Vertiefungen ausgewählt, bei denen eine selektive Reaktivität mit menschlichen Lungencarcinom-Zellen oder -Geweben oder Membranpräparaten davon beobachtet wird. Bei Vertiefungen, die eine starke Reaktivität mit menschlichen Lungencarcinom-Zellen oder -Geweben oder Membranpräparaten davon, jedoch keine Reaktivität mit normalen menschlichen Zellen oder Geweben oder Membranpräparationen davon u.a. zeigen, wird die Clonierung mittels limitierendem Verdünnungsverfahren zweimal wiederholt. Auf diese Weise werden diejenigen Clone, für die hohe Antikörpertiterwerte gegen menschliche Lungencarcinom-Zellen oder -Gewebe oder Membranpräparate davon stabil erhältlich sind, als diejenigen Hybridomzellinien ausgewählt, welche monoclonale Antikörper gegen menschliches Lungencarcinom produzieren.
    • (4) Herstellung von monoclonalen Antikörpern
  • Weibliche, nackte Balb/c-Mäuse im Alter von acht bis zehn Wochen, die mit Pristan behandelt wurden [intraperitoneale Verabreichung von 0,5 ml 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (Pristan) und ein bis zwei Wochen Fütterung], erhalten intraperitoneale Injektionen mit den im vorstehenden Verfahren (3) erhaltenen Hybridomzellen, die monoclonale Antikörper gegen menschliches Lungencarcinom produzieren, in einer Dosierung von 2 bis 4 x 10&sup6; Zellen pro Tier. Innerhalb von 10 bis 21 Tagen erzeugen die Hybridomzellen in den Mäusen Ascitescarcinome. Die Ascitesflüssigkeit wird gesammelt, zur Entfernung von Feststoffen zentrifugiert (3000 UpM, 5 Minuten), dem Aussalzen mit 50% Ammoniumsulfat unterworfen, gegen einen mit NaCl (0,5 M) angereicherten Phosphatpuffer dialysiert und mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 15 ml/Stunde durch eine mit Sephacryl S-300 (Produkt von Pharmacia Fine Chemical) gefüllte Säule (Bettvolumen 750 ml) geleitet. Eine IgM-Fraktion wird gesammelt und als gereinigter monoclonaler Antikörper verwendet.
  • Der Antikörper-Isotyp wird nach dem Ouchterlony-Verfahren bestimmt (doppelte Immundiffusion) [Seibutsukagaku Jikkenho (Methods in Experimental Biochemistry), Bd. 15, Introduction to Experimental Immunology, S. 74, Gakkai Shuppan Center, 1981].
  • Die Proteinmenge wird nach dem Folin-Verfahren bestimmt und anschließend aufgrund der Absorption bei 280 nm berechnet [1,4 (OD&sub2;&sub8;&sub0;) entspricht etwa 1 mg Immunglobulin pro ml].
  • Die auf diese Weise erhaltenen monoclonalen Antikörper werden auf Kennzeichen der Spezifität untersucht, wobei (1) die Reaktivität mit normalen oder Tumorgeweben und Membranfraktionen davon, die aus verschiedenen menschlichen Organen stammen, welche von einer Vielzahl von Patienten erhalten wurden, (2) die Reaktivität mit verschiedenen normalen menschlichen oder Tumor-Zellinien oder menschlichen fetalen Zellinien und daraus stammenden Membranpräparaten, (3) die Reaktivität mit dem bis jetzt bekannten carcinoembryonalen Antigen (z.B., CEA) und (4) die Reaktivität mit Seren, die von normalen Individuen und von Patienten stammen, und dgl., durch ein geeignetes Testverfahren bestimmt wird, z.B. durch das Enzym- Immuntest-Verfahren, das Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren, das immunhistochemische Färbeverfahren (ABC-Verfahren) usw.. Diejenigen monoclonalen Antikörper werden ausgewählt, die nur mit menschlichem Lungencarcinom reagieren und in den vorstehend angegebenen Tests keine Reaktivität zeigen.
  • Man nimmt an, daß die auf diese Weise erhaltenen monoclonalen Antikörper, die mit menschlichem Lungencarcinom spezifisch reagieren, bei der Diagnose von Lungencarcinom durch serologische Untersuchung, histologische Untersuchung, bildliches Darstellen usw., oder bei der Behandlung von Lungencarcinom nützlich sind, umfassend die Verabreichung der Antikörper wie sie sind oder in Form der sogenannten Immuntoxine, d.h. Konjugate mit Antikrebsmitteln oder Toxinen, an Krebspatienten. Man vermutet ferner, daß diese tumorspezifischen monoclonalen Antikörper, wenn sie in Affinitätssäulen eingesetzt werden, zur Reinigung von tumorspezifischen Antigenen, zur Analyse solcher Antigene und außerdem zur Entwicklung von Impfstoffen gegen Lungencarcinom verwendet werden könnten.
    • (5) Immunhistochemisches Färbeverfahren (ABC-Verfahren)
  • Das folgende Verfahren wird gemäß dem nachstehend beschriebenen Immuno-Peroxidase-Test durchgeführt, wobei ein Vectastain ABC-Kit (Produkt von Vector Laboratories, Burlingame, California) verwendet wird.
  • Die mit Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten, unter Verwendung eines Mikrotoms auf eine Dicke von 5 um geschnittenen Gewebeschnitte werden auf einen mit Eiweißalbumin beschichteten Glasobjektträger aufgebracht, in Xylol entwachst und nach und nach mit Alkohol/Wasser hydratisiert.
  • Nach fünfminütigem Waschen mit entionisiertem Wasser wird die endogene Peroxidase durch dreißigminütiges Eintauchen in 0,3% (Gew./Vol.) Wasserstoffperoxid in absolutem Methanol bei Raumtemperatur blockiert. Die Schnitte werden 20 Minuten mit einem Phosphatpuffer gewaschen und 20 Minuten bei Raumtemperatur mit verdünntem normalem Pferdeserum inkubiert. Das überschüssige Serum wird abgesaugt und SLC-454 (20 ug/ml) als der erste Antikörper zugefügt. Der Glasobjektträger wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit PBS gewaschen. Ein biotinylierter Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper vom Pferd wird zu den Schnitten hinzugefügt und der Glasobjektträger 30 Minuten stehengelassen und anschließend mit PBS gewaschen.
  • Sodann wird eine Avidin-Biotin-Peroxidase (ABC-Reagens) zu den Schnitten zugegeben und das Ganze 30 Minuten stehengelassen und anschließend mit PBS gewaschen. Danach werden die Schnitte 2 Minuten in einer Peroxidase-Substratlösung (Gemisch aus 0,02% Wasserstoffperoxid und 0,1% Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid in 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,2) inkubiert, die Reaktion wird gestoppt, indem der Glasobjektträger in eiskaltes Wasser getaucht wird. Die Schnitte werden mit Hämatoxylin kontrastgefärbt, in wässerigem Alkohol und Xylol entwässert und in Canada-Balsam eingebettet [Rinshokensa 28 (1984), 353].
    • (6) Serumdiagnose von Lungencarcinom
  • Die Serumdiagnose wird folgendermaßen durchgeführt:
  • Ein erstes Antikörperpräparat (10 bis 100 ug/ml) wird in die Vertiefungen einer EIA-Platte mit 96 Vertiefungen verteilt (50 bis 200 ul pro Vertiefung). Die Platte wird bei 4ºC über Nacht bis zu zwei Nächte oder bei Raumtemperatur zwei bis vier Stunden stehengelassen. Nach Waschen mit PBS werden in jede Vertiefung 200 ul BSA-PBS hinzugefügt, anschließend wird die Platte über Nacht bei 4ºC oder zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird die Platte gründlich mit PBS gewaschen und in jede Vertiefung 50 bis 100 ul einer 1- bis 100-fachen Verdünnung einer Serumprobe hinzugefügt. Nach Stehenlassen der Platte über Nacht bei 4ºC oder zwei Stunden bei Raumtemperatur wird sie gründlich mit PBS gewaschen. Anschließend wird in die Vertiefungen ein mit Biotin oder Peroxidase markierter zweiter Antikörper (10 bis 100 ug/ul) zugegeben (50 bis 100 ul pro Vertiefung) und die Platte wiederum über Nacht bei 4ºC oder zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Wenn ein Biotin-markierter Antikörper als der zweite Antikörper verwendet wird, wird die Platte gründlich mit PBS gewaschen, sodann Avidin-Blotin-Peroxidase (10 ug/ul) in die Vertiefungen hinzugefügt (50 bis 100 ul pro Vertiefung) und die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend gründlich mit PBS gewaschen. Sodann wird als Substratlösung eine ABTS-Substratlösung in einer Menge von 50 bis 100 ul pro Vertiefung zugefügt. Nach zehn- bis zwanzigminütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird die Reaktion beendet, indem eine 5% SDS-Lösung in einer Menge von 50 bis 100 ul pro Vertiefung zugegeben wird. Der OD&sub4;&sub1;&sub5;-Wert wird für jede Vertiefung gemessen und die Antigenmenge in der Serumprobe aufgrund der Intensität der entwickelten Farbe berechnet. Durch Vergleichen der Antigenspiegel in den Seren von gesunden Individuen und derjenigen in den Seren von Patienten mit Lungencarcinom wird ein Normalbereich des Spiegels definiert. Wenn der betreffende Spiegel einen solchen vorher bestimmten Bereich übersteigt, wird der Test auf Lungencarcinom als positiv eingestuft.
    • (7) Antigenanalyse
  • Bei Durchführung des Immuntests, der immunhistochemischen Färbung oder Serumdiagnose, die vorstehend erwähnt sind, werden die Antigene (Lungen-Plattenepithelcarcinom-Membranpräparate, gezüchtete Lungencarcinom-Zellinien, Lungenkrebs-Gewebe) mit Reagentien, wie z.B. Enzymen (z.B. Neuraminidase, Protease) und Natriumperjodat, vorbehandelt und sodann mit den monoclonalen Antikörpern umgesetzt. Wenn man anschließend die unterschiedlichen Reaktivitäten vergleicht, welche die Originalantigene ohne eine solche Vorbehandlung und die in der vorstehenden Art und Weise vorbehandelten Antigene mit den monoclonalen Antikörpern aufweisen, kann man die chemische Beschaffenheit der antigenen Stellen zeigen, welche von den monoclonalen Antikörpern erkannt werden. Das heißt, falls die Antigenität bei Behandlung mit Neuraminidase verschwindet, kann man annehmen, daß Sialinsäuren mit den antigenen Determinanten in Zusammenhang stehen. Falls die Antigenität bei Behandlung mit Protease verschwindet, kann man annehmen, daß Proteine mit den antigenen Determinanten in Zusammenhang stehen. Falls die Antigenität bei Behandlung mit Natriumperjodat verschwindet, stehen vermutlich Zuckerketten mit den antigenen Determinanten in Zusammenhang.
    • (8) Beurteilung mittels kompetetivem Bindungs-Hemmungs-Test, ob SLC-454 sich von den bekannten Krebsmarkern unterscheidet oder nicht
  • Die auf eine EIA-Platte beschichteten Lungencarcinom-Membranpräparate werden mit 1% BSA-Lösung blockiert und mit seriellen Verdünnungen von SLC-454, Kaninchen-Anti-CEA-Antikörper, Kaninchen-Anti-AFP-Antikörper und Kaninchen-Anti-β&sub2;-Microglobulin-Antikörper versetzt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wird die Platte gründlich mit PBS gewaschen. Sodann wird Biotin-markierter SLC-454 hinzugefügt und die Platte drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Waschen wird Avidin-Biotin-Peroxidase (Vectastain ABC Immunoperoxidase Staining Kit; Produkt von Vector) zugegeben und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wird eine ABTS-Substratlösung zugefügt und für jede Vertiefung die Absorption bei 415 nm gemessen.
  • Wenn der erste Antikörper das gleiche Antigen (Epitop) erkennt, das SLC-454 erkennt, dann ist die Bindungsstelle des als zweiter Antikörper eingesetzten Biotin-markierten SLC-454 durch den ersten Antikörper besetzt, aus diesem Grund kann der zweite Antikörper nicht an das Antigen gebunden werden und die Entwicklung der Farbe wird verhindert. Wenn dagegen im vorstehenden Verfahren die Bindung des zweiten Antikörpers (Biotin-markierter SLC-454) nicht durch den ersten Antikörper verhindert wird, kann man demgemäß vermuten, daß SLC-454 ein anderes Antigen als der erste Antikörper erkennt.
  • Die Herstellung und die Eigenschaften des erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers werden in den nachstehenden Beispielen und den begleitenden Zeichungen ausführlicher beschrieben und erläutert, wobei:
  • in Figur 1 ein Streuungsbild dargestellt ist, das die Ergebnisse von Serumdiagnosen auf Lungencarcinom unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers SLC-454 zeigt;
  • in Figur 2 die Analysenergebnisse der Antigene graphisch dargestellt sind, die vom monoclonalen Antikörper SLC-454 erkannt werden.
  • In Figur 2 werden die Symbole folgendermaßen verwendet:
  • für Behandlung mit 0,1 E/ml Neuraminidase,
  • Δ für Behandlung mit 0,1 E/ml α-L-Fucosidase,
  • für Behandlung mit 0,25% Trypsin,
  • für Behandlung mit 10 E/ml Protease,
  • für Behandlung mit 50 nM NaIO&sub4; und
  • × für keine Behandlung.
  • Figur 3 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, ob die Bindungsaktivität des monoclonalen Antikörpers SLC-454 durch bekannte Tumormarker gehemmt wird oder nicht.
  • In Figur 3 werden die Symbole folgendermaßen verwendet:
  • Δ für SLC-454,
  • für Kaninchen-Anti-CEA-Antikörper,
  • für Kaninchen-Anti-AFP-Antikörper und
  • für Kaninchen-Anti-Beta&sub2;-Microglobulin-Antikörper.
    • Beispiel 1 (1) Herstellung von Antikörper-produzierenden Zellen
  • Membranpräparate von normalem menschlichem Lungengewebe wurden neugeborenen (Balb/c x C57BL/6)F&sub1;-Mäusen innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt in einer Dosierung von 100 ug Protein pro Tier intravenös verabreicht. Nach einem Zeitraum von 8 Wochen erhielten die Mäuse intraperitoneale Verabreichungen von Membranpräparaten von menschlichem Lungen-Plattenepithelcarcinom (100 ug Protein pro Tier) zusammen mit Aluminiumhydroxidgel (2 mg pro Tier) und abgetötetem B. pertussis-Impfstoff (1 x 10&sup9; pro Tier), darauf folgten 3 bis 5 Immunisierungen mit dem gleichen Antigen aber ohne Adjuvans in einer Dosierung von 100 ug pro Tier, bezogen auf Protein, in Abständen von ein bis zwei Wochen. Von diesen immunisierten Mäusen wurden diejenigen Mäuse als immunisierte Mäuse ausgewählt, deren Antisera mit menschlichen Lungencarcinom-Zellen oder -Geweben oder davon hergeleiteten Membranpräparaten stark reagierten, sodann wurden Milzzellen dieser Mäuse präpariert und der Zellfusion unterworfen.
    • (2) Herstellung von Myelomzellen
  • Die 8-Azaguanin-resistente Mausmyelom-Zellinie P3-U1 wurde in normalem Medium entsprechend gezüchtet, daß zur Zeit der Zellfusion nicht weniger als 2 x 10&sup7; Zellen vorlagen, und als ein Elterstamm der Zellfusion unterworfen.
    • (3) Hybridom-Herstellung
  • Die in (1) bzw. (2) erhaltenen Milzzellen und Myelomzellen wurden in einem Verhältnis von 5:1 verwendet und der Fusion unterworfen, wobei das vorstehend erwähnte Verfahren angewendet wurde. Nach 14-tägiger Züchtung in HAT-Medium bei 37ºC unter 5% CO&sub2; wurden die fusionierten Zellen in HAT-Medium selektiert und nach Wechsel des Mediums auf HT-Medium weiter gezüchtet. Aufgrund der Ergebnisse der Bestimmung der Antikörpertiter gegen menschliches Lungencarcinom wurden aktive Vertiefungen ausgewählt und nach Wechsel des Mediums auf normales Medium die Clonierung zweimal wiederholt. Auf diese Weise wurde die Hybridomzellinie SLC-454 ausgewählt, die keine Reaktivität mit normalen menschlichen Zellen oder Geweben oder anderen Krebstypen aufweist, die aber eine spezifische Reaktivität mit menschlichem Lungencarcinom aufweist, was durch verschiedene Testverfahren bestimmt wurde.
    • (4) Reinigung der monoclonalen Antikörper
  • Mit Pristan behandelte, nackte, weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 8 Wochen erhielten intraperitoneale Injektionen der in (3) erhaltenen Hybridomzellinie SLC-454 in einer Dosierung von 4 x 10&sup6; Zellen pro Tier. Innerhalb von 10 bis 21 Tagen erzeugten die Hybridome Ascitescarcinome. Ascitesflüssigkeit wurde von den die Ascitesflüssigkeit enthaltenden Mäusen (5 bis 10 ml pro Tier) gesammelt, durch Zentrifugation (3000 UpM, 5 Minuten) von Feststoffen gereinigt, einem Aussalzen mit 50% Ammoniumsulfat unterworfen, gegen PBS, angereichert mit NaCl (0,5 M), dialysiert und mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 15 ml pro Stunde durch eine mit Sephacryl S-300 (Produkt von Pharmacia Fine Chermcal) gefüllte Säule (Bettvolumen 750 ml) geleitet. Eine IgM-Fraktion wurde gesammelt und als gereinigter Antikörper verwendet.
    • (5) Spezifität von SLC-454
  • Die Reaktionsspezifität des auf diese Weise erhaltenen, gegen Lungencarcinom spezifischen, monoclonalen Antikörpers SLC-454 ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Ziel Antikörper SLC-454 Anzahl der positiven Ergebnisse zu Testproben insgesamt Affinitätsanalyse (ELISA) Gewebe-Membrankomponente Lungen-Plattenepithelcarcinom Lungen-Adenocarcinom Großzelliges Lungencarcinom Normale Lunge Normales anderes Gewebe als Lunge* gereinigtes Antigen gezüchtete Zellinien Kleinzelliges Lungencarcinom Fetale Lunge Andere Krebsarten als Lungenkrebs** Normale Lungenzelle *Magen, Leber, Niere, Pankreas, Gallenblase, Herz, Dickdarm, Dünndarm ** Eine von zwei Pankreaskrebs-Zellinien und eine von drei Magenkrebs-Zellinien wurden gefärbt.
    • Beispiel 2
  • Verschiedene Krebsgewebe wurden immunhistochemisch angefärbt, wobei der in Beispiel 1 erhaltene monoclonale Antikörper SLC-454 verwendet wurde. Auf diese Weise wurden in Paraffin eingebettete Blockschnitte gefärbt, die von sieben Patienten mit Lungen-Plattenepithelcarcinom, sieben Patienten mit Lungen-Adenocarcinom, fünf Patienten mit großzelligern Lungencarcinom, drei Patienten mit kleinzelligem Lungencarcinom, vier Patienten mit Magenkrebs, drei Patienten mit Hepatorn, einem Patienten mit Pankreaskrebs, einem Patienten mit Rectumkrebs, einem Patienten mit Leukämie, einem Patienten mit Gallengangkrebs, einem Patienten mit Harnblasenkrebs, einem Patienten mit Neuroblastom, einer Patientin mit Uteruskrebs und einem Patienten mit Gaumenkrebs stammten. Außerdem wurden verschiedene normale Gewebetypen von Erwachsenen oder fetale Gewebetypen immunhistochemisch angefärbt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Tumortyp SLC-454 Anzahl der positive Testergebnisse zu Testproben insgesamt Lungen-Plattenepithelcarcinom Lungen-Adenocarcinom Großzelliges Lungencarcinom Kleinzelliges Lungencarcinom Magenkrebs Hepatom Pankreaskrebs Rectumkrebs Leukämie Gallengangkrebs Blasenkrebs Neuroblastom Uteruskrebs Gaumenkrebs
  • Normale Gewebetypen von Erwachsenen und fetale Gewebetypen (Lungen, Milz, Magen, Dickdarm, Dünndarm, Herz, Leber, Niere, Knochenmark, Schilddrüse, Gehirn, Pankreas) ergaben negative Ergebnisse.
    • Beispiel 3
  • Eine Suspension von SLC-454 (10 ug/ml) wurde in Portionen zu je 50 ul in die Vertiefungen einer EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (Produkt von Flow Laboratories) verteilt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde die Platte mit PBS gewaschen. Sodann wurde 1% BSA-PBS hinzugefügt (200 ul pro Vertiefung). Nach Stehenlassen über Nacht wurde die Platte gründlich mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 20-fache Verdünnungen von Seren in einer Menge von 100 ul pro Vertiefung zugegeben, die zum einen von normalen Individuen (65 Proben), zum anderen von Lungenkrebs-Patienten stammten (210 Proben). Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde die Platte gründlich mit PBS gewaschen. Anschließend wurde der Biotin-markierte monoclonale Anti-Lungenkrebs-Antikörper SLC-454 (5 ug/ml) als der zweite Antikörper zugegeben (100 ul pro Vertiefung). Die Platte wurde über Nacht bei 4ºC stehengelassen und sodann gründlich mit PBS gewaschen. Avidin-Biotin-Peroxidase (Produkt von Vector), (10 ug/ul), wurde in Portionen zu je 100 ul in die Vertiefungen verteilt und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit PBS gewaschen. Danach wurde eine ABTS- Substratlösung in einer Menge von 100 l pro Vertiefung zugegeben und die Reaktion 30 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen gelassen und sodann durch Zusatz von 5% SDS-Lösung (Natriumdodecylsulfat), (100 ul pro Vertiefung), beendet. Die Farbentwicklung wurde für jede Vertiefung unter Verwendung eines Absorptionsmeßgerätes (OD&sub4;&sub1;&sub5;) gemessen. Wie in Figur 1 dargestellt, wurde bei 65 Serumproben von gesunden Individuen kein positives Ergebnis erhalten (OD&sub4;&sub1;&sub5; > 0,70), wohingegen bei den Serumproben von Patienten mit Lungen-Adenocarcinom 21 von 69 Proben, bei den Serumproben von Patienten mit Lungen-Plattenepithelcarcinom 19 von 69 Proben und bei den Serumproben von Patienten mit großzelligem Lungencarcinom 6 von 27 Proben positive Ergebnisse zeigten. Jedoch ergaben bei Serumproben von Patienten mit kleinzelligem Lungencarcinom 7 von 45 Proben in dem vorstehenden Serumdiagnosesystem positive Ergebnisse. Bei den serumproben von Patienten mit gutartigen Lungenerkrankungen zeigten 3 von 16 Proben positive Ergebnisse und bei den serumproben von Magenkrebs-Patienten zeigte keiner von 28 Fällen ein positives Ergebnis. Diese Ergebnisse machen deutlich, daß die Serumdiagnose unter Verwendung von SLC-454 ein wirksarnes Verfahren zur Diagnose von Lungenkrebs darstellt.
    • Beispiel 4
  • Zur Analyse der Antigene, die vom monoclonalen Antikörper SLC-454 erkannt werden, wurden aus Lungen-Plattenepithelcarcinom-Gewebe stammende Membranpräparate mit nachstehend beschriebenen Enzymen und Reagens behandelt und sodann auf Reaktivität mit SLC-454 untersucht.
  • Enzyme und Reagens
  • Trypsin (2,5% Lösung; Produkt von Gibco) 0,25% in PBS
  • Neuraminidase (Produkt von Boehringer Mannheim) 0,1 E/ml in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5), 3 mM CaCl&sub2;
  • α-L-Fucosidase (Produkt von Boehringer Mannheim) 0,1 E/ml in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,3)
  • Protease (Produkt von Sigma) 10 E/ml in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2)
  • NaIO&sub4; (Produkt von Wako Pure Chemical) 50 mM in PBS
  • Die Membranpräparate von Lungen-Plattenepithelcarcinom- Gewebe (100 ug Protein pro ml) wurden in Portionen zu je 50 l in die Vertiefungen einer EIA-Platte (Produkt von Linbro) verteilt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde die Platte dreimal mit PBS gewaschen. Sodann wurde 1% BSA-PBS in die Vertiefungen verteilt (200 ul pro Vertiefung). Die Platte wurde 30 Minuten bis 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann dreimal mit PBS gewaschen. Eines der vorstehenden Enzyme und Reagens wurden in die Vertiefungen verteilt (50 ul pro Vertiefung) und die Reaktion eine Stunde bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurde die Platte fünfmal mit PBS gewaschen und der monoclonale Antikörper SLC-454 (10 ug/ml) in die Vertiefungen verteilt (50 l pro Vertiefung), danach wurde die Platte über Nacht bei 4ºC stehengelassen.
  • Nach fünfmaligem Waschen mit Tween 20 (Produkt von Wako Pure Chemical) -PBS wurde Peroxidase-markiertes Anti-Maus-IgG (400-fache Verdünnung) zugegeben (50 ul pro Vertiefung) und die Reaktion zwei Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platte wurde fünfmal mit Tween 20-PBS gewaschen, eine ABTS- Substratlösung zugegeben (100 ul), die Reaktion 30 Minuten durchgeführt und die Absorption bei 415 nm gemessen.
  • Wie in Figur 2 dargestellt, verschwand die Antigenität bei Behandlung mit Perjodat (NaIO&sub4;), Trypsin oder Protease vollständig. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde gefolgert, daß der monoclonale Antikörper SLC-454 Glycoproteine erkennt.
    • Beispiel 5
  • Lungenkrebs-Membranpräparate, beschichtet auf eine EIA- Platte, wurden mit 1% BSA-PBS-Lösung blockiert. Serielle Verdünnungen von SLC-454, Kaninchen-Anti-CEA-Antikörper, Kaninchen-Anti-AFP-Antikörper und Kaninchen-Anti-β&sub2;-Microglobulin- Antikörper (alle hergestellt von DAKO) wurden in die Vertiefungen gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde die Platte gründlich mit PBS gewaschen. Anschließend wurde Biotinmarkierter SLC-454 hinzugefügt und die Platte drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Waschen wurde Avidin-Biotin-Peroxidase (Vectastain ABC Immunoperoxidase Staining Kit; Produkt von Vector) zugegeben und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde eine ABTS-Substratlösung zugegeben und für jede Vertiefung die Absporption bei 415 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt. Die Bindungsaktivität von SLC-454 wurde durch SLC-454 selbst gehemmt, überhaupt nicht jedoch durch Anti-CEA-Antikörper, Anti-AFP- Antikörper und Anti-β&sub2;-Microglobulin. Aufgrund dieses Ergebnisses wird gefolgert, daß SLC-454 ganz andere Antigene erkennt als diese Antikörper.
  • Die Erfindung ist ausführlich und mit Bezug auf die spezifische Ausführungsform beschrieben worden, dem Fachmann wird jedoch klar sein, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne daß der in den beiliegenden Patentansprüchen dargelegte Umfang der Erfindung verlassen wird.

Claims (5)

1. Monoclonaler Antikörper der IgM-Klasse erhältlich aus der Hybridomzellinie SLC-454 (ECACC Hinterlegungsnummer 86070306) und fähig zur Reaktion mit menschlichem Lungen-Plattenepithelcarcinom, Lungen-Adenocarcinom und großzelligem Lungencarcinom, aber im wesentlichen nicht reagierend mit menschlichem kleinzelligern Lungencarcinom und normalen Lungenzellen.
2. Hybridomzellinie SLC 454, ECACC Nr. 86070306.
3. Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers nach Anspruch 1, umfassend das Züchten von aus der Hybridomzellinie SLC-454, ECACC Nr. 86070306, stammenden Hybridomzellen und das Gewinnen des Antikörperprodukts.
4. Verfahren zum Nachweis des Vorkommens von menschlichem Lungen-Plattenepithelcarcinom, Lungen-Adenocarcinom oder großzelligem Lungencarcinom in einem Patienten, umfassend
(a) das Durchführen eines Immuntests mit einer Serumprobe des Patienten mit dem aus der Hybridomzellinie SLC-454 (ECACC Nr. 86070306) erhältlichen monoclonalen Antikörper und
(b) das Untersuchen der Ergebnisse auf das Vorliegen einer positiven Reaktion.
5. Immunhistochemisches Färbeverfahren zum Nachweis von menschlichem Lungen-Plattenepithelcarcinom, Lungen- Adenocarcinom und großzelligem Lungencarcinom in einem Patienten, umfassend die Anwendung eines aus der Hybridomzellinie SLC-454 (ECACC Nr. 86070306) erhältlichen monoclonalen Antikörpers auf eine Gewebeprobe aus der Lunge des Patienten und den Nachweis der selektiven Reaktion des Antikörpers mit in der Probe vorhandenen Lungen-Plattenepithelcarcinom-, Lungen-Adenocarcinom- oder großzelligen Lungencarcinom-Zellen durch unterschiedliche Färbung der den reagierten Antikörper enthaltenden Zellen und der Zellen des kleinzelligen Lungencarcinoms und normalen menschlichen Lungengewebes, die nicht reagierend sind und daher den Antikörper nicht enthalten.
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